PT103729A - Estojo e processo para a detecção e identificação de leveduras de interesse clínico, através de uma amplificação isotérmica de adn seguida de hibridação com oligonucleótidos específicos, e respectivas utilizações. - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE COM UM PROCESSO PARA A DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS DE INTERESSE CLÍNICO ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DE UMA TÉCNICA DE AMPLIFICAÇÃO ISOTÉRMICA DE ADN, QUE UTILIZA OLIGONUCLEÓTIDOS INICIADORES NÃO ESPECÍFICOS PARA AMPLIFICAR UMA REGIÃO DO ADN RIBOSSÓMICO (P.E. DO RADN 265), SEGUIDA DE HIBRIDAÇÃO REVERSA DOS PRODUTOS MARCADOS (P.E. COM DIGOXIGENINA) COM UM PAINEL DE SONDAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS (P.E. IMOBILIZADOS NUM SUPORTE SÓLIDO COMO UMA MEMBRANA DE NYLON) ESPECÍFICAS PARA CADA UMA DAS ESPÉCIES. A OCORRÊNCIA DE HIBRIDAÇÃO É SEGUIDAMENTE DETECTADA POR UM MÉTODO COLORIMÉTRICO. A PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE IGUALMENTE COM O DESENVOLVIMENTO DE UM ESTOJO, PARA A DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS COM RELEVÂNCIA CLÍNICA, BASEADO NO REFERIDO PROCESSO. DESTA FORMA, O PRESENTE INVENTO É ÚTIL NA DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS RELACIONADAS COM INFECÇÕES COM A VANTAGEM DE SE REVELAR UM MÉTODO SIMPLES, RÁPIDO, FIÁVEL E DE BAIXO CUSTO, PODENDO SER APLICADO NA ÁREA CLÍNICA, FARMACÊUTICA, VETERINÁRIA, ALIMENTAR E BIOTECNOLÓGICA.

Description

1

DESCRIÇÃO "ESTOJO Ξ PROCESSO PARA A DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS DE INTERESSE CLÍNICO, ATRAVÉS DE UMA AMPLIFICAÇÃO ISOTÉRMICA DE ADN SEGUIDA DE HIBRIDAÇÃO COM OLIGONUCLEÓTIDOS ESPECÍFICOS, E RESPECTIVAS UTILIZAÇÕES"

Dominio técnico da invenção A presente invenção relaciona-se com um estojo e um processo para a detecção e identificação de leveduras de interesse clínico, mediante a utilização de uma técnica optimizada de amplificação isotérmica de ADN seguida de hibridação reversa com oligonucleótidos específicos e uma detecção colorimétrica da ocorrência de hibridação, tendo assim aplicação nas áreas médica, farmacêutica, veterinária, alimentar e biotecnológica.

Sumário da invenção A presente invenção relaciona-se com um processo para a detecção e identificação de leveduras de interesse clínico através da utilização de uma técnica de amplificação isotérmica de ADN, preferencialmente baseada na amplificação isotérmica de ADN mediada por estruturas semicirculares (LAMP - "Loop-Mediated Isothermal DNA Amplification"). 0 processo descrito na invenção utiliza oligonucleótidos iniciadores não específicos para amplificar uma região do ADN ribossómico (p.e. do rADN 26S) de uma gama variada de espécies de leveduras, em que ocorre simultaneamente a marcação dos fragmentos de ADN amplificados com uma molécula marcadora (p.e. digoxigenina), seguida de hibridação reversa dos produtos de amplificação marcados 2 com um painel de oligonucleótidos específicos para as diferentes espécies, imobilizados numa superfície sólida (p.e. membrana de nylon), e detecção colorimétrica da ocorrência de hibridação. A presente invenção relaciona-se igualmente com o desenvolvimento de um estojo, para a detecção e identificação de leveduras com relevância clínica, baseado no referido processo.

Desta forma, o presente invento é útil na detecção e identificação de leveduras relacionadas com infecções com a vantagem de se revelar um método simples, rápido e de baixo custo, podendo ser aplicado na área médica e farmacêutica.

Antecedentes da invenção A ocorrência de micoses nosocomiais invasivas, em doentes imunocomprometidos, tem crescido progressivamente em anos recentes (Martin et al. 2003). As leveduras do género Candida são os agentes etiológicos mais frequentes deste tipo de infecções, com grande prevalência de C. albicans. No entanto, outras leveduras, como por exemplo C. parapsilosis e C. glabrata, ocorrem como organismos patogénicos oportunistas associados a infecções sistémicas, colocando dificuldades relacionadas com as diferentes susceptibilidades destas leveduras no que respeita às terapias antifúngicas (Hobson 2003).

Desta forma, o desenvolvimento de um sistema fiável e de rápida identificação destas leveduras patogénicas revela-se ser da maior importância, de modo a melhorar a gestão da doença e a selecção do tratamento mais adequado. 3 A identificação corrente de leveduras, em laboratório, geralmente envolve a análise das suas caracteristicas fenotípicas, o que se reconhece ser um procedimento trabalhoso, moroso e dispendioso, não fornecendo por vezes, para além disso, resultados fiáveis. Estes microrganismos são ainda dificeis de cultivar a partir de algumas amostras clinicas, como o sangue e a urina, sendo que as metodologias tradicionais e correntemente utilizadas no diagnóstico clinico envolvem o isolamento e a cultura destes organismos. De realçar que o isolamento de Candida a partir de amostras de sangue é presuntivo de infecção invasiva, embora em apenas 20% dos doentes com candidémia se conseguem obter hemoculturas destas leveduras. A presença de anticorpos específicos no soro contra Candida é também usado como critério de diagnóstico, mas está associada a estes processos uma baixa sensibilidade, entre outras razões porque os doentes imunocomprometidos apresentam dificuldades em gerar uma resposta imunitária. Os métodos serológicos não têm também permitido a diferenciação entre as várias espécies.

As técnicas de diagnóstico baseadas em PCR (reacção em cadeia de polimerase) têm evoluído mas a sua implementação, ao nível da rotina laboratorial, ainda não se encontra estabelecida. Esta situação deve-se, muito possivelmente, ao facto de que esta técnica requer equipamento dispendioso e sofisticado (p.e. termociclador). Vários grupos têm desenvolvido tecnologias alternativas de amplificação de ácidos nucleicos como forma de ultrapassar a etapa limitante de PCR. Neste sentido, o desenvolvimento de um processo de amplificação isotérmica revela-se de 4 particular interesse, uma vez que poderá facilitar a sua integração em estojos de diagnóstico a usar p.e. em ambulatório ou em locais de menores recursos financeiros (estojos POC - "Point Of Care").

Uma destas tecnologias é a amplificação isotérmica de ADN mediada por estruturas semi-circulares (LAMP - Loop-Mediated Isothermal DNA Amplification), descrita inicialmente por Notomi et al. (2000) (ver também documento EP 1 020 534 Al - "Process for synthesizing nucleic acid"). Desde então, foram descritos vários desenvolvimentos a esta elegante, robusta e muito promissora técnica de amplificação isotérmica de ADN (Mori et al. 2001, 2004, 2006; Nagamine et al. 2001, 2002). A técnica LAMP baseia-se na síntese de ADN usando oligonucleótidos iniciadores que reconhecem pelo menos seis sequências distintas no ADN, e uma polimerase de ADN sem actividade exonucleotídica. A reacção decorre na presença de ADN molde e dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfatados), usualmente em menos de 90 minutos a uma temperatura constante (ex. entre 60 e 65°C) . Os produtos finais de amplificação apresentam repetições invertidas alternadas da sequência-alvo, sendo visualizados como um perfil do tipo marcador de pesos moleculares de ADN quando submetidos a uma electroforese em gel de agarose. A técnica LAMP proporciona uma elevada eficiência de amplificação, sendo o ADN amplificado cerca de 109 a 1010 vezes, com um limite de detecção e especificidade comparável à técnica PCR. Para além disso, a sensibilidade 5 da técnica LAMP não é, aparentemente, afectada pela presença de ADN não-alvo em amostras, sendo este método ainda mais tolerante à presença de reconhecidos inibidores de PCR, como p.e. os presentes no soro sanguíneo (Kaneko et ai. 2007). O elevado potencial da tecnologia LAMP para o desenvolvimento de estojos de diagnóstico molecular, pela sua simplicidade e evitando o recurso a equipamento sofisticado, justifica o crescente número de documentos que relatam a utilização desta técnica para a detecção e identificação de organismos com relevância clínica e biotecnológica (Tabela 1). Tem sido enfatizado o diagnóstico de infecções bacterianas e virais. No entanto, também foram objecto de atenção parasitas como por ex. o Plasmodium falciparum e Trypanosoma spp., bem como fungos filamentosos, tais como Paracoccidioídes brasiliensis e Ochroconis gallopava. Resultados anteriores sobre técnicas isotérmicas de amplificação de ácidos nucleicos em leveduras são baseados na tecnologia NASBA (Nucleíc Acid Sequence-Based) (Borst et al. 2001, 2002; Loeffler et al. 2003; Widjojoatmdjo et al. 1999) e, muito recentemente, foi também publicada a utilização da tecnologia LAMP para a identificação de leveduras de contaminação alimentar como Dekkera (Hayashi et al. 2007). 6

Tabela 1. Exemplos de organismos para os quais têm sido desenvolvidos testes de detecção baseados em LAMP_

Organismo Referência

Fungos

Ohori et al. (2006) Endo et al. (2004) Hayashi et al. (2007) Poon et al. (2005) Kuboki et al. (2003); Thekisoe et al. (2005) Kamachi et al. (2006) Kato et al. (2005) Maruyama et al. (2003); Song et al. (2005); Yano et al. (2007) Torigoe et al. (2007) Minami et al. (2006) Furuhata et al. (2005) Enosawa et al. (2003); Mukai et al. (2006); Iwamoto et al. (2003) Saito et al. (2005) Aoi et al. (2006) Maeda et al. (2005); Yoshida et al. (2005) Hara-Kudo et al. (2005); Ohtsuka et al. (2005) Song et al. (2005) Seki et al. (2005) Horisaka et aJ. (2004) Suzuki et al. (2006) Parida et al. (2005) Imai et al. (2006) Nakagawa e Ito (2006) Yoshino et al. (2006);

Ochroconis gallopava Paracoccidioides brasiliensis Dekkera/Brettanomyces Parasitas

Plasmodium falciparum Trypanosoma spp.

Bactérias

Bordetella pertussis Clostridium difficile Escherichia coli

Haemophilus influenzae Helicobacter pylori Legionella spp.

Mycobacterium spp.

Mycoplasma pneumoniae Nitrosomonas europaea Porphyromonas gingivalis

Salmonella enterica

Shigella spp.

Streptococcus pneumoniae Yersinia pseudotuberculosis Virus

Citomegalovirus

Virus do Dengue

Virus da Gripe Aviaria H5N1

Virus da Gripe Humana

Virus do Herpes Koi 7

Vírus do Sarampo Vírus da Papeira Norovirus Vírus da Batata Y

Coronavírus do Síndroma Respiratório Agudo Vírus do Nilo Oeste

Gunimaladevi et al. (2004) Fujino et al. (2005) Okafuji et al. (2005) Fukuda et al. (2006)

Nie (2005)

Thai et al. (2004)

Parida et ai. (2004) Têm sido desenvolvidos vários métodos para a detecção e/ou identificação de fungos patogénicos, incluindo de leveduras, baseados na amplificação de ácidos nucleicos, principalmente por PCR, seguido de electroforese em gel de agarose, hibridação com sondas de ADN específicas, ou qualquer outro método para a detecção de amplificação e/ou diferenciação dos produtos amplificados. Têm sido descritos oligonucleótidos, universais ou específicos para determinadas espécies, usados em reacções de amplificação e hibridação. Muitos destes oligonucleótidos, e métodos para a sua utilização, têm sido objecto de registo de patentes. Grande parte dos oligonucleótidos desenvolvidos tem como alvo sequências complementares de regiões bastante variáveis do ADN genómico de fungos, como as regiões ITS1 ("Internai Transcribed Spacer" 1) e ITS2 das unidades de rADN (p.e. documentos W02007038578 - "Compositions and methods for the detection of Candida species"; WO2006123295 - DNA fragments, primers and method for amplification of the DNA fragments and kit including the aforementioned primers for the detection and Identification of clinically relevant Candida species"; US2005260584 - "Nucleic acids for the Identification of fungi and methods for using the same"; US2005164243 - "Nucleic acid probes and methods for 8 detecting clinically important fungai pathogens"; US6017699 - "PCR Identification and quantification of important Candida species").

Outros métodos descritos desenvolvem oligonucleótidos e sistemas baseados em PCR para a detecção e diferenciação de fungos patogénicos e de genes específicos, como por ex. genes envolvidos na resistência a antibióticos (p.e. documento US2006263810 - "Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungai pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinicai specimens for diagnosis in microbiology laboratories")

Um conceito interessante para o desenvolvimento de técnicas de identificação molecular de leveduras, incorporado na presente invenção, consiste na amplificação de um segmento universal de ADN, como por ex. a partir de ADN ribossómico, seguido de hibridação reversa dos produtos com um painel de oligonucleótidos específicos para várias espécies, com uma subsequente detecção colorimétrica da hibridação positiva (p.e. Anthony et al. 2000; Martin et al. 2000; Playford et al. 2006; Posteraro et al. 2000). A presente invenção apresenta a novidade, incorporada no desenvolvimento do conceito anterior, da optimização e utilização de um processo isotérmico de amplificação de ADN, neste caso baseado na tecnologia LAMP, para amplificar e marcar fragmentos de ADN (p.e. com a molécula de digoxigenina) a partir de leveduras patogénicas, fragmentos esses que são usados depois numa hibridação reversa e detecção colorimétrica da ocorrência de hibridação. 9 0 objecto da presente invenção consiste, portanto, no desenvolvimento de um método molecular e estojo para a detecção e identificação de leveduras de relevância clinica, tendo como ponto de partida a simples extracção de ADN genómico ou mesmo directamente a partir de células inteiras. Baseia-se preferencialmente na tecnologia LAMP para a amplificação de ácidos nucleicos, sendo a primeira vez que esta tecnologia é utilizada para amplificar e marcar ADN genómico de leveduras, neste caso com a molécula marcadora digoxigenina. 0 conceito utilizado na presente invenção difere dos outros métodos que recorrem à técnica LAMP, e que se encontram actualmente divulgados, uma vez que estes envolvem a utilização de conjuntos de oligonucleótidos iniciadores LAMP específicos para a espécie na detecção e identificação de um único organismo, sendo a presença de produtos de amplificação de ADN indicadora de que a amostra contém esse determinado organismo.

Pelo contrário, na presente invenção considera-se a utilização de um conjunto de oligonucleótidos iniciadores LAMP relativamente conservados, comuns a muitas espécies de fungos, que conduzem à amplificação de um fragmento de ADN comum a uma vasta gama de espécies de leveduras e à sua marcação com uma molécula marcadora (p.e. digoxigenina), usando nucleótidos modificados. Essas espécies, quer de forma individual ou inseridas numa população mista de leveduras, podem ser subsequentemente diferenciadas mediante hibridação reversa dos produtos amplificados com um painel de oligonucleótidos específicos imobilizados num suporte sólido (p.e. membrana de nylon). 10

Para além disso, as condições de desenvolvimento da reacção LAMP foram optimizadas para este sistema, de forma a permitir uma maior simplicidade de detecção das leveduras em questão.

Descrição geral da invenção A presente invenção relaciona-se com um processo de detecção e identificação de leveduras de interesse clinico baseado em técnicas de amplificação isotérmica de ADN, em particular da técnica LAMP. O método proporciona uma identificação num período inferior a seis horas e é adaptável a um estojo, desenvolvido a partir deste processo, com aplicação na detecção e identificação de leveduras clinicamente relevantes. 0 processo, objecto da presente invenção, compreende a amplificação isotérmica de um fragmento do ADN genómico de leveduras, preferencialmente do gene do ARN ribossómico 26S, que é marcado com uma molécula marcadora durante a reacção de amplificação (p.e. digoxigenina) seguido de hibridação reversa dos produtos com um painel de oligonucleótidos específicos para as várias espécies, com o objectivo de identificar as leveduras ao nível da espécie.

Outro dos aspectos da presente invenção constitui ainda o desenvolvimento de um estojo de diagnóstico molecular para detectar e identificar estes microrganismos a partir de culturas purificadas e, também, directamente a partir de amostras clínicas (ex. amostras de sangue).

Desta forma, pretende-se com a presente invenção, desenvolver ferramentas de rotina, fiáveis, sensíveis, de simples execução e com uma boa relação preço/qualidade, 11 aplicáveis na área clinica, farmacêutica, veterinária, alimentar e biotecnológica.

Os métodos de diagnóstico molecular, baseados maioritariamente na reacção de PCR, combinam algumas destas caracteristicas mas implicam a utilização de eguipamento e reagentes sofisticados e/ou dispendiosos.

Na presente invenção foi desenvolvida, optimizada e aplicada à detecção e identificação de leveduras a referida metodologia de amplificação isotérmica de ADN, conhecida como LAMP, de forma a ultrapassar as limitações relacionadas com o passo de amplificação através de PCR. 0 primeiro, e talvez o passo mais importante na optimização da técnica LAMP, é a concepção do conjunto de oligonucleótidos iniciadores. Em geral, verifica-se pela experiência r que é necessário conceber vários conjuntos de oligonucleótidos iniciadores até que um destes funcione eficientemente na reacção LAMP.

Foram usadas várias espécies de leveduras na optimização da invenção (Tabela 2). Foram seleccionadas oito espécies para estudo sendo o critério de selecção a sua relevância clinica, no que diz respeito a micoses invasivas: Candida albicans, C. glabrata, C. parapsílosis, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. krusei, Pichia anómala e Saccharomyces cerevisiae. As restantes espécies foram usadas como controlo negativo nos testes de detecção e identificação de leveduras. 12

Tabela 2. Lista das leveduras usadas na presente invenção

Espécie Estirpe

Candida albicans PYCC 3436 PYCC 2411 PYCC 2746 PYCC 4079 Candida glabrata PYCC 2418' PYCC 3109 PYCC 2716 Candida kruseia PYCC 3341' PYCC 2631 PYCC 4740 Candida lusitaniaeb PYCC 2705' PYCC 4093' PYCC 4175 Candida mal tosa PYCC 3860' Candida oleophila PYCC 4296 Candida parapsilosis PYCC 2545' PYCC 5124 Candida tropicalis PYCC 3097' PYCC 4672 PYCC 2508 Candida viswanathii PYCC 2811 Kl uyveromyces polysporusd PYCC 3887' Lodderomyces PYCC 4136'

Origem

Pele humana com micose interdigital

Expectoração (Portugal)

Expectoração de doente asmático (Noruega)

Desconhecida

Fezes humanas

Tracto digestivo de animal doméstico (Alemanha)

Desconhecido

Expectoração de doente brônquico (Sri Lanka)

Tracto digestivo de cavalo (Portugal) Água do mar (Portugal)

Ceco de porco (Portugal)

Essência de Citrus (Israel) Desconhecida

Tanque de neutralização de glutamato monossódico (Japão)

Desconhecida

Caso de psilose (Porto Rico)

Desconhecida

Doente brônquico

Solo próximo de rio poluído (Portugal) Fígado de elefante (Portugal)

Camarão Peneaus braziliensis - (Golfo do México)

Solo (África do Sul)

Sumo de laranja concentrado 13 elongi sporus

Pichia anómala PYCC PYCC PYCC 4121 3294 5618 Saccharomyces bayanus PYCC 4456 Saccharomyces cerevisiae PYCC 4455' Saccharomyces exiguuse PYCC 2543' Saccharomyces paradoxus PYCC 4570' Stephanoascus PYCC 3818 (EUA)

Desconhecida

Pus de pulmão de doente de tuberculose falecido (Itália)

Desconhecida

Cerveja turva

Leveduras de produção de cerveja (Holanda) (Japão)

Exsudado de árvore Pescoço de vaca (Holanda) aSinónimo actual de Issatchenkia orientalis; bSinónimo actual de Clavispora lusitaniae; CT de Clavispora lusitaniae; dSinónimo actual de Vanderwaltozyma polyspora; eSinónimo actual de Kazachstania exígua; PYCC - Colecção Portuguesa de Culturas de Leveduras, Caparica, Portugal; T -estirpe tipo;

Para a extracção do ADN usaram-se células de leveduras cultivadas em meio de cultura MYP (agar, extracto de malte, extracto de levedura e peptona de soja) que foram posteriormente suspendidas em tampão de lise contendo esferas de vidro. Após incubação e ruptura das células, as suspensões foram centrifugadas, sendo o sobrenadante usado para a amplificação do ADN. As soluções de ADN extraído podem ser mantidas durante vários anos, a -20°C, sem degradação aparente.

Os oligonucleótidos iniciadores LAMP, desenvolvidos no âmbito desta invenção, têm como alvo sequências mais ou menos conservadas no interior dos domínios D1/D2 do rARN 26S de fungos. Esta região foi seleccionada devido a ser 14 frequenteraente utilizada em estudos de sistemática e identificação de leveduras, e pela disponibilidade das respectivas sequências em bases de dados de acesso público.

As respectivas sequências são as seguintes: F3, oligonucleótido iniciador externo directo: Seq. N°1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') B3, oligonucleótido iniciador externo reverso: Seq. N°2 (5'-CCT TCC CTT TCA ACA ATT TCA C-3'); FIP, oligonucleótido iniciador interno directo: Seq. N°3 (5'-CTG CAT TCC CAA ACA ACT CGA CTC ACA GAG GGT GAG AAT CCC G-3'); e BIP, oligonucleótido iniciador interno reverso: Seq. N°4 (5'-TAT TGG CGA GAG ACC GAT AGC GTT TCA CTC TCT TTT CAA AGT TC-3').

Os iniciadores foram concebidos de acordo com os procedimentos descritos por Notomi et al. (2000). O conjunto de oligonucleótidos iniciadores LAMP amplificou com sucesso o ADN genómico de todas as leveduras testadas, produzindo os padrões esperados, do tipo marcador de pesos moleculares, em electroforegramas de gel de agarose.

Os oligonucleótidos iniciadores atrás indicados não têm uma sequência-alvo totalmente complementar no rADN de algumas das leveduras clinicamente relevantes testadas (p.e. com C. krusei), provocando uma menor sensibilidade da reacção LAMP na amplificação de ADN genómico a partir dessas leveduras. Embora uma menor sensibilidade não constitua um problema na amplificação de ADN a partir de culturas puras, tal como o descrito na presente invenção, isto pode, contudo, criar algumas dificuldades na realização de análises directas a 15 amostras clínicas, onde podem estar presentes quantidades diminutas de ADN. A utilização de oligonucleótidos iniciadores degenerados ou uma mistura de iniciadores pode constituir uma alternativa viável para ultrapassar este problema.

Os oligonucleótidos específicos (sondas) para as várias espécies foram concebidos tendo como objectivo a identificação de leveduras com interesse clínico, com base na análise comparativa das sequências de rADN 26S recuperadas do GenBank. Este painel de sondas de oligonucleótidos pode ser alargado a espécies adicionais e/ou variantes, eventualmente usando outras regiões do ADN. A Tabela 3 apresenta as sondas usadas no âmbito da presente invenção.

Tabela 3. Sondas de ADN usadas no âmbito da presente invenção____

Sonda Sequência(5' -> 3') %GCa Tm (°C)a Espécies-alvo U210 TCG AGT TGT TTG GGA ATG 50.0 65 Panfúngica CAG CTC Cal70b TGA GAT GAC CCG GGT CTG 50.0 65 Candida TGT AAA albicans Cal7 6b GAC CCG GGT CTG TGT AAA 56.5 66 C. albicans GTT CC Cgl66 GTG GCG AGG GTG TCA GTT 67 54 C. glabrata CTT TGT Cgl7 5 GTG TCA GTT CTT TGT AAA 48.0 68 C. glabrata GGG TGC TCG Cdl76c GGC CCG GGT CTA TGT AAA 56.5 66 C. GTT CC dubliniensis C1180 GAC TCT TTG CAC CGC GGC 66.7 67 C. lusitaniae TCC Ctl66 GCG ATG AGA TGA TCC AGG 67 52 C. tropicalis CCT ATG T Ct17ld GAG ATG ATC CAG GCC TAT 44.0 64 C. tropicalis GTA AAG T 16

16 Cpl66 GCG ATG AGA TGT ccc AGA CCT ATG Cpl71e GAG ATG TCC CAG ACC TAT GTA AAG TTC Ckl7 5 GGC GGA AGC AGT GAG GCC CTT CT Pal71 GAG ATG o o o ATT CCT ATG TAA GGT GC Pal76f GCC CAT TCC TAT GTA AGG TGC TAT c Scl7 6g GTG CGG TTC TTT GTA AAG TGC CTT CG 67 54 C. parapsilosis 44.4 67 C. parapsilosis 65.2 70 C. krusei 68 50 Pichia anómala 48.0 66 Pichía anómala 50.0 68 S. cerevisiae aDados obtidos com Oligo Analyzer 1.0.2 (Teemu Kuulasmaa, Universidade de Kuopio, Finlandia); bIdêntica em C. africana espécie recentemente descrita, e duas discrepâncias com C. dubliniensis e C. viswanathii; cDuas discrepâncias em C. albicans; dIdêntica em C. sojae e uma discrepância em C. maltosa; eIdêntica em C. orthopsilosis e uma discrepância em C. metapsilosis, ambas recentemente descritas, e duas discrepâncias com C. maltosa e L. elongisporus; fIdêntica em P. subpelliculosa; gDuas discrepâncias em S. bayanus e S. paradoxus.

Adicionalmente, foi concebida uma sonda universal para fungos (U210, Tabela 3) . Os alvos para as sondas especificas encontram-se localizados no fragmento amplificado por LAMP.

Todas as sondas foram sintetizadas com seis bases adicionais de timina na extremidade 3', de forma a garantir uma eficiente ligação às membranas de nylon (Brown et al. 2000) .

Com o objectivo de optimizar a reacção LAMP, para garantir uma elevada sensibilidade e eficácia na detecção de leveduras em amostras clinicas, testou-se diferentes tempos 17 de incubação, tendo-se obtido melhores resultados usando um período de incubação de 90 minutos, a 64°C, em vez do tradicional período de 60 minutos ou menos. A mistura de reacção LAMP foi igualmente optimizada para o sistema de identificação da presente invenção e contém os olígonucleótidos iniciadores FIP, BIP, F3 e B3, dNTPs, o ADN molde, betaína, MgCl2 e a polimerase Bst. Para a marcação dos produtos de amplificação, 1/40 dos dTTPs encontravam-se na forma de dUTPs marcados com digoxigenina.

Procedeu-se à desnaturação do ADN molde, antes da reacção LAMP. Numa forma preferencial de realização do presente invento, procedeu-se à inactivação térmica da enzima polimerase após a reacção LAMP.

As reacções LAMP foram igualmente realizadas com a adição de suspensões celulares de leveduras directamente à mistura de reacção, sem extracção prévia de ADN genómico.

Para determinação da sensibilidade da reacção LAMP, procedeu-se à quantificação do ADN genómico extraído de C. albicans PYCC 3436T e C. krusei PYCC 3341T, através de electrof orese em gel de agarose, com diluições em série usadas como padrão nas reacções LAMP. 0 limite de detecção dos produtos da reacção de amplificação isotérmica LAMP foi obtido com cerca de 0,05 e 1 pg de ADN genómico para C. albicans e C. krusei, respectivamente.

Foi possível confirmar que a reacção LAMP prossegue sem o passo prévio de desnaturação térmica do molde de ADN, o que 18 torna esta técnica realmente isotérmica. Contudo, verificou-se que a sensibilidade da técnica é significativamente inferior quando se utilizam moldes de ADN não desnaturados comparativamente com os moldes de ADN desnaturados. Este aspecto pode revelar-se crucial na realização de análises directas a partir de amostras clinicas.

Para agilizar o tempo de resposta da identificação, através da eliminação do passo de extracção de ADN, foi testada a utilização de células de leveduras, tratadas termicamente, directamente na mistura reaccional LAMP. Desta forma, foram obtidos produtos de amplificação utilizando 1 a 10 células de levedura na mistura de reacção. A simplicidade destes procedimentos incrementa a potencial importância dos estojos de diagnóstico baseados na técnica LAMP para aplicação em análises clinicas de rotina.

Os produtos de amplificação LAMP marcados com digoxigenina foram hibridados com um painel de sondas de oligonucleótidos específicos para as várias espécies testadas. Assim, as sondas de oligonucleótidos (Tabela 3) foram inicialmente imobilizadas num suporte sólido (como p.e. tiras de membranas de nylon).

Após ligação (cross-linking) dos oligonucleótidos às membranas, procedeu-se à sua lavagem para remoção de sondas não ligadas sendo em seguida secas e armazenadas à temperatura ambiente.

Após desnaturação dos fragmentos de ADN amplificados e marcados com digoxigenina, estes foram usados numa reacção 19 de hibridação com os oligonucleótidos específicos imobilizados nas tiras de nylon, em tampão de hibridação. A ocorrência de hibridação foi detectada mediante a utilização de fosfatase alcalina e de um sistema de detecção colorimétrico. A hibridação reversa dos fragmentos amplificados por LAMP, marcados com digoxigenina, com as sondas de oligonucleótidos específicas permite a correcta identificação das respectivas espécies de leveduras.

Cada fragmento amplificado por LAMP produziu um sinal visualmente evidente de hibridação com a respectiva sonda específica para a espécie e sonda universal U210 para fungos. Os sinais de hibridação específicos são normalmente fortes embora com diferentes intensidades, dependendo da sonda. Numa forma preferencial de realização do método, é possível estandardizar as intensidades de sinal para todas as sondas, ex. através da modificação da sua concentração e/ou do número de resíduos de timina adicionados na extremidade 3' dos oligonucleótidos específicos.

Uma discrepância interna na sequência da sonda Scl76, em comparação com o alvo complementar, foi suficiente para distinguir espécies muito próximas, tal como o demonstrado pela diferenciação entre S. cerevisiae PYCC 4455T e S. bayanus PYCC 4456T ou S. paradoxus PYCC 4570T, que apenas apresentam sinais fracos de hibridação com essa sonda.

De uma forma geral, os resultados da presente invenção indicam que o desenvolvimento de metodologias de 20 amplificação isotérmica de ADN, isentas de PCR, terão um enorme impacto na implementação global de estojos de diagnóstico molecular, fiáveis, fáceis de usar e de resposta rápida, para a identificação de microrganismos patogénicos e, em particular, de leveduras infecciosas.

Descrição detalhada da invenção 1. Estirpes de leveduras

As estirpes de leveduras usadas nesta invenção estão listadas na Tabela 2 e encontram-se mantidas na Colecção Portuguesa de Culturas de Leveduras (PYCC), Caparica, Portugal.

Foram seleccionadas oito espécies, sendo o critério de selecção a sua relevância clínica no que diz respeito a micoses invasivas: Candída albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. krusei, Pichia anómala e Saccharomyces cerevisiae.

As restantes espécies foram utilizadas como controlo negativo nos ensaios de hibridação reversa.

2. Extracção de ADN

As culturas foram cultivadas em agar MYP (0,05% p/v de extracto de levedura, 0,7% de extracto de malte, 0,25% de peptona de soja (soytone) e 1,5% de agar) e as células suspendidas em 500 μL de tampão de lise (50 mM Tris, 250 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0,3% SDS, pH 8) contendo o equivalente a um volume de 200 μί de esferas de vidro (0 425 - 600 μπι) . 21

Após agitação em vortex durante 2 minutos, os tubos foram incubados durante 1 hora a 65°C e agitados de novo, em vortex, durante 2 minutos. As suspensões foram então centrifugadas durante 15 minutos a 14.000 rpm, o sobrenadante diluído (1:750) em água esterilizada bi-destilada e a solução final usada directamente para a amplificação de ADN.

As soluções de ADN podem ser mantidas durante vários anos a -20°C, sem degradação aparente.

3. Oligonucleótidos Iniciadores LAMP

Foi concebido um conjunto de oligonucleótidos iniciadores LAMP tendo como alvo sequências relativamente conservadas nos domínios D1/D2 do rARN fúngico 26S, de forma a amplificar um fragmento de 190 pb provenientes de uma vasta gama de espécies de leveduras.

As respectivas sequências são as seguintes:

Seq. 1 - F3, oligonucleótido iniciador externo directo (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')

Seq. 2 - B3, oligonucleótido iniciador externo reverso (5'-CCT TCC CTT TCA ACA ATT TCA C-3')

Seq.3 - FIP, oligonucleótido iniciador interno directo (5'-CTG CAT TCC CAA ACA ACT CGA CTC ACA GAG GGT GAG AAT CCC G-3'); e

Seq.4 - BIP, oligonucleótido iniciador interno reverso (5'-TAT TGG CGA GAG ACC GAT AGC GTT TCA CTC TCT TTT CAA AGT TC-3' ) . O conjunto de oligonucleótidos iniciadores é totalmente complementar aos segmentos no interior do rADN 26S de três das espécies em estudo, C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis. 22

No que diz respeito às outras espécies, o número máximo de substituições nucleotidicas ocorreu para o oligonucleótido iniciador FIP que apresenta cinco substituições, quando comparadas com as sequências de C. krusei e C. lusitaniae. Os oligonucleótidos iniciadores foram concebidos de acordo com os procedimentos descritos por Notomi et al. (2000). 4. Sondas de oligonucleótidos especificas

As sondas de oligonucleótidos especificas para as várias espécies testadas, tendo como objectivo a identificação de leveduras com interesse clínico, foram concebidas com base na análise comparativa das sequências de rADN 26S consultadas no GenBank (Tabela 3).

Adicionalmente, foi concebida uma sonda universal para fungos (U210). Os alvos para as sondas específicas encontram-se localizados no fragmento amplificado por LAMP.

Todas as sondas foram sintetizadas com seis bases de timina adicionais na extremidade 3' , de forma a garantir uma eficiente ligação às membranas de nylon.

5. Reacção LAMP A mistura de reacção LAMP foi optimizada para o sistema de identificação da presente invenção e contém: 1,6 μΜ de cada oligonucleótido iniciador FIP e BIP; 0,2 μΜ de cada oligonucleótido iniciador F3 e B3; 900 μΜ de cada dNTP; 1,4 μΐ de solução de ADN molde; 0.8 M de betaína; 3 mM de MgCl2; 3,2 U de polimerase Bst e respectivo tampão 1* (New England Biolabs). 23

Para a marcação dos fragmentos de ADN amplificados por LAMP, 1/40 dos dTTPs encontravam-se na forma de dUTPs marcados com digoxigenina. O ADN molde foi desnaturado a 94°C durante 4 minutos e mantido em gelo antes da reacção LAMP. A mistura de reacção LAMP foi incubada a 64°C durante 90 minutos num bloco de aquecimento, seguido de um passo opcional que consistiu na manutenção a 80°C, durante 5 minutos, para inactivação da enzima.

Os fragmentos de ADN amplificados foram separados através de electroforese em gel de agarose (1,4%), sendo a detecção efectuada com brometo de etidio.

As reacções LAMP foram igualmente realizadas com a adição de suspensões celulares de leveduras directamente à mistura de reacção (células cultivadas em MYP durante 2 a 5 dias, suspendidas em água e tratadas durante 5 minutos a 99°C). 5. Hibridação reversa

Os fragmentos de ADN amplificados por LAMP e marcados com digoxigenina foram hibridados com um painel de sondas de oligonucleótidos imobilizados numa membrana de nylon. Cada uma das sondas é especifica para uma determinada espécie dentre as leveduras com relevância clínica testadas.

As sondas de oligonucleótidos (Tabela 3) foram inicialmente imobilizadas em tiras de nylon (1 χ 2 cm; Hybond™-N, Amersham Pharmacia Biotech) utilizando o procedimento seguinte: 0,3 μΐ de cada solução aquosa 50 pM da sonda foram colocados numa localização específica da membrana de 24 nylon, sendo a membrana com as sondas em seguida irradiada com luz UV de ondas curtas durante 2,5 minutos.

Após ligação (cross-linking) dos oligonucleótidos às membranas, procedeu-se à sua lavagem em SSC 0,5x (lx SSC corresponde a 1,15 M de NaCl com 0,015 M de citrato de sódio) e 0,1% SDS, durante 2 minutos a 37°C, para remoção de sondas não ligadas.

As tiras foram então secas e armazenadas à temperatura ambiente.

Para a hibridação, cada tira foi colocada num tubo de microcentrifuga de 2 ml, contendo 1 ml de tampão de hibridação pré-aguecido (Dig Easy Hyb; Roche Diagnostics) , e incubado com agitação suave a 55°C durante 10 minutos.

Após desnaturação dos fragmentos de ADN amplificados por LAMP e marcados com digoxigenina, a 95°C durante 5 minutos seguidos de arrefecimento em gelo, foram adicionados 4 μΐ da reacção de mistura ao tubo de microcentrifuga contendo a tira e o tampão de hibridação. A hibridação foi realizada a 55°C durante 3 horas com agitação suave. A tira foi então removida do tubo e lavada em SSC 0,25* e 0,1% SDS (40 ml para cada conjunto de 30 tiras) a 55°C durante 10 minutos. A ocorrência de hibridação foi detectada mediante a utilização de fosfatase alcalina e de um sistema de detecção colorimétrico, de acordo com as instruções do fabricante (Dig Labelling and Detection Kit; Roche 25

Diagnostics). A cor desenvolveu-se entre 5 a 30 minutos a partir do inicio da reacção.

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Lisboa, 4 de Maio de 2007

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção e identificação de leveduras de interesse clínico, baseado na amplificação isotérmica de uma região do rADN, com posterior discriminação dos fragmentos de ácidos nucleicos amplificados por hibridação com um painel de sondas oligonucleotídicas específicas para as várias espécies, caracterizado por: a) se proceder à extracção do ADN das leveduras, a partir das culturas purificadas, ou directamente a partir das amostras presumivelmente infectadas; b) se utilizar um conjunto de oligonucleótidos iniciadores não específicos, e relativamente conservados em fungos, para amplificar os fragmentos do rADN fúngico a partir de uma gama diversificada de espécies; c) se proceder à amplificação isotérmica do rADN fúngico, usando a tecnologia LAMP, e utilizando os oligonucleótidos iniciadores não específicos; d) se proceder, durante a reacção de amplificação, à marcação dos fragmentos de ADN com uma molécula marcadora, usando nucleótidos modificados (p.e. com digoxigenina); e) se utilizar um conjunto de sondas oligonucleotídicas específicas para as várias espécies de leveduras com relevância clínica, bem como uma sonda oligonucleotídica universal para fungos, imobilizadas num suporte sólido, como por exemplo, uma tira de membrana de nylon; f) se realizar uma hibridação reversa dos fragmentos de ADN amplificados e marcados com um painel de sondas oligonucleotídicas, especificas para as 1 2 várias espécies, imobilizadas num suporte sólido (p.e. membrana de nylon); g) se detectar a ocorrência de hibridação entre os fragmentos amplificados e as sondas específicas, mediante revelação do suporte sólido utilizando um método colorímétríco para detecção da molécula marcadora (p.e. sistema de detecção colorimétrico serológico da molécula digoxigenina, com o uso de uma fosfatase alcalina e respectivo substrato).

2. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as leveduras clinicamente relevantes pertencerem ao seguinte grupo de espécies: Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Candida krusei, Pichia anómala, Saccharomyces cerevisiae.

3. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os oligonucleótidos iniciadores, usados na amplificação isotérmica de ADN, terem ou serem baseados (p.e. por extensão ou encurtamento das sequências a partir das extremidades, e delecção, troca e adição de nucleótidos internos à sequência) nas seguintes sequências, ou das sequências complementares respectivas: Seq.l: 5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3' Seq.2: 5'-CCT TCC CTT TCA ACA ATT TCA C-3' Seq.3: 5'-CTG CAT TCC CAA ACA ACT CGA CTC ACA GAG GGT GAG AAT CCC G-3'; Seq.4: 5'-TAT TGG CGA GAG ACC GAT AGC GTT TCA CTC TCT TTT CAA AGT TC-3'. 2 3

4. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as sondas oligonucleotidicas especificas se encontrarem imobilizadas num suporte sólido, como por exemplo uma tira de membrana de nylon.

5. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por as sondas de oligonucleótidos específicos para as várias espécies de leveduras clinicamente relevantes terem como alvo regiões complementares localizadas no interior do fragmento de ADN amplificado.

6. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por as sondas específicas usadas terem ou serem baseadas (p.e. por extensão ou encurtamento das sequências a partir das extremidades, e delecção, troca e adição de nucleótidos internos à sequência) em qualquer uma das seguintes sequências, ou das sequências complementares respectivas: U210: 5'- TCG AGT TGT TTG GGA ATG CAG CTC - 3' Cal70 5' - TGA GAT GAC CCG GGT CTG TGT AAA - 3' Cal7 6 5'- GAC CCG GGT CTG TGT AAA GTT CC - 3' Cgl7 5 5' - GTG TCA GTT CTT TGT AAA GGG TGC TCG - 3 Cgl66 5' - GTG GCG AGG GTG TCA GTT CTT TGT - 3' Cdl7 6 5' - GGC CCG GGT CTA TGT AAA GTT CC - 3' C1180 5' - GAC TCT TTG CAC CGC GGC TCC - 3' Ct 171 5' - GAG ATG ATC CAG GCC TAT GTA AAG T - 3' Ct 166 5' - GCG ATG AGA TGA TCC AGG CCT ATG T - 3' Cpl66 5'- GCG ATG AGA TGT CCC AGA CCT ATG - 3' Cpl71 5' - GAG ATG TCC CAG ACC TAT GTA AAG TTC - 3 Ckl7 5 5' - GGC GGA AGC AGT GAG GCC CTT CT - 3' Pal71 5' - GAG ATG CCC ATT CCT ATG TAA GGT GC - 3' Pal7 6 5' - GCC CAT TCC TAT GTA AGG TGC TAT C - 3' Scl7 6 5' - GTG CGG TTC TTT GTA AAG TGC CTT CG - 3' 3 4

7. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por as sondas específicas poderem, ou não, ser adicionadas de uma cauda de nucleótidos de timina na sua extremidade 3'.

8. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a reacção de amplificação isotérmica LAMP de ADN ser optimizada, mediante a utilização combinada de pelo menos um dos oligonucleótidos iniciadores da reivindicação 3, dos dNTPs, da solução de ADN molde, betaína, MgCl2, polimerase Bst, com ou sem desnaturação térmica prévia do ADN molde.

9. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a reacção LAMP ser realizada entre 55 °C e 70 °C, preferencialmente entre 60 °C e 65 °C, durante mais de 15 minutos, preferencialmente entre 60 e 90 minutos.

10. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com as reivindicações 8 a 9, caracterizado por a reacção de amplificação isotérmica LAMP de ADN decorrer com a adição de ADN genómico extraído, ou directamente de suspensões celulares de leveduras, à mistura reaccional de amplificação.

11. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com as reivindicações 8 a 10, caracterizado por se utilizarem nucleótidos modificados com uma 4 5 molécula marcadora (biotina, digoxigenina, ou outra) na reacção de amplificação isotérmica de ADN.

12. Processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a hibridação reversa dos fragmentos de ADN amplificados, marcados com uma molécula marcadora, ser realizada contra um painel de sondas especificas para as várias espécies, previamente imobilizadas num suporte sólido (p.e. tiras de nylon).

13. Utilização do processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se destinar à identificação de leveduras, particularmente à identificação de leveduras de interesse clinico.

14. Utilização do processo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por se aplicar a um estojo de detecção e identificação de leveduras de interesse clinico.

15. Estojo para a detecção e identificação de leveduras caracterizado por se basear no processo das reivindicações 1 a 12, contendo pelo menos um dos oligonucleótidos iniciadores da reivindicação 3 e as sondas da reivindicação 4.

16. Utilização do estojo para a detecção e identificação de leveduras, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por se aplicar à detecção e identificação de leveduras clinicamente relevantes, com aplicação em 5 6 laboratórios de análises clinicas, hospitais e centros clínicos. Lisboa, 4 de Maio de 2007 6