PT104331A

PT104331A - Protenas de fuso, processo para a sua preparaão e sua utilizaão em sistemas de expresso de protenas recombinantes

Info

Publication number: PT104331A
Application number: PT104331A
Authority: PT
Inventors: Antenio Manuel Oliveira Castro; Antenia Pereira Da Conceiaco Maria; Sofia Judite Marques Da Costa; Andr Augusto Da Silva Almeida
Original assignee: Escola Superior Agrária De Coi; Hitag Biotechnology Lda
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2010-07-13
Also published as: US20120165508A1; CN102348800A; ZA201105921B; BRPI0924214A2; SG174348A1; EP2388329A2; MX2011007492A; CA2749571A1; CN102348800B; WO2010082097A2; WO2010082097A4; WO2010082097A3; AU2009337517A1

Abstract

A INVENÃO REFERE-SE A PROTENAS DE FUSO COMPREENDENDO UMA SEQUNCIA DE AMINOáCIDOS CORRESPONDENTE A UM FRAGMENTO H OU UMA SEQUNCIA DE AMINOáCIDOS CORRESPONDENTE A UMA PROTENA DE LIGAÃO AO CáLCIO EXCRETADA-SECRETADA PELO VERME ADULTO DE FASCIOLA HEPáTICA, SEGUIDA DE UMA SEQUNCIA DE AMINOáCIDOS CORRESPONDENTE A UM FRAGMENTO PROTEICO OU PROTENA NO RELACIONADA, A UM PROCESSO PARA A SUA PREPARAÃO E SUA UTILIZAÃO EM SISTEMAS DE EXPRESSO DE PROTENAS RECOMBINANTES.

Description

1

DESCRIÇÃO

"PROTEÍNAS DE FUSÃO, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUÃ UTILIZAÇÃO EM SISTEMAS DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a proteínas de fusão, a um processo para a sua preparação e à sua utilização em sistemas de expressão de proteínas recombinantes.

Antecedentes da invenção A preparação de extractos ricos numa proteína específica raramente ocorre com facilidade a partir dos organismos que as produzem. Assim, a produção de proteínas recombinantes é frequentemente a única forma viável de produzir essas proteínas em quantidades e com os níveis de actividade necessários. A expressão de proteínas recombinantes constitui uma das aplicações mais relevantes e de maior aplicabilidade, tanto a nível de investigação e desenvolvimento, como a nível industrial. A possibilidade de expressar proteínas estranhas em modelos bem definidos, usando bactérias, fungos ou eucariotas, constitui uma ferramenta de grande potencial e relevo no âmbito dos processos biotecnológicos, permitindo a produção de elevadas quantidades da proteína de interesse. 2 A E. coli tem sido o sistema mais usado a nível mundial, para proteínas que não necessitem de modificações de pós-tradução, tais como a glicosilação, para terem actividade. A expressão de proteínas recombinantes em E. coli é um dos métodos mais atractivos de produção heteróloga devido à simplicidade da bactéria, capacidade de um crescimento rápido e económico, conhecimento fisiológico e caracterização genética existente e também devido à disponibilidade de ferramentas genéticas avançadas, entre elas, a grande variedade de plasmídeos, partners recombinantes de fusão e estirpes com as mutações adequadas. Tendo em conta as vantagens oferecidas por este modelo, a expressão de proteínas recombinantes em E. coli tornou-se num dos métodos de produção proteica mais usados, quer ao nível laboratorial, quer industrial. Vários vectores expressando proteínas de fusão com sequências que são adicionadas para fins de isolamento e estabilização da produção foram descritos e usados comercialmente. Entre os mais divulgados temos a produção de proteínas com o designado "Histidine-tag", caracterizada pela adição de uma sequência com várias histidinas, a produção de proteínas de fusão com glutationa-S-transferase, com proteínas de ligação à maltose (MBP), com proteínas de ligação a RNA (Documento US2004033564) ou com proteínas de fusão com ubiquitina (Documento WO9701627).

Uma das maiores dificuldades na utilização destes sistemas de expressão reside na produção de proteínas na forma de corpos de inclusão, situação frequente que origina rendimentos muito reduzidos e a formação de precipitados difíceis de manipular. Esta ocorrência é particularmente frequente quando são usados fragmentos instáveis. 3 0 objecto da presente invenção baseia-se no desenvolvimento de uma metodologia que permite aumentar significativamente a produção de proteínas recombinantes e facilitar o seu isolamento baseado na fusão de sequências de proteínas ou proteínas de ligação ao cálcio. A presente invenção apresenta-se como uma alternativa aos sistemas descritos no estado da técnica no contexto da produção de antigénios recombinantes, assumindo-se como um método simples, com elevado rendimento e de aplicação geral que pode ter impacto significativo tanto a nível de investigação, como de aplicações comerciais.

Descrição da invenção A presente invenção refere-se a proteínas de fusão que compreendem na sua estrutura: (1) parte ou a totalidade da sequência de aminoácidos de proteínas de ligação ao cálcio excretadas/secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepatica; e uma proteína ou fragmento proteico de interesse não relacionado. É também objecto da presente invenção um processo para a preparação destas proteínas de fusão que permita aumentar muito significativamente a expressão e a solubilização das proteínas de fusão e consequentemente dos fragmentos ou proteínas adicionados. A adição de pequenos fragmentos de proteínas de ligação ao cálcio do helminta Fasciola hepatica- doravante designados fragmentos H (de Helminta) - (SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4), ou 4 dessas proteínas excretadas/secretadas pelo verme adulto (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3), ou de sequências semelhantes de preferência com 90 a 95% de homologia, a fragmentos proteicos ou proteínas não relacionados permite um aumento significativo nos níveis de produção destes polipéptidos e da sua solubilização.

Assim, um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos com a estrutura do fragmento H ou das proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepatica, seguida de uma sequência de aminoácidos estruturalmente semelhantes a um fragmento proteico ou proteína não relacionada. A adição do tag de fusão (fragmento H ou proteína de ligação ao cálcio) à proteína não relacionada pode ser efectuado na posição N ou C-terminal.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um vector de expressão caracterizado por compreender uma sequência polinucleotídica que codifica a referida proteína de fusão.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão mencionado. A presente invenção refere-se, igualmente, a um processo para a preparação de proteínas de fusão caracterizado pelo facto de se cultivar uma célula hospedeira anteriormente referida em condições apropriadas à expressão da referida proteína de fusão e se isolar a proteína de fusão. 5 A invenção refere-se ainda à utilização da referida proteína de fusão para a produção de proteínas ou fragmentos proteicos adicionados, em sistemas de expressão de proteínas recombinantes.

Outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um fragmento H ou proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepatica para a produção de proteínas recombinantes. A produção destas proteínas de fusão permite aumentar muito significativamente a expressão e solubilização dos fragmentos ou proteínas adicionadas, potenciando assim a sua utilização quer para fins de investigação e desenvolvimento, quer para fins industriais.

Breve descrição das figuras

Figura 1- Esquema das subclonagens usadas para avaliar o efeito do fragmento H ou do Fh8 sobre a produção proteica, em que:

A - elemento estrutural H B - proteína de Fasciola hepatica contendo fragmento H C - fragmento IL5 humano (SEQ ID No 6 - sequência com 48 aa correspondente a um exão da IL5 humana) D - fragmento CP12 (SEQ ID No 5- sequência de 73 aa de uma proteína de parede do Cryptosporidium parvum) E - fragmento TgOWP (SEQ ID No 7 - sequência de 122 aa de uma proteína de parede do Toxoplasma gondii) .

Figura 2- Resultados das produções (mg/L)das construções contendo o fragmento CP12. A- Gráfico da produção proteica; 6 B- Géis SDS-PAGE Tris-Tricina corados com Coomassie Blue. M- Marcador Prestained SDS-PAGE Standards (BioRad) . (a) : Fi, F2 e F3 - Fracções 1, 2 e 3 de CP12 recolhidas da coluna de Ni-NTA. (b) : Fi, F2, F3 e F4 - Fracções 1, 2, 3 e 4 de HCP12 (SEQ ID No 8) recolhidas da coluna de Ni-NTA. (c) : Fi, F2, F3, F4, F5, F6 e F7 - Fracções 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 de Fh8CP12 recolhidas da coluna de Ni-NTA. As setas indicam as bandas das respectivas proteínas.

Figura 3- Resultados das produções das construções contendo o fragmento IL5. A- Gráfico da produção proteica; B- Géis de SDS-PAGE Tris-Tricina corados com Coomassie blue. M-Marcador Prestained SDS-PAGE Standards (BioRad) . (a) : F4, F2 e F3 - Fracções 1, 2 e 3 de IL5 recolhidas da coluna de Ni-NTA. (b) : Fi, F2, F3 e F4 - Fracções 1, 2, 3 e 4 de HIL5 recolhidas da coluna de Ni-NTA. As setas indicam as bandas das respectivas proteínas.

Figura 4- Resultados das produções das construções contendo o fragmento TgOWP. A- Gráfico da produção proteica; B- Géis SDS-PAGE Tris-Tricina corados com Coomassie Blue. M-Marcador Prestained SDS-PAGE Standards (BioRad) . (a) : Fl, F2, F3 e F4 - Fracções 1, 2, 3 e 4 de TgOWP recolhidas da coluna de Ni-NTA. (b): Fl, F2, F3, F4 e F5 - Fracções 1, 2, 3, 4 e 5 de HTgOWP recolhidas da coluna de Ni-NTA. As setas indicam as bandas das respectivas proteínas.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção diz respeito a proteínas recombinantes fusionadas com fragmentos (designados fragmentos H (de Helminta) - SEQ ID NO 2 e/ou SEQ ID NO 4) ou totalidade das sequências de aminoácidos existentes em proteínas de 7 ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepatica, nomeadamente a proteína designada por Fh8 ou fasciolina (Genbank number AF213970), e a família de proteínas de ligação ao cálcio designadas genericamente por Fh22 que incluem os antigénios referenciados por EMBL número AJ003822; AJ003821. Esta estratégia permite aumentar os níveis de produção dos antigénios que são fusionados aos fragmentos H ou às proteínas contendo os fragmentos H, e a sua solubilização permitindo um ganho de eficiência nos sistemas de produção de proteínas recombinantes existentes. Este sistema permite evitar a produção do antigénio de interesse em corpos de inclusão viabilizando o seu isolamento. As características bioquímicas dos antigénios de ligação ao cálcio permitem o isolamento das proteínas de fusão por técnicas de cromatografia básicas, nomeadamente colunas de troca iónica, devido à capacidade de ligação ao cálcio criando um elemento de carga susceptível de servir de base para recuperar o antigénio de fusão.

Os exemplos apresentados referem-se a aplicações utilizando o fragmento H do Fh8 (SEQ ID NO 2) ou a proteína Fh8 (SEQ ID NO 1) . Os resultados experimentais mostraram que o fragmento H das proteínas Fh22 (SEQ ID NO 4) ou as proteínas Fh22 (SEQ ID NO 3) têm acção semelhante. Do mesmo modo a metodologia desenvolvida no âmbito da presente invenção não se restringe à produção das proteínas de fusão demonstradas nos exemplos, sendo extensíveis a qualquer polipéptido, não desvirtuando o espírito da invenção.

As várias construções foram subclonadas no vector de expressão em Escherichia coli pQE (Qiagen), do qual resulta a produção de proteínas recombinantes expressando na sua sequência N-terminal uma sequência de 6 histidinas, produção essa realizada na E. coli M15(pREP4) (Qiagen), permitindo o seu isolamento por cromatografia de afinidade com uma coluna de NiNTA agarose (Qiagen) , com base nos protocolos fornecidos pelo fabricante (Castro, 2001; Silva e tal., 2004). Todas as comparações de produção efectuadas usaram este sistema, efectuando-se o isolamento do antigénio recombinante em condições desnaturantes para permitir o isolamento mais eficaz, de forma a efectuar a comparação entre os níveis de produção das várias construções.

Para a produção e isolamento da proteína de interesse poderá ser usado qualquer sistema de expressão e isolamento de proteína recombinante. A invenção refere-se a construções contendo os fragmentos H ou os antigénios contendo os fragmentos H de forma a solubilizar os polipéptidos que são fusionados e aumentar a sua produção. A mesma metodologia poderá ser usada noutros sistemas de produção proteicos, nomeadamente em fungos ou sistemas eucariotas.

Um dos princípios da invenção caracteriza-se pela adiçao dos fragmentos H, concretamente à sequência do fragmento N-terminal do Fh8 ou do Fh22, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4, por processos de biologia molecular, antes da sequência correspondente ao polipéptido que se pretende produzir. Esta construção, pode ser realizada por inclusão desta sequência por técnicas de biologia molecular, nomeadamente usando enzimas de restrição adequadas e adicionando antes e depois da sequência do fragmento esses locais de restrição ou por outros processos como a adição de fragmentos de DNA com a sequência de interesse (linkers) a um produto de PCR, 9 ou outras estratégias aplicáveis. A reduzida amplitude do fragmento H permite o uso de uma grande variedade de estratégias para a fusão com o polipéptido de interesse.

Outra possibilidade para a construção consiste na preparação de uma proteína de fusão usando o polipéptido correspondente à sequência do Fh8 ou Fh22 e o polipéptido que se pretende produzir. 0 processo de inserção da sequência do Fh8 ou Fh22 pode ser realizado com recurso às técnicas de biologia molecular, nomeadamente através do uso de enzimas de restrição, metodologia essa usada nos processos de demonstração. A invenção foi aplicada a vários fragmentos, nomeadamente: - CP12: A CP12 é uma proteína de superfície do Cryptosporidium parvum, protozoário coccídeo pertencente ao género Cryptosporidium, filo Apicomplexa. Esta proteína com 104 aminoácidos (GenBank n° XM_625821), tem um peso molecular de 12 kDa possuindo uma sequência sinal amino-terminal (aa 1-28) e uma região transmembranar (aa 12-32), que é característica das proteínas de superfície, e não contendo domínios conservados nem funcionais (Yao et al., 2006). O fragmento CP12 usado neste trabalho apresenta 213 pb e corresponde à sequência nucleotídica da proteína CP12 sem o seu domínio transmembranar. O fragmento foi amplificado por PCR e subclonado no vector pQE (CP12), foram igualmente preparadas construções contendo o fragmento H seguido do CP12 (HCP12 - SEQ ID No 8), e contendo a sequência do Fh8 fusionada com a sequência do CP12 (Fh8CP12 - SEQ ID No 11) . A análise da produção dos antigénios recombinantes isolados em condições desnaturantes usando resina de NiNTA agarose (QIAGEN) 10 evidenciou um aumento de 216 % entre a produção de CP12 e HCP12, e de 954 % entre a produção de CP12 e Fh8CP12. - IL5: A interleucina 5 humana é um factor de crescimento hematopoiético, possuindo uma sequência nucleotidica de 816 pb que codificam para 134 aminoácidos (GenBank n° BC069137.1). O fragmento IL5 usado para avaliação corresponde a uma pequena parte da IL5, constituída por 144 pb correspondendo a um exão da extremidade 5' da IL5 codificando para 48 aminoácidos. O fragmento foi amplificado por PCR e subclonado no vector pQE (IL5), foram igualmente preparadas construções contendo o fragmento H seguido do IL5 (HIL5 - SEQ ID No 9), e contendo a sequência do Fh8 fusionada com a sequência do IL5 (Fh8lL5 - SEQ ID No 12). A análise da produção dos antigénios recombinantes isolados em condições desnaturantes usando resina de NiNTA agarose (QIAGEN) evidenciou um aumento de 610 % entre a produção de IL5 e HIL5, e de 1600 % entre a produção de IL5 e Fh8IL5. - TgOWP - A proteína TgOWP é uma proteína da parede do oocisto do Toxoplasma gondii com 1846 pb que codificam para 499 aminoácidos (GenBank n° EU851867.1). O fragmento TgOWP corresponde ao 2° exão, compreendido entre as pb 2875 e 3238. 0 fragmento foi amplificado por PCR e subclonado no vector pQE (TgOWP), foi igualmente preparada a construção contendo o fragmento H seguido do TgOWP (HTgOWP - SEQ ID No 10). A análise da produção dos antigénios recombinantes isolados em condições desnaturantes usando resina de NiNTA agarose (QIAGEN) evidenciou um aumento de 575 % a produção de TgOWP e HTgOWP. 11

Nos 3 exemplos supracitados os níveis de produção passaram de níveis compatíveis com a sua expressão em corpos de inclusão para níveis de produção correspondentes a proteínas solúveis, pelo que se pode afirmar que a colocação de fragmentos H ou de proteínas de ligação ao cálcio excretadas/secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática permite aumentar muito significativamente a produção de proteína recombinante, provavelmente aumentando a solubilidade do antigénio produzido.

Caracterização dos antigénios Fh8 e Fh22 e respectivos fragmentos H:

Os antigénios Fh8 e Fh22 foram isolados e caracterizados previamente por elementos constando na lista de inventores (Castro, 2001, Silva et al., 2004, Eguino et al., 1999) procedendo-se de seguida a uma descrição resumida dos antigénios.

Foi efectuado o isolamento de clones de cDNA codificando para um polipéptido de 69 aminoácidos com uma massa molecular calculada de 8 kDa, o qual foi designado por Fh8 ou fasciolina (Genbank number AF213970). O polipéptido tem como principal característica a existência de dois potenciais motivos de ligação ao cálcio (EF-hand). Os resultados obtidos (Castro, 2001) permitiram demonstrar que o Fh8 é um antigénio presente nos produtos de excreção/secreção (ESP) de verme adulto de F. hepatica podendo aparecer sob a forma de polímeros. 12

Para fins de caracterização e análise da actividade da Fh8, assim como do potencial interesse diagnóstico, procedeu-se à obtenção de um antigénio recombinante, rFh8, contendo a sequência correspondente ao Fh8.

Para fins de investigação, o fragmento correspondente ao Fh8 foi subclonado no vector de expressão em Escherichia coli pQE (Qiagen). A produção da proteína recombinante rFh8 expressando na sua sequência N-terminal uma sequência de 6 histidinas foi realizada na E. coli M15(pREP4) (Qiagen) e isolada por cromatografia de afinidade com uma coluna de NiNTA agarose (Qiagen), com base nos protocolos fornecidos pelo fabricante (Castro, 2001; Silva et ai., 2004). Vários clones de cDNA isolados codificavam para proteínas de ligação ao cálcio com elevada homologia. Estes clones foram subclonados e analisados verificando-se que alguns deles tinham "inserts" idênticos (EMBL número AJ003822), contendo um ORF correspondente a um péptido de 191 aminoácidos com um peso molecular calculado de 22 kDa, que foi designada por Fh22-1. Outro clone continha um "insert" com um ORF para uma proteína com elevada homologia com a anterior que será caracterizada posteriormente e foi designada Fh22-2 (EMBL número AJ003821). A Fh22 é uma proteína de ligação ao cálcio com 4 estruturas EF-hands que foi descrita como sendo um componente do ESP de vermes adultos de F. hepatica (Eguino et al, 1999). Estes antigénios foram subclonados e produzidos no vector de expressão pQE. A caracterização dos antigénios Fh8 e Fh22 demonstrou a existência nos ESP de um conjunto de proteínas com 13 características estruturais semelhantes. Assim, este conjunto de antigénios é caracterizado pela presença de EF-hands, estruturas de ligação ao cálcio que condicionam toda o folding dos mesmos, sendo provavelmente a causa da estabilidade tanto da proteína nativa como dos antigénios recombinantes produzidos em E. coli. Ambas as proteínas recombinantes são produzidas a níveis superiores a 6 mg/L de cultura e ambas as proteínas demonstraram ser produzidas de forma solúvel no citoplasma de E.coli.

Os resultados obtidos com base nas mutações dirigidas efectuadas a nível do Fh8 mostram que os níveis de produção observados em E. coli estão dependentes de elementos estruturais que não as EF-hands, uma vez que os níveis de proteína recombinante mutadas nas EF-hands (impossibilitando a ligação ao cálcio) isoladas não se alteram significativamente. Estes dados sugerem a existência de outras estruturas na proteína que garantam essa estabilidade. A estrutura tridimensional do Fh8 veio demonstrar que, com excepção de pequenas sequências nas extremidades N-terminal (11 a.a) e C-terminal (6 a.a.), toda a restante sequência está envolvida ou comprometida (formação de centro activo) pela estrutura resultante da ligação do cálcio às EF-hands. Assim estes estudos levaram à identificação da sequência N-terminal do Fh8 (posteriormente designada por sequência H) como tendo um papel essencial na estabilidade e produção do Fh8.

Para a proteína Fh22, a disposição dos motivos HLH (a estrutura EF-hand, helix-loop-helix -HLH), é semelhante à do Fh8, e tal como no Fh8, com excepção das sequências N e C-terminal, a restante proteína está envolvida nas estruturas de ligação ao cálcio ou comprometidas pelas mesmas. 14

Os fragmentos e construções foram subclonados no vector de expressão em Escherichia coli pQE (Qiagen) . A produção da proteína recombinante rFh8 expressando na sua sequência N-terminal uma sequência de 6 histidinas foi realizada na E. coli M15(pREP4) (Qiagen) e isolada por cromatografia de afinidade com uma coluna de NiNTA agarose (Qiagen), com base nos protocolos fornecidos pelo fabricante (Castro, 2001; Silva et al.r 2004). Para a produção e isolamento do antigénio poderá ser usado qualquer sistema de expressão e isolamento de proteína recombinante.

Estirpes usadas

Neste trabalho foram utilizadas as estirpes Escherichia coli XLl Blue (Stratagene) e Escherichia coli Ml5 [pREP4] (QIAGEN) para a clonagem dos plasmídeos pGEM-T Easy (Promega) e dos plasmídeos pQE30 e pQE32 (QIAGEN), respectivamente.

Para a expressão proteica utilizou-se a estirpe Escherichia coli Ml5 [pREP4]. O DNA plasmídico foi isolado e purificado através do kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System da Promega, a partir de culturas bacterianas crescidas a 37 °C, durante a noite, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.

Construções O esquema das construções realizadas para avaliar o antigénio recombinante Fh8 e seu elemento estrutural de 11 aminoácidos (fragmento H) no aumento da expressão de proteínas recombinantes encontra-se na Figura 1. 15

Todas as construções apresentadas na Figura 1 foram obtidas por reacção de polimerase em cadeia (PCR) e clonadas em pGEM e posteriormente em pQE, tal como é indicado seguidamente.

PCR

Os primers usados nos PCR estão descritos na Tabela 1.

Para obtenção do fragmento H e do fragmento Fh8RSac, contendo os locais de restrição BamHI e Saci, usou-se como molde, para a reacção de PCR, o vector pQE30 contendo o gene codificando para o polipéptido Fh8 (Castro, 2001; Silva et al. , 2004). A reacção de PCR teve início com um passo de desnaturação de 1 minuto a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação, com 45 segundos de desnaturação a 94 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 45 segundos de polimerização a 72 °C. Realizou-se um passo adicional de polimerização durante 11 minutos a 72 °C.

Os fragmentos escolhidos (CP12, IL5 e TgOWP) para avaliar a capacidade do antigénio recombinante (e parte deste) de produzir um efeito positivo na expressão proteica foram obtidos e amplificados por PCR. Nesta reacção de PCR também se adicionaram os locais de corte das enzimas de restrição Saci e Kpnl aos respectivos fragmentos.

Tabela 1. Lista das construções efectuadas, moldes de DNA, primers usados e respectivo programa de PCR

Objectivo Mostra de DNA usado como molde Identificação e sequência dos primers usados Programa de PCR Obtenção do framento H DNA plasmídico - vector pQE30 contendo a sequência de DNA codificando para o polipéptido Fh8 HBamSac : 5'-G A T C C A T G C CTAGTGTTCAAGAGGT TGAAAAACTCCTTGAG C T C C A T G-31 Fh8Rev: 5'-G T T C A C A T A A TACACAATGGTACCCT A-3' 1 min. a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (45 s a 94 °C, 30 s a 50 °C e 45 s a 72 °C). 11 min, a 72 °C Obtenção do Fh8RSac DNA plasmídico - vector pQE30 contendo a sequência de DNA codificando para o polipéptido Fh8 HFwd: 5'-G G A T C C A T G C C T A G T G T T C A A-3' Fh8RSac: 5'-G T T C A C A T A A TACACAATCTGGAGCT CIGATGACAAAATC-3' 1 min, a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (45 s a 94 °C, 30 s a 50 °C e 45 s a 72 °C), 11 min, a 72 °C Obtenção do Fragmento CP12 DNA genómico de Cryptosporidm pârvum CPl2Fwd: 5'-C A T A C T G G T A TGAGCTCGAAGGAGTA C -3' CPl2Rev: 5’-C A I T A A A A G G TACCTTTCATTATCAA G-31 4 min, a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 50 °C e 1 min a 72 °C). 7 min. a 72 °C

Obtenção do Fragmento IL5 DNA genómico humano IL5Fwd: 5'-T T C A G A G C C G AGCTCATGAGGATGC-3' IL5Rev: 5'-A A G A A A A T T A CGGTACCTTACTCATT G G C-3' 4 min, a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 50 °C e 45 s a 72 °C). 7 min, a 72 °C Obtenção do Fragmento TgOWP DNA genómico de Toxoplasm gondii TgOWPJacI: 5'-T G T G C C I G I G T G A G C T C C C I C C I G T G-3' TgOWPJpnl: 5'-T G A T G C G C GGTACCCTAGGGAACG A C-3' 4 min, a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 50 °C e 1 min a 72 °C). 7 min. a 72 °C Obtenção do fragmento HCP12 Ligação entre o produto de PCR correspondente ao fragmento H digerido com Sac I e o produto de PCR correspondente ao fragmento CP12 digerido com Sac I HFwd: 5’-G G A T C C A T G C C TAGTGTTCAA-31 CPl2Rev: 5’-C A T T A A A A G G TACCTTTCATTATCAA G-31 4 min. a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 45 s a 72 °C). 7 min. a 72 °C Obtenção do fragmento HIL5 Ligação entre o produto de PCR correspondente ao fragmento H digerido com Sac I e o produto de PCR correspondente ao fragmento IL5 digerido com Sac I HFwd: 5’-G G A T C C A T G C C T A G I G T T C A A-31 IL5Rev: 5'-A A G A A A A T T A CGGTACCTTACTCATT G G C-3' 4 min. a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 45 s a 72 °C). 7 min. a 72 °C

Obtenção do fragmento HTgOWP Ligação entre o produto de PCR correspondente ao fragmento H digerido coi Sac I e o produto de PCR correspondente ao fragmento TgOfP digerido com Sac I HFwd: 5'-G G A T C C A T G C C T A G T G T T C A A-3' TgOWPJpnl: 5'-T G A T G C G C GGTACCCTAGGGAACG A C-3' 4 min. a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 45 s a 72 °C). 7 min, a 72 °C Obtenção do fragmento Fh8CP12 Ligação entre o produto de PCR correspondente ao fragmento FhSRSac digerido com Sac I e o produto de PCR correspondente ao fragmento CP12 digerido com Sac I HFwd: 5'-G G A T C C A T G C C T A G T G I I C A A-3' CPl2Rev: 5'-C A T T A A A A G G IACCTTTCATTATCAA G-31 4 min. a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 1 min. a 72 °C). 7 min. a 72 °C Obtenção do fragmento Fh8lL5 Ligação entre o produto de PCR correspondente ao fragmento Fh8RSac digerido com Sac I e o produto de PCR correspondente ao fragmento IL5 digerido com Sac I HFwd: 5'-G G A T C C A T G C C I A G T G T T C A A-3' ILSRev: 5'-A A G A A A A T T A CGGTACCTTACTCATT G G C-3' 4 min. a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 1 min. a 72 °C). 7 min. a 72 °C 8 Τ 19 A reacção de PCR para obter o CP12 foi efectuada usando como molde o DNA genómico do Cryptosporidium parvum, obtido a partir de oocistos deste parasita, usando o kit de extracção de DNA QIAamp DNA mini kit da QIAGEN, seguindo o protocolo do fabricante. A reacção de PCR teve inicio com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 1 minuto de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C. A reacção de PCR para obter o fragmento IL5 foi efectuado usando como molde o DNA genómico do Homo sapiens, obtido a partir de sangue periférico, usando o kit de extracção de DNA QIAamp DNA mini kit da QIAGEN seguindo o protocolo do fabricante. A reacção de PCR teve inicio com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 45 segundos de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C. A reacção de PCR para obter o TgOWP foi efectuado usando como molde o DNA genómico do Toxoplasma gondii, obtido a partir de uma cultura de trofozoitos deste parasita, usando o kit de extracção de DNA QIAamp DNA mini kit da QIAGEN seguindo o protocolo do fabricante. A reacção de PCR teve inicio com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 1 minuto de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C. 20

Para as construções com o fragmento H e os fragmentos CP12, IL5 ou TgOWP usamos como molde a ligação entre o fragmento H digerido com a enzima de restrição Saci e o fragmento alvo digerido com a mesma enzima de restrição.

Para as construções com o fragmento Fh8RSac com os fragmentos CP12 e IL5 usamos como molde a ligação entre o fragmento Fh8RSac digerido com a enzima de restrição Saci e o fragmento alvo digerido com a mesma enzima de restrição. O programa de PCR usado na obtenção das construções com o fragmento H (nomeadamente HCP12, HIL5 e HTgOWP) teve inicio com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 55 °C e 45 segundos de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C. O programa de PCR usado na obtenção das construções com o antigénio recombinante Fh8RSac, nomeadamente Fh8CP12 e Fh8lL5, teve inicio com um passo de desnaturação durante 4 minutos a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 55 °C e 1 minuto de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C. O termociclador usado para todas as reacções de PCR foi o My CyclerTM Thermal Cycler (BioRad). A mistura das reacções de PCR efectuadas era constituída por 1 pL de amostra (molde de DNA) , 2 pL de cloreto de magnésio, 1 pL de dNTPs (Roche), 1 pL do primer forward e 1 pL do primer reverse, 5 pL de tampão da enzima Taq polimerase (Thermo Scientific), 1 unidade/pL da enzima Taq polimerase (Thermo Scientific) e água destilada até completar um volume final de 50 pL. 21

Extracção e purificação de DNA a partir dos géis de agarose

Para isolar em gel de agarose os produtos de PCR ou bandas de DNA resultantes de digestões com enzimas de restrição, utilizou-se o illustraTM GFX PCR DNA & Gel Band Purification kit (GE Healthcare) , pelo procedimento seguidamente descrito.

Ligação ao vector pGEM A reacção de ligação ao vector pGEM-T Easy deu-se através da mistura de 3 pL da amostra de DNA (produto de PCR ou de digestões com enzimas de restrição), com 1 pL do vector pGEM-T Easy (Promega) , 5 pL de tampão da enzima DNA ligase 2X (Promega) e com 1 pL de enzima DNA T4 Ligase (Promega) , perfazendo um volume final de 10 pL. Esta reacção ocorreu à temperatura ambiente, durante a noite ou durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C.

Confirmação dos transformantes por digestão com enzimas de restrição

Após a reacção de ligação ao vector pGEM, transformou-se E. coli XLl Blue com o produto da ligação. As células foram depois espalhadas em placas de LB/Ampicilina/X-Gal/IPTG e incubadas durante a noite a 37 °C. Os transformantes que apresentavam cor branca foram repicados para culturas liquidas de LB/Ampicilina e, posteriormente, fez-se a extracção do DNA plasmídico a partir de E. coli.

A confirmação dos transformantes foi realizada por digestão com a enzima de restrição EcoRI (Promega), tendo-se utilizado 7 pL dos clones seleccionados, 2 pL de tampão H 10X e 1 pL de EcoRI, perfazendo um volume final de 10 pL. A 22 reacção ocorreu durante 2 a 3 horas, a 37 °C, tendo-se visualizado o resultado da digestão num gel de agarose com percentagem (p/v) apropriada.

Ligação ao vector pQE

Os inserts resultantes das digestões com enzimas de restrição, realizadas neste trabalho, foram inseridos no vector pQE através da mistura de 6 pL de insert com 2 pL de vector pQE, 1 pL de tampão ligase 10X (Promega) e 1 pL da enzima DNA T4 Ligase (Promega). Esta reacção ocorreu à temperatura ambiente, durante a noite ou durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C.

Após a ligação do insert ao vector pQE, transformou-se E. coli Ml5 [pREP4] com o produto da ligação. As células foram depois espalhadas em placas de LB/Ampicilina/Kanamicina e incubadas durante a noite a 37 °C. Os transformantes obtidos foram repicados para culturas líquidas de LB/Ampicilina/Kanamicina e, posteriormente, fez-se a extracção do DNA plasmídico a partir de E. coli. A confirmação dos transformantes foi realizada por digestão com as enzimas de restrição Kpnl e BamHI (Promega), quer no caso dos controlos negativos da avaliação da expressão proteica, pQECP12, pQEIL5 e pQETgOWP, quer no caso das construções com o antigénio recombinante Fh8 ou com o fragmento H.

Em primeiro, realizou-se a digestão com Kpnl, misturando 26 pL de DNA, 3 pL de tampão J (Promega) e 1 pL de Kpnl (Promega), perfazendo um volume final de 30 pL. Analisou-se 10 pL desta digestão em gel de agarose e procedeu-se à segunda digestão dos 20 pL resultantes com BamHI, na qual 23 de misturou 2 pL de tampão K 10X (Promega) e 1 pL de BamHI (Promega). O resultado da digestão foi visualizado em gel de agarose com percentagem (p/v) apropriada.

Sequenciação das construções realizadas

Todas as construções realizadas, com as inserções nos vectores pGEM e pQE, foram confirmadas por sequenciação na Eurofins MWG Operon (Alemanha).

Análise da expressão das construções com o antigénio recombinante/fragmento H, em condições desnaturantes

Procedeu-se à preparação de uma pré-cultura de 200 ml que se colocou a crescer durante a noite a 37 °C com agitação e induziu-se 2 litros de cultura colocando 100 ml da cultura saturada e 900 ml de meio LB contendo 100 pg/ml de Ampicilina, 50 pg/ml de Kanamicina e 1 mM de IPTG. Após 5 horas de incubação procedeu-se à recolha das células centrifugando 20 minutos a 4000 rpm a 4 °C. A lise celular deu-se por incubação das células com 40 mL de tampão ureia 8 M, pH 8.0, deixando-se em agitação durante a noite. Centrifugou-se o extracto a 13000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente e recolheu-se o sobrenadante. Após recuperação do sobrenadante, filtrou-se o mesmo por coluna de lã de vidro e aplicou-se na coluna de Ni-NTA (Amersham Biosciences), pré-equilibrada com ureia 8M, pH 8.0.

Depois do sobrenadante ter passado na coluna pela acção da gravidade, esta foi lavada com 5 CV (volumes da coluna) de tampão ureia 8 M, pH 8.0, seguidos de 5 CV de tampão ureia 8 M com 10% de glicerol, pH 6.5. A eluição deu-se com tampão ureia 8 M, pH 4.5, tendo-se recolhido fracções de 4 mL. 24

As fracções eluídas foram quantificadas pelo método de Bradford e analisadas em gel de SDS-PAGE Tris-Tricina, tal como se encontra descrito seguidamente.

Quantificação proteica A quantificação proteica foi realizada pelo método de Bradford, com o reagente Protein Assay (BioRad) diluído 1:5, tendo-se lido a densidade óptica a um comprimento de onda de 595 nm. A curva de calibração foi obtida através da leitura da densidade óptica, a 595 nm, de soluções de concentração conhecida da albumina sérica bovina (BSA) com este reagente.

Electroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE Tris-Tricina

Os géis Tris-Tricina usados para analisar as fracções recolhidas basearam-se nos sistemas Tris-Tricina de

Schagger, H. e Jagow, G. (1987) e SDS-PAGE de Laemmli (1970). Desta forma, o sistema adoptado era constituído por dois géis: um gel resolvente de 15 % e um gel de empacotamento de 4 %. 0 gel resolvente continha 3,3 mL de acrilamida 30 %, 2,205 mL de tampão de gel, 705 pL de glicerol, 367,5 pL de água, 150 pL de PSA4 10 % e 9 pL de TEMED. O gel de empacotamento continha 700 pL de acrilamida 30 %, 1,25 mL de tampão de gel, 3 mL de água, 200 pL de PSA 10 % e 5 pL de TEMED. O sistema de electroforese usado era constituído por dois reservatórios, superior (junto dos géis) e inferior, nos quais foi colocado tampão de cátodo e tampão do ânodo, respectivamente. Aplicou-se uma diferença de potencial (ddp) de 100 V para o gel de empacotamento e uma ddp de 150 V para o gel resolvente. 25

As amostras (em condições nativas ou desnaturantes) , antes de serem aplicadas no gel, foram tratadas com tampão de amostra Tris-Tricina IX. As amostras em condições nativas foram ainda colocadas no banho a 100 °C, durante 2 minutos, ficando depois a 4 °C até serem carregadas no gel.

Os géis foram corados com Coomassie Blue e descorados com uma solução descorante.

Exemplos 0 antigénio recombinante em estudo neste trabalho caracteriza-se por apresentar uma boa expressão e pode ser facilmente isolado através de cromatografia de troca iónica.

As estratégias apresentadas de seguida tiveram como ponto de partida estas premissas, escolhendo-se três fragmentos (IL5, CP12 e TgOWP) para avaliar o aumento de expressão com a adição do fragmento H ou da proteína contendo este fragmento.

Exemplo 1 - Obtenção das construções HCP12 e HIL5

Para a obtenção destas construções procedeu-se numa primeira fase à obtenção do fragmento H. Procedeu-se à realização de um PCR com os primers H e Fh8Rev (ver Tabela 1). O primer H permite a incorporação de um local para digestão da Saci após o codão do 11 aminoácido do Fh8. Esse produto de PCR foi isolado e digerido com a enzima de restrição Saci. Procedeu-se então ao isolamento do fragmento N-terminal digerido com Saci (fragmento H). 26

Numa segunda fase procedeu-se à amplificação dos fragmentos IL5 (primers IL5Sac e IL5Kpn) e CP12 (primers CP12Sac e CP12Kpn) usando como moldes, respectivamente, DNA genómico (DNAg) humano e DNAg de Cryptosporidium parvum isolados. Após isolamento dos produtos de PCR procedeu-se à digestão com Saci e respectivo isolamento dos fragmentos digeridos com Sac.

Procedeu-se à preparação de ligações entre o fragmento H digerido com Sac e os fragmentos IL5 e CP12 digeridos com Saci. Procedeu-se de seguida à obtenção do fragmento HIL5 por PCR usando como molde essa ligação e como primers: Primer H e primer IL5Kpn. Para a obtenção do fragmento HCP12 procedeu-se de forma semelhante usando o primer H e o primer CP12 Kpn. Estes fragmentos foram subclonados no vector pQE30 usando as enzimas de restrição BamHI e Kpnl.

Exemplo 2- Obtenção da construção HTgOWP:

Para a obtenção de HTgOWP, digeriu-se o vector pQEHCP12 com Kpnl e Saci, removendo desta forma o fragmento CP12 do vector, ficando com pQE30 H. 0 fragmento TgOWP foi produzido por PCR, usando como sequência molde DNAg de Toxoplasma gondii e os primers

TgOWPSac e o primer TgOWPKpn. A reacção de PCR possibilitou a adição dos locais de restrição das enzimas Saci e Kpnl à sequência molde de DNA de TgOWP. Este produto foi então purificado em gel de agarose e ligado ao vector pGEM. Procedeu-se então à digestão com as enzimas de restrição Kpnl e Saci e isolamento do fragmento TgOWP digerido com Saci e Kpnl. 27

Este fragmento foi ligado ao vector pQE30H digerido com Saci e Kpnl de forma a obter-se a construção pQEHTgOWP.

Exemplo 3 - Obtenção das construções pQECPl2, pQEIL5 e pQETgOWP:

Os vectores contendo o fragmento H (pQEHCP12, pQEHIL5 e pQEHTgOWP) foram usados para a construção dos respectivos controlos negativos. Sendo assim, usou-se os fragmentos HCP12, HIL5 e HTgOWP como ponto de partida para a obtenção dos controlos negativos.

Como se procedeu da mesma forma para os três vectores, apresenta-se de seguida o exemplo de obtenção do vector recombinante pQECP12.0 vector pQEHCP12 foi digerido com a enzima Saci e posteriormente purificado em gel de agarose. Depois de purificado, o vector pQEHCP12 foi também digerido com a enzima de restrição EcoRI, presente na sequência do vector pQE30. Esta digestão permitiu a remoção do fragmento H e de uma pequena parte do vector pQE30. Procedeu-se à purificação em gel de agarose dos vectores pQEHCP12, PQEHIL5 e pQEHTgOWP digeridos com as enzimas de restrição Saci e EcoRI para posteriormente receberem um fragmento da digestão do vector pQE30 vazio. Para tal, foi necessário proceder à digestão deste vector com as mesmas enzimas de restrição, Saci e EcoRI. A banda de menor peso molecular obtida, que correspondia à pequena parte do vector pQE30 entre os locais de restrição de EcoRI a Saci (cerca de 70 pb) foi purificada em gel de agarose e ligada ao pQE30 com o fragmento CP12 obtido anteriormente, de modo a formar o vector pQECP12. O vector pQECP12 foi depois transformado em E. coli Ml5 [pREP4]. 28

Exemplo 4- Obtenção das construções pQEFh8CPl2 e pQEFh8lL5: Obtenção do fragmento Fh8RSac. 0 fragmento Fh8RSac foi obtido a partir da alteração por PCR de uma sequência molde de Fh8 e usando os primers Fh8For e Fh8RSac, onde se adicionou o local de restrição da enzima Saci antes do codão de terminação do Fh8. 0 produto da reacção de PCR foi depois purificado em gel de agarose e ligado ao vector pGEM. 0 produto de PCR obtido foi então digerido com a enzima de restrição Saci, tendo-se obtido um fragmento Fh8RSac digerido com a enzima Saci. Este fragmento foi posteriormente purificado através de um gel de agarose e utilizado para fazer a ligação aos fragmentos CP12 e IL5 digeridos com a enzima Saci.

Obtenção dos fragmentos Fh8CPl2 e Fh8lL5

Tal como já foi referido anteriormente, os fragmentos CP12 e IL5 foram obtidos por uma estratégia semelhante, a partir de uma reacção de PCR, na qual se adicionaram os locais de restrição de Saci e Kpnl. Após a amplificação de IL5 ou CP12, estes fragmentos foram digeridos com a enzima de restrição Saci e ligados ao fragmento Fh8RSac, também previamente digerido com Saci. Procedeu-se de seguida à obtenção do fragmento Fh8CP12 usando a ligação Fh8CP12 como molde e os primers Fh8For e CP12Kpn. De igual modo procedeu-se à obtenção do fragmento Fh8lL5 usando a ligação Fh8lL5 como molde e os primers Fh8For e IL5Kpn.Procedeu-se ao isolamento dos fragmentos de PCR e subclonagem inicialmente no vector pGEM e posteriormente no vector pQE. 29

Análise da expressão do antigénio recombinante através da coluna de Ni-NTA, em condições desnaturantes.

As proteínas IL5 (SEQ ID No 6), HIL5 (SEQ ID No 9), Fh8lL5 (SEQ ID No 12), CPI2 (SEQ ID No 5), HCP12 (SEQ ID No 8), Fh8CPl2 (SEQ ID No 11), TgOWP (SEQ ID No 7)e HTgOWP (SEQ ID No 10), foram expressas em E. coli Ml5 [pREP4], tendo-se feita a sua avaliação em culturas de 2 L com meio LB e respectivos antibióticos. As proteínas IL5, CP12 e TgOWP foram usadas como controlo negativo da análise da expressão proteica das respectivas proteínas de fusão. Todas as culturas foram induzidas com 1 mM de IPTG durante 5 horas, a 37 °C, tendo-se preparado os extractos celulares e analisado as fracções solúveis em condições desnaturantes (ureia 8 M) através de colunas de Ni-NTA (Amersham Biosciences). A expressão das proteínas de fusão e dos respectivos controlos negativos foi quantificada pelo método de Bradford e avaliada em géis de SDS-PAGE Tris-Tricina.

Quantificação da expressão proteica. A quantificação da expressão proteica foi efectuada pelo método de Bradford, encontrando-se apresentados nas Figuras 2,3 e 4, os níveis de expressão proteica entre as proteínas de fusão, HIL5 e HCP12 - Fh8CP12 e Fh8lL5, e respectivos negativos, IL5 e CP12. A expressão de HIL5 (1,22 mg/L) foi aproximadamente 6 vezes superior à do respectivo controlo negativo, IL5 (0,2 mg/L). Este aumento tornou-se ainda mais significativo no caso da fusão de IL5 com o Fh8, onde a expressão (3,2 mg/L) foi 30 aproximadamente 16 vezes superior à obtida para o respectivo controlo negativo, IL5. A fusão de CP12 com o fragmento H do antigénio recombinante (1,21 mg/L) resultou numa expressão proteica 3 vezes maior do que a expressão obtida com o respectivo controlo negativo, CP12 (0,44 mg/L). Este aumento tornou-se ainda mais significativo no caso da fusão de CP12 com o Fh8, onde a expressão (3,94 mg/L) foi aproximadamente 9 vezes superior à obtida para o respectivo controlo negativo, CP12. A proteína de fusão Fh8CP12 apresentou uma expressão proteica 3 vezes maior que a proteína de fusão HCP12.

As proteínas que serviram de controlo negativo, IL5 e CP12, são proteínas que em condições normais (sem adição de parte ou totalidade do antigénio recombinante) não são produzidas de forma solúvel em E. coli, podendo ser dirigidas para corpos de inclusão aquando do seu refolding (Proudfoot et al., 1990; Yao et al., 2006).

Para além disso, as sequências usadas neste trabalho correspondem a uma pequena parte das proteínas IL5 e CP12, tornando ainda mais difícil a sua estabilização aquando do refolding das mesmas. Os valores de expressão obtidos para estas proteínas encontram-se abaixo do limite de solubilidade (normalmente entre 0,5 a 1 mg/L), realçando a difícil expressão solúvel. A adição do fragmento H ou da totalidade do antigénio recombinante estabiliza os fragmentos de IL5 e CPI 2 e provoca um aumento da sua expressão. Mais impressionante que esse aumento de expressão, são as alterações que 31 ocorrem ao nível da célula que levam à passagem de uma estrutura insolúvel para uma outra solúvel. A expressão da proteína de fusão HTgOWP (3,68 mg/L) foi aproximadamente 6 vezes superior à expressão do controlo negativo, TgOWP (0,64 mg/L). Esta proteína possui uma expressão que se situa no limite de solubilidade. No entanto, o que importa salientar é o aumento considerável da expressão introduzido pela adição do fragmento H. Este fragmento, tal como aconteceu com IL5 e CP12, vai estabilizar a proteína, levando à sua produção solúvel. Dado que a produção de TgOWP com a adição do fragmento H atingiu níveis de expressão elevados, não se justifica a necessidade de adição de TgOWP com a sequência do antigénio recombinante (Fh8). A expressão proteica com o antigénio recombinante foi também avaliada por electroforese (Figuras 2, 3 e 4) em condições desnaturantes (SDS-PAGE Tris-Tricina).

Lisboa, 15 de Abril de 2010.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína de fusão caracterizada pelo facto de compreender uma sequência de aminoácidos idêntica ou 90 a 95% estruturalmente semelhante ao fragmento H ou às proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepatica, seguida de uma sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada.

2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o fragmento H corresponder a um fragmento estruturalmente semelhante ao N-terminal de 11 aminoácidos da proteína Fh8,SEQ ID NO 2.

3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o fragmento H corresponder ao fragmento estruturalmente semelhante ao N-terminal de 20 aminoácidos da proteína Fh22, SEQ ID NO 4.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a uma proteína de ligação ao cálcio ser estruturalmente semelhante à excretada-secretada pelo verme adulto de Fasciola hepatica ser de Fh8, SEQ ID NO 1.

5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a uma proteína de ligação ao cálcio ser estruturalmente semelhante à excretada-secretada pelo verme adulto de Fasciola hepatica ser de Fh22, SEQ ID NO 3). 2

6. Proteína de fusão de acordo com as reivindicações anteriores caracterizada por a adição dos marcadores de fusão à proteína não relacionada ser feita na posição N ou C-terminal.

7. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada ser de CP12.

8. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada ser de IL5.

9. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada ser de TgOWP.

10. Um vector de expressão caracterizado pelo facto de compreender uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

11. Uma célula hospedeira caracterizada pelo facto de compreender o vector de expressão de acordo com a reivindicação 10.

12. Um processo para a preparação de proteínas de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se cultivar uma célula 3 hospedeira de acordo com a reivindicação 11 em condições apropriadas à expressão da proteína de fusão e se isolar a proteína de fusão.

13. Utilização da proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizada por ser utilizada para a produção de proteínas ou fragmentos proteicos adicionados em sistemas de expressão de proteínas recombinantes.

14. Utilização de um fragmento H ou proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepatica caracterizada por ser utilizada para a produção de proteínas recombinantes. Lisboa, 15 de Dezembro de 2009.