PT104607B

PT104607B - Derivados triterpenóides úteis como agentes antiproliferativos

Info

Publication number: PT104607B
Application number: PT104607A
Authority: PT
Inventors: Jorge Antonio Ribeiro Salvador; Rita Catarina Mendes Dos Santos; Marta Cascante Serratosa
Original assignee: Univ De Coimbra
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2012-03-23
Also published as: US8969395B2; WO2010134830A1; PT104607A; US20120129901A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AO USO DE NOVOS DERIVADOS LUPANOS DE FÓRMULA GERAL (I) E (II), OU DOS SEUS SAIS, CRISTAIS, COMPLEXOS, HIDRATOS, OU ÉSTERES FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS POSTERIORMENTE HIDROLISÁVEIS, PARA PREVENIR E/OU INIBIR O CRESCIMENTO DE TUMORES E PARA TRATAR O CANCRO OU OUTRAS DOENÇAS PROLIFERATIVAS, PARTICULARMENTE PARA TRATAR LEUCEMIA, CANCRO DO FÍGADO, DO COLO DO ÚTERO, DO CÓLON E DA PRÓSTATA. A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE AINDA A SÍNTESE DESTES DERIVADOS E AS FÓRMULAS FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM.

Description

DESCRIÇÃO

DERIVADOS TRITERPENÓIDES ÚTEIS COMO AGENTES ΑΝΤΙPROLIFERATIVOS

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à síntese de novos derivados da betulina e do ácido betulínico. Esta invenção refere-se também ao tratamento do cancro, baseando-se na descoberta de que estes novos derivados da betulina e do ácido betulínico são agentes antitumorais potentes.

Antecedentes da Invenção

Actualmente o cancro é a segunda causa de morte nos países desenvolvidos e em fase de desenvolvimento. Todos os anos, o cancro é responsável pela morte de cerca de seis milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar de importantes avanços no que diz respeito à eficácia da quimioterapia e de outras formas de tratamento, a taxa de mortalidade para a maioria dos tipos de cancro continua a ser muito elevada. Adicionalmente, os efeitos tóxicos que resultam da utilização dos fármacos quimioterapêuticos reduzem severamente a qualidade de vida dos pacientes. Por conseguinte, existe um esforço contínuo, por parte de vários grupos de investigação, para o desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos mais potentes e menos tóxicos.

Muitos dos compostos naturais derivados das plantas, como por exemplo, os triterpenos (betulina e ácido betulínico) demonstraram actividade anticancerígena efectiva (Setzer, W.N. and Setzer, M.C., Mini-Rev. Med. Chem. 3:540-556, 2003 and Kinghorn, A. D. et al. , Planta Med.,

70:691-705, 2004). A betulina está presente, em grande quantidade, no súber de várias espécies de bétulas. Por exemplo, o súber da Bétula paparlfera contem cerca de 5 a 18% de betulina (U.S. Pat. No. 09/371298). O ácido betulínico também pode ser obtido a partir de fontes naturais U.S. Pats. Nos. 6, 264,998, 6, 175, 035 and 6, 943, 260 and WO

03/066659) ou por via sintética, a partir da betulina. Pezzuto, J.M. e os seus colaboradores, (U.S. Pat. No. 5,804,575) descreveram dois processos de síntese do ácido betulínico a partir da betulina. Krasutsky, P.A. e os seus colaboradores., (U.S. Pat. No. 6,232,481) descreveram um outro processo para a síntese deste triterpenoíde, envolvendo vários passos. Finalmente Menard, H. e os seus colaboradores (WO 2006/063464) reportaram a síntese do ácido betulínico a partir da betulina por intermédio de uma reacção de oxidação electroquímica. Tanto a betulina como o ácido betulínico apresentaram actividade biológica diversificada, incluindo actividade antiinflamatória, antiviral, antimalárica, anticancerígena, anti-séptica, antimicrobiana e antialimentar (Dzubak, P. et al., Nat. Prod. Rep., 23:294-311, 2006 and Tolstikova, T. G. et al., Russ. J. Bioorg. Chem., 32:37-49, 2006). Entre todas as actividades referidas, o ácido betulínico, apresentou particularmente actividade anticancerígena e antiviral (WO 98/51294, U.S. Pat. No. 5,869,535, US 2006/0159783, WO 96/39033 and U.S. Pat. No. 5,679,828).

Inicialmente o ácido betulínico foi considerado como um agente citotóxico especifico para o melanoma. Pisha, E. e seus colaboradores., (Nat. Med., 1:1046-1051, 1995) reportaram a actividade antitumoral selectiva do ácido betulínico em células de melanoma humano MEL-1, MEL2, e MEL-4 e confirmaram esta actividade realizando estudos in vivo em ratos atímicos. DasGupta, T. K. e os seus colaboradores e Pezzuto, J. M e seus colaboradores, (WO 96/29068 and U.S. Pat. No. 5,962,527) também descreveram a utilidade do ácido betulínico e dos seus derivados para o controlo selectivo no tratamento de melanoma humano. No entanto, estudos mais recentes indicaram que o ácido betulínico possui um largo espectro de actividade anticancerígena contra outras linhas celulares de cancro. Ramadoss, S. e os seus colaboradores (U.S. Pat. No. 6,048,847) reportaram, pela primeira vez, a actividade do ácido betulínico e dos seus derivados no tratamento da leucemia, de linfomas, de cancro da próstata e do pulmão. Debatin, K. M. e os seus colaboradores. (U.S. Pat. No. 6,369,109) descreveram a actividade antiproliferativa do ácido betulínico e derivados em células de neuroblastoma e finalmente Mukherjee, R.

e seus colaboradores (US

2006/0159783) reportaram a actividade anticancerígena do ácido betulínico contra células do estômago, mama, pulmão, colo do útero, cavidade oral, laringe, fígado, rim, cancro do colón, ovário, próstata, bexiga, células endoteliais, glioblastoma, leucemia e mieloma, usando um extracto vegetal com uma elevada percentagem deste triterpenoíde.

mecanismo molecular de acção do ácido betulínico nas células cancerígenas continua sob investigação. No entanto, este triterpenoíde parece actuar por provocação da apoptose via activação de caspases, de um modo independente do estado do gene p53 e da activação do receptor CD95, (Fulda, S. et al. , Câncer Res., 57:49564964, 1997 and Wick, W. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 289:1306-1312, 1999), originando um efeito directo na mitocôndria (Fulda, S. et al. , J. Biol. Chem., 273:3394233948, 1998). A capacidade de provocar a apoptose, a aparente ausência de actividade citotóxica nas células normais (Zuco, V. et al., Câncer Lett., 175:17-25, 2002), e o índice terapêutico favorável, fazem do ácido betulínico um agente anticancerígeno atractivo e promissor (Eiznhamer, D. A. and Xu, Z.-Q., IDrugs, 7:359-373, 2004).

Nos últimos anos, verificou-se um grande interesse da síntese e avaliação biológica de novos derivados da betulina e do ácido betulínico. A estrutura base destes triterpenoides é constituída por um esqueleto de 30 carbonos, com três posições susceptiveis de sofrerem modificações químicas simples, C-3, C-20 e C-28.

As modificações da estrutura base destes compostos, nestas posições, podem originar derivados potencialmente mais activos que os substratos de partida e que poderão ser desenvolvidos como fármacos antitumorais. 0 uso da betulina, do ácido betulínico e dos seus derivados na prevenção e tratamento do cancro, encontra-se descrito nas patentes US 2002/0652352, US 2006/0194774, WO 2007/101873, WO 2007/112043, WO 2008/063318, US 2008/ 0293682, US 2008/0167254, entre outras.

pedido de patente internacional com o número de publicação

WO 2007/112043, atrás referido, descreve uma família de compostos através de uma fórmula geral, relativamente aos quais não se pode prever qual a actividade antitumoral, visto haver inúmeros compostos incluídos no âmbito dessa fórmula que não possuem qualquer actividade antitumoral significativa.

documento

Synthesis and

Cytotoxic Activity of

A-ring

Modified

Betulinic

Acid

Derivatives, Bioorganic &

Medicinal

Chemistry Letters actividade citotóxica desses compostos verificando que um número significativo deles não apresenta actividade antitumoral. Também o documento Synthesis and cytotoxicity of 2-cyano-28-hydroxy-lup-l-en-3-onas, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 2168-2171, faz um estudo sobre a actividade citotóxica desses compostos onde se verifica uma grande diversidade dessa actividade, havendo muitos compostos sem actividade significativa em relação a nenhuma das linhas celulares testadas

Apesar de todas as patentes acima referidas, no seu conjunto, descreverem um grande número de derivados da betulina e do ácido betulínico, continua a existir a necessidade de se obterem novos derivados mais activos, clinicamente mais seguros e com propriedades farmacocinéticas melhoradas. Assim, um dos objectivos desta invenção é a síntese de novos derivados da betulina e do ácido betulínico para o tratamento, prevenção, inibição, regulação e/ou modulação do cancro.

Os derivados da betulina e do ácido betulínico contendo azoto na sua estrutura, como por exemplo, os derivados contendo funções amina, oxima, amida, hidrazina e hidrazona, os conjugados com aminoácidos e os derivados com grupos imidazole ou outros N-heterocíclicos, foram reportados como possuindo actividade antiproliferativa em linhas celulares tumorais (U.S. Pat. No. 5, 869, 535, WO 2007/ 101873, WO 2007/112043 and US 2008/0293682). Com o objectivo de obter moléculas não só mais potentes do ponto de vista terapêutico, como também clinicamente aceitáveis, descobrimos que a introdução nas posições C-3 e/ou C-28 da betulina, do ácido betulínico e de outros derivados, de um anel imidazole, 2'-metilimidazole ou triazole, confere aos novos derivados as caracteristicas desejáveis que constituem a base da presente invenção.

Breve descrição das figuras

FIG. 1 representa a estrutura química da betulina e do ácido betulínico.

FIG. 2 representa a síntese e estrutura dos triterpenos e derivados (3, 4, 14-27). Condições reaccionais: (a) CDI, CBMI ou CDT, THF anidro, N2, refluxo durante 5-10 h; (b) CDI ou CDT, THF anidro, N2, refluxo durante 9-10 h; (c) Sílica gel; (d) Anidrido acético, DMAP, THF, temperatura ambiente (rt) durante 12 h; (e) KOH, MeOH, THF, rt durante 17 h; (f) Anidrido acético, imidazole, CHCI3, refluxo durante 2 h.

FIG. 3 representa a síntese e estrutura de outros triterpenos e derivados (5, 28-34). Condições reaccionais: (a) CDI, CBMI ou CDT, THF anidro, N₂, refluxo durante 6-9 h; (b) CH3I, K2CO3, DMF anidro, rt durante 1 h.

FIG. 4 representa a síntese e a estrutura de outros triterpenos e derivados (1, 6-10, 35-43). Condições reaccionais: (a) NBS, CCI4, refluxo durante 3 h; (b) NaOH

- 8 aq. (4N), MeOH, THF, rt durante 29 h; (c) CDI, CBMI ou CDT, THF anidro, N₂, refluxo durante 7-8 h; (d) m-CPBA, CH2CI2, 0-5°C durante 5 h; (e) H2SO4 (2M), 0-5°C, durante 1 h; (f) CDI ou CBMI, THF anidro, N₂, refluxo durante 6-7 h.

FIG. 5 representa a síntese e estructura de outros triterpenos e derivados (11-13, 44-50) Condições reaccionais: (a) CDI ou CBMI, THF anidro, N₂, refluxo durante 7-9 h; (b) DDQ, dioxano, N₂, refluxo durante 15 h; (c) O2, t-BuOK, t-BuOH, 40°C durante 2 h.

FIG. 6 representa o esqueleto básico das fórmulas gerais dos derivados da presente invenção.

FIG. 7 representa um estudo preliminar da actividade antiproliferativa dos diferentes derivados triterpénicos, da presente invenção, em linhas celulares cancerígenas .

FIG. 8 representa os resultados da quantificação, por citometria de fluxo, das células apoptóticas após 72 horas de incubação com os derivados triterpénicos 20, 40 e 46 a concentrações correspondentes ao seu valor de IC50· A percentagem de células em apoptose inicial (barras cinzento escuro) ou em apoptose tardia (barras cinzento claro), para cada uma das condições, é representada como um gráfico de barras, calculado a partir de dot plots.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se a derivados da betulina e do ácido betulinico, às composições farmacêuticas que os contêm, à sua utilização para matar, inibir e/ou prevenir a proliferação de células cancerígenas, ao processo de síntese destes derivados e à avaliação das suas actividades biológicas, utilizando linhas celulares humanas de leucemia (Jurkat), carcinoma hepatocelular (HepG2), adenocarcinoma do cólon (HT-29), adenocarcinoma do colo do útero (HeLa), adenocarcinoma da próstata (PC-3, LNCaP, LAPC4 ) , adenocarcinoma da mama (MCF-7) melanoma (A-370), carcinoma do pâncreas (MIA PaCa-2) e neuroblastoma (SHSY5Y). Estes novos derivados da betulina e do ácido betulinico demonstraram um efeito anticancerígeno de largo espectro, mediado pela inibição do ciclo celular e pelo facto de provocarem a apoptose. A presente invenção fornece também um método para o tratamento de um indivíduo com cancro. Este método compreende a administração de uma dose terapêutica dos derivados da betulina ou do ácido betulinico, numa formulação adequada, com o objectivo de matar, inibir ou prevenir a proliferação celular. Para a preparação da composição farmacêutica utilizam-se preferencialmente diluentes, excipientes e/ou solventes aceitáveis. 0 método descrito na presente invenção será particularmente útil no tratamento de carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do colo do útero, leucemia, adenocarcinoma da próstata e adenocarcinoma do cólon.

Mais especificamente, a presente invenção referese a compostos com a fórmula geral (I) ou (II):

em que, na fórmula I,

Ri, R₂ e R3 têm os significados seguintes:

Compostos	Ri	r₂	r₃
		0
14	OH	ΟΗζΑ'Λν \=J	ch₂=cch₃
15	OH	0 ÇH₃ X I CH₂O N ^XN \=J	ch₂=cch₃
16	OH	0 U N CHjO^N' ^=N	ch₂=cch₃
17	0 O^N^N \=/	0 X CH,0 N ^XN \=J	ch₂=cch₃
18	0 ÇH3 <ΛΛ \=/	0 ÇH₃u I CH₂O N ^XN \=J	ch₂=cch₃

(continuação)

Ri R2 R3

O O

A Ά O N \=N	Jl n οη₂ο©' ^=N	ch₂=cch₃
0	CH₂OH	ch₂=cch₃
\=/ 0 A O N	ch₂oh	ch₂=cch₃
\=N OAc	0 X CH₂O N ^SN	ch₂=cch₃
OAc	\=/ 0 çh₃ A Ã CH₂O N ^XN	ch₂=cch₃
OAc	\=J 0 Jl N ch₂o^x><n^z	ch₂=cch₃
0 Ob^N	\=N CH₂OAc	ch₂=cch₃
\=J 0 ÇH3 O^N ^XN	CH₂OAc	ch₂=cch₃
\=J 0 A A O N A	CH₂OAc	ch₂=cch₃
\=N 0 O^N^N	COOH	ch₂=cch₃
\=J 0 çh₃ ΛΑ	COOH	ch₂=cch₃
\=J 0	0
O-^N^N		ch₂=cch₃
\=J	\=/
0 ch₃	0 ÇH₃
O^N ^XN	DA	ch₂=cch₃
\=J	\=J
0	0
A -^Nx	H. ,Ν_χ
O N	N	ch₂=cch₃
\=N	\=N
0 O-^N^N	COOMe	ch₂=cch₃
\=J 0 ÇH₃	COOMe	ch₂=cch₃
\=/ OH	0 A CH₂O N ^XN	CH₂=CCH₂OMe
OH	\=J O ÇH₃ A Ã CH₂O N ^XN	CH₂=CCH₂OMe
OH	\=J 0 Jl N ch₂o^n^z	CH₂=CCH₂OMe
	\ ' *=N

Compostos	Ri	r₂	r₃
38	0 O^fbN	0 X /X CH₂O N ^XN	CH₂=CCH₂OMe
	\=/	\=/
	o ÇH₃	o ÇH₃
39	o^aA	A X CH₂0 N ^XN	CH₂=CCH₂OMe
	\=/	\=/
	0	0
	X N	X A
40		CH₂O N 5	CH₂=CCH₂OMe
	\=N	\=N
		0
41	OH	ΟΗ-Τγ'γΜν	CH(CH₃)CHO
		\=/
		O ÇH₃
42	OH	A X CH₂O N ^XN	CH(CH₃)CHO
		\=/
	0	0
43	O-^N^N	A /x CH₂O N ^XN	CH(CH₃)CHO
	\=/	\=/
e, na fórmula	(II), R₄,	R₅ θ = têm	os significado
seguintes:
Compostos	r₄	Rs	_
		o ÇH₃
45	H	“A
		\=J
		0
46	H		—
		\=J
		o ÇH₃
47	H	0	_
		\=/
		0
48	OH		_
		\=J
	0	0
49	O-^N^N	‘X-N
	\=/	\=J
	0 ÇH₃
50	cAA	COOH	_
	\=/

s

Outro aspecto da presente invenção é proporcionar um composto de formula (I) ou (II) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, para administração a um indivíduo que sofra de cancro seleccionado a partir do grupo constituído por carcinoma hepatocelular, adenocar13 cinoma do colo do útero, leucemia, adenocarcinoma da próstata e adenocarcinoma colorrectal.

A presente invenção fornece novos derivados da betulina e do ácido betulínico com a formula geral (I) ou (II) que apresentam actividade inibidora da proliferação de células cancerígenas. Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se com a inibição de células tumorais associadas ao carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do colo do útero, leucemia, adenocarcinoma da próstata e adenocarcinoma colorrectal. 0 perfil de citotoxicidade melhorado torna os novos derivados de fórmulas (I) e (II) desta invenção candidatos superiores para o tratamento do cancro.

Adicionalmente, a presente invenção fornece um processo de preparação de novos derivados da betulina e do ácido betulínico com a formula geral (I) e (II), com actividade nas células cancerígenas e com propriedades físicas e químicas que facilitam a sua incorporação em

formulações, que para prevenir cancerígenas.	podem ser ou inibir	administradas a	um indivíduo, de células
o	crescimento
Outro	obj ectivo	da	presente	invenção é

ultrapassar o problema associado à baixa disponibilidade dos agentes anticancerígenos sintéticos, utilizando como substratos a betulina ou o ácido betulínico presentes na Natureza.

Adicionalmente a presente invenção permite ultrapassar o problema da elevada toxicidade em mamíferos associada aos agentes anticancerígenos utilizando derivados de compostos naturais como por exemplo da betulina e do ácido betulínico.

A presente invenção permite também ultrapassar o problema do elevado custo dos agentes anticancerígenos sintéticos, utilizando derivados de produtos naturais, como por exemplo da betulina e do ácido betulínico.

A presente invenção fornece também um método de identificação de um tumor que poderá ser tratado com os derivados sintetizados. Este tratamento compreende o contacto da amostra de células com o composto. Valores de IC50 inferiores ou iguais a 30 μΜ são indicativos de que o tumor poderá ser tratado com os respectivos compostos.

Além disso, a presente invenção fornece um método de administração dos compostos sintetizados a um indivíduo que possui um tipo de cancro seleccionado de um grupo incluindo carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do colo do útero, leucemia, adenocarcinoma da próstata e adenocarcinoma do cólon.

A presente invenção fornece ainda a composição de formulações farmacêuticas que incluem os compostos com a fórmula geral (I) ou (II), e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

De acordo com outro aspecto a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com cancro. 0 método compreende a administração de uma quantidade farmacologicamente efectiva de um derivado da betulina ou do ácido betulínico aqui descrito, a um indivíduo, no qual os compostos vão inibir o crescimento das células cancerígenas e consequentemente tratar o cancro.

Finalmente a presente invenção fornece novos derivados da betulina e do ácido betulínico, que são usados para inibir o ciclo celular e provocar a apoptose.

Este e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão perceptíveis na seguinte descrição da invenção, que não pretende limitar o espírito ou o âmbito da invenção, mas sim fornecer exemplos.

Descrição Detalhada da Invenção termo sais farmaceuticamente aceitáveis tal como aqui se utiliza refere-se aos compostos aqui descritos, após reacção com ácidos ou bases para a obtenção dos respectivos sais. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se restringem aos que são actualmente utilizados em alimentos, bebidas e em formulações medicinais ou farmacêuticas. Exemplos específicos incluem sais alcalinos metílicos tais como sais de cálcio, magnésio, bário, zinco, sódio e potássio; sais de haletos e alumínio, sais de alquilamina tais como sais de amónia, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, propilamina, butilamina, tetrabutilamina, pentilamina e hexilamina, sais de alcanolamina, tais como sais de etanolamina, dietanolamina, trieta nolamina, propanolamina, dipropanolamina, isopropanolamina e diisopropanolamina; sais de outras aminas orgânicas tais como de piperazina e piperidina; sais com aminoácidos básicos tais como lisina, arginina, histidina, triptofano e guanidina; e outros sais tais como acetato, ascorbato, benzoato, citrato, oxalato, estearato, trifluoracetato, succinato, tartarato, lactato, fumarato, gluconato, glutamato, fosfato/difosfato e valerato. Genericamente estes sais podem ser preparados por reacção de um ácido livre ou de uma base com estes compostos, em quantidades estequiométricas da base ou ácido apropriado, em água ou num solvente orgânico ou numa mistura dos dois. A lista dos sais mais adequados pode ser encontrada no Remington's Pharmaceutical Sciences 17^th ed. Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985. No geral, estes sais apresentam uma solubilidade aquosa superior à dos compostos originais.

Tal como usado aqui, o termo contactando refere-se a qualquer método adequado para pôr a betulina, o ácido betulinico ou os seus derivados e análogos ou outro tipo de composto terapêutico, em contacto com as células, de preferência células com proliferação anormal. A condição In vitro é conseguida expondo as células aos agentes inibitórios, num meio adequado.

Os termos quantidade farmacologicamente eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado, tal como a redução do crescimento das células tumorais.

Os termos tratar o cancro ou tratamento do cancro incluem, mas não se limitam à inibição do crescimento, à morte ou à redução do número de células cancerígenas. Inibir o crescimento refere-se a inibir o aumento do número de células cancerígenas ou a interromper a divisão das células cancerígenas.

Como é evidente para um especialista na técnica, os termos cancro, células cancerígenas ou tumor referem-se a exemplos de doenças proliferativas de células neoplásicas.

Tal como aqui utilizado o termo células normais, refere-se a uma amostra de células que não contêm um cancro especificamente escolhido. As células normais utilizadas são linhas de células não tumorais.

termo substrato refere-se à betulina, ou ácido betulínico ou aos derivados intermediários 3-13 utilizados como material de partida.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados de forma estável por via oral ou parentérica a humanos ou animais para actuar, por exemplo, como um fármaco ou quasi-fármaco. Os exemplos de administração parentérica incluem injecção intravenosa, injecção intraarterial, injecção intramuscular, injecção subcutânea, injecção intracutânea, injecção intraperitoneal, injecção intra-espinal, injecção peridural, administração percutânea, administração perpulmomar, administração pernasal, administração perintestinal, administração através da cavidade oral, administração permucosal. Exemplos de formas farmacêticas utilizadas incluem injecções, supositórios (supositórios rectais, uretais e vaginais), líquidos para uso externo (tais como injecções, gargarejos, colutórios, fomentação, inaladores, sprays, aerossóis, enemas, tinturas, detergentes, desinfectantes, gotas nasais e gotas para os ouvidos), cataplasmas, fitas de absorção percutânea, preparações externas para a pele, pomadas (tais como pastas, linimentos e loções). Adicionalmente, exemplos de formas farmacêuticas para administração oral incluem comprimidos para administração interna (comprimidos não revestidos, comprimidos revestido, drageias, comprimidos com revestimento gastroresistente, e comprimidos mastigáveis), comprimidos para administração na (tais como preparações orais, comprimidos comprimidos adesivos), pós, cápsulas (tais duras e cápsulas moles), grânulos (como cavidade oral sublinguais e como cápsulas os grânulos revestidos, pílulas, preparados líquidos ou formulações de libertação prolongada, f armaceut i cament e aceitáveis).

Exemplos específicos de preparações liquidas que podem ser administrados por via oral incluem as soluções para uso interno, misturas, suspensões, emulsões, xaropes, xaropes secos, elixires, infusões, decocções e limonadas.

A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo os compostos acima mencionados e diluentes farmaceuticamente aceitáveis, veículos ou excipientes.

Tal como utilizado aqui, os termos diluentes farmaceuticamente aceitáveis, veículos ou excipientes, incluem todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, diluentes, lubrificantes, aglutinantes, estabilizadores e agentes reguladores da absorção, e outros fisiologicamente compatíveis. Numa situação espeífica da invenção, o veículo é adequado para a administração parentérica. Alternativamente, o veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual ou oral.

Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injectáveis. Os diluentes que podem ser utilizados na composição incluem mas não estão limitados ao fosfato dicálcico, sulfato de cálcio, lactose, celulose, caulino, manitol, cloreto de sódio, amido seco, açúcar em pó e para comprimidos de libertação prolongada a hidroxipropilmetilcelulose (HPMC).

Os aglutinantes que podem ser utilizados na formulação incluem, mas não estão limitados, ao amido, à gelatina e diluentes, tais como sacarose, glicose, dextrose e lactose. Os estabilizadores utilizados são polissacarídeos, tais como acácia, agar, ácido algínico, goma guar e tragacanta, e agentes emulsificantes anfotéricos como a gelatina e polímeros sintéticos e semi-sintéticos, tais como resinas carbómero, éteres de celulose, quitina e carboximetilcelulose. Os excipientes que podem ser utilizados na formulação incluem, mas não estão limitados, à celulose microcristalina, sulfato de cálcio, fosfato dicálcico, amido, estearato de magnésio, lactose e sacarose. Os solventes que podem ser usados incluem, mas não estão limitados, à solução de Ringer, água, água destilada, solução de dimetilsulfóxido a 50% em água, propilenoglicol (puro ou em água), tampão fosfato, solução salina balanceada, glicol e outros líquidos convencionais. A utilização destes meios e agentes juntamente com as substâncias farmacologicamente activas é bem conhecida (Rowe, RC et al. Manual de excipientes farmacêuticos, 4 ^aedição, Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido, 2003). Compostos activos complementares também podem ser incorporados nas formulações.

As formulações farmacêuticas no âmbito da presente invenção devem conter o agente activo (compostos acima mencionados) numa quantidade efectiva para atingir o efeito terapêutico desejado, evitando os efeitos secundários adversos. A quantidade da formulação terapêutica ou farmacêutica, eficaz no tratamento de uma determinada doença, distúrbio ou condição depende da natureza e gravidade da doença, o local alvo da acção, o peso do indivíduo, dietas especiais, terapêuticas concomitantes, a via de administração e outros fatores que são facilmente reconhecidos pelos especialistas.

A dose será adaptada pelo médico de acordo com factores convencionais, tais como extensão da doença e os diferentes parâmetros do indivíduo. As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas

em sistemas	de	libertação controlada. P	or exemplo, podem
utilizar-se	os	materiais poliméricos (Smolen, VF e Bali,
L., Controlled	Drug	Biodisponibilidade:	Drug design	de
produto e	desempenho,	Wiley & Sons, 1	984; Ranade W	e
Hollinger,	MA,	Drug	Delivery Systems	(Farmacologia	e
Toxicologia	Series) ,	2 ^a edição, CRRC	Press, 2003),	ou
bombas (Saudek,	CD et	al. , N. Engl. J.	Med. 321:574-579,

1989).

Os compostos da presente invenção podem também ser administrados recorrendo à utilização de anticorpos monoclonais, que actuam como transportadores individuais para as moléculas a que estão acoplados. Os compostos da presente invenção podem também ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis, úteis para a realização da libertação controlada do fármaco, por exemplo, o ácido polilático, poliortoésteres, reticulado copolímeros e hidrogéis, ácido butírico e polidi-hidropiranos. Para uso veterinário, um composto da presente invenção ou o sal correspondente, não tóxico, pode ser administrado como uma formulação adequada aceitável, em conformidade com as práticas veterinárias normais. 0 veterinário pode facilmente determinar a dosagem, regime e via de administração, mais adequados para um determinado animal.

A presente invenção fornece também um método para prevenir ou inibir o crescimento de tumores que consiste em estabelecer o contacto entre as células e uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos acima mencionados. Os tumores nos quais os compostos da presente invenção podem ser aplicados incluem inchaços e tumores verdadeiros, incluindo tumores benignos e malignos. Exemplos específicos destes tumores incluem gliomas, tais como astrocitoma, glioblastoma, meduloblastoma, oligodendrogliomas, ependimona e papiloma do plexo coróide, tumores cerebrais, tais como meningioma, adenoma pituitário, neuroma, tumor congénito, tumor cerebral metastático, carcinoma espinocelular, linfoma, uma variedade de adenomas e cancros da faringe resultantes destes adenomas, tais como cancro da epifaringe, cancro da mesofaringe e cancro da hipofaringe; cancro da laringe, timoma, mesotelioma, como por exemplo mesotelioma pleural, peritoneal e pericardial; cancro da mama, como por exemplo o cancro do dueto toráccico, carcinoma lobular e carcinoma papilar; carcinomas do pulmão, como o carcinoma broncogénico, carcinoma alveolar, adenoma brônquico, carcinoma das células pequenas, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma das células grandes e carcinoma adenoescamoso;

carcinoma gástrico; carcinomas do esófago, como por exemplo o carcinoma do colo do útero do esófago, carcinoma toráccico do esófago e carcinoma abdominal do esófago; carcinoma do intestino grosso, colón sigmoidal, do cólon lateral, tais como carcinoma retal, carcinoma do carcinoma do cólon ascendente, carcinoma carcinoma do ceco e carcinoma do cólon descendente; hepatomas, como carcinoma hepatocelular, carcinoma dos duetos intra-hepáticos, blastoma hepatocelular e cistoadenocarcinoma dos duetos hepáticos; carcinoma pancreático; tumores do pâncreas hormono-dependentes , tais como msulinoma, gastnnoma, adenoma produtor de VIP (peptideo intestinal vasoactivo); carcinoma dos duetos extrahepáticos, carcinoma capsular hepático, carcinoma perianal, carcinoma da pelve uretral; cancros renais, tais renais (tumor Grawitz), tumor angiomiolipoma renal; cancro células germinativas, tais embrionário, tumor do saco vite renal e uretal; carcinoma como, carcinoma de células de Wilms (nefroblastoma) e testicular ou tumores das como seminoma, carcinoma Lino, coriocarcinoma e teratoma; cancro da próstata, cancro da bexiga, carcinoma da vulva; histerocarcinomas, como carcinomas do cólo do útero, cancro do corpo uterino e endometrioma; histeromioma, sarcoma uterino, doenças das vilosidades, carcinoma de vagina, tumores das células germinativas do ovário, tais como disgerminoma, tumor vitelino, teratoma, e tumores ovarianos, tais como o cancro do ovário; melanomas, tais como, nevo nevocitico e melanoma, linfomas cutâneos como a micose fungóide, os cancros da pele, tais como, cancros endoepidermais resultantes de cancros da pele, cancro espinocelular, sarcomas dos tecidos moles, como histiocitoma fibroso, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomiossarcoma, leiomiossarcoma, sarcoma sinovial, fibrossarcoma, neuroma, hemangiossarcoma, neurofibrossarcoma, hemangiopericitoma;

linfomas tais como linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin, mieloma, plasmocitoma, leucemia mielóide aguda e crónica, linfoma de células T do adulto e leucemia linfocítica crónica;

doenças crónicas mieloproliferativas, como, pletora verdadeira, trombocitemia essencial, mieloinchaço), tumor de derrame pleural, tumor ascítico, outros lipomas, fibromas, hemangeomas, miomas, tipos de adenomas, fibromiomas endoteliomas.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, o contacto das células cancerígenas com um destes compostos é efectivo na indução de paragens do ciclo celular e por provocar a apoptose.

Os métodos de preparação dos compostos 14-50, representados nas Tabelas -1 e 2, estão resumidos nos esquemas das FIG. 2-5. Procedimentos convencionais podem ser utilizados na preparação dos diferentes derivados intermediários da betulina e do ácido betulínico, utilizados como substratos. As fórmulas gerais dos compostos da invenção estão representados na FIG. 6. Os compostos da invenção resultam de modificações nas posições C-2, C-3, C-20, C-28 ou C-29 da betulina e ácido betulínico. Estes compostos foram caracterizados com base nos dados espectrais. Os sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis, os isómeros, polimorfos, N-óxidos e metabolitos destes compostos podem ser preparados de acordo com métodos previamente descritos.

Apesar dos vários modelos de realização da invenção estarem divulgados aqui, muitas adaptações e modificações podem ser feitas, no âmbito da invenção, em conformidade com o conhecimento geral dos especialistas. Tais modificações incluem a substituição de qualquer aspecto da invenção por outro equivalente, a fim de se obter o mesmo resultado. Os seguintes exemplos são ilustrativos dos vários aspectos da invenção, e não limitam os aspectos gerais da invenção aqui divulgados.

Síntese dos intermediários da betulina e do ácido betulínico

Como a reactividade do grupo hidroxilo da betulina na posição C-28 é muito superior à do hidroxilo em

C-3, a 28-acetoxibetulina 4 foi obtida, com um rendimento moderado (78%) utilizando anidrido acético (AC2O) e dois equivalentes de imidazole em CHCI3, durante 2 h a refluxo. A diacetilação da betulina 1 com AC2O e uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (DMAP) em CH₂C1₂ originou o derivado 3β, 28-diacetoxibetulina 6, num rendimento elevado (97%). A subsequente hidrólise selectiva do 3β,28diacetoxibetulina 6 com hidróxido de potássio metanólico em THF, de acordo com um método previamente descrito,(Tietze, L. F. et al. , Liebigs Ann. Chem., 12:1245-1249, 1991) originou o composto 3p-acetoxibetulina 3 com um rendimento de 74%. De acordo com a FIG. 3, o éster metilico 5 do ácido betulinico 2, disponível comercialmente foi sintetizado com um bom rendimento (83%) por intermédio da reacção com iodeto de metilo (CH3I) na presença de K2CO3.A metoxilação do grupo isopropenilo da betulina 1 ocorreu em dois passas de acordo com um método previamente descrito (Uzenkova, N. V. et al., Chem. Nat. Compd., 41:692-700, 2005.) No primeiro passo a reacção do derivado 3β,28-diacetoxibetulina 6 com N-bromosuccinimida (NBS) em CCI4 originou o derivado 30-bromo que foi posteriormente hidrolisado com NaOH (4M) numa mistura de MeOH:THF,à temperatura ambiente, para originar o derivado 30-metoxi 7 e o derivado 30-bromo 8. A razão entre os compostos 7 e 8 depende das condições reaccionais. Um aumento no tempo da hidrólise origina um aumento na quantidade do derivado 30-metoxi. Para a síntese do composto 9, a betulina 1 foi epoxidada com ácido mcloroperbenzoico (m-CPBA) , seguido de uma abertura do anel epóxido, catalizada por ácido, para originar os isómeros epiméricos (20R-aldeido) 9 (39%) and (20S-aldeido) 10 (20%) como produtos principais. Os valores mais elevados de desvio químico dos sinais dos protões H-20 e H-30 no espectro de ^{* 1}H NMR da configuração 20R (δ 9,86 e δ 1,10 ppm) em comparação com os da configuração 2OS (δ 9, 62 and δ 1,04 ppm) são caracteristicos e são consistentes com os dados reportados na literatura (Okamoto, I. et al., Chem. Pharm. Buli. 48:120-125, 2000). 0 ácido betulónico 11 foi facilmente obtido por intermédio do método bem conhecido de oxidação com o reagente de Jones em acetona (Kim, D. S. H. L. et al. , Synth. Commun., 27:1607-1612, 1997). Para a síntese do intermediário 12, o ácido betulónico 11 foi desidratado com a 2,3-dicloro-5,6-dicianobenzoquinona (DDQ) em dioxano de acordo com o método já conhecido (Walker, D.;

Hiebert, J. D., Chem. Rev., 67:153-195, 1967). 0 procedimento, previamente publicado, que utilize oxigénio na presença de tert-butoxido de potássio (t-BuOK) foi utilizado para a síntese do diosfenol 13 como produto principal (72%) (Urban, M. et al. , J. Nat. Prod., 67:11001105, 2004) .

Síntese dos carbamatos e N-acilimidazoles

A síntese dos compostos com as fórmulas gerais (I) e (II) foi realizado por intermédio da reacção dos compostos 1-7, 9 e 11-13 com 1,1'-carbonildiimidazole (CDI), 1,1'-carbonilbis(2-metilimidazole) (CBMI) ou 1,1'28 carbonildi(1,2,4-triazole) (CDT), a refluxo, em THF anidro e sob atmosfera de N₂. A reacção do CDI com alcoóis ou fenóis foi reportada para a obtenção de N-alquilimidazóis ou ésteres carboxílicos do imidazole (carbamatos), dependendo da estrutura do álcool e das condições reaccionais utilizadas (Tang, Y. Q. et al., Synthesis, 15:2540-2544, 2004). No nosso caso a reacção com o CDI,

CBMI ou CDT originou os carbamatos 14-29, 33-43 e 50 com bons rendimentos. Por outro lado, a reacção do CDI, CBMI ou CDT com a função ácido carboxílico, dos substratos do tipo lupano, originou os derivados N-acilheterociclicos 3032 e 44-49 o que está de acordo com resultados previamente obtidos (Rannard, S. P. et al. , Org. Lett., 2:2117-2120, 2000).

Materiais e Métodos

Química

As reacções sensíveis ao ar e à água foram realizadas sob atmosfera de azoto. Os reagentes sensíveis foram introduzidos por intermédio de uma seringa seca. 0 THF foi destilado de CaH₂. Betulina (1), ácido betulinico (2), CDI, CBMI, CDT, NBS, NaOH, m-CPBA, H₂SO₄, DDQ, t-BuOK e álcool tert-butílico (t-BuOH) foram adquiridos à Sigma Aldrich Co. , enquanto que os solventes foram comprados à VWR Portugal. Para a realização de cromatografia em camada fina (TLC) utilizou-se Kieselgel 60HF254/Kieselgel 60G e a cromatografia em coluna flash (FCC) foi realizada com Kieselgel 60 (230-400 mesh, Merk). Todos os rendimentos não foram optimizados e representam genericamente a média de duas experiências. Os pontos de fusão foram determinados num aparelho BUCHI melting point Point B-540 e não são corrigidos. Os espectros de IV foram obtidos num espectroftómetro JASCO FT/IR-420. Os espectros de RMN foram registrados num espectroftómetro Bruker Digital NMR-Avance 300 e no Bruker Digital NMR-Avance 400 em CDCI3 utilizando o Me4Si como padrão interno. A elucidação das estruturas químicas foi feita com base nos espectro de ³Η RMN, ¹³C RMN, DEPT135, COSY, HMQC e HMBC. Os desvios químicos (δ) estão reportados em partes por milhão (ppm). Os sinais estão reportados como m (multipleto), s (singuleto), d (dubleto), brs (singuleto largo) e as constantes de acoplamentos (J) são apresentadas em hertz (Hz). Os espectros de massa foram obtidos num espectrómetro de massa Finnigan Polaris Q GC/MS Benchtop Ion Trap por injecção directa da amostra.

Exemplos de Preparação

Exemplo 1 (Intermediário)

Acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en-3p-ilo (Composto 3)

Uma mistura de acetato de lup-20(29)-eno-3p,28diilo (0,32 g; 0,6 mmol) KOH metanólico (66 ml; 0,6 mmol) e em THF (20 ml) foi agitada, à temperatura ambiente, durante 17 horas. Acidificou-se a solução com HC1 aquoso (3%, 50 ml) e extraiu-se com acetato de etilo (3 χ 30 ml) . A fase orgânica total foi lavada com solução saturada de Na2CC>3 (3 χ 30ml), água (30 ml) e solução saturada de NaCl (30 ml), seca com Na2S0₄ anidro, filtrada e evaporada à secura, obtendo-se um sólido branco que foi posteriormente recristalizado de benzeno, obtendo-se o composto 3 (0,26 g, 89 %): p.f. (benzeno) 259-260 °C; IV (filme): 882, 978,

1246, 1642, 1729, 3070, 3440 cm’¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz) δ 0,84; 0,85; 0,97; 1,02 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s, 3H, 30-H₃) ; 2,04 (s, 3H, OCOCH₃) ;

2,39 (dt, J= 10,7 Hz e J= 5,9 Hz, 1H, 19-H); 3,33 (d, J = 10,7 Hz, 1H, 28_a-H) ; 3,79 (d, J= 10,7 Hz, 1H, 28_b-H) ; 4,47 (dd, J = 10, 3 Hz e J = 5, 7 Hz, 1H, 3a-H) ; 4,58 (s, 1H, 29_aH) ; 4,68 (s, 1H, 29_b-H) ; ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz) δ 60,5 (C28); 80,9 (C3); 109,7 (C29) ; 150,5 (C20); 171,1 (OCOCH₃) ; EI-MS m/z (%): 484 (9) M⁺, 203 (71), 189 (100), 187 (55); 107 (61), 105 (52), 95 (77), 91 (67), 81 (60), 79 (85).

Exemplo 2 (Intermediário)

Acetato de 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo (Composto 4)

Uma mistura de betulina (0,35 g; 0,8 mmol) anidrido acético (4 ml) e imidazole (0,llg; 1,6 mmol) em

CHC1₃ (60 ml) foi aquecida a refluxo durante 2h. Após arrefecimento, diluiu-se a mistura da reacção em CHC1₃ (60 ml), lavou-se com uma mistura de HC1 aquoso (10%, 40 ml) e gelo, com água (30 ml), com solução saturada de NaCl (30 ml), e secou-se com Na₂SO₄ anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo,obtendo-se um resíduo sólido branco, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merk, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 4:1) obtendo-se o composto 4 (0,32 g,

%): p.f. (benzeno) 275-277 °C; IV (filme): 880, 1102,

1244, 1642, 1734, 3070, 3471 cm’¹; RMN (CDC1₃, 300 ΜΗζ) δ 0,76; 0,82; 0,96; 0,97; 1,03 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃,

25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,68 (s, 3H, 30-H₃); 2,07 (s, 3H,

OCOCH₃); 2,45 (dt, J = 10,9 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 19-H) ;

3,18 (dd, J= 11,0 Hz e J= 4,7 Hz, 1H, 3a-H) ; 3,86 (d, J =

10,9 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,24 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28_b-H) ; 4,59 (s, 1H, 29_a-H) ; 4,69 (s, 1H, 29_b-H) ; ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz) δ 62,8 (C28); 78,9 (C3); 109,9 (C29); 150,2 (C20); 171,6 (OCOCH3); EI-MS m/z (%): 484 (12) M+, 203 (54), 189 (100),

187 (71), 145 (49); 133 (67), 119 (62), 107 (49), 105 (69), 91 (56).

Exemplo 3 (Intermediário) 3p-Hidroxilup-20(29)-en-28-oato de metilo (Composto 5)

A uma solução de ácido betulínico (0,15 g, 0,3 mmol) e K₂CO₃ anidro (0,12 g; 0,8 mmol) em DMF seca (2 ml) adicionou-se iodeto de metilo (41 μΐ; 0,7 mmol). A reacção decorreu com agitação magnética e à temperatura ambiente durante 1 h. Diluiu-se a mistura da reacção em acetato de etilo (30 ml), lavou-se com água (3 χ 20 ml) e com solução saturada de NaCl (20 ml) . Secou-se com Na₂SO4 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um sólido branco que foi posteriormente recristalizado de metanol, obtendo-se o composto 5 (0,13 g, 83 %) : p.f.

(metanol) 220-222 °C; IV (filme): 1643, 1720, 3070, 3320 cif¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz) δ 0,75; 0,82; 0,92; 0,94; 0,96 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s,

3H, 30-H₃); 2,43 (m, 1H, 19-H) ; 3,18 (dd, 1H, J = 10, 9 Hz e J= 4,5 Hz, 3a-H) ; 3,67 (s, 3H, COOCH₃); 4,58 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,71 (s largo, 1H, 29_b-H) ; ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz) δ 80,6 (C3); 110,1 (C29); 149,7 (C20); 177,2 (C28); EI-MS m/z (%): 471 (25) M⁺, 286 (26), 253 (52), 247 (29), 203 (36), 192 (100), 189 (100), 175 (64), 119 (47), 105 (51).

Exemplo 4 (Intermediário)

Acetato de lup-20(29)-eno-3p,28-diilo (Composto 6)

Uma solução de betulina (0,35 g; 0,8 mmol), anidrido acético (12 ml) e DMAP (0,10 g; 0,8 mmol) em THF (10 ml) foi agitada à temperatura ambiente durante 12 horas. Colocou-se a mistura da reacção num matraz contendo HC1 aquoso (10%, 50 ml) e gelo e extraiu-se com acetato de etilo (3 x 30 ml). A fase orgânica total foi lavada com HC1 aquoso (10%, 2 * 20ml), água (30 ml) e solução saturada de NaCl (30 ml), seca com Na2SC>4 anidro, filtrada e evaporada á secura, obtendo-se um sólido branco que foi posteriormente cristalizado de benzeno, obtendo-se o composto 6 (0,37 g,

%): p.f. (benzeno) 224-226 °C; IV (filme): 880, 1241,

1642, 1735, 3073 cm-1; ³H RMN (CDCI3, 300 MHz) δ 0,83;

0,84; 0,97; 1,03 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃,

27-H₃); 1,68 (s, 3H, 30-H₃); 2,04 (s, 3H, OCOCH₃); 2,07 (s,

3H, OCOCH3); 2,45 (dt, J= 11,0 Hz e J =5, 8 Hz, 1H, 19-H);

3,85 (d, J= 11,0 Hz, 1H, 28_a-H); 4,25 (d, J= 11,0 Hz, 1H,

28_b-H) ;	4,47 (dd, J = 10,3 Hz	e J = 5,8	Hz, 1H, 3a-H);	4,59
(s largo, 1H,	29_a-H); 4,69	(s largo,	1H, 29_b-H) ; ¹³	C RMN
(CDC1₃,	75 MHz]	) δ 62,8 (C28);	80, 9	(C3)	; 109,9 (C29);	150, 1
(C20);	171,0 1	(OCOCH3); 171,6	(OCOCH₃) ;	EI-MS m/z (%)	: 526
(5) M⁺,	466 (72), 216 (46),	203 (	47) ,	202 (44), 190	(53) ,
189 (100), 187	(68), 119 (47)	, 91	(51) ;

Exemplo 5 (Intermediários)

30-Metoxilup-20(29)-eno-3p,28-diol (Composto 7) e 30bromolup-20(29)-eno-3p,28-diol (Composto 8)

A solução do composto 6 (2,5 g; 4,8 mmoles) em

CC1₄ (100 ml) foi tratada com NBS (1,7 g; 9,6 mmoles) e agitada sob refluxo durante 3 horas. A mistura da reacção foi filtrada, para remover o precipitado e concentrada com a ajuda do evaporador rotativo. 0 resíduo obtido foi novamente dissolvido numa mistura de MeOH/THF (24/12 ml), colocou-se sob atmosfera de árgon, á temperatura de 0 °C e adicionou-se NaOH 4N ( l,2ml, 4,8 mmol) e deixou-se reagir durante 29 horas. Colocou-se a mistura da reacção num matraz contendo gelo e HC1 diluído, filtrou-se o sólido obtido, lavou-se com água (2 * 100 ml), secou-se com Na2SC>4 anidro e purificou-se por cromatográfia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 7 (1,4 g;

64%): p.f. (acetona/n-hexano) 212-214 °C; IV (filme): 1645,

3073, 3347 cnf¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz): δ 0,76; 0,82;

0,97; 0,98; 1,02 ( todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃,

27-H₃); 2,28 (dt, J= 10,8 Hz e J = 5,4 Hz, 1H, 19-H); 3,18 (dd, J= 10,8 Hz e J= 5,2 Hz, 1H, 3a-H) ; 3,31 (d, J= 10,5

Hz, 1H, 28_a-H) ; 3,35 (s, 3H, OCH₃); 3,78 (d, J = 10,5 Hz,

1H, 28_b-H) ; 3,86 (s largo, 2H, 30-H₂) ; 4,91 (s, 1H, 29_a-H) ;

4,92 (s, 1H, 29_b-H) ; ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz): δ 58,3 (OCH₃); 60,2 (C28); 74,8 (C30); 78,9 (C3); 109,0 (C29);

150,9 (C20); EI-MS m/z (%): 473 (25) M⁺, 201 (93), 189 (86), 187 (100), 145 (75), 131 (66), 121 (71), 119 (73), 95 (66), 81 (69). E o composto 8 (0,45 g, 18%): p.f.

(acetona/n-hexano) 202-205 °C; IV (filme): 1642, 3075, 3371 crf¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz): δ 0,76; 0,82; 0,97; 0,99;

1,03 ( todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃);

2,39 (dt, J= 11,0 Hz e J = 5,3 Hz, 1H, 19-H); 3,19 (dd, J

= 10,9 Hz	e J = 5,1 Hz, 1H, 3a-H	); 3,33 (	d, J = 10, 8	Hz,
1H, 28_a-H) ;	3, 81 (d, J = 10, 8, 1H,	28_b-H) ;	3,99 (s, 2H,	30-
h₂); 5,03	(s, 1H, 29_a-H); 5,12	(s, 1H,	29_b-H) ; ¹³C	RMN
(CDC1₃, 75	MHz) : δ 60, 3 (C28) ;	78,9 (C3	); 109,8 (C29);
151,0 (C20J	i; EI-MS m/z (%): 522 (3	) M+, 121	(74), 119 (	91) ,

107 (85), 105 (82), 93 (84), 91 (91), 81 (84), 79 (100), 67 (82) .

Exemplo 6 (Intermediários)

3β, 28-Di-hidroxi-(20R)-lupan-29-al (Composto 9) e do

3β,28-di-hidroxi-(20S)-lupan-29-al (Composto 10)

A uma solução de betulina 1 (0,87 g; 1,9 mmol) em CH2CI2 anidro, à temperatura de 0-5°C, adicionou-se ácido m-cloroperbenzoico (0,50 g; 2,9 mmol) e deixou-se sob agitação magnética durante 5 horas. De seguida adicionou-se H₂SO₄ 2 M (4 ml), mantendo a temperatura a 0-5 °C e deixou35 se sob agitação durante mais 1 hora. Diluiu-se a mistura da reacção em CH₂CÍ2 (100 ml), lavou-se com solução saturada de Na2CC>3 (3 χ 30 ml), com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml) . Secou-se com Na2SO4 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um sólido branco que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 9 (0,35 g, 39 %): p.f. (acetona/n-hexano ) 203-205

°C; IV (filme): 1714,	. 3393	cm ;	³H	RMN (CDCI3, 300	MHz) δ
0,77; 0,84; 0,95; 0,	98; 1,	03 (todos	s, 15H, 23-H₃,	24-H₃,
25-H₃, 26-H₃, 27-H₃);	1, 10	(d, J	= 6,	9 Hz, 3H, 30-H	); 2,60
(m, 1H, 20-H); 3,20 i	(dd, J	= 10, 9	Hz	e J = 5,1 Hz,	1H, 3a-
H) ; 3, 26 (d, J = 10, E	J Hz, 1H, 28_a-	-H) ;	3, 77 (d, J = 1	0, 8 Hz,
1H, 28_b-H) ; 9,86 (d,	J = 2,	0 Hz,	1H,	29-H) ; ¹³C RMN	(CDCI3,
75 MHz) δ 60,2 (C28	); 78,	9 (C3)	; 206, 8 (CHO). EI-	-MS m/z
(%) : 458 (2) M+, 369	(100)	, 207	(43)	, 192 (51), 189 (72),
161 (67), 133 (31),	121	(31) ,	107	(36), 95 (33	) . E 0
composto 10 (0,18 g,	20 %) :	p.f.	(acetona/n-hexano)	202-206
°C; IV (filme): 1716	, 3340	cnf¹;	³H RMN (CDC1₃, 300	MHz) δ
0,77; 0,84; 0,98; 1,	06 (todos s,	15H, 23-H₃, 24-H₃,	25-H₃,

26-H₃, 27-H₃); 1,04 (d, J = 7, 0 Hz, 3H, 30-H) ; 2,65 (m, 1H,

20-H) ; 3,20 (dd, J = 10, 9 Hz e J = 5, 1 Hz, 1H, 3a-H); 3,33 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28_a-H) ; 3,80 (d, J= 10,8 Hz, 28_b-H); 9,62 (s, 1H, 29-H) ; ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz) δ 60,2 (C28);

78,9 (C3); 204,8 (CHO); EI-MS m/z (%): 458 (4) M⁺, 369 (76), 207 (48), 190 (46), 189 (100), 161 (70), 119 (51),

105 (46), 95 (47), 91 (59).

Exemplo 7 (Intermediário)

Ácido 3-oxo-lup-20(29)-en-28-óico (Composto 11)

A uma solução de betulina 1 (1,0 g; 2,3 mmoles) em acetona (50 ml), arrefecida a 0 °C e adicionou-se o reagente de Jones (3,2 ml), gota a gota. A reacção decorreu durante 1 hora e meia a 0°C e com agitação magnética. Parou-se a reacção adicionando metanol (50 ml), obtendo-se uma solução de coloração verde que se deixou sob agitação durante 30 minutos, ao fim dos quais se adicionou água (50ml). Evaporou-se a acetona e parte do metanol e extraiuse a fase aquosa com acetato de etilo (3 χ 40 ml). Lavou-se a fase orgânica com água (2 χ 30 ml) e com solução saturada de cloreto de sódio (2 χ 30 ml), secou-se com Na₂SO₄ anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido branco, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por

cromatografia	flash (	gel	de sílica 230-400 Mesh, Merck,
eluente: éter	de petróleo 40-60°C-acetato	de	etilo 4:1)
obtendo-se o	composto	11	(1,2 g; 56%) : p	. f.	(acetona/n-
hexano) 247-24	9 °C; IV (filme): 1642, 1686,	1703, 3070 cm
³; ³H RMN (CDC1₃, 300 :	MHz)	: δ 0,95; 0,99; 1	, 02;	1,04; 1,09
(todos s, 15H,	23-H₃,	24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃)	; 1,72 (s,
3H, 30-H₃); 3,	04 (dt,	J =	10,7 Hz e J = 4,3	Hz,	1H, 19-H);
4,64 (s largo,	1H, 29_a	-H) ;	4,77 (d, J = 1,5	Hz,	1H, 29_b-H) ;
¹³C RMN (CDCI3,	75 MHz	) : δ	109,7 (C29); 150	,3 (C20); 182,2
(C28); 218,2	(C3); EI	-MS	m/z (%) : 454 (19)	1 M⁺,	408 (24),
393 (20), 248	(85) ,	189	(100), 175 (61),	133	(55), 119

(76), 105 (54), 79 (52).

Exemplo 8 (Intermediário)

Ácido 3-oxolup-l,20(29)-dien-28-óico (Composto 12)

Uma solução do composto 11 (0,40 g; 0,9 mmol) e

DDQ (0,60 g; 2,6 mmol) em dioxano anidro (18 ml) foi aquecida a refluxo e sob atmosfera de N₂ durante 15 h. Diluiu-se a mistura da reacção em acetato de etilo (60 ml) e removeu-se a matéria insolúvel por filtração. Lavou-se o filtrado com solução saturada de Na₂C0₃ (3 χ 30 ml), com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml). Secouse com Na₂SO₄ anidro, filtrou-se e evaporou-se com a ajuda do evaporador rotativo, obtendo-se um sólido amarelo que foi seco em estufa de vácuo. 0 produto bruto da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 4:1) obtendo-se o composto 12 (0,18 g, 45 %): p.f. (acetona/n-hexano ) 221-223 °C; IV (filme):

1645, 1689, 1730, 3070 cri¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz) δ 0,99; 1,02; 1,06; 1,07; 1,13 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,70 (s, 3H, 30-H) ; 3,03 (m, 1H, 19-H); 4,63

(s,	1H,	29_a-H) ;	4,76	(s,	1H,	29	_b-H) ; 5,80	(d, J =	10, 3	Hz,
1H,	2-H	); 7,11	(d, J	= 10	, 3 Hz,	1H, 1-H);	¹³C RMN 1	:cdci₃	, 75
MHz)	δ	109,9 (	C29) ;	125,	1 (	C2)	; 150,2 (	C20); 160,1 (	Cl) ;
181,	7 (	C28); 205, 9 (	C3) ;	EI-MS	m/z (%) :	452 (17)	M+,	213
(100	) ,	150 (39	) , 137	(34	) , 95	(31), 91	(42), 81	(36)	, 79

(41), 77 (29), 67 (34).

Exemplo 9 (Intermediário)

Ácido 2-hidroxi-3-oxolup-l,20(29)-dien-28-óico (Composto 13) composto 11 foi dissolvido (0,36g; 0,8 mmol) numa mistura de terc-butóxido de potássio (3 g; 26,7 mmol) em álcool terc-butilico (32 ml). A reacção decorreu durante 2 horas a 40 °C, com agitação magnética e sob atmosfera de 0₂· Transferiu-se a mistura da reacção para um matraz contendo HC1 diluído (3 %, 10 ml) e extraiu-se com acetato de etilo (2 * 40 ml) e lavou-se a fase orgânica total com solução saturada de Na₂C03 (3 χ 30 ml), água (30 ml) e solução saturada de NaCl (30 ml). Secou-se com Na₂SC>4 anidro, filtrou-se e evaporou-se á secura obtendo-se um resíduo sólido de cor amarelada. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 13 (0,27 g, 73 %): p.f. (acetona/n-hexano) 202-204 °C; IV (filme): 1645, 1669, 1698, 1730, 3073, 3389 αιΓ¹; ³H RMN (CDC1₃, 300

MHz) δ 0,98;	1,00; 1,10; 1,13; 1,20	(todos s, 15H,	23-H₃,
24-H₃, 25-H₃,	26-H₃, 27-H₃); 1,70 (s,	3H, 30-H₃); 3,	02 (m,
1H, 19-H); 4,	64 (s, 1H, 29_a-H) ; 4,75	(s, 1H, 29_b-H)	; 6,45
(s, 1H, 1-H);	¹³C RMN (CDCI3, 75 MHz)	δ 109,9 (C29);	128, 9

(Cl); 143,9 (C2); 150,1 (C20); 182,4 (C28); 201,2 (C3); EIMS m/z (%): 469 (11) M+, 321 (43), 213 (100), 189 (32), 150 (45), 136 (29), 91 (63), 80 (34), 75 (54), 69 (65).

Exemplo 10 (lH-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-lup-20(29)-en28-ilo (Composto 14) e (lH-imidazol-l-il)-carboxilato de lup-20(29)-eno-3p,28-diilo (Composto 17)

A uma solução de betulina (0,20 g; 0,5 mmoles) em tetrahidrofurano (THF) anidro (8 ml) adicionou-se 1,1'carbonildimidazole (CDI) (0,29 g; 1,8 mmoles). Após 7 horas de agitação magnética, à temperatura de refluxo e sob

atmosfera	de	azoto	a reacção	estava completa	como
verificado	por	TLC.	Transferiu-se	o conteúdo do	balão
reaccional	para	uma matraz contendo	água destilada (	20 ml)

e extraiu-se com éter dietilico (3 * 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou-se com Na2SC>4 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, branco, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de

petróleo	4 0-60° C-acetate	> de etilo	3:2	) obtendo-se o
composto	14 (0,15 g; 63	% ) : p.f. (acetona)	202-204 °C; IV
(filme):	880, 1645, 1751	, 3078, 3570	cm ¹	; ³H RMN (CDC1₃,
300 MHz):	δ 0,76; 0,83; 0	,97; 1,01; 1,	06 (todos s, 15H, 23-
H₃, 24-H₃,	25-H₃, 26-H₃,	27-H₃); 1,70	(s,	3H, 30-H₃) ; 2,4 7
(dt, J =	10,7 Hz e J =	5, 6 Hz, 1H,	19-H)	i ; 3,19 (dd, J =
10,8 Hz e	J= 5,2 Hz, 1H,	3a-H); 4,21	(d,	J = 10,7 Hz, 1H,

28_a-H) ; 4, 63 - 4, 67 (m, 2H, 28_b-H e 29_a-H) ; 4,72 (d, J= 1,4

Hz, 1H, 29_b-H) ; 7,13 (s largo, 1H, 4'-H); 7,46 (s largo,

1H,	5’-H); 8,	26 (s, 1H, 2’-H) .	¹³C RMN (CDCI3,	75 MHz): δ
67, 5	(C28);	78,9 (C3); 110,	,3	(C29); 117,2 (	C5' ) ; 129,6
(C4 ’	); 136,8	(C20'); 148,7	(OCO	); 149,5 (C20)	; EI-MS m/z
(%) :	536 (12)	M⁺, 207 (36),	189	(39), 187 (54)	, 119 (44),
107	(34), 105	(34), 91 (46),	79 (	Ϊ38), 69 (100).
E 0	composto	17 (0,56 g; 20	%) :	: p.f. (acetona/n-hexano)

880, 1642, 1757, 3070 cnT¹; ³H RMN (CDCI3, 300 MHz) δ 0,91;

0,96; 1,02; 1,08 (todos s, 15H,

23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃,

4H, 3a-H,

28_b-H,

2H,

1H, ¹³C

RMN (CDC1₃, 75

MHz): δ

67, 3

129, 5

Exemplo 11 (2'-metil-lH-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-lup20(29)-en-28-ilo (Composto 15) e (2'-metil-lH-imidazol-1il)-carboxilato de lup-20(29)-eno-3p,28-diilo (Composto 18)

A uma solução de betulina (0,20 g; 0,5 mmoles) em tetrahidrofurano (THF) anidro (8 ml) adicionou-se 1,1'carbonilbis(2-metilimidazol) (CBMI) (0,24 g; 1,4 mmoles).

Após 9 horas de agitação magnética, à temperatura de refluxo e sob atmosfera de azoto a reacção estava completa como verificado por TLC. Transferiu-se o conteúdo do balão reaccional para uma matraz contendo água destilada (30 ml) e extraiu-se com éter dietílico (3 χ 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou-se com Na2SO4 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, branco, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1) obtendo-se o composto 15 (0,14 g; 57%) : p. f. (benzeno) 163-165 °C; IV (filme) : 884, 1642, 1758, 3073, 3313 cm-1; 1H RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,77; 0,83; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,70 (s, 3H, 30-H3); 2,47 (m, 1H, 19-H); 2,71 (s, 3H, 2’-CH3); 3,19 (dd, J = 10,8 Hz

e J	= 5,2 Hz, 1H, 3a-H) ;	4,17 (d, J = 10, 9 Hz,	1H,	28a-H);
4,59	- 4,62 (m, 2H, 28b-H	e 29a-H); 4,72 (s largo,	1H, 29b-
H) ;	6,91 (d, J = 1,7 Hz,	1H, 4’-H); 7,38 (d,	J =	1,7 Hz,
1H,	5’-H); 13C RMN (CDC13, 75 MHz): δ 67,3	(C28); 78,8
(C3)	; 110,2 (C29) ; 118,1	(C5’); 126,5 (C4 ’ ) ;	147,	9 (C2’);
149,	5 (OCO); 149,6 (C20);	EI-MS m/z (%): 550	(10)	M+, 189
(26)	, 187 (26), 133 (25),	119 (37), 107 (28),	91	(30), 83
(100	), 81 (27), 79 (26).
E o	composto 18 (0,11 g;	38%): p.f. (acetona/n-	hexano) 127-
129	°C; IV (filme) 1645,	1753, 3070 cm-1; 1H	RMN	(CDC13,
300	MHz) δ 0,90; 0,95; 0,	96; 1,02; 1,08 (todos	s,	15H, 23-
H3,	24-H3, 25-H3, 26-H3,	27-H3); 1,71 (s, 3H,	30-H3); 2,48

(m, 1H, 19-H)	; 2,65 (s, 3H, 2'-CH3) ; 2,66	i (s,	3H, 2''	-CH3);
4, 15	(d, J =	10,8 Hz,	1H,	28a-H	); 4,58 -	4, 67	(s, 3H,	3a-H,
28b-H	e 29a-:	H); 4,73	(s,	1H,	29b-H) ; 6,	85 (	)s, 1H,	4'-H);
6, 86	(s, 1H,	H-4 ) ;	7, 34	(s,	1H, H-5')	; 7,	36 (s,	1H, H-
5 ) ;	13CRMN	(CDC13,	75	MHz) :	δ 66, 7	(C28	); 85,9	(C3) ;
110, 3	(C29);	118,0 (C5	' e	C5 ' ' )	; 127,8 e	127,	9 (C4',	C4 ) ;
147, 9	(C2' e	C2 ' ' ) ; 14 9,5	(oco:	); 149,6 (	OCO)	; 150,0	(C20);
EI-MS	m/z (%)	: 658 (2)	M+,	127	(13), 119	(12)	, 105 (10), 95
(19) ;	93 (13)	, 91 (16)	, 83	(100	), 81 (19)	, 79	(11) .

Exemplo 12 (ΙΗ-Triazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-lup-20(29)-en28-ilo (Composto 16) e (lH-triazol-l-il)-carboxilato de lup-20(29)-eno-3p,28-diilo (Composto 19)

A uma solução de betulina (0,20 g; 0,5 mmoles) em tetrahidrofurano (THF) anidro (8 ml) adicionou-se 1,1'carbonil-di-(1,2,4-triazole) (CDT) (0,30 g; 1,8 mmoles). Após 9 horas de agitação magnética, à temperatura de refluxo e sob atmosfera de azoto a reacção estava completa como verificado por TLC. Transferiu-se o conteúdo do balão reaccional para uma matraz contendo água destilada (30 ml) e extraiu-se com éter dietílico (3 χ 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou-se com Na₂SO4 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, amarelo, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 16 (0,18 g; 72%) : p.f. (acetone/n-hexane) 200-203 °C; IV (filme): 882, 1642, 1762, 1791, 3070, 3389 cif¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz): δ 0,77; 0,84; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,70 (s, 3H, 30H₃); 2,49 (dt, J = 10,7 Hz e J = 6,0 Hz, 1H, 19-H); 3,19 (dd, J= 10,8 Hz e J= 5,2 Hz, 1H, 3a-H) ; 4,30 (d, J= 10,8

Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,63 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,72 - 4,74(m,

2H, 28_b-H e 29_b-H) ; 8,09 (s largo, 1H, 3'-H); 8,83 (s largo, 1H, 5’-H); ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz): δ 68,4 (C28);

78,9 (C3); 110,3 (C29); 145,4 (C5’); 147,9 (OCO); 149,5 (C20); 153,6 (C3’); EI-MS m/z (%): 537 (4) M⁺, 190(74),

189 (100), 187 (89), 133 (72), 119 (98), 107 (75),105 (82), 91 (93), 79 (89).

E o composto 19 (0,07 g; 24%): p.f. (acetona/n-hexano) 157159 °C; IV (filme) 882, 1642, 1763, 1787, 3070 cif¹; ³H RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 0,92; 0,98; 1,00; 1,02; 1,09 (todos s,

15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,72 (s, 3H, 30-H₃); 2,50 (m, 1H, 19-H); 4,30 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,64 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,73 - 4, 82 (m, 3H, 3a-H, 28_b-H e 29_bH) ; 8,08 (s largo, 1H, 3'-H); 8,09 (s largo, 1H, 3''-H);

8,80 (s largo, 1H, 5'-H); 8,83 (s largo, 1H, 5''-H); ¹³C

RMN	(CDCI3,	100 MHz) : δ;	69, 3	(C28); 87,7	(C3) ;	110, 3
(C29) ; 145,3	(C5'); 145,4 1	!C5” ) ;	147, 2	(OCO);	147, 9	(OCO);
149,	4 (C20);	153,5 e 153,6	(C3' ,	C3 ) ;	EI-MS	m/z (%	) : 632
(4)	M⁺, 189	(86), 187 (62)	, 133	(67) ,	119 (79), 107	(60) ,
105	(83), 95	(67), 93 (74),	91 (100).

Exemplo 13 (ΙΗ-Imidazol-l-il)-carboxilato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en3β-ί1ο (Composto 20)

Uma solução de betulina 1 (0,2 g, 0,45 mmol) e

CDI (0,37 g, 2,25 mmol) em THF anidro (8 ml) foi submetida a refluxo durante 9 h para obter o composto 17. Adicionouse o gel de sílica (0,2 g) gue se deixou sob agitação, à temperatura ambiente, durante 18 h. Removeu-se o gel de sílica por filtração, colocando o filtrado num matraz contendo água destilada (20 ml) gue se extraiu com éter dietílico (3 χ 50 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secouse com Na₂SO₄ anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, branco, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 20 (0,17 g; 68%): p.f.(acetona/n-hexano) 198-199 °C; IV (filme):

882, 1645, 1758, 3070, 3327 cm¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz) δ

0,89; 0,95; 0,96; 0,99; 1,04 (s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃,

26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s, 3H, 30-H₃); 2,40 (dt, J= 10,7 Hz e

J = 5,7 Hz, 1H, 19-H); 3,34 (d, J = 10,9 Hz, 1H, 28_a-H); 3,80 (d, J= 10,0 Hz, 1H, 28_b-H) ; 4,59 (m, 1H, 29_a-H) ; 4,69 - 4,73 (m, 2H, 3«-H e 29_b-H) ; 7,15 (s, 1H, 4'H); 7,47 (m, 1H, 5'-H); 8,21 (s, 1H, 2'-H). ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz): δ

60,4 (C28); 87,1 (C3); 109,7 (C29); 117,4 (C5'); 128,9 (C4^T ); 136,6 (C2' ) ; 147,9 (OCO); 150,4 (C20); EI-MS m/z (%): 536 (6) Μ+, 203 (37), 189 (35), 119 (41), 105 (37), 95 (35), 91 (30), 81 (29), 79 (32), 69 (100).

Exemplo 14 (ΙΗ-Triazol-l-il)-carboxilato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en3β-ί1ο (Composto 21)

Uma solução de betulina 1 (200 mg, 0,45 mmol) e

CDT (443 mg, 2,7 mmol) em THF anidro (8 ml) foi submetida a refluxo durante 10 h para obter o composto 19. A dicionouse o gel de sílica (0,2 mg) que se deixou sob agitação, à temperatura ambiente, durante 15 h. Removeu-se o gel de sílica por filtração, colocando o filtrado num matraz contendo água destilada (20 ml) que se extraiu com éter dietílico (3 x 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secouse com Na2SO₄ anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, amarelo, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 21 (0,15 g; 63%) : p.f. (acetona/n-hexano) 221-224 °C; IV (filme) :

886, 1642, 1764, 3070, 3406 cif¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz) δ

0,90; 0,98; 0,99; 1,04 (s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃,

27-H₃); 1,69 (s, 3H, 30-H₃); 2,40 (dt, J = 10,5 Hz e J =

5,8 Hz, 1H, 19-H); 3,34 (d, J = 10,8 Hz, 1H, 28_a-H); 3,80 (d, J = 10,8 Hz, 1H, 28_b-H); 4,59 (s largo, 1H, 29_a-H) ;

4,69 (s largo, 1H, 29_b-H) ; 4,79 (dd, J = 9,1 e 7,5 Hz, 1H,

3α-Η) ; 8,08 (s, 1Η, 3’-H); 8,79 (s, 1H, 5’-H); ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz): δ 60,4 (C28); 87,8 (C3); 109,7 (C29);

145,3 (C5¹); 147,2 (OCO); 150,4 (C20); 153,4 (C3¹); EI-MS ια/ζ (%): 537 (6) M⁺, 119 (49), 107 (46), 105 (60), 93 (55), 91 (100), 81 (46), 79 (53), 77 (51), 70 (38).

Exemplo 15 (lH-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-acetoxilup-(20)29-en-

28-ilo (Composto 22)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14, mas usando o acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en-3p-ilo 3 (0,24 g; 0,5 mmol) e CDI (0,16 g; 1,0 mmol) em THF anidro (10 ml), a refluxo durante 5 horas. O resíduo sólido branco resultante da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 22 (0,25 g; 85%) : p.f.(acetona/n-hexano) 101-103 °C ; IV (filme): 882, 1240, 1642, 1730, 1760, 3073 cnf¹; ³H

RMN (CDCI3, 300 MHz): δ 0,84; 0,85; 0,86; 1,00; 1,06 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,71 (s, 3H, 30H₃) ; 2,05 (s, 3H, OCOCH₃); 2,48 (m, 1H, 19-H); 4,20 (d, J = 10,6 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,47 (dd, J = 10,2 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 3a-H) ; 4, 63 - 4, 67 (m, 2H, 28_b-H e 29_a-H) ; 4,72 (s largo, 1H, 29_b-H); 7,12 (s, 1H, 4’-H); 7,45 (s, 1H, 5’-H); 8,22 (s, 1H, 2’-H); ¹³CRMN (CDC1₃, 75 MHz): δ 67,4 (C28);

80,8 (C3); 110,3 (C29); 117,2 (C5’); 129,9 (C4’ ); 136,8 (C2’); 148,8 (OCO); 149,5 (C20); 170,9 (OCOCH3); EI-MS m/z (%): 578 (19) Μ⁺, 189 (24), 187 (26), 133 (20), 119 (35),

105 (36), 93 (19), 91 (42), 79 (26), 69 (100).

Exemplo 16 (2'-Metil-lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-acetoxilup(20)29-en-28-ilo (Composto 23)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15, mas usando o acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en-3p-ilo 3 (0,24 g; 0,5 mmol) e CBMI (0,18 g; 1,0 mmol) em THF anidro (10 ml), a refluxo durante 7 h. 0 resíduo sólido branco resultante da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:2), obtendo-se o composto 23 (0,25 g; 86%): p.f.(acetona/n-hexano) 99-102 °C ; IV (filme): 882, 1245, 1642, 1731, 1757, 3073 cnt¹; ³H RMN (CDCI3, 300 MHz): δ 0,84; 0,85; 0,86; 0,99; 1,06 (todos s,

15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,71 (s, 3H, 30-H₃) ; 2,05 (s, 3H, OCOCH3); 2,48 (dt, J = 10,7 Hz e J = 5,7 Hz,

1H, 19-H); 2,70 (s, 3H, 2’- CH₃); 4,16 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,47 (dd, J= 10,2 Hz e J = 5, 8 Hz, 1H, 3a-H) ; 4,58

- 4,62 (m, 2H, 28_b-H e 29_a-H) ; 4,72 (s largo, 1H, 29_b-H) ;

6,90 (d, J = 1,8 Hz, 1H, 4'-H); 7,38 (d, J = 1,8 Hz, 1H,

5’-H); ¹³CRMN (CDCI3, 75 MHz): δ 67,0 (C28); 80,8 (C3);

110,2 (C29); 118,1 (C5’); 127,1 (C4^T); 147,9 (C2’); 149,5 (OCO); 149,7 (C20); 170,9 (OCOCH₃) ; EI-MS m/z (%): 592 (14)

M⁺, 189 (20), 187 (16), 145 (15), 119 (22), 107 (19), 105 (25), 91 (28), 83 (100), 79 (16).

Exemplo 17 (ΙΗ-Triazol-l-il)-carboxilato de 3p-acetoxilup-(20)29-en28-ilo (Composto 24)

A reacção foi realizada de acordo como procedimento descrito para o composto 16, mas usandoo acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en-3p-ilo 3 (0,24 g; 0,5 mmol) e CDT (0,25 g; 1,5 mmol) em THF anidro (10 ml)a refluxo durante 6 h. 0 resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 4:2), obtendo-se o composto 24(0,21 g; 74%) : p.f. (acetona/n-hexano) 111-114 °C ; IV (filme) : 882, 1247, 1642, 1729, 1770, 1795, 3070 cif¹; 0 RMN (CDC1₃, 300 MHz): δ 0,84; 0,85; 0,86; 1,00; 1,06 (todos s, 15H, 23H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃) ; 1,71 (s, 3H, 30-H₃) ; 2,05 (s, 3H, OCOCH₃); 2,49 (dt, J = 10, 6 Hz e J = 6,0 Hz, 1H,

19-H); 4,30 (d, J= 10,7 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,47 (dd, J= 10,2 Hz e J= 5,8 Hz, 1H, 3«-H) ; 4,63 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,72 - 4,75 (m, 2H, 28_b-H e 29_b-H) ; 8,09 (s, 1H, 3’-H); 8,82 (s,

1H, 5’-H); ¹³C RMN (CDC1₃, 75 MHz) δ 68,4 (C28); 80,8 (C3);

110,3 (C29); 145,4 (C5’); 147,9 (OCO); 149,5 (C20); 153,6 (C3¹); 171,0 (OCOCH₃); EI-MS m/z (%): 579 (6) M⁺, 202 (58), 189 (88), 187 (78), 145 (59), 119 (78), 107 (62), 105 (77), (100), 79 (58).

Exemplo 18 (ΙΗ-Imidazol-l-il)-carboxilato de 28-acetoxilup-(20)29-en3β-ί1ο (Composto 25)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo 4 (0,24 mg; 0,5 mmol) e CDI (0,16 mg; 1 mmol) em THF anidro (10 ml) a refluxo durantes 7 h. 0 resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatográfia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 25 (0,24 g; 81%) : p.f. (acetona/n-hexano) 194-195 °C ; IV (filme) : 882, 1239, 1642, 1733, 1756, 3070 cif¹; ³H RMN (CDC1₃, 400

MHz): δ 0,89; 0,95; 0,99; 1,05 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s, 3H, 30-H₃) ; 2,07 (s, 3H, OCOCH₃); 2,45 (dt, J = 10,8 Hz e J = 5,9 Hz, 1H, 19-H); 3,85 (d, J= 11,0 Hz, 1H, 28_a-H); 4,26 (d, J= 11,0 Hz, 1H, 28_b-H) ; 4,60 (s, 1H, 29_a-H) ; 4, 66 - 4,70 (m, 2H, 3«-H e 29_bH) ; 7,07 (s, 1H, 4’-H); 7,41 (s, 1H, 5’-H); 8,12 (s, 1H,

2’-H); ¹³CRMN (CDC1₃, 100 MHz): δ 62,8 (C28); 86,3 (C3);

109,9 (C29); 117,0 (C5’); 130,5 (C4^T ); 137,0 (C2’); 148,5 (OCO); 150,0 (C20); 171,6 (OCOCH₃) ; EI-MS m/z (%): 578 (5), M+, 189 (64), 187 (56), 145 (44), 133 (43), 119 (51), 105 (66), 95 (50), 91 (71), 69 (100).

Exemplo 19 (2'-Metil-lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 28-acetoxilup(20)29-εη-3β-ί1ο (Composto 26)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo 4 (0,24 g; 0,5 mmol) e CBMI (0,18 g; 1,0 mmol) em THF anidro (10 ml) a refluxo durante 9 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 26 (0,24 g; 82%) : p.f. (acetona/n-hexano) 173-175 °C ; IV (filme): 882, 1642, 1740, 3070 cm·¹; ³Η RMN (CDC1₃, 300 MHz): δ 0,89; 0,95; 0,96; 0,99; 1,05 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3,

26-H3, 27-H3)	; 1,69 (s, 3H,	30-H₃); 2,	08 (s,	3H, OCOCH3) ;
2,45 (dt, J --	= 10,7 Hz e J =	5, 7 Hz, 1H,	19-H);	2,69 (s	, 3H,
2’-CH₃) ; 3, 85 (d, J = 11,0	Hz, 1H, 28_a-H) ;	4,26 (d,	J =
11,0 Hz, 1H,	28_b-H) ; 4,60 (s	largo, 1H,	29_a-H)	; 4,64 -	4, 69
(m, 2H, 3a-H	e 29_b-H) ; 6,90	(d, J = 1,5	Hz, 1H, 4’-H);	7, 36
(d, J = 1,5	Hz, 1H, 5’-H);	¹³CRMN (CDCI3, 100 MHz) :	62, 7
(C28); 86,4	(C3); 109,9 (C29); 118,1	(C5');	126,8 (	C4 ' ) ;
147,9 (C2¹);	149,1 (OCO); 150,0 (C20);	171, 6	(OCOCH3)	; EI-
MS m/z (%):	592 (6) M⁺, 467	(100), 407	(58) ,	107 (45)	, 105
(56), 95 (70	), 91 (52), 83 (	40), 81 (61	), 67 (	53) .

Exemplo 20 (lH-Triazol-l-il)-carboxilato de 28-acetoxilup-(20)29-en3β-ί1ο (Composto 27)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 16 mas usando o composto 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo 4 (0,24 g; 0,5 mmol) e CDT (0,25 g; 1,5 mmol) em THF anidro (10 ml) a refluxo durante 8 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 27 (0,26 g; 88%) : p.f. (acetona/n-hexano) 221-224 °C ; IV (filme) :

1733, 1766, 1787, 3070 cnf¹; ³H RMN (CDC1₃, 400 MHz) : δ

0,90; 0,97; 0,98; 0,99; 1,05 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃,

25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s, 3H, 30-H₃) ; 2,07 (s, 3H,

OCOCH₃); 2,45 (dt, J = 10,9 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 19-H) ;

3, 85	(d, J =	10, 9	Hz, 1H, 28_a-H) ,	; 4,26	(d, J =10, 9	Hz,	1H,
28_b-H	); 4,60	(s largo, 1H,	29_a-H	) ; 4,69 (s largo,	1H,	29_b-
H) ; 4	,79 (dd,	J =	9,0 Hz e	J = 7	, 5 Hz,	1H, 3a-H);	8, 08	(s,
1H, 3	’-H); 8,	79 (	s, 1H, 5’·	-H) ; ¹³C RMN	(CDC1₃, 100	MHz	) : δ
62, 8	(C28);	87, 9	(C3); 109,9 (	:C29) ;	145,3 (C5’)	; 1	47, 3
(OCO)	; 150,1	(C20	); 153,5	(C3¹);	171, 6	(OCOCH₃); EI-MS	m/z
(%) :	579 (4)	M⁺,	203 (51),	189	(84) ,	187 (69), 159 (	47) ,
119 (	56), 107	(57)	, 105 (75	), 91	(100),	79 (54).

Exemplo 21

Ácido 3β —(lH-imidazol-1-carboxiloxi)-lup-20(29)-en-28-óico (Composto 28) e (lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 28-(lHimidazol-l-il)-28-oxo-lup-20(29)-en-3p-ilo (Composto 30)

A	reacção	foi	realizada	de acordo com 0
procedimento	descrito	para	0 composto 14	mas usando 0 ácido
betulínico 2	(0,30 g;	0, 65	mmol) e CDI	(0,53 g; 3,25 irano 1)

em THF anidro (12 ml) a refluxo durante 7 h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo

40-60°C-acetato de etilo 2:3), obtendo-se o composto 28 hexano) 228-230 °C; IV (filme): 1642, 1699, 1762, 3070 cm ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz) δ 0,89; 0,95; 0,96; 0,99 (todos s,

15H, 23-H₃,

24-H₃, 25-H₃,

6-H₃, 27-H₃);

3H, 30H₃); 3,04 (dt,

J = 10,7 Hz e J = 4,1 Hz,

1H, 19-H) ; 4,62

7, 43

MHz) :

δ 86, 6

136, 9

550 (42), 159 composto

151°C;

(CDC1₃,

24-H₃,

29_a-H) ; 4,69 (dd, J = 10, 1

Hz e J =

6,2 Hz, largo,

1H, 29_b-H) ;

5'-H) (C3) ;

109, 7 (C29);

117, 2

148, 3 (OCO);

(4 ) M :⁺, 203

150, 5 (C20);

(41) , (37), 119 (0,09

IV (filme):

400 MHz) δ

25-H₃, 26-H₃, (47) , g;

; ¹³CRMN (CDC1₃, 75

181,5 (C28);

EI-MS

189 (50), 187 (40) (41), 79 (36), 69 (100)

1642, 1722, 1757, 3073 cm^-1;

0,91; 0,95; 1,01 (todos s,

3H, 30-H₃)

175

150RMN

15H,

23-H₃, ; 2,97 (dt,

J = 10,9 Hz e J = 4,5 Hz,

4,66—4,69

3a-H

100 MHz) : δ

1H, 19-H);

e 29_a-H); 4, (m, 2H,

78 (s largo, 1H,	29_b-H) ;	7, 05	(s, 1H,	4’-H);
4”-H); 7,41 (s,	1H, 5-	-H); 7,	53 (s,	1H, 5’-
1H, 2-H); 8,28	(s, 1H,	2'-H);	¹³crmn	(CDC1₃,
86,3 (C3); 110,2	(C29);	117, 0	(C5’’)	; 117,4
(C4^T); 130,5	(C4” ) ;	137, 0	(C2'’)	; 137,3

(33) ,

203 (22), 189 (31),

107 (27),

105 (27), 95 (38), 91 (28) , (24), 69 (100).

(C2^T ’); 148,5 (OCO);

149, 7 (C20), 172,9 (C28);

EI-MS m/z

Exemplo 22

Ácido 3β-(2'-metil-lH-imidazol-1-carboxiloxi)-lup-20(29) en-28-oic (Composto 29) e (2'-metil-lH-imidazol-l-il)carboxilato de 28-(2'-metil-lH-imidazol-l-il)-28-oxo-lup20(29)-en-3p-ilo (Composto 31)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o ácido betulinico 2 (0,30 g; 0,65 mmol) e CBMI (0,57g; 3,25 mmol) em THF anidro (12 ml) a refluxo durante 8 h. 0 sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 29 (0,28 g; 77%) : p.f. (acetona/nhexano) 170-174 °C; IV (filme): 883, 1642, 1703, 1756, 3070 ctíT¹; ³H RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,89; 0,94; 0,95; 0,96; 0,99 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,70 (s, 3H, 30-H3); 2,67 (s, 3H, 2'-CH3); 3,05 (dt, J= 10,7 Hz e J = 4,3 Hz, 1H, 19-H); 4,61 - 4,68 (m, 2H, 3«-H e 29a-H) ; 4,75 (s largo, 1H, 29b-H) ; 6,88 (d, J= 1,6 Hz, 1H, 4’-H); 7,35 (d, J = 1,6 Hz, 1H, 5’-H); ¹³CRMN (CDC13, 75 MHz): δ 86,2 (C3); 109,6 (C29); 118,0 (C5’); 127,3 (C4’ ); 147,9 (C2’); 149,3 (OCO); 150,6 (C20); 180,6 (C28); EI-MS m/z (%): 564 (10) M⁺, 439 (100), 393 (61), 203 (58), 123 (50), 121 (50), 109 (57), 95 (74), 83 (66), 81 (97).E o composto 31 (0,09 g; 22%) : p.f. (acetato de etilo/n-hexano) 164-166 °C; IV (filme) : 1642, 1722, 1752, 3070 cnf¹; ³H RMN (CDC1₃,

400 MHz) δ 0,89; 0,94; 0,96; 1,01 (todos s, 15H, 23-H₃, 2454

H₃,	25-H₃, 26-H₃,	27-H₃) ;	1,73	(s, 3H, 30-H₃);	2, 63 (	s, 3H,
2’-	CH₃); 2,65 (s,	3H, 2’’	-ch₃)	; 3,06 (dt, J	= 11,0 Hz	e J =
4,3	Hz, 1H, 19-H)	; 4,62-	4, 66	(m, 1H, 3a-H,	29	_a-H); 4	,79 (s
largo, 1H, 29_b-H)	; 6,86	(s largo, 2H, 4'-H	e	4’’-H)	; 7,34
(s	largo, 1H, 5	’-H); 7	,39	(s largo, 1H,	5	’’-H);	¹³crmn
(CDC1₃, 100 MHz) :	δ 85,9 (C3	); 110,1 (C29)	r	118, 0	(C5’ e
C5'	’); 127,1 e	127,7 (	C4 ’ ,	C4 ’ ’ ) ; 14 7,9	e	148, 9	(C2' ,
C2'	'); 149,5 (OCO); 150	, 0 (C20); 175,2 (C28	) ; EI-MS m/z

(%): 628 (2) Μ⁺, 519 (18), 127 (30), 119 (17), 105 (20), 95 (22), 93 (18), 91 (19), 83 (100), 81 (24).

Exemplo 23 (ΙΗ-Triazol-l-il)-carboxilato de 28-(lH-triazol-l-il)-28oxo-lup-20(29)-en-3p-ilo (Composto 32)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 16 mas usando o ácido betulinico 2 (0,30 g; 0,7 mmol) e CDT (0,64g; 3,9 mmol) em THF anidro (12 ml) a refluxo durante 7 h. 0 sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merk, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 32 (0,32 g; 82%): p.f.(acetona/n-hexano) 253-256 °C; IV (filme):

1642, 1734, 1762, 1787, 3070 cm¹; ³H RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 0,92; 0,95; 0,97; 0,99; 1,02 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃,

25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,73 (s, 3H, 30-H₃); 2,96 (m, 1H, 19H) ; 4,66 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,78 - 4,81(m, 2H, 3a-H e

29_b-H) ; 8,00 (s, 1H, 3’-H); 8,07 (s, 1H, H-3’’); 8,79 (s,

1H, H-5’’); 8,93 (s, 1H, H-5’); ¹³CRMN (CDC1₃, 100 MHz): δ

87,8 (C3); 110,1 (C29); 145,1 (C5’); 145,3 (C5^T ’); 147,3 (OCO); 149,9 (C20);

152,1 (C3’); 153,6 (C3” ) ;

173,4 (C28);

EI-MS m/z (%): 602 (10) M⁺, 202 (70),

190 (86), 189 (93),

188 (100), 187 (65), 173 (72), 105 (62), 91 (85), 70 (84).

Exemplo 24

3β —(ΙΗ-imidazol-l-carboniloxi)-lup-20(29)-en-28-oato de metilo (Composto 33)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 5 (0,10 g; 0,2 mmol) e CDI (0,06 g; 0,4 mmol) em

THF anidro (4 ml) a refluxo durante 6 h. 0 resíduo sólido branco obtifo foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 33 (0,11 g; 88%) : p.f. (acetona/nhexano) 220-224 °C ; IV (filme): 1240, 1642, 1725, 1758,

3070 cm’¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz): δ 0,98; 0,93; 0,95; 0,97 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s,

3H,	30-H₃); 3,00 (dt, J =	10,3 Hz e J = 3,7	Hz, 1H,	19-H);
3, 67	(s, 3H,	COOCH3); 4,61 (s largo,	1H,	29_a-H) ; ·	4, 67 -
4,74	(m, 2H,	3a-H, 29_b-H) ;	7,13 (s, 1H,	4 ’ -h:	); 7,45 (	s, 1H,
5 '-H	); 8,24 '	(s, 1H, 2'-H)	; ¹³CRMN (CDC1	3, 75	MHz): δ	86, 9
(C3)	; 109,6	(C29); 117,2	(C5^T); 129,3	(C4 ' )	; 136,6	(C2');
148,	1 (OCO);	150,5 (C20);	176,6 (C28);	EI-MS m/z (%	) : 564
(4)	M⁺, 203 l	(35), 190 (28	), 189 (71),	187 (	38), 175	(35) ,
119	(43), 105	(33), 91 (37	), 79(33) 69	(100)

Exemplo 25

3β-(2'-Metil-lH-imidazol-l-carboniloxi)-lup-20(29)-en-28oato de metilo (Composto 34)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 5 (0,10 g; 0,2 mmol) e CBMI (0,07 g; 0,4 mmol) em

THF anidro (4 ml), a refluxo durante 9 h. 0 residuo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 34 (0,12 g; 93%) : p.f. (acetona/nhexano) 205-207 °C ; IV (filme): 1642, 1728, 1752, 3073 cif ¹; ³Η RMN (CDC1₃, 400 MHz): δ 0,88; 0,93; 0,94; 0,95; 0,98 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s, 3H, 30-H₃); 2,65 (s, 3H, 2’-CH₃); 3,00 (dt, J= 10,4 Hz, J = 3,8 Hz, 1H, 19-H); 3,67 (s, 3H, COOCH3); 4,61 (s,1H,

29_a-H) ; 4,65 (dd, J= 11,2 Hz e J = 5, 1 Hz, 1H, 3a-H) ; 4,74 (s, 1H, 29_b-H) ; 6,85 (s largo, 1H, 4'-H); 7,34 (s largo,

1H, 5’-H); ¹³CRMN (CDCI3, 100 MHz): δ 86,0 (C3);109,7 (C29); 118,0 (C5’); 127,7 (C4^T); 147,9 (C2’); 149,5 (OCO);

150,5 (C20); 176,6 (C28); EI-MS m/z (%): 578 (13) M⁺, 393 (100), 189 (68), 119 (56), 105 (64), 95 (71), 91 (75),83 (87) , 81 (70), 79 (52) .

Exemplo 26 (lH-Imidazol-l-il)-carboxilato de 33-hidroxi-30-metoxi-lup20(29)-en-28-ilo (Composto 35) e (lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 30-metoxilup-20(29)-εηο-3β,28-diilo (Composto 38)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 7 (0,21g; 0,4 mmol) e CDI (0,22 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 8 h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 1:1), obtendo-se o composto 35 (0,17 g; 68%) : p.f. (acetona/n-hexano) 136-138 °C ; IV (filme):

1239, 1645, 1760, 3078, 3406 cnf¹; ³Η RMN (CDC1₃, 300 MHz) :

δ 0,78; 0,84; 0,98; 1,02; 1,07 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 2,39 (dt, J = 11,0 Hz e J = 5,3 Hz, 1H, 19-H); 3,20 (dd, J = 10,8 Hz e J = 5, 1Hz, 1H, 3«-H) ;

3, 89	(s, 2H,	30-H₂) ;	3, 38 (	s, 3H,	och₃:	1 ; 4,21 (d, J = 10	,8
Hz,	1H, 28_a-H	); 4,65	(d, J	= 10, 8	Hz,	1H, 28_b-H) ; 4,95 (	s,
1H,	29_a-H), 4	,98 (s,	1H, 29_b-H),	7, 13	(s, 1H, 4’-H); 7,	47
(s,	1H, 5’-H)	; 8,23	(s, 1H,	2’-H);	¹³CRMN (CDCI3, 75 MHz) :	δ
58, 3	(OCH3);	67,2	(C28);	74,9	(C30)	; 78,8 (C3); 109	,7
(C29	); 117,2	(C5¹);	129,9 1	(C4¹ ) ;	136, 8	(C2¹); 148,8 (OCO	);

150,3 (C20); EI-MS m/z (%): 566 (7) M⁺, 187 (30), 119 (34),

105 (32), 93 (32), 91 (46), 81 (33), 79 (39), 69 (100), 67 (29). Ε o composto 38 (0, 08 g; 28%) : p.f. (acetona/nhexano) 174-176 °C; IV (filme): 1239, 1645, 1757, 3078 cnf ¹; ³Η RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 0,91; 0,96; 1,03; 1,09 (todos s,

15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃);

2,40 (dt, J =

11,0 Hz e J= 5,3 Hz, 1H, 19-H); 3,37 (s, 3H, OCH₃); 3,89 (s, 2H, 30-H₂); 4,18 (d, J = 10,7 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,62 4,70 (m, 2H, 3«-H, 28_b-H) ; 4,95 (s, 1H, 29_a-H) ; 4,98 (s,

1H, 29_b-H) ; 7,07 (s, 1H, 4’-H); 7,08 (s, 1H, 4’’-H); 7,41 (s, 1H, 5’-H); 7,43 (s, 1H, 5’’-H); 8,13 (s, 1H, 2’-H);

8,15 (s, 1H, 2’’-H); ¹³C RMN (CDC1₃, 100 ΜΗζ): δ 58,4 (OCH₃); 66,9 (C28); 75,1 (C30); 86,2 (C3); 109,9 (C29);

117,0 (C5’, C5''); 130,6 e 130,7 (C4’, C4 ’ ’ ) ; 137,0 (C2’,

C2' ' ) ; 148,5 (OCO); 149,1 (OCO); 150,4 (C20); EI-MS m/z (%): 660 (11) M⁺, 199 (23), 189 (25), 187 (30), 145 (28),

(100).

Exemplo 27 (2'-Metil-lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-30metoxi-lup-20(29)-en-28-ilo (Composto 36) e (2'-metil-lHimidazol-l-il)-carboxilato de 30-metoxilup-20(29)-eno3p,28-diilo (Composto 39)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 7 (0,21 g; 0,4 mmol) e CBMI (0,24 g; l,4mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 7h. 0 sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 4060°C-acetato de etilo 2:1), obtendo-se o composto 36 (0,19 g; 74%) : p.f. (acetona/n-hexano) 109-112 °C ; IV (filme) : 1645, 1759, 3070, 3389 cm’¹; ^ΤΗ RMN (CDC1₃, 300 ΜΗζ) : δ 0,76; 0,83; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 2,38 (dt, J = 11,1 Hz e J = 5,3 Hz,

1H, 19-H); 2,68 (s, 3H, 2’-CH₃); 3,19 (dd, J= 10,8 Hz e J = 5,1 Hz, 1H, 3a-H) ; 3,36 (s, 3H, OCH₃) ; 3,88 (s, 2H, 30H₂); 4, 14 (d, J = 10,4 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,58 (d, J = 10,4

Hz, 1H, 28_b-H) ; 4,94 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,96 (s largo,

1Η, 29_b-H) ; 6,88 (d, J = 1,7Hz, 1H, 4’-H); 7,37 (d, J =

1,7Hz,	1H, 5’-H);	¹³crmn	(CDCI3,	75 MHz) : δ	58, 3	(OCH₃) ;
66, 7	(C28);	74,9	(C30);	78, 8	(C3) ;	109, 6	(C29);	118, 0
(C5');	127, 4	(C4 ' )	; 147,9	(C2');	149, 8	(OCO);	150, 4	(C20);
EI-MS	m/z (% )	: 580	(9) M⁺,	189 (25), 187	(28) ,	119 (27), 107

(23), 105 (25), 91 (24), (100), 81 (27), (25). E o composto 39 (0, 07g; 21%) : p.f. (acetona/n-hexano) 116-118 °C; IV (filme) : 1642, 1754, 3070 cnf¹; ³H RMN (CDC1₃,400

MHz) δ 0,90; 0,95; 0,96; 1,03; 1,08 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 2, 39 (dt, J = 11,3 Hz e J =

5,5 Hz, 1H, 19-H); 2,65 E 2,66 (ambos s, 3H cada, 2'-CH3,

2’’-CH₃); 3,37 (s, 3H, OCH₃) ; 3,89 (s, 2H, 30-H₂) ; 4,14(d,

J= 10,8 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,58 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28_b-H);

4,65 (dd, J = 11, 1 Hz e J = 4,8 Hz, 1H, 3a-H) ; 4,95 (s, 1H, 29_a-H) ; 4,98 (s, 1H, 29_b-H) ; 6,86 (s, 1H, 4’-H); 6,87 (s largo, 1H, 4'-H); 7,34 (s largo, 1H, 5'-H); 7,36 (s largo, 1H, 5’’-H); ¹³C RMN (CDCI3, 100 MHz): δ 58,4 (OCH₃);66,5 (C28); 75,1 (C30); 85,9 (C3); 109,8 (C29); 118,0 (C5’ e C5’’); 127,7 e 127,9 (C4^T, C4 ’ ’ ) ; 147,9 (C2’ e C2 ’ ’ ) ; 149,5 (OCO); 149,9 (OCO); 150,4 (C20); EI-MS m/z (%): 688(11)

M⁺, 187 (23), 185 (22), 145 (32), 119 (22), 105 (26),95 (26), 91 (46), 83 (100), 81(27).

Exemplo 28 (lH-Triazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-30-metoxi-lup20(29)-en-28-ilo (Composto 37) e do (lH-triazol-l-il)carboxilato de 30-metoxilup-20(29)-eno-3p,28-diilo (Composto 40)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 16 mas usando o composto 7 (0,21 g; 0,4 mmol) e CDT (0,30 g; 1,8 mmol) em

THF anidro (8 ml), a refluxo durante 7 h. 0 sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 1:1), obtendo-se o composto 37 (0,15 g; 57%) : p.f. (acetona/n-hexano) 137-140 °C ; IV (filme) : 1645, 1766, 1782, 3070, 3414 cif¹; G RMN

(CDC1₃, 300	MHz): δ	0,76;	0, 83;	0, 97;	1,01; 1,06 (todos s,
15H, 23-H₃,	24-H₃, 25-H₃,	26-H₃,	27-H₃)	; 2, 39 (dt, J =	11,2
Hz e J = 5,	3 Hz, 1H,	19-H	); 3,19	(dd,	J = 10,8 Hz e J	= 5,0
Hz, 3a-H);	3,36 (s,	3H,	OCH₃) ;	3, 88	(s, 2H, 30-H₂);	4,29
(d, J = 10,	6 Hz, 1H,	28_a-	H); 4,72 (d,	J = 10,6 Hz, 1H,	28_b-

H) ; 4,94 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,97 (s largo, 1H, 29_b-H) ;

8, 09	(s largo, 1H,	3’-H); 8,82 (s	largo, 1H, 5'-H);	¹³CRMN
(CDC1	₃, 75 MHz):	δ 58,3 (OCH₃);	68, 1	(C28	) ;	74,9 (	C30) ;
78, 9	(C3); 109,7	(C29); 145,4 (C5’);	147,	9 (	OCO) ;	150, 3
(C20)	; 153,6 (C3’)	; EI-MS m/z (%)	: 567	(13	) M⁴	, 201	(71) ,
189 (	78), 187 (70)	, 145 (72), 131	(61) ,	119	(71	), 105	(82) ,
91 (:	100), 79 (57)	. E o composto	40 (	0, 05	g;	17%) :	p.f.
(acetona/n-hexano)	172-175 °C; IV (filme)		1646,	1763,
1782,	3070 cm ¹; ³H	RMN (CDC1₃, 400	MHz)	δ 0,	91;	0, 98;	0, 99;
1,03;	1,09 (todos	s, 15H, 23-H₃,	24-H₃	, 25	-h₃,	26-H₃	, 27-
H₃) ;	2,40 (dt, J =	= 11,1 Hz e J =	5,4 Hz, 1H,	19-H);	3, 37

(s, 3H, OCH₃); 3,89 (s, 2H, 30-H₂) ; 4,29 (d, J= 10,8 Hz,

1H, 28_a-H) ; 4,71 - 4,82 (m, 2H, 3«-H e 28_b-H) ; 4,96 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,98 (s largo, 1H, 29_b-H) ; 8,08 e 8,09 (ambos s, 1H cada, 3'-H, 3''-H); 8,79 e 8,83 (ambos s, 1H cada, 5'-H, 5^T'-H);

'C RMN (CDC1₃, 100 MHz): δ 58,3 (OCH₃);

68,1 (C28); 74,9 (C30); 87,7 (C3); 109,8 (C29); 145,3 e

145.4 (C5’, C5' ' ) ; 147,2 (OCO); 147,9 (OCO); 150,3 (C20);

153.5 e 153,6 (C3¹, C3' ' ) ; EI-MS m/z (%): 663 (15) M⁺, 201 (70), 119 (81), 107 (66), 105 (80), 95 (75), 91 (100), 81 (94 ) , 79 (82) , 67 (74 ) .

Exemplo 29 (lH-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-(20R)-lupan29-OXO-28-Í1O (Composto 41) e (lH-imidazol-l-il)-carboxilato de (20R) -lupan-29-oxo-3p,28-diilo (Composto 43)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 9 (0,29 g; 0,6 mmol) e CDI (0,32 g; 1,9 mmol) em

THF anidro (12 ml), a refluxo durante 7 h. 0 resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 2:3), obtendo-se o composto 41 (0,23 g; 67%) : p.f. (acetona/nhexano) 175-177 °C ; IV (filme): 1239, 1722, 1762, 3414 cif¹; ³H RMN (CDC1₃, 400 MHz): δ 0,77; 0,85; 0,98; 1,07 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,15 (d,

J = 7,0 Hz, 3H, 30-H₃); 2,64 (m, 1H, 20-H) ; 3,21 (dd, J =

10,8 Hz e J= 5,1 Hz, 1H, 3a-H) ; 4,13 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,60 (d, J = 10,9 Hz, 1H, 28_b-H); 7,09 (s largo,

1H, 4'-H); 7,42 (s largo, 1H, 5'-H); 8,15 (s largo, 1H, 2'H) ; 9,85 (d, J= 1,9 Hz, 1H, 29-H) ; ¹³CRMN (CDC1₃, 100 MHz): δ 14,4 (C30); 48,8 (C20); 66,4 (C28); 78,8 (C3); 117,1 (C5’); 130,6 (C4^T); 137,0 (C2’); 149,1 (OCO); 206, 3 (C29);

EI-MS m/z (%): 552 (18) M+, 207 (46), 189 (58), 187 (47), 145 (49), 119 (45), 105 (51), 91 (58), 79 (48), 69 (100). E o composto 43 (0,13 g; 30%): p.f.(acetona/n-hexano) 145-146 °C ; IV (filme): 1239, 1716, 1758 cif¹; ³H RMN (CDC1₃, 300

MHz): δ 0,92; 0,97; 0,99; 1,09 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,16 (d, J = 7, 0 Hz, 3H, 30-H₃); 2,64 (m, 1H, 20-H) ; 4,13 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28_a-H) ; 4,61 (d, J = 10,9 Hz, 1H, 28_b- H) ; 4,69 (dd, J = 10, 9 Hz e J = 5, 4 Hz,

1H, 3a-H);	7,09 (s largo, 2H, 4'	-H, 4’’	-H); 7,43 (s	largo,
2H, 5	’ -H,	5''-H); 8,15 (s largo,	2H, 2’·	-H, 2”-H); 9,	85 (d,
J = 1	, 9 Hz	, 1H, 29-H) ; ¹³CRMN (CDC1₃, 75	MHz) : δ 66, 3	(C28);
86, 2	(C3)	; 117,0 (C5’, C5' ' );	130, 6	(C4’, C4' ' ) ;	136, 9
(C2' ,	C2 ' ’	); 148,4 (OCO); 148,9	(OCO);	206, 1 (C29);	EI-MS
m/z	(%) :	646 (6) M+, 187 (23),	159 (	Ϊ23), 119 (23	) , 105
(29) ,	93 (	20), 91 (34), 81 (19),	79 (22	), 69 (100).

Exemplo 30 (2'-Metil-lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi(20R)-lupan-29-oxo-28-ilo (Composto 42)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 9 (0,19 g; 0,4 mmol) e CBMI (0,15 g; 0,8 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 6 h. 0 residuo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 42 (0,18 g; 75%) : p.f. (acetona/n-hexano) 132-134 °C ; IV (filme) : 1716, 1759, 3365 cm⁴; ³H RMN (CDC1₃, 300

MHz)	: δ 0,77; 0,85; 0,98; 1,07 (todos s, 15H,	23-H₃,	24-H₃,
25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,16	(d, J = 7, 0	Hz, 3H,	30-H₃)	; 2,66
(s,	3H, 2'-CH₃); 3,21 (dd,	J = 10,4 Hz	, J = 4,	6 Hz, 1H, 3a-
H) ;	4,09 (d, J = 10, 9 Hz,	1H, 28_a-H) ;	4,55 (d,	J = 10	,9 Hz,
1H,	28_b-H) ; 6, 87 (d, J =	1,7 Hz, 1H,	4’-H);	7,35 (d, J =
1,7	Hz, 1H, 5’-H); 9,85 (	d, J = 1,8	Hz, 1H,	29-H);	¹³crmn
(CDC1₃, 100 MHz): δ 66,0	(C28); 78,!	9 (C3);	118, 1	(C5’);
130,	1 (C4^T); 144,3 (C2');	149,2 (OCO)	; 206,3	(C29) ;	EI-MS
m/z	(%): 566 (8) M⁺, 189	(67), 161	(72), 1	47 (72)	, 133
(83)	, 105 (80), 91 (93), 83 (68), 81 (	100), 79	(62) .

Exemplo

Ácido 28-(lH-imidazol-l-il)-lup-20(29)-eno-3,28-diona (Composto 44)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto mmol)

1,4 mmol) em THF anidro a refluxo durante 9 h.

sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash eluente: éter de petróleo , obtendo-se composto

189-190 °C;

IV (filme):

1642, 1703, 1721, 3073 cm-1; 1H

RMN (CDC13, 400

MHz) δ 0,94; 0,96; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, (s, 1H, 2’-H) 13C RMN (CDC13, 100 MHz): δ 110,2 (C29);

117,4 (C5^T); 129,6 (C4^T), 137,3 (C2’), 149,7 (C20);172,9 (C28); 217,9 (C3); EI-MS m/z (%): 504(4) M+, 410 (30),409 (100), 245 (46), 203 (49), 189 (58), 147 (25), 107(31),

105 (27), 91 (24).

Exemplo 32

Ácido 28-(2'-metil-lH-imidazol-l-il)-lup-20(29)-eno-3,28diona (Composto 45)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 11 (0,20 g; 0,4 mmol) e CBMI (0,24 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 8 h. 0 sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 45 (0,20 g; 84%) : p.f. (acetona/n-hexano) 196-198 °C; IV (filme) : 1642, 1703, 1721, 3073 cnf¹; ³H RMN (CDC1₃,

300 MHz) δ 0,94; 0,98;l,00; 1,02; 1,06 (todos s, 15H,23H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,72 (s, 3H, 30-H₃);2,63 (s, 3H, 2’-CH₃); 3,06 (dt, J= 11,1 Hz, J= 4,6 Hz, 1H,19H) ; 4,65 (s largo, 1H, 29_a-H) ; 4,78 (s largo, 1H, 29_b-H) ;

6,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H, 4’-H); 7,40 (d, J = 1,5 Hz,1H,

5'-H); ¹³C RMN (CDC1₃, 100 MHz): δ 110,0 (C29) ; 117,9 (C5^T);

126,9 (C4^T); 148,9 (C2’); 149,9 (C20); 175,2 (C28); 218,0 (C3); EI-MS m/z (%): 518 (2) M⁺, 409 (100), 245 (54),203 (50), 189 (76), 119 (50), 105 (58), 91 (71), 81 (72), 79 (49) .

Exemplo 33

Ácido 28-(lH-imidazol-l-il)-lup-1,20(29)-dieno-3, 28-diona (Composto 46)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 12 (0,20 g, 0,5 mmol) e CDI (0,22 g; 1,4 mmol) em

THF anidro (8 ml), a refluxo durante 9 h. 0 resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merk, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 46 (0,19 g; 82%) : p.f. (acetona/nhexano) 95-96 °C ; IV (filme): 1645, 1668, 1720, 1762, 3070 cm¹; ³H RMN (CDC1₃, 300 MHz): δ 1,00; 1,01; 1,07; 1,12 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,72 (s,

3H,	30-H₃) ;	2, 98 (dt, J =	11,0 Hz	e J	= 4,6 Hz, 1H,	19-H);
4, 67	(s,	1H	, 29_a-H); 4,79	(s, 1H,	29_b-H) ; 5,80	(d, J	= 10, 1
Hz,	1H, 2	-H	) ; 7, 05 (s, 1H,	4’-H);	7, 12	(d, J =	10,1 Hz, 1H,
1-H)	; 7,54	(s, 1H, 5'-H);	8,29 (s,	1H,	2'-H); ¹³CRMN (	:cdci₃,
75 MHz) :	δ	110,3 (C29);	117, 5	(C5’	); 125,2	(C2) ;	128, 8
(C4 ’	); 137,	1 (C2’); 149,5	(C20);	159,	6 (Cl);	172, 6	(C28);
205,	4 (C3	);	EI-MS m/z (%):	502 (4)	M⁺,	408 (32)	, 407	(100),
243	(43) ,	205 (30), 203 (2	6), 189	(34)	, 135 (25	), 105	(28) ,

(29).

Exemplo 34

Ácido 28-(2'-metil-lH-imidazol-l-il)-lup-1,20(29)-dieno3,28-diona (Composto 47)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 12 (0,20 g; 0,5 mmol) e CBMI (0,24 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 9 h. 0 resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:1), obtendo-se o composto 47 (0, 20 g; 87%) : p.f. (acetona/nhexano) 99-103 °C ; IV (filme): 1642 , 1668, 1721, 1760,

3073 cm¹; X RMN (CDCI3, 300 MHz): δ 1,01; 1,07; 1,12

(todos s,	15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃,	27-H₃); 1,73	(s,
3H,	30-H₃)	; 2, 67 (s, 3H, 2'	^r-CH₃); 3,06 (dt	, J = 10, 8 Hz	e J
= 4,	3 Hz,	1H, 19-H); 4,67	(s, 1H, 29_a-H);	4,80 (s, 1H,	29_b-
H) ;	5, 80 (	d, J = 10, 3 Hz,	1H, 2-H) ; 6,90	(s largo, 1H,	4 ’-
H) ;	7,12 (	d, J = 10, 3 Hz,	1H, 1-H); 7,42	(s largo, 1H,	5-
H) ;	¹³crmn	(CDCI3, 75 MHz	): δ 110,1 (C29); 118,0 (C5’);
125,	1 (C2)	; 126,4 (C4');	148,9 (C2¹); 149,6 (C20); 1	59, 6
(Cl)	; 175,	0 (C28); 205,4	(C3); EI-MS m/z	(%): 516 (3)	M⁺,
408	(37) ,	407 (100), 243	(56), 205 (37	), 189 (42),	135
(43)	, 105	(37), 91 (44) , 81 (36) .
		Exemplo 35

Ácido 2-hidroxi-28-(lH-imidazol-l-il)-lup-1,20(29)-dieno3,28-diona (Composto 48) e (ΙΗ-imidazol-l-il)-carboxilato

A reacção foi realizada de acordo com o procede 28-(ΙΗ-imidazol-l-il)-3,28-dioxo-lup-1,20(29)-dien-2-ilo (Composto 49) dimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 13 (0,30 g, 0,65 mmol) e CDI (0,52 g, 3,25 mmol) em THF anidro (12 ml), a refluxo durante 8 h. 0 resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo1:4), obtendo-se o composto 48 (0, 24 g; 70%) : p.f. (acetona/nhexano) 145-148 °C ; IV (filme): 1645, 1667, 1724,1762,

3078, 3448 cm’¹; ³H RMN (CDC1₃, 400 MHz): δ 0,99;1,10;

1,14; 1,19 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃,27H₃); 1,72 (s, 3H, 30-H₃); 2,97 (dt, J = 10, 6 Hz e J = 4,0

Hz, 1H, 19-H); 4,67 (s, 1H, 29_a-H) ; 4,79 (s, 1H, 29_b-H) ;

6,45 (s, 1H, 1-H); 7,09 (s, 1H, 4'-H); 7,56 (s, 1H, 5'-H); 8,43 (s, 1H, 2’-H); ¹³CRMN (CDC1₃, 100 MHz): δ 110,4 (C29) ;

117,4 (C5’); 128,8 (Cl); 129,6 (C4^T ); 137,3 (C2’); 143,9 (C2); 149,5 (C20); 172,9 (C28); 201,1 (C3); EI-MS m/z (%):

518 (22) M⁺, 423 (100), 215 (94), 213 (65), 189 (57), 119 (55), 105 (54), 91 (89), 79 (54), 69 (55). E o composto 49 (0,11 g; 27%): p.f.(acetona/n-hexano) 211-213 °C ; IV (filme): 1642, 1721, 1757, 1826, 3070 cm’¹; ³H RMN (CDC1₃,

300	MHz) :	δ 0,89;	1,00; 1,16; 1,17; 1,36 (	todos s, 15H, 23-
h₃,	24-H₃,	25-H₃,	26-H₃, 27-H₃); 1,73 (s,	3H, 30-H₃) : 2,92
(dt,	J =	10,9 Hz	e J = 4, 6 Hz, 1H, 19-H)	l ; 4,67 (s largo,
1H,	29_a-H)	V 4,74	(s largo, 1H, 29_b-H) ; 6,	97 (s, 1H, 1-H);
7, 04	e 7,	21 (ambos s, 1H cada, 4'-H, 4''	-H) ; 7,51 e 7,79

(ambos s, 1H cada, 5'-H, 5''-H); 8, 27 e 8,42 (ambos s, 1H

cada, 2'-H, 2''-H);	¹³crmn	(CDCI3,	75	MHz): δ	110, 6	(C29);
117, 3 (C5’ e C5 ’ ’ ) ;	129, 6	(C4 ’ e	C4 ’	'); 132,6	(Cl) ;	137, 2
(C2’ e C2 ' ’ ) ; 14 6, 5	(C2) ;	149,1 l	;oco:	l; 152,2	(C20);	172, 8

(C28); 202,3 (C3); EI-MS m/z (%): 612 (9) M⁺, 518 (35), 517 (100), 449 (19), 405 (14), 295 (15), 189 (27), 105 (18), 91 (21), 69 (16).

Exemplo 36

Ácido 2-(2'-metil-lH-imidazol-l-carboniloxi)-3-oxolup1,20(29)-dien-28-óico (Composto 50)

A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 13 (0,21 g; 0,45 mmol) e CBMI (0,40 g; 2,3 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 7 h. 0 resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 2:3), obtendo-se o composto 50 (0,22 g; 83%) : p.f. (acetona/nhexano) 141-143 °C ; IV (filme): 1645, 1687, 1770, 1824, 3070, 3394 cnf¹; ³H RMN (CDC1₃, 400 MHz): δ 1,01; 1,05; 1,16; 1,21; 1,24 (todos s, 15H, 23-H₃, 24-H₃, 25-H₃, 26-H₃, 27-H₃); 1,69 (s, 3H, 30-H₃); 2,66 (s, 3H, 2’-CH₃); 3,04 (dt,

J =	10, 9	Hz e J =	4,0 Hz,	1H,	19-H);	4,62 (s,	1H,	29_a-H) ;
4,75	(s,	1H, 29_b-H)	; 6, 92	(d,	J =	= 1,7	Hz, 1H,	4 ’ -h:	) ; 6, 99
(s,	1H, 1	-H); 7,41	(d, J =	1,7	Hz,	1H,	5’-H); ¹³	CRMN	(CDCI3,
100	MHz) :	δ 109,8	(C29);	118,	4 (	C5 ' ) ;	127,6 (	:C4') ;	142,0

(Cl); 145,7 (C2’); 147,4 (C2); 148,6 (OCO); 150,2 (C20);

180, 7	(C28);	196,9 (C3); EI-MS	m/z (%) :	576	(3)	M⁺,	215
(100),	213 (	62), 107 (35), 105	(46), 93	(35) ,	91	(62)	, 81
(34) ,	79 (40	), 67 (34).

Estudo preliminar da actividade citotóxica:

A actividade antiproliferativa dos compostos 14, 28, 35, 41 e 48 foi avaliada nas seguintes linhas celulares cancerígenas: MCF-7 (adenocarcinoma humano da mama), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), A-375 (melanoma humano), HT-29 (adenocarcinoma humano do cólon), HeLa (adenocarcinoma humano do cólo do útero), MIA-PaCa-2 (adenocarcinoma humano do pâncreas), SH-SY5Y (neuroblastoma humano), e Jurkat (leucemia humana) (FIG. 7). Para a realização deste ensaio, as suspensões celulares foram preparadas e diluídas de acordo com o tipo de célula e com a densidade celular pretendida (l*10³ - 30 χ 10³ células/ poço baseado nas caracteristicas de crescimento). As células foram semeadas em placas de 96-poços e a viabilidade celular foi determinada pelo método do MTT (MCF-7, HepG2, A-375, HT-29, HeLa and MIA-PaCa-2) ou do XTT (SH-SY5Y and Jurkat) após 72 h de incubação com os compostos, na concentração de 20 μΜ, em triplicado.

Actividade citotóxica nas linhas celulares HepG2, HeLa, Jurkat e Chang liver

A citotoxicidade dos compostos com as fórmulas gerais (I) e (II) 14-50 foi determinada nas linhas celulares humanas (HepG2, HeLa e Jurkat) (Tabela 3) . Os compostos apresentados na Tabela 4 foram também testados na linha celular não tumoral (Chang liver). A viabilidade celular das células HeLa, HepG2 e Chang liver foi determinada pelo método do MTT. Resumidamente, as células em crescimento exponencial foram semeadas em placas de 96poços, na densidade de 1 χ ΙΟ³, 8χ 10³e5x 10³ células/poço, respectivamente e incubadas durante 24 h antes do tratamento. 0 meio de crescimento foi substituído por meio contendo os compostos a testar dissolvidos em DMSO (concentração final de DMSO <0,1%) a diferentes concentrações, em triplicado e incubaram-se as células durante 72 h. Após incubação com os compostos, o meio foi removido e adicionou-se uma solução de MTT (0,5 mg/ml, 100 μΐ) a cada poço e incubou-se novamente as placas durante 1 h. Adicionou-se DMSO (100 μΐ) para dissolver os cristais de formazana e leu-se a absorvância a 550 nm num leitor de placas ELISA (Tecan Sunrise MR20-301, TECAN, Áustria). Nas células Jurkat, a viabilidade celular foi determinada pelo método do XTT. Resumidamente, as células em crescimento exponencial foram semeadas em placas de 96-poços na densidade de 5,5 χ 10³ células/poço, tratadas com os diferentes compostos em triplicado e incubadas durante 72 h. Após incubação com os compostos adicionou-se a mistura de XTT (100 μΐ) e após 4 h de incubação leu-se a absor71 vância 450 nm, no leitor de placas ELISA. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 3 e 4 expressos como a concentração que inibe 50% do crescimento celular (IC50)· Conhecido pela sua actividade citotóxica, o ácido betulinico 2 foi utilizado como controlo positivo. Com base nos valores de IC50, os compostos foram classificados em muito activos (IC50 < 10 μΜ), moderadamente activos (10 μΜ > IC₅₀ < 30 Mm) e fracamente activos (IC50 > 30 μΜ) . Todos os valores de IC50 representam a média de pelo menos três experiências e estão expressos como a média ± desvio padrão (DP) .

Tabela 3

Actividade citotóxica in vitro dos derivados do tipo lupano ____________________IC50 (μΜ ±DP) ^a______________

Composto

HepG2 ^b Jurkat ^c HeLa ^d

2	36,4 ± 1,5	26, 9 ± 2,2	26, 0	±2,1
14	4,2 ± 0,3	16,3 ± 1,2	7,6	± 0, 6
15	8,1 ± 0, 4	15,8 ±2,4	11,0	± 1,7
16	-	-	15,2	±2,1
17	> 30	> 30	>	30
18	> 30	> 30	>	30
19	-	-	>	30
20	2,0 ± 0, 4	11,1 ±1,3	3, 0	± 0,2
21	-	-	11,3	±1,9
22	> 30	> 30	>	30
23	> 30	> 30	>	30

(continuação )

IC₅₀ (μΜ ±DP) ^a

Composto

HepG2 ^b Jurkat ^c HeLa ^d

24		-			-		23,2	±	2,1
25	>	3	0	>	3i	0	>	3i	0
26	>	3	0	>	3i	0	>	3i	0
27		-			-		>	3i	0
28	6,2	±	0,2	5,2	±	0,7	5,1	±	0, 3
29	7,3	±	1,0	16, 1	±	3, 3	7,5	±	1,5
30	2,9	±	0,4	6, 0	±	1,2	8,2	±	0,4
31	11,6	±	0, 8	20,1	±	3,2	12, 4	±	1,7
32		-			-		14,5	±	3,2
33	4,3	±	0,1	9,9	±	0, 6	8,2	±	0, 5
34	13, 4	±	1,7	16, 4	±	2,4	13, 4	±	1,7
35	8, 3	±	0,4	12,2	±	1,3	9,8	±	0, 6
36	14,4	±	1,3	24,8	±	4,7	8,9	±	2,1
37		-			-		13, 8	±	2, 3
38	19, 6	±	1,6	16,2	±	1,0	>	3l	0
39	28,2	±	2, 5	>	3i	3	13, 4	±	0, 6
40		-			-		>	3l	0
41	11,5	±	1,1	13, 7	±	1,4	11,1	±	1,4
42	14,3	±	2,4	21,3	±	4,1	16, 6	±	1,5
43	26, 1	±	1,1	20,2	±	1,6	19,2	±	1,5
44	0, 8 :	±	0, 05	1,4	±	0,2	2, 0	±	0, 3
45	5,5	±	1,1	9,3	±	2,2	4,2	±	1,2
46	1,7	±	0,2	2, 3	±	0, 3	3, 0	±	0,2
47	12, 7	±	1,2	9,4	±	0, 8	6, 4	±	0, 8
48	6, 5	±	0,4	7,0	±	1,6	4,6	±	0,7
49	4,0	±	0, 3	8,1	±	0, 6	3,9	±	0, 3
50	6, 8	±	1,5	12, 5	±	1,2	10, 6	±	0,7

^a Os resultados correspondem á média (±DP) de três experiências independentes feitas em triplicado ^b Carcinoma hepatocelular humano ^c Leucemia humana ^d Adenocarcinoma humano do colo do útero

Tabela 4

Actividade citotóxica in vitro dos derivados lupano numa linha celular não-tumoral

IC₅₀ (μΜ ±DP) ^aComposto

Chang liver ^b

2	92, 3	±	4,1
14	79, 7	±	6, 4
20	60, 7	±	3, 8
28	56, 8	±	2,2
30	149, 9	±	13, 6
33	73, 9	±	3, 6
35	96, 4	±	7,5
38	170, 4	±	17, 7
41	145,7	±	4,5
43	156,2	±	12, 5
44	48, 8	±	2, 8
46	55,9	±	4,6
48	62, 8	±	10, 3
49	71,6	±	4,9

^a Os resultados correspondem á média (±DP) de três experiências independentes feitas em triplicado ^b Células humanas de fígado normais

Análise do ciclo celular das células HepG2, HeLa, Jurkat e Chang liver tratadas com os compostos.

Os efeitos de alguns destes compostos no ciclo celular foram determinados por citometria de fluxo (Tabela 5). Para este ensaio semearam-se 2,3 χ 10⁵ HepG2 células/poço, 2,9 χ 10⁴ HeLa células/poço, 1,6 χ 10⁵ Jurkat células/poço e 1,4 χ 10⁵ Chang liver células/poço em placas de 6 poços com 2 ml de meio. 0 número de células a semear foi determinado pela relação células/área do poço, considerando o número de células semeado em placas de 96-poços. Após 24 h de incubação a 37°C com 5% de CO2, os compostos 20, 44, 46 e o ácido betulínico 2 foram adicionados nas concentrações correspondentes aos seus valores de IC50· As células Chang liver foram incubadas com os compostos 20, 44 e 46 a concentrações equivalentes aos respectivos valores de ICgo determinados nas células HepG2, a 72 h. Após 72 h de incubação as células foram tripsinizadas, centrifugadas e mantidas em tampão TBS contendo 1 mg/ml PI, 10 mg/ml RNAse livre de DNAase e 0,1% Igepal CA-630. Após um período de incubação de 1 hora, a 4°C, na ausência de luz, as amostras foram analisadas por FACS, utilizando um comprimento de onda de excitação de 4 88 nm e um citómetro de fluxo Epics XL (Coulter Corporation, Hialeah, FL). Todos os resultados representam a média de pelo menos 3 poços diferentes. Para calcular a percentagem de células em cada fase do ciclo celular utilizou-se o programa Multicycle [Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, (EUA)]. Todas as experiências foram realizadas 3 vezes com três replicados por experiência. Como demonstrado na Tabela 5 todos os compostos induzem um significativo aumento da população de células na fase S (aumento de 17 % para o composto 20, 20 % para o composto 44 e 12 % para o composto 46 nas células HepG2) com uma diminuição concominantes da percentagem de células na fase G0/G1 (diminuição de 12 % para o composto 20, 16 % para o composto 44 e 7 % para o composto 46 na linha celular HepG2) relativamente às células não tratadas, sugerindo que a inibição da proliferação celular pelos compostos testados está associada a uma paragem na fase S, do ciclo celular. Para avaliar a selectividade do efeito nas células tumorais, testámos os compostos 20, 44 e 46 numa linha celular não-tumoral. As células Chang liver foram tratadas com os compostos, a uma concentração equivalente ao seus valores de ICso determinados nas células HepG2, após 72 h de incubação e não se verificou qualquer efeito (Tabela 5).

Tabela 5

Análise do ciclo celular das células tratadas com os derivados lupano

Linha

Celular

Composto

Fase do Ciclo celular (% de células) ^a

G0/G1

G2/M

HepG2 ^b

Controlo	61,	3	±	2,	2	19,	1	±	0,	5	19,	5	±	2,	4
AB	59,	7	±	2,	0	25,	9	±	1,	3	14,	3	±	0,	9
20	49,	4	±	1,	2	36,	1	±	0,	8	14,	5	±	0,	8
44	45,	6	±	2,	1	39,	6	±	3,	6	14,	9	±	1,	4
46	54,	7	±	1,	5	30,	7	±	0,	6	14,	3	±	1,	0

HeLa ^c

Controlo	69,	8	±	0,	7	12,	9	±	0,	9	17,2 ± 0,7
AB	66,	8	±	1,	2	21,	4	±	0,	9	11,7 ±1,1
20	50,	6	±	1,	3	36,	4	±	2,	4	13, 0 ± 1,4
44	53,	1	±	1,	1	33,	1	±	0,	9	13,8 ± 1,1
46	64,	6	±	2,	4	25,	6	±	1,	5	9,7 ± 1,3

Jurkat ^d

Controlo	61,	7	±	4,	4	13,	2	±	1,	9	25,	1	±	2,	7
AB	56,	8	±	5,	0	18,	9	±	1,	2	24,	1	±	4,	7
20	48,	6	±	4,	4	35,	6	±	3,	1	15,	8	±	2,	1
44	52,	7	±	0,	5	26,	6	±	0,	9	20,	8	±	1,	1
46	49,	6	±	2,	6	29,	8	±	0,	8	20,	7	±	2,	4

Chang	Controlo 20	68,2 68, 6	± ±	2, 3	22, 0 22, 0	± ±	1,8	9,1 9,3	± ±	1,4 1,3
4,	2	3,	0
liver ^e	44	68,2	±	2,	9	23,2	±	2,	5	8, 6	±	0, 8
	46	68,2	±	4,	9	22, 6	±	3,	8	9,2	±	1,4

Os resultados correspondem à média (±DP) de três experiências independentes feitos em triplicado

Carcinoma hepatocelular humano

Leucemia humana

Adenocarcinoma humano do colo do útero

Células humanas de fígado normais

- 76 Provocação da apoptose pelos compostos 20, 44 e 46

A percentagem de células apoptóticas foi determinada 72 h após o tratamento das células com os derivados, a concentrações equivalentes aos seus valores de IC50· Resumidamente, o mesmo número de células HepG2, HeLa, Jurkat e Chang liver utilizado na análise do ciclo celular, foi tratado com os derivados 20, 44, 46 e ácido betulínico 2, como descrito anteriormente. As células foram recolhidas, lavadas com tampão de ligação, arrefecido em gelo (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂) e ressuspendidas neste mesmo tampão (95 μΐ) numa concentração máxima de 8 χ 10⁵ células/ml. Adicionou-se anexina V-FITC (1 pg/ml) e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente e na ausência de luz. Imediatamente antes da análise por FACS adicionaram-se 20 pl da solução de IP a 1 mg/ml.

Em cada histograma foram analisadas aproximadamente 1 χ 10⁴ células. As experiências foram realizadas três vezes, com triplicados para cada experiência.

A análise por FACS usando anexina V-FITC e IP foi utilizada para diferenciar as células em apoptose inicial (annexin V⁺ e IP~) das células necróticas ou em apoptose tardia (annexin V⁺ e IP⁺) . Os novos derivados do tipo lupano foram extremamente potentes a a provocar a apoptose nas células HepG2, HeLa e Jurkat células apresentando uma actividade marcadamente superior à do ácido betulínico 2 (FIG. 8) . 0 composto 44 foi o mais efectivo a provocar a apoptose, em todas as linhas celulares, apesar dos compostos 20 e 46 também serem extremamente efectivos (FIG. 8). Em comparação com as células não tratadas, o tratamento das células HepG2 com o composto 44 provocou a apoptose em 53 % das células (42% de apoptose inicial e 11% de apoptose tardia), o composto 46 provocou apoptose em 38% das células (28% de apoptose inicial e 10% de apoptose tardia) e o composto 20 provocou apoptose em 29% das células (22% de apoptose inicial e 7% de apoptose tardia) (FIG. 8) . Na concentração correspondente aos valores de ICso determinados nas células HepG2, não se observou nenhum efeito na provocação de apoptose nas células normais de fígado, Chang liver (Fig. 8). Estes resultados estão em concordância com a incapacidade demonstrada pelos três derivados em inibir a proliferação destas células (Tabela 4). A introdução da função imidazolilo demonstrou ser importante para a capacidade de provocar a apoptose e paragem do ciclo celular, uma vez que estes compostos exibem uma actividade superior à do ácido betulinico 2.

Citotoxicidade noutras linhas celulares cancerígenas

Os compostos apresentados na Tabela 6 também foram testados nas seguintes linhas celulares: PC-3 (adenocarcinoma humano da próstata), LNCaP (adenocarcinoma humano da próstata), LAPC4 (adenocarcinoma humano da próstata) and HT-29 (adenocarcinoma humano do cólon).

Tabela 6

Actividade citotóxica in vitro dos derivados lupano

Composto					IC₅₀ (μΜ	±DP)	a
LAPC4	b	LNCaP ^c	PC	-3	d	HT-	-29 ^e
14	10, 3	±	1,6	13, 0	±	1,5	21,0	±	2, 0		-
15		-			-			-		16,2	±	2,1
17	12, 9	±	1,1	14,4	±	1,3		•30		-
20	16, 4	±	2,1	15,0	±	1,8	9,2	±	0,7		-
28	11,8	±	0,9	15,6	±	0, 8	5,6	±	0,4		-
29		-			-			-		5,7	±	0, 6
30	4,4	±	0,2	1,9	±	0,2	1,1	±	0,1		-
31		-			-			-		7,8	±	1,6
34		-			-			-		12, 9	±	0, 5
35	9,5	±	0,7	7,7	±	0,9	11,4	±	1,3		-
36		-			-			-		10, 4	±	1,6
38	7,3	±	1,1	8,1	±	1,0	2, 0	±	0, 3		-
41		•30		15,6	±	2,4	16, 7	±	2,4		-
42		-			-			-		15,8	±	1,7
43	7,9	±	1,3	6, 9	±	0, 3	6,2	±	0,7		-
44	17,2	±	2, 3	13, 7	±	0, 5	6, 9	±	1,1		-
45		-			-			-		4,7	±	1,1
47		-			-			-		5,9	±	0, 3
50		-			-			-		9,0	±	1,7

^a Os resultados correspondeu à média (±DP) de três experiências independentes feitos en triplicado ^b Adenocarcinoma humano da próstata ^c Adenocarcinoma humano da próstata ^d Adenocarcinoma humano da próstata ^e Adenocarcinoma humano do cólon

Claims

1.

Composto, caracterizado por apresentar a

REIVINDICAÇÕES fórmula (I) ou (II):

em que, na fórmula I

Ri, R

2 e R3 têm os significados seguintes:

Compostos Ri R₂ R₃

14 OH X CH₂O N ^XN \=J ch₂=cch₃ 15 OH 0 ÇH₃ A X CH₂O N ^XN \=J ch₂=cch₃ ie OH 0 LI N CHsO^N' ^=N CH₂=CCHo 17 0 O^N^N \=/ 0 A /x CH₂O N ^XN \=J ch₂=cch₃ 18 0 çh₃ O^N ^XN \=/ 0 CH₃ A X CH₂O N ^XN \=J ch₂=cch₃ 19 0 X A O N -6 \=N 0 X A CH₂O N ^=N ch₂=cch₃ 0 20 O^N^N \=/ CH₂OH ch₂=cch₃ 21 ο-^Λ \=N CH₂OH ch₂=cch₃

r₃ (continuação)

R₂ o

X

CH₂O N ^XN \=/

O ÇH₃

A X ch₂o n ^xn \=/ o

A zN

CH₂O N ^=N

CH₂OAc

COOH

COOH \=J o ÇH₃tA \=J

1 zN_K \=N

COOMe

O

X /x

CH₂O N ^SN \=J

O ÇH₃

A X

CH₂O N ^XN \=J

O

A N

CH₂O N' ^=N

O

X /X

CH₂O N ^XN \=J o ÇH₃

A X

CH₂O N ^SN \=J

O

U N CH₂CrN' ^=N ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃ ch₂=cch₃

CH₂=CCH₂OMe

CH₂=CCH₂OMe (continuação )

Compostos Ri r₂ r₃ 0 X CH₂O N ^XN \=/ 41 OH CH(CH₃)CHO 42 OH 0 ÇH₃ A Ã CH₂O N ^SN \=/ CH(CH₃)CHO 0 0 43 O^N^N \=/ U CH,0 N ^XN \=J CH(CH₃)CHO

e, na fórmula (II), R4, R5 e ³³³³³³ têm os significados seguintes:

Compostos R₄ R₅

0 CH₃ 45 H \=/ 0 46 H An \=J 47 H 0 ch₃ IA \=J 0 48 OH An \=/ 0 0 49 O-^N^N \=J Vn \=J 50 0 ch₃ O^N ^XN \=J COOH 2. Processo para a preparação de um composto reivindicação 1, caracterizado por se fazer reagir

composto de fórmula (III) (III) em que ³⁷³⁷⁷⁷ é uma ligação simples ou dupla; R7 é H ou OH; R₈é OH, OAc ou =0; R_g é CH₂0H, CH₂0Ac, COOH ou COOMe e Ri₀ é CH₂=CCH₃, CH₂=CCH₂0Me ou CH(CH₃)CHO, com CDI, CDMI ou CDT ao refluxo num solvente anidro sob atmosfera inerte.

3. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma guantidade terapeuticamente eficaz de um composto da reivindicação 1 e um diluente, veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1 para uso no tratamento do cancro, caracterizado por o referido composto ser administrado a um paciente com necessidade de tal tratamento.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4, para uso no tratamento do cancro, caracterizado por o cancro ser seleccionado a partir do grupo constituído por carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do colo do útero, leucemia, adenocarcinoma do cólon e adenocarcinoma da próstata.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, para uso na inibição da progressão do ciclo celular numa célula associada com uma doença neoplásica, caracterizado por o referido composto ser administrado a um paciente com necessidade de tal tratamento.

7.

Composto de acordo com a reivindicação 6, para uso na inibição da progressão do ciclo celular numa célula associada com uma doença neoplásica, caracterizado por a doença neoplásica ser carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do cólo do útero ou leucemia.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1, para uso para provocar a apoptose numa célula associada com uma doença neoplásica, caracterizado por o referido composto ser administrado a um paciente com necessidade de tal tratamento.

9. Composto de acordo com a reivindicação 8, para uso para provocar a apoptose numa célula associada com uma doença neoplásica, caracterizado por a doença neoplásica ser carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do cólo do útero ou leucemia.

10. Método para a identificação de um tumor susceptível de ser tratado com um composto da reivindicação 1, caracterizado por compreender o contacto de uma amostra de células com o referido composto, em que uma IC50 do composto para a amostra de células, inferior ou igual a 30 μΜ é indicativa de que o tumor é susceptível de ser tratado com o referido composto.