PT105331A - Conservante alimentar - Google Patents

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PT105331A
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PT105331A
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Sara Alexandra Valadas Da Silva Monteiro
Ricardo Manuel De Seixas Boavida Ferreira
Alexandra Manuela Lourenco Carreira
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Cev Biotecnologia Das Plantas S A
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Abstract

OS INVENTORES PROPORCIONAM A UTILIZAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM POLIPÉPTIDO ANTIMICROBIANO COMPREENDENDO BLAD OU UMA SUA VARIANTE ACTIVA PARA PREVENIR OU INIBIR DETERIORAÇÃO DE UM PRODUTO ALIMENTAR POR UM MICROORGANISMO. É IGUALMENTE PROPORCIONADO UM MÉTODO PARA PREVENÇÃO OU INIBIÇÃO DA DETERIORAÇÃO DE UM PRODUTO ALIMENTAR POR UM MICROORGANISMO COMPREENDENDO A ADMINISTRAÇÃO A UM PRODUTO ALIMENTAR DISSO NECESSITADO DE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM POLIPÉPTIDO ANTIMICROBIANO COMPREENDENDO BLAD OU UMA SUA VARIANTE ACTIVA.

Description

1 DESCRIÇÃO "Conservante alimentar"
Campo da Invenção A invenção refere-se ao campo de agentes antimicrobianos que têm como alvo microorganismos que deterioram alimentos.
Introdução A conservação de alimentos é o processo de tratamento de alimentos para prevenir ou inibir a deterioração dos alimentos causada por degradação química/enzimática endógena e/ou causada ou acelerada por um microorganismo. Existem várias técnicas para a conservação de alimentos, algumas delas inibindo processos endógenos (e.g. antioxidantes), algumas inibindo processos microbianos (e.g. antimicrobianos), e algumas inibindo ambos os tipos de processos (e.g. congelação). Um composto que é utilizado para inibir a deterioração de alimentos é vulgarmente referido como um conservante, que pode ser, por exemplo, um antioxidante ou um antimicrobiano. Técnicas particulares de conservação de alimentos incluem secagem, aquecimento, refrigeração ou congelação, inibição osmótica (e.g. utilização de xaropes ou sal), embalagem sob vácuo, enlatamento e engarrafamento gelificação, envasilhamento, envasamento, irradiação ionizante, processamento em campo eléctrico pulsado, conservação de alimentos em alta pressão e conservação de alimentos em pressão de água ultra-elevada, utilização de antioxidantes, e/ou utilização de conservantes antimicrobianos (e.g. dióxido de enxofre, dióxido de carbono, etanol, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido sórbico, benzoatos, nitratos e nitritos, sulfitos, propionato de cálcio e metilcloroisotiazolinona).
Apesar do número relativamente grande de técnicas de conservação de alimentos que são presentemente empregues, existe uma necessidade de desenvolvimento de novos conservantes antimicrobianos. Isto deve-se às inadequações de 2 muitas técnicas preexistentes para eficazmente atingir microorganismos e a problemas com a eficácia e/ou segurança de muitos conservantes antimicrobianos preexistentes em particular.
Muitas técnicas de conservação de alimentos que tentam criar condições de crescimento desfavoráveis para microorganismos são ineficazes contra organismos que sobrevivem em condições extremas (e.g. espécies de Pseudomonas conseguem crescer a temperaturas muito baixas; o Bacillus coagulans é resistente ao calor e tolerante aos ácidos; muitas espécies de Aspergillus demonstram oligotrofia; espécies de Zygosaccharomyces têm elevada xerotolerância).
Muitos conservantes antimicrobianos preexistentes têm actividade moderada, especialmente contra microorganismos com resistência inata ou adquirida e/ou espectro estreito. Por exemplo, espécies de Zygosaccharomyces têm elevada tolerância ao etanol, ao ácido acético, ao ácido sórbico, ao ácido benzóico e ao dióxido de enxofre. Em adição, vários dos conservantes antimicrobianos preexistentes foram associados a vários efeitos secundários tais como problemas respiratórios ou DDA. Em exemplos particulares, o dióxido de enxofre é irritante para os brônquios de asmáticos, os nitritos são potencialmente carcinogénicos, os benzoatos foram associados a várias alergias, asma, erupções cutâneas e danos cerebrais.
Adicionalmente, as técnicas eficazes para inibição do crescimento microbiano em alimentos, tais como baixo pH ou baixa actividade de água, são frequentemente inaceitáveis para o consumidor (e.g. dão um gosto ácido) ou têm implicações negativas na saúde (e.g. elevado teor de sal ou de açúcar).
Está entre os objectivos da presente invenção tentar uma solução para estes problemas, e especificamente, por exemplo, proporcionar um novo agente antimicrobiano com uma actividade potente e de largo espectro contra microorganismos enquanto possuindo baixa toxicidade.
Sumário da Invenção
Os inventores verificaram surpreendentemente que o polipéptido Blad de Lupinus apresenta uma potente actividade 3 antimicrobiana contra um grande número de diversos organismos bacterianos e fúngicos que causam a deterioração de alimentos. Os inventores verificaram também que o polipéptido Blad não é tóxico, o que torna portanto o Blad um excelente composto para utilização como conservante alimentar antimicrobiano.
Deste modo, os inventores proporcionam a utilização de uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa, para prevenir ou inibir a deterioração de um produto alimentar por um microorganismo. Preferivelmente o referido microorganismo é uma bactéria (preferivelmente uma espécie que deteriora alimentos dos géneros Pseudomonas ou Bacillus) ou um fungo (preferivelmente uma espécie que deteriora alimentos de um dos seguintes géneros: Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Botrytis, Colletotrichum, Saccharomyces, Kluyveromyces e Zygosaccharomyces).
Em concretizações preferidas o produto alimentar é derivado de, proporciona, ou é, um fruto, um fruto seco, um vegetal, uma semente, um açúcar, um produto lácteo, um alimento líquido ou pastoso, carne, peixe ou pão.
Em concretizações preferidas o produto alimentar é um morango, preferivelmente em que o microorganismo é Botrytis cinerea ou Colletotrichum acutatum, preferivelmente Botrytis cinerea.
Em concretizações preferidas a referida composição compreende ainda um agente quelante.
Os inventores proporcionam também um método para prevenção ou inibição da deterioração de um produto alimentar por um microorganismo compreendendo a administração a um produto alimentar disso necessitado de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa.
Descrição dos Desenhos A invenção será descrita com referência aos desenhos anexos, em que: 4 a Figura 1 mostra a sequência de codificação do precursor de β-conglutina de Lupinus albus (SEQ ID NO: 1); e a Figura 2 mostra o fragmento interno da sequência de codificação do precursor de β-conglutina que corresponde a Blad (SEQ ID NO:3).
Descrição Detalhada da Invenção
Blad
Blad ("banda de Lupinus albus doce") foi o nome dado a um produto de clivagem estável e intermediário da β-conglutina, a principal proteína de reserva presente em sementes do género Lupinus. Foi caracterizado como um polipéptido de 20 kD, composto por 173 resíduos de aminoácido, e codificado por um fragmento interno (519 nucleótidos, depositado no GenBank com o número de acesso ABB13526) do gene que codifica o precursor de β-conglutina de Lupinus (1791 nucleótidos, publicado no GenBank, com o número de acesso AAS97865). Quando são utilizados iniciadores que codificam as sequências terminais de Blad para amplificar uma sequência do ADN genómico de Lupinus, obtém-se um produto de -620 pb, indicando a presença de um intrão no fragmento génico que codifica Blad. O Blad de ocorrência natural é o principal componente de um glico-oligómero de 210 kD que se acumula exclusivamente (após intensiva proteólise limitada de β-conglutina) nos cotilédones de espécies de Lupinus, entre os 4o e 12° dias após o início da germinação. Enquanto o referido oligómero é glicosilado, o Blad de ocorrência natural não é glicosilado. O glico-oligómero contendo Blad é composto por vários polipéptidos, sendo que os principais exibem massas moleculares de 14, 17, 20, 32, 36, 48 e 50 kD. O polipéptido de 20 kD, o Blad, é de longe, o mais abundante polipéptido no interior do oligómero e parece ser o único com actividade de lectina. O Blad de ocorrência natural constitui aproximadamente 80% da proteína total cotiledonar em plântulas de 8 dias de idade. A sequência de codificação do precursor de β-conglutina de L. albus (SEQ ID NO:l) é dada na Figura 1. A sequência de codificação da subunidade progenitora da β-conglutina está localizada nos resíduos 70 a 1668. A subunidade progenitora de 5 β-conglutina codificada de 533 resíduos de aminoácido (SEQ ID NO:2) é:
MGKMRVRFPTLVLVLGIVFLMAVSIGIAYGEKDVLKSHERPEEREQEEWQPRRQRPQSRREE REQEQEQGSPSYPRRQSGYERRQYHERSEQREEREQEQQQGSPSYSRRQRNPYHFSSQRFQT LYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLILPKHSDADYVLVVLNGRATIT IVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSTSYILNPDDNQKLRVVKLAIPINNPGYFYDFYPSSTKD QQSYFSGFSRNTLEATFNTRYEEIQRIILGNEDEQEYEEQRRGQEQSDQDEGVIVIVSKKQI QKLTKHAQSSSGKDKPSDSGPFNLRSNEPIYSNKYGNFYEITPDRNPQVQDLNISLTYIKIN EGALLLPHYNSKAIYVVVVDEGEGNYELVGIRDQQRQQDEQEEKEEEVIRYSARLSEGDIFV IPAGYPISINASSNLRLLGFGINADENQRNFLAGSKDNVIRQLDRAVNELTFPGSAEDIERL IKNQQQSYFANGQPQQQQQQQSEKEGRRGRRGSSLPF O fragmento interno da seguência de codificação do precursor de β-conglutina que corresponde a Blad (SEQ ID N0:3) é dado na Figura 2. 0 polipéptido Blad (SEQ ID NO:4) é:
RRQRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLILPKHS DADYVLVVLNGRATITIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSTSYILNPDDNQKLRVVKLAIPI NNPGYFYDFYPSSTKDQQSYFSGFSRNTLEATFNTRYEEIQRIILGNED A invenção refere-se a uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa. Refere-se portanto a uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano incluindo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante activa. Em concretizações alternativas, a composição consiste essencialmente num polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa e/ou o polipéptido antimicrobiano consiste essencialmente em Blad ou uma sua variante activa. Em outras concretizações o polipéptido antimicrobiano compreendendo (ou consistindo essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa, pode ser utilizado na forma isolada.
Uma variante activa de Blad é uma variante de Blad que retém a capacidade de actuar como antimicrobiano (i.e. tem actividade antimicrobiana - veja-se adiante para uma descrição do nível desta actividade e como medi-la). "Uma variante activa de Blad" inclui no seu âmbito um fragmento de SEQ ID NO:4. Em concretizações preferidas, é seleccionado um fragmento de SEQ ID NO:4 que tem pelo menos 10% do comprimento 6 de SEQ ID NO:4, preferivelmente pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90% e o mais preferivelmente pelo menos 95% do comprimento de SEQ ID NO:4. 0 Blad ou uma sua variante têm geralmente um comprimento de pelo menos 10 resíduos de aminoácido, tal como pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 ou 173 resíduos de aminoácido. "Uma variante activa de Blad" inclui também no seu âmbito uma sequência polipeptídica que tem homologia com SEQ ID NO:4, tal como pelo menos 40% de identidade, preferivelmente pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 97%, e o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade, por exemplo ao longo da totalidade da sequência ou ao longo de uma região de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 30, preferivelmente pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 50, preferivelmente pelo menos 60, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, preferivelmente pelo menos 120, preferivelmente pelo menos 140, e o mais preferivelmente pelo menos 160 ou mais resíduos de aminoácido contíguos. Os métodos para medir a homologia de proteínas são bem conhecidos na especialidade e os peritos na especialidade entenderão que no presente contexto, a homologia é calculada com base na identidade de aminoácidos (por vezes referida como “homologia rígida"). A variante activa de Blad homóloga difere tipicamente da sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 4 por substituição, inserção ou deleção, por exemplo de 1, 2, 3, 4, 5 a 8 ou mais substituições, deleções ou inserções. As substituições são preferivelmente 'conservativas', ou seja, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido similar, onde aminoácidos similares partilham um dos seguintes grupos: resíduos aromáticos (F/H/W/Y), resíduos alifáticos não polares (G/A/P/I/L/V), alifáticos polares não carregados (C/S/T/M/N/Q) e alifáticos polares carregados (D/E/K/R). Os subgrupos 7 preferidos compreendem: G/A/P; I/L/V; C/S/T/M; N/Q; D/E; e K/R.
Um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa (como descrito acima) pode consistir em Blad ou uma sua variante activa com qualquer número de resíduos de aminoácido adicionados ao terminal N e/ou ao terminal C desde que o polipéptido retenha a actividade antimicrobiana (novamente, veja-se adiante para uma descrição do nível desta actividade e de como medi-la). Preferivelmente, não mais de 300 resíduos de aminoácido são adicionados a cada uma ou a ambas as extremidades de Blad ou uma sua variante activa, mais preferivelmente não mais de 200 resíduos de aminoácido, preferivelmente não mais de 150 resíduos de aminoácido, preferivelmente não mais de 100 resíduos de aminoácido, preferivelmente não mais de 80, 60 ou 40 resíduos de aminoácido, o mais preferivelmente não mais de 20 resíduos de aminoácido.
Um polipéptido antimicrobiano compreendendo (ou consistindo essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa (como descrito acima) pode ser utilizado na invenção na forma de uma proteína purificada (e.g. removida de uma fonte vegetal, animal ou microbiana) e/ou recombinante. A produção de uma forma recombinante permite a produção de variantes activas de Blad.
Os métodos de purificação de Blad de ocorrência natural estão já descritos na especialidade (e.g. Ramos et al (1997) Planta 203 (1) : 26-34 e Monteiro et al (2010) PLoS ONE 5(1) : e8542). Uma fonte adequada de Blad de ocorrência natural é uma planta do género Lupinus, tal como Lupinus albus, preferivelmente um cotilédone da referida planta, preferivelmente colhido entre cerca de 4 e cerca de 14 dias após o início da germinação, mais preferivelmente colhido 6 a 12 dias após o início da germinação (tal como 8 dias após o início da germinação). Estão divulgados na especialidade métodos para a extracção da proteína total que conduz a um extracto bruto compreendendo Blad, e para a purificação de uma proteína deste extracto que conduz a um extracto parcialmente purificado e.g. compreendendo o glico-oligómero contendo Blad que compreende Blad.
Para isolar o Blad propriamente dito pode então utilizar-se SDS-PAGE e/ou, preferivelmente, HPLC de fase inversa (RP)-HPLC numa coluna C-18.
Uma maneira alternativa de obter um extracto parcialmente purificado compreendendo o glico-oligómero que compreende Blad consiste em utilizar a actividade de ligação a quitina do Blad. 0 glico-oligómero liga-se de uma maneira muito forte a uma coluna de quitina como parte de uma purificação por cromatografia de afinidade com quitina, sendo eluído com HC1 0,05 N. Os detalhes de um exemplo deste método de purificação são como se segue:
Cotilédones de tremoços com oito dias de idade foram colhidos e homogeneizados em água Milli-Q Plus (pH ajustado para 8,0), contendo CaCl2 10 mM e MgCl2 10 mM. O homogenato foi filtrado através de gaze e centrifugado a 30 000 g durante 1 h a 4°C. A pelete foi subsequentemente suspensa em tampão Tris-HC1 100 mM, pH 7,5, contendo NaCl a 10% (p/v), EDTA 10 mM e EGTA 10 mM, agitou-se durante lha 4°C, e centrifugou-se a 30 000 g durante lha 4°C. A fracção total de globulina, contida no sobrenadante, foi precipitada com sulfato de amónio (561 g/1), deixada em agitação no frio durante lhe foi centrifugada a 30 000 g durante 30 min a 4°C. A pelete obtida foi dissolvida em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, dessalinizada em colunas PD-10 equilibradas com o mesmo tampão e passada através de uma coluna de cromatografia de afinidade com quitina pré-equilibrada com o mesmo tampão. A coluna foi lavada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e as proteínas ligadas foram eluídas com HC1 0,05 N. As fracções eluídas foram imediatamente neutralizadas com Tris 2 M e as fracções de pico foram reunidas, liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE .
Para a preparação da coluna de quitina, obteve-se quitina bruta da Sigma e processou-se como se segue: lavou-se a amostra de quitina extensivamente com água Milli-Q Plus, seguida de HC1 0,05 N. Lavou-se então com carbonato de sódio a 1% (p/v) e depois com etanol, até a absorvância da lavagem ser inferior a 0,05. A quitina foi então empacotada numa ponta de pipeta e equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. 9
Os métodos de produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na especialidade. Esses métodos, como aqui aplicados, irão envolver a inserção do polinucleótido que codifica um polipéptido compreendendo Blad, ou uma sua variante activa, num vector de expressão adequado - permitindo a justaposição do referido polinucleótido com um ou mais promotores (e.g. um promotor indutível, tal como T71ac) e com outros polinucleótidos ou genes de interesse - a introdução do vector de expressão numa célula ou organismo adequados (e.g. Escherichia coli), a expressão do polipéptido na célula ou organismo transformados e a remoção do polipéptido recombinante expresso dessa célula ou organismo. Para auxiliar nesta purificação o vector de expressão pode ser construído de maneira a que o polinucleótido adicionalmente codifique, por exemplo, um marcador terminal que possa auxiliar a purificação: e.g., um marcador de resíduos de histidina para purificação por afinidade. Uma vez purificado o polipéptido recombinante, o marcador de purificação pode ser removido do polipéptido, e.g., por clivagem proteolítica.
Numa composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo (ou consistindo essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa, o referido polipéptido está preferivelmente numa forma parcialmente purificada, mais preferivelmente numa forma purificada. 0 referido polipéptido está parcialmente purificado quando está presente num ambiente a que faltam um ou mais outros polipéptidos com os quais está naturalmente associado e/ou está representado por pelo menos cerca de 10% da proteína total presente. O referido polipéptido é purificado quando está presente num ambiente a que faltam todos, ou a maioria, dos outros polipéptidos com os quais está naturalmente associado. Por exemplo, Blad purificado significa que o Blad representa pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da proteína total numa composição.
Numa composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo (ou consistindo essencialmente 10 em) Blad ou uma sua variante activa, o conteúdo da proteína de Lupinus pode consistir essencialmente no glico-oligómero contendo Blad que compreende um polipéptido que compreende (ou consiste essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa.
Uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo (ou consistindo essencialmente em) Blad pode também ser uma formulação compreendendo outro(s) composto(s) adicionado(s) à composição pelo perito.
Deterioração de alimentos e produtos alimentares
Deterioração de um produto alimentar por um microorganismo significa qualquer alteração de um produto alimentar por um microorganismo que resulta numa alteração em e.g. o sabor, odor ou aparência {e.g. formato, cor, textura, firmeza) que diminua o seu valor nutricional e/ou comercial. Por produto alimentar entenda-se qualquer substância líquida ou sólida destinada ao consumo por um ser humano ou animal por razões nutricionais ou por prazer. 0 produto alimentar pode ser consumido directa ou indirectamente (e.g. após cozedura ou processamento, tal como refinamento de cereais). Quando aplicável, o produto alimentar é preferivelmente contemplado numa forma isolada do seu ambiente natural, tal como produtos alimentares vegetais colhidos (e.g. fruta, vegetais, sementes) e produtos isolados de animais (e.g. carne, peixe, leite). O produto alimentar pode ser derivado de, pode proporcionar, ou pode ser, um fruto, um fruto seco, um vegetal, uma semente, um açúcar, um produto lácteo, um alimento líquido ou pastoso, carne, peixe ou pão. Os produtos alimentares derivados de frutos incluem vinho e sumo de fruta. As plantas que proporcionam sementes incluem cereais (e.g. milho, trigo, cevada, sorgo, painço, arroz, aveias e centeio) e legumes (e.g. feijões, ervilhas e lentilhas). Os açúcares, preferivelmente sacarose, podem ser derivados de beterraba sacarina ou cana-de-açúcar. Os produtos lácteos incluem leite, natas, queijo e iogurte. Os alimentos líquidos ou pastosos incluem sopa, molhos, pickles, maionese, creme para salada e outros molhos para saladas, conservas, xarope e comida para bebés. Os produtos alimentares de carne e/ou peixe contemplados podem ser processados ou outros, e podem ser 11 cozinhados ou outros. Produtos alimentares adicionais particulares que estão contemplados podem ser encontrados na secção seguinte, que se refere a exemplos de produtos alimentares que podem ser deteriorados por microorganismos que podem ser um alvo para as utilizações e métodos da invenção.
Os produtos alimentares incluem também alimentos compostos pré-preparados tais como sanduíches, tartes, quiches etc., especialmente os que são presentemente projectados para armazenagem no frio.
Alvos microbianos
Os inventores proporcionam a utilização de uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa para prevenir ou inibir a deterioração de um produto alimentar por um microorganismo. Os microorganismos que podem causar deterioração de um produto alimentar - microorganismos que deterioram alimentos incluem, em particular, bactérias e fungos. Nesta utilização o polipéptido antimicrobiano pode ser considerado como um conservante alimentar antimicrobiano. 0 polipéptido antimicrobiano pode ser utilizado para prevenir ou inibir a deterioração de alimentos quer por bactérias Gram-positivas quer Gram-negativas. Os alvos bacterianos particularmente preferidos (com exemplos de produtos alimentares que podem deteriorar entre parêntesis) incluem: espécies de Pseudomonas que deterioram alimentos, tais como Pseudomonas aeruginosa (Arabidopsis thaliana e alface), Pseudomonas syringae (vários produtos alimentares derivados de plantas como beterraba, trigo e cevada), Pseudomonas tolaasii (cogumelos), Pseudomonas agarici (cogumelos), Pseudomonas fragi (produtos lácteos) e
Pseudomonas lundensis (leite, queijo, carne e peixe), mais preferivelmente P. aeruginosa; e espécies de Bacillus que deterioram alimentos tais como Bacillus subtilis (tomate, batata, pão) e Bacillus coagulans (leite, sumo de tomate). 0 polipéptido antimicrobiano pode ser utilizado para prevenir ou inibir a deterioração de alimentos quer por fungos unicelulares (leveduras) quer multicelulares (filamentosos, 12 bolores). Os alvos de levedura particularmente preferidos (com exemplos de produtos alimentares que podem deteriorar entre parêntesis) incluem: espécies de Saccharomyces que deterioram alimentos, tais como Saccharomyces cerevisiae (açúcar, xaropes de açúcar, vinho e refrigerantes tais como sumos de fruta); espécies de Kluyveromyces que deterioram alimentos, tais como Kluyveromyces marxianus (queijo); e espécies de Zygosaccharomyces que deterioram alimentos, tais como Zygosaccharomyces bailii (vinho, sumo de fruta, molhos de saladas e molho de tomate) e Zygosaccharomyces rouxii (xaropes de açúcar, sumos de fruta, doces e molhos de saladas). Os alvos de bolores particularmente preferidos (com exemplos de produtos alimentares que podem deteriorar entre parêntesis) incluem: espécies de Alternaria que deterioram alimentos, tais como Alternaria alternata (batata), Alternaria arborescens (tomate), Alternaria arbusti (pêra asiática), Alternaria brassicae (vegetais), Alternaria brassicicola (brássicas), Alternaria carotiincultae (cenoura), Alternaria conjuncta (cherivia), Alternaria dauci (cenoura), Alternaria euphorbiicola (brássicas), Alternaria gaisen (pêra), Alternaria infectoria (trigo), Alternaria japonica (brássicas), Alternaria petroselini (salsa), Alternaria selini (salsa), Alternaria solani (batata, tomate) e Alternaria smyrnii (salsa-de-cavalo, salsa); espécies de Aspergillus que deterioram alimentos, tais como Aspergillus fumigatus (frutos secos, batata, arroz e pão), Aspergillus niger (fruta e vegetais e.g. uva e cebola), e Aspergillus flavus (milho, amendoim); espécies de Fusarium que deterioram alimentos, tais como Fusarium oxysporum (fruta) e Fusarium graminearum (cevada, trigo e milho); espécies de Botrytis que deterioram alimentos, tais como Botrytis cinerea (morango, uva e tomate); e espécies Colletotrichum que deterioram alimentos, tais como Colletotrichum actuatum (morango, aipo, maçã, abacate, beringela, café e goiaba), Colletotrichum coccodes (tomate, batata), Colletotrichum capsici (manjericão, grão, pimento), Colletotrichum crassipes (maracujá), Colletotrichum gloeosporioides (vegetais e frutos e.g. marmelo e maçã), Colletotrichum graminicola (cereais), Colletotrichum kahawae (café), Colletotrichum lindemuthianum (feijão), Colletotrichum musae (banana), Colletotrichum nigrum (tomate), Colletotrichum orbiculare (melão, pepino), Colletotrichum pisi (ervilha) e Colletotrichum sublineolum (arroz). 13
Em concretizações preferidas o polipéptido antimicrobiano é utilizado para prevenir ou inibir a deterioração de um fruto por um microorganismo, preferivelmente um morango, e preferivelmente em que o microorganismo é Botrytis cinerea ou Colletotrichum acutatum, preferivelmente Botrytis cinerea. 0 perito será capaz de identificar, através de métodos de rotina, uma concentração adequada (i.e. uma concentração eficaz) com que utilizar o polipéptido antimicrobiano para prevenir ou inibir a deterioração em qualquer cenário particular. Preferivelmente, por exemplo, utiliza-se o Blad numa concentração de pelo menos 1 pg/ml, pelo menos 5 pg/ml, pelo menos 10 pg/ml, pelo menos 50 pg/ml, pelo menos 100 yg/ml, ou pelo menos 150 yg/ml, e até 350 yg/ml, até 500 pg/ml, até 600 pg/ml, até 1 mg/ml, até 2,5 mg/ml, até 5 mg/ml ou até 10 mg/ml. Preferivelmente a concentração de Blad é seleccionada entre 10 pg/ml e 5 mg/ml, mais preferivelmente entre 50 pg/ml e 2,5 mg/ml, mais preferivelmente entre 100 pg/ml e 1 mg/ml, e ainda mais preferivelmente entre 150 pg/ml e 600 pg/ml (tal como cerca de 250 yg/ml). Os inventores proporcionaram evidências (vejam-se os Exemplos 4 e 5) de que o Blad não é tóxico para animais até pelo menos 400 pg/ml.
Os inventores verificaram surpreendentemente que uma combinação de Blad com um agente quelante (e.g. EDTA) produz um efeito antimicrobiano sinérgico. Portanto, preferivelmente, utiliza-se um agente quelante para melhorar a actividade antimicrobiana do polipéptido antimicrobiano, e a utilização desse agente quelante pode diminuir a concentração do polipéptido antimicrobiano necessária para se conseguir um nível particular de prevenção ou inibição de deterioração. Um agente quelante (também conhecido como quelante, quelador ou agente sequestrante) é qualquer composto que se liga a um ião metálico para formar um complexo não covalente e reduz a actividade do ião. Os agentes quelantes adequados incluem poliaminocarboxilatos, tais como EDTA (ácido etilenodiaminotetra-acético) e EGTA (ácido etilenoglicol bis(β-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetra-acético). Preferivelmente, utiliza-se o EDTA como agente quelante, preferivelmente numa concentração de pelo menos 10 pg/ml, pelo menos 50 pg/ml, ou 14 pelo menos 100 pg/ml, e até 500 pg/ml, até 1 mg/ml, até 5 mg/ml, até 10 mg/ml, ou até 20 mg/ml. Preferivelmente, utiliza-se o EDTA numa concentração entre 0,1 mg/ml e 1 mg/ml.
Verificações O polipéptido antimicrobiano pode ser utilizado para inibir o crescimento de um microorganismo que deteriora alimentos (o que significa que possui actividade microbistática) e/ou matar o referido microorganismo (o que significa que possui actividade microbicida) num produto alimentar de modo tal que a deterioração do referido produto alimentar pelo referido microorganismo é prevenida ou inibida. O perito será capaz de identificar uma dose e/ou concentração adequadas para obter uma inibição de crescimento ou morte particularmente desejadas do microorganismo.
Preferivelmente, quando utilizado como agente microbistático, o polipéptido antimicrobiano reduz a taxa de crescimento em 10%, mais preferivelmente em 50%, mais preferivelmente em 75%, mais preferivelmente em 90%, mais preferivelmente em 95%, mais preferivelmente em 98%, mais preferivelmente em 99%, e ainda mais preferivelmente em 99,9%, em comparação com condições equivalentes onde o polipéptido antimicrobiano não está presente. Mais preferivelmente o polipéptido antimicrobiano previne qualquer crescimento do microorganismo.
Preferivelmente, quando utilizado como agente microbicida, o polipéptido antimicrobiano mata 10% da população dos microorganismos, mais preferivelmente 50% da referida população, mais preferivelmente 75% da referida população, mais preferivelmente 90% da referida população, mais preferivelmente 95% da referida população, mais preferivelmente 98% da referida população, mais preferivelmente 99% da referida população, e ainda mais preferivelmente 99,9% da referida população, em comparação com condições equivalentes onde o polipéptido antimicrobiano não está presente. Mais preferivelmente o polipéptido antimicrobiano mata toda a população do microorganismo. 15
Quando utilizado para prevenir ou inibir a deterioração de um produto alimentar por um microorganismo o polipéptido antimicrobiano é preferivelmente utilizado numa quantidade eficaz, ou seja, uma quantidade que proporciona um nível de inibição de crescimento e/ou morte de um microorganismo tal que se consiga um nível detectável de prevenção ou inibição da deterioração (e.g. uma diminuição na taxa de deterioração), preferivelmente em comparação com condições equivalentes onde o polipéptido antimicrobiano não está presente. Preferivelmente, a quantidade eficaz do polipéptido antimicrobiano não é tóxica para um ser humano ou animal.
Utilizações e métodos
Os inventores proporcionam a utilização de uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa para prevenir ou inibir a deterioração de um produto alimentar por um microorganismo. Para este fim proporcionam também um método para a prevenção ou inibição da deterioração de um produto alimentar por um microorganismo compreendendo a administração a um produto alimentar disso necessitado de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa. Preferivelmente, a quantidade eficaz do polipéptido antimicrobiano não é tóxica para seres humanos ou animais. A prevenção ou inibição de deterioração pode ocorrer durante a armazenagem, transporte, manipulação, processamento ou exibição do produto alimentar.
Uma composição compreendendo o polipéptido antimicrobiano pode, por exemplo, ser misturada no produto alimentar ou pode, por exemplo, ser aplicada sobre a superfície do produto alimentar (por exemplo na forma de um filme líquido ou pulverização). 0 produto alimentar pode também ser imerso (e opcionalmente mantido) na referida composição. Para qualquer produto alimentar particular a utilização da referida composição como conservante pode ser combinada com qualquer outra técnica de conservação de alimentos bem conhecida, antimicrobiana ou outra, incluindo secagem, aquecimento, refrigeração ou congelação, inibição osmótica (e.g. utilização de xaropes ou sal), embalagem sob vácuo, enlatamento e 16 engarrafamento, gelificação, envasilhamento, envasamento, irradiação ionizantes, processamento em campo eléctrico pulsado, conservação de alimentos em alta pressão, e conservação de alimentos em pressão de água ultra-elevada, utilização de antioxidantes, e/ou utilização de outros conservantes antimicrobianos (e.g. dióxido de enxofre, dióxido de carbono, etanol, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido sórbico, benzoatos, nitratos e nitritos, sulfitos, propionato de cálcio e metilcloroisotiazolinona).
Exemplos
Nos Exemplos seguintes BLAD significa o glico-oligómero contendo Blad de ocorrência natural compreendendo o polipéptido Blad de 20 kD, purificado segundo Ramos et al (1997) Planta 203(1): 26-34: vejam-se as partes "Plant material and growth conditions" e "Purification of proteins" da secção de Materiais e Métodos desse documento.
Definições: MIC - Concentração Inibitória Mínima: a menor concentração de um antimicrobiano que inibe o crescimento visível de um microorganismo. MFC/MBC - Concentração Fungicida/Bactericida Mínima (ou Concentração Letal Minima): a menor concentração de um agente antimicrobiano necessária para matar 99,9% do inoculo inicial após 24 h num cenário normalizado de condições.
Exemplo 1 - Actividade bactericida de BLAD. MIC e MBC de BLAD para várias espécies bacterianas (utilizando meio de Mueller-Hinton):
Espécie Bacteriana MIC (pg/ml) MBC (pg/ml) Pseudomonas aeruginosa 32-256 128-256 Listeria monocytogenes 8 > 512 Bacillus subtilis 4 > 512 Staphylococcus aureus 8 > 512 Salmonella thyphimurium 64 128 17
Em particular, P. aeruginosa e B. subtilis podem causar deterioração de alimentos. Verificou-se que o BLAD é bacteriostático a 100 pg/ml e bactericida a 250 yg/ml contra P. aeruginosa. Contra P. aeruginosa, o BLAD a 50 pg/ml ou o EDTA a 1 mg/ml inibem o crescimento (i.e. ambos são bacteriostáticos) mas uma combinação dos dois é bactericida.
Exemplo 2 - Actividade fungicida de BLAD. MIC e MFC de BLAD para vários fungos filamentosos (utilizando meio RPMI)
Espécie Fúngica MIC (pg/ml) MFC (pg/ml) Alternaria sp. 64 > 512 Aspergillus fumigatus 32 > 512 Aspergillus niger 32-64 > 512 Botrytis cinerea 128 512 Colletotrichum acutatum 64 > 512 Colletotrichum gloesporioides 64 > 512 Fusarium oxysporum 64 > 512 MIC de BLAD para vários fungos filamentosos (utilizando vários meios): MIC (pg/ml) Estirpe PDB PDB pH 7,5 AM3 RPMI Botrytis cinerea BM 128 (1) 4-8 (3) 8-32 (3) 128 (2) B. cinerea BT 32-128 (3) 8 (3) 16-32 (3) 64-128 (3) Colletotrichum kahawae (do Quénia) 32 4 1-4 64 C. kahawae (do Zimbabwe) 16 4-8 4-16 64 18
Dados de halos de inibição (diâmetro) para BLAD contra Botrytis cinerea BM em Ágar de Dextrose de Batata (PDA) a 0,6% ou 0,9% p/v (incubação de 3 dias a 25°C): BLAD por disco Diâmetro médio de Diâmetro médio de (pg) halos em ágar a 0,6% halos em ágar a 0,9% (mm) (mm) 20 yg 0 0 50 yg 13 0 100 yg 25,5 11 200 yg 36 22 Em ágar a 0,6%, o crescimento de B. cinera foi crescentemente inibido com quantidades crescentes de BLAD desde 20 ygl até 200 yg. Observou-se uma inibição menos marcada a 5 mg/ml e a 10 mg/ml em ágar a 0,9%.
Dados de halos de inibição (diâmetro) para BLAD a 200 pg/disco contra várias leveduras em PDA com ágar a 0,9% (p/v) (incubação de 3 a 5 dias a 25°C):
Levedura Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces marxianus Zygosaccharomyces bailii Zygosaccharomyces rouxii
Diâmetro médio de halos de inibição(mm) 30 28 >40 40 0 BLAD a 200 yg/disco mostrou significativa inibição do crescimento de todas estas leveduras, todas elas podendo causar deterioração de alimentos.
Exemplo 3 - Ensaios de conservação/descontaminação de morangos
Investigou-se a susceptibilidade dos morangos a contaminação por B. cinerea após tratamento com BLAD. Verificou-se que até 38% de morangos não tratados fornecidos por um fornecedor comercial estavam contaminados (dimensão da amostra: dez caixas de 500 g), sublinhando o problema da contaminação dos morangos. 19
Protocolo de Ensaio - 1. Preparar amostras homogéneas e representativas. 2 . Lavar com água e descontaminar utilizando etanol a 70% v/v. 3 . Enxaguar duas vezes com água. 4 . Tratar com BLAD em várias concentrações (omitido para controlo) : imergir em solução de tratamento durante 1 minuto antes de deixar secar em placas de Petri de incubação (contendo uma cama de esponja molhada com água estéril, papel de filtro e malha de plástico). 6. Inocular cada morango com 10 μΐ de solução de esporos de B. cinerea a 1-5 x 106 esporos/ml. 7. Incubar durante 5 dias sob as condições seguintes:
Temperatura: 25°C (+/- 3°C)
Humidade relativa: 80-90%
Iluminação: protegido da luz solar directa 8. Em intervalos, recolher amostras de 1 g e homogeneizar utilizando um vórtex. 9. Realizar diluições decimais em série. 10. Dispersar sobre meios sólidos e efectuar a contagem das colónias.
Todas as técnicas de manuseamento foram realizadas sob condições estéreis, utilizando material autoclavado.
Os dados seguintes representam a percentagem de morangos infectados com B. cinerea após inoculação com a solução de esporos de B. cinerea:
Dias após Concentração de BLAD (mg/ml) : inoculação 0(controlo) 50 150 250 350 0 0 0 0 0 0 1 44 33 4 0 0 2 63 63 15 6 5 3 93 77 46 50 40 4 100 100 56 70 60 5 100 100 73 70 6 4 20 O BLAD em concentrações de 150 yg/ml a 350 pg/ml retardou significativamente o inicio da contaminação com B. cinerea e reduziu a proporção total de morangos contaminados em comparação com o controlo.
Exemplo 4 - Estudo de toxicidade dérmica de BLAD em porguinhos-da-índia.
Estudo confidencial realizado na Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, em nome do Instituto Superior de Agronomia (18 de Julho, 2006 - 1 de
Agosto, 2006) utilizando o OECD Guideline for testing of Chemicals, No. 402, Acute Dermal Toxicity. O estudo foi conduzido de acordo com as boas práticas laboratoriais e respeito pelos animais. A toxicidade dérmica aguda de BLAD foi avaliada após exposição a uma dose única em porguinhos-da-india, gue são amplamente aceites como animais adeguados para estudos de toxicidade dérmica. O BLAD foi aplicado na pele glabra em dois grupos de 10 animais, com dosagens de 200 pg/ml e 400 pg/ml, respectivamente. Após a exposição, mantiveram-se os animais sob observação durante um período de 15 dias, durante o gual se registaram a massa corporal, a morbidade e a mortalidade.
Materiais e Métodos - 1. Materiais
Item de teste: o BLAD foi fornecido a 5 mg/ml (líquido opaco amarelado, 0-4°C) e armazenado a -80°C.
Animais: porquinhos-da-índia albinos; estirpe: Dunkin
Hartley (HsdPoc: DH) de Harlan Ibérica, Barcelona. Número de animais utilizados: 30;
Peso corporal: 400-449 g;
Idade: 6 semanas. 21
Alojamento: os animais foram colocados individualmente em caixas de polietileno com aparas de madeira esterilizadas (Lignocel).
Condições ambientais: a) Fotoperiodo: ciclos de luz/escuridão de 12 h em 12 h. b) Ambiente controlado: uma temperatura média de 19/22°C e humidade média de 60%.
Adaptação: os animais foram mantidos sob as condições ambientais do teste durante sete dias antes do inicio do teste.
Alimento: Global Diet 2014, Dieta de Manutenção para Roedores fornecida por Harlan Ibérica, Barcelona; água ad libitum. 2. Métodos
Administração: raparam-se os animais 48 h antes do teste e apenas animais que tinham a pele isenta de lesões foram considerados no estudo. Aplicou-se uma aliquota de 1 ml (a 200 yg/ml ou 400 yg/ml) na pele rapada de cada animal.
Desenho do estudo: os 30 animais do estudo foram divididos em quatro grupos, dois grupos de dez animais cada um e dois grupos com cinco animais cada um. Um grupo de dez animais foi exposto a BLAD a 200 yg/ml (grupo de teste 1) e outro grupo de dez animais foi exposto a BLAD a 400 pg/ml (grupo de teste 2). Os dois grupos de cinco animais serviram como controlos: um grupo foi exposto a água (aliquota de 1 ml) enquanto outro grupo não foi submetido a qualquer administração mas foi manuseado como todos os outros grupos.
Verificações: após a exposição, os animais foram observados diariamente durante 15 dias para registar quaisquer sinais de morbidade ou mesmo morte. Em termos da morbidade foi dada particular atenção ao possível surgimento de lesões na pele no local de exposição e possíveis sinais de toxicidade geral tais como alterações em padrões de comportamento normal. O peso corporal foi individualmente avaliado antes da exposição e no final do período de teste. 22
Resultados - Com nenhuma concentração de BLAD houve sinais de quaisquer alterações físicas na área da administração dérmica ou alterações nos comportamentos de bebida/alimentação ou geral. Não ocorreram reacções adversas ou morte após a administração de BLAD. 0 aumento da massa corporal foi similar em todos os grupos (e foi consistente com o aumento esperado para animais em desenvolvimento com esta idade jovem).
Conclusões - o BLAD em concentrações até 400 pg/ml (e possivelmente superiores) não apresenta toxicidade dérmica.
Exemplo 5 - Estudo de toxicidade oral de BLAD em ratos albinos.
Estudo confidencial realizado na Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, em nome do Instituto Superior de Agronomia, utilizando o OECD Guideline for testing of Chemicals, No. 401, Acute Oral Toxicity. O estudo foi conduzido de acordo com as boas práticas laboratoriais e respeito pelos animais. A toxicidade oral aguda de BLAD foi avaliada após exposição a uma dose única em ratos, que são amplamente aceites como animais adequados para estudos de toxicidade oral. 0 BLAD foi administrado por gavagem em dois grupos de 10 animais cada um, com dosagens de 200 pg/ml e 400 pg/ml, respectivamente. Após a exposição, os animais foram mantidos sob observação durante um período de 15 dias, durante o qual se registaram a massa corporal, a morbidade e a mortalidade. Após o período de observação os animais foram submetidos a eutanásia e necropsia.
Materiais e Métodos - 1. Materiais
Item de teste: o BLAD foi fornecido a 5 mg/ml (líquido opaco amarelado, 0-4°C) e armazenado a -80°C. 23
Animais: Rattus norvegicus, estirpe: Wistar Hannover, adquirida pelo biotério da Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa a Harlan Ibérica, Barcelona. Número de animais utilizados: 30;
Peso corporal: 250-300 g;
Idade: 10 semanas.
Alojamento: os animais foram colocados individualmente em caixas de polietileno com aparas de madeira esterilizadas (Lignocel).
Condições ambientais: a) Fotoperíodo: ciclos de luz/escuridão de 12 h em 12 h. b) Ambiente controlado: uma temperatura média de 19/22°C e humidade média de 60%.
Adaptação: os animais foram mantidos sob as condições ambientais do teste durante sete dias antes do início do teste.
Alimento: Global Diet 2014, Dieta de Manutenção para
Roedores fornecida por Harlan Ibérica, Barcelona; água ad libitum. 2. Métodos
Administração: aplicou-se uma alíquota de 1 ml (a
200 pg/ml ou 400 pg/ml) em cada animal por intubação oral (oro-esofágica), vulgarmente conhecida por gavagem. A administração foi realizada com uma sonda metálica apropriada para a espécie de animal utilizada. Os animais foram submetidos a jejum durante 18 h antes da administração e alimentados 3 h após a administração.
Desenho do estudo: os 30 animais do estudo foram divididos em quatro grupos, dois grupos de dez animais cada um e dois grupos com cinco animais cada um. Um grupo de dez animais foi exposto a BLAD a 200 yg/ml (grupo de teste 1) e outro grupo de dez animais foi exposto a BLAD a 400 yg/ml 24 (grupo de teste 2). Os dois grupos de cinco animais serviram como controlos: um grupo foi exposto a água (alíquota de 1 ml) enquanto o outro grupo não foi submetido a qualquer administração mas foi manuseado como todos os outros grupos.
Verificações: após a administração os animais foram observados diariamente durante 15 dias para registar quaisquer sinais de morbidade ou mesmo morte. 0 peso corporal foi individualmente avaliado antes da exposição e no final do período de teste. Após o período de observação os animais foram submetidos a eutanásia (por asfixia numa atmosfera saturada com dióxido de carbono) para subsequente exame post-mortem.
Resultados -
Em nenhuma concentração de BLAD houve sinais de quaisquer alterações físicas ou alterações nos comportamentos de bebida/alimentação ou geral. Não ocorreram reacções adversas ou morte após a administração de BLAD. 0 aumento de massa corporal foi similar em todos os grupos (e foi consistente com o aumento esperado para animais em desenvolvimento com esta idade jovem). A necrópsia/observação macroscópica dos órgãos da cavidade torácica e abdominal revelou ausência de alterações.
Conclusões - o BLAD em concentrações até 400 pg/ml (e possivelmente superiores) não apresenta toxicidade oral.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> CEV Biotecnologia das Plantas, S.A. <120> Conservante alimentar <140> <141> <160> 4 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1791
<212> ADN <213> Lupinus albus 25 <400> 1 gatggcgatg aatgaacact gcgtttgctg gctttgatga aaatcgagtg caacctaata 60 taatcaaata tgggtaagat gagagtgagg tttccaacgt tagtgttggt actaggaata 120 gtattcctca tggcagtgtc aattggtatt gcttatggag aaaaagatgt gctaaagagt 180 catgagaggc ctgaggaaag agaacaagag gagtggcaac ctaggagaca acgacctcaa 240 agtagaaggg aagagagaga gcaagagcaa gagcagggtt ctccctcata cccacgcagg 300 cagagtggtt atgagaggag acaataccat gagaggagtg agcagaggga agagagagag 360 caagaacaac aacaaggttc tccctcatac tcacgtagac aaaggaaccc ttatcacttc 420 agctctcaaa gattccaaac tctttacaaa aataggaatg gcaaaatccg tgtgctcgag 480 aggtttgacc aaagaaccaa tagacttgag aatctccaaa actaccgcat tgttgagttc 540 caatcaaaac ctaacactct cattctccct aaacactctg atgctgacta cgtcctcgtt 600 gtactcaatg gtagagccac aatcacgata gtaaaccctg atagaagaca agcatataac 660 cttgagtatg gcgatgctct cagaatccca gctggctcaa cttcatatat ccttaacccg 720 gatgacaacc agaagcttag agtagtcaag ctcgcaatac ccatcaacaa tcctggctac 780 ttttatgatt tctatccatc gagtactaaa gaccaacaat cctacttcag tggcttcagc 840 aggaacactt tagaggccac cttcaatact cgttatgaag agatacaaag gattatttta 900 gggaatgagg atgagcaaga atatgaggaa caaaggcgtg ggcaagagca gagcgaccaa 960 gacgaggggg tgatagtgat agtttcaaag aaacagatcc aaaaattgac aaaacacgct 1020 caatcttcat caggaaaaga caaaccctct gattctggcc ccttcaactt gagaagcaat 1080 gagcccatat attcaaacaa gtatgggaac ttctatgaaa tcactccaga tagaaaccct 1140 caagttcagg atttgaatat ctctctcacc tatataaaaa ttaacgaggg agctttgttg 1200 ttgccacact ataactcaaa ggccatatat gtagtcgtgg ttgatgaagg agaaggaaat 1260 tatgaactgg taggtattcg agatcaacaa cgacaacaag atgagcaaga agagaaagag 1320 gaagaagtga taaggtatag tgctagatta tcagaaggtg acatttttgt aattccagca 1380 ggttatccaa tttccatcaa tgcttcctca aatcttcgct tgcttggatt tggcatcaat 1440 gctgatgaaa accagaggaa tttcctcgca ggttctaaag acaatgtgat aaggcagtta 1500 gatagagcag tgaatgagct cacattccct ggttctgctg aagatattga gagattaatc 1560 aaaaaccaac aacagtctta ctttgcaaat ggtcagcctc aacaacaaca acaacaacaa 1620 agtgagaagg agggaaggcg tggaagaagg ggttcatctc ttccattttg agcacttttt 1680 actaagctgt tttaaaagct actatcatgt aagagctcat agtgagctac tgagagaata 1740 ataaaactaa agttggacct ttgtactaat aatgttaata aaaaaaaaaa a 1791 26 <210> 2 <211> 533
<212> PRT <213> Lupinus albus <400> 2
Met Gly Lys Met Arg Vai Arg Phe Pro Thr Leu Vai Leu Vai Leu Gly 15 10 15
Ile Vai Phe Leu Met Ala Vai Ser Ile Gly Ile Ala Tyr Gly Glu Lys 20 25 30
Asp Vai Leu Lys Ser His Glu Arg Pro Glu Glu Arg Glu Gin Glu Glu 35 40 45
Trp Gin Pro Arg Arg Gin Arg Pro Gin Ser Arg Arg Glu Glu Arg Glu 50 55 60
Gin Glu Gin Glu Gin Gly Ser Pro Ser Tyr Pro Arg Arg Gin Ser Gly 65 70 75 80
Tyr Glu Arg Arg Gin Tyr His Glu Arg Ser Glu Gin Arg Glu Glu Arg 85 90 95
Glu Gin Glu Gin Gin Gin Gly Ser Pro Ser Tyr Ser Arg Arg Gin Arg 100 105 110
Asn Pro Tyr His Phe Ser Ser Gin Arg Phe Gin Thr Leu Tyr Lys Asn 115 120 125
Arg Asn Gly Lys Ile Arg Vai Leu Glu Arg Phe Asp Gin Arg Thr Asn 130 135 140
Arg Leu Glu Asn Leu Gin Asn Tyr Arg Ile Vai Glu Phe Gin Ser Lys 145 150 155 160
Pro Asn Thr Leu Ile Leu Pro Lys His Ser Asp Ala Asp Tyr Vai Leu 165 170 175
Vai Vai Leu Asn Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ile Vai Asn Pro Asp Arg 180 185 190
Arg Gin Ala Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Asp Ala Leu Arg Ile Pro Ala 195 200 205 27 Phe Vai Ile Pro Ala 435
Gly Ser Thr Ser Tyr 210 Vai Vai Lys Leu Ala 225 Phe Tyr Pro Ser Ser 245 Ser Arg Asn Thr Leu 260 Gin Arg Ile Ile Leu 275 Arg Arg Gly Gin Glu 290 Vai Ser Lys Lys Gin 305 Ser Gly Lys Asp Lys 325 Asn Glu Pro Ile Tyr 340 Pro Asp Arg Asn Pro 355 Ile Lys Ile Asn Glu 370 Ala Ile Tyr Vai Vai 385 Vai Gly Ile Arg Asp 405 Glu Glu Glu Vai Ile 420 lie Leu Asn Pro Asp Asp 215 lie Pro Ile Asn Asn Pro 230 235 Thr Lys Asp Gin Gin Ser 250 Glu Ala Thr Phe Asn Thr 265 Gly Asn Glu Asp Glu Gin 280 Gin Ser Asp Gin Asp Glu 295 Ile Gin Lys Leu Thr Lys 310 315 Pro Ser Asp Ser Gly Pro 330 Ser Asn Lys Tyr Gly Asn 345 Gin Vai Gin Asp Leu Asn 360 Gly Ala Leu Leu Leu Pro 375 Vai Vai Asp Glu Gly Glu 390 395 Gin Gin Arg Gin Gin Asp 410 Arg Tyr Ser Ala Arg Leu 425 Gly Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Gin Lys Leu Arg 220 Gly Tyr Phe Tyr Asp 240 Tyr Phe Ser Gly Phe 255 Arg Tyr Glu Glu Ile 270 Glu Tyr Glu Glu Gin 285 Gly Vai Ile Vai Ile 300 His Ala Gin Ser Ser 320 Phe Asn Leu Arg Ser 335 Phe Tyr Glu Ile Thr 350 Ile Ser Leu Thr Tyr 365 His Tyr Asn Ser Lys 380 Gly Asn Tyr Glu Leu 400 Glu Gin Glu Glu Lys 415 Ser Glu Gly Asp Ile 430
Asn Ala Ser Ser Asn 445 440 28 Leu Arg Leu 450
Leu Gly Phe Gly 455
Ile Asn Ala Asp Glu Asn Gin Arg Asn 460
Phe Leu Ala 465
Gly Ser Lys Asp Asn Vai 470
Ile Arg Gin Leu 475
Asp Arg Ala 480
Vai Asn Glu Leu Thr Phe Pro 485
Gly Ser Ala Glu Asp Ile 490
Glu Arg Leu 495
Ile Lys Asn Gin Gin Gin Ser 500
Tyr Phe Ala Asn Gly Gin 505
Pro Gin Gin 510
Gin Gin Gin Gin Gin 515
Ser Glu Lys Glu 520
Gly Arg Arg Gly Arg Arg Gly 525
Ser Ser Leu Pro Phe 530 <210> 3 <211> 519
<212> ADN <213> Lupinus albus <400> 3 cgtagacaaa ggaaccctta tcacttcagc tctcaaagat tccaaactct ttacaaaaat 60 aggaatggca aaatccgtgt gctcgagagg tttgaccaaa gaaccaatag acttgagaat 120 ctccaaaact accgcattgt tgagttccaa tcaaaaccta acactctcat tctccctaaa 180 cactctgatg ctgactacgt cctcgttgta ctcaatggta gagccacaat cacgatagta 240 aaccctgata gaagacaagc atataacctt gagtatggcg atgctctcag aatcccagct 300 ggctcaactt catatatcct taacccggat gacaaccaga agcttagagt agtcaagctc 360 gcaataccca tcaacaatcc tggctacttt tatgatttct atccatcgag tactaaagac 420 caacaatcct acttcagtgg cttcagcagg aacactttag aggccacctt caatactcgt 480 tatgaagaga tacaaaggat tattttaggg aatgaggat 519 <210> 4 <211> 173
<212> PRT <213> Lupinus albus <400> 4
Arg Arg Gin Arg Asn Pro Tyr His Phe Ser Ser Gin Arg Phe Gin Thr 15 10 15 29
Leu Tyr Lys Asn Arg Asn Gly Lys Ile Arg Vai Leu Glu Arg Phe Asp 20 25 30
Gin Arg Thr Asn Arg Leu Glu Asn Leu Gin Asn Tyr Arg Ile Vai Glu 35 40 45
Phe Gin Ser Lys Pro Asn Thr Leu Ile Leu Pro Lys His Ser Asp Ala 50 55 60
Asp Tyr Vai Leu Vai Vai Leu Asn Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ile Vai 65 70 75 80
Asn Pro Asp Arg Arg Gin Ala Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Asp Ala Leu 85 90 95
Arg Ile Pro Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ile Leu Asn Pro Asp Asp Asn 100 105 110
Gin Lys Leu Arg Vai Vai Lys Leu Ala Ile Pro Ile Asn Asn Pro Gly 115 120 125
Tyr Phe Tyr Asp Phe Tyr Pro Ser Ser Thr Lys Asp Gin Gin Ser Tyr 130 135 140
Phe Ser Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Thr Phe Asn Thr Arg 145 150 155 160
Tyr Glu Glu Ile Gin Arg Ile Ile Leu Gly Asn Glu Asp 165 170
Lisboa, 2010-10-12

Claims (9)

1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização caracterizada por se utilizar uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa, para prevenir ou inibir a deterioração de um produto alimentar por um microorganismo.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por o microorganismo ser uma bactéria ou um fungo.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 2 caracterizada por a bactéria ser uma espécie que deteriora alimentos dos géneros Pseudomonas ou Bacillus.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 2 caracterizada por o fungo ser uma espécie que deteriora alimentos de um dos seguintes géneros: Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Botrytis, Colletotrichum, Saccharomyces, Kluyveromyces e Zygosaccharomyces.
5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizada por o produto alimentar ser derivado de, proporcionar, ou ser, um fruto, um fruto seco, um vegetal, uma semente, um açúcar, um produto lácteo, um alimento liquido ou pastoso, carne, peixe ou pão.
6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizada por o produto alimentar ser um morango.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6 caracterizada por o microorganismo ser Botrytis cinerea ou Colletotrichum acutatum, preferivelmente Botrytis cinerea.
8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizada por a referida composição compreender adicionalmente um agente quelante.
9. Método de prevenção ou inibição da deterioração de um produto alimentar por um microorganismo caracterizado por 2/2 compreender a administração a um produto alimentar disso necessitado de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa. Lisboa, 2011-01-21
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