PT1082410E

PT1082410E - Células estaminais mesenquimatosas humanas cd45+ e/ou fibroblastos+

Info

Publication number: PT1082410E
Application number: PT99926044T
Authority: PT
Inventors: Janice M Davis-Sproul; Mark Aaron Moorman; Renee Marie Mcneil; Donald William Simonetti Jr; Lora Catherine Hammill; Stewart Craig
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2007-11-09
Also published as: DK1082410T3; EP1082410A1; ES2292245T3; WO1999061587A1; EP1082410B1; CY1107778T1; DE69936720T2; AU4221399A; DE69936720D1; CA2328524A1; ATE368731T1; US6387367B1

Description

DESCRIÇÃO "CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS HUMANAS CD45+ E/OU FIBROBLASTOS+"

Antecedentes da invenção

Este pedido é baseado no pedido provisório U.S. com o n.° de ordem 60/087123 apresentado a 29 de Maio de 1998.

As células estaminais mesenquimatosas (MSC) são as células formativas de blasto pluripotenciais encontradas inter alia na medula óssea, sangue, derme e periósteo que são capazes de se diferenciar em mais de um tipo especifico de tecido mesenquimatoso ou conjuntivo (i. e. os tecidos do corpo que suportam os elementos especializados; e. g. tecidos conjuntivos adiposo, ósseo, estroma, cartilaginoso, elástico e fibroso) dependendo de diversas influências de factores bioactivos, tais como citocinas. O potencial para se diferenciarem em células, tais como osteoblastos e condrócitos, é retido após isolamento e expansão em cultura; a diferenciação ocorre quando as células são induzidas in vitro em condições especificas ou colocadas in vivo no local de tecido lesionado.

Os epitopos na superfície das células estaminais mesenquimatosas humanas (hMSC) são reactivos com determinados anticorpos monoclonais conhecidos por SH2, SH3 e SH4, descritos na Patente U.S. N.° 5486359. Estes anticorpos podem ser utilizados como reagentes para pesquisar e capturar a população 1 celular estaminal mesenquimatosa a partir de uma população celular heterogénea, tal como a que existe, por exemplo, na medula óssea.

As células estaminais hematopoéticas (HSC) são as células formativas de blasto pluripotenciais encontradas, inter alia, na medula óssea e sangue periférico que são capazes de se diferenciar em quaisquer dos tipos específicos de células hematopoéticas ou sanguíneas, tais como eritrócitos, linfócitos, macrófagos e megacariócitos. A expressão de um determinado antigénio ou antigénios na superfície celular ou no citoplasma e a intensidade de expressão indicam o estádio de maturação e comprometimento de linhagem da célula estaminal hematopoética. As células estaminais hematopoéticas humanas (hHSC) são reactivas com determinados anticorpos monoclonais, tal como CD34, reconhecidos como sendo específicos para células hematopoéticas.

Deste modo, as células estaminais hematopoéticas humanas e as células estaminais mesenquimatosas humanas foram facilmente distinguidas pelos seus perfis imunoespecíficos.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas estimuladas em células que são positivas para marcadores de anticorpos CD45. Como a seguir indicado, uma célula estaminal mesenquimatosa é uma que é capaz de se diferenciar em mais do que um tipo específico de tecido celular mesenquimatoso. Os requerentes proporcionaram uma população de células estaminais mesenquimatosas precursoras 2 ("pré-MSC") que é positiva para CD45. Estas células estaminais mesenquimatosas precursoras podem diferenciar-se nas diversas linhagens mesenquimatosas, por exemplo, as linhagens condrócita, adipócita e osteoblástica.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas que são positivas para CD45 e positivas para, pelo menos, um dos marcadores de SH2, SH3 ou SH4. As células estaminais mesenquimatosas da presente invenção são, de um modo preferido positivas para, pelo menos, o marcador de SH3. Noutro aspecto, as células estaminais mesenquimatosas precursoras são positivas para o marcador de SH2 .

Estas células estaminais mesenquimatosas precursoras podem ser obtidas utilizando anticorpos contra marcadores de células mesenquimatosas e hematopoéticas. Inesperadamente, verificou-se que um número significativo de células positivas para marcadores seleccionados de células estaminais mesenquimatosas foi posteriormente caracterizado como sendo positivo para CD45. O CD45 é um marcador geralmente encontrado em leucócitos e células hematopoéticas e não em células estaminais mesenquimatosas cultivadas. Embora não pretendendo ser limitado por qualquer teoria, considera-se que a população de células da presente invenção compreende uma célula precursora de células estaminais mesenquimatosas mais maduras, embora não comprometidas. A invenção proporciona, adicionalmente um método para a recuperação de uma população isolada de células estaminais mesenquimatosas humanas CD45+ a partir de medula óssea ou outra fonte de células estaminais mesenquimatosas de um indivíduo por (i) obtenção de tecido de medula óssea ou outra fonte tecidular 3 de células estaminais mesenquimatosas de um dador; (ii) isolamento de uma população de células enriquecidas em células estaminais mesenquimatosas daquelas; e (iii) selecção adicional de células CD45+ a partir da população de células estaminais mesenquimatosas humanas para obter uma população de células estaminais mesenquimatosas que são enriquecidas em células estaminais mesenquimatosas CD45+.

Num aspecto adicional, a invenção proporciona um método para a recuperação de uma população isolada de células estaminais mesenquimatosas humanas CD45+ que são igualmente positivas para, pelo menos, um dos marcadores de SH2, SH3 ou SH4 a partir de medula óssea ou outra fonte de células estaminais mesenquimatosas de um indivíduo por (i) obtenção de tecido de medula óssea ou outra fonte de células estaminais mesenquimatosas de um dador (ii) isolamento de uma população de células enriquecidas em células estaminais mesenquimatosas daquelas; (iii) selecção a partir da população celular de uma população de células estaminais mesenquimatosas que são positivas para, pelo menos, um dos marcadores de SH2, SH3 ou SH4; e (iv) selecção adicional de células CD45+ a partir da população de células estaminais mesenquimatosas humanas da etapa (iii) para obter uma população de células estaminais mesenquimatosas que são positivas para, pelo menos, um dos marcadores de SH2, SH3 ou SH4 e CD45+. Numa forma de realização preferida, a população celular CD45 é, pelo menos, positiva para SH3. 4

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 apresenta histogramas de FACScan para a expressão de antigénios de superfície celular CD45 nas três fracções de células estaminais mesenquimatosas humanas: Fig. IA pré-fraccionamento; Fig. 1B fracção negativa de selecção de SH3; Fig. 1C fracção positiva de selecção de SH3. A Figura 2 apresenta os resultados do ensaio da deposição de cálcio descrito no Exemplo 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção envolve o isolamento e estimulação de uma subpopulação de células estaminais mesenquimatosas humanas. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma população de células tendo um fenótipo SH3+/CD45+ e que se considera ser uma célula estaminal mesenquimatosa precursora. A população de células estaminais mesenquimatosas humanas da presente invenção é capaz da diferenciação em linhagens celulares condrocíticas, adipocíticas e de osteoblastos.

As células estaminais mesenquimatosas da presente invenção podem ser isoladas de sangue periférico ou medula óssea. "Isolado" como aqui utilizado, significa que as células são colocadas em condições diferente do seu ambiente natural. 0 termo "isolado" não exclui a utilização posterior destas células em combinações ou misturas com outras células. Foi descrito um método de preparação de culturas de células estaminais mesenquimatosas de medula humana na Pat. U.S. N.° 5486359. São conhecidas diversas técnicas dos especialistas na matéria pelo 5 rápido isolamento de células estaminais mesenquimatosas. As abordagens ao isolamento de células estaminais mesenquimatosas incluem leucoferese, fraccionamento de gradiente de densidade, imunoselecção e separação de adesão diferencial.

As células da presente invenção são mantidas em meios de cultura que podem ser meios isentos de soro quimicamente definidos ou pode ser um "meio completo", tal como o Meio de Eagle Modificado por Dulbecco Suplementado com 10% de soro (dmem). Meios isentos de soro quimicamente definidos adequados são descritos nos documentos U.S. N° de Ordem U.S. 08/464599 e W096/39487 e "meios completos" são descritos na Patente U.S. N.° 5486359. Os Meios Quimicamente Definidos compreendem um meio minimo essencial, tal como o Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) (Gibco), suplementado com albumina do soro humano, lipoproteina humana Ex Cito, transferrina, insulina, vitaminas, aminoácidos essenciais e não essenciais, piruvato de sódio, glutamina e mitogénio. Estes meios estimulam o crescimento de células estaminais mesenquimatosas sem diferenciação.

As células estaminais mesenquimatosas da presente invenção isoladas de sangue periférico ou medula óssea podem ser adicionalmente expandidas por cultura. As células podem ser expandidas, antes ou após a sua congelação. Os meios aqui descritos são igualmente adequados para a expansão de cultura das células estaminais mesenquimatosas.

As células estaminais mesenquimatosas isoladas da presente invenção podem ser adicionalmente purificadas. Numa forma de realização preferida, "purificado" indica que a população celular contém menos de 5% de impurezas, sendo impurezas, por exemplo, células que não são CD45+. A população celular 6 purificada pode ser posteriormente utilizada em combinações ou misturas conforme apropriado. A presente invenção contempla qualquer método adequado de emprego de anticorpos monoclonais para separar células estaminais mesenquimatosas de outras células, e. g., recuperadas a partir de medula óssea. Por conseguinte, é incluido na presente invenção um método de produção de uma população de células estaminais mesenquimatosas compreendendo as etapas de proporcionar uma suspensão celular de tecido contendo células estaminais mesenquimatosas; colocação em contacto da suspensão celular com um ou uma combinação de anticorpos monoclonais que reconhecem um epitopo nas células estaminais mesenquimatosas; e separação e recuperação da suspensão celular das células ligadas pelos anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser ligados a uma fase sólida e utilizados para capturar células estaminais mesenquimatosas de amostras de tecido. As células ligadas podem, em seguida, ser separadas da fase sólida através de métodos conhecidos, dependendo da natureza do anticorpo e fase sólida.

Sistemas de base monoclonal apropriados para a preparação da desejada população celular incluem coluna de esferas magnéticas/particulas paramagnéticas utilizando anticorpos para selecção positiva ou negativa; separação baseada em afinidade de biotina ou estreptavidina; e triagem citométrica de fluxo de alta velocidade de células estaminais mesenquimatosas coradas por imunofluorescência misturadas numa suspensão de outras células. Deste modo, o método da presente invenção inclui o isolamento de uma população de hMSC e melhoramento utilizando anticorpos monoclonais contra antigénios de superfície expressos por hMSC derivados de medula, i. e. SH2, SH3 ou SH4. Os 7 depósitos das culturas de linhas celulares identificadas por SH2, SH3 e SH4 estão em depósito na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, e foram-lhe atribuídos os números de registo HB 10743, BH 10744 e HB 10745, respectivamente. Estes anticorpos monoclonais proporcionam sondas eficazes que podem ser utilizadas para a identificação, quantificação e purificação de células estaminais mesenquimatosas, independentemente da sua origem corporal.

Numa forma de realização, o isolamento da população celular da presente invenção pode compreender a utilização de uma combinação de um ou mais anticorpos que reconhecem um marcador conhecido nas células estaminais mesenquimatosas, como um anticorpo que reconhece o CD45. Um método para tal preparação das células precursoras da presente invenção é seleccionar, em primeiro lugar, uma população de células expressando um marcador identificando células estaminais mesenquimatosas, por exemplo, SH3 ou SH2 por selecção imunomagnética de uma amostra celular de medula óssea humana de baixa densidade. Alternativamente, está contemplado que a selecção celular inicial pode basear-se no marcador CD45 e a população celular ser adicionalmente caracterizada utilizando os anticorpos monoclonais hMSC.

Noutra forma de realização, está contemplado que uma população celular pode ser seleccionada com base no marcador CD 14. O CD 14 é uma proteina de membrana que funciona como um receptor para a endotoxina (lipopolissacarideo, LPS) e é fortemente expresso na superfície de monócitos mas não é expresso por progenitores mielóides.

Deste modo, num aspecto, em determinadas formas de realização aqui descritas, a população de células estaminais 8 mesenquimatosas População 1 (Pop 1) é identificada por FACS, pelo brilho relativo de anticorpos corados por imunofluorescência a ela ligados, como SH2 e SH3 intenso/ CD45 ténue/ CD 14 ténue. Em comparação, os SH2 e SH3 estão presentes em MSC expandidas por cultura; o CD45 está ausente em MSC expandidas por cultura; e o CD14 está ausente em MSC expandidas por cultura.

Ainda num aspecto adicional da invenção, uma população celular pode ser seleccionada com base num marcador de superfície celular de fibroblastos, por exemplo, o anticorpo antifibroblastos encontrado em microesferas de antifibroblastos de Miltenyi (catálogo Miltenyi # 506—01).

Está adicionalmente contemplado que os métodos acima descritos podem ser aplicados a uma população de células estaminais mesenquimatosas expandidas por cultura, de modo a que as células possuindo um fenótipo Pop 1 possam ser isoladas da população de células estaminais mesenquimatosas expandidas por cultura. A presente invenção é dirigida a diversos métodos de utilização de células estaminais mesenquimatosas humanas CD45+ da presente invenção para fins de terapêutica e/ou diagnóstico. Estes incluem a regeneração de tecidos mesenquimatosos que foram lesionados através de lesão aguda, expressão genética anormal ou doença adquirida; tratamento de um hospedeiro possuindo tecido mesenquimatoso lesionado pela remoção de pequenas aliquotas de medula óssea, isolamento das suas células estaminais mesenquimatosas e tratamento de tecido lesionado com as hMSC CD45+ combinadas com um material de transporte biocompatível adequado para a distribuição das MSC aos locais de tecido 9 lesionado; produção de diversos tecidos mesenquimatosos; detecção e avaliação de factores de crescimento ou factores inibidores relevantes para a auto-regeneração e diferenciação de MSC em linhagens mesenquimatosas comprometidas; e desenvolvimento de linhagens celulares mesenquimatosas e ensaio de factores com desenvolvimento de tecido mesenquimatoso.

As hMSC da presente invenção podem ser utilizadas numa variedade de formas. Por exemplo, as hMSC podem ser empregues como parte da terapia de substituição celular. Especificamente, as hMSC podem ser infundidas isoladas ou adicionadas a células de medula óssea para processos de transplante de medula óssea. Outras aplicações também particularmente contempladas são as ortopédicas, são tais como o aumento de formação óssea. Outras aplicações incluem, por exemplo, o tratamento de osteoartrite, osteoporose, estados traumáticos ou patológicos envolvendo quaisquer dos tecidos conjuntivos, tais como defeitos ósseos, defeitos de tecido conjuntivo, defeitos esqueléticos ou defeitos cartilagineos. Está igualmente contemplado que o material genético exógeno pode ser introduzido nas células enquanto ex vivo e que as células sejam readministradas para produção in vivo de proteínas exógenas. A modificação genética de células estaminais mesenquimatosas é discutida mais integralmente na Patente U.S. N° 5591625. A presente invenção não está limitada a um método específico para recuperação das células. Por exemplo, tais células podem ser isoladas por processos que não utilizam anticorpos, desde que as células sejam positivas para CD45 e sejam positivas para, pelo menos, um de SH2, SH3 ou SH4, de um modo preferido, pelo menos, SH3, e sejam capazes de se diferenciar em uma ou mais do que uma linhagem celular mesenquimatosa e, de um modo preferido, 10 na maioria, se não todas, as linhagens celulares mesenquimatosas. Numa forma de realização particularmente preferida, as células são igualmente capazes de auto-renovação. Deste modo, uma célula estaminal mesenquimatosa humana que é SH3+ e CD45+ em conformidade com a invenção, pode ser recuperada por técnicas exceptuando a utilização de anticorpos SH3+ e CD45+. Deste modo, o termo "célula estaminal mesenquimatosa humana que é SH3+ e CD45+" significa uma célula estaminal que possui ambos os marcadores e é capaz de se diferenciar em mais do que uma linhagem celular estaminal mesenquimatosa.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar e descrever adicionalmente a presente invenção; contudo, não se pretende que o âmbito da presente invenção seja por esse meio limitado.

Exemplo 1

Isolamento de hMSC de Medula Óssea Humana

Os aspirados de medula óssea foram obtidos de três voluntários, dadores 271, 281 e 332. A centrifugação de densidade dos aspirados de medula óssea foi realizada utilizando solução de Terapia de Células Activadas (ACT) de Densidade Flutuante (1,0720 g/mL) em tubos cónicos (Dendreon, Mountain View CA) e as células foram isoladas a partir da fracção de densidade leve. As células foram lavadas e ressuspenssas de PBS de Dulbecco a uma concentração de 2 x 107 células/mL. As células foram incubadas com anticorpo bloqueante (IgG humano a 1 mg/mL em PBS isento de azida) durante 10 minutos a 4 °C com rotação seguido de uma incubação de 30 minutos a 4 °C com 1 pg/lxlO7 11 células de anticorpo SH3. As células dos dadores 1 e 2 foram lavadas duas vezes com PBS/0,5% de BSA e ressuspenssas em PBS até 2 x 107 células/mL. Foram adicionadas esferas Dynal (lavadas 3 vezes com PBS) e a suspensão foi misturada durante 30 minutos a 4 °C. As células ligadas foram separadas magneticamente das células não ligadas. As células do dador 332 foram lavadas 2x com tampão de Miltenyi e incubadas durante 20 minutos a 4 °C com agitação com esferas IgG2 de rato anti-murganho (1 mL de microesferas por 5xl08 células) (50 nm de Miltenyi Biotec,

Auburn, CA) e seleccionadas de acordo com as instruções do fabricante.

Foram analisadas três populações celulares de cada dador: a fracção inicial (células não separadas de densidade leve), células seleccionadas de SH3 (células ligadas às esferas magnéticas derivatizadas) e células não seleccionadas de SH3 (células que não se ligaram às esferas derivatizadas). Os conteúdos de células estaminais hematopoéticas e mesenquimatosas das três amostras foram ensaiados como descrito a seguir. Números de células. Os números de células contidos nas fracções são apresentados na Tabela 1. As fracções seleccionadas de SH3 continham 4,2, 4,8 e 6,2% das células iniciais. As fracções não seleccionadas de SH3 produziram 88, 70 e 87% das células iniciais. 12

Tabela 1 Números de Células (rendimentos) Fracção Células Totais (xlO6) % de Recuperação Celular % de Viabilidade Dador 271 Inicial 262 Seleccionada de SH3 11 4,2 94,2 Não Seleccionada de SH3 231 88,1 92,8 Dador 281 Inicial 217 Seleccionada de SH3 10, 5 4,8 90,0 Não Seleccionada de SH3 150 70,0 99,5 Dador 332 Inicial 207 Seleccionada de SH3 12, 8 6,2 Não Seleccionada de SH3 181 87,4

Ensaio F de Unidade Formadora de Colónias. 0 ensaio CFU-F mede o crescimento de colónias em meios de cultura completos. As células nucleadas foram suspenssas em meio hMSC até uma concentração de 2 x 106 células em 40 mL, e foram plaqueadas em 13 placas de cultura de tecidos de 100 mm a 5 x 105 células por placa. Após 14 dias, as células foram fixas com glutaraldeído e coradas com violeta de cristal. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Ensaio CFU-F Fracção ns de colónias CFU-F /5x1O4 células CFU-F Total (% do total) Dador 271 Inicial Não realizado Seleccionada de SH3 15 3,3xl03 Não Seleccionada de SH3 0 0 Dador 281 Inicial 1,3 5,77xl03 Seleccionada de SH3 16,7 3,50x 103 (61%) Não Seleccionada de SH3 0,7 2,OlxlO3 (35%) Dador 332 Inicial 5,7 2,36xl04 Seleccionada de SH3 TNTC Não Seleccionada de SH3 0 0 TNTC = demasiado numerosa para contar 14 A fracção seleccionada de SH3 apresentou enriquecimento para colónias quando comparada com a amostra celular inicial; de facto, a fracção seleccionada de Miltenyi (dador 332) tinha demasiadas colónias para contar. Na fracção não seleccionada de SH3 um dos 3 ensaios CFU-F teve apenas 0,7 colónias por 50000 células plaqueadas, ao passo que as restantes 2 culturas não tiveram crescimento de colónias.

Tabela 3

Colónias Totais de células progenitoras Hematopoéticas (% de Recuperação)

Fracção BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Dador 271 Inicial 5,61χ105 5,30xl05 0 Seleccionada de SH3 0 2,45xl02 (0,05%) 0 Não Seleccionada de SH3 3,82χ105 (68%) 4,72xl05 (89%) 0 Dador 281 Inicial 4,63xl05 2,62xl05 0 Seleccionada de SH3 1,16xl02 (0,02%) 1,16xl02 (0,04%) 0 Não Seleccionada de SH3 3,08xl05 (67%) 2,56xl05 (98%) 0 15 (continuação)

Colónias Totais de células progenitoras Hematopoéticas (% de Recuperação) Fracção BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Dador 332 Inicial 6,07xl05 4,28xl05 8,28xl04 Seleccionada de SH3 0 1,28xl03 (0,3%) 0 Não Seleccionada de SH3 5,61xl05 (92%) 4,40xl05 (103%) 6,03xl04 (73%) As fracções não seleccionadas de SH3 continham 89, 98 e 103% das colónias CFU-GM hematopoéticas iniciais (Tabela 3). Apenas 0,04, 0,05, e 0,3% das CFU-GM iniciais foram encontradas na fracção celular seleccionada de SH3 (Tabela 3).

Cultura de células estaminais mesenquimatosas. 3,2xl06 células dos Dadores 271 e 281 foram adicionadas a 2 poços de uma placa de 6 poços. As células foram recolhidas após 13 dias em cultura. Os resultados são apresentados na Tabela 4.

Para a amostra do dador 332 cada poço foi semeado com 0,8 xlO6 células. No Dia 11, com base em exame microscópico, foram recolhidos dois de quatro poços de células seleccionadas de SH3. Todos os outros poços foram recolhidos após 14 dias em cultura. Os resultados são apresentados na Tabela 5. 16

Os resultados das culturas MSC demonstraram que as células seleccionadas de SH3 expandiram com a mesma ou eficiência superior do que a fracção celular inicial e as células recolhidas tinham a morfologia e fenótipo distintivos de MSC. No meio de cultura completo de MSC, após cultura primária, o rendimento celular desta fracção não seleccionada de SH3 foi baixo (1,3, 3,8 & 1,6%) comparativamente com as fracções celulares iniciais (17,5, 19,4 & 44,5%, respectivamente).

Tabela 4

Numeros de células de Cultura PO & Colheita Fracção Células totais recolhidas % de Rendimento Dador 271 Inicial 5,6 x 105 17, 5% Seleccionada de SH3 5,7 x 105 17, 8% Não Seleccionada de SH3 0,42 x 105 1,3% Dador 281 Inicial 6,2 x 105 19, 4% Seleccionada de SH3 6,3 x 105 19, 7% Não Seleccionada de SH3 1,2 x 105 3, 8% 17

Tabela 5

Dador 332 Fracção Número de Células recolhidas por poço Rendimento (% de células semeadas) Aparência Inicial 3,56 x 105 44,5 85% confluentes Seleccionada de SH3 (Dia 11) 3,00 x 105 37,0 85% confluentes Seleccionada de SH3 (Dia 14) 5,50 x 105 68,8 100% confluentes Não Seleccionada de SH3 1,30 x 104 T—1 sem células fusiformes; células em forma de charuto ou arredondadas

As células dos dadores 271 e 281 continuaram em cultura e as células da Passagem 1 foram recolhidas e examinadas por citometria de fluxo; as células eram MSC por morfologia e fenótipo. A observação visual destas culturas durante PO demonstrou que as colónias de tipo MSC continham igualmente células com esferas magnéticas ligadas. As células foram re-plaqueadas em frascos ou poços, dependendo das células totais disponíveis. As células foram recolhidas após 8 dias em cultura. 18

Tabela 6

Numeros de Células de Cultura PI & Colheita Fracção ns de Células Plaqueadas n* de Células Recolhidas Factor de Aumento Dador 271 Inicial 4,3 x 105 2,6 x 106 6,0 Seleccionada de SH3 4,3 x 105 1,8 x 106 4,2 Não Seleccionada de SH3 4,2 x 104 0,13 x 106 3,1 Dador 281 Inicial 4,3 x 105 2,3 x 106 5,3 Seleccionada de SH3 4,3 x 105 2,0 x 106 4,5 Não Seleccionada de SH3 1,2 x 105 0,26 x 106 2,3

As células cultivadas da colheita de seleccionadas de SH3 do Dia 11 foram analisadas. As células eram SH2 + , SH3 + , SH4+ e CD45-, correspondendo a um fenótipo de célula estaminal mesenquimatosa cultivada madura.

Análise de Citometria de Fluxo. As fracções celulares do Dador 332 foram analisadas utilizando marcadores antigénicos de SH3 e CD45. A Figura 1 apresenta o histograma de FACS da análise de CD45. 19

Tabela 7a

Análise de Fluxo de Dador 332 Fracção Células Totais % de SH3* Células SH3+ Totais Rendimento (%) Inicial 207 x 106 20, 8 43,0 x 106 Seleccionada de SH3 12,8 x 106 98, 8 12,6 x 106 29, 4 Não Seleccionada de SH3 181 x 106 13, 6 24,6 x 106 57, 2

Tabela 7b

Fracção Células Totais % de SH3+/CD45+ Células SH3+/CD45+ Totais Rendimento (%) Inicial 207 x 106 20,4 42,2 x 106 Seleccionada de SH3 12,8 x 106 98,4 12,6 x 106 29,8 Não Seleccionada de SH3 181 x 106 12,3 22,3 x 106 52, 8

Os resultados nas Tabelas 7a e b da análise de fluxo da amostra do dador 332 demonstraram uma pureza de SH3 de 98,8%, com mais de 99,5% destas células sendo CD45+. 0 número total de células CD45- na amostra foi 0,42%. 20

Os resultados indicaram que o precursor da célula estaminal mesenquimatosa observado em cultura era positivo para SH3 e positivo para CD45 e esta célula pode ser isolada utilizando o anticorpo SH3 em conjunto com esferas imunomaqnéticas ou outros métodos de imunosselecção.

Exemplo 2

Isolamento de MSC utilizando selecção celular de SH2

Foram utilizadas microesferas maqnéticas de anticorpo biotina-anti-SH2 e igGl de rato anti-murganho para isolar duas fracções de células a partir de células de medula óssea de densidade leve: ligada a SH2 e não ligada a SH2. Estas fracções celulares foram colocadas em condições de cultura MSC padrão para determinar o potencial proliferativo de MSC da população celular contida nestas fracções.

As microesferas anti-IgGl eram de Miltenyi Lote n° NE7200. A Coluna VS era de Miltenyi Lote n° 0231) . Os filtros de pré-separação eram de 30 pm de Miltenyi Lote n° 55. Tampão de Miltenyi: solução salina tamponada com fosfatos a pH 7,2 suplementada com 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. A coloração de fluxo foi realizada utilizando as instruções sugeridas pelo fabricante. A análise de fluxo foi realizada utilizando o FACS Calibur ou o FACS Vantage. A viabilidade celular e o número de células foram determinados utilizando o azul de tripano.

As células de densidade leve foram isoladas a partir de um aspirado de medula óssea humana (dador n°426) utilizando solução de Dendreon (Seattle, WA) BDS72 no seguimento de centrifugação 21 de densidade de aspirados de medula óssea. As aliquotas foram removidas como controlos para análise de fluxo e cultura de células. As células restantes foram diluidas até uma contagem celular de 2 x 107 células/mL utilizando tampão de Miltenyi. As células foram incubadas com IgG a 40 pL por mL de suspensão celular durante 10 minutos, a 4 °C, com agitação. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi incubado com o anticorpo anti-SH2 a 10 pg por 1 x 107 células durante 30 minutos, a 4 °C, com agitação. As células foram lavadas duas vezes com tampão frio. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (80 pL de tampão por 107 células). Foram adicionadas microesferas anti-IgGl (20 pL de esferas por 107 células). A mistura foi incubada a 4 °C durante 15 minutos com agitação. O tampão de Miltenyi foi adicionado para diluir a mistura e lavar as células. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (0,5 pL de tampão por 108 células). A coluna VS foi iniciada seguindo as instruções do fabricante. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada a SH2'. A coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada de SH2'. A coluna foi removida do íman e colocada num tubo rotulado 'ligada a SH2'. Foram adicionados à coluna cinco mL de tampão de Miltenyi e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Uma coluna nova foi iniciada e as células no tubo 'ligada a SH2' foram adicionadas à segunda coluna. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada a SH2'. A coluna foi enxaguada duas 22 vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada a SH2'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada a SH2'. Foram adicionados cinco mL de tampão de Miltenyi à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Foram realizadas contagens de células e ensaios de viabilidade. As células das fracções ligadas e não ligadas foram coradas para análise de fluxo. As células não ligadas e ligadas foram colocadas em cultura. As células foram recolhidas após 14 dias. As células das células de densidade leve e a fracção de ligadas a SH2 foram coradas para análise de fluxo.

Tabela 8

Rendimentos de selecção Celular de SH2 Fracção Número de células % de Rendimento Células de densidade leve 2,0 x 108 100 Ligada a SH2 3,6 x 106 1,8 Não ligada a SH2 2,3 x 108 113

Tabela 9

Análise de Fluxo das Fracções Celulares Iniciais Fracção % de células SH2+ Células de densidade leve 23, 9 Ligada a SH2 98,3 Não ligada a SH2 14, 6 23

Tabela 10

Exame Microscópico de Culturas PO no Dia 14 Fracção Aparência Células de 75% confluentes, observadas densidade leve células de fase clara Ligada a SH2 90% confluentes, observadas células de fase clara Não ligada a SH2 Observadas colónias muito pequenas

Tabela 11

Colheitas Celulares PO Fracção Células semeadas/cm2 Células recolhidas/cm2 % de Rendimento Células de densidade leve 8,0 x 104 1,4 x 104 17 Ligada a SH2 O \—1 >C o co 1,2 x 104 15 Não ligada a SH2 o \—1 >C o co 3,2 x 102 0,4

Tabela 12

Análise de fluxo de Culturas PO Fracção % de fenótipo MSC % de células CD45 + Células de densidade leve 99,5 0,3 Ligada a SH2 98,7 0,2 24 A selecção celular SH2 de células de medula óssea de densidade leve utilizando o sistema de microesferas de Miltenyi produziu menos de 2% das células de densidade leve na fracção ligada de SH2. 0 isolamento produziu uma fracção celular contendo células que eram 98,3% SH2+. As células ligadas de SH2 eram 90% confluentes com células fusiformes após 14 dias em cultura com condições de cultura MSC padrão. A cultura das células ligadas de SH2 produziu uma população de células aderentes que tinha um fenótipo MSC por análise de fluxo e morfologia. Foram isoladas muito poucas células aderentes a partir da fracção de células não ligadas de SH2. Estes resultados demonstram que o SH2 é um antigénio presente no precursor de MSC, bem como na MSC expandida por cultura.

Exemplo 3

Isolamento de MSC de Culturas PO de MSC utilizando Selecção Celular CD45

Foi referido que culturas PO de MSC continham uma mediana de 9% de células CD45+ (amplitude, 0,5 a 50%), ao passo que o fenótipo expandido por cultura de MSC é negativo para CD45. Foi realizada uma selecção CD45 de células PO nos três dadores para determinar se as MSC podiam ser cultivadas a partir da fracção de células ligadas de CD45.

As microesferas anti-CD45 eram de Miltenyi (Lote n° NE5848) . A Coluna Large Cell Separation era de Miltenyi (Cat n° 422-02). Tampão de Miltenyi: solução salina tamponada com fosfatos a pH 7,2 suplementada com 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. A coloração de fluxo foi realizada utilizando as instruções sugeridas pelo 25 fabricante. A análise de fluxo foi realizada utilizando o FACS Calibur ou o FACS Vantage. A viabilidade celular e o número de células foram determinados utilizando o azul de tripano.

As MSC de PO eram derivadas de células de medula óssea humana de densidade leve (dadores n° 394 (0), n° 386(0) e n° 381(0). Foram removidas amostras de 0,5-5,0 x 106 células como controlos para análise de fluxo. As células restantes foram diluídas até uma contagem celular de 2 x 107 células/mL utilizando tampão de Milenyi; se a contagem fosse < 2 x 107 células/mL, esta etapa não era realizada. As células foram incubadas com IgG a 40 pL por mL de suspensão celular durante 10 minutos, a 4 °C, com agitação. As células foram centrifugadas durante 5 minutos a 1100 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (80 pL de tampão por 107 células). Foram adicionadas microesferas anti-CD45 (20 pL de esferas por 107 células). A mistura foi incubada a 4 °C, durante 15 minutos com agitação. O tampão de Miltenyi foi adicionado para diluir a mistura e lavar as células. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1100 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (0,5 pL de tampão por 108 células). A Coluna Large Cell Separation foi iniciada seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada à coluna e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada a CD45'. A coluna foi enxaguada três vezes com 0,5 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada a CD45'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada a CD45'. Um mL de tampão de Miltenyi foi adicionado à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Uma nova coluna de células grandes foi iniciada seguindo as instruções do fabricante e as células no tubo 'ligada a CD45' foram 26 adicionadas à segunda coluna. A suspensão de células/microesferas foi adicionada à coluna e a suspensão escoada através da coluna. 0 efluente foi recolhido como fracção 'não ligada a CD45'. A coluna foi enxaguada três vezes com 0,5 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada a CD45'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada a CD45'. Um mL de tampão de Miltenyi foi adicionado à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Foram realizadas contagens de células e ensaios de viabilidade. As células das fracções ligada e não ligada (n° 394) e a fracção não ligada (n° 386 & n° 381) foram coradas para análise de fluxo. As células foram colocadas em cultura. As células foram recolhidas e submetidas a passagem até que um número adequado de células estivesse disponível para análise de fluxo.

Tabela 13

Dador ns 381: Rendimentos de selecção celular CD45 de PO Fracção Número de % de células Rendimento Células PO 381 8,7 x 106 100 Ligada a CD45 1,4 x 105 1,6 Não ligada a CD45 4,8 x 106 55 27

Tabela 14

Dador n2 386: Rendimentos de selecção celular CD45 de PO Fracção Número de células % de Rendimento Células PO 386 1,2 x 107 100 Ligada a CD45 2,2 x 105 1,9 Não ligada a CD45 8,4 x 106 70

Tabela 15

Dador n2 394: Rendimentos de selecção celular CD45 de PO Fracção Número de células % de Rendimento Células PO 394 1,2 x 108 100 Ligada a CD45 1,8 x 106 1,5 Não ligada a CD45 1,1 x 108 92 28

Tabela 16

Análise de Fluxo das Fracções Celulares Iniciais Fracção % de células CD45+ Células PO 381 4,7 Não ligada a CD45 381 1,5 Células PO 386 1,9 Não ligada a CD45 386 3, 5 Células PO 394 2,0 Não ligada a CD45 394 1,4

Tabela 17

Colheitas Celulares de Dador 381(1) Fracção Células/cm2 Células/cm2 Dias em Factor de semeadas recolhidas cultura Expansão Ligada a CD45 3,4 x 104 5,8 x 104 12 1, 7 Não ligada a CD45 'Jj' O \—1 X LO 8,3 x 103 7 1,5

Tabela 18

Colheitas Celulares de ligada de CD45 de Dador 381(2) Fracção Células/cm2 Células/cm2 Dias em Factor de semeadas recolhidas cultura Expansão Ligada a CD45 2,9 x 103 3,7 x 104 3 12,8 29

Tabela 19

Colheitas Celulares de Dador 386(1) Fracção Células/cm2 Células/cm2 Dias em Factor de semeadas recolhidas cultura Expansão Ligada a CD45 O \—1 X 7,5 x 104 12 1,7 Não ligada a CD45 5,4 x 103 1,6 x 104 7 3, 0

Tabela 20

Colheitas Celulares de Dador 394(1) Fracção Células/cm2 Células/cm2 Dias em Factor de semeadas recolhidas cultura Expansão Ligada a CD45 5,3 x 103 1,3 x 104 11 2, 5 Não ligada a CD45 5,3 x 103 3,1 x 104 11 5, 0

Tabela 21

Análise de Fluxo de Células Cultivadas a partir de MSC de PO Seleccionadas de CD45 Fracção % de fenótipo MSC % de CD45+ 381(2) de ligada a CD45 99,2 0,7 386(1) de ligada a CD45 99,0 0, 8 394(1) de ligada a CD45 98,5 1,4 30 A selecção CD45 de MSC de PO produziu uma população celular que era < 2% da população PO inicial. Células ligadas a CD45 cultivadas, isoladas de MSC de PO, produziram MSC como definido por citometria de fluxo e morfologia. A fracção celular não ligada a CD45 isolada das MSC de PO produziu igualmente MSC como definido por citometria de fluxo e morfologia. O fenótipo do precursor de MSC pareceu ser CD45 ténue.

Exemplo 4

Isolamento de MSC utilizando Selecção de CD45

As células de densidade leve isoladas a partir de medula óssea foram seleccionadas utilizando microesferas de Miltenyi anti-CD45 conjugadas directamente (Miltenyi Lote n° NE5848) seguindo as instruções do fabricante. A Coluna VS era de Miltenyi Lote n° 0231) . Os filtros de pré-separação de 30 pm eram de Miltenyi (Lote 55). Tampão de Miltenyi: solução salina tamponada com fosfatos a pH 7,2 suplementada com 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. A coloração de fluxo foi realizada utilizando as instruções sugeridas pelo fabricante. A análise de fluxo foi realizada utilizando o FACS Calibur ou o FACS Vantage. A viabilidade celular e o número de células foram determinados utilizando o azul de tripano.

As células de densidade leve foram isoladas a partir de aspirado de medula óssea humana (dador n° 358) utilizando solução de Dendreon BDS72 no seguimento de centrifugação de densidade de aspirados de medula óssea. As aliquotas foram removidas como controlos para análise de fluxo e cultura de células. As células restantes foram diluídas até uma contagem 31 celular de 2 x 107 células/mL utilizando tampão de Miltenyi. As células foram incubadas com IgG a 40 pL por mL de suspensão celular durante 10 minutos a 4 °C com agitação. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (80 pL de tampão por 107 células). Foram adicionadas microesferas anti-CD45 (20 pL de esferas por 107 células) . A mistura foi incubada a 4 °C durante 20 minutos com agitação. O tampão de Miltenyi foi adicionado para diluir a mistura e lavar as células. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (0,5 pL de tampão por 108 células). A coluna VS foi iniciada seguindo as instruções do

fabricante. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O

efluente foi recolhido como fracção 'não ligada a CD45'. A

coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada a CD45'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada de CD45'. Foram adicionados cinco mL de tampão de Miltenyi à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as

células para dentro do tubo. Uma coluna nova foi iniciada e as células no tubo 'ligada a CD45' foram adicionadas à segunda coluna. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O

efluente foi recolhido como fracção 'não ligada a CD45'. A

coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada a CD45'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada a CD45'. Cinco mL de tampão de Miltenyi foram adicionados à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as 32 células para dentro do tubo. Foram realizadas contagens de células e ensaios de viabilidade. As células das fracções ligadas e não ligadas foram coradas para análise de fluxo. As células foram colocadas em cultura. As células foram recolhidas e contadas.

Tabela 22

Rendimentos de selecção celular CD45 Fracção Número de células % de Rendimento Células de densidade leve 3,93 x 108 100 Ligada a CD45 1,84 x 108 47 Não ligada a CD45 1,37 x 108 35

Tabela 23

Análise de fluxo das Fracções Celulares Iniciais Fracção % de células CD45+ Células de densidade leve 78,3 Ligada a CD45 99,0* Não ligada a CD45 51, 5 * a intensidade de coloração é significativamente melhorada na fracção celular ligada de CD45 33

Tabela 24

Exame Microscópico de Culturas PO no Dia 14 Fracção Aparência Células de densidade leve 100% confluentes, muitas células de fase clara Ligada a CD45 80% confluentes, algumas células de fase clara Não ligada a CD45 95% confluentes, algumas células de fase clara

Tabela 25

Colheitas Celulares PO Fracção Células/cm2 semeadas Células/cm2 recolhidas % de Rendimento Células de densidade leve 1,6 x 105 5,4 x 104 33 Ligada a CD45 1,6 x 105 1,9 x 104 12 Não ligada a CD45 1,6 x 105 4,6 x 104 29

Quarenta e sete por cento das células estavam presentes na fracção ligada de CD45. Esta população celular ligada de CD45 era 99% positiva para CD45 por análise de fluxo e era capaz de produzir MSC a PO como definido por morfologia. A fracção celular não ligada de CD45 era 35% das células totais seleccionadas e era 51,5% positiva para CD45. A intensidade de 34 fluorescência das células não ligadas a CD45 era muito mais baixa do que a das células ligadas a CD45. Esta fracção celular era igualmente capaz de produzir MSC em cultura PO como definido por morfologia. Esta experiência proporciona provas adicionais de que o precursor de MSC é positivo para CD45 com uma intensidade de coloração ténue.

Exemplo 5

Isolamento de MSC utilizando Selecção Celular de Fibroblastos

As microesferas anti-fibroblastos foram desenvolvidas para a separação de células com base na expressão de um antigénio especifico de fibroblastos. Uma vez que MSC cultivadas possuem uma morfologia fibroblástica, as microesferas anti-fibroblastos foram utilizadas para seleccionar uma fracção de células a partir de células de medula óssea de densidade leve. As células que ficaram ligadas e aquelas que não ficaram ligadas foram colocadas em condições de cultura MSC padrão e observadas.

As microesferas anti-fibroblastos eram de Miltenyi (Lote n° NE630). A Coluna VS era de Miltenyi (Lote n° 0231). Os filtros de pré-separação de 30 pm eram de Miltenyi (Lote n° 55). Tampão de Miltenyi: solução salina tamponada com fosfatos a pH 7,2 suplementada com 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. A coloração de fluxo foi realizada seguindo as instruções sugeridas pelo fabricante. A análise de fluxo foi realizada utilizando o FACS Calibur ou o FACS Vantage. A viabilidade celular e o número de células foram determinados utilizando o azul de tripano. 35

Os ensaios foram realizados como se segue para medir o potencial osteogénico e adipogénico das células.

Ensaio de adipogénese. As células foram plaqueadas numa placa de 6 poços (2xl05 células/poço) em meios hMSC. As MSC confluentes foram induzidas por pulsos com meios de elevado teor de glucose contendo dexametasona, insulina, 3-isobutil-l-metil-xantina e indometacina. No fim do período de cultura, as placas foram fixas com 10% de formalina, coradas com Vermelho de Óleo "O" e contrastadas com hematoxilina. A formação de vacúolos lipídicos que coram de vermelho foi observada e semiquantifiçada em percentagem de área de superfície de poço.

Ensaio de deposição osteogénica de cálcio. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços (3xl04 células/poço). Os poços rotulados como "OS" foram alimentados com meios hMSC contendo suplementos de ácido Ascórbico 2-fosfato, dexametasona e β-glicerofosfato. Os poços rotulados como " Controlo " foram alimentados com meios hMSC padrão. As trocas de meios foram realizadas duas vezes por semana durante 14 a 16 dias. A deposição aumentada de : cálcio foi medida através de ensaios colorimétricos semiquantitativos.

As células de densidade leve foram isoladas a partir de aspirados de medula óssea humana (dadores n°373, n° 386 & n° 421) utilizando solução de Dendreon BDS72 no seguimento de centrifugação de densidade de aspirados de medula óssea. As alíquotas foram removidas como controlos para cultura de células. As células restantes foram diluídas até uma contagem celular de 2 x 107 células/mL utilizando tampão de Miltenyi. As células foram incubadas com IgG a 40 pL por mL de suspensão celular durante 10 minutos, a 4 °C, com agitação. As células 36 foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (80 pL de tampão por 107 células). Foram adicionadas microesferas anti-fibroblastos (20 pL de esferas por 107 células) . A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. O tampão de Miltenyi foi adicionado para diluir a mistura e lavar as células. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (1 mL de tampão por 108 células) . A coluna VS foi iniciada seguindo as instruções do fabricante. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada a fibroblastos'. A coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada de fibroblastos'. Foram adicionados à coluna cinco mL de tampão de Miltenyi e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Uma coluna nova foi iniciada e as células no tubo 'ligada a fibroblastos' foram adicionadas à segunda coluna. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada de fibroblastos'. Foram adicionados à coluna cinco mL de tampão de Miltenyi e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Foram realizadas contagens de células e ensaios 37 de viabilidade. As células dos dadores 373 e 386 foram colocadas em cultura. As células foram recolhidas e submetidas a passagem. As células PO do controlo de densidade leve e as culturas ligadas de fibroblastos do dador 373 foram coradas para análise de fluxo. As células PO do dador 386 foram colocadas dentro do ensaio de diferenciação osteogénica in vitro e do ensaio adipogénico in vitro. As culturas dos ensaios adipogénicos apresentaram adipogénese significativa das MSC.

Tabela 26

Rendimentos de selecção Celular de Dador 373 Fracção Número de células % de Rendimento Células densidade leve 6,0 x 107 100 Ligada a fibroblastos 5,6 x 106 9 Não ligada a fibroblastos 4,2 x 107 70 38

Tabela 27

Rendimentos de selecção Celular de Dador 386 Fracção Número de células % de Rendimento Células de densidade leve 6,0 x 108 100 Ligada a fibroblastos 2,1 x 107 3, 5 Não ligada a fibroblastos 4,3 x 108 72

Tabela 28

Rendimentos de selecção Celular de Dador 421 Fracção Número de células % de Rendimento Células de densidade leve 4,4 x 108 100 Ligada a fibroblastos 2,6 x 107 5, 8 Não ligada a fibroblastos 4,2 x 108 94 39

Tabela 29

Exame Microscópico de Dador 373 de Culturas PO no Dia 14 Fracção Aparência Células de densidade leve 80% confluentes, observadas células de fase clara Ligada a fibroblastos 50% confluentes, observadas células de fase clara Não ligada a fibroblastos Células arredondadas, detritos

Tabela 30

Exame Microscópico de Dador 386 de Culturas PO no Dia 14 Fracção Aparência Células de 100% confluentes, observadas células de densidade leve fase clara Ligada a 100% confluentes, observadas células de fibroblastos fase clara Não ligada a Células arredondadas flutuantes, fibroblastos detritos 40

Tabela 31

Colheitas Celulares PO de Dador 373 Fracção Células semeadas/cm2 Células recolhidas/cm2 % de Rendimento Células de densidade leve 8,1 x 104 1,2 x 104 15 Ligada a fibroblastos 8,0 x 104 5,0 x 103 10 Não ligada a fibroblastos 8,1 x 104 3,2 x 101 0,04

Tabela 32

Colheitas Celulares P0 de Dador 386 Fracção Células semeadas/cm2 Células recolhidas/cm2 % de Rendimento Células de densidade leve 1,6 x 105 1,6 x 104 10 Ligada a fibroblastos 1,6 x 105 1,8 x 104 11 Não ligada a fibroblastos 1,6 x 105 3,9 x 101 0,02 41

Tabela 33 Análise de fluxo de Dador 373 de Culturas PO Dador/Fracção % de fenótipo MSC % de células CD45+ Células de densidade leve 373(0) 89,3 10, 3 Células ligadas a fibroblastos 373(0) 85, 9 13, 8

Os resultados do ensaio de cálcio para o Dador 386(1), fracções de células de densidade leve e de células ligadas de fibroblastos são apresentados na Tabela 39 e Figura 2.

Tabela 34

Leituras Cálcio (pg/poço) espectrofotométricas de OD a 575 nm ID de

Factor

Amostra Condição de Diluição 1 2 3 1 2 3 Média S.D, Densidade Controlo 20 0,0000 0,0000 0,0000 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 leve Densidade OS 50 0,1490 0,1625 0,1903 60,4 62, 3 66,4 63, 0 3,1 leve Fibro Pos Controlo 20 0,0000 0,0000 0,0000 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Fibro Pos OS 50 0,1370 0, 1554 0,1225 58,6 61, 3 56,5 58,8 2,4 42 A fracção de células ligadas de fibroblastos de células de medula óssea de densidade leve representou 3—9% da população celular nucleada inicial e aderiram ao poliestireno. Com condições de cultura MSC padrão, a fracção de células ligadas de fibroblastos produziu uma população MSC como definido por citometria de fluxo, ensaios biológicos e morfologia.

Exemplo 6

Isolamento de MSC utilizando Selecção Celular de Fibroblastos e CD14

As microesferas anti-fibroblastos eram de Miltenyi (Lote n° NE6836). A Coluna VS era de Miltenyi (Lote n° 0231). Os filtros de pré-separação de 30 pm eram de Miltenyi (Lote n° 55). Tampão de Miltenyi: solução salina tamponada com fosfatos a pH 7,2 suplementada com 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. As esferas magnéticas anti-CDl4 eram de Dynal (Lote # A93900). A coloração de fluxo foi realizada seguindo as instruções sugeridas pelo fabricante. A análise de fluxo foi realizada utilizando o FACS Calibur ou o FACS Vantage. A viabilidade celular e o número de células foram determinados utilizando o azul de tripano.

As células de densidade leve foram isoladas a partir de um aspirado de medula óssea humana (dador n° 391) utilizando solução de Dendreon BDS72 no seguimento de centrifugação de densidade dos aspirados de medula óssea. As aliquotas foram removidas como controlos para cultura de células. As células restantes foram diluidas até uma contagem celular de 2 x 107 células/mL utilizando tampão de Miltenyi. As células foram incubadas com IgG a 40 pL por mL de suspensão celular durante 10 43 minutos a 4 °C com agitação. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (80 pL de tampão por 107 células). Foram adicionadas microesferas anti-fibroblastos (20 pL de esferas por 107 células). A mistura foi incubada a 4 °C durante 15 minutos com agitação. O tampão de Miltenyi foi adicionado para diluir a mistura e lavar as células. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (1 mL de tampão por 108 células) . A coluna VS foi iniciada seguindo as instruções do fabricante. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada de fibroblastos' . A coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada de fibroblastos'. Cinco mL de tampão de Miltenyi foram adicionados à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Uma coluna nova foi iniciada e as células no tubo 'ligada de fibroblastos' foram adicionadas à segunda coluna. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada de fibroblastos' . A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada de fibroblastos' . Cinco mL de tampão de Miltenyi foram adicionados à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Foram realizadas 44 contagens de células e ensaios de viabilidade. As células não ligadas foram colocadas em cultura. As células ligadas foram incubadas com esferas magnéticas Dynal anti-CDl4 a uma concentração celular de 2 x 107 células por mL e uma concentração de esferas de 2 x 107 esferas por mL durante 1 hora a 4 °C com agitação. A suspensão de células/esferas foi colocada junto ao iman manual Dynal durante 2 minutos. Após 2 minutos, as células não ligadas foram decantadas para dentro de um tubo rotulado 'não ligado de CD14'. 0 tubo de células/esferas foi removido do iman e foram adicionados 5 mL de tampão para ressuspender as células. A suspensão de células/esferas foi colocada junto ao iman manual Dynal durante 2 minutos. Após 2 minutos, as células não ligadas foram decantadas para dentro de um tubo rotulado 'não ligado de CD14'. 0 tubo de células/esferas foi removido do iman e foram adicionados 5 mL de tampão para ressuspender as células. A suspensão de células/esferas foi colocada junto ao iman manual Dynal durante 2 minutos. Após 2 minutos, as células não ligadas foram decantadas para dentro de um tubo rotulado 'não ligado de CD14'. 0 tubo de células/esferas foi removido do iman e foram adicionados 5 mL de tampão para ressuspender as células. As células que permaneceram ligadas às esferas foram contadas e colocadas em cultura em dois poços de 10 cm2. As células no tubo não ligado foram colocadas junto ao iman manual durante 2 minutos. As células não ligadas foram decantadas, contadas e plaqueadas para dentro de um poço de 10 cm2. As células foram recolhidas após 14 dias. As células cultivadas a partir de células de densidade leve e das fracções ligada de Fibroblastos/ligada de CD14 foram coradas para análise de fluxo. 45

Tabela 35

Rendimentos de selecção Celular de Fibroblastos Fracção Número de células % de Rendimento Células de densidade leve 3,35 x 108 100 Ligada a fibroblastos 1,2 x 107 3,4 Não ligada a fibroblastos 3,51 x 108 105

Tabela 36

Rendimentos de selecção celular de CD14 Fracção Número de células % de Rendimento Ligada de fibroblastos 9 x 106 100 Ligada a CD14 3,4 x 106 38 Não ligada a CD 14 1,9 x 106 21

Tabela 37

Exame Microscópico de Culturas PO no Dia 14 Fracção Aparência Células de densidade leve 100% confluentes, observadas células de fase clara Não ligada a fibroblastos Células arredondadas, isoladas e em feixes Ligada fibroblastos/ligada de a CD14 100% confluentes com esferas ligadas a algumas células fusiformes Ligada fibroblastos/não Células arredondadas, isoladas ligada a CD 14 e em feixes

Tabela 38

Colheitas Celulares PO Fracção Células semeadas/cm2 Células recolhidas/cm2 % de Rendimento Células de densidade leve 1,6 x 105 7,6 x 104 47 Não ligada a fibroblastos 1,6 x 105 1,6 x 102 0,1 Ligada a fibroblastos/ligada CD14 1,7 x 105 4,0 x 104 23 Ligada a fibroblastos/não ligada a CD14 1,9 x 105 1,0 x 103 0,5 47

Tabela 39

Análise de fluxo de Culturas PO Fracção % de fenótipo MSC % de células CD45+ Células de densidade leve 98,1 1,0 Ligada a fibroblastos/ligada a CD 14 98,3 0,3 A fim de definir adicionalmente o fenótipo do precursor de MSC, foi realizada uma selecção celular sequencial utilizando esferas Miltenyi para seleccionar células ligadas de fibroblastos, seguido da utilização de esferas magnéticas Dynal para isolar células ligadas de CD14 da fracção ligada de fibroblastos. Tal é possivel, visto que o tamanho da microesférula é demasiado pequeno para interferir com a selecção Dynal.

Utilizando esta técnica, a fracção celular ligada de fibroblastos/ligada de CD 14 foi aproximadamente 1,3% da população celular de densidade leve inicial. As células ligada de fibroblastos/ligada de CD 14, quando colocadas em condições de cultura MSC padrão, aderiram a frascos de poliestireno e, após 14 dias de cultura, produziram uma população MSC como definido por análise de fluxo e morfologia.

Com base nesta detecção única, parece que o precursor de MSC é uma célula fibroblasto+, CD 14+. 0 que é inesperado, visto que 48 a MSC expandida em cultura é uma célula fibroblasto+, CD 14 negativa.

Exemplo 7

Isolamento de MSC utilizando Selecção Celular de Fibroblastos e Triagem de Fluxo

As microesferas anti-fibroblastos eram de Miltenyi (Lote # NE7105). A Coluna VS era de Miltenyi (Lote n° 0231). Os filtros de pré-separação de 30 pm eram de Miltenyi (Lote n° 55) . Tampão de Miltenyi: solução salina tamponada com fosfatos a pH 7,2 suplementada com 0,5% de bsa e edta a 2 mM. A coloração de fluxo foi realizada seguindo as instruções sugeridas pelo fabricante. A análise de fluxo foi realizada utilizando o FACS Calibur ou o FACS Vantage. A triagem de fluxo foi realizada no FACSs Vantage. A determinação de viabilidade celular e número de células foi efectuada utilizando o azul de tripano. O potencial osteogénico foi medido utilizando o método descrito no Exemplo 5 e com um ensaio cúbico osteogénico in vivo como descrito, por exemplo, na Pat. U.S. N° 5486359. Os ensaios adipogénicos foram realizados de acordo com métodos descritos no Exemplo 5.

Os ensaios de condrogénese foram realizados como se segue. As células foram sedimentadas num tubo cónico de 15 mL (2,5xl05 células/sedimento) em meios condrogénicos, consistindo em elevado teor de glucose, dexametasona e TGF-p3. Os sedimentos foram submetidos a histologia para fixação, seccionamento fino e coloração histoquimica. A presença de condrócitos foi detectada utilizando o Azul de Toluidina, que cora proteoglicanos e com um anticorpo especifico para colagénio de tipo II. 49

As células de densidade leve foram isoladas a partir de aspirados de medula óssea humana (dadores # 401 e # 438) utilizando solução de Dendreon BDS72 no seguimento de centrifugação de densidade de aspirados de medula óssea. As aliquotas foram removidas como controlos para análise de fluxo e cultura de células. As células restantes foram diluídas até uma contagem celular de 2 x 107 células/mL utilizando tampão de Miltenyi. As células foram incubadas com IgG a 40 pL por mL de suspensão celular durante 10 minutos a 4 °C com agitação. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (80 pL de tampão por 107 células). Foram adicionadas microesferas anti-fibroblastos (20 pL de esferas por 107 células). A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. O tampão de Miltenyi foi adicionado para diluir a mistura e lavar as células. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de Miltenyi (1 mL de tampão por 108 células). A coluna VS foi iniciada seguindo as instruções do fabricante. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. O efluente foi recolhido como fracção 'não ligada de fibroblastos' . A coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi removida do íman e colocada num tubo rotulado 'ligada de fibroblastos'. Cinco mL de tampão de Miltenyi foram adicionados à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Uma coluna nova foi iniciada e as células no tubo 'ligada de fibroblastos' foram adicionadas à segunda coluna. O pré-filtro foi iniciado seguindo as instruções do fabricante. A suspensão 50 de células/microesferas foi adicionada ao pré-filtro e a suspensão escoada através da coluna. 0 efluente foi recolhido como fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi enxaguada duas vezes com 3 mL de tampão de Miltenyi e este efluente foi adicionado à fracção 'não ligada de fibroblastos'. A coluna foi removida do iman e colocada num tubo rotulado 'ligada de fibroblastos'. Cinco mL de tampão de Miltenyi foram adicionados à coluna e foi utilizado um êmbolo de seringa para empurrar as células para dentro do tubo. Foram realizadas contagens de células e ensaios de viabilidade.

As células da fracção não ligada de fibroblastos foram coradas para análise de fluxo. As células da fracção ligada de fibroblastos foram incubadas com anti-SH3, anti-CD45 e anti-CD 14. As células foram tríadas: o Dador 401 foi triado em dois grupos: população 1 e população 2. O Dador 438 foi triado em três grupos: população 1, população la e população 2. As células da fracção não ligada de fibroblastos (apenas Dador 401) e as populações tríadas foram colocadas em cultura. As células PO foram recolhidas e submetidas a passagem. As células PI das culturas de densidade leve e população 1 do dador n° 401 foram coradas para citometria de fluxo e colocadas no ensaio cúbico in vivo. As células Pl do dador n° 438 foram submetidas a passagem. As células P2 das culturas de densidade leve, população 1 e população la do dador n° 438 foram coradas para citometria de fluxo e colocadas nos ensaios biológicos in vitro (osteogénico, adipogénico e condrogénico). 51

Tabela 40

Rendimentos de selecção Celular de Dador 401 Fracção Número de células % de Rendimento Células de densidade leve 6,6 x 108 100 Ligada a fibroblastos 2,9 x 107 4,4 Não ligada a fibroblastos 5,4 x 108 82

Tabela 41

Rendimentos de selecção Celular de Dador 438 Fracção Número de células % de Rendimento Células de densidade leve 8,5 x 108 100 Ligada a fibroblastos 2,0 x 107 2,4 Não ligada a fibroblastos 7,9 x 108 93 52

Tabela 42 Células Ligadas de Fibroblastos após Triagem de Fluxo Fracção Perfil de Fluxo de Fenótipo de Superfície Número de Células Dador 401 População 1 SH3+ intenso; CD14 ténue 1,1 x 104 Dador 401 População 2 SH3+ intenso; CD 14 intenso 2,0 x 104 Dador 438 População 1 SH3+ intenso; CD 14 ténue 1,5 x 104 Dador 438 População la SH3+ intenso; CD45 ténue 1,5 x 104 Dador 438 População 2 SH3+ intenso; CD 14 intenso 4,8 x 105

Tabela 43

Dador 401: Exame Microscópico de Culturas PO no Dia 12 Fracção Aparência Células de densidade leve 60% confluentes, vistas células de fase intensa Não ligada a fibroblastos Vistas células arredondadas com células fusiformes raras Ligada a fibroblastos 100% confluentes, vistas População 1 células de fase intensa Ligada a fibroblastos Vistas células arredondadas População 2 com células fusiformes raras 53

Tabela 44

Dador 438: Exame Microscópico de Culturas PO no Dia 14 Fracção Aparência Células de densidade leve 90% confluentes, vistas células de fase intensa Ligada de fibroblastos População 1 100% confluentes, vistas células de fase intensa Ligada de fibroblastos População la 100% confluentes, vistas células de fase intensa Ligada de fibroblastos População 2 Detritos

Tabela 45

Dador 401: Colheitas Celulares P0 (culturas do Dia 12) Fracção Células Semeadas/cm2 Células Recolhidas/cm2 % de Rendimento Células de densidade leve OO O X 1—* O 1,7 x 104 21 Não ligada de fibroblastos OO o X 1—* o 6,7 x 102 0, 08 População 1 8,9 x 102 1,7 x 103 196 População 2 1,7 x 103 7,1 x 102 42 54

Tabela 46

Dador 438: Colheitas Celulares PO (culturas do Dia 14) Fracção Células Semeadas/cm2 Células Recolhidas/cm2 Factor de Expansão Células de densidade leve 8,0 x 104 4,5 x 104 0,6 População 1 6,0 x 102 4,2 x 104 70 População la 6,0 x 102 4,6 x 104 77 População 2 9,6 x 103 0 0

Tabela 47

Colheitas Celulares Pl (culturas do Dia 7) Fracção Células Semeadas/cm2 Células Recolhidas/cm2 Factor de Expansão 401 Células de densidade leve 6,7 x 103 3,6 x 104 5 401 População 1 0,3 x 103 2,5 x 104 90,0 438 Células de densidade leve 6,1 x 103 2,3 x 104 4 438 População 1 5,7 x 103 2,1 x 104 4 438 População la 6,2 x 103 2,6 x 104 5 55

Tabela 48

Análise de Fluxo de Culturas PI de Dador 401(1) Fracção % de fenótipo MSC % de CD45+ Células de densidade leve 99,2 0,2 População 1 99, 8 < 0,1

Tabela 49

Resultados de Ensaio Cúbico In vivo de Dador 401(1) Fracção Pontuação Média para 3 cubos Células de densidade leve 0,3 População 1 0,5 Controlo Negativo 0

Tabela 50

Dador 438: Colheita Celular P2 (culturas do Dia 7) Fracção Células semeadas /cm2 Células Recolhidas/cm2 Factor de Expansão Células de densidade leve 5,4 x 103 2,1 x 104 3,8 População 1 5,3 x 103 2,4 x 104 4,5 População la 5,3 x 103 2,2 x 104 4,2 56

Tabela 51

Análise de Fluxo de Culturas P2 de Dador 438(2) Fracção % de fenótipo MSC % de CD45+ Células de densidade leve 99,9 < 0,1 População 1 99,9 < 0,1 População la 99,9 < 0,1

Tabela 52

Dador 438(2): Resultados de Adipogénese % de Área com Vacúolos Fracção Meio Adipogénico Meio Adipogénico de Manutenção Meio MSC Humano Células de densidade leve 40 0 0 População 1 40 0 0 População la 40 0 0

Todas as amostras mediram positivo como avaliado por critérios de aceitação estabelecidos. 57

Tabela 53

Dador 438(2): Resultados de Osteogénese Fracção pg de Cálcio/placa pg de Cálcio /milhão de células Controlo os Controlo OS Células de densidade leve 1,0 16,2 5,1 12,9 População 1 1,1 18, 0 7,2 15,1 População la 1,1 14, 4 5, 8 12, 8

Todas as amostras mediram positivo como avaliado por critérios de aceitação estabelecidos.

Tabela 54a

Dador 438(2): Resultados de Condrogénese; Resultados do Azul de Toluidina Fracção Azul de Toluidina (%) Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Células de densidade leve 60 40 70 100 População 1 70 100 90 100 População la 90 100 100 100 58

Tabela 54b

Dador 438(2): Resultados de Condrogénese; Resultados de Colagénio de Tipo II Fracção Anti-Colagénio de Tipo II (%) Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Células de densidade leve 0 0 30 50 População 1 0 100 70 80 População la 0 90 100 80

Tabela 54c

Dador 438(2): Resultados de Condrogénese; Tamanho de Sedimento Fracção Diâmetro (milímetros) Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Células de densidade leve 1,0 O co 0, 9 1,0 População 1 O CG 1,2 1,5 1,5 População la 1,0 1,4 1,6 1,5

Todas as amostras mediram positivo como avaliado por critérios de aceitação estabelecidos. 59 A fim de definir adicionalmente o fenótipo do precursor de MSC, células de medula óssea de densidade leve ligadas a fibroblastos foram coradas com anti-SH3 e anti-CD14 e tríadas utilizando citometria de fluxo. 0 que resultou na triagem da população 1, população la e população 2. Todas as três destas populações eram SH3+ intensas. A população 1 era CD14+ com uma intensidade de coloração ténue. A população la era CD45+ com uma intensidade de coloração ténue. A população 2 era CD14+ com uma intensidade de coloração brilhante. As MSC foram cultivadas a partir de fracções celulares da População 1 e População la, como confirmado a partir de análise de fluxo e ensaios biológicos in vitro e in vivo. Estimou-se que uma População 1/la celular está presente em 105 células de medula óssea de densidade leve.

Lisboa, 29 de Outubro de 2007 60

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. População isolada de células estaminais mesenquimatosas humanas compreendendo células estaminais mesenquimatosas humanas que foram enriquecidas em CD45 + , de modo a que a população celular contém menos de 5% de células que não são células CD45+.
2. População isolada de células estaminais mesenquimatosas humanas da reivindicação 1, em que as células estaminais mesenquimatosas humanas que são CD45+ são, adicionalmente, reactivas com, pelo menos, um anticorpo monoclonal seleccionado a partir do grupo consistindo em anticorpo SH2, anticorpo SH3 e anticorpo SH4.
3. População celular isolada da reivindicação 2, em que as células estaminais mesenquimatosas humanas são SH3+ e CD45+ .
4. População celular isolada da reivindicação 2, em que as células estaminais mesenquimatosas humanas são SH2+ e CD45+.
5. Composição compreendendo uma população isolada de células estaminais mesenquimatosas humanas da reivindicação 1 que transportam um marcador de superfície de fibroblastos.
6. Composição da reivindicação 5, compreendendo adicionalmente células CD14+. 1
7. Processo de isolamento de uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas da reivindicação 1, compreendendo (a) a obtenção de uma população enriquecida de células estaminais mesenquimatosas humanas; caracterizada por (b) selecção a partir da população celular de (a) de células que são CD45+, utilizando um anticorpo que reconhece CD45.
8. Processo de isolamento de uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas da reivindicação 1 que são SH3+ e CD45+, compreendendo (a) a obtenção de uma população enriquecida de células estaminais mesenquimatosas humanas que são SH3+; caracterizada por: (b) selecção a partir da população celular de (a) de células que são CD45+, utilizando um anticorpo que reconhece CD45.
9. Processo de isolamento de uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas da reivindicação 1 que são SH2+ e CD45+, compreendendo (a) a obtenção de uma população enriquecida de células estaminais mesenquimatosas humanas que são SH2 + ; caracterizada por 2 (b) selecção a partir da população celular de (a) de células que são CD45+, utilizando um anticorpo que reconhece CD45.
10. Processo de isolamento de uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas da reivindicação 1 que são SH3+ e CD45+ de fibroblastos, compreendendo (a) a obtenção de uma população enriquecida de células estaminais mesenquimatosas humanas; caracterizada por (b) selecção a partir da população celular de (a) de células que são SH3+ e DCH45+ de f ibroblastos, utilizando um anticorpo que reconhece CD45.
11. Utilização de células estaminais mesenquimatosas humanas da reivindicação 1 para a preparação de preparações farmacêuticas para o tratamento de um doente.
12. Utilização da reivindicação 11, em que as células estaminais mesenquimatosas humanas são SH3+ e CD45+.
13. Utilização da reivindicação 11, em que as células estaminais mesenquimatosas humanas são SH2+ e CD45+.
14. Utilização da reivindicação 11, em que a preparação farmacêutica deve ser administrada para gerar formação óssea.
15. Utilização da reivindicação 11, em que a preparação farmacêutica deve ser administrada para tratar ou reparar um defeito do tecido conjuntivo no doente. 3
16. Utilização da reivindicação 15, em que o defeito é um defeito ósseo.
17. Utilização da reivindicação 15, em que o defeito é um defeito cartilagineo.
18. Utilização da reivindicação 11, em que a preparação farmacêutica deve ser administrada para estimular o enxerto de células estaminais hematopoéticas ou progenitoras num indivíduo que dele necessita.
19. Células estaminais mesenquimatosas humanas CD45+ isoladas da reivindicação 1 transfectadas com material genético exógeno codificando uma proteína a expressar. Lisboa, 29 de Outubro de 2007 4