PT109454A

PT109454A - Ácidos nucleicos de interferência e composições que os compreendem

Info

Publication number: PT109454A
Application number: PT109454A
Authority: PT
Inventors: Soares Da Silva Patricio
Original assignee: Phyzat Biopharmaceuticals Lda
Priority date: 2016-06-14
Filing date: 2016-06-14
Publication date: 2017-12-14
Also published as: JP2019517819A; US10590422B2; US11319541B2; WO2017216278A3; EP3469082A2; US20170362598A1; WO2017216278A2; CN109996878A; US20200231973A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO É DIRIGIDA A DÚPLEXES DE ARN DE INTERFERÊNCIA PARA MEDIAR O SILENCIAMENTO DE GENES. A PRESENTE INVENÇÃO TAMBÉM É DIRIGIDA A VETORES CODIFICANDO TAIS DÚPLEXES DE ARN DE INTERFERÊNCIA.

Description

DESCRIÇÃO

"ÁCIDOS NUCLEICOS DE INTERFERÊNCIA E COMPOSIÇÕES QUE OS COMPREENDEM"

Campo da Invenção A presente invenção é dirigida duplexes de ARN de interferência para mediar o silenciamento de genes. Apresente invenção também é dirigida a vetores codificando tais duplexes de ARN de interferência.

Descrição cia Técnica Relacionada

Independentemente da sua origem, os tumores requerem um subministro constante de nutrientes para suportar o seu crescimento ininterrupto característico. De facto, as células tumorais podem consumir mais nutrientes do que os requeridos para as suas próprias necessidades metabólicas (Medina et ai., 1992b), e exibem perfis metabólicos diferentes em comparação com os seus homólogos celulares normais. Os tumores são subministrados com nutrientes para abastecer as suas necessidades metabólicas através dos processos coletivos de angiogénese e da expressão prodigiosa de transportadores de nutrientes nas membranas plasmáticas de células constituintes. Os aminoácidos são a fonte primária de azoto celular, utilizados para nucleótidos, glutationa, açúcares amino e síntese proteica. 0 metabolismo voraz e aparentemente desperdiçador dos aminoácidos de tumores malignos leva a, entre outras coisas, equilíbrio de azoto negativo no hospedeiro com cancro. Além disso, os esqueletos de carbono dos aminoácidos são frequentemente utilizados como uma fonte de combustível oxidativo para a geração de ΆΪΡ para alem da glucose e ácidos gordos, e poderá também contribuir para a biossíntese de esterol e li pi dos (Bagqetto, 1992; Medina et al., 1.992a) , Em comparação com células ou tecidos normais, as células cancerígenas exibem canalização potenciada e altera-O-S de aminoácidos em vias metabólicas selecionadas, frequentemente em conjunto com a característica de glicólise aeróbxa dos tumores (Baggetto, 1992) e (Mazurek et al. r 2003). Os tumores sólidos têm frequentemente vascularização pobre, especialmente na fase avascular nascente característica da neoplasia e metástases, de tal forma que devem ter mecanismos eficazes para extrair aminoácidos do plasma de modo a competir com os tecidos do hospedeiro (Medina et al., 1992b) . O cancro, por sua vez, é um microcosmo de evolução, com as células "mais adequadas" resistindo através da adaptação ao microambiente local, como um resultado, são selecionados e expressos transportadores de aminoácidos com propriedades que atribuem vantagens de crescimento e sobrevivência, frequentemente a níveis aumentados em comparação com o tecido parental.

Anteriormente ao advento da clonagem e isolamento de transportadores de aminoácidos de mamíferos, Christensen propos que os transportadores ae aminoácidos específicas poderiam ser regulados positivamente em células transformadas para suportar os níveis elevados de síntese proteica necessária para o crescimento e proliferação (Christensen, 1990). Uma pesquisa, da base de dados da sequência tag humana expressa (EST) na página web do Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) (http ://cgap.nci.nih. gov), utilizando a ferramenta "cDNA Virtual northern" para determinar os níveis de expressão dos "sistemas" de transporte de aminoácidos neutros clássicos A, A3C, L e N, em tecidos normais e cancerosos revelou que enquanto cinco transportadores são significativamente potenciados globalmente em tecidos cancerosos, são destacados dois - LATI (transportador de aminoácidos neutros grande) e ASCT2 (transportador de aminoácidos ASC 2) (Fuchs et al., 2 0 05). ASCT2 e LATI são ambos regulados positivamente três vezes (coietivamente) numa variedade de tecidos cancerosos onde o seu padrão de expressão é quase idêntico (Fuchs et al., 2005). LATI tem sido associado com células cancerosas ou proliferativas. Quando LATI de comprimento completo foi inicialmente isolado e caracterizado em 1998, foi mostrado como não sendo expresso em fígado de rato mas foi detetado em linhas celulares de hepatoma (dRLh-84) e hepatocarcinoma (FAA-HTC1) de rato (Kanai et al., 1998), 0 que é consistente com o padrão de expressão de ASCT2 no fígado humano conforme discutido db8.JLXO * Ànáxise 00 NOζΊζϊι^ΤΏ. ]q! O t~ ~i 1 nh d o ί com iinlias celulares humanas reveiou a expressão de TA1 na linha celular de coriocarcinoma JEG-.3 e linha celular de carcinoma da mama MDA-.AI (Sang et ai., 199o) , bem como na linna celular de carcinoma de células do anel de sinete do estômago (KATOIII), carcinoma pulmonar de células pequenas (RERF-LO- MA) e melanoma maligno (G-361) (Kanai et ai., 1998). Tanto 4F2hc como LATI foram detetados em várias linhas celulares de leucemia, células de carcinoma pulmonar de células pequenas KERF-LC- MA, células de carcinoma do útero

HeLa e células de carcinoma da bexiga T-24 (Yanagida et ai., 2001) · 0s resultados com as células T-24 foram confirmados através de microscopia de imunofluorescência confocal, que rebelou colo^alizaçao de nAil e 4F2h na membrana plasmática (Kim et al., 2002) . LAI1 e 4F2hc também foram mostrados como estando colocalizados na membrana plasmática de células de carcinoma epidermoide oral humano KB (Yoon et ai., 2005), e podem ser importantes para a carcinoçjénese epitelial escamosa orar, aaao que a cororação imunohistoquímica mostrou que a sua expressão aumenta durante a progressão de mucosa escamosa normal para carcinoma de células escamosas orais (Kim et al., 2004b). Kíihne et al., (Kuhne et al., 2007) divulgam polimorfismos genéticos dos genes LATI e LAT2 e relacionam tais polimorfismos com a farmacocinética de melfalan. Shennan et al., (Shennan et al., 2008) divulgam que a inibição de LATI reduz o crescimento de células de cancro da mama humano. Nawashiro et al., (Nawashi.ro et al., 200 6) divulgam que LATI é um alvo molecular potencial, em tumores astroc.ltIcos humanos. Yamauchi et ai., (Yamauchi et ai., 200 9) e Kim et ai ., (Kim et al., 2008) divulgam a utilização de inibidores cie LATI para bloquear a atividade tumoral de várias células cancerígenas. Mo contexto do requerimento da chaperona 4F2hc para o desencadeamento da atividade de LATI, RT-PCR quantitativa a tempo real revelou níveis semelhantes de AP.Nm de LATI e 4F2hc em células KB (Yoon et ai,, 2005) . Isto entra em conflito com os dados a partir de células T-24 onde os níveis de LATI foram -1,5 vezes mais elevados do que 4F2hc (Kim et ai., 2002) e com resultados em células de cancro da mama humano MDA-MB-231 and MCF-7, onde o ARNm de LATI foi -4,3- e -4,9 vezes mais elevado do que 4F2hc (Shennan et ai., 2004) . Com base nos dados por {Fuchs et ai., 2005), parece que a abundância global do ARNm de 4F2hc está a par com a de LATI, mas deve ser tido em conta que os níveis de proteína de ARNm não estão sempre correlacionados de forma linear devido aios múltiplos mecanismos de controlo da expressão génica. Além disso, estas células possuem indubitavelmente mecanismos que correspondem adequadamente aos níveis proteicos de ambos componentes, de tal forma que 4F2hc não é limitante de taxa para funções vitais relacionadas com LATI.

Quando foram injetadas células de cancro do cólon RCN-9 no baço de ratos, o tamanho dos tumores hepáticos met.astáticos resultantes foi d.iretamente correlacionado com a expressão de LATI (Onkamie et ai,, 2001; Tamai et ai., 2001). Consequentemente, foi proposto que a inibição da função de LA.T1 poderia servir como uma terapêutica potencial para vários tipos de cancros {Kanai et ai., 2001) . Até à data, os estudos visando LATI especificamente são escassos. Contudo, a expressão antisense de LATI in vitro em células tumorais hepáticas não humanas resultou numa diminuição modesta porém estatisticamente significativa do número de células, viabilidade e células em fase S durante um período de 5 dias em relção a controlos apesar da ausência de uma diminuição significativa do transporte de tipo L durante este período (Storey et ai., 2005).

Oligonucleotides antisense direcionados contra 4F2hc foram mostrados como inibindo o transporte de isoleucina independente de Na· em células de glioma de rato C6-BU-1 (Broer et al., 1997), e a absorção de leucina em células citotrofoblásticas humanas BeWo (Kudo et al., 2004), mas os efeitos sobre o crescimento celular não foram relatados. Um anticorpo anti-4F2hc inibiu a proliferação de uma variedade de linhas tumorais celulares (Yaqita et al., 198 6) , mas é possível que estes efeitos fossem mediados através dos efeitos coletivos sobre outras "cadeias leves" de 4F2 para. além de LATI, ou sobre funções não relacionadas com transporte de 4F2hc (Feral et al., 2005). A inativação de LATI em células T-24 com um LATl-ARNsi contra os nucleótidos 1173---1194 in vitro levou a uma diminuição da absorção de L-CSNO (Li et al., 2005), mas não é relatado se a sobrevivência celular foi afetada. Consequentemente, permanecem sem ser relatados estudos mecanísticos ligando a "cadeia leve" de LATI ao crescimento do cancro. A utilização de ARNsi para inibir a expressão génica de LATI foi divulgada por parte de vários grupos (Kirn et al., 2006a; Kim et al., 2006b; Kaneko et al., 2007; Pinho et al., 2007a; Yin et al., 200 8; Kuhne et ai., 200 9; Liang et al., 2011; Denoyer et al., 2012; Hayashi et al., 2012; Dickens et al., 2013;

Youland et al., 2013; Habermeier et al., 2015),

Mais recentemente, LATI foi sugerido como um marcador do prognóstico de cancro nos tipos de cancros listados no seguinre quadro:

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A atividade de transporte do sistema ASC é ubíqua e caracterizada peia sua preferência por aminoácidos neutros pequenos incluindo alanina, serina, e cisteína. 0 sistema ASC de transportadores de aminoácidos neutros (SLC1A4 e SLC1A5) pertence à família de portadores de solutos 1 (SLC1) , que também inclui os transportadores de glutamato de alta afinidade. Foi identificado ATBO humano através de RT-PCR e análise de restrição enzimática na linha celular de túbulo proximal humano

HKPT e corresponde ao roedor ASCT2 . Os dois transportadores ASC exibem diferente seletividade de substrato. SLC1A4 codifica o transportador de aminoácidos dependente de sódio ASCII, que aceita L-alanina, L-serina, L-treonina, e L-cisteína de uma forma estereoespecífca. ASCT2, a segunda isoforma do sistema de transporte ASC, é codificada por SLC1A5. No rim e intestino, ASCT2 está presente nas membranas de borda em escova das células tubulares proximais e enterócitos, respetivamente. Para além dos substratos típicos do sistema ASC, também aceita L-glutamina e L-asparagma a afinidade mais elevada bem como metionina, leucina, e glicina com menor afinidade. Tanto ASCII como A.SCT2 medeiam a permuta obrigatória dependente de sódio de aminoácidos de substrato (Pinho et ai., 2007b). ASCi2 é expresso em adenocarcinomas coiorretais e a sobrevivência qos pacientes diminuiu com o aumento da percentagem de células cancerígenas positivas para ASCT2. Estes resultados inaicam que ASCT2 é expresso num número significativo de adenocarcinomas coiorretais, e que a expressão de AbCT2 esta associada com comportamento biológico agressivo (Wxtte et ai,, 2U02) . Foi proposto que ASCT3 parece ser requerido para o metabolismo da glutamina tanto em próstata não maligna como maligna. Contudo, o adenocarcinoma da próstata positivo para ASCT2 parece estar relacionado com um comportamento biológico mais agressivo, ASCT2 parece estar envolvido na progressão tumoral (Li et ai., 2003; Wang et ai,, 2015). A expressão de ASCT2 tem um papel crucial na metástase de adenocarcinomas pulmonares, e é um marcador molecular potencial para a previsão de diagnóstico pobre após cirurgia (Shimizu et al., 2014) . A expressão de ASCT2 foi também constatada como desempenhando em papel importante no crescimento de células tumorais, e é um marcador patológico prometedor para prever um resultado pior no cancro pancreático (Kaira et ai., 2015b; Kyoichi et ai., 2015) . A expressão elevada de ASCT2 foi também constatada como estando significativamente associada com prognóstico e sobrevivência pobres de pacientes de near oblast, oma (Ren et al., 2015) . Adicionalmente, outros sugeriram que a supressão de ASCT2 exerce efeitos proapoptóticos transcendendo os da privação de glutamina por si su vBryan et. al., 2004; Fuchs et al., 2004), A importância da expressão de ASCT2 era melanomas foi confirmada através de inativaçuo de ARNsh, o que inibiu a absorção de glutamina, a sinalização por mTORCl e a proliferação celular (Wang et al., 2014) . ARh ae interferência ("ARNi") é um mecanismo recentemente descoberto ae silenciamento de genes pós-traducional no qual ARM de cadeia dupla, correspondente a um gene (ou região de codificação) de interesse é introduzido num organismo, resultando na degradação do ARNm correspondente. 0 fenómeno foi originalmente descoberto em Caenorhabditis elegans (Fire et ai., 1998).

Ao contrário da tecnologia antisense, o fenómeno de ARNi persiste durante várias divisões celulares antes de que a expressão genica seja recuperada. 0 processo ocorre em pelo menos duas etapas: uma ribonuclease endógena cliva o ARNds mais .longo em ARNs mais curtos de 21, 22 ou 23 nucleótidos de comprimento, denominados "ARNs de interferência pequenos" ou ARNsi (Hannon, 2002). Os segmentos de ARNsi medeiam posteriormente a degradação do ARNm alvo. O ARNi foi utilizado para a determinação da função génica de uma forma semelhante mas mais eficiente do que os oligonucleotides antisense. Ao tabricar inativaçoes visadas ao nível de ARN através de ARNi, era vez de ao nível ae ADN utilizando tecnologia de inativação genica convencional, podem ser ensaiados um vasto número de genes rapidamente e eficazmente. O ARNi é como tal um método extremamente poderoso e simples para ensaio da função génica. 0 ARNi foi mostrado como sendo eficaz em células de mamíferos cultivadas. Na maioria dos métodos descritos até à data, o ARNi é levado a cabo introduzindo ARN de cadeia dupla nas células através de micromjeção ou através de encharcamento das células cultivadas numa solução de ARN de cadeia dupla, bera como transfetando as células coin um plasmídeo portando uma cassete de expressão de ARNsi em estrutura de grampo de cabelo sob o controlo de promotores adequados, tais como o promotor U6, Hl ou citomegalovírus ("CMV") (Elbashir et al., 2001; Harborth et al., 2001; Lee et al., 2001; Brummelkamp et al., 2002; Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002; Paul et al., 2002; Sui et al., 2002; Xia et al., 2002; Yu et al., 2002) . A inibição específica de gene da expressão génica através de ácido ribonucleico de cadeia dupls- e geralmente descrita no Documento de Patente. U.S. N°. 6.506.559, que é incorporado no presente documento por referência. A utilização exemplar da tecnologia de ARNsi é adicionalmente descrita no Pedido de Patente U.S. Publicado N.° 2003/01090635 e Pedido de Patente U.S. Publicado N.0 20040248174, que são incorporados no presente documento como referência. Davis (Davis, 2009) descreve a administração direcionada de ARNsi a seres humanos utilizando tecnologia de nanopartículas.

Sumário da invenção

Um objeto da presente invenção e utilizar uma técnica de ARN de interferência para regular negativamente a expressão aos genes LATI e/ou ASCT2 de modo a tratar ou prevenir o cancro.

Cancros preferidos que podem ser tratados ou prevenidos por parte da presente invenção incluem cancros de bexiga, cérebro, cólon, cabeça e pescoço, rim, fígado, pulmão, nódulos linfáticos, glândulas mamárias, músculo, ovário, pâncreas, pele e estômago. As composiçoes "ou moléculas) da invenção compreendem moléculas de ácido nucieico o.e interferência curtas (ANsi) e compostos relacionados incluindo, mas não limitadas a, ARNsi. Apresente invenção abrange composições e métodos de utilização de ANsi incluindo, mas não limitados a ARN de interferência curto (ARNsi), ARN de cadeia dupla (ARNds) , mic.ro-A.RN (miARN) , antagomirs e ARN curto em grampo de cabelo (ARNsh) capaz de mediar ARN de interferência. Numa forma de realização, a molécula de ANsi da invenção pode ser incorporada em RISC (complexo de silenciamento induzido por ARN) .

Um objetivo adicionai da presente invenção é proporcionar urna molécula de ARN si que regule negativamente de forma eficaz a expressão do gene LATI e/ou gene ASCT2.

Consequentemente, num aspeto, a invenção refere-se a uma molécula de ANsi, era que a dita molécula visa especificamente pelo menos uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 209 - SEQ ID NO: 297. Numa forma de realização alternativa, a invenção refere-se a uma molécula de ANsi em que a dita molécula visa especificamente pelo menos uma sequência complementar a pelo menos uma sequência, selecionada a partir da SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 104 e SSQ ID NO: 209 - SEQ ID NO: 297. Numa forma de realização, a invenção refere-se a uma molécula de ANsi isolada.

Numa forma de realização, a molécula de ANsi reduz a expressão do gene LATI e/ou ASCT2 (humano) quando introduzida numa célula. Numa forma de realização preferida adicional, a dita molécula visa especificamente pelo menos uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO 4, 6, 10, 13, 22, 34, 58, 61, 81, 83, 87 e 95 a. 104. Preferentemente, a molécula de ANsi reduz a expressão do gene LATI quando expressa numa célula. Alternativamente, numa forma de realização, a molécula de ANsi visa especif icamente pelo menos uma sequência, selecionada a partir da SEQ ID NO: 209, 216, 225, 226, 228, 235 a 238, 245, ζ6ϋ, 2d«, 26/, 27i, 272, 278, 279 e 281 a 297. Preferentemente a moiécuia ae ANsi reduz a expressão do gene ASCT2 quando expressa numa célula.

Numa rorma de realização da invenção, a molécula, de ANsi tem 4o pares ae bases ou menos de comprimento. Preferentemente, a molécula ae ANsi rem 19 a 25 pares de bases de comprimento. Numa forma ae realizaçao, o ANsi compreende ou consiste numa região de cadeia, dupla, ae 21 nucleotidos. Preferentemente, o ANsi tem uma cadeia sense e antisense. Numa forma de realização alternativa, a molécula de ANsi compreende ou consiste numa região de cadeia, dupla de 19 nucleotidos. Numa forma de realização, o ANsi tem terminais cegos. Numa forma de rearizaçao alternativa, o ANsi tem cadeias suspensas a 5’ e/ou 3 . rrererenreroenre as caaeias suspensas têm entre 1 a 5 nucleótidos, mais preferentemente, cadeias suspensas de 2 nucxeotidos. As cadeias suspensas podem ser ácidos ribonucleicos, ou ácidos desoxirribonucleicos.

Numa forma de realização, a molécula de ANsi de acordo com a invenção compreende uma modificação química. Preferentemente, a modificação química é na cadeia sense, na cadeia antisense ou em ambas. Exemplos de modificações químicas incluem ligações internucleotídicas fosforotioato, metilação 2 ' 2'-desoxi-fluororribonucleótidos, 2'-desoxirribonucleótidos, nucleótidos de 5-C metilo, incorporação de resíduos desoxibásicos invertidos ou uma substituição de nucleótidos de uracilo ribose com nucleótidos de desoxi.tirrii.dina ou combinações dos mesmos.

Numa forma de realização, as cadeias suspensas a 5' ou 3’ são dinucleótidos, preferentemente dinucleótidos de timidina. Numa forma de realização preferida, as cadeias suspensas a 5' ou 3' são desoxitimidinas.

Numa forma de realização, a molécula de ANsi compreende ou consiste em pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID MO: 105 a 208 e 298 a 386. Numa forma de realização preferida a molécula de ANsi compreende ou consiste em pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 108, 110, 114, 117, 126, 138, 162, 165, 185, 187, 191 e 199 a. 208 . Preferentemente, a molécula de ANsi. reduz a expressão do gene LATI quando expressa numa célula. Noutra forma de realização preferida a molécula de ANsi compreende ou consiste em pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 298, 305, 314, 315, 317, 324-327, 334, 349, 353, 356, 360, 361, 367, 368 e 370 a. 386. Preferentemente, A molécula de ANsi reduz a expressão do gene ASCT2 quando expressa numa célula. De forma notável, nalgumas formas de realização, a molécula de ANsi (tanto a cadeia a 5’ como a 3’ ou ambas) pode começar com pelo menos um, preferentemente dois nucleótidos de alanina. Alternativamente, se a sequência alvo começa com uma ou duas sequências de alanina, estas podem não estar incluídas (visadas) na molécula de ANsi.

Numa forma de realização são utilizadas uma pluralidade de espécies de molécula de ANsi, em que a dita pluralidade de moléculas de ANsi são direcionadas para a mesma ou uma espécie diferente de ARNrn.

Numa forma de realização, o ANsi é selecionado a partir de ARNds, ARNsi ou ARNsh. Preferentemente, o ANsi é ARNsi.

Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se a uma molécula de ANsi, conforme descrito no presente documento para utilização como um medicamento. Numa forma de realização, a invenção refere-se a um ANsi para utilização no tratamento de um distúrbio caracteri zado por aumento dos níveis de expressão (em comparação com os níveis num indivíduo saudável) de LATI e/ou ASCT2.

Noutro aspeto da invenção, é proporcionada uma molécula de ANsi, conforme descrito no presente documento para utilização no tratamento do cancro.

Num aspeto adicional, a invenção refere-se à utilização de uma molécula de ANsi, conforme descrito no presente documento na preparaçao de um medicamento para o tratamento do cancro.

Noutro aspeto, a invenção refere-se a um método para o tratamento do cancro, o método compreendendo administrar uma molécula de ANsi, conforme descrito no presente documento, a um paciente ou indivíduo com necessidade da mesma.

Numa forma de realização, o cancro é selecionado a partir de cancro da bexiga, sangue, cérebro, cólon, cabeça e pescoço, rim, fígado, pulmão, nódulos linfáticos, glândulas mamárias, músculo, ovário, pâncreas, próstata pele, estômago e útero.

Noutro as-peto da invenção é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma molécula de ANsi conforme descrito no presente documento e um portador farmaceuticamente aceitável.

Num aspeto adicionai da invenção é proporcionado um método, preferentemente um método m vit.ro de inibir a absorção de aminoácxdos para uma célula, o método compreendendo administrar um ANsi conforme descrito no presente documento a uma célula. Preferentemente, a absorção de aminoácidos é absorção de leucina independente de sódio. Alternativamente, a absorção ae aminoácidos é absorção de alanina dependente de sódio.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção é dirigida a um método de direcionamento do gene LATI e/ou gene ASCT2 através de inativação ou inibição da sua expressão como uma estratégia inovadora para a terapêutica do cancro. Em particular, e de acordo com um primeiro aspeto da presente invenção, é proporcionada a utilização de um ARNsi para inibir a expressão do gene LATI e/ou gene ASCT2 no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir o cancro, em que o ARNsi compreende um ácido nucleico de LATI ou ASCT2 sense e um ácido nucleico de LATI ou ASCT2 antisense, A presente invenção também proporciona a utilização de um vetor codificando o ARNsi para inibir a expressão génica de LATI e/ou ASCT2 no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir o cancro.

De acordo com um segundo aspeto da presente invenção, é proporcionado um método de tratamento ou prevenção do cancro compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um ARNsi. que inibe a expressão génica de LATI e/ou A.SCT2, em que o ARNsi compreende um ácido nucleico de LATI ou ASCT2 sense e um ácido nucleico de LATI ou ASCT2 antisense. A presente invenção também proporciona um método de tratamento ou prevenção do cancro compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um vetor codificando o ARNsi que inibe a expressão génica de LATI e ASCT2. A sobreexpressão do transportador de LATI, uma isoforma do sistema L de transportador de aminoácidos neutros independente de Na+ é uma observação altamente prevalente em várias formas de cancro. A presente invenção é baseada na descoberta surpreendente de que ARNs de interferência pequenos (ARMsi) seletivos para LATI são eficazes para tratar o cancro. Em particular, cancro de bexiga, sangue, cérebro, cólon, cabeca e pescoço, rim, fígado, pulmão, nódulos linfáticos, glândulas mamárias, metastáu ico, músculo, ovário, pâncreas., próstata pele, estômago e útero. 0 AKNsi ou vetor codificando o ARNsi, ou o medicamento compreendendo o ARNsi ou vetor codificando o ARNsi, pode ser adminisurado a um indivíduo através de administração entérica (por exemplo, oral, retal e intranasal), administração parentérica (por exemplo, administração intravascular, administração peri- e inura-tecidual, injeção ou deposição subcutânea, infusão subcutânea, administração intraocular e administração direta em ou perto do sítio de um tumor.

De acordo com um terceiro aspeto da presente invenção é proporcionado um método in vitro de inibir a expressão do gene LATI e/ou gene ASCT2 numa célula compreendendo colocar em contacto a células comANsi que inibe a expressão génica de LATI e/ou ASCT2 conforme descrito no presente documento. Numa forma de realização, o dito ARNsi compreende um ácido nucleico de LATI e/ou ASCT2 sense e um ácido nucleico de LATI e/ou ASCT2 antisense, em que o ácido nucleico LAT I ou ASCT2 sense é substancialmente idêntico a uma sequência alvo contida dentro do ARNm de LATI ou ASCT2 e o ácido nucleico de LATI e ASCT2 antisense é complementar com o ácido nucleico de LATI ou ASCT2 sense. A presente invenção também proporciona um método in vitro de inibir a expressão dos genes LATI e/ou ASCT2 numa célula compreendendo colocar era contacto a célula com um vetor codificando um ARNsi que inibe a expressão génica de LATI e/ou ASCT2, o dito ARNsi compreende um ácido nucleico de LATI e/ou ASCT2 sense e um ácido nucleico de LATI e/ou ASCT2 antisense, em que o ácido nucleico LAT 1 ou ASCT2 sense é substancialmente idêntico a uma sequência alvo contida dentro do ARNm de LATI ou ASCT2 e o ácido nucleico de LATI e ASCT2 antisense é complementar com o ácido nucleico de LATI ou ASCT2 sense. A expressão do gene pode ser inibida através da introdução de uma molécula de ácido ribonucleico de cadeia dupla (ARNds) na célula numa quantidade suficiente para inibir a expressão dos genes LATI e/ou ASCT2.

Os ARM si utilizados na invenção são acreditados com causando a degradação mediada por ARNi de ARNm de LATI ou ASCT2 de tal forma que o produto proteico do gene LATI ou ASCT2 não é produzido ou é produzido em quantidades reduzidas. Os ARNsi utilizados na invenção podem ser utilizados para alterar a. expressão génica numa célula na qual a expressão de LATI e/ou ASCT2 é regulada positivamente, por exemplo, como resultado de transformação maligna das células. A ligação do ARNsi a um transcrito de ARNm de LATI ou ASCT2 numa célula resulta numa redução da produção de LATI e ASCT2 por parte da célula. 0 termo "ARNsi" é utilizado para significar uma molécula de ARN de cadeia dupla que previne a tradução de um ARNm alvo. São utilizadas técnicas padrão de introdução de ARNsi na célula, incluindo aquelas nas quais o ADN é um molde a partir do qual o ARN é transcrito. 0 ARNsi que inibe a expressão génica de LATI ou ASCT2 inclui uma sequência de ácidos nucleicos de LATI ou ASCT2 sense e uma sequência de ácidos nucleicos de LATI ou ASCT2 antisense. 0 ARNsi pode ser construído de tal forma que um único transcrito tenha as sequênci as tanto sense como antisense complementar a partir do gene alvo, por exemplo, na forma de um grampo de cabelo. 0 ARNsi compreende preferentemente ARN de cadeia dupla curto que é direcionado para o ARNm alvo, isto é, ARNm de LATI ou ARNm de ASCT2 . 0 ARNsi compreende uma cadeia de ARN sense e uma cadeia ae ARN antisense complementar hibridizadas juntas através de interações de emparelhamento de bases de Watson-Crick padrão (doravante no presente documento "emparelhamento de bases") . A cadeia sense compreende uma sequência de ácidos nucleicos que e substancialmente idêntica a uma sequência alvo contida dentro do ARNm de LAT1 ou do ARNm alvo de ASCT2.

Os termos " sequencias sense/antisense” e "cadeias sense/antisense” são utilizadas indistintamente no presente documento para reterir as partes do ARISIsi da presente invenção que sao substancialmente idênticas (sentido direto) à sequência alvo de ARNm de LATI e ASCT2 ou substancialmente complementares (antisense) à sequência alvo de ARNm de LATI e ASCT2.

Conforme utilizado no presente documento, uma sequência de ácidos nucleicos "substanciaimente idêntica" a uma sequência alvo contida, dentro do ARNm alvo é uma sequência de ácidos nuciercos que e idêntica à sequência alvo, ou que difere da sequencia alvo por um ou mais nucleótidos. Preferentemente, a sequência substanciaimente idêntica e idêntica à sequência aivo ou dnere da sequencia alvo por um, dois ou três nucleotidos, mais preferentemente por um ou dois nucleótidos e ainda mais preferentemente por somente 1 rrucleótido. As cadeias sense compreendendo sequências de ácidos nucleicos substanciaimente idênticas a uma sequência aivo são caracterizadas por: ARNsi compreendendo uma tal cadeia sense induzir degradação mediada por ARNi de ARNm contendo a sequência alvo. Por exemplo, um ARNsi da invenção pode compreender uma cadeia sense compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que difere de uma sequência alvo por um, dois, tres ou mais nucleótidos, contanto que a degradação mediada por ARNi seja induzida peio ARNsi.

As caaeias sense e antisense go ARNsi podem compreender duas moléculas de ARN de cadeia simples complementares ou podem compreender uma única molécula na qual duas porções complementares têm emparelhamento de bases e estão ligadas de forma covalente através de uma área em grampo de cabelo de cadeia simpies . Isto e, a região sense e região antisense podem estar ligadas de forma covalente através de uma molécula ligante. A molécula ligante pode ser um ligante poiinucieotidico ou não nucieotidico. 0 ARNsi pode também conter alterações, substituições ou modificações de uma ou mais bases de ribonucleótidos. Por exemplo, o presente ARNsi pode ser alterado, substituído ou modificado para conter uma ou mais, preferentemente 0, 1, 2 ou 3, bases de desoxirribonucleótidos. Preferentemente, o ARNsi nâo contém quaisquer bases de desoxirribonucleótidos. O ARNsi pode compreender ARN parcialmente purificado, ARN substancialmente puro, ARN sintético, ou ARN produzido de forma recombinante, bem como ARN alterado que difere do ARN de ocorrência natural através da adição, eliminação, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleótidos. Tais alterações podem incluir a adição de material não nucleotidico, tal como à(s) extremidade (s) do ARNsi ou a um ou mais nucleótidos internos do ARNsi; modificações que tornam o ARNsi resistente à digestão por nucleases (por exemplo, a. utilização de ribonucleót idos 2'-substituídos ou modificações da estrutura principal de açúcar-fosfato) ; ou a substituição de um ou mais, preferentemente 0, 1, 2 ou 3, nucleótidos no ARNsi com de s ο X i rrib o nu c1eótidos. A degradação pode ser atrasada ou evitada através de uma ampla variedade de modificações químicas que incluem arterações aas nucleobases, açúcares e da estrutura principal de éster ae fosfato dos ARNsi. Todos estes ARNsi quimicamente moditacados são ainda capazes de induzir silenciamento génico mediado por ARNsi contanto que as modificações estivessem ausentes em regiões especificas do ARNsi e incluídas até um ponto limitado. Geralmente, as modificações da estrutura principal causam uma pequena perda. da afinidade de ligação, mas oferecem resistência a nucleases. ARNsi modificados com rosforotioato (PS) ou boranofosfato (BS) têm resistência a nucleases substancial. O silenciamento através de duplexes de ARNsi é também compatível com alguns tipos de modificações de açúcar 2 ' : 2'-H, 2'-O-metiio, 2'-O-metoxietilo, 2’-fluoro (x i) , ácido nucieico bloqueado (LNA) e ácido nucleico de ponte de etileno (ENA) . Modificações químicas adequadas são bem conhecidas para os peritos na especialidade. 0 ARNsi utilizado na presente invenção é uma molécula de cadeia dupla compreendendo uma cadeia sense e uma cadeia antisense, em que a cadeia sense compreende ou consiste numa sequência de ribonucleótidos correspondente a uma sequência alvo de LhTi ou ASu.12, e em que a sequência antisense compreende uma sequência de ribonucleótidos que é complementar com a d^ta cadeia sense, em que as ditas cadeia sense e cadeia antisense hibridam entre si para formar a dira molécula de cadeia dupla, e em que a dita molécula de cadeia dupla, quando introduzida numa célula expressando os genes LATI e ASCT2, inibe a expressão dos ditos genes. Conforme indicado mais abaixo, a dita sequência alvo de LATI compreende referentemente pelo menos cerca de 10, mais preferentemente 15 a 21, e ainda mais preferentemente cerca de 19 a 21 nucleótidos contíguos selecionados a partir: do grupo consistindo em desde a SEQ id N.° 4, 6, 10, 13, 22, 34, 58, 61, 81, 83, 87, e 95 a 104. Conforme indicado mais abaixo, a dita sequência alvo de ASCT2 compreende referent emente pelo menos cerca de 10, mais preferentemente 15 a 21, e ainda mais preferentemente cerca de 19 a 21 nucleótidos contíguos selecionados a partir do grupo consistindo em desde a SEQ ID N.° 209, 216, 225, 226, 228, 235-238, 245, 260, 264, 267, 271, 272, 278, 279, 281 a 297.

Numa forma de realização da presente invenção, as ditas cadeias sense e antisense da molécula de ARNsi estão ligadas de forma covalente através de uma molécula ligante. A dita molécula ligante pode ser um ligante polinucleotídico ou ligante não nucleotídico. Preferentemente o ligante é uma sequência em ansa. A sequência em ansa tem preferentemente 3 a 23 nucleótidos de comprimento. São descritas sequências de ansa adequadas em http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_50 6.html e (Jacque et al., 2002). Sequências de ansa preferidas incluem: AUG: (Sui et al., 2002). CCC, CCACC ou CCACACC: (Paul et al., 2002). UUCG: (Lee et al., 2002). CTCGAG ou AAGCUU : (Biology, 2003) . UUCAAGAGA: (Yu et al., 2 002). A sequência de ansa pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC, e UUCAAGAGA. Preferentemente a sequência de ansa é UUCAAGAGA ("ttcaagaga" em ADN). O ARNsi utilizado na presente invenção pode ser obtido utilizando uma série de técnicas conhecidas para os peritos na especialidade. Por exemplo, o ARNsi pode ser sintetizado quimicamente ou produzido de forma recombinante utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como o sistema in vitro de Drosophila descrito no pedido U.S. publicado 2002/0086356, a totalidade da divulgação do qual é incorporada no presente documento como referência. O ARNsi pode ser sintetizado q u i m i c a me n t e u t i 1 i z a n d o f o s f o r am idit a s de rib o n u c 1 e ó s .1. do adequadamente protegidas e um sintetizador de ADN/ARN convencional. O ARNsi pode ser sintetizado como duas moléculas de ARN separadas complementares, ou como uma única molécula de ARN c o m du a s re g iõ e s c omp1ementares. O s forne ced o re s comerciais de moléculas de ARN sintéticas ou reagentes de síntese incluem Biospring (Frankfurt, Alemanha), Proligo (Hamburgo, Alemanha), Dharmacon Research (Lafayette, Colo., EUA), Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA EUA) , Glen Research (Sterling, Va., EUA), ChemGenes (Ashland, Mass., EUA) e Sigma-Aldrich (St. Louis, MO EUA). O ARNsi pode também ser expresso a partir de vetores de ADN recombinante circular ou linear utilizando qualquer promotor adequado. Promotores adequados para expressar ARNsi a partir de ura vetor incluem, por exemplo, as sequências de promotor de ARN pol IIIU6 ou Hl e o promotor de citomegaloví rus. A seleção de outros promotores adequados encontra-se dentro do âmbito da técnica. O vetor pode também compreender promotores induzíveis ou reguláveis para expressão do ARNsi num tecido particular ou num ambiente intracelular particular. 0 ARNsi expresso a partir de um vetor pode ou ser isolado a partir de sistemas de expressão de células em cultura através de técnicas padrão, ou pode ser expresso intracelularmente. 0 vetor pode ser utilizado para administrar o ARNsi a células in vivo, por exemplo, através de expressão intracelular do ARNsi m vivo. 0 ARNsi pode ser expresso a partir de um vetor ou como duas moieculas separadas complementares, ou como uma única molécula de ARN com duas regiões complementares. A seleção de vetores adequados para expressar o ARNsi, métodos para inserção de sequências de ácidos nucleicos para expressar o ARNsi no vetor, e métodos de administração do vetor às células de interesse são bem conhecidos para os peritos na especialidade. 0 ARNsi pode também ser expresso a partir de um vetor intracelularmente in vivo. Conforme utilizado no presente documento, o termo "vetor" significa qualquer técnica à base de ácidos nucleicos e/ou vírus utilizada para administrar um acido nucleico desejado. Pode ser utlizado qualquer vetor capaz de aceitar as sequências codificantes para a(s) molécula (s) de ARNsi a ser expressas, incluindo plasmídeos, cosmídeos, ADN nu, opcionalmente condensado com um agente de condensação, e vetores virais. Vetores virais adequados incluem vetores derivados a partir de adenovirus (AV); vírus adeno-associados (AAV); retrovirus (por exemplo, lentivírus (LV), rabdovírus, vírus da leucemia de ratinho, herpesvirus, e semelhantes. 0 tropismo de vetores virais pode ser modificado através de pseudotipagem dos vetores com proteínas de envelope ou outros antigénios de superfície a partir de outros vírus, ou através de substituição de diferentes proteínas de cápsitíe virai, conforme adequado. Quando o vetor é um vetor lentiviral é preferentemente pesudotipado com proteínas de superfície a partir de vírus da estorcatite vesicular, vírus da raiva, virus do Sbola ou vírus Mokola.

Os vetores são produzidos por exemplo através de clonagem de uma sequência alvo de LATI ou ASCT2 num vetor de expressão de tal forma que sequências reguladoras ligadas operativamente flanqueiam a sequência de LATI ou ASCT2 de uma forma que permite a expressão (através de transcrição da molécula de ADN) de ambas cadeias (Lee et al., 2002}. E transcrita uma molécula de ARM que é antisense para o ARNrn de LATI ou ASCT2 através de um primeiro promotor (por exemplo, uma sequência promotora a 3' do ADN clonado) e uma molécula de ARN que é a cadeia sense para o ARNrn de LATI ou ASCT2 é transcrita, por parte de um segundo promotor (por exemplo, uma sequência promotora a 5' do ADN clonado). As cadeias sense e antisense hibridam in vivo para gerar construções de ARNsi para silenciamento do gene LATI ou gene ASCT2 . Alternativamente, são utilizados dois vetores para criar as cadeias sense e antisense de uma. construção de ARNsi. LATI ou ASCT2 clonados podem codificar uma construção tendo estrutura secundária, por exemplo, grampo de cabelos, em que um. único transcrito tem as sequências tanto sense como antisense complementar a partir do gene alvo. Um tal transcrito codificando uma construção tendo estrutura secundária, compreenderá preferentemente uma sequência de ribonucleotides de cadeia simples (sequência de ansa) ligando a dita cadeia. sense e a dita cadeia antisense. O ARNsi é preferentemente isolado. Conforme utilizado no presente documento, "isolado” significa sintético, ou alterado ou removido a partir do estado natural através de intervenção humana. Por exemplo, um ARNsi naturalmente presente num animal vivo não está "isolado", mas um ARNsi sintético, ou um ARNsi parcialmente ou completamente separado a partir dos materiais coexistentes do seu estado natural está "isolado". Um ARNsi isolado pode existir em forma substancialmente pura, ou pode existir num ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula à qual o ARNsi foi administrado. Por meio de exemplo, ARNsi que são produzidos dentro de uma célula através de processos naturais, mas que são produzidos a partir de uma. molécula precursora "isolada", são eles próprios moléculas "isoladas". Consequentemente, um ARNds isolado pode ser introduzido numa célula alvo, onde é processado através da proteína Dicer (ou o seu equivalente) em ARNsi isolado.

Conforme utilizado no presente documento, "inibir" significa que a atividade do produto de expressão génica de LATI ou ASCT2 ou nível do produto de expressão génica de LATI ou ASCT2 é reduzida por debaixo da observada na ausência de molécula de ARNsi da invenção. A inibição com uma molécula de ARNsi é preferentemente significativa por debaixo do nível observado na presença de uma molécula inativa ou atenuada que é incapaz de mediar uma resposta de ARNi. A inibição da expressão génica com a molécula de ARNsi é preferentemente significativamente maior na presença da molécula de ARNsi do que na sua ausência. Preferentemente, o ARNsi inibe o nível de expressão génica de LATI ou ASCT2 por pelo menos 10%, mais preferentemente pelo menos 50% e ainda mais preferentemente pelo menos 75%.

Preferentemente a molécula de ARNsi inibe a expressão génica de LATI ou ASCT2 de tal forma a que o crescimento da célula contendo o gene LATI ou ASCT2 seja inibido. Ao inibir o crescimento celular é entendido que a célula tratada prolifera a uma taxa menor ou tem viabilidade diminuída do que uma célula não tratada. O crescimento celular é medido através de ensaios de prolifer a ç ão c o nhe c i do s n a t é c n ica.

Conforme utilizado no presente documento, um "ácido nucleico isolado" é um ácido nucleico removido a partir do seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ocorrendo naturalmente) e consequentemente, alterado sinteticamente a partir do seu estado natural. Na presente invenção, ácido nucleico isolado inclui ADN, ARN e derivados dos mesmos. Quando o ácido nucleico isolado é ARN ou derivados do mesmo, a base "t" deve ser substituída com "u" nas sequências de nucieótidos.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "complementar" refere~se a emparelharoento de bases de Watson-Crick ou Hoogsten entre unidades nucleotídicas de um polinucleótido, e o termo "ligar" significa a interação física ou química entre dois polipéptidos ou compostos ou polipéptidos ou compostos associados ou combinações dos mesmos.

Conforme utilizado no presente documento, a frase "região de sequência altamente conservada" significa que uma sequência de nucleótidos de uma ou mais regiões num gene alvo não varia significativamente de uma geração a outra ou a partir de um sistema biológico a outro.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "complementaridade" ou "complementar" significa que um ácido nucleico pode formar ligação(ões) hidrogénio com outra sequência de ácidos nucleicos ou através de Watson-Crick tradicional ou de outros tipos de interação não tradicionais. Com referência à presente invenção, a energia livre de ligação para uma molécula de ARNsi corn a sua sequência complementar é suficiente para permitir que a função relevante do ácido nucleico prossiga, por exemplo, atividade de ARNi . Por exemplo, o grau de complementaridade entre as cadeias sense e antisense da molécula de ARNsi pode ser o mesmo ou diferente do grau de complementaridade entre a cadeia sense do ARNsi e a sequência de ARN alvo.

Uma percentagem de complementaridade indica a percentagem de resíduos contíguos numa molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogénio (por exemplo, ernparelhamento debases de Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 sendo complementar a 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 100%) . "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos realização ligações de hidrogénio com o mesmo número de resíduos contíguos numa segunda sequência de ácidos nucleicos. Preferentemente o termo "complementaridade" ou "complementar" significa que pelo menos 90%, mas preferentemente peio menos 95% e ainda mais preferentemente 100% dos resíduos num primeiro sense de ácidos nucleicos podem formar ligações de hidrogénio com uma segunda sequência de ácidos nucleicos.

As sequências de ácidos nucleicos complementares hibridam sob condições adequadas para formar duplexes estáveis contendo poucos (ura ou dois) ou nenhum emparelhamento erróneo. Além disso, a cadeia sense e cadeia antisense do ARNsi podem former um nucleótido ou estrutura, de ansa em grampo de cabelo de cadeia dupla através da hibridação. Numa forma de realização preferida, tais dúplexes não contêm mais de 1 emparelhamento erróneo por cada 10 emparelhamentos. Numa forma de realizarão especialmente preferida, as cadeias sense e antisense do duplex são totalmente complementares, isto é, os dúplexes não contêm emparelhamentos erróneos.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "célula" e derxnido utixizanao o seu sentido biológico habitual. A célula pode estar presente num organismo, por exemplo, mamíferos tais como seres humanos, vacas, ovelhas, símios, macacos, sumos, caes, e gatos * A célula pode ser eucariótica (por exemplo, uma ctulula d.e mamireroj . A célula pode ser de origem de linha germinal ou somática, totipotente ou muiLipotente, ce divisão ou não de divisão. A célula pode também ser derivada a partir de ou pode compreender uma garneta ou embrião, uma célula estaminal, ou uma célula totalmente diferenciada. Preferentemente a célula é uma célula cancerígena da bexiga, cérebro, cólon, cabeça e pescoço, rim, fígado, pulmão, nódulos linfáticos, glândulas mamárias, músculo, ovário, pâncreas, pele ou estômago.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "ARN" significa uma molécula compreendendo pelo menos um resíduo de ribonucleótido. Por "ribonucleótido" é entendido um nucleótido com um grupo hidroxilo na posição 2' de uma fração beta-D-ribo-furanose. O termo inclui ARN de cadeia dupla, ARN de cadeia simples, ARN isolado tal como ARN parcialmente purificado, ARN essencialmente puro, ARN sintético, ARN produzido de forma recombinante, bem como ARN alterado que dlfere do ARN de ocorrência natural através da adição, eliminação, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleótidos. Tais alterações podem incluir a adição de material não nucleotídico, tal como no (s) terminal(is) do ARNsi ou internamente, por exemplo era um ou ma is nucleótidos do ARN. Os nucleótidos nas moléculas de ARN da presente invenção podem também compreender nucleótidos não padrão, tais como nucleótidos de ocorrência não natural ou nucleótidos ou desoxinucleótidos sintetizados quimicamente. Estes ARNs alterados podem ser referidos com análogos de ARN de ocorrência natural. Preferentemente o termo "ARN" consiste somente em resíduos de ribonucleótido.

Conforme utilizado no ’presente documento, o termo "organismo" refere-se a qualquer entidade viva composta por pelo menos uma célula. Um organismo vivo pode ser tão simples quanto, por exemplo, uma única célula eucariótica ou tão complexo quanto um mamífero, incluindo um ser humano.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "indivíduo" significa um organismo, que é um dador ou recetor de células explantadas ou as próprias células. "Indivíduo" também se refere a um organismo ao qual as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser administradas. 0 indivíduo é preferentemente um mamífero, por exemplo, um ser humano, primata não humano, ratinho, rato, cão, gato, cavalo, ou vaca. Mais preferentemente o indivíduo é um ser humano.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "amostra biológica" refere-se a qualquer amostra contendo polinucieótidos. A amostra pode ser uma amostra de tecido ou celular, ou um fluido corporal contendo polinucieótidos (por exemplo, sangue, muco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebrospinal, saliva, fluido amniotico, sangue de cordão amniótico, urina, fluido vaginal e sémen). A amostra pode ser um homogenado, lisado, extrato, cultura celular ou cultura de tecido preparada a partir de um organismo inteiro ou um subconjunto das suas células, tecidos ou partes constituintes, ou uma fração ou porção dos mesmos. Por ultimo, a amostra pode ser um meio, tal como um caldo ae nutrientes ou gel no qual um organismo, ou ceiuias de um organismo, foram propagadas, em que a amostra contém polinucieótidos. A invenção refere-se a métodos de inibir a expressão génica de LATI e/ou ASCT2 que causa a inibição do crescimento de células cancerígenas. Em particular, a invenção proporciona um método para inibir o crescimento de uma. população de células cancerígenas compreendendo aplicar o ARNsi de LATI e/ou ASC.T2 à dita população de células cancerígenas. 0 crescimento de células cancerígenas é inibido através do contacto de uma célula com uma composição de um ARNsi de LATI e/ou ASCT2. LATI e ASCT2 são proteínas transportadoras de aminoácidos que são sobreexpressas em tumores tais como cancros da bexiga, cérebro, cólon, cabeça e pescoço, rim, fígado, pulmão, nódulos linfáticos, glândulas mamárias, músculo, ovário, Pâncreas, pele e estômago. 0 crescimento das células expressando LATI ou ASCT2 pode ser inibido por um ARNsi de LATI ou ASCT2 . A célula pode ser adicionalmente colocada em contacto com um. agente de potenciamento da transfeçáo para potenciar a administração do ARNsi ou vetor codificando ARNsi à célula. Dependendo do método específico da presente invenção, a célula pode ser proporcionada in vitro, in vivo ου. ex vivo.

Foi extraída informação de sequência relativa ao gene LATI humano (acesso GenBanK NM.._0Uo486) a partir da base de dados de nucieótidos NCBI Entrez. Foram identificados até 104 segmentos de ΆκΝιη. For extraiaa inrormação de sequência relativa ao gene ASCT2 humano (acesso GenBank. NM_001145144) a partir da base de dados de nucleótidos NCBI Entrez. Foram identificados até 89 segmentos o.e ARhm. São conhecidos métodos para desenhar ARN de cadeia dupla tendo a capacidaoe de inibir a expressão génica numa célula alvo. Veja-se por exemplo, o Documento de Patente Os N.° 6.0O6, 5o9, e Eloashir et ai,, 2001, incorporados no presente documento como referência na sua totalidade. A s^eção de sit.:.os alvo oe ARNsi pode ser realizada conforme segue i. miCiaiidO corn o coaao de irucio ATG do transcrito, rastrear a jusarme para sequências dinucleotídicas de AA. Registar a ocorrência de cada AA e os 19 nucleótidos adjacentes a 3' como sítios alvo de ARNsi potenciais. Tuschal et aí. não recomendam desenhar ARNsi para as regiões nao traduzidas (UTRs) a 5’ e 3' e regiões perto do codão de início (dentro de 75 bases) já que estas podem ser ricas em sítios de ligação a proteínas reguladoras. As proteínas de ligação a UTR e/ou complexos de iniciação da tradução podem interferir com. a ligação do complexo endonuclease de ARNs i, 2. Comparar os sítios alvo potenciais coin a base de dados genómica adequada, (ser humano, ratinho, rato, etc.) e eliminar da. consideração quaisquer: sequências alvo com homologia significativa a com outras sequências codificantes. É sugerido utilizar BLAST, que pode ser encontrado no servidor NCBI em. : www. ncbi . nlm. nih. gov,/BLAST/ 3. Selecionar sequências alvo qualificantes (isto é, sequências tendo mais de 55% de teor de GC) para a síntese.

Num aspeto da invenção, o comprimento do ácido nucieico sense é pelo menos de 10 nucieótidos e pode ser tão lonao quanto o transcrito de LATI de ocorrência natural, Preferentemente, o ácido nucieico sense tem menos de 75, 50, ou 25 nucieótidos de comprimento.

É adicionalmente preferido que o ácido nucieico sense compreenda peio menos 19 nucieótidos. Mais preferent.emente, o ácido nucieico sense tem 19-25 nucieótidos de comprimento. Exemplos de ácidos nucleicos sense de ARNsi de LATI da oresente invenção que inibem a expressão de LATI em células de mamíferos incluem oligonucleótidos compreendendo qualquer uma das seguintes sequências alvo do gene LATI: nucieótidos 145-165 (SEQ ID N° 4), 217-237 (SEQ ID N° 6), 466-486 (SEQ ID N° 10), 628-648 (SEQ ID N° 13), 796-816 (SEQ IDN° 22), 1243-1263 (SEQ ID N° 34), 525-545 (SEQ ID N° 58), 624-644 (SEQ ID N° 61), 1245-1265 (SEQ ID N° 81), 13161336 (SEQ ID N 0 83), 1410-1430 (SEQ ID N° 87) , 147-165 (SEQ ID N 0 95) , 219-237 (SEQ ID N° 96) , 468-486 (SEQ ID N° 97), 630648 (SEQ ID N 0 98), 798-816 (SEQ ID N0 99), 1247-1263 (SEQ ID N 0 100), 527-545 (SEQ ID N° 101), 1247-1265 (SEQ ID N° 102), 1318-1336 (SEQ ID N° 103), 1412-1430 (SEQ ID N° 104) .

Foram geradas cento e quatro sequências, que representara a sequência para uma cadeia da dupla cadeia é ARN, para LAT-1. Estas incluíram as seguintes sequências nucleotídicas:

bEQ iD M l AAGo oGC oc GC oc TAocGGo o SEQ ID N° 2 AAGGAAGAGGCGCGGGAGAAG SEQ ID N° 3 AAGAGGCGCGGGAGAAGATGC SEQ ID N0 4 AAGATGCTGGCCGCCAAGAGC SEQ ID N° 5 AAGAGCGCGGACGGCTCGGCG SEQ ID N° 6 AACATCACGCTGCTCAACGGC dEq _lD iSF ^ / AAGeAGGcAGGc r. CGcGGGeG SEQ ID N0 8 AAATCGGGCGGCGACTACGCC SEQ ID N0 9 AATCGGGCGGCGACTACGCCT SEQ ID N° 10 AAGCTCTGGATCGAGCTGCTC SEQ ID N° 11 AAGCCGCTCTTCCCCACCTGC SEQ ID N0 12 AAGCTCGTGGCCTGCCTCTGC SEQ ID N0 13 AACTGCTACAGCGTGAAGGCC SEQ ID N° 14 AAGGCCGCCACCCGGGTCCAG SEQ ID N° 15 AAGCTCCTGGCCCTGGCCCTG SEQ ID ND 16 AAGGGTGATGTGTCCAATCTA SEQ ID N0 17 AATCTAGATCCCAACTTCTCA SEQ ID N6 18 AACTTCTCATTTGAAGGCACC

SEQ ID N° 19 AAGGCACCAAACTGGATGTGG SEQ ID 2 0 AAACTGGATGTGGGGAACATT SEQ ID N° 21 AACTGGATGTGGGGAACATTG SEQ ID N° 22 AACATTGTGCTGGCATTATAC SEQ ID N° 23 AATTACTTGAATTTCGTCACA SEQ ID N° 24 AATTTCGTCACAGAGGAAATG SEQ ID N° 25 AAAI G ATC AAC C C C T AC AG AA SEQ ID Nc' 26 A AT G ATC AACC C C T AC AG A A A SEQ ID 2 7 AACCCCTACAGAAACCTGCCC SEQ ID N° 28 AAACCTGCCCCTGGCCATCAT SEQ ID N° 2 9 AACCTGCCCCTGGCCATCATC SEQ ID N° 30 AACCTGGCCTACTTCACCACC SEQ ID N° 31 AACTATCACCTGGGCGTCATG SEQ ID M° 32 A AT G G G T C C C T G T T C A CAT C C SEQ ID N° 33 AAGGCCACCTGCCCTCCATCC SEQ ID N° 3 4 AAGGACATCTTCTCCGTCATC SEQ ID N° 35 AACTTCTTCAGCTTCTTCAAC SEQ ID N° 36 AACTGGCTCTGCGTGGCCCTG SEQ ID N° 37 AAAGCCTGAGCTTGAGCGGCC SEQ ID N° 38 AAGCCTGAGCTTGAGCGGCCC SEQ ID N° 39 AAGGTGAACCTGGCCCTGCCT SEQ ID N° 40 AACCTGGCCCTGCCTGTGTTC SEQ ID N° 41 AAGACACCCGTGGAGTGTGGC SEQ ID !9° 42 AAAAACAAGCCCAAGTGGCTC SEQ ID N° 43 AAACAAGCCCAAGTGGCTCCT SEQ ID N° 4 4 AACAAGCCCAAGTGGCTCCTC SEQ ID !4° 45 AAGCCCAAGTGGCTCCTCCAG SEQ ID M° 46 AAGTGGCTCCTCCAGGGCATC SEQ ID N° 47 AAGCTCATGCAGGTGGTCCCC SEQ ID N ° 4 8 GGCGCCGGCGGCCGAG GAG A A. SEQ ID N° 49 CCGGCGGCCGAGGAGAAGGAA SEQ ID N° 50 GGAGAAGATGCTGGCCGCCAA SEQ ID N° 51 GAAGGAAGAGGCGCGGGAGAA SEQ ID 14° 52 GGAGAAGATGCTGGCCGCCAA SEQ ID W° 53 GGGCGTGACCCTGCAGCGGAA SEQ ID W° 54 GACGCCCACGGGCGTGCTCAA SEQ ID N° 55 GCTCGGCACCACCATCTCC A A. SEQ ID 14° 56 CTCGGCACCACCATCTCC A A A SEQ ID 14° 5 7 CTCGCTGCCCGCCTTCCTCAA SEQ ID 14° 58 CTTCGCCACCTACCTGCTCAA SEQ ID Í40 59 GGTGCCCGAGGAGGCAGCCAA SEQ ID 14° 60 GCTGCTGCTCACGGCCGTGAA SEQ ID 14° 61 CGTGAACTGCTACAGCGTGAA SEQ ID N° 62 GGATGCCTTTGCCGCCGCCAA SEQ ID N° 63 GGGCTTCGTCCAGATCGGGAA

SEQ ID N° 64 CGGGAAGGGTGATGTGTCCAA

SEQ ID N° 65 TGTGTCCAATCTAGATCCCAA

SEQ ID N° 66 GATCCCAACTTCTCATTTGAA

SEQ ID N° 67 CTTCTCATTTGAAGGCACCAA

SEQ ID N ° 6 8 T T C T CA TXT GAAG G CAC CAAA

SEQ ID N° 69 ACCAAACTGGATGTGGGGAA

SEQ ID If 7 0 C T T T G C C TAT G GAG GAT G GAA

SEQ ID N° 71 TGGAGGATGGAATTACTTGAA

SEQ ID N° 72 TGAATTTCGTCACAGAGGAAA

SEQ ID N° 73 CGTCACAGAGGAAATGATCAA

SEQ ID N° 74 AAATGATCAACCCCTACAGAA

SEQ ID N° 75 AATGATCAACCCCTAGAGAAA

SEQ ID N° 76 GCTGGTGTACGTGCTGACCAA

SEQ ID N° 77 CGTGGCCGTGGACTTCGGGAA

SEQ ID N° 78 GTCCTGCTTCGGCTCCGTCAA

SEQ ID N° 79 TTCTTCGTGGGGTCCCGGGAA

SEQ ID IT 80 GCTGCTCTACGCCTTCTCCAA

SEQ ID N° 81 GGACATCTTCTCCGTCATCAA

SEQ ID N° 82 CAACTTCTTCAGCTTCTTCAA

SEQ ID M0 83 TGATCTGGCTGCGCCACAGAA

SEQ ID N° 84 GATCTGGCTGCGCCACAGAAA

SEQ ID N° 85 TGAGCTTGAGCGGCCCATCAA

SEQ ID N° 86 TGAGCGGCCCATCAAGGTGAA

SEQ ID N° 87 GATCGCCGTCTCCTTCTGGAA

SEQ ID N° 88 CTTCTTCGGGGTCTGGTGGAA

SEQ ID if 89 TTCTTCGGGGTCTGGTGGAAA

SEQ ID N° 90 TCTTCGGGGTCTGGTGGAAAA

SEQ ID N° 91 CTTCGGGGTCTGGTGGAAAAA

SEQ ID N° 92 CGGGGTCTGGTGGAAAAACAA

SEQ ID 1ST-' 93 C T G G T G G AAA AAC AAG C C CAA

SEQ ID N° 9 4 CACGACCGTCCTGTGTCAGAA

SEQ ID N° 95 AAGATGCTGGCCGCCAAGAGC

SEQ ID N° 96 AACATCACGCTGCTCAACGGC

SEQ ID IIo 9 7 AAGCTCTGGATCGAGCTGCTC

SEQ ID N° 98 AACTGCTACAGCGTGAAGGCC

SEQ ID N° 9 9 AACATTGTGCTGGCATTATAC

SEQ ID N° 100 AAGGACATCTTCTCCGTCATC

SEQ ID N° 101 CTTCGCCACCTACCTGCTCAA

SEQ ID IIo 102 GGACATCTTCTCCGTCATCAA

SEQ ID N° 103 TGATCTGGCTGCGCCACAGAA

SEQ ID N° 104 GATCGCCGTCTCCTTCTGGAA A especificidade do gene de ASCT2 foi confirmada pesquisando a base de dados NCBI BlastN, Os ARNsi foram sintetizados qu i m i c ame n. t e. A totalidade dos quarenta e dois duplexes de ARNsi purificados foram complexados com lipofectarnina e adicionados às celuias durante 12 h em meio isento de soro. Posteriormente, as células foram, cultivadas durante 72-96 h em meio suplementado com soro, que foi substituído por meio isento de soro 24 horas antes das experiências. Um duplex de ARNsi negativo desordenado foi utilizado como controlo. 0 LATI-ARNsi é direcionado a uma sequência, génica de LATI de alvo único. Alternativamente, o ARNsi é direcionado a sequências de genes LATI de alvo múltiplo. Por exemplo, a composição contém LATI-ARNsi dirigido a duas, três, quatro cinco ou mais sequências alvo de LATI. Por sequência alvo de LAtl é entendida uma sequência de nucleótidos que é idêntica a uma porção do gene LATI. A sequência alvo pode incluir a região não traduzida (OT) 5', a grelna de leitura aberta (ORE’1) ou a região não traduzida a 3' do aene de LATI humano. AiterRativamente, o ARNsi é uma sequência de ácido nucleico complementar a um modulador a montante ou a jusante da expressão do gene LATI. Exemplos de moduladores do montante e a jusante incluem, um fator de transcrição que liga ao promotor do gene η.ΑΤι, uma quinase ou fostatase que interatua com o polipéptido LATI, um potenciador ou promotor de LATI.

Li-iTr-ARNsi que hi.ondam com ARNm alvo diminuem ou inibem a produção do produto polipeptídico de LATI codificado pelo gene fATi através de associação com o transcrito de ARNm normalmente Je Cd.dej.ci simpies, interferindo deste modo com a tradução e, d-ssim, a expressão da proteína. Sequências de ácido nucleico exemplares para a produção de LATI-ARNsi incluem as sequências de nucleótidos 145-165 (SEQ ID N° 4), 217-237 (SEQ ID N° 6), 466-486 (SEQ ID N° 10), 628-648 (SEQ ID N° 13), 796-816 (SEQ ID N° 22) , 1243-1263 (SEQ ID N° 34), 525-545 (SEQ ID N° 58), 624-644 (SEQ ID N° 61), 1245-1265 (SEQ ID N° 81), 1316-1336 (SEQ ID N° 83), 1410-1430 (SEQ ID N° 87), 147-165 - '°Eg iD No 95) 219-237 (SEQ ID N° 96), 468-486 ÍSEQ ID N° 97^

' " 630-648 (SEQ ID N° 98), 798-816 (SEQ ID N° 99), 1247-1263 (¢-^ ' ID N° 100) , 527-545 (SEQ ID N° 101), 1247-1265 (SEQ ID N° 1 n?x w)«- 1318-1336

(SEQ ID N° 103), 1412-1430 (SEQ ID N 0 104) OQ 1 iQ a secruência alvo. Numa forma de realização adicional, cie mod 4 a° a melhorar a atividade de mibiçao do ARNsi, pode s~ "r adicionado nucleótido "u" à extremidade 3’ da cadej a , Q n 11 s e n s e d a sequência alvo. São adicionados preferente me nt-o ^ ·.

Peio menos 2, mais preferentemente 2 a 10, e ainda mais - '-i-erentemente de 2 a 5 u. Os u adicionados formam a cadeia unir-, , ~α ua extremidade 3’ da cadeia antisense do ARNsi. O LATI-ARNsi pode ser diretamente introduzido r-o «o de uma forma que é capaz de ligar aos transcritos de ARNm. Alternativamente, pode ser introduzido nas cédulas um vetor codificando o LATI-ARNsi.

Uma sequência de ansa consistindo em uma sequência de nucleótidos arbitrária pode estar localizada entre a sequência sense e a antisense, Consequentemente, a presente invenção também proporciona ARNsi tendo a fórmula geral 5’-[A]-[B]-[A1j-3', em que [A] é uma sequência de ribonucleótidos correspondendo a uma sequência alvo do gene LATI. Preferentemente [A] é uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nos nucleótidos 145-165 (SEQ ID N° 4), 217-237 (SEQ ID N° 6), 466-486 (SEQ ID N° 10), 628-648 (SEQ ID N° 13) , 796-816 (SEQ ID N° 22) , 1243-1263 (SEQ ID N° 34) , 525-545 (SEQ ID N° 58), 624-644 (SEQ ID N° 61), 1245-1265 (SEQ ID N° 81), 1316-1336 (SEQ ID N° 83), 1410-1430 (SEQ ID N° 87), 147-165 (SEQ ID N° 95), 219-237 (SEQ ID N° 96), 468-486 (SEQ ID N° 97), 630-648 (SEQ ID N° 98), 798-816 (SEQ ID N° 99), 1247-1263 (SEQ ID N° 100), 527-545 (SEQ ID N° 101), 1247-1265 (SEQ ID B° 102), 1318-1336 (SEQ ID N° 103), 1412-1430 (SEQ ID N° 104), [B] é uma sequência de ribonucleótidos consistindo em 3 to 23 nucleótidos; e [A'] é uma sequência de ribonucleótidos consistindo na sequência complementar de [A]. A regxao [Aj hibridiza com [A.’ ] , e posteriormente é formada uma ansa consistindo na região [3] . A sequência em ansa pode ser preferentemente de 3 a 23 nucleótidos de comprimento. São descritas sequências de ansa adequadas em http://www.ambion.com/techlib/tb/tb__506.html. Além disso, sequência de ansa consistindo em 23 nucleótidos também proporciona ARNsi ativo (Jacque et ai., 2002). Sequências de ansa preferidas incluem: AUG: (Sui et al., 2002). CCC, CCACC ou CCACACC: (Paul et al., 2002). IJUCG: (Lee et ai., 2 0 02) . CTCGAG ou AAGCUU : (Biology, 2003) , UUCAAGAGA: (Yu et ai., 2002). A sequência de ansa pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC, e UUCAAGAGA. Preferentemente a sequência de ansa. é UUCAAGAGA ("11c a agaga" em ADN).

Num aspeto adicional da invenção, o comprimento do ácido nucleico sense é pelo menos de 10 nucleótidos e pode ser tão longo quanto o transcrito de ASCT2 de ocorrência natural· Preferentemente, o ácido nucleico sense tem menos de 75, 50, ou 25 nucleótidos de comprimento. É adicionalmente preferido que o ácido nucleico sense compreenda pelo menos 19 nucleótidos. Mais preferentemente, o ácido nucleico sense tem 19-25 nucleótidos de comprimento. Exemplos de ácidos nucleicos sense de ARNsi de ASCT2 da presente invenção que inibem a expressão de ASCT2 em células de mamíferos incluem oligonucleotides compreendendo qualquer uma das seguintes sequências alvo do gene ASCT2: nucleótidos 300-320 (SEQ ID N° 209), 452-472 (SEQ ID N0 216) , 773-793 (SEQ ID N° 225), 776-796 (SEQ ID M° 226), 830-850 (SEQ ID N° 228), 1122-1142 (SEQ ID N° 235), 1123-1143 (SEQ ID N° 236), 1124-1144 (SEQ ID N° 237), 1150-1170 (SEQ ID N° 238), 769-789 (SEQ ID N° 260), 994 1014 (SEQ ID N° 264), 1066-1086 (SEQ ID N° 267), 1131-1151 (SEQ ID N° 271), 1154-1174 (SEQ ID N° 272), 1264-1284 (SEQ ID N° 278), 1268-1288 (SEQ ID N° 279) , 302-320 (SEQ ID N° 281) , 454-472 (SEQ ID K° 2 82), 775-793 (SEQ ID N° 283), 778-796 (SEQ ID N° 284), 832-850 (SEQ ID N° 285), 1124-1142 (SEQ ID N° 286), 1125-1143 (SEQ ID N° 287), 1126-1144 (SEQ ID N° 288), 1152-1170 (SEQ ID N° 289), 771-789 (SEQ ID N° 291), 996-1014 (SEQ ID ISI° 292), 1068-1086 (SEQ ID N° 293), 1133-1151 (SEQ ID N° 294), 1156-1174 (SEQ ID N0 295), 1266-1284 (SEQ ID N° 296), 1270-1288 (SEQ ID N° 2 97) .

Foram geradas oitenta e nove sequências, que representam a sequência para uma cadeia da dupla cadeia é ARK, para ASCT2 . Estas incluíram as seguintes sequências nucleotídicas:

SEQ ID N0 209 AAGAGAGGAATATCACCGGAA SEQ ID N° 210 AATATCACCGGAACCAGGGTG SEQ ID N° 211 AACCAGGGTGAAGGTGCCCGT SEQ ID N° 212 AAGGTGCCCGTGGGGCAGGAG SEQ ID N° 213 AACATCCTGGGCTTGGTAGTG SEQ ID N° 214 AAGCTGGGGCCTGAAGGGGAG SEQ II) N° 215 AAGGGGAGCTGCTTATCCGCT SEQ ID N0 216 AACTCCTTCAATGAGGCCACC SEQ ID N ° 217 AATGAGGCCACCATGGTTCTG SEQ ID N° 218 AAGATCGTGGAGATGGAGGAT SEQ ID N0 219 AAGTACATTCTGTGCTGCCTG SEQ ID N° 22 0 AAAAACCCCTACCGCTTCCTG SEQ ID N° 221 AAAACCCCTACCGCTTCCTGT SEQ ID N° 222 AAACCCCTACCGCTTCCTGTG SEQ ID N° 223 AACCCCTACCGCTTCCTGTGG SEQ ID N° 22 4 AAG T GC G T GGAGGAGA A T AA T SEQ ID N° 225 AATAATGGCGTGGCCAAGCAC SEQ ID N0 226 AATGGCGTGGCCAAGCACATC SEQ ID N° 227 AAGCACATCAGCCGTTTCATC SEQ ID KP 22 8 AACATGGACGGTGCCGCGCTC SEQ ID N° 229 AAAGATCATCACCATCCTGGT SEQ ID N° 23 0 AAGATCATCACCATCCTGGTC

SEQ ID N231 AAGCAGTCAACCTCCCGGTCG SEQ ID N° 2 32 AACCTCCCGGTCGACCATATC SEQ ID N° 233 AATGTAGAAGGTGACGCTCTG SEQ ID N° 234 AAGGTGACGCTCTGGGGGCAG SEQ ID N ° 235 A A A AT TAG G T G GAC C GTAC GG SEQ ID N° 236 AAATTACGTGGACCGTACGGA SEQ ID N° 23 7 AATTACGTGGACCGTACGGAG SEQ ID N° 238 AAGCACAGAGCCTGAGTTGAT SEQ ID N° 239 A A G T G A AG .A GTGAGCTGCCCC SEQ ID N° 240 AAGAGTGAGCTGCCCCTGGAT SEQ ID N° 241 AAGGAAACCCCCTCCTCAAAC SEQ ID If 242 AAACCCCCTCCTCAAACACTA SEQ ID N° 243 A A AC ACTATCG GGGG CCCG CA SEQ ID N'·' 244 AACACTATCGGGGGCCCGCAG SEQ ID If 245 AAGAGAGGAATATCACCGGAA SEQ ID N ° 2 46 T AT C AC C G G A AC C AG G G T G AA. SEQ ID N° 247 GCAGGAGGTGGAGGGGATGAA SEQ ID N0 248 CTTTGGTGTGGCGCTGCGGAA SEQ ID N° 249 CTGCGGAAGCTGGGGCCTGAA SEQ ID N° 250 GCTGCTTATCCGCTTCTTCAA SEQ ID N° 251 CCGCTTCTTCAACTCCTTCAA SEQ ID If 252 CATGTTCCTGGTGGCTGGCAA SEQ ID N° 253 ACTCTTTGCCCGCCTTGGCAA SEQ ID N° 254 CTACTTCCTCTTCACCCGCAA SEQ ID tf 255 TACTTCCTCTTCACCCGCAAA SEQ ID ΝΛ 256 CTTCCTCTTCACCCGCAAAAA SEQ ID N '·' 25 7 C AC G C T G C C G C T GAT G AT G A A SEQ ID N° 258 GATGAAGTGCGTGGAGGAGAA SEQ ID N° 259 GAAGTGCGTGGAGGAGAATAA SEQ ID N° 260 GGAGAATAATGGCGTGGCCAA SEQ ID N° 261 GCCCATCGGCGCCACCGTCAA SEQ ID tf 262 GCAGTCCTTGGACTTCGTAAA SEQ ID N- 263 AGCAGTCCTTGGACTTCGTAA SEQ ID N'·' 264 CATCATCCTCGAAGCAGTCAA SEQ ID N° 265 ACTCTGGCCATCATCCTCGAA SEQ ID N ° 266 T G T AC C G T C C T C A AT G TAG AA. SEQ ID N° 267 CCGGTCCTGTACCGTCCTCAA SEQ ID N° 268 GGGGGCAGGACTCCTCCAAAA SEQ ID Nft 269 TGGGGGCAGGACTCCTCCAAA SEQ ID N5 270 CTGGGGGCAGGACTCCTCC A A SEQ ID N° 271 TGGACCGTACGGAGTCGAGAA SEQ ID N° 272 AC AGAG CCTGAGTTG ATACAA SEQ ID N° 2 73 G C C T G A G T T G A T A C A A G T G AA SEQ ID N° 274 CTGCCAGTCCCCACTGAGGAA SEQ ID tf 275 CAGTCCCCACTGAGGAAGGAA

SEÇ ID N° 2 76 GGAAGGAAACCCCCTCCTCAA

SEQ ID N° 277 GAAGGAAACCCCCTCCTCAAA

SEQ ID N° 2 78 TGCCACGGTCGCCTCTGAGAA

SEQ ID N° 2 79 ACGGTCGCCTCTGAGAAGGAA

SEQ ID N° 280 GAGAAGGAATCAGTCATGTAA

SEQ ID N° 281 G AG AG GA AT AT C AC C G G AA

SEQ ID N° 282 GCTGGGGCCT GA AG G G G AG

SEQ ID N° 283 TAATGGCGTGGCCAAGCAC

SEQ ID N° 284 TGGCGTGGCCAAGCACATC

SEQ ID M° 285 CATGGACGGTGCCGCGCTC

SEQ ID N° 286 AATTACGTGGACCGTACGG

SEQ ID N° 287 ATTACGTGGACCGTACGGA

SEQ ID IIo 288 TTACGTGGACCGTACGGAG

SEQ ID N° 289 GCACAGAGCCTGAGTTGAT

SEQ ID N° 290 GAGAGGAATATCACCGGAA

SEQ ID N° 291 AGAATAATGGCGTGGCCAA

SEQ ID N° 292 TCATCCTCGAAGCAGTCAA

SEQ ID N° 293 GGTCCTGTACCGTCCTCAA

SEQ ID N° 294 GACCGTACGGAGTCGAGAA

SEQ ID N° 295 AGAGCCTGAGTTGATACAA

SEQ ID N° 296 CCACGGTCGCCTCTGAGAA

SEQ ID N° 297 GGTCGCCTCTGAGAAGGAA A especificidade do gene de ASCT2 foi confirmada pesqu:j_Sar^ a base de dados NCBI BlastN. Os ARNsi foram sinteti2ado^ quimicamente. A totalidade dos quarenta e dois duplexes de &RNs. purificados foram complexados com iipofectamina e adicionados às células durante 12 h em meio isento de soro. Posteriormente, as células foram cultivadas durante 72-96 h em meio suplementado com soro, que toí substituído por meio isento de soro 24 horas antes das experiências. Foi utilizado um duplex de ARNsi negativo desordenado como controlo. O ASCT2—ARNsi é direcionado a uma sequência génica de ASCT2 de alvo único, a11ernativamente, o ARNsi é direcionado a sequências de aenes ASCT2 de alvo múltiplo. Por exemplo, a. composição contém ASCT2-ARNsi dirigido a duas, três, quatro cinco ou mais sequências alvo de ASCT2. Por sequência alvo de ASCT2 entende-se uma sequência de nucleótidos que é idêntica a uma porção do gene ASCT2. A sequência alvo pode incluir a região não traduzida (UT) 5', a grelha de leitura aberta (ORF) ou a região não traduzida a 3' do gene de ASCT2 humano. Alternativamente, o ARNsi é uma sequência de ácido nucleico complementar a um modulador a montante ou a jusante da expressão do gene ASCT2. Exemplos de moduladores do montante e a jusante incluem, um fator de transcrição que liga ao promotor do gene ASCT2, uma quinase ou fosfatase que interatua com o polipéptido ASCT2, um potenciador ou promotor de ASCT2. ASCT2--ARNsi que hibridam com ARNm alvo diminuem ou inibem a produção do produto polipeptídico de ASCT2 codificado pelo gene ASCT2 através de associação com o transcrito de ARNm normalmente de cadeia simples, interferindo deste modo com a tradução e, assim, a expressão da proteína. Sequências de ácido nucleico exemplares para a produção de ASCT2-ARNsi incluem as sequências de nucleótidos 300-320 (SEQ ID N° 209), 452-472 (SEQ ID N° 216), 773-793 (SEQ ID N° 225), 776-796 (SEQ ID N° 226), 830-850 (SEQ ID N° 228), 1122-1142 (SEQ ID N° 235), 1123-1143 (SEQ ID N° 236), 1124-1144 (SEQ ID N° 237), 1150-1170 (SEQ ID N° 238), 769-789 (SEQ ID N° 260), 994-1014 (SEQ ID N° 264), 1066-1086 (SEQ ID N° 267), 1131-1151 (SEQ ID N° 271), 1154-1174 (SEQ ID N 0 272), 1264-1284 (SEQ ID N° 278), 1268-1288 (SEQ ID N 0 279), 302-320 (SEQ ID N° 281), 454-472 (SEQ ID N° 282), 775-793 (SEQ ID N° 283), 778-796 (SEQ ID N° 284), 832-850 (SEQ ID N° 285), 1124-1142 (SEQ ID N° 286), 1125-1143 (SEQ ID N 0 287), 1126-1144 (SEQ ID N° 288), 1152-1170 (SEQ ID N° 289), 771-789 (SEQ ID N° 291), 996-1014 (SEQ ID N° 292), 1068-1086 (SEQ ID N 0 293), 1133-1151 (SEQ ID N° 294), 1156-1174 (SEQ ID N 0 295), 1266-1284 (SEQ ID N° 296), 1270-1288 (SEQ ID N 0 297) como a sequência alvo. Além disso, de forma a potenciar a atividade o.e inibição do .ARNsi, pode ser adicionado nucleótido "u" a extremidade 3' da cadeia antisense da sequência alvo. Preferentemente pelo menos 2, mais preferentemente 2 ôl 10, e o mars preferentemente de 2 a 5 u são adicionados. Os u adicionados formam a cadeia única na extremidade 3' da cadeia antisense do ARNsi. 0 ASCT2-ARNsi pode ser diretamente introduzido nas células ae UI*a forma que é capaz de ligar aos transcritos de ARNm. Alternativamente, pode ser introduzido nas células um vetor codificando o ASCT2-ARNsi.

Uma sequência de ansa consistindo em uma sequência de nucieótidos arbitrária pode estar localizada entre a sequência sense e a antisense, Consequentemente, a presente invenção também proporciona ARNsi tendo a fórmula geral 5«- [A] -[B]-[A']-3', em que [A] é urna sequência de ribonucleótidos One corresponde a uma sequência alvo do gene de ASCT2. Preferentemente [A] é uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nos nucieótidos 300-320 (SEQ ID N° 209), 452--472 (SEQ ID N° 216), 773-793 (SEQ ID N° 225), 776-796 (SEQ ID N° 226) , 830-850 (SEQ ID N° 228) , 1122--1142 (SEQ ID N° 235) , 1123-1143 (SEQ ID N° 236), 1124-1144 (SEQ ID N0 237), 1150-1170 (SEQ ID N° 238), 769-789 (SEQ ID N° 260), 994-1014 (SEQ ID N° 264), 1066-1086 (SEQ ID N° 267), 1131-1151 (SEQ ID N° 271), 1154-1174 (SEQ ID N° 272), 1264-1284 (SEQ ID N° 278), 1268-1288 (SEQ ID N° 279), 302-320 (SEQ ID N° 281), 454-472 (SEQ ID N° 282), 775-793 (SEQ ID N° 283), 778-796 (SEQ ID N° 284), 832-850 (SEQ ID N'° 285), 1124-1142 (SEQ ID N° 286), 1125-1143 (SEQ ID N° 287), 1126-1144 (SEQ ID N° 288), 11521170 (SEQ ID N 0 289), 271-789 (SEQ ID N° 291), 996-1014 (SEQ ID N 0 292), 1068-1086 (SEQ ID N° 293), 1133-1151 (SEQ ID N° 294), 1156-1174 (SEQ ID N0 2 95), 1266-1284 (SEQ ID K° 296), 1270-1288 (SEQ ID N° 297), [B] é uma sequência de ribonucleotides consistindo em 3 a 23 nucieótidos; e [A'] é urna sequência, de ribonucleót idos consistindo na sequência complementar de [A] . A região [AI hibridiza com [A'], e posteriormente é formada uma ansa consistindo na região [B] . a sequência em ansa pode ser preferentemente de 3 a 23 nucieótidos de comprimento. São descritas sequências de ansa adequadas em http : //www. ambion . com/techlib/tb/tb__5 06 .html. Além disso, sequência de ansa consistindo em 23 nucieótidos também proporciona ARNsi ativo (Jacque et ai., 2002). Sequências de ansa preferidas incluem: AUG: (Sui et ai., 2002) . CCC, CCACC ou CCACACC: (Paul et ai., 2002). UUCG: (Lee et ai., 2 0 02) . CTCGAG ou AAGCUU : (Biology, 2003). UUcAaGAGa : (fu et a.^ ., 2 0 u2) . A sequência de ansa pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC, e UUCAAGAGA. Preferentemente a sequência de ansa é UUCAAGAGA ("ttcaagaga" em ADN).

Os inventores constataram surpreendentemente, que os ARNsi direcionados para certas sequências alvo do gene LATI ou gene ASCT2 são particularmente eficazes na inibição da absorção de [14 C]— L-ieucina independente de sódio ou absorção de [14C] -L-alanina dependente de sódio, respetivamente, expressão de LATI ou ASCT2, crescimento celular e crescimento de tumores com sobreexpressão de transportadores de LATI e/ou ASCT2.

Numa forma de realização específica da presente invenção, a cadeia sense do ARNsi de LATI utilizada na presente invenção compreende ou consiste em pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID N° 6, N° 22, N° 34, M° 58 e N° 61. O ARNsi compreende também uma cadeia antisense correspondente. A utilização de um tal ARNsi foi verificada que é ser particularmente eficaz na inibição de transporte de [i4C]-L-leucina independente de sódio. Numa forma de realização adicional, a cadeia sense do ARNsi de LATI compreende ou consiste em pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 110, 126, 138, 162 e 165.

De acordo com outro aspeto da presente invenção é proporcionado um ARNsi compreendendo uru ácido nucleico LATI sense e um ácido nucleico LATI antisense e o ácido nucleico LAT 1 sense é substancialmente idêntico a uma sequência alvo coirciaa dentro ao ARNm de LATI e o ácido nucleico de LATI antisense é complementar com o ácido nucleico de LATI sense. Os ácidos nucleicos sense e antisense hibridizam entre si para formar uma molécula de cadeia dupla.

As moléculas de ARNsi da presente invenção têm a propriedade de inibir a expressão do gene LATI quando é introduzido numa célula que expressa o dito gene.

As moléculas de ARNsi da presente invenção têm a propriedade de inibir o crescimento celular quando são introduzidas numa célula que expressa o gene LATI.

As moléculas de ARNsi da presente invenção têm a propriedade de inibir o crescimento tumoral quando são introduzidas num tumor que expressa o gene LATI.

Numa forma de realização especifica da presente invenção, a cadeia sense do ARNsi de ASCT2 utilizada na presente invenção compreende ou consiste em pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID N° 22 5, N° 2 37, N° 2 67 e N° 278. 0 ARNsi compreende também uma cadeia antisense correspondente. A utilização de um tal ARNsi foi verificada que é ser particularmente eficaz na inibição de transporte de [14C] -L-leue.ina independente de sódio. Numa forma de realização adicional, a cadeia sense do ARNsi de LATI compreende ou consiste em pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo 314 326, 356 e 367.

De acordo com um outro aspeto da presente invenção é proporcionado um ARNsi compreendendo um ácido nucleico ASCT2 sense e um ácido nucleico ASCT2 antisense e o ácido nucleico A.SCT2 sense é substancialmente idêntico a uma sequência alvo contida dentro do ARNm de ASCT2 e o ácido nucleico de ASCT2 antisense é complementar com o ácido nucleico de ASCT2 sense. Os ácidos nucleicos sense e antisense hibridizam entre si para formar uma molécula de cadeia dupla.

As moléculas de ARNsi da presente invenção têm a propriedade de inibir a expressão do gene ASCT2 quando é introduzido numa célula que expressa o dito gene.

As moléculas de ARNsi da presente invenção têm a propriedade de inibir o crescimento celular quando são introduzidas numa célula que expressa o gene ASCT2.

As moléculas de ARM si da presente invenção têm a propriedade de inibir o crescimento tumoral quando sáo introduzidas num tumor que expressaL o cjene ASCT2.

Quando se combina o ARNsi de LATI e o ARNsi de ASCT2 da presente invenção têm a propriedade de inibir a expressão dos genes ae LAi 1 e ASCT2 quando são introduzidos numa cé"! ul^ que expressei o dito gene.

Quando se combina as moléculas de ARNsi de LATI e ARNsi de a o c: dei presenre -i.nvei:Ç3.o tem a. propried.ade d.e inibir o crescimento celular quando introduzidas numa célula que expressa os genes LATI e ASCT2.

Quando se combina as moléculas de ARNsi de LATI e ARNsi de ASCT2 da presente invenção têm a propriedade de inibir o crescimento tumoral quando são introduzidas num tumor que expressa os genes LATI e ASCT2.

Outro aspeto da invenção refere-se a sequências de ácidos nucleicos e vetores que codificam o ARNsi de acordo com o quarto aspeto da presente invenção, bem como a composições compreendendo-o, úteis, por exemplo, nos métodos da presente invenção. As composições da presente invenção podem compreender, adicionalmente, agentes de aumento de transfeção. A sequência de ácido nucleico pode ser operativamente ligada a um promotor induzível ou regulável. Os vetores apropriados são discutidos acima. Preferentemente, o vetor é um vetor virai adeno-associado. A composição da presente invenção pode compreender adicionalmente um agente farmacêutico para o tratamento de cancro, em que o agente é diferente do ARNsi. Preferentemente o agente farmacêutico é selecionado a partir do grupo consistindo em abarelix, arnifostina, aminoglutet imida, anastrozol, bevacizumab, bicalutamida, bleomicina, bortezomib, bussulfano, capecitabina, carboplatina, c a must i n a, cet u x i m a b, c 1 o r a mb u c i 1 o, c i s p 1 a t i n a, c 1 a d. r i b i n a, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina dactinomicina, daunorubicina, docetaxel, doxorrubicina, erlotinib, 4'-epidoxorrubicina, epirrubicina, estramustina, etopósido, f1o xu r i di n a, fIu da r ab i n a, 5-f1u o rou ra c ilo, flutamida, gefitinib, gencitabina, goserelin, hexametilmelamina, hidroxiureia, ifosfamida, imatinib, irinotecano, leuprólido, megestrol, xnelfalano, δ-mercatopurina, metotrexato mitomicina, mitotano, mitoxantrona, oxaliplatina, paelitaxel, pentostatina, prednisona, procarbazina, rituximab, satraplatina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, 6-tioguanina, tiotepa, topotecano, toremifen, trastuzumab, t r i p t o r e 1 i n a., v a 1 r u b i c i n a, v i n b 1 a s t i n a, v i n c r i s t i n a e vinolrebina.

Sistemas de administração não virais de ARNsi envolvem a criação de reagentes de transfeção de ácidos nucleicos. Os reagentes de transfeção de ácidos nucleicos têm duas propriedades básicas. Em primeiro lugar, devem interatuar de alguma forma com a carga de ácido nucleico, Muito frequentemente isto envolve forças eletrostáticas, que permitem a formação de complexos de ácido nucleico. A formação de um complexo garante que os reagentes de transfeção e ácidos nucleicos sejam apresentados simultaneamente à membrana celular. Os complexos podem ser divididos em três classes, com base na natureza do reagente de administração: lipoplexos; poliplexos; e lipopoiiplexos. Os lipoplexos são formados através da interação de ácidos nucleicos aniónicos com lípidos catiónicos, os poiiplexos através da interação com polímeros catiónicos. Os reagentes lipopoiiplexos podem combinar a ação de lípidos catiónicos e 'polímeros para administrar ácidos nucleicos. A adição de histona, poli-L-lisina e protamina a algumas formulações de lípidos catiónicos resulta em níveis de administração que sao raais elevados do que quer lípidos quer polímeros por si so. As formulações combinadas também podem ser menos tóxicas. Os sistemas biocompatíveis mais relevantes para esta rmalidade são nanocápsulas biodegradáveis não virais concebidas especialmente de acordo corn a físico-química de ácidos nucleicos. Têm um núcleo aquoso rodeado por um envelope polimérico biodegradável, que proporciona proteção e transporte do ARNsi para o citosol e permite que o ARNsi funcione de forma eficiente in vivo. A presente invenção também proporciona uma célula contendo o ARNsi de acordo com o quarto aspeto da presente invenção ou o vetor da presente invenção. Preferentemente a célula é uma célula de mamífero, mais preferentemente uma célula humana. É adicionalmente preferido que a célula seja uma célula isolada.

Enquanto a descrição anterior proporciona uma descrição geral do assunto abrangido dentro do âmbito da presente invenção, incluindo métodos, bem como o melhor modo do mesmo, de preparar e utilizar esta invenção, são proporcionados os seguintes exemplos para permitir adicionalmente que os peritos na especialidade pratiquem a presente invenção e para proporcionar uma descrição completa por escrito da mesma. Contudo, os peritos na especialidade apreciarão que que as especificidades destes exemplos não devem ser lidas como limitativas da invenção, cujo âmbito deve ser apreendido a partir das reivindicações e equivalentes das mesmas anexos a esta divulgação. Vários aspetos adicionais e formas de realização da presente invenção serão evidentes para os peritos na especialidade em vista da presente revelação.

Todos os documentos citados na presente memória descritiva, incluindo a referência a identificadores de base de dados de sequências, são incorporados no presente documento como referência na sua totalidade. A menos que seja especificado de outro modo, quando é feita referência aos identificadores de base de dados de sequências, o número de versão é o 1. "e/ou" quando utilizados no presente documento são para ser tomados com divulgação específica de cada urna das características especificadas ou componentes com ou se o outro. Por exemplo, "A e/ou 3" é para ser tomado como divulgação específico de cada um dos (i) A, (ii) B e (iii) A e B, tal como se cada um fosse definido individualmente no presente documento. A menos que o contexto dite de outra forma, as descrições e definições das características acima expostas não estão limitadas a qualquer aspeto particular ou forma de realização da invenção e aplicam igualmente a todos os aspetos e formas de realização que são descritos. A invenção é ainda descrita nos seguintes exemplos não limitativos.

Os exemplos a seguir ilustram a presente invenção em detalhe, mas não são para serem interpretados como limitativos do âmbito da mesma.

Descrição dos desenhos

Figura 1, (A) 0 anticorpo criado contra a LATI reconheceu a presença de LATI em todas as linhas celulares de cancro. A abundância de proteína LATI foi marcadamente reduzida nas células tratadas com o ARNsí-LATl (B).

Figura 2. (A) 0 anticorpo criado contra a ASCT2 reconheceu a presença ae AsCT2 em todas as linhas celulares de cancro. A abundância de proteína ASCT2 foi marcadamente reduzida nas células tratadas com o ARNsi-ASCT2 (B)

Figura 3. Efeito de 3 mM de L-ieucina não marcada na absorção de ImC] -L-leucina independente de sódio (0,25 ΛΜ) a uma taxa inicial ae absorçao de (1 min) em células de carcinoma epitexial. Absorção de [i4C] -L-leucina (0,25 ΛΜ) a uma. taxa inicial de aosorção ae (1 mm) em células de carcinoma tratadas durance /2 h com ARNsi-LATl (0, 5, 10 e 25 nM) contra as sequências nucleotídicas N° 6, N° 22, N° 34, N° 58 e K° 61 Figura 4. Efeito ae 3 mM ae L--alanina não marcada na absorção de [14C] -L-alanina dependente de sódio (0,25 ΛΜ) a uma taxa inicial de absorçuo de (l min) em células de carcinoma epitexial. Aosorção de [14C] -L-alanina (0,25 ΛΜ) a uma taxa iniciai de dbt>orÇao de (1 min) em células de carcinoma tratadas durante 72 h com ARNsi-ASCT2 (0, 5, 10 e 25 nM) contra as sequências nucleotídicas 225, N° 237, N° 267 e N° 278. Figura 5. (A) Tratamento de células com o ARNsi-LATl contra as sequências nucleotídicas N° 22 e N° 34 durante 12 h diminuiu a viabilidade celular. (A) Tratamento de células com o ARNsi---ASCT2 contra as sequências nucleot ídicas N° 237 e N° 27 8 durante 12 h diminuiu a viabilidade celular.

Figura 6. Quadro de sequências alvo e ARNsi de LAT 1 Figura 7 Quadro de sequências alvo e ARNsi de ASCT2 írA&L v JL, £L«L> wi w í 11^5 v wUlv S*

Cultura celular

As linhas celulares SK-HEP-1, T24 e HT-1080 foram mantidas numa atmosfera humidificada de 5 % de C02---95 % de ar a 37 °C. As células SK-HEP-1 foram cultivadas em RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 20 % (Gibco, RU), penicilina G a 100 U/ml, anfotericina B a 0,25 gg/ml estreptomicina a 100 gg/ml (Gibco, RU), bicarbonato de sódio a 25 mM (Merck, Alemanha) e ácido N-2-h i dr o x i e ti1pipe r a z i na-N'-2- et aηo s s u1f ó nic o (HEP E S) (Sigma, St. Louis, MO). As células T24 e HT-1080 foram cultivadas, respetivamente, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) - alta glicose (Sigma, St. Louis, MO) e DMEM - baixa glicose (Sigma, St. Louis, MO), suplementado com 10 % de FBS (Grbco, RU), penicilina G a 100 U/ml, anfotericina B a 0,25 gg/ml estreptomicina a 100 gg/ml (Gibco, RU), 25 mM bicarbonato de sódio (Merck, Atlemanha) e HEPES a 25 mM (Sigma, St, Louis, MO) . O meio foi mudado a cada dois dias, e células alcançaram confluência 3-4 dias após semeadura inicial. Para a subcultura, as células foram dissociadas com 0,25 % de t r i p s i n a- á eido et i1e ηo di am i η otetracético (ED TA) (Si gma, St. Louis, MO), divididas 1:15 e subcult ivadas numa área de crescimento de 21-cm2 (Sarstedt, Alemanha). As experiências foram realizadas geralmente 3-4 dias após a semeadura inicial. Expressão da. proteína de LATI e ASCT2

As linhas celulares cultivadas em placas de 21 cm2 foram enxaguadas duas vezes com solução salrna tarnponada com fosfato (PBS) fria e foi adicionado 100 μΐ de tampão de lise RIPA (NaCl a 154 mM, base de TRTZMA a 65,2 mM, EDTA a 1 mM, NP-40 a 1 % (IGEPAL), aesoxicolato de sódio a 6 mM) contendo inibidores de protease: PMSF a i mM, 1 pg/ml de ieupeptina e 1 pg/'ml de aprotinina; e inibidores de fosfatase: Na3V04 a 1 mM e NaF a 1 mM. As células foram raspadas e sonicadas brevemente. Foram separadas quantidades iguais de proteína total (20 pg) num gel de poliacrilamida e SDS a 10 % e eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose em tampão de transferência Tris-Glicrina contendo metanol a 20 %. As folhas Transblot foram bioqueaaas em leite em pó magro a 5 % em solução salina tamponada com Tris (TBtí) durante 60 min e, em seguida, incubadas durante a noite, a 4 °C, com. os seguintes anticorpos: anticorpo de coelho anti-LATl (1:1000; Cell Signalling); anticorpo de coelho anti-ASCT2 (1:1000; Cell Signalling); ou anticorpo monoclonal de ratinho anti-GAPDH (1:20.000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) , diluídas em leite em. pó magro a 2,5 % em TBS-Tween 20 (0,1 % vol/vol) , Os imunoblots foram subsequentemente lavados e incubados com anticorpos de cabra anti-coelho marcado com fluorescência (1:20.000; ΙΚΟγβϊια 800, Rockland) ou anticorpo secundário anti-ratinho de cabra marcado com fluorescência (1 :20.000; AlexaFluor 680, Molecular Probes) durante 60 min a temperatura ambiente e protegido da luz. A membrana foi lavada e fotografada através de aigitalizaçáo, tanto a 700 nm como a 800 nm, com um Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences).

Expressão do gene de LATI e ASCT2 O ARN total a partir de células cultivadas em placas de 21 crrk foi isolado e purificado utilizando o Reagente TRIzol (Life Technologies, Espanha) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e a concentração do ARN foram verificadas no espetrofotómetro NanoDrop ND1000 (Thermo Scientific, EUA) . O ARN total (1 pg) foi convertido em ADlSFc utilizando o kit Maxima Scientific First Strand ADNc Synthesis para RT-qPCR (Thermo Scientific, EUA), de acordo com as instruções. Foi utilizado o seguinte protocolo: Ia etapa, 10 min a 25 °C; 2a etapa, 15 min a 50 °C; 3aetapa, 5 min a 85 °C. 0 ADNc foi utilizado para análise de qPCR utilizando Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, EUA) no instrumento StepOnePlus (Applied Biosystems, EUA.) . Foram utilizados QuantiTect Primer Assay para LATI e ASCT2 (Quiagen, Alemanha) , e para o gene GAPDH referência foram selecionados o iniciador direto 5 ' -CTTTTGCGTCGCCAG-3' e o iniciador reverso 5 <... TTGATGGCAACAATATCCAC-3'. A reação qPCR foi realizada em placas de PCR de 96 poços (Sarstedt, Alemanha) conforme segue: um ciclo de 10 min a 95 °C, seguido por 40 ciclos de PCR a 95 °C 15 s e 60 °C 60 s. Uma curva de fusão foi feita imediatamente depois da qPCR, para demonstrar a especificidade da amplificação. Sera controlos de modelo foram sempre avaliados para cada gene alvo. Os valores do ciclo de quantificação (CQ) foram gerados automaticamente pelo software StepOnePlus 2.3 e a razão do gene alvo foi expressa em comparação com o gene GAPDH de referência. As eficácias de PCR em tempo real foram constatadas como sendo entre 95 % e 115 %.

Atividade de LATI

Foram inoculadas células em placas de 24 poços (Sarstedt, Alemanha) e cultivadas até a confluência ser alcançada. No dia da experiência, o meio de crescimento foi aspirado e as monocamadas de células foram pré-incubadas durante 15 minutos em meio de Hanks a 37 °C. O meio de Hanks teve a composição seguinte (em mM) : NaCl 140, KC1 5, MgS04-7H20 0, 8, K2HPCn 0,33, KH2PO4 0,44, MgCl2-6H20 1,0, CaCl2 0,025, Tris-HCl 9,75, pH 7,4. A absorção foi iniciada através da adição de meio de Hanks com [14C] - L-leucina a 0,25 pM na ausência e na presença de concentrações crescentes (0, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 PM) do substrato não marcado, durante 1, 3 e 10 min. Durante a pré-incubação e a incubação, as células foram continuamente agitadas e mantidas a 37 °C, A absorção foi interrompida através da rápida remoção da solução de absorção por meio de uma bomba de vácuo ligada a uma pipeta de Pasteur, seguida de uma lavagem rápida com meio de Hanks. Subsequentemente, as células foram solubilizadas em 0,1% vol/vol de Triton X-100 (dissolvida era

Tris-HCl a 5 rnM, pH 7,4), e a radioatividade ioi medida através de contagem de cintilação líquida.

Atividade de ASCT2

Foram inoculadas células em placas de 24 poços (Sarstedt, Alemanha) e cultivadas até a confluência ser alcançada. No dia da experiência, o meio de crescimento foi aspirado e as monocamadas de cérulas foram pré-incubadas durante 15 minutos em mexo de Hanks a 37 °C. 0 meio de Hanks teve a composição seguinte (em mM) : ChCl 140, KC1 5, MgS0,-7H20 0,8, K2HPO4 0,33, KH2PO4 0,44, MgCl2-6H20 1,0, CaCl2 0, 025, Tris-HCl 9,75, pH 7,4. A absorção foi iniciada através da adição de meio de Hanks com [ - r-alanina a 0,25 pM na ausência e na presença de concentrações crescentes (0, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 pM) do substrato não marcado, durante 1, 3 e 10 min. Durante a pré-incubaçao e a incubação, as células foram continuamente «gitaaas e mantidas a 3 / °C, A absorção foi interrompida através da rapiaa remoção da soxuçao de absorção por meio de uma boroba de vácuo ligada a uma pipeta de Pasteur, seguida de uma lavagem rápida com meio de Hanks. Subsequentemente, as células foram soluoilizadds em u,1% vox/vol de Triton X—100 (dissolvida em Tris-HCl a 5 mM, pH /,4), e a radioatividade foi medida através de contagem de cintilação líquida.

Si lend ament o do gene de LATI

As células foram inoculadas emplacas de 24 poços (Sarstedt, Aiemanhdi ou oe 6 poços (Corning, EUA) e incubadas durante 24 h sob condições de crescimento normais. Foram diluídos ARNsi contra LATI e Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Espanha) em iriei0 de cultura isento de soro e a mistura foi incubada durante 20 min a temperatura ambiente (TA) para a formação do complexo. Foram adicionados lipoplexos às células em ineio de cultura isento de soro e incubados durante 24 h, após o qual foi adicionado meio de cultura celular fresco a uma concentração final de 20 ou 10 % de FBS para as células SK-HEP-1 ou i24, respetivamente. As células foram adicionalmente incubadas em condições normais para os pontos de tempo desejados. Subsequentemente, as células foram utilizadas oara a avanaçao da atividade LATI no transporte de ([ 14C] -L-leucina, com 1 min de incubação) ~v, ^ ~ T7irr,

“v4''' expressão LATI (imunotransferência e RT-qPCR)

Silenciarnento do gene de ASCT2

As células foram inoculadas emplacas de 24 poços (Sarstedt,

Alemanha) ou 6 poços (Corning, EUA) e incubadas dur^teYí h sob condições de crescimento normais. Foram diluídos ARNsi contra ASCT2 e Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Espanha) em meio de cultura isento de soro e a mistura f0i incubada durante 20 min a TA para a formação do complexo." Foram adicionados lipoplexos às células em meio de cultura isento da soro θ incubeiqos Gujouritrp' 24 h π"1·* ί . ^ ^ η, dpuo ^ qual lai adicionado meio de cultura celurar fresco a uma concentração final de 20 ou 10 % de FBS para as células SK-HEP-1 ou T24, respetivamente. As células foram adicionalmente Incubadas em condições normais para os pontos de tempo desejados. Subsequentemente, as células foram utilizadas para a avaliação da atividade ASCT2 no transporte ( ι]-C] -L-alanina, com 1 min de incubação) ou expressão ASCT2 (imunotransferência e RT-qPCR).

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidaae celular foi medida utilizando calceína-AM (Invitrogen). Calceína-AM permeante de membrana, um corante não fluorescente, é absorvida e convertida por esterases intracelulares em calceína impermeante de membrana, que emite iluorescencia verde. Após o tratamento com as substâncias de tesre ou veícuio, as células foram lavadas duas vezes com meio de Hants e carregadas com calceína-AM a 2pM em meio de Hank, a temperatura ambiente durante 30 min. A fluorescência foi medida a comprimentos de onda de 485 nrn de excitação e 530 mn de emissão num espectrofluorómetro de microplaca (Gemini EM,

Molecular Devices). são realizadas nove medições de fluorescência consecutivas por poço, para permitir leituras de fluorescência em toda a área do poço, que foi, depois, considerada para o cálculo de fluorescência média por poço.

Para determinar a coloração mínima para calceína (calceirw.) , oito poços foram tratados com e-tanol durante 30 min antes da adição calceína-AM. A percentagem, de número de células é calculada como [ (calceínaajriostra) / (calceínaControio) ] x 100. Animais e implantação do tumor

As células SK-HEP1 serão cultivadas em cultura de tecidos e 107 células por ratinho serão injetadas no flanco posterior dos ratinhos fêmeas NMRI nu/nu. Urna vez que os tumores se desenvolveram e os volumes dos tumores atingiram critérios de randomização, a terapêutica começará por injeções intratumorais uma vez por dia. Será. incluído um grupo não tratado totalmente e um grupo de terapêutica simulada (apenas inserção de agulha intra-tumoral) no estudo como controlos. Foram utilizados ratinhos imunodeficientes fêmea NMRI nu/nu de Harlan ou Charles River. Os animais foram entregues com a idade de 4-6 semanas e são utilizados para o implante após pelo menos 1 semana de quarentena. Todas as intervenções nos animais foram realizadas de acordo com o número de Diretiva Europeia 86/609, e as regras do "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", 7® edição, 1996, Institute for Laboratory Animal Research (ILAR), Washington, DC. Somente foram selecionados animais com saúde inquestionável para entrar nos procedimentos de teste. Durante as experiências, os animais foram monitorizados pelo menos diariamente. Cada gaiola foi marcada com uma ficha indicando origem animal, género, e a data de nascimento. Os animais foram numerados durante a implantaçao do tumor ou no momento do início de uma experiência de determinação de dose. O volume do tumor foi determinado por uma medição bidimensional com compassos de calibre no dia da randomização (Dia 0) e, depois, duas vezes por semana. Os volumes tumorais foram calculados de acordo com a seguinte equação:

Vol de tumor [mm3] - a [mm] x b2 [mm2] x 0,5 onde "a" β o maior diâmetro e "b" o o diâmetro perpendicular do tumor representando um elips°ióe idealizado. O volume relativo de um tumor individual no dia X (RTVx) foi calculado dividindo o volume absoluto [mm3] do respetivo tumor no dia X (Tx) pelo volume absoluto do mesmo tumor no dia da randomização, ou seja, no dia 0 (TO), multiplicado por 100, conforme é mostrado pela seguinte equação:

RTVs foram utilizados para a caracterização do crescimento e classificação de atividade do composto como se segue: Pontuação RTVx [%] CR Remissão completa< 10 PR Remissão parcial > 10; < 50 MR Remissão menor > 50; < 75 NC Sem alterações > 75; < 125 P Progressão > 125

Mediana do grupo e faixa (alternativamente média geométrica + /- SEM) de RTVs foram calculados, considerando apenas os tumores de animais que estavam vivos no dia em questão (para a mediana) . A mediana do grupo (média geométrica) de RTVs foram utilizadas para desenhar curvas de crescimento do tumor e para a avaliação do tratamento. A inibição do tumor num dia particular (T/Cx) foi calculada a partir da mediana de RTV de um grupo de teste e o RTV mediano de um grupo de controlo, multiplicado por 100, conforme é mostrado pela seguinte equação:

A valor ótimo / mínimo / melhor T / C [%] registado para um grupo particular durante uma experiência representa a atividade máxima anti tumoral para o respetivo tratamento e é classificado como se segue:

Pontuação T/C [%] — inativo > 65 + / -- Atividade limítrofe > 50; < 65 + Atividade moderada >_ 25; < 5 0 ++ Atividade alta > 10; < 25

Atividade muito alta > 5; < 10 ++++ Remissão completa < 5 O tempo de duplicação / quadruplicação do volume tumoral (DT / QT) é definido como o intervalo de tempo (era dias) necessário para um grupo de alcançar um RTV mediano de 200% / 4 0 0% do volume inicial do tumor. O atraso no crescimento é definido como a dxierença era dias entre os tempos de duplicação do volume do tumor e quaaruplicaçao de um grupo Ge teste e o respetivo grupo de controlo.

Sistemas de administração de ARNsi não-virais

1. Os lipossomas que transportam agentes ARNsi-LATI

terapêuticos são capazes de passar através da. membrana da célula alvo para distribuir cargas. Um grande número de lípidos pode ser utilizado para a síntese de lipossomas utilizados para a administração de ARNsi. Lípidos neutros que podem ser complexados com ARNsi-LATI incluem DOPE íI/2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina), por exemplo, PC (fosfatidilcolina), DOPO (1,2-dioleoil-sn-giicero-3- fosfatidilcolina e DPPE (1,2-cIipalmitoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina).

2. Lípidos catiónicos que podem ser complexados com ARNsi-LATI incluem DOTAP (1,2-dioiei-3-trimetilamónio propano), CDAN (N(1)-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonano-l, 9-diamina)/DOPE, DC-Chol (3Λ~[N-(Ν',N'- dimetlaminoetano)carbamool] colesterol)/DOPE, DOTAP/DOPE, lípido catiónico RPR209120 (2- (3-[Bis-(3-amino-propil)-amino1 - propilamino)-N-ditetradecilcarbamoilmetil-acetamida).

Complexo de lipossomas galact osilados (Gal-C4-CisoI/DGPE) lipossomas/ ARN-si-LATl podem também induzir o silenciamento génico. 3. Polímeros catiónicos também podem ser usados em administração de ARNsi-LATl ou ARNsi-ASCT2. Estes materiais combinam com ARNsi-LATl aniónico ou ARNsi-ASCT2 para formar um complexo de polímero de ARNsi -LATI ou complexo de polímero de ARNsi-ASCT2 que pode interagir com as superfícies das células carregadas negativamente através da porção catiónica do complexo. Entre os polímeros disponíveis, polietilenoimina (PEI) tem. a capacidade de se ligar fortemente a. ARNsi-LATl ou ARN s i - A S C T 2 carregado negativamente . Polímeros biodegradáveis tais como poli(L-lisina) (PLL) são conhecidos pela sua baixa toxicidade e maior biocompatibilidade do que PEI. Um derivado da PLL, ácido poli[a-(4-aminobutil)-L-glicólico] exibe uma maior eficiência de transfeçáo e imunogenicida.de e a cítotoxicidade inferior do que o polímero de PLL original e pode ser usado com ARNsi-LATl ou ARNsi-ASCT2. 4. Microesíeras de gelatina catiónica podem ser preparadas reticulando quimicamente gelatina no estado de emulsão água-ern-oleo. Para impregnar o ADN de plasmídeo de expressão de ARNsi-LATl ou ARNsi-ASCT2 nas microesíeras de gelatina cationizadas, ADN de plasmídeo de expressão de ARNsi-LATl contendo DBS pode ser gotejado sobre microesíeras de gelatina cationizadas liofilizaaas e depois mantidas durante 24 h a 4 0 pi V-x » 5. As nanopartí cuias podem ser produzidas com base na. gelificação iónica. modificada de tripolifosfato (TPF) com quitosano. Podem ser utilizados dois tipos diferentes de quiuosano (cloridrato e glutamato de quitosano) e cada tipo com auas massas moleculares diferentes. As nanopartículas podem ser obtidas espontaneamente após a adição de uma solução aquosa ae TrP a solução de quitosano sob agitação magnética constante à temperatura ambiente. As partículas podem então ser incubadas a temperatura ambiente para utilização antes ou análise posterior. As nanoparticulas sao recolhidas por meio de centrifugação. Os sobrenadantes são descartados e as nanoparticulas são ressuspensas em água destilada filtrada. Para. a associação do ARNsi-LATl ou ARNsi-ASCT2 com as nanoparticulas de quitosano-TPP (quitosano-TPP- ARNsi-LATl ou quitosano-TPP- ARNsi-ASCT2) , ARNsi-LATl ou ARNsi~ASCT2 em água bidestilada é adicionado à solução de TPP antes de adicionar isto gota a gota à solução de quitosano, sob agitação magnética constante à temperatura ambiente. As partículas são então incubadas à temperatura ambiente antes da utilização ou análise-posterior . 6. 0 quitosano (114 kDa) foi dissolvido em tampão de acetato de sódio para se obter um 0,2-1 mg/ml de intervalos de solução de trabalho. Vinte microlitros de ARNsi-LATl ou ARNsi-ASCT2 (intervalo de 20-250 pm) foi adicionado a 1 ml de quitosano filtrado com agitação e deixado durante 1 h. Para calcular as razões de N:P específico (definida como a proporção molar dos grupos amino de quitosano/grupos fosfato de ARN) uma massa por fosfato de 325 Da foi usada para ARN e massa por carga de 167,88 para o quitosano (84 % de desacetilação). 7. Os ARNsi-LATl ou ARNsi-ASCT2 podem ser encapsulados em partículas de lípidos e ácido nucleico estáveis (SNALP) e administrado por meio de injeção intravenosa. A formulação de SNALP continha os lípidos 3-N-(W-metoxipoli(etileno-glicol)2000) carbamoil] -1,2 dimiristiloxi-propilamina (PEG-DMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-d imeti1- 3-qminopropanona (DLinDMA), 1,2-distearoi.I -sn-glicero-3-fosfoeolina (DSPC) e colesterol. 3. Os ARNsi-LATl ou ARNsi-ASCT2 podem ser encapsulados em Inject in In Vivo SiRNa Delivery Reagent (BioCellChallenge SAS, Toulon, França) e admini strados por meio de injeção intravenosa. A formulação de injeção continha a seguinte misuura: 1U pg de ARNsi em 10 μΐ de tampão contendo glicose, 40 μΐ com uma água isenta de ARNase estéril, 10 μΐ de reagente Injectin. A mistura deve ser misturada por pipetagem para cima e para baixo, e incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente antes da injeção.

Exemplo 1

Imunotransferência de LATI A presença da proteína de LATI foi estudada por meio de imunotransferência utilizando um anticorpo criado contra LATI. Conforme mostrado na Figura IA, o anticorpo criado contra LATI reconheceu a presença de LATI em todas as linhas celulares de cancro. A abundância de proteína LATI foi marcadamente reduzida nas células tratadas com o ARNsi-LATI (Figura 1B).

Exemplo 2

Imunotransferência de ASCT2 A presença da proteína de ASCT2 foi estudada por meio de imunotransferência utilizando um anticorpo criado contra ASCT2. Conforme mostrado na Figura 2Ά, o anticorpo criado contra ASCT2 reconheceu a presença de ASCT2 em todas as linhas celulares de cancro. A abundância de proteína ASCT2 foi marcadamente reduzida nas células tratadas com o ARNsi-ASCT2 (Figura 2B).

Exemplo 3

Captação de [14C] -L-leucina A captação de [14C]-L-leucina independente de sódio (0,25 ΛM) na taxa inicial de captação (1 min) em células de carcinoma epitelial foi significativamente (P<0,01) reduzida por L-leucina não marcada a 3 raM. Conforme mostrado na Figura 3, o tratamento de células com o ARNsi-LATI contra as sequências nucleotídicas N° 6, N° 22, N° 34, N° 58 e N° 61 (por exemplo, um ARNsi compreendendo ou que consiste na SEQ ID NO: 110, 126, 138, 162 e 165, respetivamente) durante 72 h diminuiu a captação de [14C]-L-leucina (0,25 ΛΜ) numa maneira dependente da c o n c e n t r a ç ã o .

Exemplo 4

Captação de [14C] -L-alanina A captação de [14C]-L-alanina dependente de sódio (0,25 ΛΜ) na taxa inicial de captação (1 min) em células de carcinoma epiteiial foi significativamente (P<0,01) reduzida por L-aianina nao marcada a 3 mH. Conforme mostrado na Figura 4, o tratamento cie células com o ARNsi-ASCT2 contra as sequências nucleotidicas N° 225, N° 237, N° 267 e N° 278 (por exemplo, um ARMsi compreendendo ou que consiste na SEQ ID NO: 314, 326, 356 e 367 durante 72 h diminuiu a captação de [14C] -L-alanina (0,25 μΜ) numa maneira dependente da concentração.

Exemplo 5

Viabilidade celular

Conforme mostrado na Figura 5Ά, o tratamento de células com o ARNsi—LATI contra as sequências nucleotidicas N° 22 (por exemplo, um ARNsi compreendendo ou que consiste na SEQ ID NO: 126) durante 12 h diminuiu a viabilidade celular. Diminuições semelnantes na viabilidade celular às observadas com ARNsi —LA.il contra sequências nucleotidicas N° 22 foram também observadas após tratamento durante 12 h com o ARNsi- LATI contra as sequências nucleotidicas N° 34 (por exemplo, um ARNsi compreendendo ou que consiste na SEQ id NO: 138) . Conforme mostrado na Figura 5B, o tratamento de células com o ARNsi-ASCT2 contra as sequências nucleotidicas N° 237 (por exemplo, um ARNsi compreendendo ou que consiste na SEQ ID NO: 326) durante 12 h diminuiu a viabilidade celular. Diminuições semelhantes na viabi1idade ceiuiar as observadas com ARNsi —LATI contra sequências nucleotidicas N° 237 foram também observadas após tratamento durante i2 h comi o ARNsi— ASCT2 contra as sequências nucleotidicas N° 278 (por exemplo, um ARNsi compreendendo ou que consiste na SEQ ID NO: 367)

Exemplo 6

Crescimento tumoral Conclusão O tratamento de células de cancro que expressam transportador de LATI e/ou ASCT2 com ARNsi-LATI e/ou ARNsi-ASCT2 leva a uma diminuição na proteína de LATI e/ou ASCT2 e uma diminuição na captação de [14C]- L-leucina e captação de [14 C]-L-alanina, que é acompanhada por uma diminuição na viabilidade celular. A diminuição da viabilidade celular de células de cancro induzida pelo ARNsi-LATl e/ou o ARNsi-ASCT2 é acompanhada por apoptose e uma diminuição do crescimento do tumor e do potencial de metástases, conforme evidenciado em. tumores subcutâneos de ratinhos nus da linha celular SK-Hep-1.

Aspetos adicionais da invenção ficarão evidentes para os peritos na especialidade, ou podem ser aprendidas a partir da prática da invenção. Os objetivos e vantagens da invenção podem ser concretizeLdos e alcançados por meio das intervenções e combinações particularmente destacadas nas reivindicações anexas.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Jina molécu.ia r|e ANsi (ácido nucleico de interferência curuo) , em que a dita molécula visa. especif icamente pelo menos uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: lu4 e br,Q ID Νυ: 20 9 - SEQ ID NO: 2 97 ou pelo menos uma sequência coxnplementai a urna sequência selecionada a partir da SEQ ID MO:

1-SaQ id NO: iU4 e SEQ ID NO: 209 - SEQ ID NO: 297 caracterizada p°r sua ULinzação como uin medicamento. ^ * Uma in0"'-écula de ANsi de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o ANsi visar especificamente pelo menos uma sequencia selecionada a partir da SEQ ID NO 4, 6, 10, 13, 22, 34, 08, 61, ul, 8c, 8 / e 95 a 104, e em que a dita molécula reduz a expressão do aeng LATI
3. Jma molécula de ANsi de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o ANsi visar especificamente pelo menos uma sequencia selecionada a partir da SEQ ID NO: 209, 216, 225, 226, 228, 235 a 238, 245, 260, 264, 267, 271, 272, 278, 279 e 281 u 29/, e em que a dita molécula reduz a expressão do gene ASCT2 . (I. Uma molécula de ANsi de acordo com qualquer reivindicação ailucor, caracterizada por a dita molécula ter entre 19 e 25 pares de bases de comprimento.
5. Uma molécula de ANsi de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada por o ANsi ser selecionado a partir de ARNds, ARNsi ou ARNsh.
6. Uma molécula ae ANsi ae acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o ANsi ser ARNsi Jma molécula de ANsi de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada por 0 ANsi compreender cadeias suspensas a 5' e/ou 3'.
8. Jiria molécula cie ANsi de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada por o ANsi compreender pelo menos uma modificação química.
9. Uma molécula de ANsi de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizada por a molécula de ANsi compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir da SEQ id NO: 105 a 208 e 298 a 386. lu. Uma molécula ae ANsi de acordo corn a reivindicação 9, caracterizada por a molécula de ANsi compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir de 108, 110, 114, 117, 126, 138, 162, ie>5, 18o, 18/, i91 e 199 a 208, e em. que preferentemente, a drta molécula reduz a expressão do gene LATI,
11. Uma molécula de ANsi de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada por a molécula de ANsi compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir de 298, 305, 314, 315, 317, 324-327, 334, 349, 353, 356, 360, 361, 367, 368 e 370 a 386, e em que preferentemente, a dita molécula reduz a expressão do gene ASCT 2.
12. Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos um ANsi de acordo com qualquer das reivindicações anteriores e um veiculo farmaceuticamente a C Θ .1 L ã V61.
13. Uma molécula de ANsi de acordo com qualquer reivindicação anterior caracterizada por sua utilização no tratamento de cancro.
14. Uma molécula de ANsi de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o dito cancro ser selecionado a partir de cancro da bexiga, sangue, cérebro, cólon, cabeça e pescoço, rim, fígado, pulmão, nódulos linfáticos, glândulas mamárias, músculo, ovário, pâncreas, próstata pele, estômago e útero.
15. Utilização do ANsi de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por servir para preparar um medicamento para o tratamento de cancro.
16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por o cancro ser selecionado a partir de cancro da bexiga, sangue, cérebro, cólon, cabeça e pescoço, rim, fígado, pulmão, nódulos linfáticos, glândulas mamárias, metastático, músculo, ovário, pâncreas, próstata pele, estômago e útero.