PT110564B - Dispositivo automático para deteção de hemozoína, método de operação e seus usos - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO A UM DISPOSITIVO PORTÁTIL E RESPETIVO MÉTODO DE DETEÇÃO E/OU QUANTIFICAÇÃO DE HEMOZOÍNA POR ESPETROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO ÓTICA NUMA AMOSTRA LÍQUIDA DE UM PACIENTE CARACTERIZADO POR COMPREENDER: MEIOS PARA COLOCAÇÃO DE PELO MENOS TRÊS AMOSTRAS; MEIOS PARA ISOLAR OTICAMENTE A AMOSTRA DO EXTERIOR; UM SISTEMA DE ILUMINAÇÃO (3) QUE COMPREENDE PELO MENOS TRÊS EMISSORES DE ESPETROFOTOMETRIA INDEPENDENTES PARA EXCITAR CADA AMOSTRA (5); PELO MENOS TRÊS DETETORES ÓTICOS PARA DETETAR A ABSORVÊNCIA DE CADA AMOSTRA (6); EM QUE OS EMISSORES, DETETORES E OS MEIOS PARA A COLOCAÇÃO DA AMOSTRA ESTÃO ALINHADOS (4); MEIOS PARA A CALIBRAÇÃO DOS EMISSORES, E UM MICROCONTROLADOR CAPAZ DE CALCULAR A RELAÇÃO ENTRE A ABSORVÊNCIA DE CADA AMOSTRA DE FORMA A DETETAR O PICO DE ABSORÇÃO.

Description

DESCRIÇÃO

DISPOSITIVO AUTOMÁTICO PARA DETEÇÃO DE HEMOZOÍNA, MÉTODO DE

OPERAÇÃO E SEUS USOS

Domínio técnico

[0001] A presente divulgação insere-se no domínio das técnicas de diagnóstico, e diz respeito a um sistema laboratorial automatizado para a quantificação dos parasitas da malária, através da determinação da presença e da quantificação de hemozoína (Hz), em amostras de sangue por técnicas de espetrofotometria por absorvência e respetivo método de deteção.

Antecedentes

[0002] A malária é uma das doenças parasíticas mais severas, com metade da população mundial em risco e estimando-se um número de 1 a 2 milhões de mortes anuais. A identificação da doença num estado inicial aumenta consideravelmente a possibilidade de tratamento efetivo e a taxa de sobrevivência. Atualmente, a sua identificação é baseada em microscopia, normalmente célula a célula, tornando-se dispendiosa, exigindo elevados tempos de análise e técnicos especializados e, consequentemente, é realizada apenas em laboratórios especializados. São, também, comummente utilizadas para o diagnóstico de malária, as técnicas de diagnóstico molecular, como Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) em que ácidos nucleicos parasitas são detetados por eletroforese, citometria de fluxo ou espetrometria de massa. No entanto, têm elevado custo, implicam elevado consumo de tempo e exigem equipamentos e técnicos especializados, não estando habitualmente disponíveis em regiões endémicas. Para aplicações ín-sítu, especialmente em regiões onde a doença é endémica, utilizamse testes de diagnóstico rápido (RDTs) por imunocromatografia. Contudo, não são quantitativos e a sua capacidade de deteção do parasita na fase inicial é reduzida. Assim, o tratamento efetivo e a erradicação da doença são frequentemente comprometidos, devido à falta de acesso às ferramentas de diagnóstico adequadas. Surge assim a necessidade de um sistema de diagnóstico simples, rápido, preciso e de baixo custo para utilização ín-sítu, nas regiões endémicas ou para despiste aquando dos primeiros sintomas de malária, detetando a presença do parasita num estado inicial e, deste modo, administrando atempadamente fármacos antimaláricos, assim como monitorizando a resposta à terapêutica desta doença.

[0003] A presença do parasita da malária (Plasmodíum) no sangue leva a um conjunto de alterações bioquímicas e morfológicas nos glóbulos vermelhos. Uma destas alterações consiste na degradação da hemoglobina (Hb), necessária ao metabolismo do parasita Plasmodium durante o seu desenvolvimento intracelular, produzindo hemozoína (Hz), um cristal anisotrópico, também conhecida como pigmento da malária. O sangue humano saudável não tem Hz. A concentração de Hz aumenta à medida que a doença progride, enquanto a concentração de Hb diminui. Assim, a determinação da quantidade de Hz numa amostra ajuda a indicar, não só a presença do parasita da malária, como também o estádio de infeção. Adicionalmente, os coeficientes de extinção molar da Hb e da Hz diferem significativamente, especialmente a certos comprimentos de onda, o que origina diferentes espetros de absorção ótica dos glóbulos vermelhos normais e infetados. Assim, é possível identificar e quantificar a Hz através da medição dos espetros de absorção do sangue (sangue total ou fracionado) , analisando os picos de Hb e Hz, que funcionarão como um marcador importante da malária.

[0004] Os estudos prévios, I. Silva et al. , Spectrophotometric Characterization of Hemozoin as a Malaria Biomarker, Proc. SPIE 10453, Third International Conference on Applications of Optics and Photonics, 1045304 (22 August 2017); AOP2017, Faro, Portugal, 8-12 May 2017 (DOI: 10.1117/12.2270995) e I. Silva et al., Hemozoin and hemoglobin characterization by optical absorption towards a miniaturized spectrophotometric malaria diagnostic system, 5th IEEE Portuguese BioEngineering Meeting, Coimbra, Portugal, 16-18 February 2017 (DOI: 10.1109/ENBENG.2017.7889466) divulgam a existência de um pico de absorção ótica da Hz aos 672 nm, assim como a possibilidade de detetar pequenas variações na concentração de Hz em amostras de sangue total, recorrendo à zona visível do espetro ótico, e usando volumes de amostra reduzidos. No entanto, estes documentos recorrem a equipamentos de espetrofotometria comerciais e de elevado custo e que se encontram em ambiente laboratorial, não sendo, portanto, portáteis.

[0005] O documento US7236236B2 descreve métodos para detetar o parasita da malária, que incluem a libertação do parasita da malária por hemólise dos glóbulos vermelhos (usando um citómetro de fluxo), a marcação do parasita com um marcador fluorescente para preparar uma amostra para medição, a deteção da informação ótica da amostra (intensidade da fluorescência emitida pela amostra) e a distinção do parasita com base na informação ótica obtida. No entanto o dispositivo não é portátil e necessita de marcadores fluorescentes.

[0006] O documento US8920726B2 descreve um dispositivo para análise do sangue e deteção de malária que inclui a preparação das amostras de sangue com um agente hemolitico, um agente de coloração e uma porção de controlo, para medição e classificação das células sanguíneas como sendo infetadas ou não por malária, com base em sinais de fluorescência e dispersão da luz.

[0007] O documento US9541552B2 descreve um dispositivo para análise de uma amostra de sangue hemolisada, que inclui uma fonte de luz num comprimento de onda para o qual a Hb numa amostra de sangue hemolisada tem absorvência (na região verde do espetro, em torno dos 570 nm). Entre a fonte de luz (de espetro alargado, podendo ser luz branca ou luz na gama do verde) e a amostra na qual a luz incide há um filtro para remoção da luz fora da gama de comprimentos de onda de interesse. O dispositivo inclui uma matriz (do inglês array) de pixels de fotodetetores que quantifica a luz na saída da amostra, numa banda de comprimentos de onda correspondente a pelo menos uma parte de um espetro de luz verde, e gera sinais representativos da quantidade de Hb na amostra e da quantidade de parasita da malária na amostra. Entre a amostra e o detetor há um sistema de lentes para direcionar o caminho ótico da saída da luz para a superfície dos detetores. Através de um processador é aplicado um algoritmo que gera um valor de glóbulos vermelhos baseado no sinal da Hb e um valor de parasitémia (percentagem dos glóbulos vermelhos infetados pelos parasitas da malária) com base no sinal do parasita e no valor dos glóbulos vermelhos.

[0008] O documento US9046473B2 descreve um método e instalação para determinação de organismos intraeritrócitos, em particular cristais anisotrópicos (como a Hz) numa amostra líquida de sangue total. Este método inclui uma fonte de luz (que ilumina a amostra na região do espetro entre os 410 e 420 nm), um detetor ótico para criar uma imagem da amostra e um programa de processamento de análise das imagens obtidas. As imagens são posteriormente analisadas para detetar a presença de, pelo menos, um glóbulo vermelho na imagem contendo uma região com diminuição de quantidade de Hb e/ou com menor concentração de Hb no glóbulo vermelho, determinando a presença do organismo intraeritrócito na amostra. Adicionalmente, um marcador fluorescente pode ser adicionado à amostra para detetar a presença da Hz pelas diferenças relativas entre a fluorescência dos glóbulos vermelhos.

[0009] O documento WO2009/009899A1 baseia-se no facto de a Hz ter uma forte resposta ótica não linear, produzindo um sinal de terceiro harmónico quando excitada por um sinal ótico de um laser, e descreve um sistema para detetar Hz numa amostra de sangue, células sanguíneas, tecidos ou outros meios. O sistema inclui uma fonte de luz (preferencialmente um laser no infravermelho) para excitar a amostra de modo a gerar uma resposta ótica não linear, lentes ou espelhos para focar o sinal ótico na amostra, um detetor para detetar o sinal da resposta não linear da amostra excitada (tubo fotomultiplicador, podendo também ser um fotodíodo ou matriz (do inglês array) de fotodíodos).

[0010] O documento de WO2016/066754A1 baseia-se nas propriedades magnéticas da Hz como indicador de infeção de malária. A presença da Hz numa amostra de sangue total (lisado) é detetada num processo que envolve: a separação magnética da amostra no dispositivo, a dissolução da componente magnética separada para obtenção de uma solução que possa ser analisada compreendendo o material alvo, e a análise espetroscópica. A análise espetroscópica inclui espetrometria de absorção ótica, utilizando luz quasimonocromática, com comprimentos de onda na gama 350 - 420 nm ou 600 - 640 nm. O método permite detetar uma concentração de hemozoína inferior a 0,1 pg/mL na amostra, preferencialmente inferior a 0,08 gg/ml. O documento de patente citado, ao analisar o comportamento ótico da Hz em zonas de menores comprimentos de onda, implica uma fase de separação magnética (aplicando campos magnéticos) da Hz do sangue total lisado, para remover o efeito da absorção do sangue nessas regiões do espetro, assim como uma fase de dissolução numa solução aquosa com um agente alcalino. A presente invenção utiliza regiões do espetro não afetadas pela absorção ótica do sangue (baseando-se na presença de um pico de absorção da Hz em torno dos 670 nm) , implicando menos passos no processo e eliminando a necessidade de separar magneticamente o sangue, podendo utilizar sangue total.

[0011] Os documentos de patente US8388509B2, US8467842B2 e US8840536B2 descrevem sistemas, dispositivos e métodos para, entre outras aplicações, detetar Hz, assim como para diagnosticar, monitorizar ou tratar uma infeção de malária. Os sistemas incluem sensores para deteção de uma resposta multi-harmónica não linear associada às nanoparticuias de Hz num tecido biológico sujeito a um estímulo de energia eletromagnética (com picos de comprimento de onda entre 690 nm e 2100 nm) . O sensor é configurado para detetar uma resposta não linear usando uma ou mais configurações diferenciais de iluminação (Darkfield Illumination, Rheinberg). A resposta da energia associada às nanopartículas de Hz é comparada com um perfil de resposta de referência. A presente invenção recorre a métodos de iluminação diferentes dos documentos de patente citados, uma vez que recorre preferencialmente a díodos emissores de luz (LEDs), podendo também ser usados díodos laser. Adicionalmente, os documentos citados detetam uma resposta não linear da dispersão das nanopartículas de Hz, enquanto a presente invenção mede a absorção ótica da Hz. Estes documentos utilizam métodos muito mais complexos e dispendiosos do que o dispositivo de acordo com a presente divulgação, que utiliza a análise espetrofotométrica por absorção ótica como método de deteção.

Descrição Geral

[0012] A presente divulgação compreende um dispositivo e respetivo método de deteção/quantificação de Hz em amostras de sangue total, baseado em espetrofotometria, capaz de detetar concentrações baixas de Hz em amostras de sangue, nomeadamente a partir de concentrações de 1 pg/ml ou inferiores. Com este dispositivo não é necessário existirem amostras de controlo, é rápido, elimina a subjetividade associada à interpretação dos resultados por parte dos técnicos e é simples, uma vez que elimina a necessidade de reagentes e as amostras de sangue total não necessitam de ser sujeitas a centrifugação ou incubação a temperatura controlada.

[0013] A presente divulgação distingue-se de outras abordagens ao identificar, ín-sítu e sem necessidade de reagentes, a presença e quantidade de Hz através de espetrofotometria de absorção ótica, com o objetivo de detetar, daí, a presença de parasitas da malária e o seu estádio, utilizando para tal comprimentos de onda específicos nos espetros de absorção do sangue total como um marcador importante desta doença. Além disso, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende um sistema de calibração importante, não só para a correta medição, mas garantindo também que as diminuições da capacidade da iluminação dos LEDs ou díodos laser devidas ao desgaste dos componentes eletrónicos ao longo da respetiva vida útil sejam desprezáveis. Esta calibração permite ainda que o dispositivo não seja afetado por variações de temperatura que poderiam alterar o desempenho dos componentes eletrónicos. Quando comparado com os RDTs, esta divulgação, por permitir detetar a intensidade do pico de Hz, apresenta a vantagem de identificar o estádio da doença. Além disso, tirando vantagem das tecnologias on-chíp, este método, quando comparado com a microscopia, permite detetar a infeção sem necessidade de técnicos especializados, reduzindo a taxa de erro e produzindo resultados muito rapidamente. Quando comparado com a PCR, a deteção por espetrofotometria permite a utilização de amostras de sangue total, sem necessidade de processamento (centrifugação/ separação) de amostras ou reagentes. Em relação a outros métodos óticos, a solução proposta tem caracteristicas técnicas distintivas, referidas ao longo da presente descrição e das reivindicações, que resultam na vantagem de implicar menos instrumentação, reduzindo o custo e a complexidade do dispositivo e conferindo-lhe portabilidade.

[0014] O dispositivo combina os poços para as amostras fluidicas com: um sistema de emissão ótica, compreendido por LEDs ou díodos laser e eletrónica de atuação; com um sistema de deteção ótico, compreendido por fotodetetores, pela eletrónica de leitura e por um microcontrolador; e com um sistema de alimentação.

[0015] O princípio de funcionamento baseia-se na deteção por absorção ótica da Hz e da Hb e num algoritmo que correlaciona os seus valores. A luz nos comprimentos de onda específicos atravessa a amostra. A intensidade da luz, transmitida através da amostra fluídica, é proporcional à concentração da biomolécula em análise, e é medida por um fotodetetor colocado por baixo da câmara/poço de deteção. Um algoritmo relaciona os valores da absorvência em cada um dos comprimentos de onda considerados. A existência de um pico de absorção na região próxima dos 670 nm é indicativa da presença de Hz na amostra.

[0016] Numa realização, o sistema pode compreender 6 poços para amostra, 6 LEDs ou 6 díodos laser e 6 fotodíodos, todos espaçados entre si (na direção horizontal) a uma distância igual, de modo a assegurar o alinhamento ótico entre os componentes, e encapsulados de modo a garantir o isolamento ótico do sistema em relação ao exterior, pelo que o dispositivo deverá ter cor escura para evitar a entrada de luz externa no dispositivo. Numa configuração diferente, o sistema pode conter um número inferior do conjunto poços/LEDs ou díodos laser/fotodíodos, desde que no mínimo contenha 3 de cada, em torno da região dos 670 nm.

[0017] Numa realização, os poços para as amostras são transparentes, podendo ser fabricados num material como polidimetilsiloxano (PDMS), vidro, quartzo, acrílico, poliestireno, entre outros, de modo a assegurar a passagem da luz.

[0018] Numa realização, os poços podem ter fundo plano para a reflexão ótica não afetar as medições óticas, podendo, no entanto, ter qualquer formato. Os poços deverão ter ainda um diâmetro ou dimensão de base (se não for circular) igual ou superior à área fotossensível do fotodíodo, de modo a não afetarem as medições óticas e um caminho ótico superior a 3 mm.

[0019] Numa realização, os LEDs ou díodos laser podem ser circulares, com diâmetro igual ou inferior à área sensível do fotodíodo, e cada LED ou díodo laser emite uma gama de comprimentos de onda específicos, preferencialmente em torno das regiões: 567 nm, 591 nm, 617 nm, 623 nm, 670 nm, 721 nm, de modo a permitir informação de diferentes regiões da zona visível do espetro ótico, para a construção de um algoritmo de decisão que permita a distinção entre presença ou ausência de um pico de absorção de Hz. A escolha da gama dos comprimentos de onda de interesse foi efetuada após a realização de testes experimentais com um sistema espetrofotométrico comercial, e teve em conta as propriedades óticas do sangue, em particular os picos de absorção da Hb, e ainda a alteração das propriedades óticas do sangue total com a presença de Hz (Figura 4). No entanto, noutras configurações, diferentes comprimentos de onda nestas gamas podem ser utilizados, focando sempre no pico de absorção de Hz nos 670 nm.

[0020] Assim, em cada comprimento de onda, a intensidade de luz detetada pelo fotodiodo é dependente das caracteristicas da amostra: quantidade de Hb e presença e quantidade de Hz.

[0021] Numa realização, os feixes de luz produzidos pelos LEDs ou díodos laser incidirão sobre as amostras fluídicas nos poços e serão detetados pelos fotodíodos, o que implica o alinhamento entre o feixe de luz, a amostra e os detetores, sendo o sistema controlado por um microcontrolador que define qual o LED ou díodo laser em funcionamento e por conversores corrente-tensão, de forma a produzir um valor de tensão proporcional à corrente gerada pelos fotodíodos, e que possa ser adquirido pelo ADC (Conversor Analógico Digital) do microcontrolador.

[0022] Numa realização, o sistema de calibração garante não só a correta medição mas também que as diminuições da capacidade da iluminação dos LEDs ou díodos laser devidas ao desgaste dos componentes eletrónicos ao longo da respetiva vida útil sejam desprezáveis. Esta calibração permite ainda que o dispositivo não seja afetado por variações de temperatura que poderiam alterar o desempenho dos componentes eletrónicos.

[0023] Numa realização, o microcontrolador recebe os valores de tensão para cada um dos seis poços de teste e, tendo por base os valores de referência (ou seja, os valores obtidos apenas com os poços com água aquando da fase de calibração do sistema), calcula os valores discretos de absorvência (ou densidade ótica) através da lei de LambertBeer. Após o cálculo dos valores da absorvência, o microcontrolador executa um algoritmo de decisão, de modo a classificar a amostra como contendo ou não Hz (indicando assim a presença ou ausência do marcador dos parasitas da malária). Na presença de Hz, existe um pico de absorvência em torno dos 670 nm, pelo que o algoritmo se baseia na variação entre os valores de absorvência nos comprimentos de onda analisados.

[0024] De um modo mais especifico, após o cálculo da absorvência (ABS) da amostra nos comprimentos de onda 567 nm, 591 nm, 617 nm, 623 nm, 670 nm e 721 nm, é executada a seguinte sequência de passos do algoritmo:

1) cálculo das diferenças ou quocientes entre a absorvência da amostra em vários comprimentos de onda, incluindo: relação entre a absorvência no pico de 670 nm e um ou mais comprimentos de onda superiores a este; relação entre a absorvência aos 670 nm e um ou mais comprimentos de onda inferiores a este; relação entre a absorvência em vários comprimentos de onda inferiores a 670 nm para auxiliar na reconstrução do espetro.

2) uma diferença positiva, acima de um limite (do inglês threshold) definido numa gama entre 0,002 e 0,005, ou um quociente superior a 1 indica um declive positivo (ou seja, aumento da absorvência entre os comprimentos de onda), podendo representar a subida para um pico de absorção, enquanto uma diferença negativa, com valor absoluto acima de um limite (do inglês threshold) definido numa gama entre 0,002 e 0,005, ou quociente inferior a 1 indica a diminuição da absorvência entre os comprimentos de onda.

3) a presença de Hz é detetada por um aumento da absorvência em torno dos 670 nm, em relação aos comprimentos de onda vizinhos. As diferenças e quocientes entre os comprimentos de onda mais baixos representam a variação típica do espetro de absorção ótica da Hb, e por isso representativas do espetro ótico do sangue total, auxiliando a deteção da presença dos picos. Estas diferenças e os limites (do inglês thresholds) para comparação foram determinadas previamente através de testes experimentais.

[0025] Numa realização, uma vez feita a leitura dos dados, comparação e decisão, o sistema enviará a informação para o ecrã (dísplay), comunicando com o utilizador. O resultado de teste é apresentado no ecrã do microcontrolador, fornecendo assim em tempo real a informação ao utilizador. O ecrã pode ser tátil ou não, e a informação do teste (utilizador e resultado do teste) pode ser armazenado num cartão de memória e/ou transmitido para um computador por comunicação em série ou através de um sistema sem fios, ou por USB, entre outros.

[0026] Mais ainda, o algoritmo baseia-se na medição de valores de absorção ótica numa gama espectral mais alargada, considerando a correlação entre seis valores espectrais, o que permite uma maior fiabilidade do estádio da malária. Para além disso, utiliza LEDs ou díodos laser como fonte de luz e fotodíodos alinhados com os LEDs ou com os díodos laser como fotodetetores, eliminando a necessidade de filtros óticos e lentes.

[0027] Um dos aspetos da presente realização descreve, um dispositivo portátil para deteção e/ou quantificação de hemozoína por espetrofotometria de absorção ótica numa amostra líquida de um paciente que compreende meios para colocação de três amostras;

meios para isolar oticamente a amostra do exterior;

pelo menos três emissores de espetrofotometria independentes para excitar cada amostra, em que o primeiro emissor emite a um comprimento de onda de aproximadamente 670 nm, o segundo emissor que emite a um comprimento de onda superior a 670 nm, e o terceiro emissor que emite a um comprimento de onda entre 620 - 670 nm;

pelo menos três detetores óticos para detetar a absorvência de cada amostra;

em que os emissores, detetores e os meios para a colocação da amostra estão alinhados;

meios para a calibração dos emissores, e um microcontrolador capaz de calcular a relação entre a absorvência de cada amostra de forma a detetar o pico de absorção.

[0028] Numa realização, o referido dispositivo pode compreender um emissor adicional, respetivo detetor ótico e meio para a colocação de amostra.

[0029] Numa realização, o referido dispositivo pode compreende quatro, cinco, ou seis emissores, respetivos detetores óticos e meios para a colocação da amostra.

[0030] Numa realização, o dispositivo compreende meios de calibração para uniformizar a intensidade de cada emissor à intensidade inferior emitida.

[0031] Numa realização, o dispositivo compreende meios para a colocação da amostra que compreendem um suporte para colocação de amostras líquidas entre os emissores e os detetores.

[0032] Numa realização, o suporte compreende poços.

[0033] Numa realização, os poços estão equidistantes, isto é, a uma distância igual.

[0034] Numa realização, os poços são transparentes. De preferência, os poços compreendem materiais como polidimetilsiloxano (PDMS), vidro, quartzo, acrílico, poliestireno, ou suas combinações.

[0035] Numa realização, os poços têm fundo plano.

[0036] Numa realização, a área da base dos poços é igual ou superior à área fotossensível do detetor ótico.

[0037] Numa realização, os emissores óticos são LEDs, díodos laser, ou suas combinações.

[0038] Numa realização, os emissores óticos são circulares com diâmetro igual ou inferior à área sensível do fotodíodo.

[0039] Numa realização, cada emissor emite uma gama de comprimentos de onda específicos.

[0040] Numa realização, cada um dos emissores emite numa gama de comprimento de onda em torno de: 567 nm, 591 nm, 617 nm, 623 nm, 670 nm, 721 nm.

[0041] Numa realização, o dispositivo compreende ainda uma fonte de alimentação. De preferência, a fonte de alimentação é uma pilha, uma bateria, ou suas combinações.

[0042] Numa realização, a amostra é sangue, em particular sangue do mesmo paciente. De preferência, a amostra de sangue é diluída, em particular com água, soro fisiológico, dextrano ou suas misturas.

[0043] Numa realização o dispositivo compreende ainda um ecrã para apresentação de resultados e/ou uma entrada para um dispositivo de memória, por exemplo um cartão de memória.

[0044] A presente divulgação diz ainda respeito a um método para deteção e/ou quantificação de hemozoína por espetrofotometria de absorção ótica numa amostra líquida de um paciente que compreende os seguintes passos:

determinar a absorvência de uma amostra a:

um comprimento de onda de aproximadamente 670 nm, um comprimento de onda superior a 670 nm, e a um terceiro comprimento de onda entre 620 670 nm;

calcular a relação entre a absorvência de cada amostra de forma a detetar o pico de absorção.

[0045] Numa realização, o sistema apresentado permite a deteção de Hz em amostras de sangue total através da variação dos valores de absorvência das amostras em até seis comprimentos de onda, sem necessidade de amostra de controlo, e utilizando apenas um conjunto de poços descartável. O sangue não necessita de processamento anterior complexo, bastando ser diluído em água, soro ou dextrano.

[0046] Numa realização, o dispositivo é portátil, compreendido por duas placas PCB (placa de circuito impresso, do inglês Printed Circuit Board) posicionadas paralelamente, uma superior de emissão com o conjunto de seis LEDs ou díodos laser e circuitos eletrónicos para controlar, baseado num controlo PWM (modulação por largura de pulso), qual o LED ou díodo laser em funcionamento em cada momento, e uma inferior com os fotodíodos e os conversores corrente-tensão, havendo transmissão de luz na vertical através dos poços.

[0047] Numa realização, outras configurações são também viáveis (sistema de leitura na parte superior ou mesmo passagem de luz na horizontal, sendo necessário neste caso poços com diferentes geometrias). A configuração escolhida necessita de garantir o alinhamento entre o feixe de luz, a amostra e os fotodíodos. O dispositivo pode ser utilizado em qualquer ambiente, uma vez que não é afetado por luminosidade externa. Esta caracteristica deve-se à construção do dispositivo (o isolamento total à luz da lâmina de análise).

A lâmina de análise está isolada devido à cor preta do seu suporte, concebido para assegurar o isolamento total relativamente à luz ambiente e à dispersão da luz vinda da placa de iluminação.

[0048] Numa realização, como alternativa à utilização de LEDs ou díodos laser, o dispositivo pode incluir luz branca convencional com filtros óticos passa-banda para cada um dos comprimentos de onda de interesse, que poderão ser colocados sobre ou sob os poços das amostras de teste.

Breve descrição das figuras

[0049] Para uma mais fácil compreensão da presente divulgação juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente divulgação.

[0050] A figura 1 representa a placa ou lâmina (1) com cada um dos poços (2) para a colocação das amostras no sistema.

[0051] A figura 2 representa a disposição dos componentes eletrónicos em que (3) corresponde ao sistema de iluminação, (4) ao sistema de deteção ótico (posicionado sob o suporte para as amostras e alinhado com este e com o sistema de iluminação), (5) ao conjunto de seis LEDs ou díodos laser e (6) aos fotodíodos.

[0052] A figura 3 apresenta os esquemas das placas de circuito impresso do sistema de iluminação ótico (7) e do sistema de deteção ótico (8) do dispositivo.

[0053] A figura 4 apresenta três curvas medidas num equipamento espetrofotométrico comercial: espetro de absorção da hemoglobina (diluída em água numa concentração de 1 g/L) na região visível do espetro ótico, sem hemozoína, e espetros de absorção da hemozoína na região visível do espetro ótico, quando misturada nas concentrações de 0,1 g/L e 0,25 g/L com amostras de hemoglobina de concentração 1 g/L.

[0054] A figura 5 representa cinco análises espetrofotométricas com o dispositivo proposto, uma amostra sem hemozoina e quatro soluções de hemozoina nas concentrações de 1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pl/mL e 20 pg/mL.

[0055] A figura 6 representa um exemplo de um dispositivo, em que (9) corresponde à embalagem, de cor preta para um melhor isolamento da luz, (10) o suporte para a estrutura dos poços, (11) o display para apresentação de resultados e (12) a entrada de cartão de memória.

[0056] A figura 7 representa as curvas de calibração (corrente nos fotodíodos vs. duty-cycle aplicado nos LEDs).

[0057] A figura 8 representa um fluxograma de um algoritmo de calibração do sistema ótico.

[0058] A figura 9 representa um fluxograma de um algoritmo de decisão do dispositivo.

Descrição detalhada

[0059] A presente divulgação apresenta o dispositivo portátil e método para detetar a presença de hemozoina e a sua quantificação numa amostra fluídica, podendo esta ser de sangue total diluído, em tempo real e em qualquer lugar, por absorção ótica. O dispositivo combina num único sistema os poços das amostras, os LEDs ou díodos laser para emissão dos feixes de luz, a eletrónica de atuação, os fotodetetores, a eletrónica de leitura e a alimentação do sistema, sendo oticamente isolado do exterior para evitar a entrada de luz no sistema.

[0060] Numa realização, o dispositivo compreende componentes optoeletrónicos posicionados na zona superior e inferior do sistema, em que na zona superior estão até seis LEDs ou díodos laser em torno das regiões de absorção da hemoglobina e da hemozoína, preferencialmente em: 567 nm, 591 nm, 617 nm, 623 nm, 670 nm, 721 nm e circuitos eletrónicos de controlo com controlo PWM, e na zona inferior estão até seis fotodíodos, cada um orientado para um LED ou díodo laser, e conversores de corrente-tensão; uma placa de teste com até seis poços colocada entre o conjunto de LEDs ou díodos laser e os fotodíodos, em que cada poço se encontra alinhado paralelamente com um LED e um fotodíodo, de modo a que os feixes de luz transmitidos pelos LEDs incidam sobre as regiões de teste com as amostras; um microcontrolador para controlo dos componentes optoeletrónicos e para execução dos métodos de análise e interpretação dos valores obtidos pelos fotodíodos; um ecrã (do inglês dísplay) para visualização do resultado. Alternativamente, em vez dos LEDs ou díodos laser, o sistema pode incluir luz branca e filtros passa-banda centrados nos mesmos comprimentos de onda. A lâmina com os poços para as amostras deve ser fabricada num material transparente, como o vidro, quartzo ou materiais poliméricos, e cada poço pode apresentar fundo plano para evitar fenómenos de reflexão ótica.

[0061] O presente exemplo de utilização da invenção é demonstrativo, não se pretendendo limitar o âmbito da proteção.

[0062] Numa realização, a calibração é realizada antes de cada análise, o que permite que a análise seja realizada corretamente, independentemente das alterações no reagente ou no material do disco de análise, normalizando as medições óticas.

[0063] Numa realização, o primeiro passo do método para deteção da presença de hemozoína como marcador da presença de parasitas da malária, consiste na sua calibração, de modo a assegurar em todos os fotodíodos a mesma corrente para a amostra de referência (com água).

[0064] Numa realização, de forma a possibilitar a calibração do sistema ótico, e em consequência, a aplicação de um algoritmo de decisão baseado na deteção dos valores de absorvência de pico entre comprimentos de onda, a modelação por PWM é utilizada para todos os circuitos recetores receberem a mesma potência luminosa de cada LED, na presença de água (ou seja, a transmissão é máxima para todos os comprimentos de onda quando comparada com o sangue) . Esta forma torna viável calcular a transmitância e a respetiva absorvência na presença de sangue, que varia para os comprimentos de onda de interesse, de acordo com a presença de Hb e Hz. De uma forma geral, com a variação do duty cycle (DC) da onda quadrada gerada pelo microcontrolador, o valor médio aplicado à base do transístor varia e, como tal, a luminosidade recebida nos fotodíodos também varia proporcionalmente. Considerando os casos extremos, para um DC de 0%, o LED encontra-se desligado, e para um DC de 100%, o LED transmite nas suas condições nominais. Para a gama de percentagens entre estes extremos, é possível então variar linearmente a luminosidade transmitida. Para otimizar o processo de calibração, foi previamente encontrada uma curva linear para cada LED (Fig. 7) que relaciona o valor de DC aplicado ao LED com o valor lido nos fotodíodos, na presença de água (em poços cilíndricos com caminho ótico de por exemplo 5 mm ou 3 mm) . Desta forma, a calibração em tempo real poderá aceder à equação desta curva para estimar um valor de DC final para uma determinada corrente, sendo apenas necessário fazer pequenos ajustes em torno desse valor. Encontradas as curvas de transmissão de luminosidade de cada LED na água, a calibração final do sistema passa pela aplicação do algoritmo representado no fluxograma da Figura 8 .

[0065] Numa realização, o algoritmo da figura 8 apresenta a execução sequencial dos seguintes passos:

• Inicialização de estruturas de dados (vetores) para guardar os valores de calibração, a serem aplicados posteriormente na deteção;

• Leitura dos valores de corrente obtida nos fotodiodos nas condições nominais, i.e., aplicando um DC de 10 0 %;

• Obtenção do valor mínimo de corrente lida nos fotodiodos;

• Calibração do circuito ótico de cada LED com a variação do DC, e consequentemente, da intensidade luminosa transmitida, para obter nos fotodiodos o mesmo valor de corrente (mínimo encontrado).

Uma representação mais pormenorizada do último passo mencionado (4) encontra-se presente em (13) . Verifica-se assim que, para cada LED, é encontrada uma aproximação ao valor de DC correspondente à corrente mínima pretendida (a partir das curvas de calibração já mencionadas), com um pequeno ajuste deste valor para um intervalo de erro na saída de 0,5% relativamente ao valor de corrente desejado.

[0066] O sistema de calibração implementado garante não só a correta medição, mas também que as diminuições da capacidade da iluminação dos LEDs devidas ao desgaste dos componentes eletrónicos ao longo da respetiva vida útil sejam desprezáveis. Esta calibração permite ainda que o dispositivo não seja afetado por variações de temperatura que poderiam alterar o desempenho dos componentes eletrónicos.

[0067] Numa realização, para melhores resultados a calibração é realizada antes de cada análise, ou quando as condições de análise são alteradas, permitindo que a análise seja realizada corretamente, independentemente das alterações no material do disco de análise, normalizando as medições óticas:

- colocar em cada um dos poços de teste 100 pL de água e colocar esta lâmina num encaixe específico no dispositivo, ficando as regiões de teste paralelas ao conjunto LEDs ou díodos laser/fotodíodos e ativar o sistema de forma a que cada LED ou díodo laser emita o feixe de luz, que será recebido por um fotodíodo e convertido num valor de tensão, que será lido pelo microcontrolador.

- determinar qual o fotodíodo que recebeu menor corrente do LED ou díodo laser e selecioná-lo como conjunto LED ou díodo laser/fotodíodo de referência.

- através de um sinal modulado por largura de pulso (PWM) ajustar a razão cíclica para diminuir a tensão média em cada um dos restantes LEDs ou díodos laser até a corrente em todos os fotodíodos ser semelhante, quando a amostra nos poços é água.

- guardar os valores da calibração.

[0068] Seguidamente, após o processo de calibração, ou seja, depois de ajustar os LEDs ou díodos laser para que, com água nos poços, a corrente gerada em cada fotodíodo seja igual, procede-se à análise das amostras, de acordo com os passos:

- a amostra fluídica, que consiste em 100 pL de volume de sangue total diluído (onde se pretende detetar a presença de hemozoína), é colocada em cada um dos poços de teste, e esta lâmina é colocada num encaixe específico no dispositivo, ficando as regiões de teste paralelas ao conjunto LEDs/fotodiodos.

o sistema é novamente ativado e os LEDs emitem sequencialmente um feixe de luz que atravessa a amostra até aos fotodiodos.

cada fotodiodo capta a intensidade de luz que atravessa o poço da amostra e gera uma corrente elétrica que é proporcional à quantidade de luz recebida (cujo valor depende da presença de sangue e de hemozoína na amostra) e é convertida numa tensão pelo bloco de conversão corrente-tensão.

o microcontrolador calcula a absorvência para a amostra em cada um dos comprimentos de onda dos LEDs, através da Lei de Lambert-Beer tendo em conta os valores de tensão de referência no passo de calibração.

o microcontrolador executa a classificação das amostras, em particular o microcontrolador executa a classificação das amostras recorrendo ao algoritmo apresentado na Figura 9: as diferenças ou quocientes entre os valores de absorvência entre os diferentes comprimentos de onda são determinadas, de modo a determinar a presença de picos de absorção, principalmente em torno dos 670 nm. Se o cálculo das diferenças ou quocientes dos valores de absorvência ótica indicar a presença de um pico de absorção na região dos 670 nm, a amostra é classificada como contendo hemozoína, se este pico não existir então não está presente hemozoína.

os resultados são visualizados no ecrã do dispositivo, ou armazenados num cartão de memória e/ou transmitidos para um computador por comunicação série ou através de um sistema sem f ios.

[0069] Numa realização, a figura 5 apresenta o resultado obtido para várias amostras com e sem hemozoina, usando o dispositivo. Como pode ser observado, uma amostra sem hemozoina não apresenta pico de absorvência nos 670 nm, enquanto as amostras de sangue com hemozoina (nas concentrações testadas de 1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL e 20 pg/mL) apresentam picos nesta região, tão mais significativos quanto maior a concentração de hemozoina na amostra.

[0070] Numa realização, a figura 6 representa o exemplo do desenho de um dispositivo final, sendo as dimensões ajustáveis, que compreende o suporte para a estrutura dos poços e o ecrã para apresentação de resultados. 0 suporte para o encaixe da estrutura dos poços fica a meia altura do dispositivo e funciona como uma gaveta que encaixa nas paredes do dispositivo, permitindo fixar as amostras e garantindo o alinhamento com os componentes optoelectrónicos. As placas PCB - Figura 3 - ficam na parte superior e inferior do suporte, consoante a configuração desejada. No topo do dispositivo encontra-se o microcontrolador, acoplado ao ecrã, havendo ainda um espaço disponível para a bateria de alimentação do sistema. A embalagem deve ter cor preta e não possuir entradas de luz para assegurar o isolamento ótico e garantir que a luz externa não afeta as medições.

[0071] Ao longo da descrição e reivindicações a palavra compreende e variações da palavra, não têm intenções de excluir outras caracteristicas técnicas, como outros componentes, ou passos. Objetos adicionais, vantagens e caracteristicas da invenção irão tornar-se evidentes para os peritos na técnica após o exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção.

[0072] Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos como forma de ilustrar, e não têm a intenção de serem limitativos da presente invenção. Além disso, a presente invenção abrange todas as possíveis combinações de formas de realização particulares ou preferenciais aqui descritas.

[0073] Ainda que na presente divulgação se tenham somente representado e descrito realizações particulares da mesma, o perito na matéria saberá introduzir modificações e substituir umas características técnicas por outras equivalentes, dependendo dos requisitos de cada situação, sem sair do âmbito de proteção definido pelas reivindicações anexas.

[0074] As realizações apresentadas são combináveis entre si.

[0075] As seguintes reivindicações definem realizações adicionais.

Claims (21)

1. Dispositivo portátil para deteção e/ou quantificação de hemozoina por espetrofotometria de absorção ótica numa amostra líquida de um paciente caracterizado por compreender: meios para colocação de pelo menos três amostras (1); meios para isolar oticamente a amostra do exterior (9); pelo menos três emissores de espetrofotometria independentes para excitar cada amostra (5), em que o primeiro emissor emite a um comprimento de onda de aproximadamente 670 nm, o segundo emissor que emite a um comprimento de onda superior a 670 nm, e o terceiro emissor que emite a um comprimento de onda entre 620 - 670 nm;

pelo menos três detetores óticos (6) para detetar a absorvência de cada amostra;

em que os emissores, detetores e os meios para a colocação da amostra estão alinhados (4);

meios para a calibração dos emissores, e um microcontrolador capaz de calcular a relação entre a absorvência de cada amostra de forma a detetar o pico de absorção.

2. Dispositivo portátil de acordo com a reivindicação anterior em que o referido dispositivo compreende um emissor adicional, respetivo detetor ótico e meio para a colocação de amostra.

3. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o referido dispositivo pode compreender quatro, cinco, ou seis emissores, respetivos detetores óticos e meios para a colocação da amostra (4) .

4. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que compreende meios de calibração para uniformizar a intensidade de cada emissor à intensidade inferior emitida.

5. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que compreende meios para a colocação da amostra que compreendem um suporte para colocação de amostras líquidas entre os emissores e os detetores (10).

6. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o suporte compreende poços (2).

7. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os poços estão equidistantes.

8. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os poços são transparentes.

9. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os poços compreendem materiais como polidimetilsiloxano (PDMS), vidro, quartzo, acrílico, poliestireno, ou suas combinações.

10. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os poços têm fundo plano.

11. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a área da base dos poços é igual ou superior à área f otossensível do detetor ótico.

12. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os emissores óticos são LED (5), díodos laser, ou suas combinações.

13. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que os emissores óticos são circulares com diâmetro igual ou inferior à área sensível do fotodíodo (6).

14. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que cada emissor emite numa gama de comprimentos de onda específicos.

15. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que cada um dos emissores emite numa gama de comprimento de onda em torno de: 567 nm, 591 nm, 617 nm, 623 nm, 670 nm, 721 nm.

16. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que compreende ainda uma fonte de alimentação.

17. Dispositivo portátil de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a fonte de alimentação é uma pilha, uma bateria, ou suas combinações.

18. Dispositivo para deteção de hemozoina por espetrofotometria de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a amostra é sangue, em particular sangue do mesmo paciente.

19. Dispositivo para deteção de hemozoina por espetrofotometria de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a amostra de sangue é diluída, em particular com água, soro fisiológico, dextrano ou suas misturas.

20. Dispositivo para deteção de hemozoina por espetrofotometria de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores contendo um ecrã para apresentação de resultados (11) e/ou uma entrada para um cartão de memória (12).

21. Método para deteção e/ou quantificação de hemozoína por espetrofotometria de absorção ótica numa amostra líquida de um paciente que compreende os seguintes passos:

i) determinar a absorvência de uma amostra a:

um comprimento de onda de aproximadamente 670 nm, um comprimento de onda superior a 670 nm, e um terceiro comprimento de onda entre 620 670 nm;

ii) calcular a relação entre a absorvência de cada amostra de forma a detetar o pico de absorção.