PT1173603E - Indicadores biológicos para validação de um processo de esterilização contra priões - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "INDICADORES BIOLÓGICOS PARA VALIDAÇÃO DE UM PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO CONTRA PRIÕES"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO (a) Campo da Invenção A invenção refere-se a um método de controlo de um processo de esterilização, que compreende os passos de medição do grau de degradação de um indicador de degradação de uma proteína prião quando exposto a diferentes processos de esterilização. (b) Descrição da Técnica Anterior
Os indicadores biológicos são considerados essenciais para avaliar a eficácia de qualquer processo de esterilização uma vez que os monitores químicos e físicos não são completamente fiáveis. Estes últimos são úteis para detectar a esterilização geral, mas são absolutamente necessários ensaios de esporos para qualquer garantia de esterilização uma vez que são mais resistentes ao calor do que os vírus e bactérias vegetativas. Os indicadores biológicos são normalmente compostos por esporos bacterianos de Bacillus stearothermophilus (para autoclaves e esterilizadores por vapor químico) ou Bacillus subtilis (para esterilizadores por calor seco e óxido de etileno) que são removidos depois do tratamento de esterilização e incubados à temperatura apropriada para observar qualquer crescimento 1 microbiano (Dental Products Report, Outubro 1995, pp. 96-104). Contudo, hoje em dia, os esporos bacterianos já não são as formas de vida mais resistentes desde a descoberta dos priões. A proteína Sup35 (aqui referida como Sup35p) transportando [PSI+] é uma proteína semelhante a prião devido às suas notáveis semelhanças com priões. De facto, o terminal N da Sup35p é insolúvel em detergentes não iónicos e parcialmente resistente à acção de proteases. Além disso, forma principalmente filamentos amilóides anormais constituídos sobretudo por folhas β, ao contrário da isoforma normal da proteína formada sobretudo por hélices α (Glover, J. R., Kowal, A. S. et al., Cell (1997) 89:811-819 ; King, C., Tittmann, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 94:6618-6622). A acumulação intracelular destes filamentos de prião anormais é responsável pela indução de encefalopatias espongiformes transmissíveis tanto em animais como em humanos, e daí a importância da degradação dos filamentos para impedir qualquer transmissão iatrogénica da doença. Foram descritos vários casos de contaminação iatrogénica devidos à utilização de equipamento médico contaminado, tal como eléctrodos de EEG, que tinham estado previamente em contacto com doentes de Creutzfeld-Jakob e inadequadamente esterilizados (Jarvis, W. R. Hospital Infection Control (1985) 12(12):145-148). Uma vez que também permanece a possibilidade de contaminação do sangue, que ainda não foi excluída, a maioria dos instrumentos médicos entram na categoria de estar em risco de estarem contaminados, mas isso a níveis diferentes dependendo da história específica do doente. A indisponibilidade de indicadores de esterilização para atestar a degradação de priões torna os dispositivos desadequados e até perigosos para utilização múltipla. Até à 2 data, a maioria dos paises adoptou requisitos semelhantes para a esterilização de instrumentos contaminados. Os processos recomendados para esterilização de instrumentos médicos utilizados em doentes de alto risco é a incineração de qualquer equipamento descartável que tenha estado em contacto com um doente ou, no minimo, a sua imersão em hidróxido de sódio 1 N, que é muito corrosivo para instrumentos metálicos, ou autoclavagem a 132 °C/1 atm de pressão durante uma hora (Rosenberg, R. N. et al., Annals of Neurology (1986) 19(1) :7 5 — 7 7; Galtier, F-, J. Pharm. Clin. (1994) 13:317-9) que pode deformar materiais termossensiveis tais como polímeros.
Está descrito na patente dos Estados Unidos N° 5633349 um método para a inactivação de priões, vírus e outros agentes infecciosos, que podem estar presentes num material biológico em bruto (e. g., plasma para a preparação de albumina), deixando o produto biológico desejado (e. g., BSA, HSA) intacto. Contudo, seria altamente desejável dispor de um método para avaliação da eficácia de um processo de esterilização.
Seria altamente desejável dispor de um novo indicador da degradação de priões e, portanto, da esterilização completa de dispositivos médicos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A solução reside portanto no desenvolvimento deste novo indicador de esterilização, baseado na proteína Sup35, que asseguraria que todos os dispositivos médicos são completamente esterilizados e adequados para utilização comprovando a degradação de priões. Este indicador poderia ser utilizado para qualquer processo de esterilização vulgarmente utilizado, bem 3 como para novas técnicas tais como, por exemplo, esterilizadores de gás plasma a baixa temperatura ou à base de ozono.
Um objecto da presente invenção é proporcionar um novo indicador da degradação de priões e consequentemente da esterilização completa de dispositivos médicos.
De acordo com a presente invenção é proporcionado um método de avaliação da eficácia de um processo de esterilização, que compreende os passos de: a) submeter uma quantidade suficiente de pelo menos um indicador da degradação da proteína prião num recipiente ao processo de esterilização; e b) determinar o grau de degradação do indicador 0 indicador pode ser seleccionado do grupo consistindo em proteína Sup35p, proteína Ure2p, proteína Het-s e as suas combinações. 0 indicador pode ser uma forma purificada de ocorrência natural em fungos, uma forma recombinante, um análogo, um mutante ou um fragmento do indicador. 0 indicador pode ser um indicador biológico, indicador bioquímico ou indicador químico.
Em aspectos particulares da invenção, a medição da degradação do indicador pode ser realizada por determinação do peso ou da massa, quantificação de radicais, variações colorimétricas, radiometria, nefelometria, método imuno-enzimático, transferência de Western, transferência por gota, teste radio-imunológico, dicroísmo circular, microscopia 4 electrónica, microscopia de fluorescência, FTIR, ligação de vermelho do Congo ou digestão com proteinase. 0 processo de esterilização pode ser realizado por autoclavagem, exposição quimica, calor seco, gás plasma a baixa temperatura, exposição à base de ozono ou técnicas de esterilização utilizando agentes de esterilização alquilantes e/ou oxidantes. A exposição quimica pode ser a um vapor ou uma solução seleccionados do grupo consistindo em detergente, óxido de etileno, protease, hidróxido de sódio e enzima. A quantidade de indicador exposto aos processos de esterilização pode ser entre 0,1 ng a 100 g. 0 recipiente pode ser de um material seleccionado do grupo consistindo em papel, vidro, borossilicato, metal, polímero, liga e compósito. O recipiente também pode ser poroso, permeável ou semi-permeável.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 ilustra a produção do segmento do terminal N de SUP35 recombinante expressa bacterianamente; A Fig. 2 ilustra a microscopia electrónica de transmissão do segmento do terminal N de Sup35 recombinante em diferentes soluções; A Fig. 3 ilustra a análise por dicroísmo circular da 5 proteína do terminal N de Sup35; A Fig. 4 ilustra o efeito de tratamentos em autoclave e com óxido de etileno sobre a integridade da proteína do segmento N de Sup35; e A Fig. 5 ilustra o efeito do tratamento com Sterrad® 100 sobre a integridade do segmento N de Sup35.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
De acordo com uma forma de realização da presente invenção, é proporcionado um novo indicador da degradação de priões e consequentemente da esterilização completa de dispositivos médicos.
Um aspecto particular da presente invenção é a utilização de [PSI+], um factor genético não mendeliano codificado pelo gene SUP35 da levedura Saccharomyces cerevisiae, e Het-s codificado por Podospora anserina, como indicadores da degradação de proteína prião na esterilização de dispositivos médicos e todos os outros aparelhos, superfícies ou bacias utilizados em processos cirúrgicos e cuidados de saúde.
Outra forma de realização da invenção é a utilização de indicadores de fertilização formados por Sup35p, Ure2p, Het-s, ou Psi que é muito simples de usar. O indicador pode estar em solução dentro de um frasco de vidro, pelo que o recipiente seria resistente a qualquer técnica de esterilização, seja ele autoclavado utilizando temperatura e pressão elevadas ou técnicas a baixa temperatura tais como plasma. Seriam utilizados tampões não desnaturantes tais como Tris/EDTA, TFA/acetonitrilo, 6 ou até ureia 2 M para manter a integridade dos filamentos de Sup35p. É conhecido que uma única unidade infecciosa de prião corresponde a 10^-10^ moléculas de PrP, ou 0,5-5 fg, que está abaixo do limite de detecção dos geles de SDS-PAGE (Hill, A. F., Antoniou, M. e Collinge, J., Journal of General Virology (1999) 80:11-14) .
Assim, noutra forma de realização da invenção, há prova de degradação de uma quantidade maior de proteína, tal como 10 pg, que assegura que ocorreu esterilização completa e portanto que o instrumento médico é seguro para reutilização. Isto baseia-se na consideração de que se há uma modificação estrutural da proteína, i. e. se a proteína sofre uma alteração de conformação ou degradação após a exposição a várias técnicas de esterilização, é tornada inactiva e consequentemente não infecciosa.
Além disso, por utilização de 10 pg de indicador, a invenção permite ser capaz de detectar facilmente qualquer degradação da proteína por geles de SDS-PAGE corados com Azul Brilhante de Coomassie por exemplo, uma técnica laboratorial corrente, uma vez que por este método pode ser detectado tão pouco como 0,1 pg de proteína (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1989).
Noutra forma de realização da invenção, a degradação ou alteração pode ser calculada por transferência de Western ou por transferência por gota utilizando um anticorpo contra a proteína marcada para calcular a ausência de ou um sinal de detecção modificado a ser produzido por qualquer alteração da proteína 7
Sup35 alvo. Além disso, a degradação do indicador também pode ser detectada por mudança de cor da solução, o que confirmaria a esterilização. Se necessário, também podem ser utilizadas técnicas tais como dicroismo circular, microscopia electrónica, microscopia de fluorescência, FTIV, ligação de Vermelho do Congo ou digestão com proteinase K para detectar a alteração de conformação da proteina esterilizada de folhas β para hélices a, evidenciando assim a degradação da proteina e consequentemente a sua inactivação.
Uma vez que os materiais utilizados para o indicador (frascos de vidro, soluções, etc.) são muito vulgares e baratos, o custo total de produção desse indicador é razoavelmente baixo. Torna-o portanto muito acessível a qualquer instituição, hospital ou indústria que o venha a adquirir para assegurar a segurança dos seus instrumentos médicos.
Numa forma de realização da invenção, o indicador de esterilização é rentável uma vez que todos os instrumentos podem ser testados e demonstrado serem seguros para reutilização, se e só se o indicador de esterilização demonstrar inactivação completa na sequência de um ciclo completo de esterilização. Os testes correntes de esporos não excluem completamente a possibilidade de proteínas residuais activas permanecerem na superfície dos dispositivos. Além disso, estas técnicas podem alterar a qualidade dos instrumentos, e assim a qualidade dos cuidados médicos prestados. A substituição de todos os instrumentos hipoteticamente contaminados seria de facto muito dispendiosa para os serviços médicos e no processo podem ser deitados foram instrumentos reutilizáveis por receio de contaminação.
MATERIAIS E MÉTODOS
Estirpes bacterianas
Para experiências de clonagem, utilizou-se em rotina a estirpe SURE de Escherichia coli (inVitrogen™) . Para expressão e purificação de proteínas, o plasmideo de expressão foi transformado na estirpe E. coli BL21 (pRep4) (Novagen).
Manipulações de ADN e purificação de proteínas
As técnicas de ADN correntes foram descritas anteriormente (Sambrook et al., 1989). A sequenciação de ADN foi realizada nos serviços de sequenciação de ADN do Instituto Armand Frappier (Montreal, Canadá). Os processos de expressão/purificação de proteínas foram realizados como descrito pelo fabricante (Clontech) .
Clonagem do domínio do terminal N de agregação de Sup35 num vector de expressão bacteriano A primeira região de 759 pb de Sup35 que codifica a região peptídica suficiente para agregação foi amplificada por PCR a partir de um clone genómico em pEMBLyex4 gentilmente cedido pelo Dr. Ter-Avanesyan (Moscovo, Rússia); (Glover. J. R., Kowal, A. S. et al., Cell (1997) 89:811-819). Foram utilizados os seguintes iniciadores: (a) 5'-AGTGGATCCTCGGATTCAAACCAAGGCAA-3' (que introduz um sítio de enzima de restrição BamHI, sublinhado), e (b) 5'-CGCGTCGACATCGTTAACACCTCCGTC-3' (que introduz um sítio de enzima de restrição Sall, sublinhado). 0 fragmento foi então clonado em pT7Blue3 (Perfectly Blunt Cloning Kit - Novagen) na estirpe SURE de E. coli (InVitrogen) . Os 9 clones positivos foram sequenciados para avaliar qualquer mutação ou deleção no gene. 0 N-segmento do gene Sup35 foi então excisado com BamHl e Sall e inserido no vector de expressão pQE30 (Qiagen) utilizando os mesmos sítios de restrição. Os clones positivos em pQE30 foram então transferidos em BL21 [pREP4] para expressão e purificação da proteína.
Expressão e purificação de proteínas
Os protocolos foram executados sobretudo de acordo com os fabricantes. A indução de 1 L de cultura bacteriana (ΟϋβοΟ de 0,8) foi feita utilizando IPTG (concentração final de 1 mM) durante uma hora à temperatura ambiente. As células foram recolhidas, ressuspensas em 50 mL de Tampão B (ureia 8 M, fosfato de Na 0,1 M, Tris HC1 0,01 M pH 8,0), sonicadas e centrifugadas a 10000 x g durante 15 min a 4 °C. O sobrenadante foi recolhido e aplicado num a coluna de Ni2+-NTA (resina de afinidade com metal TALON; Clontech) para cromatografia de afinidade utilizando um gradiente de pH com protocolo de purificação com ureia 8 M por desnaturação de Qiagen. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE (técnica de electroforese em gel utilizada para calcular o tamanho e a quantidade da proteína) e por transferência de Western utilizando um anticorpo anti-histidina de murganho (Qiagen) contra a cauda de 6-histidina presente no vector pQE30, de forma a detectar a proteína especificamente. Após separação das proteínas em SDS-PAGE e electrotransferência em nitrocelulose, a membrana foi incubada com o anticorpo primário (anti-HIS RGS, de Qiagen, 1:2000) em Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM (TBS) com leite magro a 5%, Tween 20 a 0,1% durante uma hora. Efectuou-se então 3 lavagens (10 minutos cada) com TBS com Tween 20 a 0,1%. A detecção foi realizada com o Kit BM Chemiluminescence utilizando 10 de rábano finalmente um anticorpo anti-murganho acoplado a peroxidase (1:4000) (Roche Diagnostics). As membranas foram expostas e reveladas em películas radiográficas.
Indução e análise de filamentos
Para induzir a formação de filamentos, efectuou-se uma diálise de 6 h a 12 h à temperatura ambiente da proteína (9 μΜ, em solução de ureia 8 M) contra uma solução de ureia 2 M, Tris-HC1 30 mM pH 8,0, NaCl 300 mM (referida como "ureia 2 M") ou uma solução de ácido trifluoroacético a 0,1%, acetonitrilo a 40% (referida como "TA") ou uma solução de Tris/EDTA (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, "TE").
Microscopia Electrónica de Transmissão (TEM)
Amostras (50 pL) da suspensão de filamentos foram sedimentadas por ultracentrifugação (178000 g, 20 min, Beckman Airfuge) em grelhas de cobre revestidas com carbono-Formvar (3 mm de diâmetro, 200 mesh). Estas grelhas foram então coradas negativamente por PTA (ácido fosfotúngstico) a 3% (p/v) e por acetato de uranilo a 2% (p/v) durante 1 minuto cada. As amostras foram então observadas utilizando um microscópio electrónico de transmissão Hitachi H-7100 a 75 kv. 11
Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD)
Os espectros de CD de uma suspensão de filamentos 9 μΜ (ureia 2 M) foram registados num espectropolarimetro Jasco J710 à temperatura ambiente utilizando uma célula com um passo de 0,05 cm. As amostras foram varridas com os seguintes parâmetros: velocidade de varrimento 100 nm/min; tempo de resposta: 0,25 s; acumulações: 3 (célula vazia), 5 (só tampão) e 10 (amostras de proteína); sensibilidade: 50 mgraus; comprimento de onda de partida: 260 nm; comprimento de onda final: 200 nm.
Ensaios de esterilização
Autoclavagem a 121 °C durante uma hora e Sterivac® (óxido de etileno) foram utilizados como controlos negativos; Sterrad® 100, que utiliza uma combinação de peróxido de hidrogénio e plasma gasoso como agentes esterilizantes foram utilizados como os processos experimentais. As amostras foram submetidas ou a um ciclo inteiro de cada processo ou só a um quarto de um ciclo, como foi o caso com ozono. A seguir a isto, foi avaliada a degradação de Sup35. Expôs-se 10 pg de proteína aos processos de esterilização descritos na Tabela 1. A degradação da proteína foi determinada por SDS-PAGE utilizando coloração com Nitrato de Prata e Azul de Coomassie bem como por micrografias de TEM (formação de filamentos) . Também se usou detecção imunológica utilizando quimioluminescência (descrita acima), após os processos de esterilização. 12
Tabela 1
Ciclos de esterilização utilizados para avaliação da degradação de Sup35 Processo de Agente Ciclo Tempo esterilização esterilizante necessário para um ciclo completo Autoclave Calor Temperatura: 121 °C Pressão: 1 atm 1 hora Sterivac®. 3M Óxido de (a) Temperatura: Aprox. 16 Etileno (OE) 134 °F (b) Tempo de pré-aquecimento: 30 min (c) Tempo de esterilização: 2 h 10 (d) Tempo de ventilação: 12 h horas Sterrad® 100, H2O2 e plasma (a) Vácuo (0,3 Aprox. Johnson and Johnson gasoso torr): 5-20 min (b) injecção de H2O2 a 58% + H2O: 6 min (c) difusão (0,5 torr): 44 min (d) plasma: 15 min 75-95 min 13
RESULTADOS
Purificação e caracterização de N-proteina SUP35 0 gene SUP35 codifica uma proteína associada ao ribossoma de 76,5 kDa. Contudo, foi demonstrado que só os primeiros 114 aminoácidos são suficientes para formação de filamentos (King, C., Tittmann, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 94:6618-6622). Foram utilizados iniciadores de ADN semelhantes aos já descritos (Glover. J. R., Kowal, A. S. et al., Cell (1997) 89 :811-819) para amplificar os primeiros 639 nucleótidos incluindo e a partir do codão de iniciação, utilizando um clone genómico fornecido pelo Dr. Ter-Avanesyan. Glover et al. (1997) demonstraram que o péptido resultante com o comprimento de 213 aminoácidos podia apresentar muitas características bioquímicas semelhantes aos priões. A proteína expressa, purificada em condições desnaturantes, tem um peso molecular aparente de 30 kDa, como calculado por análise por SDS-PAGE (Fig. 1, painel do lado esquerdo). A proteína expressa bacterianamente de cromatografia com purificação através de níquel (Materiais e Métodos) e amostras de proteína foram analisadas por SDS-PAGE e coloração com Azul de Coomassie (painel do lado esquerdo) e transferência de Western com um anticorpo contra o marcador 6XHIS (painel do lado direito) . Foi confirmada a identidade da proteína observada por coloração Coomassie do gel, utilizando um anticorpo produzido contra o marcador 6XHIS, que está presente na proteína expressa bacterianamente devido à sua incorporação na grelha na extremidade N do péptido (Fig. 1, painel do lado direito).
Para assegurar que a N-proteína SUP35 purificada se estava a comportar de modo análogo a priões, foi investigada a aptidão para sofrer agregação ordenada, formando filamentos semelhantes 14 a amilóides. Estes podem ser observados por microscopia electrónica de transmissão (MET). As imagens por MET da suspensão de proteína em ureia 8 M ou dialisada lentamente contra ureia 2 M ou solução de ácido trifluoroacético/acetonitrilo a 0,1%/(TE) a 40% e mantidas a 4 °C durante uma semana estão ilustradas na Fig. 2. A proteina produzida bacterianamente em ureia 8 M foi dialisada contra ureia 2 M, ácido trifluoroacético/acetonitrilo a 0,l%/40% de (TA) ou Tris-EDTA (TE) , mantida durante uma semana a 4 °C e processada para MET. (M refere-se ao marcador). De facto, a proteina Sup35 salvo em solução de ureia 8 M (mesmo durante semanas a 4 °C) tende a formar agregados facilmente observados por análise por MET.
Além disso, o envelhecimento extenso das soluções contendo Sup35p deve apresentar caracteristicas semelhantes a folhas β, com um único minimo de absorção diferencial próximo de 220 nm quando analisado por dicroismo circular. Como se pode observar na Fig. 3, é possível distinguir um espalhamento do pico da proteína em ureia 2 M (agregados ordenados) do enrolamento em espiral aleatório da Sup35 na solução de ureia 8 M. A partir destes resultados, conclui-se que a porção N da proteína Sup35 expressa bacterianamente se comporta como esperado e apresenta muitas caracteristicas bioquímicas semelhantes a priões.
Estabilidade de Sup35p a vários processos de esterilização A eficácia dos tratamentos de esterilização foi avaliada com base no seu impacto sobre a integridade da Sup35p. Amostras da proteína Sup35, mantidas em diferentes formas, foram processadas e então analisadas por SDS-PAGE e/ou transferência 15 de Western.
As requerentes são as primeiras a confirmar que a esterilização clássica em autoclave foi incapaz de destruir proteina Sup35 tal como sucede com priões. Não foi possivel recuperar proteína intacta a partir de Sup35 mantida em ureia 8 M (sem agregados) após autoclavagem enquanto que os filamentos da proteina Sup35 em TFA eram resistentes à degradação, como se observa por coloração com Coomassie da SDS-PAGE (Fig. 4, painel superior, proteína Sup35 em ureia 8 M ou em TA foi processada para esterilização e depois analisada quanto à integridade por SDS-PAGE. (U refere-se a amostras não tratadas e T a amostras tratadas)). Obteve-se resultados semelhantes quando as mesmas amostras foram expostas a óxido de etileno (Fig. 4, painel inferior). A partir destes resultados, conclui-se que os tratamentos em autoclave e com óxido de etileno são incapazes de degradar a proteína Sup35 agregada de forma ordenada.
Por outro lado, as proteínas em ureia 8 M e ureia 2 M foram degradadas por tratamento com Sterrad® 100 (processo oxidativo, que combina peróxido de hidrogénio e plasma gasoso) . Foi possível destruir os agregados da proteina em ureia 2 M por este tratamento. Os agregados da proteina em TA podiam contudo resistir ao processo de esterilização, como avaliado pela proteína intacta observada no gel corado com Azul de Coomassie (Fig. 5, painel superior, amostras de proteína Sup35 em ureia 8 M, ureia 2 M ou ácido trifluoroacético/acetonitrilo a 0,l%/40% (TA) foram processadas e a proteína intacta remanescente foi analisada por SDS-PAGE revelada por coloração com Azul de Coomassie (painel superior) ou análise por transferência de Western, com um anticorpo contra marcador 6XHIS (painel inferior). (U refere-se a amostras não tratadas, T a amostras tratadas, e * nos painéis de transferências de Western a Sup35p 16 intacta). Para aumentar a sensibilidade da técnica de detecção e assegurar que este tratamento podia de facto degradar os filamentos da proteína Sup35 em ureia 3 M, foi realizada análise por transferência de Western utilizando um anticorpo de detecção do marcador 6XHIS presente na extremidade N da proteína expressa bacterianamente (Fig. 5, painel inferior). Estas experiências mostram que o processo Sterrad® 100 pode degradar os agregados da proteína Sup35 mantida em ureia 2 Μ. A única resistência observada foi nas amostras de Sup35 colocadas em TA. Há duas explicações possíveis para estes resultados inesperados. Primeiro, pode ter havido uma interacção entre o ácido trifluoroacético/acetonitrilo e o peróxido de hidrogénio utilizado como o agente esterilizante nos sistemas Sterrad, que podia ter inibido o potencial oxidativo deste processo. Esta resistência acrescida também podia ter sido causada pela protonação da proteína pela solução de TA, que tornaria a proteína menos susceptível ao efeito oxidativo do peróxido de hidrogénio. As análises por MET de amostras em diferentes soluções para processos de esterilização utilizados neste estudo indicaram desintegridade da conformação de filamentos de Sup35. Estas observações confirmaram os resultados obtidos por outros métodos, tais como o método com Azul de Coomassie e por Transferência de Western como aqui descritos acima. A partir destes resultados, espera-se que outras técnicas de esterilização que utilizam agentes esterilizantes oxidativos, tais como esterilizadores à base de ozono, ácido peracético, etc. também sejam eficientes para alterar a proteína Sup35.
Lisboa, 10 de Agosto de 2007 17
Claims (7)
- REIVINDICAÇÕES 1. Método de avaliação da eficácia de um processo de esterilização, que compreende os passos de: a) submeter uma quantidade suficiente de pelo menos um indicador da degradação de proteína prião num recipiente ao referido processo de esterilização, em que o referido indicador é seleccionado do grupo consistindo em proteína SUP35, URE2, proteína HET-s ou sua combinação; e b) determinar o grau de degradação do referido indicador.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o passo b) é realizado por determinação do peso ou a massa, radicais quantificadores, variações colorimétricas, radiometria, transferência por gota, teste radio-imunológico, dicroísmo circular, microscopia electrónica, microscopia de fluorescência, FTIR, coloração com vermelho do Congo ou digestão com proteinase.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de esterilização é realizado por autoclavagem, exposição química, aquecimento a seco, exposição a plasma gasoso a baixa temperatura, exposição com base no ozono ou técnicas de esterilização utilizando agentes esterilizantes alquilantes e/ou oxidantes.
- 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a referida exposição química é uma exposição ao vapor ou solução seleccionada do grupo consistindo em detergente, óxido de 1 etileno, protease, hidróxido de sódio e enzima.
- 5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida quantidade de indicador do passo a) está entre 0,1 ng e 100 g.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido recipiente é de um material seleccionado do grupo consistindo em papel, vidro, borossilicato, metal, polímero, liga e compósito.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referido recipiente é poroso, permeável ou semi-permeável. Lisboa, 10 de Agosto de 2007 2
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