PT1289574E

PT1289574E - Processo para o cultivo de substituto de cartilagem e biomatriz preparada segundo este processo

Info

Publication number: PT1289574E
Application number: PT01953164T
Authority: PT
Inventors: Thomas Graeve; Michaela Noll; Markus Schandar
Original assignee: Arthro Kinetics Ag
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2007-09-10
Also published as: WO2001092473A2; WO2001092473A3; ES2356678T3; DE10026789A1; JP2003534792A; US20040030404A1; EP1792980B1; ES2287144T3; DE50115729D1; EP1289574B1; DE50112626D1; DE20019809U1; EP1792980A1; CA2410944A1; CY1106821T1; ATE364408T1; EP1289574A2; ATE490461T1; EP1792980A3; DE10026789B4

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA O CULTIVO DE SUBSTITUTO DE CARTILAGEM E BIOMATRIZ PREPARADA SEGUNDO ESTE PROCESSO" A invenção refere-se a processos para o cultivo de células de cartilagem diferenciadas e desdiferenciadas, a um substituto de cartilagem, a uma biomatriz, a um sistema célula-matriz-cartilagem, bem como a processos para a sua preparação.

As enfermidades das articulações constituem uma doença largamente difundida e associada com uma multiplicidade de incómodos para as pessoas afectadas. Os defeitos do osso e da cartilagem desempenham assim um papel central no caso da patogénese da artrose, mas também no caso de estados pós-traumáticos e de próteses internas desapertadas. Os defeitos deste tipo podem ser tratados pelo emprego de ossos ou cartilagens autólogos ou homólogos, ou de materiais de substituição correspondentes. Enquanto que os materiais autólogos não estão disponíveis ilimitadamente, no caso dos transplantes homólogos têm de se tomar em consideração questões infecciosas. 0 principal problema das doenças das articulações degenerativas ou traumáticas consiste no facto de a cartilagem da articulação danificada mostrar apenas uma capacidade reduzida para a regeneração. Como processo biológico de terapia, um tratamento conhecido de defeitos de cartilagem desse tipo é o transplante autólogo de condrócitos (ACT). Com este processo 1 terapêutico pôde ser demonstrada, pela primeira vez, a formação de nova cartilagem de hialina num defeito de cartilagem de articulação. 0 princípio deste método baseia-se em injectar células de cartilagem do doente cultivadas in vitro, após desbridamento da cartilagem degenerada, por baixo de uma aleta de periósteo cosida sobre o defeito (método de Peterson) . 0 processo é tecnicamente exigente e levanta problemas metódicos; assim, a permanência a longo prazo das células de cartilagem no defeito, por exemplo, não está garantida. Além disso, não está claro se as células de cartilagem cultivadas no momento do transplante são capazes de formar a matriz necessária para o preenchimento permanente do defeito. As células transplantadas encontram-se na maioria dos casos desdiferenciadas e apresentam semelhanças morfológicas e fisiológicas com fibroblastos. A partir do documento DE 19721661 Al conhece-se a utilização de materiais inovadores, para a substituição de osso e cartilagem, que se distinguem por uma estrutura especifica de materiais em si conhecidos. Trata-se de um implante de osso ou de cartilagem à base de uma rede tridimensional que consiste, no essencial, numa multiplicidade de bastonetes de um material parcial ou completamente biorreabsorvivel dispostos ordenadamente. Os bastonetes formam uma estrutura geométrica tridimensional, em que esta estrutura está adaptada, relativamente à elasticidade e resistência, ao tecido que esta deve substituir no corpo do doente. Os bastonetes podem consistir em poli-D-lactideos, poli-L-lactideos, poli-DL-lactídeos, hidroxipatites, fosfatos de cálcio ou misturas destas substâncias, que contêm essencialmente fosfatos de cálcio ou hidroxipatites, colagénio, agár ou gelatina. 2 0 documento WO 99/08728 divulga uma mistura de factores osteoindutivos ou condroindutivos que está presente incorporada em nanosferas. É também divulgado um sistema compreendendo uma matriz biodegradável, contendo, p. ex., colagénio do tipo I ou tipo II e, incorporados nesta, os factores envolvidos pelas nanosferas. As nanosferas são concebidas como partículas poliméricas. A partir do documento WO 95/33821 é conhecida a preparação de estruturas tridimensionais de colagénio, em que as regiões intersticiais são ligadas por pontes, p. ex., por fibroblastos ou condrócitos e em que o cultivo desta rede se realiza num meio de cultura. Nesta publicação descreve-se o cultivo das células mencionadas sobre esta rede tridimensional, bem como a utilização deste tecido artificial como substituto de cartilagem. 0 documento WO 98/17791 descreve o isolamento e a utilização de precursores de condrócitos, que podem ser reproduzidos metodicamente em cultura e ser utilizados para tecido de cartilagem empregável terapeuticamente. Também neste caso, se descreve o cultivo de condrócitos sobre uma rede tridimensional, em que os espaços intersticiais são ligados por pontes pelos condrócitos. O documento WO 99/00152 divulga um processo para a preparação de um transplante bioartificial, em que se removem todas as células reactivas a antigénios de um tecido alogénio ou xenogénio, através de tratamento enzimático ou químico, e o material isento de células, não desnaturado, assim obtido é colonizado com células autólogas desejadas, pelo que se obtém um transplante imediatamente pronto para ser empregue. 3 A desvantagem dos processos conhecidos é o facto de as células de cartilagem transplantadas ou cultivadas não recuperarem a sua capacidade de síntese original.

As células de cartilagem incorporadas na substância intercelular da cartilagem - os condrócitos - sofrem nomeadamente desdiferenciação sob as condições de cultivo in vitro, ao longo do período de cultivo. Enquanto que as células de cartilagem primárias (cultura PO), após o seu isolamento a partir de tecido de cartilagem, mostram ainda capacidades de síntese típicas de células de cartilagem, tal como a formação de colagénio do tipo II, tipo IX e tipo XI, as células cultivadas perdem estas propriedades típicas durante as passagens adicionais (Pl-PX) in vitro.

As células de cartilagem, ao contrário de outras células, são além disso difíceis de cultivar. As células de cartilagem cultivadas encontram-se num estado de desdiferenciação e assemelham-se morfológica e fisiologicamente aos fibroblastos. Sobretudo no caso de grandes defeitos, é contudo necessária a multiplicação dos condrócitos autólogos por cultivo e passagem, para a preparação de quantidades suficientes de material de transplante a partir de pequenas amostras.

Até à data, a desdiferenciação das células de cartilagem apenas pode ser evitada por adição de estimulantes de crescimento adicionais, o que dificulta a utilização destas culturas no domínio in vivo dado que os estimulantes de crescimento podem interagir desfavoravelmente com o sistema imunitário do organismo receptor Através dos processos conhecidos não está, além disso, garantido que as células preservam o seu metabolismo natural ou extensamente natural, 4 mesmo após várias passagens durante o cultivo.

As estruturas tridimensionais conhecidas para o cultivo de células de cartilagem nos processos actuais não podem ser, além disso, adaptadas especificamente ao respectivo defeito de cartilagem. Não está, além disso, garantido que as células de cartilagem transplantadas permaneçam diferenciados e permanentemente no local do defeito e possibilitem, deste modo, a regeneração da cartilagem.

Efectivamente não existe até a data qualquer processo de transplante que garanta uma permanência duradoura de células de cartilagem transplantadas no local do defeito e uma regeneração da cartilagem associada a esta. 0 problema técnico que está na base da presente invenção consiste portanto em disponibilizar transplantes de cartilagem, bem como processos e meios para a sua preparação, que permitem um tratamento melhorado de doenças de cartilagem, em particular uma melhor cicatrização ou regeneração do defeito de cartilagem tratado. A invenção soluciona o problema que lhe está na base pela disponibilização, em particular, de um processo para a rediferenciação e/ou multiplicação de células de cartilagem desdiferenciadas, em que as células de cartilagem desdiferenciadas são cultivadas numa biomatriz gelatinosa tridimensional, sofrem ai rediferenciação e retomam as suas capacidades metabólicas tipicas das células. A biomatriz, de acordo com a invenção, contém um esqueleto de colagénio constituído de novo, a partir de uma solução de colagénio, de um modo preferido fresca, com uma concentração de pelo menos 1,5 mg 5 de colagénio/mL de biomatriz, de um modo preferido 1,5 até 4 mg de colagénio/mL de biomatriz. Este esqueleto de colagénio é obtido a partir de uma solução ácida de colagénio, de um modo preferido com um valor de pH de 0,1 até 6,9, de um modo preferido, 2,0 até 5,0, de um modo preferido 3,0 até 4,5, em particular 3,2 até 4,2 e de um modo particularmente preferido 3,8, de um modo preferido isenta de células, que foi preparada e armazenada a 2 até 10 °C, de um modo preferido 4 °C. Esta solução de colagénio é misturada, para a preparação de uma biomatriz isenta de células, a 2 até 10 °C, de um modo preferido a 4 °C, com uma solução de meio, em particular um meio de cultura celular convencional, tampão, por exemplo tampão de Hepes, e soro, em particular soro humano autólogo, formando-se um gel por elevação da temperatura até, por exemplo, à temperatura ambiente ou 37 °C. Para a preparação de uma biomatriz contendo células introduzem-se células, de um modo preferido pré-cultivadas, por exemplo células de cartilagem ou percursores de células de cartilagem, na solução de meio, tampão e soro e mistura-se depois a 2 até 10 °C, de um modo preferido 4 °C, com a solução de colagénio igualmente temperada a 2 até 10 °C, de um modo preferido 4 °C. As células assim incorporadas na biomatriz podem ser depois cultivadas e ser eventualmente novamente removidas. Subsequentemente forma-se um gel, por exemplo, à temperatura ambiente ou a 37 °C e reveste-se a biomatriz com meio de cultura celular. O processo de acordo com a invenção permite realizar vantajosamente um cultivo intermédio das células numa biomatriz de acordo com a invenção, em que os condrócitos, por exemplo da cultura P2, são estimulados na biomatriz tridimensional à síntese de novo de proteínas de matriz típicas das células, em particular colagénio II, enquanto que em culturas conhecidas, pelo contrário, não se consegue detectar qualquer formação de colagénio. Vantajosamente, as 6 células podem ser subsequentemente novamente removidas da biomatriz e cultivadas. Através da possibilidade de rediferenciação, de acordo com a invenção, de células de cartilagem desdiferenciadas, é possivel cultivar e/ou multiplicar condrócitos ao longo de um período de tempo prolongado, sem que as células percam as capacidades de síntese específicas necessárias para a formação de cartilagem. Pode disponibilizar-se assim, com vantagem, material celular suficiente para a preparação de transplantes de cartilagem, mesmo no caso de uma quantidade de partida de tecido de cartilagem reduzida. 0 termo cultivo de células significa, no âmbito da presente invenção, uma manutenção das funções vitais das células num ambiente adequado, realizado de um modo preferido in vitro, por exemplo, sob fornecimento e escoamento de eductos e produtos metabólicos, em particular também uma multiplicação das células.

As células de cartilagem ou condrócitos são, no âmbito da presente invenção, células de cartilagem ocorrentes naturalmente ou modificadas por tecnologia genética ou seus percursores que podem ter origem animal ou humana.

Numa outra forma de realização da invenção está previsto cultivar células de cartilagem diferenciadas, em particular sob preservação da sua diferenciação, numa biomatriz tridimensional tal como caracterizada anteriormente. Vantajosamente são preservadas as capacidades metabólicas da cultura primária, sem que ocorra uma desdiferenciação das células de cartilagem diferenciadas. A invenção disponibiliza portanto também um processo de cultivo para condrócitos, que compreende uma repressão da rediferenciação. 7

Num outro aperfeiçoamento vantajoso da invenção está previsto que as células de cartilagem que se pretende verificar quanto à sua função, sua morfologia e/ou seu estado de diferenciação sejam introduzidas numa biomatriz tridimensional mencionada, cultivadas e verificadas simultânea ou posteriormente. Vantajosamente, pode analisar-se assim, por exemplo, o metabolismo das células de cartilagem ín vítro antes das células de cartilagem serem empregues in vivo. A verificação pode ser, por exemplo, a medição de capacidades metabólicas, bem como uma verificação morfológica ou funcional. A invenção refere-se por conseguinte também a processos de rastreio e de diagnóstico, em que as células de cartilagem podem ser cultivadas de acordo com os processos descritos anteriormente e analisadas simultânea ou subsequentemente, por exemplo, quanto a parâmetros fisiológicos, morfológicos e/ou biomoleculares. Neste caso, podem detectar-se, em particular, doenças degenerativas ou traumáticas das articulações ou a sua ausência. No âmbito destes processos, podem analisar-se também os efeitos de potenciais medicamentos e/ou agentes patogénicos, antigénios ou semelhantes sobre as células cultivadas, por exemplo, em processos de rastreio de fármacos. Neste caso, num aperfeiçoamento preferido, cultivam-se as células na presença e ausência do agente a ser analisado e comparam-se os efeitos observados.

Numa outra forma de realização vantajosa da invenção, a seguir ao cultivo das células de cartilagem na biomatriz tridimensional removem-se as mesmas desta, por exemplo, por meio de tratamento de colagénio e subsequente concentração, e cultivam-se adicionalmente numa cultura celular convencional, bidimensional ou tridimensional. Assim podem combinar-se vantajosamente as vantagens do cultivo bidimensional e tridimensional.

Numa forma de realização particularmente vantajosa da invenção introduzem-se as células de cartilagem numa biomatriz tridimensional de acordo com a invenção e cultiva-se nesta de modo a que possa ser obtido subsequentemente um substituto de cartilagem, também designado de transplante de cartilagem, passivel de ser transplantado. Numa realização preferida, este substituto de cartilagem pode ser um substituto de cartilagem de articulação. Assim, pode adaptar-se, com vantagem, a biomatriz à forma do defeito de cartilagem, por exemplo, já durante a fase do cultivo das células.

Numa forma de realização vantajosa, a invenção refere-se também a um processo mencionado anteriormente para a preparação de um substituto de cartilagem, em particular substituto de cartilagem de articulação, em que, de um modo preferido, após cultivo das células de cartilagem na biomatriz tridimensional, se removem as mesmas desta, de um modo preferido por meio de tratamento de colagénio e separação por centrifugação, e se cultivam adicionalmente - de um modo preferido - numa densidade celular mais elevada, numa cultura celular convencional bi- ou tridimensional, em que pode ser obtido um substituto de cartilagem passível de ser transplantado, em particular substituto de cartilagem de articulação. A invenção refere-se também a um substituto de cartilagem, em particular substituto de cartilagem de articulação, que foi preparado segundo o processo de acordo com a invenção e um eventual processo de cultivo do tipo convencional subsequentemente ou/e precedente. 9 A invenção refere-se também a uma biomatriz, de um modo preferido gelatinosa, na qual se possam realizar os processos de cultivo mencionados anteriormente, nomeadamente quer uma biomatriz sem células de cartilagem, quer uma biomatriz com células de cartilagem. No último caso, a combinação entre biomatriz e células de cartilagem diferenciadas ou rediferenciadas cultivadas na mesma designa-se também por sistema célula-matriz-cartilagem ou biotransplante. Este biotransplante pode ser empregue directamente para a terapia de doenças ou defeitos de cartilagem.

De acordo com a invenção, uma biomatriz significa uma estrutura de gel contendo colagénio, meio de cultura celular, soro e tampão, em particular tampão de Hepes. A solução de colagénio utilizada para a preparação da biomatriz é uma solução que contém uma fracção elevada de colagénio nativo, não desnaturado, em meio aquoso, ácido, em particular com um valor de pH de 0,1 até 6,9, de um modo preferido 2,0 até 5,0, em particular 3,0 até 4,5, de um modo preferido, 3,2 até 4,2 e de um modo particularmente preferido, 3,8, por exemplo, em ácido acético, em particular em solução a 0,1% de ácido acético. Uma fracção elevada significa uma fracção de colagénio não desnaturado, face ao colagénio total em solução, ^ 50%, em particular ^ 60, á 70, ^ 80, ^ 90 ou ^ 95, em particular > 99%. Numa realização preferida, não se utiliza qualquer colagénio liofilizado. O teor em colagénio da solução situa-se, vantajosamente, entre 3 mg de colagénio/mL de solução até 8 mg de colagénio/mL de solução, de um modo preferido 6 mg de colagénio/mL de solução. Numa forma de realização preferida, utiliza-se vantajosamente colagénio que foi incubado, sob agitação, em ácido acético a 0,1%, durante 3 até 14 dias, a 4 °C, após isolamento a partir de, por exemplo, caudas de ratos, 10 e em que se separaram por centrifugação as fracções de colagénio não dissolvidas. Utiliza-se vantajosamente DMEM (meio de Dulbecco, Eagle modificado) como meio de cultura celular. Pode utilizar-se também, contudo, qualquer outro meio de cultura celular que permita o cultivo de células de cartilagem. Numa realização preferida utiliza-se, vantajosamente soro autólogo humano como soro e, por exemplo, Hepes como tampão. Numa realização preferida ajusta-se uma concentração 3 M de Hepes nesta solução. Numa realização preferida, o valor de pH da solução de meio de cultura celular, tampão e soro perfaz 7,5 até 8,5, por exemplo, 7,6 até 8,2, em particular 7,8. A biomatriz pode conter também obviamente outros factores, tal como factores de crescimento, agentes de adesão, antibióticos, meios de selecção ou semelhantes. A invenção refere-se também, por conseguinte, a processos para a preparação de uma biomatriz, em que num primeiro passo se prepara colagénio fresco, por exemplo a partir de caudas de rato, reunindo-se, em solução tampão, as fibras de colagénio isoladas de tecido contendo colagénio, desinfectando-se superficialmente em álcool e lavando-se subsequentemente em solução tampão e transferindo-se subsequentemente para uma solução ácida com um valor de pH de 0,1 até 6,9, de um modo preferido 2,0 até 5,0, de um modo particularmente preferido, 3,0 até 4,0, em particular 3,3, por exemplo, uma solução a 0,1% de ácido acético. Subsequentemente, num passo adicional, agita-se o colagénio que se encontra na solução, a 2 até 10 °C, em particular 4 °C, durante alguns dias, por exemplo 3 até 14 dias, separam-se as fracções de colagénio não dissolvidas por centrifugação e guarda-se uma solução de colagénio, pronta, com um teor em colagénio de 3 mg/mL até 8 mg/mL a 2 até 10 °C, por exemplo 4 °C. Obviamente que também é possível armazenar a 11 solução no estado congelado, por exemplo a -10 °C até -80 °C, em particular -20 °C. Num terceiro passo, mistura-se esta solução de colagénio com uma solução com um valor de pH de 7,5 até 8,5, de um modo preferido 7,6 até 8,2, em particular 7,8, contendo meio de cultura celular em concentração dupla, soro e tampão, na proporção de, um modo preferido, 1:1 e obtendo-se assim uma biomatriz que apresenta um valor de pH de 7,0 até 7,8, de um modo preferido 7,4.

Para a preparação de um biotransplante mistura-se a solução com meio de cultura celular em concentração dupla, soro e tampão com células de cartilagem pré-cultivadas e separadas por centrifugação, em que se utilizam, de um modo preferido 2xl04 até 2xl07 células por cada mL, de um modo preferido 2xl06 células. Mistura-se subsequentemente esta solução com um valor de pH de 7,5 até 8,5, de um modo preferido 7,6 até 8,2, em particular 7,8, a 2 até 10 °C, em particular 4 °C, numa proporção de 1:1 com a solução de colagénio mencionada anteriormente. Subsequentemente pipeta-se a solução de gel para dentro de recipientes de cultura e reveste-se com meio após a gelificação a 37 °C. Em seguida cultiva-se o biotransplante 3 até 8 dias, de modo a estar subsequentemente disponível para transplantes. O biotransplante chega em recipientes de cultura à sala de operações e pode ser depois adaptado ao defeito, pelo médico, através de processamento mecânico, por exemplo, com uma faca, da dimensão, espessura e forma. Subsequentemente o biotransplante é fixado ao defeito, por exemplo, por meio de cola para tecidos, em particular cola de fibrina. Após cerca de 5 minutos o biotransplante está firmemente ancorado ao defeito. A operação pode também ser realizada por artroscopia dado que o biotransplante é flexível. 12

Uma outra possibilidade de emprego do biotransplante consiste numa combinação do transplante de biomatriz, de acordo com a invenção, com osso. Neste caso, o biotransplante é aplicado, por exemplo, sobre cilindros autólogos de osso da cristã ilíaca, por exemplo por meio de cola de fibrina. De acordo com a invenção é possibilitada, em particular, a terapia de osteocondrose dissecante e defeitos na cabeça do fémur no caso de luxação da anca devida à paralisia cerebral, bem como o tratamento de lesões traumáticas e degenerativas na junta do joelho. Através da terapia precoce e causal com o novo método pode travar-se, de acordo com a invenção, um progresso das doenças de articulações devidas a traumas ou à degeneração. Para o tratamento da artrose em pessoas mais jovens, está disponível, de acordo com a invenção, um processo terapêutico único e novo que adia consideravelmente a substituição endoprotética da articulação, tornando-se também desnecessária em casos individuais. A aplicação do processo de acordo com a invenção possibilita também a terapia da destruição da articulação devida a inflamações. 0 desenvolvimento da biomatriz gelatinosa de acordo com a invenção, na qual as células autólogas podem ser incorporadas de forma exactamente definida possibilita, pela primeira vez, o transplante de uma quantidade definida de células de cartilagem numa matriz mecanicamente moldável e pressionável. 0 sistema célula-matriz-cartilagem de acordo com a invenção, construída a partir de uma biomatriz de acordo com a invenção e células de cartilagem, pode ser preparado com qualquer dimensão e espessura e pode ser adaptado exactamente ao defeito, por processamento mecânico. 0 biotransplante de acordo com a invenção oferece, além disso, a vantagem de, ao contrário do ACT, não ser necessária uma remoção adicional do periósteo na tíbia do doente. Através do cultivo in vitro do sistema célula-matriz- 13 cartilagem, de acordo com a invenção, é possível analisar as células de cartilagem, antes do transplante, relativamente à sua produção de matriz. Isto é uma importante condição para a preparação de transplantes de cartilagem, ao seu teste quanto à funcionalidade e para assegurar a qualidade. Assim, pôde mostrar-se que a nova síntese de proteínas de cartilagem típicas, tal como, por exemplo, colagénio do tipo II, que servem para a estabilidade primária do transplante, são formadas pelas células de cartilagem autólogas na matriz in vitro. De acordo com a invenção, pôde mostrar-se, através de ensaios na articulação do joelho de porcos em miniatura que, em comparação com o defeito vazio do transplante de matriz vazia sem células de cartilagem ou de suspensões de células de cartilagem segundo Peterson, os sistemas célula-matriz-cartilagem, de acordo com a invenção, cicatrizam extremamente bem na cartilagem da articulação, preenchem completamente o defeito e são além disso estáveis à pressão.

Por fim, a invenção refere-se também a uma biomatriz para a utilização num dos processos mencionados anteriormente. A invenção refere-se também a processos para o tratamento de doenças ou defeitos de cartilagem, em particular doenças das articulações degenerativas, inflamatórias e/ou traumáticas, em que se emprega um substituto de cartilagem, biotransplante, preparado de acordo com a presente invenção e/ou células de cartilagem cultivadas de acordo com a invenção, em tecidos doentes ou danificados ou regiões de cartilagem ou de osso, ou se trocam pelas regiões doentes ou defeituosas. A invenção é explicada em maior detalhe com base nos exemplos. 14

Exemplo 1:

Preparação de colagénio

Para a preparação de uma solução de colagénio utiliza-se tecido contendo colagénio, tal como, por exemplo, tendões de caudas de ratos. Todos os trabalhos são realizados sob condições de esterilidade. Para este efeito, desinfectam-se as caudas de ratos superficialmente, após armazenamento a -20 °C, durante 5 minutos em álcool a 70%. Subsequentemente remove-se a pele das caudas dos ratos e retiram-se a fibras individuais de colagénio. No caso de se utilizar outros tecidos de partida, as células eventualmente presentes podem ser cuidadosamente eliminadas por tratamento mecânico, enzimático ou químico. Reúnem-se as fibras de colagénio em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,2), desinfectam-se superficialmente, durante 10 minutos, em álcool a 7 0% e lavam-se em seguida com PBS. Determina-se o peso das fibras de colagénio e transferem-se as fibras para uma solução a 0,1% de ácido acético (cerca de 8 até 12 mg/mL) .

Agita-se esta mistura, a 4 0 C, durante 3 até 14 dias e centrifuga-se subsequentemente (1000 rpm, 1 hora 00 O O as fracções de colagénio não dissolvidas. Numa realização preferida, a solução de colagénio pronta tem um teor de colagénio de 3 mg/ml até 8 mg/mL . 0 colagénio, como material de partida, encontra-se portanto em elevada proporção em solução e não na forma de fibra, esqueleto ou de matriz, tal como definido anteriormente. A solução de colagénio obtida é, de um modo preferido, isenta de células e preparada a partir de colagénio fresco, não liofilizado. 15

Exemplo 2:

Preparação da biomatriz e biotransplante, respectivamente

Todos os trabalhos são realizados sob condições de esterilidade e com materiais esterilizados.

Solução de colagénio: no mínimo 3 mg/mL em ácido acético

Solução tampão: 77,5 mL de meio com concentração dupla (por exemplo DMEM) 20 mL de soro 2,5 mL de solução de Hepes (3 M, pH 7,8)

Ambas as solução são guardadas a 4 °C. A biomatriz consiste numa solução de colagénio em ácido acético a 0,1% (colagénio de cauda de rato com um teor em colagénio de 3 mg/mL até 8 mg/mL, de um modo preferido 6 mg/mL) e uma solução tampão de meio em concentração dupla, soro e solução de Hepes. Pouco tempo após a mistura destes dois componentes numa relação de, de um modo preferido, 1: 1 forma-se por gelificação uma estrutura de colagénio tridimensional constituída de novo, a temperaturas acima de 4 °C, por exemplo, à temperatura ambiente.

Para a preparação do biotransplante, portanto de uma biomatriz contendo células, recolhem-se de modo habitual, na solução tampão, 2xl04 até 2xl07, de um modo preferido 2xl06, de células de cartilagem pré-cultivadas e separadas por centrifugação (1000 rpm, 10 min., TA)/mL, suspendem-se e misturam-se, a 4 °C, com partes iguais da solução de colagénio. 16

Pipeta-se esta solução de gel para recipientes de cultura e, após a gelificação a 37 °C, formando uma nova estrutura de colagénio com células de cartilagem incorporadas nesta, reveste-se com meio. 0 material está depois disponível para transplante, após 3 até 8 dias de período de cultura.

Caso desejado, as células podem ser novamente libertadas e novamente obtidas a partir da biomatriz por tratamento de colagénio e subsequente separação por centrifugação. As células diferenciadas obtidas podem ser um ponto de partida para cultivos adicionais.

Exemplo 3:

Transplante em articulação aberta e aplicação artroscópica

Tanto no caso de transplante em articulação aberta, como também no caso de aplicação artroscópica, adapta-se primeiro mecanicamente a dimensão e a forma da cartilagem de matriz celular ao defeito de cartilagem. Subsequentemente introduz-se o transplante no defeito e fixa-se ai por meio de cola de fibrina. Dado que o sistema célula-matriz-cartilagem descrito é, por um lado, um material flexível, mas contudo estável na sua forma, é possível enrolar praticamente este biotransplante nos instrumentos cilíndricos da artroscopia e introduzi-los assim no defeito. Devido à estabilidade na sua forma, os transplantes retomam a sua forma original no local alvo e podem ser então fixados no defeito com cola de fibrina. 17

Exemplo 4:

Resultados de análises por PCR

Na tabela seguinte reproduzem-se os resultados de análises por PCR. 0 objectivo destas análises foi o de demonstrar que o cultivo de acordo com a invenção, numa biomatriz de acordo com a invenção de acordo com o exemplo 1 e 2, conduz a uma rediferenciação de condrócitos. A partir da tabela torna-se evidente que, partindo de uma cultura PO, se perde a capacidade dos condrócitos de sintetizar colagénio do tipo II, no decorrer das passagens PI e P2 subsequentes realizadas convencionalmente. As células sofrem desdiferenciação no decurso desta passagem. Uma passagem P2 numa biomatriz de acordo com a invenção conduz, pelo contrário, à rediferenciação de condrócitos desdiferenciados, o que é comprovado pela capacidade recuperada de sintetizar colagénio do tipo II.

Tabela: Resultados das análises por PCR: a partir dos condrócitos das culturas individuais isolou-se ARN e transcreveu-se para ADNc. P0-2D 3 semanas P1-2D 2 semanas P2-2D 3 semanas P2- colagénio 2xl06/mL 3 semanas microglobulina 32 + + + + Colagénio do tipo I + + + + Colagénio do tipo II + + Colagénio do tipo XI + + + + 18 (continuação) PO-2D 3 semanas P1-2D 2 semanas P2-2D 3 semanas P2- colagénio 2xl06/mL 3 semanas Bmp 2 + + + + Bmp 4 + + + + Bmp 7 - -

Testou-se a expressão (transcrição) de genes específicos dos condrócitos por amplificação por PCR com iniciadores adequados e subsequente electroforese em gel: - microglobulina β2 é um gene expresso constitutivamente e serve como controlo positivo; colagénio do tipo II e XI são tipos de colagénio específicos da cartilagem; - proteínas morfogénicas do osso (Bmp) 2,4 e 7 desempenham um papel na diferenciação do tecido de cartilagem.

Lisboa, 28 de Agosto de 2007 19

Claims

REIVINDICAÇÕES Processo para a multiplicação de células de cartilagem diferenciadas, em que as células de cartilagem diferenciadas são cultivadas, preservando a sua diferenciação, por incorporação numa biomatriz tridimensional gelatinosa, contendo 1,5 até 4 mg/mL de colagénio de caudas de rato em meio de cultura celular tamponizado contendo soro, em que a biomatriz pode ser preparada agitando-se 3 até 14 dias a 2 até 10 °C as fibras de colagénio, isoladas de um tecido, em solução a 0,1% de ácido acético, separando-se por centrifugação fracções de colagénio não dissolvidas e misturando-se a 2 até 10 °C a solução de colagénio obtida, pronta, com um teor em colagénio de 3 mg/mL até 8 mg/mL, com uma solução contendo meio de cultura celular, soro e tampão e formando-se subsequentemente um gel a uma temperatura mais elevada, à temperatura ambiente até 37 °C.
2. Processo para a verificação da função, morfologia e/ou do estado de diferenciação de células de cartilagem, em que as células de cartilagem a verificar são introduzidas numa biomatriz tridimensional gelatinosa, contendo 1,5 até 4 mg/mL de colagénio de caudas de rato em meio de cultura celular tamponizado contendo soro, são cultivadas nesta e verificadas simultânea ou subsequentemente, em que a biomatriz pode ser preparada agitando-se 3 até 14 dias a 2 até 10 °C as fibras de colagénio, isoladas de um tecido, em solução a 0,1% de ácido acético, separando-se por centrifugação fracções de colagénio não dissolvidas e misturando-se a 2 até 10 °C a solução de colagénio obtida, pronta, com um teor em colagénio de 3 até 8 mg/mL, com uma 1 solução contendo meio de cultura celular, soro e tampão e formando-se subsequentemente um gel a uma temperatura mais elevada, à temperatura ambiente até 37 °C.
3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as células de cartilagem, subsequentemente ao cultivo na biomatriz tridimensional gelatinosa, são removidas desta e são cultivadas adicionalmente numa cultura celular convencional, de um modo preferido bidimensional.
4. Processo para a preparação de um substituto de cartilagem, em que as células de cartilagem são introduzidas numa biomatriz tridimensional gelatinosa, contendo 1,5 até 4 mg/mL de colagénio de caudas de rato em meio de cultura celular tamponizado contendo soro, e são cultivadas nesta de modo a que seja obtido um substituto de cartilagem passível de ser transplantado, em que a biomatriz pode ser preparada agitando-se 3 até 14 dias a 2 até 10 °C as fibras de colagénio, isoladas de um tecido, em solução a 0,1% de ácido acético, separando-se por centrifugação fracções de colagénio não dissolvidas e misturando-se a 2 até 10 °C a solução de colagénio obtida, pronta, com um teor em colagénio de 3 até 8 mg/mL, com uma solução contendo meio de cultura celular, soro e tampão e formando-se subsequentemente um gel a uma temperatura mais elevada, a temperatura ambiente até 37 °C.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que as células de cartilagem, após cultivo na biomatriz tridimensional gelatinosa, são removidas desta e são cultivadas adicionalmente com uma densidade celular mais elevada, de 2 modo a ser obtido um substituto de cartilagem passível de ser transplantado.
6. Processo para a preparação de uma biomatriz para o cultivo de células de cartilagem contendo os passos isolamento de caudas de rato contendo colagénio, transferência do tecido contendo colagénio para solução a 0,1% de ácido acético, incubação do tecido de colagénio transferido para a solução de ácido acético a 2 até 10 °C, separação por centrifugação de fracções de colagénio não dissolvidas, mistura da solução de colagénio obtida com um teor de colagénio de 3 até 8 mg/mL, a 2 até 10 °C, com uma solução contendo células de cartilagem, meio de cultura celular, soro e tampão, numa relação de 1:1 e gelificação da solução misturada por elevação da temperatura.
7. Biomatriz, preparável de acordo com o processo de acordo com a reivindicação 6. Lisboa, 28 de Agosto de 2007 3