PT1435231E

PT1435231E - Lipossomas não peguilados de longo tempo de circulação

Info

Publication number: PT1435231E
Application number: PT03258252T
Authority: PT
Inventors: Gautam Vinod Daftary; Srikanth Annappa Pai; Sangeeta Hanurmesh Rivankar
Original assignee: Zydus Bsv Pharma Private Ltd
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2003-12-31
Publication date: 2010-04-08
Also published as: EP1435231B1; KR20110075051A; AU2003303368B2; EA200500850A1; JP2006513189A; WO2004058140B1; EA008930B1; CN1756533A; NZ540778A; WO2004058140A3; KR101133084B1; BR0317882A; CN1756533B; CA2511464C; EP1435231A1; KR101171045B1; EP1435231B8; KR20050088233A; ES2337563T3; AU2003303368A1

Description

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DESCRIÇÃO

"Lipossomas não peguilados de longo tempo de circulação" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a lipossomas, que podem ser utilizados para conter e entregar agentes terapêuticos ou de diagnóstico e à sua preparação.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO

Os lipossomas são normalmente compostos de fosfolípidos e/ou esteróis e consistem numa estrutura vesicular baseada em bicamadas lipídicas que circundam compartimentos aquosos. Variam largamente nas suas propriedades fisico-quimicas como tamanho, carga superficial e composição em fosfolípidos.

Os lipossomas têm recebido atenção crescente como possíveis veículos para agentes terapêuticos ou de diagnóstico. Por exemplo, têm sido utilizados lipossomas para entregar agentes de diagnóstico como agentes de contraste para ressonância magnética como o quelato Gd-ácido dietilenotriaminopenta-acético (Gd-DTPA) (Veja-se e.g. Patente U.S. 6 132 763) e agentes terapêuticos como agentes antraciclina, que têm exibido actividade marcada contra uma ampla variedade de neoplasmas. (Veja-se e.g. Patente U.S. 4 769 250).

Contudo, os lipossomas causam agregação no sangue pela sua reacção mútua com várias proteínas do plasma sanguíneo e são capturados pelo sistema reticuloendotelial (RES). Por exemplo, as células de Kupffer no fígado ou os macrófagos fixos no baço capturam os lipossomas antes que estes atinjam o alvo pretendido. A captura pelo RES torna muito difícil a entrega seleccionada dos lipossomas a tecidos ou células-alvo.

Adicionalmente à captura pelo RES, os lipossomas são sujeitos a interacções electrostáticas, hidrófobas e de Van der Walls com proteínas plasmáticas. Estas interacções resultam na desestabilização dos lipossomas conduzindo à depuração rápida de circulação das vesículas, frequentemente antes de atingirem o seu alvo. 2

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Além disso, em adição às interacções celulares e proteicas com os lipossomas, levantaram-se dificuldades na produção de lipossomas encapsulando certos fármacos devido às interacções dos fármacos com os fosfolipidos dos lipossomas. Por exemplo, as antraciclinas exibiram um efeito tensioactivo ou semelhante a detergente na bicamada da vesícula fosfolipídica que causa vazamento e cria instabilidade na vesícula de lipossoma. Assim, lipossomas instáveis ao ambiente de circulação e/ou ao seu conteúdo vazarão o agente antineoplásico antes de atingir o sítio do tumor. Como resultado dos lipossomas "que vazam" e das toxicidades devastadoras resultantes, os cientistas tentaram desenvolver lipossomas de longo tempo de circulação que sejam capazes de extravasar para os locais do tumor, que são altamente vasculares por natureza.

Uma vez que os fármacos anticancerígenos normalmente mais utilizados não são especificamente tóxicos para as células tumorais e são tóxicos para todos os tecidos com os quais contactam, criam efeitos colaterais indesejáveis, como resultado das suas interacções com os tecidos normais. Por exemplo, o cloridrato de doxorrubicina é um dos antibióticos de antraciclina citotóxicos normalmente mais utilizados, utilizados na quimioterapia do cancro e tem demonstrado ter actividade contra uma grande variedade de neoplasmas. 0 cloridrato de doxorrubicina é eficaz no tratamento de muitos tumores sólidos e leucemias. É particularmente eficaz no tratamento de cancros da mama que envolvem politerapias. 0 cloridrato de doxorrubicina é terapia protocolar para o sarcoma de Kaposi relacionado com a SIDA. 0 cloridrato de doxorrubicina possui também actividade notável contra tumores dos ovários, pulmão, testículos, próstata, colo do útero, cabeça e pescoço, sarcomas estrogénicos e sarcoma de Ewing.

As composições convencionais de injecções de cloridrato de doxorrubicina estão disponíveis na forma de produto liofilizado ou na forma de uma solução de cloridrato de doxorrubicina em água. É necessário que o produto liofilizado seja reconstituído com água para injecção antes da administração. Ambos os produtos comercializados têm sido associados a uma série de toxicidades quando administrados por via intravenosa. A mielossupressão grave normalmente é 3

ΕΡ 1 435 231/PT limitadora da dose. Outras toxicidades incluem náuseas e vómitos, alopecia, mucosite (incluindo estomatite e esofagite) e cardiotoxicidade, o que pode limitar o uso de cloridrato de doxorrubicina. 0 cloridrato de doxorrubicina é um vesicante potente que pode causar extravasamento e necrose no local da injecção, ou em qualquer local em que a pele seja exposta. A reacção cutânea à doxorrubicina ("doxorubicin flare") não é incomum e é caracterizada por estrias eritematosas no local da injecção. Esta reacção à doxorrubicina geralmente regride em cerca de meia hora. 0 mecanismo de acção do cloridrato de doxorrubicina não é exactamente conhecido, mas têm sido estudadas e descritas muitas possibilidades. 0 mecanismo primário envolve a capacidade do cloridrato de doxorrubicina para intercalar ADN. A integridade do ADN é significativamente comprometida e normalmente resulta em funções de ADN alteradas. Cortes de cadeias simples e duplas são também comuns devido à intercalação do cloridrato de doxorrubicina com o ADN. Outro mecanismo do cloridrato de doxorrubicina envolve a sua capacidade de gerar radicais livres que induzem danos na membrana celular e no ADN. 0 cloridrato de doxorrubicina também inibe a topoisomerase II, tornando a reprodução do ADN ineficaz.

Alguns dos efeitos tóxicos resultantes do cloridrato de doxorrubicina incluem toxicidade cardíaca, reacção anafiláctica, emetogenicidade, mielossupressão, mucosites, toxicidade da pele, alopecia e toxicidade no local da injecção (Câncer Investigation, 19 (4): 424-436 (2001)). Em teoria, são mais vantajosos os sistemas de circulação prolongada (libertação lenta), que efectivamente entregam e libertam um fármaco em tumores e nas proximidades das células tumorais. Assim, é desejável ter um lipossoma estável capaz de encapsular agentes, como o cloridrato de doxorrubicina, que não liberte prematuramente o seu conteúdo em tecidos saudáveis ou não cancerígenos. Várias abordagens adoptadas num esforço para aumentar o tempo de circulação dos lipossomas e assim garantir a entrega do seu conteúdo ao tecido-alvo incluem o seguinte: mascarar os lipossomas relativamente ao reconhecimento pelo sistema 4 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ reticuloendotelial utilizando um revestimento de resíduos de ácido siálico (Patente U.S. 4 501 728); tornar a membrana lipossómica rígida com esfingomielina ou um fosfolípido neutro com cadeias acilo predominantemente saturadas contendo 5 a 20% de glicolípido (Patente U.S. 4 920 016); formar lipossomas com uma razão de fármaco para lípido 3-80 vezes superior às preparações tradicionais de lipossomas num sistema de 3 compartimentos do agente, bicamadas e tampão inibidor de libertação contendo ácido cítrico (Patente U.S. 6 083 530); incorporar colesterol no lipossoma (Alberto A. Gabizon, Câncer Investigation, 19 (4) 424-436 (2001)); e derivatizar o fosfolípido com polietilenoglicol (lipossomas peguilados) (Patente U.S. 5 013 556 e 6 132 763).

Infelizmente, as abordagens acima mostraram apenas potencial limitado para aumentar o tempo de circulação dos lipossomas in vivo. Por exemplo, foi determinado que mascarar o lipossoma com ácido siálico só tinha capacidade limitada para prolongar as meias vidas de circulação de lipossomas in vivo (Patente U.S. 4 920 016). Para superar estes problemas, os cientistas revestiram a superfície do lipossoma com um polímero hidrófilo como o polietilenoglicol (PEG) para evitar a adsorção de várias proteínas do plasma sanguíneo à superfície do lipossoma. Veja-se e.g. Patentes U.S. 5 013 556 e U.S. 5 676 971. Estes lipossomas peguilados têm sido denominados lipossomas estereoquimicamente estabilizados ou lipossomas furtivos ("stealth"). Os lipossomas peguilados parecem reduzir alguns dos efeitos tóxicos causados pela libertação do seu conteúdo mas, infelizmente, apareceram novos efeitos tóxicos devido à presença do polietilenoglicol. Por exemplo, as preparações lipossómicas contendo fosfolípidos peguilados conduzem à toxicidade cutânea geralmente conhecida como "Síndrome Mão-Pé", o que resulta em erupções/úlceras de pele nas palmas das mãos e solas dos pés (Kenneth B. Gordon, Câncer, vol. 75 (8), 1995, 2169-2173).

Outra desvantagem com lipossomas peguilados é que a presença de moléculas grandes (PEG) na superfície lipossómica pode reduzir as interacções dos lipossomas com as células e impedir a entrada dos lipossomas no tecido tumoral, reduzindo assim possivelmente a acumulação de fármaco lipossómico no 5 ΕΡ 1 435 231/PT tecido tumoral. (Clinicai Câncer Research, (5), 1999, 3645-3652) .

Assim, permanece a necessidade de lipossomas estáveis de longo tempo de circulação que não causem efeitos nocivos como a "Síndrome Mão-Pé", bem como métodos de produção desses lipossomas e composições neles baseadas. A presente invenção atende a esta necessidade.

Zhigaltsev et al (J. Liposome Res. 11 (1): 55-71) descreve um estudo da carga activa de lipossomas com dopamina em resposta a um gradiente de sulfato de amónio. A fase inicial da preparação do lipossoma envolveu a hidratação de um filme lipídico seco formado por evaporação de uma solução clorofórmica de fosfatidilcolina (ePC, hsPC ou DMPC) e colesterol. A hidratação realizou-se com 120 mM de solução de sulfato de amónio para fornecer uma concentração lipídica final de 20, 50 ou 100 mg/ml. Há uma referência ao estabelecimento de um gradiente de sulfato de amónio transmembranar por permuta por diálise contra sacarose, mas sem a divulgação do uso de sacarose na solução de hidratação de sulfato de amónio.

Em WO-A-8806442 refere-se a encapsulação de doxorrubicina ou outros agentes antineoplásicos num lipossoma utilizando um gradiente iónico transmembranar para carregar o agente. É feita referência à hidratação de filmes lipidicos de f osf olipido/colesterol mas não ao uso de uma solução hidratante compreendendo sulfato de amónio ou sacarose. WO-A-8500968 refere-se à redução na toxicidade de adriamicina (4Ό-tetra-hidropiranildoxorrubicina) ou outros fármacos por encapsulação num lipossoma contendo a-tocoferol ou outro composto protector do fármaco. É feita referência à evaporação de uma solução de clorofórmio/metanol de um fosfolipido, colesterol, adriamicina e α-tocoferol e hidratação do filme resultante com uma solução salina tamponada com fosfato. A quantidade de solução hidratante utilizada é 1 ml/60 pmol de lípido. Não há referência ao uso de uma solução hidratante compreendendo sulfato de amónio ou sacarose. 6

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Em US-A-5 316 771 descreve-se a carga transmembranar de fármacos anfipáticos em lipossomas usando um gradiente transmembranar de amónio. Nos processos exemplificados, um filme lipídico é hidratado com sulfato de amónio aquoso contendo desferal (mesilato de desferroxamina). Adicionaram-se, em cada caso, 5 ml da solução a um filme formado a partir de 100 mg de fosfatidilcolina de ovo. Não há descrição do uso de sacarose na solução hidratante de sulfato de amónio. US-A-4 235 871 refere-se à preparação de lipossomas carregados por emulsão de uma mistura de uma solução orgânica de um lipido com uma solução aquosa da substância activa, removendo o solvente orgânico para fornecer um gel, suspendendo, em seguida, o gel em água. Nos processos exemplificados, um lipido formado a partir de 50 μιηοΐθ de fosfolípido e 50 μιηοΐ de esterol é dissolvido num solvente orgânico e misturado com 10,5 ml de uma solução aquosa da substância activa e, após emulsificação, são adicionados ao gel resultante 5 ml de uma solução aquosa adicional. Faz-se referência à presença de sacarose, mas não como um componente de um meio de hidratação aquoso e não há nenhuma referência a sulfato de amónio.

Em EP-A-0561424 refere-se a utilização de sacarose como um açúcar de protecção durante a desidratação do lipossoma. Há uma referência à adição de tampão aquoso à solução de um lipido formado a partir de fosfatidilcolina de ovo, mas não há nenhuma referência a sulfato de amónio. 0 objecto principal da presente invenção é desenvolver uma composição lipossómica de doxorrubicina, que terá uma longo tempo de circulação e que não dará origem à Sindrome Mão-Pé. Outro objecto da presente invenção é diminuir a toxicidade e outros efeitos adversos associados à administração de doxorrubicina, tais como náuseas, vómitos e alopecia. Ainda um outro objecto da presente invenção é desenvolver lipossomas que suportem composições de agentes antineoplásicos como a doxorrubicina. 7 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

SUMARIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de lipossomas não peguilados de longo tempo de circulação compreendendo a dissolução de um ou mais fosfolipidos e um ou mais esteróis num solvente ou mistura de solventes e a remoção deste(s) solvente(s), em que, antes ou após a remoção do solvente, os lipidos resultantes são hidratados com um meio de hidratação aquoso numa quantidade no intervalo de 10 a 35 ml por cada mmol de fosfolípido presente na solução lipídica, em que o meio de hidratação aquoso compreende sacarose e não menos do que 125 mmol/litro de sulfato de amónio.

Preferivelmente, a quantidade utilizada de meio de hidratação aquoso é cerca de 30 ml por cada mmol de fosfolípido na solução lipídica. O processo geralmente compreende ainda a calibração dos lipossomas na composição lipossómica para 0,06 μιη a 0,16 μιη e/ou a remoção do sal de hidratação extralipossómico da composição lipossómica usando solução tampão de diálise para formar lipossomas não peguilados calibrados. O processo de produção dos lipossomas não peguilados pode ainda compreender a carga dos lipossomas com um agente terapêutico ou de diagnóstico. O agente terapêutico é preferivelmente um agente antineoplásico como cloridrato de daunorubicina, cloridrato de epirrubicina e, especialmente, cloridrato de doxorrubicina. A razão molar de fosfolípido para esterol é preferivelmente de 1:0,1 - 1:2 e é mais preferivelmente cerca de 1:0,7.

Os fosfolipidos preferidos têm uma temperatura de transição de fase de 40°C a 60°C, uma cadeia de ácido gordo com um mínimo de dezasseis carbonos e são seleccionados a partir de diestearoílfosfatidilcolina (DSPC), dipalmitoílfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) e derivados destes fosfolipidos. 8

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Preferivelmente, o fosfolípido é a diestearoílfosfatidilcolina (DSPC) e o esterol é o colesterol. 0 processo pode envolver além disso a calibração dos lipossomas não peguilados. Eles são preferivelmente calibrados por extrusão através de um filtro com um tamanho de poro de 0,4-0,05 μιη.

Outra concretização da presente invenção proporciona lipossomas produzidos pelo processo aqui descrito e reivindicado. Os lipossomas compreendem os ingredientes nas proporções descritas no processo da sua preparação e preferivelmente o tamanho médio dos lipossomas assim obtidos é 0,06 μιη a 0,16 μιη. A presente invenção proporciona também uma composição lipossómica não peguilada de doxorrubicina de longo tempo de circulação para administração parentérica compreendendo lipossomas não peguilados de doxorrubicina, cloridrato de histidina e sacarose; em que os lipossomas não peguilados de doxorrubicina são obtidos através do processo da invenção e compreendem um fosfolípido; especialmente diestearoílfosfatidilcolina, um esterol, especialmente colesterol; e sacarose; em que os lipossomas têm preferivelmente um tamanho médio de partícula de 0,06 a 0,16 μιη. Estes lipossomas não peguilados de doxorrubicina têm tipicamente um tempo de circulação no sangue pelo menos 25 vezes maior do que o obtido com Adriamycin quando testada em ratinhos albinos suíços em doses equivalentes. A concentração de doxorrubicina (calculada na forma de cloridrato) é preferivelmente 1-10 mM, mais preferivelmente de 3 nM a 7 nM e o mais preferivelmente cerca de 3,45 mM. A razão molar de diestearoílfosfatidilcolina para colesterol é preferivelmente de 1:0,6 a 1:0,8; mais preferivelmente cerca de 1:0,7. A razão molar de doxorrubicina (na forma de cloridrato) para diestearoílfosfatidilcolina é preferivelmente de 1:2 a 1:15, mais preferivelmente 1:2 a 8 e o mais preferivelmente cerca de 1:3,5. 9 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ A concentração de sacarose é preferivelmente de 0,1 M a 0,5 M, mais preferivelmente 0,25 M a 0,3 M, especialmente cerca de 0,27 M. A concentração de cloridrato de histidina é preferivelmente de 1 mM a 100 mM, mais preferivelmente de 8 a 12 mM e o mais preferivelmente cerca de 10 mM. O tamanho médio preferido dos lipossomas é de 0,08 μιη a 0,12 μιη.

Numa composição exemplificativa, a doxorrubicina (na forma de cloridrato) está presente em cerca de 2 mg/ml; e a razão molar de doxorrubicina para fosfolipido é cerca de 1:3,5; e a razão de fosfolipido para colesterol é cerca de 1:0,7.

Noutra composição exemplificativa, a doxorrubicina (na forma de cloridrato) está presente em cerca de 4 mg/ml e a razão molar de doxorrubicina para fosfolipido é cerca de 1:3,5 e a razão de fosfolipido para colesterol é cerca de 1:0,7. O tempo de circulação (t^>) da composição no sangue é preferivelmente mais do que 40 vezes maior do que a obtida com Adriamycin quando testada em ratinhos albinos suíços em doses equivalentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona lipossomas estáveis não peguilados de longo tempo de circulação, bem como um método de produção dos mesmos. Lipossomas peguilados são lipossomas revestidos com polietilenoglicol (PEG). A superfície do lipossoma é decorada com vários milhares de cadeias de PEG, um processo chamado "peguilação". As cadeias de PEG tornam a superfície do lipossoma "peluda" e isto impede a absorção rápida dos lipossomas à superfície das proteínas sanguíneas. A absorção rápida acelera a remoção rápida dos lipossomas do sangue. Em contraste, os lipossomas peguilados são protegidos e são removidos do sangue a uma velocidade muito mais lenta. Comparados com os lipossomas feitos sem PEG, os lipossomas peguilados são mais estáveis e menos extensivamente capturados por células do sistema reticuloendotelial (SRE) e têm uma 10 ΕΡ 1 435 231/PT tendência reduzida para vazar qualquer fármaco ou aqente encapsulado enquanto em circulação. Por exemplo, a farmacocinética dos lipossomas-PEG que encapsulam doxorrubicina é caracterizada por uma longa meia-vida de circulação, lenta depuração do plasma e um volume reduzido de distribuição comparado com a doxorrubicina lipossómica não peguilada ou a doxorrubicina livre. A longo tempo de circulação e a capacidade dos lipossomas peguilados extravasarem através da vasculatura do tumor resulta na localização de doxorrubicina no tecido tumoral com a possibilidade aumentada de resposta tumoral aumentada devido à acumulação melhorada de fármaco especialmente em tumores altamente angiogénicos. Além disso, o aumento da estabilidade dos lipossomas peguilados sobre os lipossomas convencionais resulta numa diminuição na disponibilidade do fármaco no tecido de órgãos sensíveis e assim numa diminuição na toxicidade e outros efeitos adversos como náuseas, vómitos e alopecia. Contudo, um efeito colateral grave conhecido como "Síndrome Mão-Pé", em que se observam úlceras ou erupções cutâneas nas palmas das mãos e nas solas dos pés, tem sido relatado como resultante de usos clínicos dos lipossomas peguilados (Kenneth B. Gordon, Câncer, vol. 75 (8), 1995, 2169-2173). Outra desvantagem com lipossomas peguilados é que a presença de moléculas grandes (PEG) sobre a superfície lipossómica pode reduzir as interacções dos lipossomas com as células e impedir a entrada dos lipossomas no tecido tumoral, reduzindo assim, possivelmente, a acumulação de fármaco lipossómico no tecido tumoral. O processo da presente invenção proporciona lipossomas não peguilados de longo tempo de circulação estáveis, de baixa toxicidade, que apresentam a estabilidade dos lipossomas peguilados com a longa meia vida de circulação e toxicidade reduzida acima descritas. Contudo, uma vez que os lipossomas da presente invenção não requerem o uso de PEG para conseguir os resultados acima, eles não causam "Síndrome Mão-Pé".

No processo da presente invenção, a hidratação dos lípidos é realizada utilizando um meio de hidratação aquoso compreendendo sulfato de amónio e sacarose antes ou após evaporação do solvente utilizado para dissolver os lípidos. Solventes adequados para a invenção são solventes orgânicos 11 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ nos quais ο fosfolipido possa ser dissolvido. Um perito na especialidade apreciaria solventes adequados e normalmente utilizados na produção de lipossomas. Solventes adequados exemplificativos incluem, mas não se lhes limitam, clorofórmio, cloreto de metileno, etanol, metanol ou acetona.

Quando a hidratação de lípidos é realizada após evaporação do solvente, são preferidos solventes como clorofórmio ou cloreto de metileno.

Quando a hidratação de lipidos é realizada antes da evaporação do solvente, são preferidos solventes misciveis em água como etanol, metanol, ou acetona.

Quando a hidratação é realizada após evaporação do solvente, o processo compreende a formação de um filme lipidico por evaporação do solvente de uma solução lipídica compreendendo um ou mais fosfolipidos, um ou mais esteróis e um solvente ou uma mistura de solventes. A evaporação de um solvente pode ser conseguida por qualquer técnica de evaporação tais como, mas não se lhes limitando, evaporação por passagem de uma corrente de gás inerte sobre a solução, por aquecimento, por vácuo, ou por aquecimento sob vácuo. Normalmente, são empregues frascos de evaporador rotativo.

Quando a hidratação é realizada antes da evaporação do solvente, o processo compreende a evaporação do solvente da suspensão lipossómica aquosa que contém o solvente. A evaporação de um solvente pode ser realizada por qualquer técnica de evaporação, tais como, mas não se lhes limitando, evaporação por passagem de uma corrente de gás inerte sobre a solução, por aquecimento, por vácuo, ou por aquecimento sob vácuo. Normalmente, são empregues frascos de evaporador rotativo.

Após ser evaporado um solvente ou uma mistura de solventes, só os lipossomas permanecem na forma de suspensão aquosa. 12

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Pode ser utilizado na presente invenção qualquer fosfolipido adequado para preparar lipossomas. Fosfolipidos adequados incluem os que tendem a diminuir a permeabilidade da membrana lipossómica. Os lipossomas que contêm fosfolipidos com longas cadeias de ácido gordo são mais estáveis e resultam numa libertação mais lenta de agente do que os lipossomas compreendidos por fosfolipidos com cadeias curtas de ácido gordo. À medida que o comprimento da cadeia de carbono do ácido gordo aumenta, a temperatura de transição de fase também aumenta. Lipossomas compreendidos por fosfolipidos com temperatura de transição de fase superior libertam os seus conteúdos mais lentamente do que lipossomas compreendidos por fosfolipidos com temperatura de transição de fase mais baixa. Altas temperaturas de transição de fase permitem a libertação lenta dos conteúdos do interior dos lipossomas na corrente sanguínea uma vez que as membranas de fosfolipidos são semipermeáveis. Outras características dos fosfolipidos que afectam a estabilidade e permeabilidade da membrana incluem o grau de saturação e a carga.

Os lipossomas da presente invenção contêm preferivelmente lípidos neutros. É preferido que os lípidos neutros tenham uma temperatura de transição de fase de 40°C a 65°C e mais preferivelmente de 50°C a 54°C. Fosfolipidos preferíveis têm uma cadeia de ácido gordo de pelo menos dezasseis carbonos.

Fosfolipidos adequados empregues no processo da presente invenção incluem, mas não se lhes limitam, diestearoílfosfatidilcolina (DSPC), dipalmitoílfosfatidil-colina (DPPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) ou derivados destes fosfolipidos. As fosfatidilcolinas são lípidos neutros preferidos. Um fosfolipido preferido é a 1,2-diestearoíl-sn-glicerol-3-fosfocolina, que é normalmente conhecida como diestearoílfosfatidilcolina (DSPC). 0 peso molecular da DSPC é 790 e tem a fórmula molecular C44H88NO8P. São incorporados esteróis em lipossomas juntamente com fosfolipidos para alterar a rigidez e permeabilidade das membranas lipossómicas. Um esterol exemplificativo é o colesterol e seus derivados ou análogos. O colesterol tende a aumentar a rigidez e diminuir a permeabilidade das membranas lipossómicas. O colesterol é uma molécula anfipática e 13 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ insere-se a si próprio na membrana de fosfolípido com os seus grupos hidroxilo orientados para a superfície aquosa. 0 colesterol é incorporado numa concentração que proporciona óptima permeabilidade à membrana lipossómica, mas também mantém a rigidez da membrana. A selecção da razão de fosfolípido para colesterol define a taxa de dissolução dos conteúdos dos lipossomas. Os lipossomas da presente invenção normalmente têm uma razão molar de fosfolípidos para esterol que varia de 1:0,1 a 1:2. Preferivelmente o intervalo é de 1:05 1:1,5. Uma razão molar preferível de fosfolípidos para esterol quando a diestearoílfosfatidilcolina (DSPC) é o fosfolípido e o colesterol é o esterol é de 1:0,6 a 1:0,8. Uma razão molar preferida é cerca de 1:0,7.

Evapora-se o solvente ou as misturas de solventes sob vácuo. Quando a hidratação é realizada após a remoção do solvente, o filme lipídico formado é hidratado com um meio de hidratação aquoso para formar lipossomas. O meio de hidratação aquoso é adicionado ao filme com agitação ou sob mistura, para hidratar o filme lipídico e formar lipossomas. Um perito na especialidade apreciaria os meios de hidratação aquosos adequados para empregar. Os meios de hidratação aquosos preferíveis contêm tampões/sais, de modo a estarem disponíveis para mais tarde estabelecerem um gradiente químico no processo para ajudar no carregamento de vários agentes para o interior dos lipossomas. 0 volume do meio de hidratação aquoso é controlado/reduzido em comparação com as quantidades dos meios de hidratação utilizados na produção convencional de lipossomas e de lipossomas peguilados. Por reduzirem o volume do meio de hidratação aquoso, os fosfolípidos podem empacotar-se juntos e apertados, resultando numa membrana lipossómica ou "concha" mais espessa. A "concha" mais espessa proporciona conteúdos lipossómicos estáveis, de longo tempo de circulação, libertação lenta e toxicidade diminuída, sem a necessidade de PEG. Quanto menor o volume do meio de hidratação utilizado, mais apertados os fosfolípidos se empacotarão juntos e mais espessa a concha se tornará. Por "controlado/reduzido" quer-se significar que o volume do meio de hidratação aquoso utilizado na presente invenção é menos do que as quantidades anteriormente conhecidas ou aceites de meio de hidratação 14 ΕΡ 1 435 231/PT aquoso. Utilizando um volume reduzido preferido de meio de hidratação (e.g. 30 ml por cada mmol de fosfolípido) e uma concentração de colesterol preferida, a composição lipossómica resultante teria uma bicamada rígida de fosfolípido.

Esta redução no volume do meio de hidratação pode também ser encarada em termos da razão do volume de meio utilizado por moles de fosfolípido presentes na solução lipídica. Na presente invenção, a quantidade de meio de hidratação aquoso utilizada está no intervalo de 10 a 35 ml por cada mmol de fosfolípido presente na solução lipídica. Preferivelmente, o volume do meio de hidratação aquoso está entre 20-35 ml, especialmente 20 a 30 ml, por cada mmol de fosfolípido presente na solução lipídica. Mais preferivelmente, o volume do meio de hidratação aquoso é cerca de 30 ml por cada mmol de fosfolípido utilizado na solução lipídica.

Os lipossomas são adequadamente calibrados. Um perito na especialidade apreciaria métodos conhecidos de calibração de lipossomas. A homogeneização sob pressão é um destes métodos. Outro método adequado inclui a extrusão dos lipossomas através de filtros com um tamanho de poros que corresponda ao tamanho do lipossoma desejado. Devido aos lipossomas da presente invenção terem uma membrana empacotada mais apertada, a calibração tende a ser mais difícil do que com lipossomas convencionais. Assim, são preferivelmente calibrados através de uma série de filtros com poros cada vez menores. Por exemplo, após a hidratação, os lipossomas são inicialmente passados por um filtro com poros de tamanho 0,40 μιη, seguido por filtros sucessivamente menores de 0,06 μιη ou, preferivelmente, 0,05. Os lipossomas resultantes variam em tamanho de 0,05 ou 0,06 μιη-0,2 μιη. Um intervalo de tamanho médio preferido é de 0,08 μιη a 0,12 μιη. O sal extralipossómico no meio de hidratação é removido ou lavado dos lipossomas. A diálise utilizando um meio de diálise é um método exemplificativo de remoção de sal de um meio de hidratação extralipossómico. Pode ser utilizada na diálise qualquer solução tampão adequada. A remoção do sal extralipossómico presente na composição lipossómica cria um gradiente químico de dentro para fora através da membrana lipossómica, ao qual mais tarde se recorre para o carregamento 15 ΕΡ 1 435 231/PT dos lipossomas. Outros meios adequados para remover o sal extralipossómico incluem a ultrafiltração ou a cromatografia em coluna.

Os lipossomas da presente invenção proporcionam um mecanismo de entrega de longo tempo de circulação, com libertação lenta para agentes terapêuticos ou de diagnóstico. Qualquer método conhecido pode ser utilizado para carregar os lipossomas com um agente terapêutico ou de diagnóstico desejado. Métodos exemplificativos incluem a adição do agente ao filme lipídico antes da hidratação do filme lipídico, a incorporação do agente directamente no meio de hidratação, por gradiente de pH, ou por gradiente químico. Um método preferido envolve a carga de um agente utilizando um gradiente químico. Quando os lipossomas são carregados por processos de carga activos, a solução de fármaco é misturada com o branco da suspensão lipossómica a uma temperatura superior ou equivalente à temperatura de transição de fase dos fosfolípidos.

Utilizando um gradiente químico, a quantidade de agente pode ser facilmente controlada e uma vez que o agente é carregado no interior do lipossoma, a fuga para o meio extralipossómico é mínima. Além disso, se for utilizado no passo de hidratação um meio de hidratação contendo um tampão/sais, a criação desse gradiente torna-se muito viável após a remoção do sal do meio de hidratação extralipossómico como descrito anteriormente. Contudo, a hidratação com solução de sulfato de amónio isotónica processada com cloreto de sódio (conforme divulgado na patente U.S. 5 316 771) resulta em lipossomas que vazam em armazenamento. 0 teor de fármaco livre da composição lipossómica aumenta em armazenamento, o que por sua vez aumenta a toxicidade. Portanto, existe uma necessidade de reforçar a membrana lipossómica. A presente invenção proporciona assim o uso concomitante de um agente iso-osmótico que não é reactivo com outros ingredientes da solução nem com os próprios lipossomas no meio de hidratação. Verificou-se que o uso de sacarose é protector para as membranas lipossómicas. A sacarose ajuda a proteger e tornar rígida a membrana lipossómica e além disso a manter a isotonicidade da composição lipossómica. As membranas lipossómicas têm sido protegidas por desidratação antes da liofilização pelo uso de 16

ΕΡ 1 435 231/PT sacáridos como trealose, sacarose, ou maltose (Patente U. S. 4 880 635) . A presente invenção proporciona assim a utilização de sacarose com sulfato de amónio como um meio de hidratação originando lipossomas mais rígidos e que não vazem o agente encapsulado no seu interior em armazenamento. Com a adição de sacarose ao meio de hidratação, a sacarose permanece nas superfícies interna e externa da membrana lipossómica endurecendo ambos os lados da membrana lipossómica, reduzindo assim a fuga do fármaco. É preferível que a concentração de sacarose no meio de hidratação seja de 0,1 M a 0,5 M. É preferida uma concentração de 0,25 M a 0,3 M, especialmente cerca de 0,27 M. A concentração de sulfato de amónio no meio de hidratação desempenha um papel fundamental na fuga do fármaco dos lipossomas. O sulfato de amónio numa concentração inferior a 125 mM, quando utilizado para hidratação na formação de lipossomas mostrou a fuga do fármaco em armazenamento. Assim, a concentração de solução de sulfato de amónio é não inferior a 125 mmol/litro e o meio de hidratação contém sacarose.

Quando é efectuada uma diálise, a diálise remove o sal extralipossómico, i.e., o sulfato de amónio, mas não remove o sulfato de amónio intralipossómico, causando assim o gradiente químico de dentro para fora através da membrana lipossómica. Há muitas soluções tampão adequadas que podem ser utilizadas para carregar o agente nos lipossomas e para diluir a composição lipossómica resultante para uma concentração desejada do agente. Uma vez que os lipossomas contêm principalmente fosfolípidos, que são estáveis a pH neutros em torno de 6,0 a 8,0, as soluções tampão utilizadas para carregar e diluir lipossomas também devem ter um pH neutro. Além disso, idealmente, a solução tampão deve ser adequada para preparações parentéricas. Algumas das soluções tampão mais comuns utilizadas em preparações parentéricas, que são adequadas na presente invenção para carregar o agente para os lipossomas e para a diluição da composição lipossómica, são tampões de glicina, fosfato, citrato, acetato e histidina. A solução tampão de histidina é preferível, tem o pH mais 17 ΕΡ 1 435 231/PT estável no intervalo de pH neutros. Preferivelmente, a solução tampão compreende sacarose e cloridrato de histidina numa razão molar de 29:0,1 a 29:10, mais preferivelmente cerca de 29:1. A razão mássica entre o cloridrato de histidina e a sacarose pode ser cerca de 1:50. O uso de sacarose ajuda a proteger e aumentar a rigidez da membrana lipossómica e também na manutenção da isotonicidade da composição lipossómica.

Após os lipossomas serem carregados, remove-se qualquer agente que não esteja aprisionado. Métodos adequados incluem, mas não se lhes limitam, cromatografia de filtração em gel, diálise, ou tratamento com resina copolimérica de estireno/divinilbenzeno microporosa, especialmente Dowex e posterior filtração. O tratamento com Dowex é um método preferido devido à sua facilidade de uso. Quando é utilizada a diálise, é preferivelmente realizada da mesma forma como descrito anteriormente quando da remoção dos sais do meio de hidratação extralipossómico.

Como discutido acima, controlando ou reduzindo a quantidade de meio de hidratação aquoso, os lipossomas resultantes têm um teor de fosfolípidos por unidade de volume aumentado em relação aos lipossomas convencionais ou peguilados. O aumento de teor de fosfolípidos aumenta a estabilidade do lipossoma e diminui a permeabilidade, retardando assim a libertação de qualquer agente aprisionado.

Agentes adequados para o carregamento em lipossomas da presente invenção são compostos anfipáticos solúveis em água com grupos ionizáveis. Os agentes anfipáticos exibem ambas as características lipófila e hidrófila e podem ser um agente terapêutico ou de diagnóstico. Agentes terapêuticos podem ser quaisquer agentes desejados e incluem agentes antineoplásicos.

Um agente antineoplásico é um fármaco que previne, mata ou bloqueia a crescimento e propagação de células cancerosas. Há muitos agentes antineoplásicos adequados, alguns dos quais incluem altretamina; asparaginase; BCG; sulfato de bleomicina; bussulfano; carboplatina; carmustina; cisplatina-cis-platina, cis-diaminodicloroplatina; cladribina, 2-clorodesoxiadenosina; ciclofosfamida, arabinósido de citosina-citarabina; dacarbazina imidazolocarboxamida; dactinomicina; cloridrato de ΕΡ 1 435 231/ΡΤ dexametasona; epirrubicina; floxuridina; goserelina; daunorubicina, daunomicina-daunorrubicina; doxorrubicina, cloridrato de doxorrubicina; epipodofilotoxina etoposido; floxuridina; fluoximesterona; flutamida; fludarabina; hidroxiureia; idarrubicina HC1; ifosfamida-isofosfamida; interferão alfa, interferão alfa 2a; interferão alfa 2b, interferão alfa n3; irinotecano; leucovorina de cálcio; leuprolida; levamisole; lomustina; megestrol; mostarda de melfalano-L-fenilalanina, L-sarcolisina; cloridrato de nitrogenada, mitomicina-paclitaxel; procarbazina; 6-tioguanina; melfalano; mecloretamina, mostarda metilprednisolona, metotrexato-ametopterina, mitomicina-C; mitoxantrona; mercaptopurina, plicamicina-mitramicina; prednisona; estreptozocina-estreptozotocina; tamoxifeno; tiotepa-trietilenotiofosforamida; vinblastina; vincristina; ou tartarato de vinorelbina. Agentes antineoplásicos preferidos incluem cloridrato de doxorrubicina, cloridrato de daunorubicina e cloridrato de epirrubicina. A presente invenção também proporciona para o carregamento dos lipossomas com agentes de diagnóstico incluindo, mas não se lhes limitando, agentes de contraste de IRM (imagiologia por ressonância magnética) (também chamados agentes paramagnéticos) utilizados para ajudar a fornecer uma imagem clara durante a RMI. A RMI é um tipo especial de procedimento de diagnóstico que usa ímans e computadores para criar imagens ou “fotografias" de certas áreas dentro do corpo. Ao contrário dos raios-X, não envolve radiação ionizante. Agentes exemplificativos de diagnóstico de MRI incluem gadodiamida; gadopentetato; gadoteridol; gadoversetamida e quelato Gd: ácido dietilenotriaminopenta-acético (Gd-DTPA) (Patente U.S. 6 132 763).

Depois de os lipossomas serem carregados e os agentes de diagnóstico/terapêuticos não encapsulados removidos, a composição lipossómica pode ser assepticamente filtrada para esterilização tornando-se adequada para administração por via parentérica. Idealmente, o filtro é pelo menos um filtro de 0,2 μιη. A composição lipossómica é então filtrada num recipiente em volume estéril despirogenado. Posteriormente, a composição estéril é embalada assepticamente em recipientes despirogenados esterilizados mais pequenos, como frascos de 19 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ vidro. 0 ar na câmara de expansão do recipiente é removido por purga com um gás inerte como azoto e os recipientes são selados. Por "adequado para administração por via parentérica" quer-se dizer que a composição é estéril, isotónica e controlada relativamente a endotoxinas bacterianas. A presente invenção também proporciona lipossomas não peguilados estáveis, de longo tempo de circulação e de baixa toxicidade. Os lipossomas são produzidos preferivelmente pelos métodos aqui descritos. Os lipossomas da presente invenção são lipossomas não peguilados de longo tempo de circulação com uma meia-vida de circulação no sangue pelo menos 25 vezes mais longa do que a das formulações não lipossómicas convencionais (Adriamycin ) , quando testados em ratinhos albinos suíços em doses equivalentes. A meia-vida de circulação no sangue preferida é cerca de 40 vezes mais longa do que a obtida com Adriamycin®.

Os lipossomas não peguilados da presente invenção são compreendidos por um fosfolípido e colesterol. Razões aceitáveis de fosfolípido para colesterol são anteriormente descritas e estão preferivelmente numa razão molar de 1:0,1 a 1:2. Uma razão molar preferida de fosfolípido para esterol é cerca de 1:0,7. As fosfatidilcolinas são os fosfolípidos preferidos e a diestearoílfosfatidilcolina (DSPC) é especialmente preferida.

Os lipossomas não peguilados podem ser carregados com um agente terapêutico ou de diagnóstico. Estes agentes são conhecidos e discutidos acima. Os lipossomas não peguilados da presente invenção são preferivelmente carregados utilizando um gradiente químico como discutido acima.

Um lipossoma preferido não peguilado da presente invenção é carregado com cloridrato de doxorrubicina e é preparado utilizando os métodos descritos acima. Numa concretização, quando se carrega o cloridrato de doxorrubicina utilizando o procedimento de carregamento activo acima descrito, o agente é dissolvido numa solução tampão adequada (como descrito anteriormente) antes da carga para se obter uma concentração de pelo menos 25 mM. Quando o processo de carregamento activo envolve um gradiente de sulfato de amónio, o sulfato de amónio 20 ΕΡ 1 435 231/PT reage com cloridrato de doxorrubicina para formar sulfato de doxorrubicina. O sulfato de doxorrubicina é insolúvel e permanece dentro dos lipossomas após o carregamento. Uma vez que qualquer fármaco livre ou não aprisionado seja retirado dos lipossomas carregados, os lipossomas carregados de fármaco são diluídos utilizando solução tampão aquosa para se conseguir a concentração requerida de fármaco. A solução tampão preferida utilizada é a solução tampão de histidina-sacarose como previamente discutido.

Uma composição exemplificativa de doxorrubicina lipossómica não peguilada contém cerca de 2 mg/ml de doxorrubicina (calculada na forma de cloridrato). Outra composição exemplificativa de doxorrubicina lipossómica não peguilada contém cerca de 4 mg/ml de doxorrubicina (calculada na forma de cloridrato). Utilizando métodos da presente invenção, a doxorrubicina pode ser carregada nos lipossomas não peguilados numa concentração de duas vezes a desejada na composição final desejada. Seguidamente, os lipossomas carregados podem ser diluídos com uma solução tampão adequada (como descrito anteriormente) para se conseguir a concentração desejada de doxorrubicina por ml de composição lipossómica. Na diluição, o meio externo no qual os lipossomas são suspensos é diluído, enquanto o agente no interior dos lipossomas permanece não diluído.

Numa concretização preferida, a razão molar de cloridrato de doxorrubicina para fosfolípidos é de 1:2 a 1:15. Uma razão molar preferida é cerca de 1:3,5. A presente invenção proporciona também composições lipossómicas não peguiladas de doxorrubicina. A composição compreende lipossomas não peguilados, como acima descrito, em veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis, conhecidos na especialidade. Os lipossomas carregam-se com cloridrato de doxorrubicina. As composições são adequadas para administração por via parentérica e são de longo tempo de circulação.

Uma concretização proporciona composições lipossómicas não peguiladas de doxorrubicina de longo tempo de circulação para administração por via parentérica. A composição lipossómica compreende lipossomas não peguilados de 21 ΕΡ 1 435 231/PT doxorrubicina num veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na especialidade. Numa composição farmacêutica preferida, a concentração de doxorrubicina varia de 1 mM a 10 mM, mais preferivelmente cerca de 6,9 mM, mas o mais preferivelmente cerca de 3,45 mM. A concentração molar de fosfolípidos varia de 10 mM a 15 mM da composição parentérica. Um teor mais preferido é cerca de 12,15 mM. A composição preferida compreende ainda diestearoilfosfatidilcolina, colesterol, cloridrato de histidina e sacarose. Os lipossomas têm preferivelmente um tamanho médio de 0,06 μιη a 0,16 μιη. 0 teor de cloridrato de doxorrubicina é preferivelmente de 1-10 mM e mais preferivelmente o teor de cloridrato de doxorrubicina é cerca de 3,45 mM.

Em composições preferidas da presente invenção, a razão molar de diestearoilfosfatidilcolina para colesterol é de 1:0,6 a 1:0,8 e é preferivelmente cerca de 1:0,7.

Em composições preferidas da presente invenção, a razão molar de cloridrato de doxorrubicina para diestearoilfosfatidilcolina é de 1:2 a 1:10, preferivelmente de 1:2 a 1:8 e mais preferivelmente cerca de 1:3,5. O teor de sacarose é preferivelmente de 0,45 M a 0,55 M, mais preferivelmente de 0,1 M a 0,5 M, especialmente de 0,25 M a 0,3 M e o mais preferivelmente cerca de 0,27 M.

Em composições preferidas da invenção o teor de cloridrato de histidina é de 1 mM a 100 mM, mais preferivelmente de 8-12 mM e o mais preferivelmente cerca de 10 mM.

Em composições preferidas da invenção, os lipossomas têm um tamanho médio de 0,08 μιη-0,12 μιη.

Numa concretização da invenção, o cloridrato de doxorrubicina está presente a cerca de 4 mg/ml e a razão molar 22 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ de doxorrubicina para DSPC é cerca de 1:3,5 e a razão de DSPC para colesterol é cerca de 1:0,7.

Noutra concretização da invenção, o cloridrato de doxorrubicina está presente a cerca de 2 mg/ml e a razão molar de doxorrubicina para DSPC é cerca de 1:3,5 e a razão de DSPC para colesterol é cerca de 1:0,7.

Os lipossomas de doxorrubicina nas composições têm preferivelmente um tempo de meia circulação (11/2) mais de 40 vezes superior ao da Adriamycin quando testados em ratinhos albinos suíços em doses equivalentes. O crescimento tumoral é reduzido por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição lipossómica não peguilada de doxorrubicina da presente invenção. Como as composições lipossómicas não peguiladas de doxorrubicina têm um tempo de circulação prolongado, exibem diminuição da toxicidade e não apresentam problemas de "Síndrome Mão-Pé", fornecem um tratamento viável para reduzir o crescimento tumoral. Um médico especializado seria capaz de usar os dados aqui apresentados, bem como o conhecimento comum de quantidades de dosagem, tempos de dosagem e vias de administração, para tratar um indivíduo que tem um tumor susceptível a tratamento por cloridrato de doxorrubicina com os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção. As composições de cloridrato de doxorrubicina de concentração 2 mg/ml e 4 mg/ml da presente invenção são úteis para tratamento de redução do crescimento tumoral. A presente invenção proporciona também um processo preferido para fazer as composições preferidas da invenção. O processo compreende dissolver lípidos compreendendo diestearoílfosfatidilcolina (DSPC) e colesterol num único solvente ou numa mistura de solventes, remover o(s) referido(s) solvente(s) antes ou após a hidratação dos lípidos por adição de um meio de hidratação aquoso para formar lipossomas numa composição lipossómica, em que o referido meio de hidratação aquoso compreende sulfato de amónio e sacarose e tem uma concentração de sulfato de amónio não inferior a 125 mM e em que o meio de hidratação aquoso é 23 ΕΡ 1 435 231/PT adicionado numa quantidade no intervalo de 10 ml a 35 ml por cada mmol de DSPC; calibrar os lipossomas na composição lipossómica resultante, preferivelmente para 0,06 μιη-0,16 μιη; remover o sulfato de amónio extralipossómico da composição lipossómica calibrada utilizando uma solução tampão de histidina-sacarose compreendendo cloridrato de histidina e sacarose; dissolver o cloridrato de doxorrubicina na referida solução tampão de histidina-sacarose para obter uma solução de cloridrato de doxorrubicina de concentração pelo menos 25 mM; misturar a solução de cloridrato de doxorrubicina resultante e a composição lipossómica isenta de sulfato de amónio extralipossómico para obter uma composição lipossómica carregada com doxorrubicina; remover o cloridrato de doxorrubicina extralipossómico da referida composição lipossómica carregada com doxorrubicina por, por exemplo, filtração de fluxo tangencial, cromatografia de coluna ou tratamento com resinas como resinas de copolímero microporoso de estireno/divinilbenzeno; perfazer o volume da resultante composição lipossómica isenta de cloridrato de doxorrubicina extralipossómico com uma solução tampão de histidina-sacarose para obter uma composição lipossómica de uma concentração desejada de doxorrubicina; filtrar assepticamente a referida composição lipossómica através de um filtro estéril de 0,2 μιη de classe de esterilização para um recipiente estéril para obter a referida composição lipossómica de doxorrubicina.

As composições de lipossomas não peguilados contendo doxorrubicina da presente invenção demonstraram diminuição dos efeitos tóxicos relativamente às formulações convencionais de cloridrato de doxorrubicina (Adriamycin ) e formulações lipossómicas peguiladas de cloridrato de doxorrubicina (Caelyx ). A Tabela 1, abaixo, fornece os resultados de toxicidade aguda e estudos farmacocinéticos em ratinhos. Compararam-se os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção, como produzidos pelos parâmetros estabelecidos no Exemplo II, com Adriamycin® e Caelyx®. A DL5o 24 ΕΡ 1 435 231/PT para os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção é superior à da Adriamycin® ou Caelyx®, demonstrando assim que os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção têm toxicidade mais baixa.

Tabela 1

Toxicidade Aguda e Estudos Farmacocinéticos em Ratinhos

Parâmetros Exemplo II Caelyx® Adriamycin® DL50 (mg/kg) 16,13 13,5 10,29 DMT (mg/kg) 8 8 5 Cmax ^g/ml) 267,54 285,74 26,8 T ± max (horas) 0, 085 0,085 0, 085 Kel 0,0997 0,07109 4,851811 Tl/2 (horas) 6, 948 9, 748 0, 143 AUC ^g-h/ml) 1694,024 2083,215 1, 244 Vd (ml) 1, 480 1,688 41,42 Vd (ml/kg) 59,20 67, 52 1656,79 Cl (ml/h) 0, 15 0,12 200,96

Abreviaturas: DMT = dose máxima tolerada; Cmax = concentração máxima de fármaco atingida no plasma; Tmax = tempo necessário para atingir a concentração máxima de fármaco no plasma; Kel = constante de eliminação; T1/2 = tempo necessário para que a concentração de fármaco no plasma diminua 50%; AUC = área sob a curva "concentração" vs. "tempo"; Vd = volume de distribuição; Cl = velocidade de depuração do fármaco.

Usaram-se os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção em tumor mamário humano de MCF-7 implantado em ratinhos. Os resultados são fornecidos na Tabela 2, abaixo. A diferença no peso e na eficácia do tumor é medida por T/C% (percentagem do teste relativamente ao controlo). Neste estudo (Exemplo VI), a maior razão de T/C utilizando Caelyx é -78 a 12 mg/kg e -34,7 a 6 mg/kg enquanto utilizando os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção, o mais elevado é -93,4 a 12 mg/kg e -89,43 a 6 mg/kg. Estes resultados demonstram que as composições lipossómicas não peguiladas de doxorrubicina da presente invenção parecem ser mais eficazes na redução do peso do tumor do que a formulação de lipossoma peguilado actualmente comercializada, Caelyx . 25

ΕΡ 1 435 231/PT

Tabela 2;

Efeito no Peso Tumoral Médio (mg) de Tumor mamário Humano de MCF-7 Implantado em Ratinhos Nus

Dia Controlo Salino Exemplo II (6mg/kg) Exemplo II (12mg/kg) Caelyx® (6mg/kg) Caelyx® (12mg/kg) 1 36,5 31,5 68, 4 38,3 57, 88 5 36,75 45,33 81,6 44,3 50, 75 9 63,13 40,17 43,6 41,5 31,38 12 52,38 42,83 46, 1 60, 17 32 16 78,13 5,33 16,2 25 27,8 19 94 3,33 8 25 22,8 23 95,38 3,33 4,5 16 16,6 26 94,38 3,33 4,5 25 12,6 Ganho de peso 43, 4 -28,17 -63, 9 -13,3 -45,2 T/C% NA -89,43 -93, 4 -34, 7 -78

Testou- -se a actividade antitumoral dos lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção contra células de leucemia L1210 em Ratinho. Os resultados sao fornecidos na Tabela 3, abaixo. Os resultados deste teste (Exemplo VI) mostram que composições lipossómicas nao peguiladas de doxorrubicina da presente invenção são tão eficazes como os lipossomas peguilados (Caelyx ). 26 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Tabela 3:

Actividade Antitumoral Contra Modelo de Leucemia L1210 em

Ratinho

Grupo Dosagem (mg/kg) Ratinhos Tempo de sobrevivência (Dias) Tempo médio de sobrevivência (Dias) T/C% 1/5 17 2/5 16 Controlo NA 3/5 17 16 NA Salino 4/5 16 5/5 16 1/5 20 2/5 20 Exemplo II 6 3/5 22 20,4 128 4/5 20 5/5 20 1/5 23 2/5 20 Exemplo II 12 3/5 20 21,2 132 4/5 20 5/5 23 1/5 18 2/5 22 Caelyx® 6 3/5 20 20, 4 128 4/5 20 5/5 22 1/5 18 2/5 22 Caelyx® 12 3/5 20 20,6 129 4/5 23 5/5 20 T/C%: percentagem do teste relativamente ao controlo Os resultados acima nas Tabelas 1-3 demonstram que a composição lipossómica não peguilada de doxorrubicina da presente invenção tem um perfil de toxicidade inferior e um tempo de circulação mais longo do que os lipossomas peguilados e tem eficácia comprovada ín vivo na actividade antitumoral contra modelos tumorais MCF-7 e L1210. A fim de que os peritos na especialidade possam compreender mais completamente a presente invenção, são expostos os Exemplos seguintes, que descrevem a preparação, 27 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ caracterização e a aplicação quimioterapêutica in vivo num modelo animal de formulações de lipossomas da presente invenção. Estes Exemplos são apresentados unicamente com fins ilustrativos e não são destinadas a limitar a presente invenção em qualquer forma.

Utilizou-se, nestes Exemplos, cloridrato de doxorrubicina de grau parentérico, de acordo com as especificações da

Farmacopeia Americana. Utilizaram-se, nestes Exemplos, fosfolípidos de grau parentérico. Utilizou-se, nestes

Exemplos, colesterol de acordo com as especificações da

Farmacopeia Americana. Utilizou-se, nestes Exemplos, água de grau parentérico, de acordo com as especificações de Água para Injecção. Todos os outros aditivos utilizados nestes Exemplos eram de grau parentérico. Todo o processamento foi realizado numa área com um ambiente controlado.

Utilizou-se Caelyx® (formulação lipossómica peguilada de doxorrubicina) produzidos por Ben Venue Laboratories, E.U.A. e Adriamycin (formulação nao lipossómica convencional de doxorrubicina) produzidos por Pharmacia & Upjohn, E.U.A. em estudos em animais para avaliação comparativa com uma composição lipossómica não peguilada de doxorrubicina da presente invenção. A Adriamycin é um pó liofilizado estéril para injecção, cada frasco contendo 10 mg de cloridrato de doxorrubicina, 50 mg de lactose e 1 mg de hidroxibenzoato de metilo. Antes da utilização, o pó liofilizado é reconstituído com 5 ml de água para injecção fornecida com o conjunto.

Utilizou-se um Contador de células (Sysmex™ Automated Hematology Analyzer-KX-21) para os testes hematológicos.

EXEMPLOS

Exemplo I

Processo de produção de uma composição lipossómica contendo doxorrubicina.

Formação do filme lipídico:

Dissolveram-se DSPC (1,565 g) e colesterol (0,521 g), um após o outro em clorofórmio (40 ml) num balão de evaporador rotativo. Foram misturados até se formar uma solução límpida. 28 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Ligou-se ο balão a um evaporador rotativo e ajustou-se a temperatura do banho de água a 60°C. Evaporou-se o solvente sob vácuo para formar uma fina película de lípidos na parede do balão. Após libertar o vácuo, rodou-se o balão durante aproximadamente 5 minutos enquanto se passava azoto no balão para secar qualquer solvente residual.

Hidratação: 0 filme lipídico no balão foi então hidratado com 60 ml de meio de hidratação aquoso contendo sulfato de amónio. O meio de hidratação consiste em 10,0 g de sacarose, 2,04 g de sulfato de amónio e 100 ml de água. O balão contendo o filme lipídico e o meio hidratação foi rodado durante 30 minutos num banho de água a uma temperatura mantida a 65-68°C para formar lipossomas.

Redução de tamanho dos lipossomas por extrusão: A suspensão lipossómica obtida anteriormente foi calibrada por extrusão, sucessivamente através de filtros com tamanho de poro de 0,4 μιη para 0,05 μιη.

Desenvolvimento do gradiente de sulfato de amónio: A suspensão dos lipossomas calibrados foi sujeita a diálise contra uma solução tampão de histidina-sacarose para remover sulfato de amónio extralipossómico criando assim um gradiente químico. Usou-se um sistema de filtração de fluxo tangencial equipado com uma cassete de 300 KD para a diálise. Testou-se a ausência de sulfato de amónio utilizando agente de Nesseler. A solução tampão de histidina-sacarose utilizada na diálise e carregamento do fármaco (abaixo) é a seguinte: 170,0 g de sacarose, 3,40 g de histidina HC1, 1,7 litros de água e hidróxido de sódio em quantidade suficiente para ajustar o pH entre 6,0 e 6,5.

Carregamento do fármaco:

Num balão de fundo redondo, preparou-se uma solução de doxorrubicina HC1 15 mg/ml em solução tampão de histidina-sacarose (descritos acima) para carregar a preparação lipossómica e para obter lipossomas carregados de fármaco tendo uma concentração de 4 mg/ml de doxorrubicina (calculada 29 ΕΡ 1 435 231/PT na forma de cloridrato). Os lipossomas calibrados e dialisados anteriormente foram adicionados lentamente ao balão de fundo redondo e misturados, durante uma hora, a 65°C. Os lipossomas carregados de fármaco foram misturados com Dowex® durante 30 minutos para remover o fármaco não aprisionado. Os lipossomas carregados de fármaco foram diluídos para uma concentração 2 mg/ml utilizando solução tampão de histidina-sacarose e, em seguida, filtrados assepticamente utilizando um filtro estéril de membrana de 0,22 μιη. A composição lipossómica de doxorrubicina filtrada foi então preenchida assepticamente em frascos de vidro despirogenados estéreis e selada sob cobertura de azoto utilizando rolhas de borracha revestidas por Teflon®.

Exemplo II

Comparaçao de DL5q das formulações de doxorrubicina.

Preparou-se uma composição de doxorrubicina lipossómica tendo por ml da composição DSPC - 9,55 mg

Colesterol - 3,15 mg

Doxorrubicina (na forma de cloridrato) - 2,01 mg

Sacarose - 95 mg

Cloridrato de histidina - 2 mg A composição foi preparada pelo mesmo procedimento que no Exemplo 1.

Dissolveu-se cloridrato de doxorrubicina (216 mg) em 14 ml de solução tampão de histidina-sacarose e adicionou-se a 40 ml de lipossomas calibrados e misturados durante 1 hora. A dispersão resultante de solução lipossómica carregada com o farmaco foi, então, passada por uma coluna Dowex para remover o fármaco não aprisionado. ® O produto obtido após passagem através da coluna Dowex tinha as seguintes características: 30 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Análise do produto

Teor de doxorrubicina total (HC1) 3,98 mg/ml

Teor de doxorrubicina aprisionada (HC1) 3,94 mg/ml

Analisou-se o produto acima após diluição com tampão de histidina para uma concentração de 2 mg/ml, para os parâmetros seguintes:

Aparência

PH

Tamanho da partícula

Teor de DSPC

Teor de colesterol

Teor de Doxorrubicina (HC1)

Teor de Sacarose

Teor de Histidina HC1

Endotoxinas bacterianas

Esterilidade Líquido de cor vermelha, translúcido 6,1

Tamanho médio de partícula 0, 093 μιη 9,55 mg/ml 3,15 mg 2,01 mg/ml 9,35%p/v

Positivo

Menos de 2,2 EU/mg de cloridrato de doxorrubicina. Estéril

Esta composição foi sujeita a estudos de toxicidade aguda em ratinhos.

Comparação de DL5q das formulações de doxorrubicina.

Animais utilizados : ratinhos albinos Suíços de·ambos os sexos. Intervalo de peso dos animais : 20-22 g. Número de grupos 3 Número de animais por grupo : 10 Dividiram-se os animais em 3 grupos, cada grupo compreendido por dez animais. O Grupo 1 recebeu uma composição do Exemplo II, o Grupo 2 recebeu Caelyx®, e o Grupo 3 recebeu Adriamycin®.

Todos os animais receberam injecções por via intravenosa. As soluções do fármaco foram adequadamente diluídas com solução de dextrose (5% p/v), antes da administração aos animais. Os animais foram observados por um período de 31

ΕΡ 1 435 231/PT 14 dias, tendo sido observados para quaisquer toxicidade e mortalidade clinicas.

Os valores de DL50 das diferentes formulações de doxorrubicina estudadas são fornecidos na Tabela 1.

Verificou-se que a dose DL50 foi de 16,13 mg/kg enquanto a dose DL50 para a preparação convencional comercializada (Adriamycin®) foi 10,29 mg/kg. A DL50 para a preparação lipossómica peguilada comercializada Caelyx® foi 13,5 mg/kg. Estes resultados mostram que os lipossomas não peguilados da presente invenção têm uma toxicidade reduzida quando comparados com outras formulações de doxorrubicina e com formulações lipossómicas peguiladas de doxorrubicina, incluindo formulações lipossómicas peguiladas de doxorrubicina.

Exemplo III

Comparação da Toxicidade Sub-aguda de Formulações de doxorrubicina.

Animais utilizados Número de grupos Número de animais por grupo Intervalo de peso dos animais Via de administração ratinhos albinos Suíços de ambos os sexos 11 8 19-23 g Intravenosa

Dividiram-se os animais em 11 grupos, compreendendo cada grupo oito animais. O Grupo 1 recebeu injecção de glicose 5%, o Grupo 2 recebeu brancos de lipossomas (antes do carregamento do fármaco) da presente invenção, o Grupo 3, Grupo 4 e Grupo 5 receberam uma composição do Exemplo II em doses diferentes, o Grupo 6, Grupo 7 e Grupo 8 receberam Caelyx® em doses diferentes, o Grupo 9, Grupo 10 e Grupo 11 receberam Adriamycin em doses diferentes. As doses são fornecidas na Tabela 4. 32 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Tabela 4

Doses de Formulações de Doxorrubicina para Estudos de Toxicidade de Dose Repetida em Ratinhos Grupo Grupo Dose Dose cumulativa N. ° (mg/kg peso (mg/kg peso corporal) corporal) 1 Dextrose - - 2 Brancos de - - lipossomas 3 1 7 4 Exemplo II 2 14 5 3 21 6 1 7 7 Caelyx® 2 14 8 3 21 9 1 7 10 Adriamycin® 2 14 11 3 21 Todos os grupos receberam injecções em dias alternados, durante catorze dias por via intravenosa. As formulações foram adequadamente diluídas com injecção de Dextrose a 5% antes da administração aos animais. Os animais foram observados durante o período de estudo de 14 dias relativamente ao seguinte: mortalidade, sinais clínicos e sintomas, pesos corporais, consumo de alimentos e peso de órgãos.

RESULTADOS

Mortalidade:

Registou-se a percentagem de mortalidade num período de quatros dias para todas as formulações.

33 ΕΡ 1 435 231/PT TABELA 5

Percentagem de mortalidade para as Várias Doses de Formulações de Doxorrubicina

Grupo Dose Percentagem de (mg/kg Peso mortalidade corporal)

Dextrose - 0 Brancos de lipossomas - 0 Exemplo II 1 0 2 0 3 0 Caelyx® 1 0 2 0 3 0 Adriamycin® 1 0 2 0 3 12, 5

Sinais clínicos:

Durante o decurso do estudo, observou-se a descamação {" shedding") da pele da cauda e alopecia em todos os grupos tratados com doxorrubicina. Observou-se derramamento da pele da cauda nos animais após cinco injecções. Observou-se alopecia dependente da dose em todos os animais tratados com doxorrubicina. A Tabela 6 detalha a alopecia durante o decurso deste estudo. 34 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Tabela 6

Incidência de alopecia em Ratinhos Tratados com Várias Formulações de doxorrubicina Formulação Classificação de alopecia

Dextrose + + + + Piloerecção # + + + + + + + + + +

Brancos de lipossomas Exemplo II (1 mg/kg)

Exemplo II (2 mg/kg)

Exemplo II (3 mg/kg)

Caelyx® (1 mg/kg)

Caelyx® (2 mg/kg)

Caelyx® (3 mg/kg)

Adriamycin® (1 mg/kg)

Adriamycin® (2 mg/kg)

Adriamycin® (3 mg/kg) # Observou-se piloerecção (elevação do pelo) em um de 8 animais no dia 12 do tratamento. + Um de 8 animais mostrou alopecia + + Dois de 8 animais mostraram alopecia + + + Três de 8 animais mostraram alopecia + + + + Quatro de 8 animais mostraram alopecia

Peso corporal:

Os pesos corporais de animais foram registados no dia 1, dia 4, dia 7 e dia 14. Observou-se diminuição nos pesos corporais em todos os grupos tratados com o fármaco nas doses de 2 mg/kg e 3 mg/kg. A perda de peso foi significativamente diferente do controlo. 0 peso corporal de animais que receberam brancos de lipossomas foi comparável ao do grupo da dextrose.

Consumo de alimentos:

De um período de 4 a 14 dias, animais tratados com doxorrubicina mostraram, em geral, uma diminuição no consumo de alimentos. 35

ΕΡ 1 435 231/PT

Peso de órgãos:

Os órgãos dos animais sobreviventes foram recolhidos e pesados. Os pesos médios de órgãos de todos os animais foram comparáveis em todos os grupos tratados com fármaco.

Exemplo IV

Avaliação da farmacocinética de formulações de doxorrubicina.

Animais utilizados ratinhos albinos Suíços de ambos os sexos 3 48 25-30 g 10 mg/kg 5 min, 30 min, 5h, 10 h, 15 h, lh, 2h, 20 h Número de grupos Número de animais por grupo

Peso corporal dos animais

Dose para estudo farmacocinético

Pontos de tempo Número de ratinhos por ponto de tempo : 6 ratinhos

As amostras de sangue após a colheita foram centrifugadas a 4000 rpm durante 20 min e o plasma foi separado e congelado a -20°C até ser analisado. O plasma congelado foi descongelado e utilizado para análise.

Adicionou-se 1 ml de acetonitrilo a 100 μύ de plasma, agitou-se em vórtex durante 10 min, centrifugou-se a 3250 rpm durante 10 min. Retirou-se o sobrenadante e adicionou-se-lhe 0,5 ml de solução saturada de ZnS04. A solução resultante foi agitada em vórtex durante 5 min e então centrifugada durante 10 min a 3250 rpm. A camada superior orgânica foi então retirada e seca sob azoto gasoso isento de oxigénio a 60°C. O resíduo obtido foi então reconstituído com 200 μύ de solvente A contendo ZnS04. Injectou-se então 100 μύ desta solução na coluna de HPLC.

Instrumento Coluna Temp Coluna Fase Móvel

Shimadzu Liquid Chromatograph LC-10ATVp C8 Thermoquest™ hypersil MOS (250X4,6 mm, 5 μ)

Ambiente

Solvente A : Água Acidificada (pH 2,5, ajustado com ácido perclórico a 60%) & tetra-hidrofurano (80:1, v/v) 36 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Solvente Β: Acetonitrilo Solvente A: Solvente B (40:60)

Caudal 1 ml/min

Detector Detector Fluorescente (RF - 10 AXL Shimadzu; Ex 460 nm e Em 550 nm Tempo de execução 15 min

Análise estatística

Utilizou-se o teste t de Student para comparação entre as três formulações. Os resultados estão resumidos na Tabela 1

Exemplo V

Comparaçao da Toxicidade Sub-aguda de Formulações de Doxorrubicina.

Animais utilizados Número de grupos Número de animais por grupo Intervalo de peso dos animais Dosagem & administração Administração foi feita uma ve Cães 3 3 10-20 kg 1 mg/kg por infusão intravenosa durante 20 minutos. z por semana (i.e. após 7 dias) para 4 doses.

Avaliação farmacológica sinais clínicos de toxicidade, peso corporal, parâmetros hemodinâmicos, hematologia e parâmetros bioquímicos

Tabela 7

Sinais clínicos de Toxicidade:

Sinais Controlo (Injecção de Dextrose 5%) Adriamycin® Exemplo II Lesão dérmica Nenhum dos sinais foi observado neste grupo Lesões de alopecia, lesões eritémicas, vistas após a terceira dose Nenhum dos sinais foi observado neste grupo Vómitos Primeira e segunda dose - 2/3 Terceira e quarta dose - 1/3 Diarreia 1/3 após segunda, terceira e quarta dose Outros Anorexia 37

ΕΡ 1 435 231/PT

Peso corporal: O grupo tratado com Adriamycin® mostrou diminuição no peso corporal enquanto o grupo de controlo e os grupos tratados com a composição do Exemplo II não mostraram nenhuma mudança no peso corporal.

Tabela 8

Parâmetros Hemodinâmicos:

Parâmetros Controlo (Injecção de Dextrose 5%) Adriamycin® Exemplo II Tensão arterial Normal Normal Normal Frequência cardíaca Normal Aumenta em média + 29,17% Normal Frequência respiratória Normal Diminui em média -42,12% Normal Temperatura Temperatura corporal aumenta durante e após a administração (não significativo clinicamente)

Parâmetros hematológicos estudados: RBC, WBC total e WBC diferencial,

Hemoglobina,

Hematócrito, volume corpuscular médio e Plaquetas.

Todos os parâmetros estudados acima estavam dentro da normalidade em todos os grupos.

Parâmetros bioquímicos:

Verificou-se aumento nos níveis de creatinina- fosfoquinase e lactato desidrogenase no grupo tratado com Adriamycin enquanto no grupo de controlo e nos grupos da composição do Exemplo II não foram observadas mudanças significativas.

Testes da função hepática (LFT):

Observou-se aumento nos níveis de aspartato- aminotransferase, alanina-aminotransferase e bilirrubina total 38 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ (Κ) no grupo tratado com Adriamycin enquanto no grupo de controlo e nos grupos da composição do Exemplo II não foram observadas mudanças significativas.

Testes da função Renal (KFT):

Observou-se aumento de ureia nitrogenada (BUN) e creatinina no grupo tratado com Adriamycin enquanto o grupo de controlo não mostrou nenhum aumento. 0 grupo tratado com a composição do Exemplo II mostrou um aumento em ambos os níveis de BUN e creatinina, que foram contudo significativamente inferiores aos do grupo tratado com Adriamycin .

Exemplo VI

Avaliaçao da Actividade Antitumoral da formulação lipossómica não peguilada de doxorrubicina da presente invenção com a formulação lipossómica peguilada de doxorrubicina (Caelyx®) contra L1210 de leucemia em ratinhos e MCF-7 de tumor mamário humano implantadas em ratinhos nus.

Preparação da Dose:

Ambas as formulações de doxorrubicina acima foram diluídas para 1 mg/ml com solução salina estéril normal (0,9%). Administraram-se volumes apropriados de solução de fármaco a vários grupos de teste com base no peso corporal de modo a que os animais receberam o fármaco como indicado nas Tabelas 9 e 10.

Utilizaram-se em ambos os modelos fêmeas de ratinhos NCr nus (nu/nu) de seis semanas de idade.

Os animais foram alojados em gaiolas micro-isoladoras de policarbonato conforme especificado no Manual de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (publicação ILAR, 1996, National Academy Press). Os espaços estavam bem ventilados (mais de 10 renovações de ar por hora), com 50% de ar fresco. Manteve-se um fotoperíodo de 12 horas luz/12 horas escuro. A temperatura da sala foi mantida entre 18-26°C.

Os animais do estudo foram aclimatizados durante pelo menos 3 dias antes da inoculação do tumor. 39 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Descrição Geral:

Testaram-se ambas as formulações de lipossomas acima enumeradas em modelos L1210 de leucemia em ratinhos e MCF-7 de tumor mamário humano em duas concentrações, cada uma contra um grupo controlo recebendo solução salina.

Modelo L1210 Células Tumorais: A linha celular L1210 de leucemia em ratinhos foi obtida a partir de ATCC e propagada utilizando métodos padrão de expansão celular in vitro. As células foram crescidas em meio de cultura com suplementos adequados e soro fetal bovino (FBS) a 10%. A cultura foi, então, crescida em 35 frascos T-225 para 80-90% de confluência. As células foram colhidas por centrifugação e as células peletizadas foram ressuspensas em meio RPMI isento de soro para 106 células viáveis/ml. Os animais foram injectados com 0,1 ml de suspensão celular utilizando uma agulha 25G.

Grupos e Dosagens:

Cada grupo consistiu em 5 animais. Os ratinhos foram inoculados por via intraperitoneal com 106 células tumorais/ratinho. Ambas as formulações lipossómica foram administradas por via intravenosa nos dias 1, 5 e 9 nas dosagens mostradas na Tabela 9. Observaram-se os animais durante 30 dias após o tratamento e registou-se a mortalidade.

Tabela 9

Grupo No. Número de Machos/ Fêmeas Formulação Dose Total (mg/kg) Dose/ injecção (mg/kg) Número Total de doses 1 0/5 Solução salina NA NA 3 2 0/5 Caelyx® 12 4 3 3 0/5 Caelyx® 6 2 3 4 0/5 Exemplo II 12 4 3 5 0/5 Exemplo II 6 2 3 40

ΕΡ 1 435 231/PT

Os animais foram examinados diariamente e pesados duas vezes por semana e os pesos foram registados. Registou-se qualquer mortalidade durante o decurso do estudo.

Avaliaram-se as actividades antitumorais de ambas as formulações lipossómicas por comparação do tempo médio de sobrevivência em cada grupo tratado com o dos controlos que receberam solução salina. Os resultados foram expressos em termos da razão T/C que foi calculada da seguinte forma: T/C% = Tempo médio de sobrevivência do grupo de teste X 10 0 Tempo médio de sobrevivência do grupo de controlo

Uma T/C >125% é considerada actividade significativa

Os resultados da actividade antitumoral contra o Modelo L1210 de leucemia em ratinhos são fornecidos na Tabela 3. A mortalidade variou de 15 a 26 dias após a primeira injecção (Dia 1) . 0 tempo médio de sobrevivência do grupo de controlo, que recebeu solução salina, foi de 16,5 dias. Foi observado aumento no tempo de sobrevivência em ambos os grupos tratados com o fármaco. Ambos os grupos tratados com o fármaco mostraram diferença semelhante no tempo médio de sobrevivência (T/C%), indicando que a composição do Exemplo II é tão eficaz como Caelyx contra o modelo tumoral L1210.

Modelo MCF-7: Células Tumorais: A linha celular MCF-7 de tumor mamário humano foi obtida a partir de ATCC e propagada utilizando métodos padrão de expansão celular in vitro. As células foram crescidas em meio de cultura com suplementos adequados e FBS a 10%. A cultura foi, então, crescida em 35 frascos T-225 para 80-90% de confluência. As células foram colhidas por centrifugação e as células peletizadas foram tripsinisadas e ressuspensas em RPMI isento de soro para 107 células viáveis/ml. Os animais foram injectados com 0,1 ml de suspensão celular utilizando uma agulha 25G. 41 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Grupos e Dosagens:

Cada grupo consistiu em 5 animais. Os ratinhos foram implantados com peletes de estrogénio 5 dias antes da inoculação. Foram inoculados por via subcutânea com 107 células tumorais/ratinho. Permitiu-se que o tumor crescesse até atingir um tamanho de 30-100 mm3. Quando o tamanho adequado foi atingido (5o dia após a inoculação), administrou-se aos ratinhos a formulação de teste por via intravenosa nos dias 1, 5 e 9, como mostrado na Tabela 10. O tamanho do tumor foi medido utilizando um paquímetro, duas vezes por semana até 30 dias após o início do tratamento.

Tabela 10

Grupo No. Número de Machos/ Fêmeas Formulação Dose Total (mg/kg) Dose/iniecção (mg/kg) Número total de doses 1 0/5 Solução salina — — — 2 0/5 Caelyx® 12 4 3 3 0/5 Caelyx® 6 2 3 4 0/5 Exemplo II 12 4 3 5 0/5 Exemplo II 6 2 3

Os animais foram examinados diariamente e pesados duas vezes por semana e os pesos foram registados. O comprimento e a largura para os tumores de ratinhos individuais foram medido duas vezes por semana utilizando paquímetros e foi calculado o peso tumoral aproximado (mg) a partir das dimensões do tumor (mm x mm) utilizando a fórmula do volume de uma elipsóide prolata: L X W2 2 onde L é a maior das duas medições.

Avaliou-se a actividade antitumoral de ambas as formulações lipossómica por comparação da alteração no peso do tumor do grupo tratado com o dos controlos, que receberam solução salina. A alteração no peso do tumor foi calculada subtraindo-se o peso médio do tumor do grupo no dia 5 após a inoculação das 42 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ células tumorais do peso médio do tumor do grupo no dia da avaliação final (30 dias após o tratamento). υ Wt = Wt final - Wt inicial A razão T/C para todos os grupos de teste foi calculada do seguinte modo: T/C% = υ Wt Teste / WtiniCiai de Teste X 100

Considera-se necessária uma T/C <20% para demonstração de actividade moderada. Uma T/C <10% é considerada actividade significativa. A actividade antitumoral contra o modelo MCF-7 de tumor mamário humano está tabulada na Tabela 2.

Tabela 11

Mortes iniciais em Vários Grupos de animais

Grupo Dosagem Mortalidade Controlo Nula 0/5 Exemplo II 6 mg/kg 0/5 Exemplo II 12 mg/kg 0/5 Caelyx® 6 mg/kg 2/5 Caelyx® 12 mg/kg 1/5

No Grupo de controlo, os tumores continuaram a crescer durante o estudo atingindo um máximo de 116,4 mg no dia 26 enquanto os tumores em ratinhos tratados regrediram significativamente durante o decurso do estudo. Os tumores desapareceram completamente no grupo que recebeu 12 mg/kg de composição da formulação do Exemplo II, o que indica que a composição do Exemplo II é eficaz contra MCF-7 de tumores mamários humanos.

Ocorreram várias mortes iniciais em vários grupos, como mostrado na Tabela 11. Contudo, a causa da morte parece não estar relacionado com os tumores. Não houve mortes no grupo de controlo com solução salina, que tinha os maiores tumores. Alguns dos animais mortos foram necropsiados e em todos eles foram encontradas bexigas anormais e espessas. No final do estudo, muitos dos Ratinhos sacrificados também tinham bexigas 43 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ espessas. Ο exame histopatológico de uma das bexigas espessas não revelou nenhuma evidência de metástases do tumor. A morte prematura de ratinhos nus estrogenisados, implantados com tumor, deveu-se à incidência de doença urogenital.

Exemplo VII

Determinação da dose máxima tolerada (DMT) e avaliação da eficácia terapêutica de lipossomas de doxorrubicina da presente invenção em ratinhos nus atímicos com tumor de ovário humano de A121. A dose máxima tolerada e a avaliação da eficácia terapêutica de lipossomas de Doxorrubicina da presente invenção em ratinhos nus atímicos com tumor de ovário humano de A121 foram realizadas em comparação com uma formulação não lipossómica convencional (Adriamycin®) e uma formulação lipossómica peguilada (Caelyx®) .

Ratinhos nus atímicos Ncr-nu/nu [4 ratinhos/grupo (10 no Grupo de Controlo)] foram implantados por via subcutânea, com tumor de ovário humano de A121 através de implante feito com trocarte. Foram usados nesta experiência um total de 46 animais. Foram utilizados para esta experiência um total de 46 animais. Avaliaram-se por via intravenosa doses eguivalentes de Adriamycin®, Caelyx® e uma composição do Exemplo II. Os fármacos foram administrados por via intravenosa através da veia da cauda dos ratinhos nos dias 5 e 12 após o implante do tumor.

Todos os grupos de tratamento demonstraram uma boa eficácia antitumoral. O esguema de dosagem é apresentado abaixo.

Controlo

Os ratinhos controlo nao receberam tratamento. 44

ΕΡ 1 435 231/PT

Adriamycin® 6 mg/kg x 2) 12 mg/kg x 2) 18 mg/kg x 2) 12 mg/kg (injecção 24 mg/kg (injecção 36 mg/kg (injecção

Caelyx^ 12 mg/kg 24 mg/kg 36 mg/kg (injecção 6 mg/kg x 2) (injecção 12 mg/kg x 2) (injecção 18 mg/kg x 2)

Composição do Exemplo II 12 mg/kg (injecção 6 mg/kg x 2) 24 mg/kg (injecção 12 mg/kg x 2) 36 mg/kg (injecção 18 mg/kg x 2)

Todos os ratinhos que receberam a maior dosagem de 36 mg/kg de fármaco livre (18 mg/kg x 2 de Adriamycin®) e 3 de 4 Ratinhos que receberam a dosagem intermédia de 24 mg/kg morreram como resultado de toxicidade do fármaco. A dose maxima tolerada (DMT) de Adriamycin é, portanto, inferior a 24 mg/kg.

Os ratinhos toleraram tanto o Caelyx como a composição do Exemplo II. Ambas as formulações foram bem toleradas a 36 mg/kg. Contudo, o Caelyx® pareceu causar maior toxicidade do que a composição do Exemplo II e produziu maior perda de peso dos ratinhos que receberam a dose elevada (36 mg/kg).

Este estudo demonstra que a composição do Exemplo II é melhor tolerada do que a preparação lipossómica peguilada (Caelyx ) disponível comercialmente e a formulação lipossómica não convencional (Adriamycin®). 45 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Exemplo VIII

Avaliação da eficácia da composição lipossómica de doxorrubicina da presente invenção em ratinhos nus atímicos implantados com uma poliquimioterapia resistente, Pgp positiva, xenoenxertos de tumor do cólon humano DLD-1.

Submeteu-se a composição do Exemplo II, juntamente com Caelyx® e Adriamycin® a estudos de eficácia em ratinhos nus atímicos implantados s.c. com tumor do cólon humano DLD-1 resistente ao fármaco (Pgp+). Os animais, ratinhos nus atímicos, 4 ratinhos/grupo (10 no Grupo de controlo), implantados por via subcutânea com tumor do cólon humano DLD-1 através de implante feito com trocarte.

Controlo Os ratinhos controlo não receberam tratamento.

Adriamycin 12 mg/kg (injecção 24 mg/kg (injecção 6 mg/kg x 2) 12 mg/kg x 2)

Caelyx 24 mg/kg 36 mg/kg 48 mg/kg (injecção 12 mg/kg x 2) (injecção 18 mg/kg x 2) (injecção 24 mg/kg x 2)

Composição do Exemplo II 24 mg/kg (injecção 12 mg/kg x 36 mg/kg (injecção 18 mg/kg x 48 mg/kg (injecção 24 mg/kg x 2)2)2)

Foram utilizados para a 42 animais. experiência o total de

Resultados: No presente estudo, as dosagens de Adriamycin® foram reduzidas para 12 e 24 mg/kg com base na toxicidade observada no Exemplo VII após a administração de 36 mg/kg de fármaco livre. Em contraste, as dosagens de Caelyx® e a composição do 46 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ

Exemplo II foram aumentadas para 48 mg/kg para comparar as suas eficácias e toxicidades com o fármaco livre nas suas respectivas DMT. Todos os agentes foram administrados aos ratinhos nus atimicos i.v. através da veia da cauda nos dias 5 e 12 após implante s.c. do tumor com o xenoenxerto de tumor do cólon humano resistente a múltiplos fármacos, Pgp positivo.

Todos os grupos de tratamento demonstraram eficácia antitumoral. Contudo, os ratinhos gue receberam gualquer das preparações lipossómicas demonstraram eficácia antitumoral significativamente maior. Em dosagens equivalentes de fármaco livre (24 mg/kg), observou-se um atraso de crescimento médio do tumor de 10 dias com o fármaco livre, enquanto todos os ratinhos administrados com preparações lipossómicas tinham tumores que eram menores que 600 nm3 no dia 40. Não houve evidência de toxicidade em dosagens de 36 mg/kg, para Caelyx ou para a composição do Exemplo II. Às dosagens mais elevadas (48 mg/kg) ambas as formulações lipossómicas do fármaco (Caelyx® ou Exemplo da Composição II, 24 mg/kg x 2), os ratinhos demonstraram perda de peso >15% e 1 de 4 animais de cada um desses grupos morreu cedo (dias 17, 19) como resultado da toxicidade do fármaco. Portanto, a DMT de ambas as formulações lipossómicas foi semelhante e pareceu ser inferior a 48 mg/kg.

Em contraste com a Adriamycin , as duas formulações lipossómicas [Caelyx -(doxorrubicina peguilada) e a composição do Exemplo II (doxorrubicina não peguilada)] exibiram significativa eficácia antitumoral contra tumores de cólon humano DLD-1 resistente a múltiplos fármacos, Pgp positivo, em ratinhos atimicos nus implantados s.c.. Em doses equivalentes de 24 mg/kg, ambas as formulações lipossómicas exibiram eficácia aumentada em comparação com o fármaco livre. Adicionalmente, ambas as formulações lipossómicas exibiram toxicidades inferiores comparativamente ao fármaco livre, o que permite que mais fármaco seja administrado. A DMT para a Adriamycin parece ser cerca de metade do que para as formulações lipossómicas. As dosagens de fármaco lipossómico de 36 mg/kg foram bem toleradas. 47

ΕΡ 1 435 231/PT

Exemplos IX a XIII A composição e o processo do Exemplo IX a XIII são dados na Tabela 12.

Tabela 12

Exemplo IX Exemplo X Exemplo XI Exemplo XII Exemplo XIII Parâmetros alterados —» Tamanho da partícula aumentada Colesterol Inferior Colesterol Superior Fosfolípido C14 Hidratação Convencional Ingredientes 1 DSPC 1,565 g 1,565 g 1,565 g - 1,565 g DMPC - - - 1,565 g - Colesterol 0,521 g 0,3 g 0,74 g 0,521 g 0,521 g Clorofórmio 40 ml 40 ml 40 ml 40 ml 40 ml Meio Hidratante 60 ml 60 ml 60 ml 60 ml 120 ml Tamanho médio da partícula 0,18 μπι 0.085 μπι 0,095 μπι 0, 095 μπι 0,085 μπι Tampão de histidina 1,71 1,71 1,7 1,7 1,71 Doxorrubicina HC1 330 mg 330mg 330mg 330mg 330 mg Tampão de histidina (para solubilizar o fármaco) 22 ml 22 ml 22 ml 22 ml 40 ml Tampão de histidina (para diluição) 8 0 ml 8 0 ml 8 0 ml 8 0 ml

Procedimento:

Foi seguido o procedimento do Exemplo I para os exemplos X, XI e XII. No Exemplo IX, foi seguido o procedimento do Exemplo I, excepto para a redução de tamanho dos lipossomas, que foi realizada por extrusão através de membranas de 0,4 μη a 0,2 μιι para obter um tamanho médio no intervalo de 0,15 μιη a 0,25 μιη. No Exemplo XIII, foi seguido o procedimento do Exemplo II, excepto para o volume de hidratação, que foi duplicado.

Os resultados dos testes toxicológicos são apresentados na Tabela 13. 48

ΕΡ 1 435 231/PT TABELA 13

Observações Exemplo IX Exemplo X Exemplo XI Exemplo XII Exemplo XIII Parâmetros alterados Tamanho da partícula aumentada Colesterol Inferior Colesterol Superior Fosfolípido Cl 4 Hidratação Convencional Resultados i Ti/2 em ratinhos 2 h (Cmax e AUC não comparáveis) 3 h 5 h (Cmax e AUC não comparávei s) 2 h 4 h L D 5 g 0ΓΠ ratinhos 12 mg/kg 10 mg/kg 12 mg/kg 10 mg/kg 14 mg/kg Conclusão (com referência à composição do Exemplo I) Tl/2 significa tivamente menor Tl/2 significativamente menor e toxicidade aumentada Cmax e AUC foram significa tivamente menores Tl/2, Cmax, AUC significa tivamente menores Menor Ti/2

Exemplo XIV (Comparativo)

Composição lipossómica de doxorrubicina sem sacarose.

Formação do filme lipídico:

Dissolveu-se diestearoilfosfatidilcolina (1,565 g) e colesterol (0,521 g) um após o outro em clorofórmio (40 ml) num balão de evaporador rotativo. Misturaram-se até se formar uma solução límpida. Ligou-se o balão a um evaporador rotativo e ajustou-se a temperatura do banho de água a 60°C. Evaporou-se o solvente sob vácuo para formar uma fina película de lípidos na parede do balão. Após libertar o vácuo, rodou-se o balão durante aproximadamente 5 minutos enquanto se passava azoto no balão para expulsar qualquer solvente residual.

Hidratação: O filme lipídico no balão foi hidratado com 60 ml de meio de hidratação aquoso. 0 meio de hidratação aquoso era contendo sulfato de amónio em água a 2,04%p/v. Rodou-se o balão 49 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ contendo ο filme lipídico e o meio de hidratação durante 30 minutos num banho de água mantido a 65-68°C para formar brancos de lipossomas.

Redução de tamanho dos brancos de lipossomas por extrusão: A suspensão lipossómica obtida anteriormente foi calibrada por extrusão através de filtros com tamanho de poro de 0,4 μιη para 0,05 μιη, sucessivamente.

Diálise: A suspensão dos lipossomas calibrados sofreu diálise contra uma solução de cloridrato de histidina 0,2% p/v de pH 6,5. Utilizou-se um sistema de filtração de fluxo tangencial para a diálise. Continuou-se a diálise até ser removido o sulfato de amónio extralipossómico. A ausência de sulfato de amónio no meio extralipossómico foi confirmada utilizando reagente Nesseler.

Carregamento do fármaco:

Num balão de fundo redondo, preparou-se uma solução de 15 mg/ml de doxorrubicina HC1 por dissolução de 216 mg de cloridrato de doxorrubicina em 14 ml de solução de cloridrato de histidina (descrito acima). Adicionou-se lentamente ao balão de fundo redondo o volume medido (40 ml) de lipossomas calibrados e dialisados anteriormente e misturou-se, durante uma hora, a 65°C.

Os lipossomas carregados de fármaco foram tratados com Dowex para remover o fármaco não aprisionado.

As amostras da composição obtida antes e após tratamento com Dowex® foram analisados para o teor de doxorrubicina por cromatografia liquida de alta pressão (HPLC). Os resultados são os seguintes:

Teor de doxorrubicina total (HC1) (antes :4,02 mg/ml do tratamento com Dowex®)

Teor de doxorrubicina aprisionada (HC1) :4 mg/ml (após tratamento com Dowex®)

Diluiram-se os lipossomas carregados com doxorrubicina após a remoção do fármaco livre para uma concentração de 50 ΕΡ 1 435 231/PT doxorrubicina de 2 mg/ml (sob a forma de cloridrato) utilizando uma solução de cloridrato de histidina e sacarose (descrita anteriormente). A composição lipossómica assim obtida foi, então, filtrada assepticamente utilizando um filtro de membrana de 0,22 μιη estéril num recipiente estéril despirogenado e analisou-se para os seguintes parâmetros:

Aparência pH Tamanho de partícula Teor de doxorrubicina HC1 Endotoxinas bacterianas Esterilidade Líquido de cor vermelha, translúcido 6,3

Tamanho médio de partícula 0,097 μιη : 2,05 mg/ml : Menos de 2,2 EU/mg de doxorrubicina (na forma de cloridrato). : Estéril

Realizaram-se estudos de estabilidade na composição obtida neste Exemplo e as observações são apresentadas na Tabela 14.

Exemplo XV:

Processo de produção de uma composição lipossómica de doxorrubicina_com solução de sulfato de amónio 120 mM. (Comparativo).

Formação do filme lipídico:

Dissolveu-se diestearoílfosfatidilcolina (1,565 g) e colesterol (0,521 g) , um após o outro em clorofórmio (40 ml) num balão de evaporador rotativo. Misturaram-se até se formar uma solução límpida. Ligou-se o balão a um evaporador rotativo e ajustou-se a temperatura do banho de água a 60°C. Evaporou-se o solvente sob pressão reduzida para formar uma fina película de lípidos na parede do balão. Após libertar o vácuo, rodou-se o balão durante aproximadamente 5 minutos enquanto se passava azoto no balão para expulsar qualquer solvente residual.

Hidratação: O filme lipídico no balao foi hidratado com 60 ml de meio 51 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ de hidratação aquoso. 0 meio de hidratação aquoso consiste em sacarose a 10%p/v, sulfato de amónio em água a l,58%p/v. 0 balão contendo o filme lipidico e o meio de hidratação foi rodado durante 30 minutos num banho de água mantido a 65-68°C para formar brancos de lipossomas.

Diálise: A suspensão dos lipossomas calibrados sofreu diálise contra um tampão de histidina. Utilizou-se um sistema de filtração de fluxo tangencial para a diálise. Continuou-se a diálise até ser removido o sulfato de amónio extralipossómico. A ausência de sulfato de amónio no meio extralipossómico foi confirmada utilizando reagente Nesseler. Utilizou-se a solução de cloridrato de histidina seguinte na diálise e carregamento do fármaco (abaixo): 170,0 g de sacarose, 3,40 g de histidina HC1, 1,7 litros de água e hidróxido de sódio numa quantidade suficiente para ajustar o pH para 6,0 a 6,5.

Carregamento do fármaco:

As amostras da composição obtida antes e após tratamento com Dowex® foram analisadas para o teor de doxorrubicina por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Os resultados são os seguintes: 52

ΕΡ 1 435 231/PT

Teor de doxorrubicina total (HC1) (antes :4,11 mg/ml do tratamento com Dowex®)

Teor de doxorrubicina aprisionada (HC1) :4,10 mg/ml (após tratamento com Dowex®)

Diluíram-se os lipossomas carregados com doxorrubicina após a remoção do fármaco livre para uma concentração de doxorrubicina de 2 mg/ml (na forma de cloridrato) utilizando uma solução de cloridrato de histidina e sacarose (descrito acima). A composição lipossómica assim obtida foi, então, filtrada assepticamente utilizando um filtro de membrana de 0,22 μιη estéril num recipiente estéril despirogenado e analisou-se para os seguintes parâmetros:

Aparência PH Tamanho de partícula Teor de doxorrubicina HC1 Endotoxinas bacterianas Esterilidade Líquido de cor vermelha, translúcido 6,35

Tamanho médio de partícula 0,09 μπι : 2,03 mg/ml : Menos de 2,2 EU/mg de doxorrubicina (na forma de cloridrato). : Estéril

Realizaram-se estudos de estabilidade da composição obtida neste Exemplo e as observações são apresentadas na Tabela 14.

Exemplo XVI:

As composições do Exemplo XIV (comparativa), Exemplo XV juntamente com a Composição da presente invenção (Exemplo II) foram submetidas a estudos de estabilidade de curto prazo a temperatura acelerada (25°C).

Os resultados do teor de doxorrubicina são apresentados na Tabela 14: 53

ΕΡ 1 435 231/PT

Tabela 14

Exemplo II (Hidratado com sacarose e solução de sulfato de amónio 155 mM) Exemplo XIV (Comparativo) (Hidratado com solução de sulfato de amónio 155 mM sem sacarose) Exemplo XV .(Comparativo) (Hidratado com sacarose e solução de sulfato de amónio 120 mM) Aprisionado (mg/ml) Total (mg/ml) Aprisionado (mg/ml) Total (mg/ml) Aprisionado (mg/ml) Total (mg/ml) Inicial 2,01 2, 01 2, 05 2, 05 2,03 2,03 25°C-1 semana 2,01 2, 01 1, 86 2, 04 1,84 2,03

Este Exemplo mostra que a presença de sacarose é essencial para reduzir a fuga de doxorrubicina encapsulada e a concentração de sulfato de amónio no meio de hidratação é importante. Uma concentração de 120 mM leva à fuga de doxorrubicina encapsulada e, portanto, não é satisfatória. Contudo, com a composição do Exemplo II contendo sacarose e sulfato de amónio numa concentração de 155 mM não houve fuga da doxorrubicina encapsulada durante a duração do estudo.

Exemplo XVII:

Preparação da composição lipossómica de doxorrubicina pelo processo de remoção do solvente após a hidratação.

Dissolveu-se diestearoílfosfatidilcolina (1,565 g) e colesterol (0,521 g) um após o outro em etanol (20 ml), bombeando-se lentamente sob pressão para o meio de hidratação aquoso, que foi constantemente agitado. O meio de hidratação aquoso consistiu de sacarose a 10% p/v, sulfato de amónio a 2,04% p/v em água. Esta solução lipidica contendo o solvente etanol foi transferida para o balão de evaporador rotativo. Ligou-se o balão a um evaporador rotativo e ajustou-se a temperatura do banho de água a 60°C. Removeu-se o etanol sob vácuo.

Redução de tamanho dos brancos de lipossomas por extrusão: A suspensão lipossómica obtida anteriormente foi calibrada por extrusão sucessiva através de filtros com tamanho de poro de 0,4 μιη para 0,05 μιη. 54

ΕΡ 1 435 231/PT

Diálise; A suspensão dos lipossomas calibrados sofreu diálise contra um tampão de histidina. Utilizou-se um sistema de filtração de fluxo tangencial para a diálise. Continuou-se a diálise até ser removido o sulfato de amónio extralipossómico. A ausência de sulfato de amónio no meio extralipossómico foi confirmada utilizando reagente Nesseler. Utilizou-se a solução de cloridrato de histidina seguinte na diálise e carregamento do fármaco (abaixo): 170,0 g de sacarose, 3,40 g de histidina HC1, 1,7 litros de água e hidróxido de sódio numa quantidade suficiente para ajustar o pH para 6,0 a 6,5.

Carregamento do fármaco:

Os lipossomas carregados de fármaco foram tratados com Dowex® para remover o fármaco não aprisionado.

Diluiram-se os lipossomas carregados com doxorrubicina após a remoção do fármaco livre para uma concentração de doxorrubicina de 2 mg/ml (na forma de cloridrato) utilizando a solução de cloridrato de histidina e sacarose (descrita acima). A composição lipossómica assim obtida foi, então, filtrada assepticamente utilizando um filtro de membrana de 0,22 μιη estéril num recipiente estéril despirogenado. O resumo dos estudos toxicológicos e de eficácia realizados é o seguinte:

Exemplo II - Os lipossomas não peguilados de longo tempo de circulação contendo doxorrubicina da presente invenção mostraram efeitos tóxicos diminuídos quando comparados aos das formulações não lipossómicas de cloridrato de doxorrubicina (Adriamycin®) e formulações lipossómicas peguiladas de cloridrato de doxorrubicina (Caelyx ) . A DL5o para os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente 55 ΕΡ 1 435 231/ΡΤ invenção é superior às de Adriamycin® e Caelyx®, demonstrando-se assim que os lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção têm menor toxicidade.

Exemplo III - No estudo de toxicidade sub-aguda, observou-se um padrão similar de toxicidade para Caelyx® e para as composições dos grupos do Exemplo II nos quais a Adriamycin mostrou toxicidade.

Exemplo IV - No estudo farmacocinético, a composição do Exemplo II e Caelyx mostraram uma meia-vida plasmática comparável. 0 volume de distribuição aparente é aproximadamente igual ao volume total de sangue o que indicou baixa captação lipossómica por tecidos normais e foi semelhante ao Caelyx®. Adriamycin® mostrou taxa de depuração mais rápida e elevado volume de distribuição, indicando captação de doxorrubicina livre nos tecidos normais.

Exemplo V - No estudo de toxicidade com cães, foi melhor tolerada a composição de Exemplo II do que a Adriamycin®.

Exemplo VI - Nos modelos de tumor de leucemia L1210 e do tumor mamário humano MCF-7 em ratinhos, a composição do Exemplo II foi eficaz.

Exemplo VII - A dose máxima tolerada da composição do Exemplo II foi muito superior à da Adriamycin em ratinhos implantados com tumores.

Exemplo VIII - A Composição do Exemplo II foi eficaz em ratinhos nus atímicos implantados com xenoenxertos de tumor do cólon humano DLD-1 resistente a múltiplos fármacos, Pgp positivo.

Os Exemplos anteriores provam claramente que as composições da presente invenção são muito úteis para reduzir o crescimento tumoral. Isto envolve a administração parentérica de uma quantidade terapeuticamente eficaz de lipossomas não peguilados de doxorrubicina da presente invenção. Os lipossomas não peguilados de doxorrubicina têm um tempo de circulação prolongado, exibem toxicidade diminuída e

ΕΡ 1 435 231/PT 56 e sao não apresentam problemas como a "Síndrome Mão-Pé" portanto úteis para reduzir o crescimento tumoral.

Lisboa, 2010-03-30

Claims

ΕΡ 1 435 231/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o fabrico de lipossomas nao peguilados de longo tempo de circulação compreendendo; dissolução de um ou mais fosfolipidos e um ou mais esteróis num solvente ou mistura de solventes; hidratação dos lipidos resultantes; e remoção do(s) referido(s) solvente(s) antes ou após a referida hidratação, em que a referida hidratação se faz com um meio de hidratação aquoso numa quantidade no intervalo de 10 a 35 ml por cada mmol de fosfolípido presente na solução lipídica para formar lipossomas não peguilados, caracterizado por o meio de hidratação aquoso compreender sacarose e não menos do que 125 mmol/litro de sulfato de amónio.
2. Processo da Reivindicação 1, em que a concentração de sacarose no meio de hidratação aquoso é de 0,1 M a 0,5 M.
3. Processo da Reivindicação 2, em que a concentração de sacarose é de 0,25 M a 0,3 M.
4. Processo da Reivindicação 3, em que a concentração de sacarose é cerca de 0,27 M.
5. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que os lipossomas na composição lipossómica são calibrados de 0,06 μιη a 0,16 μιη.
6. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o sal de hidratação extralipossómico é removido da composição lipossómica utilizando uma solução tampão de diálise.
7. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a quantidade utilizada de meio de hidratação aquoso é de 20 a 35 ml por cada mmol de fosfolípido na solução lipídica. ΕΡ 1 435 231/ΡΤ 2/5
8. Processo da Reivindicação 7, em que a quantidade de meio de hidratação aquoso utilizado é cerca de 30 ml por cada mmol de fosfolípido na solução lipidica.
9. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a razão molar de fosfolípido para esterol é de 1:0,1-1:2.
10. Processo da Reivindicação 9, em que a razão molar de fosfolípido para esterol é cerca de 1:0,7.
11. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o fosfolípido é seleccionado entre diestearoílfosfatidilcolina (DSPC), dipalmitoílfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) e derivados destes fosfolípidos.
12. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o fosfolípido é a diestearoílfosfatidilcolina (DSPC).
13. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o esterol é o colesterol.
14. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes compreendendo ainda o carregamento dos lipossomas com um agente de diagnóstico ou terapêutico.
15. Processo da Reivindicação 14, em que o agente terapêutico é um agente antineoplásico.
16. Processo da Reivindicação 14, em que o agente antineoplásico é seleccionado entre cloridrato de doxorrubicina, cloridrato de daunorubicina e cloridrato de epirrubicina.
17. Processo da Reivindicação 16, em que o agente antineoplásico é o cloridrato de doxorrubicina.
18. Processo da Reivindicação 17, em que o fosfolípido é a diestearoílfosfatidilcolina e o esterol é o colesterol. ΕΡ 1 435 231/ΡΤ 3/5
19. Processo da Reivindicação 18, em que a concentração de doxorrubicina encapsulada nos lipossomas é de 1 mM a 10 mM expressa na forma de cloridrato de doxorrubicina.
20. Processo da Reivindicação 19, em que a referida concentração de doxorrubicina é 3 mM- 7 mM.
21. Processo da Reivindicação 20, em que a referida concentração de doxorrubicina é cerca de 3,45 mM.
22 . Processo da Reivindicação 20, em que a referida concentração de doxorrubicina é cerca de 6,9 mM.
23. Processo de qualquer das reivindicações 18 a 22, em que a razão molar de diestearoilfosfatidilcolina para colesterol é de 1:0,6 a 1:0,8.
24. Processo de qualquer uma das reivindicações 18 a 23, em que a razão molar de doxorrubicina encapsulada (na forma de cloridrato) para diestearoilfosfatidilcolina é de 1:2 a 1:15.
25. Processo da Reivindicação 24, em que a razão molar de doxorrubicina encapsulada (na forma de cloridrato) para diestearoilfosfatidilcolina é cerca de 1:3,5.
26. Processo de qualquer uma das reivindicações 18 a 25, em que os lipossomas na composição lipossómica hidratada são calibrados; o sulfato de amónio extralipossómico é removido da composição lipossómica calibrada utilizando uma solução tampão de histidina-sacarose compreendendo cloridrato de histidina e sacarose; a composição lipossómica libertada do sulfato de amónio extralipossómico é misturada com a solução de pelo menos 25 mM de cloridrato de doxorrubicina dissolvida numa solução tampão de histidina-sacarose compreendendo cloridrato de histidina e sacarose para proporcionar uma composição lipossómica carregada com doxorrubicina; e é removido o cloridrato de doxorrubicina extralipossómico da composição lipossómica. ΕΡ 1 435 231/ΡΤ 4/5
27. Processo da Reivindicação 26, em que a razão molar de sacarose para cloridrato de histidina no tampão isotónico utilizado para remover o sulfato de amónio extralipossómico é de 29:0,1 a 29:10.
28. Processo da Reivindicação 24 ou Reivindicação 25, em que a concentração de sacarose é de 0,1 M a 0,5 M.
29. Processo de qualquer uma das reivindicações 26 a 28, em que a concentração de cloridrato de histidina é de 8 a 12 mM.
30. Lipossoma obtenível por um processo da Reivindicação 2.
31. Lipossoma da Reivindicação 30, em que o processo é como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 30 quando dependendo directa ou indirectamente da Reivindicação 3.
32. Composição lipossómica não peguilada de doxorrubicina de longo tempo de circulação para administração parentérica compreendendo lipossomas não peguilados de doxorrubicina da Reivindicação 30 ou Reivindicação 31, cloridrato de histidina e sacarose.
33. Composição lipossómica não peguilada de doxorrubicina de longo tempo de circulação para administração parentérica compreendendo lipossomas não peguilados de doxorrubicina da Reivindicação 30 ou Reivindicação 31, cloridrato de histidina e sacarose, em que os lipossomas não peguilados de doxorrubicina compreendem um fosfolípido, colesterol e sacarose.
34. Composição da Reivindicação 33, em que o tamanho do lipossoma e/ou componentes são como definido em qualquer uma das Reivindicações 5, 9, 10, 11, 12, 13, 18 a 25, 28 e 29.
35. Composição de qualquer uma das Reivindicações 31 a 34, em que a doxorrubicina (na forma de cloridrato) está presente em cerca de 2 mg/ml; a razão molar de doxorrubicina para fosfolípido é cerca de 1:3,5; e a razão de fosfolípido para colesterol é cerca de 1:0,7. ΕΡ 1 435 231/PT 5/5
36. Composição de qualquer uma das Reivindicações 31 a 34, em que a doxorrubicina (na forma de cloridrato) está presente a cerca de 4 mg/ml e a razão molar de doxorrubicina para fosfolipido é de cerca de 1:3,5 e a razão de fosfolípido para colesterol é de cerca de 1:0,7. Lisboa, 2010-03-30