PT1526178E - Família de genes semelhantes a msp-3 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "FAMÍLIA DE GENES SEMELHANTES A MSP-3" A presente invenção refere-se à protecção contra a malária. De um modo mais particular, o pedido descreve uma nova família de genes abrangendo o já conhecido gene MSP-3 e mostrando excepcional redundância de epitopos expostos, sugerindo, desta forma que esta familia de genes desempenha um papel importante na imunogenicidade do parasita. A caracterização desta família génica possibilita a definição de novas composições imunogénicas e de vacina contra P. falciparum.

Os parasitas responsáveis pela malária em humanos, incluindo, especialmente, Plasmodium falciparum, exibem diferentes morfologias no hospedeiro humano e expressam diferentes antigénios, em função da sua localização no organismo do hospedeiro infectado. As diferenças morfológicas e antigénicas destes parasitas durante o seu ciclo de vida no homem possibilitam a definição de, pelo menos, quatro estádios distintos de desenvolvimento.

Precisamente o primeiro estádio de desenvolvimento do parasita no homem corresponde à forma esporozoíta introduzida no sangue do hospedeiro por picadas de vectores de insecto do parasita. 0 segundo estádio corresponde à passagem do parasita para o fígado e à infecção das células hepáticas, nas quais os parasitas se desenvolvem, de modo a formarem os esquizontes hepáticos que, quando estão maduros (por exemplo, no caso de P. falciparum no 6o dia após penetração dos esporozoítas), 1 libertam merozoítos hepáticos por rebentamento. 0 terceiro estádio é caracterizado pela infecção dos eritrócitos sanguíneos pelas formas assexuadas (merozoítos) do parasita; este estádio eritrocítico de desenvolvimento corresponde à fase patogénica da doença. 0 quarto estádio corresponde à formação das formas com potencial sexual (ou gametócitos) que se irão tornar formas sexuadas extracelulares ou gâmetas no mosquito.

Demonstrou-se repetidamente que os anticorpos desempenham um papel importante no desenvolvimento de imunidade clínica à malária de Plasmodium falciparum.

Numerosos estudos imunológicos sugerem, agora que os anticorpos humanos das subclasses citofílicas (igGl e lgG3) são, particularmente, críticos para o estado de pré-imunização. Esta imunidade antiparasita é um tipo de imunidade independente de estirpe, não esterilizante que é adquirida após longa exposição (15-20 anos) ao parasita. É geralmente observada em África e na Papua-Nova Guiné, mas foi apenas recentemente documentada no S-E Asiático (Soe, Khin Saw et al. 2001). Embora os anticorpos possam actuar directamente após invasão de merozoíto dos glóbulos vermelhos, o mecanismo in vivo mais eficiente para o controlo parasítico, mediado por anticorpo, em áreas endémicas requer a participação de monócitos (Khusmith e Druilhe 1983); (Lunel e Druilhe 1989). O ensaio de inibição celular dependente de anticorpo (ADCI) mimetiza esta cooperação entre monócitos e anticorpos citofílicos, específicos de parasita e surge, actualmente, como o melhor marcador substituto in vitro de imunidade adquirida contra estádios sanguíneos de P. falciparum.

Até à data, foram identificadas duas moléculas como alvos de anticorpos humanos eficazes para ADCI, nomeadamente a 2 proteína de superfície 3 de Merozoíto de 48 kDa, - a seguir designada como MSP-3 - (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun et al. 1994) e a proteína rica em Glutamato de 220 kDa, - a seguir designada como GLURP - (Theisen, Soe et al. 1998). Foi também demonstrado que GLURP e MSP-3 podem inibir o crescimento parasítico in vivo por transferência passiva em murganhos SCID humanizados de P. falciparum (Badell, Oeuvray et al. 2000). A associação de anticorpos humanos contra MSP-3 à protecção clínica é também indicada por vários estudos imunoepidemiológicos que demonstram que os níveis de anticorpos citofílicos específicos de MSP-3 (IgGl e IgG3) estão significativamente associados a um reduzido risco de ataques de malária (Roussillon 1999). Estes estudos demonstraram, adicionalmente que os anticorpos citofílicos lgG3 desempenham um papel fundamental na protecção contra a malária proporcionando, por este motivo, suporte epidemiológico ao conceito de que os anticorpos contra MSP-3 podem activamente controlar a multiplicação parasítica in vivo, por cooperação com células contendo receptores de Fcy II (Bouharoun-Tayoun, Oeuvray et al. 1995). Estes receptores exibem afinidade mais elevada para a subclasse de IgG3, do que para a subclasse de IgGl (Pleass e Woof 2001). Os principais epitopos de células B reconhecidos por estes anticorpos igG humanos foram localizados em sequências conservadas na região MSP-3212-257 (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun et al. 1994; Theisen, Soe et al. 2000; Theisen, Dodoo et al. 2001). A sequenciação nucleotídica demonstrou que estes epitopos importantes são altamente conservados entre um número de linhas laboratoriais de P. falciparum e isolados de campo de África e Ásia (Huber, Felger et al. 1997); (McColl e

Anders 1997).

Trucco et al. (2001) divulgam a sequência de proteínas das proteínas MSP6 (agora denominada MSP3.2) e MSP3 (agora 3 denominada MSP3.1) e o seu alinhamento de sequência. Oeuvray et al. (1994) divulgam a identificação de um epitopo antigénico (MSP-3b) na proteína MSP3 e descrevem as suas sequências nucleotídica e proteica. Este epitopo antigénico foi encontrado por utilização do anticorpo MoAb 2-45 e confirmado por teste de anticorpo dirigido contra um péptido MSP-3b sintético. 0 Número de Acesso Q8IJ53 descreve uma proteína hipotética de 424 aminoácidos, hipoteticamente expressa a partir de uma Fase de Leitura Aberta prevista, in silico, da sequência do genoma de Plasmodium falciparum. A requerente caracterizou, agora, uma série de 9 genes de P. falciparum, todos agrupados na extremidade 3' do cromossoma 10 que codificam proteínas e epitopos que são todos alvos para anticorpos de ocorrência natural em indivíduos expostos à malária, mediando a morte do estádio eritrocítico de P. falciparum por cooperação com monócitos sanguíneos e que exibem um grau invulgar de conservação de sequência entre vários isolados de P. falciparum. O presente pedido divulga uma família de genes isolados, denominada família semelhante a MSP-3, cujos produtos têm características estruturais e imunológicas comuns, assim como para alguns destes genes e as proteínas correspondentes, tomados individualmente.

Os polipéptidos antigénicos, como divulgados nas reivindicações compreendendo epitopos das referidas novas proteínas, assim como composições polipeptídicas antigénicas compreendendo, pelo menos, dois dos referidos epitopos são também parte da invenção. 4

Outros aspectos importantes da invenção são as composições imunogénicas e vacinas contra a malária compreendendo, como um imunogénio, um polipéptido ou uma composição polipeptídica, como anteriormente mencionado. São também divulgados os anticorpos recombinantes e suas partes que reagem de forma cruzada com diversos produtos da família génica semelhante a MSP-3, tomados como tal ou num medicamento para imunoterapia passiva ou num kit para o diagnóstico in vitro de malária. 0 pedido divulga métodos para o diagnóstico in vitro de malária num indivíduo, por utilização de um polipéptido antigénico ou por utilização de um anticorpo, como anteriormente definidos, assim como kits compreendendo, pelo menos, parte dos reagentes necessários (polipéptidos, anticorpos...) para a realização destes métodos. São também divulgadas sequências nucleotídicas codificando, pelo menos, um dos novos antigénios de P. falciparum e a sua utilização num medicamento ou uma vacina de ácido nucleico contra P. falciparum.

Ao longo da presente descrição são utilizados vários termos, os quais devem ser compreendidos de acordo com as seguintes definições:

No que se segue, o termo "gene" é sinónimo de uma "sequência de ocorrência natural", incluindo uma sequência codificante, ou de uma sequência recombinante ou sintética, incluindo uma sequência codificante. No presente texto, um "gene" não contém também, necessariamente, elementos 5 reguladores, contrariamente à aceitação desta palavra que é frequentemente utilizada na literatura cientifica. Consequentemente, o gene de acordo com a invenção é qualquer sequência nucleotidica que compreende a Fase de Leitura Aberta da sequência de ocorrência natural de Plasmodium ou que compreende a mesma e contém, adicionalmente, a totalidade ou parte das sequências reguladoras para expressão da referida sequência de ocorrência natural. De acordo com a presente definição, 0 gene é uma molécula de ácido nucleico isolada, i. e, uma sequência nucleotidica que não está no seu ambiente natural.

Na presente descrição, a expressão "família de genes" tem o mesmo significado que na literatura científica, i. e., designa um grupo de vários genes que tem várias particularidades ou características (estruturais ou funcionais) em comum.

De acordo com o presente pedido, um "motivo semelhante a MSP-3-c/d" é uma sequência de aminoácidos de 20 aminoácidos que é idêntica a qualquer das sequências de SEQ ID N° 25 a 30 ou que é obtida por rearranjo de, pelo menos, duas destas sequências. Por exemplo, uma sequência tendo os aminoácidos 1 a 5 de SEQ ID N° 25, seguidos dos aminoácidos 6 a 12 de SEQ ID N° 29 e os aminoácidos 13 a 20 de SEQ ID N° 27, é um motivo semelhante a MSP-3-c/d. Por outras palavras, um "motivo semelhante a MSP-3-c/d" é uma sequência de aminoácidos de 20 aminoácidos, em que os aminoácidos são escolhidos entre os seguintes: 6

posição de a.a. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 a. a. L E L I K L T S K D E E D I I K H N E D S H V N I S L W K N N V D E S D Q S L Y V P S R Q S N Q P I P A

Tabela 1 vários destes aminoácidos têm uma carga semelhante e não é provável que alterem a estrutura global da molécula ou o reconhecimento por anticorpos, e. g., valina, isoleucina, leucina.

Qualquer sequência de aminoácidos de 20 aminoácidos que compreende os aminoácidos mais conservados indicados anteriormente (í. e., aminoácidos nas posições 1, 2, 8, 10, 12, 14 e 17 a 20), e em que os resíduos de aminoácidos em outras posições sejam diferentes dos anteriores e que seja reconhecida por um anticorpo dirigido contra qualquer dos motivos de MSP-3-c/d de SEQ ID N° 25 a 30 irá ser também considerada como um "motivo semelhante a MSP-3-c/d", de acordo com a presente invenção. Esta última propriedade funcional pode ser testada por um imunoensaio, tais como aqueles conhecidos pelo especialista na técnica e/ou descritos abaixo.

Na presente descrição, um "motivo semelhante a MSP-3-b" designa uma sequência de aminoácidos de 11 a 14 aminoácidos que é idêntica a qualquer das sequências de SEQ ID N° 17 a 24 ou que é obtida por rearranjo de, pelo menos, duas destas sequências. Por exemplo, uma sequência tendo os aminoácidos 1 a 5 de SEQ ID N° 17, seguidos dos aminoácidos 6 a 11 de SEQ ID N° 22, é um motivo semelhante a MSP-3-b. Por outras palavras, um "motivo 7 semelhante a MSP-3-b" é uma sequência de aminoácidos de 11 a 14 aminoácidos, em que os aminoácidos são escolhidos entre os seguintes, em que significa "sem aminoácido":

posição de a.a. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 a. a. I L E R G W E F G G G V P E Y F D D A G L I S S A Y F - - P - L S A G A A L L - - - I L I E S S

Tabela 2 Vários destes aminoácidos têm uma carga semelhante e não é provável que alterem a estrutura global da molécula ou o reconhecimento por anticorpos, e. g., valina, isoleucina, leucina.

Um subgrupo de motivos semelhantes a MSP-3-b corresponde às sequências de SEQ ID N° 17, 18 e 22 e sua combinação, i. e., as sequências de 11 aminoácidos seleccionados como se segue:

posição de a.a. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 a. a. I L G W E F G G G V P Y F A I A

Tabela 3

Qualquer sequência de aminoácidos de 11 a 14 aminoácidos que compreende os aminoácidos mais conservados indicados anteriormente (í. e., os aminoácidos indicados na tabela 3 que correspondem a aminoácidos particulares nas posições 1, 2, e 5 a 13 da Tabela 2), e em que os resíduos de aminoácidos em outras posições sejam diferentes dos anteriores e que sejam reconhecidos por um anticorpo dirigido contra qualquer dos motivos de MSP-3-b de SEQ ID N° 17 a 24, irá ser também considerada como um "motivo semelhante a MSP-3-b", de acordo com a presente invenção. Esta última propriedade funcional pode ser testada por um imunoensaio, tais como aqueles conhecidos pelo especialista na técnica e/ou descritos abaixo.

No que se segue, por vezes é feita referência a um gene ou uma proteína que é um "homólogo" de um gene ou proteína particular, cuja sequência é divulgada. Aqui, esta palavra designa sequências próximas em diferentes estirpes de Plasmodium (em particular, estirpes de P. falciparum), i. e., sequências exibindo, pelo menos, 70% e, de um modo preferido, pelo menos, 90% de identidade de sequência com a sequência de referência.

Uma "substituição conservativa" significa, numa sequência de aminoácidos, uma substituição de um resíduo de aminoácido por outro que tem propriedades semelhantes, no que respeita a hidrofobicidade e/ou impedimento estereoquímico, de modo que a estrutura terciária do polipéptido não seja dramaticamente alterada. Por exemplo, substituindo uma guanina por uma alanina ou vice-versa, é uma substituição conservativa. Valina, leucina e isoleucina são também aminoácidos que podem ser conservativamente substituídos entre si. Outros grupos de substituição conservativa são, sem serem limitativos, (D, E), (K, R), (N, Q) e (F, W, Y) · Um variante de um polipéptido, obtido por substituição conservativa de, pelo menos, um aminoácido do referido polipéptido, irá ser aqui designado como um "variante conservativo" do referido polipéptido. 9

Quando necessário, são proporcionadas definições adicionais no texto seguinte. A presente requerente descreve um grupo de 9 genes, 6 dos quais nunca foram descritos e que estão todos agrupados na mesma região do cromossoma 10. De facto, este cromossoma contém uma série de 9 fases de leitura aberta, separadas por regiões não codificantes e compreende, numa fileira (5' - 3'), genes codificando proteínas denominadas primeiro GLURP, seguido de 1300 pares de bases por MSP-3 (agora denominado msp-3-1) seguido de 7 outros genes denominados MSP-3-2, MSP-3-3, MSP-3-4, MSP-3-5, MSP-3-6, MSP-3-7, MSP-3-8. Esta organização é mostrada na Figura 1.

Além de estarem agrupados na mesma região cromossómica, aqueles 9 genes têm características excepcionais que indicam que são produtos privilegiados para o desenvolvimento de vacinas contra a infecção no estádio sanguíneo de P. falciparum:

Foi demonstrado que todos os 9 genes eram simultaneamente expressos em todos os parasitas estudados, i. e., que as proteínas correspondentes poderiam ser detectadas em estádios eritrocíticos de P. falciparum e localizam-se todas na superfície merozoítica. Isto foi anteriormente mostrado para GLURP, MSP-3-1 e MSP-3-2 (designado "MSP6" por (Trucco, Fernandez-Reyes et al. 2001) e foi adicionalmente demonstrado para os restantes, pela construção de particulares sequências na extremidade N daqueles genes que são únicas para cada um deles que não partilham epitopos de reactividade cruzada e cujos anticorpos correspondentes, reagem todos com a superfície merozoítica. Além do mais, a transcrição foi demonstrada por RT-PCR com iniciadores únicos, específicos de cada. 10

Além do mais, os 8 genes semelhantes a MSP-3 partilham a mesma organização génica geral que é ilustrada na Figura 1, com uma "assinatura" N-terminal inicial de 4 aminoácidos (indicada "s" na Figura 1) idêntica em cada um deles e idêntica a proteínas homólogas de MSP-3 semelhantes, descritas em Plasmodium vivax e Plasmodium Knowlesi.

Um primeiro objectivo divulgado no pedido é, por este motivo, uma família (ou grupo) de genes isolados que tem as seguintes propriedades: - localizam-se no cromossoma 10 de Plasmodium falciparum; - são altamente conservados em estirpes de Plasmodium falciparum; são expressos em Plasmodium falciparum nos estádios eritrocíticos; codificam proteínas que têm uma assinatura NLRN ou NLRK na sua extremidade N-terminal e que se localizam na superfície merozoítica, em que a referida família compreende, pelo menos, 3 genes.

Nas proteínas da família de MSP-3 de acordo com a invenção, a assinatura NLRN ou NLRK é mais frequentemente seguida por A ou G.

Os genes da família partilham também de um modo preferido, a mesma organização geral, como mostrada na Figura 1. 11

Um exemplo de uma tal família é a família semelhante a MSP-3 completa, compreendendo os genes das sequências SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15. É também considerada como uma família génica qualquer grupo de, pelo menos, 3 genes seleccionados de entre estes genes.

Excepto a assinatura N-terminal anteriormente mencionada, o restante da parte N-terminal é altamente variável de um produto génico para o outro, ao passo que, em contraste, a extremidade C é idêntica, na sua organização, para todos os genes, excepto 2 (MSP-3-5 e MSP-3-6), incluindo o segmento "b" semelhante a epitopo ("b"), o semelhante a epitopo "c/d" ("c/d"), a região rica em Glutâmico e no C-terminal extremo um fecho de leucina.

Particulares famílias de genes são, por este motivo, famílias, como descrita acimas, em que os referidos genes têm, adicionalmente, a seguinte propriedade: codificam proteínas que têm um motivo semelhante a MSP-3-b e/ou um motivo semelhante a MSP-3-c/d. Um exemplo de uma tal família é a família abrangendo os genes das sequências SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 13 e 15 ou qualquer grupo de, pelo menos, 3 genes seleccionados de entre estas sequências.

Todas as 7 proteínas (GLURP + as 6 moléculas homólogas semelhantes a MSP-3) deduzem anticorpos em indivíduos expostos à malária.

Para aqueles produtos génicos em que foram investigadas, particularmente GLURP, MSP-3-1 e msp-3-2, as respostas imunitárias deduzidas estão associadas, sob condições de campo, a protecção clínica contra ataques de malária. Esta associação é altamente significativa estatisticamente, particularmente com 12 anticorpos preparados do isótipo IgG3 e foi confirmada em três cenários, Dielmo e Ndiop em África, Oo-Do em Birmânia. Por razões de homologia descritas abaixo, é extremamente provável que a mesma verificação se realize nos restantes 5 genes.

No caso de GLURP, MSP-3-1 e msp-3-2, as regiões visadas por anticorpos associados a protecção, são a região de não repetição RO de GLURP e a região não repetida C-terminal de MSP e MSP-3-2. Os diversos péptidos derivados de MSP-3-1 são mostrados na Fig 2. A protecção estava associada a anticorpos para os péptidos b, c e d de MSP-3.

Os anticorpos para os 7 produtos génicos são todos eficazes na mediação da morte do estádio sanguíneo de P. falciparum, no mecanismo ADCI dependente de monócito, mediado por anticorpo, sob condições in vítro. Estes resultados, descritos no Exemplo 1, mostram que os anticorpos para cada uma daquelas regiões são também eficazes no alcance da inibição de crescimento do estádio eritrocítico de P. falciparum, sob condições in vítro. A família preferida de genes tem ainda, por conseguinte, a seguinte propriedade: os anticorpos para os produtos dos referidos genes medeiam a morte do estádio sanguíneo de P. falciparum, no mecanismo ADCI dependente de monócito, mediado por anticorpo, sob condições in vítro.

De acordo com outra forma de realização preferida, uma família de genes tem ainda, por conseguinte, a seguinte propriedade: os anticorpos para os produtos dos referidos genes medeiam a inibição de crescimento de Plasmodium falciparum em murganhos infectados por P. falciparum. 13 A requerente demonstrou, também que existe um elevado qrau, muito invulgar, de conservação de sequência de cada um dos 7 genes, entre diversos isolados de P. falciparum. Isto tinha sido anteriormente demonstrado para GLURP e conduziu à escolha da região não repetitiva RO, a qual tem a conservação mais elevada entre diversos isolados tendo, contudo, algumas substituições de aminoácidos. Isto foi também demonstrado para MSPl-3-1, cuja sequência se verificou ser eminentemente conservada entre 111 isolados para a região abrangendo os péptidos a, b, c e d de MSP-3, i. e., a região utilizada para imunização de voluntários, onde não se verificou qualquer substituição de um único aminoácido e, por conseguinte, absolutamente nenhuma alteração de aminoácido. Adicionalmente, isto foi recentemente confirmado para o restante da extremidade C de MSP-3-1 e toda a região conservada C-term de MSP-3-2, MSP-3-3, MSP-3-4, MSP-3-7 e MSP-3-8 (Figuras 9 e 10) . Este notável grau de conservação de sequência desta família génica está em marcado contraste com o polimorfismo relativamente grande observado para a maioria dos outros candidatos vacinais actualmente estudados e é, obviamente, um critério importante que reforça o potencial desta família génica para o desenvolvimento de vacinas.

As famílias génicas como descrita acimas compreendendo, pelo menos, 3 genes seleccionados de entre os genes das sequências SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15, ou seus homólogos em Plasmodium, particularmente estirpes de Plasmodium falciparum são também, por conseguinte, famílias génicas preferidas.

Outro aspecto divulgado no pedido é um gene de Plasmodium falciparum isolado que tem a sequência de SEQ ID N° 5, 7, 13 ou 15, ou um gene isolado correspondendo a um homólogo de um gene 14 de Plasmodium falciparum de sequência de SEQ ID N° 5, 7, 9, 11, 13 ou 15 numa estirpe de Plasmodium.

Estes genes que são genes semelhantes a MSP-3 não descritos, podem ser muito úteis para o especialista na técnica em várias aplicações nos campos de investigação, diagnóstico e vacinações, pelas razões anteriormente e abaixo descritas. Em particular, podem ser utilizados para produzir proteínas recombinantes semelhantes a MSP-3. Consequentemente, as proteínas recombinantes de SEQ ID N° 6, 8, 10, 12, 14 e 16 são também divulgadas, assim como qualquer proteína recombinante tendo a sequência que seja um homólogo de uma proteína de SEQ ID N° 6, 8, 10, 12, 14 ou 16 numa estirpe de Plasmodium diferente da estirpe 3D7. A comparação de sequências entre genes da família de MSP-3 mostra uma conservação muito invulgar dos epitopos entre membros da família, especialmente daqueles visados por anticorpos biologicamente activos, o que é crítico para protecção. A comparação das sequências é resumida na Figura 11.

Os requerentes identificaram 2 regiões que são muito semelhantes, se não totalmente idênticas, entre membros da família e envolvem uma região crítica no péptido MSP-3-b e uma nos péptidos c e d de MSP-3 (região que é abrangida por ambos os péptidos MSP-3-c e MSP-3-d). As pequenas diferenças entre estes epitopos muito conservados entre os diversos genes são resumidas nas Figuras 12 e 13. É digno de nota e altamente significativo que as regiões mais conservadas nos diversos genes sejam aquelas duas que são os alvos de anticorpos biologicamente activos no ADCI - ensaio in vitro e por transferência passiva em murganhos SCID (ver acima). 15 A requerente demonstrou também que existe reactividade cruzada imunológica entre as diferentes proteínas da família de MSP-3, como consequência daquelas homologias estruturais entre membros da família génica (exemplo 5). A consequência prática, ao nível imunológico e de desenvolvimento de vacinas, é que a imunização por qualquer dos membros da família génica irá induzir anticorpos reactivos para os mesmos e para todos os restantes produtos génicos.

Por conseguinte, o presente pedido descreve um tipo muito particular de família multigénica onde, em vez de polimorfismo de epitopo que é habitualmente a característica de famílias multigénicas descritas até à data, a conservação de epitopo é a principal característica e onde, em caso de deleção, mutação num dado gene, outro ou todos os outros membros da família podem assumir a função antigénica. Adicionalmente, todos os genes são simultaneamente expressos por um dado parasita.

Deste modo, o pedido também divulga uma proteína que é codificada por um gene entre aqueles aqui anteriormente divulgados. Numa particular forma de realização, a proteína é uma proteína recombinante. É, por conseguinte, divulgado um polipéptido antigénico compreendendo um fragmento de, pelo menos 10, de um modo preferido, pelo menos 15, aminoácidos consecutivos de uma proteína de acordo com a invenção. Certamente, os polipéptidos limitados a fragmentos de msp-3-1 ou MSP-3-2, não são aqui considerados. 16

Os polipéptidos antigénicos preferidos de acordo com a invenção são polipéptidos antigénicos de MSP3-3 que compreendem, pelo menos, o motivo semelhante a MSP-3-c/d, como definido na SEQ ID N° 27. Um polipéptido antigénico da invenção adicionalmente compreende, pelo menos, um motivo seleccionado de entre as sequências SEQ ID N° 17 a 24 e é parte da invenção.

Outro aspecto da presente invenção é uma composição polipeptidica antigénica compreendendo um motivo semelhante a MSP3 c/d de MSP3.3, como definido acima e, pelo menos, outro motivo semelhante a MSP-3-b. Por "composição polipeptidica" significa-se uma composição compreendendo componentes polipeptidicos, i. e., polipéptidos ou moléculas compreendendo um grupo polipeptídico, tais como lipopolipéptidos, conjugados consistindo em polipéptidos ligados a um suporte, etc. As composições polipeptidicas de acordo com a invenção podem ser soluções, cápsulas de fecho, etc.

Numa particular forma de realização da composição polipeptidica antigénica de acordo com a invenção o, pelo menos outro, motivo semelhante a MSP-3-c/d é seleccionado de entre as sequências de SEQ ID N° 25 26, 28, 29 e 30 e os seus variantes conservativos.

Na composição polipeptidica antigénica da invenção os, pelo menos dois, motivos semelhantes a MSP-3-c/d diferentes podem ser transportados por moléculas distintas (i. e., a composição pode compreender uma diversidade de moléculas, cada contendo apenas um motivo); alternativamente, cada componente polipeptídico destas composições pode transportar, pelo menos, dois motivos. Uma composição antigénica como descrita acima que contém moléculas que compreendem, pelo menos, dois motivos diferentes, 17 semelhantes a MSP-3-c/d é, por este motivo, um objectivo da presente invenção. Estas moléculas podem ser moléculas complexas, nas quais os, pelo menos dois, motivos são parte de péptidos distintos covalentemente ligados a um transportador comum; de um modo preferido, o seu grupo polipeptidico é constituído por um polipéptido único compreendendo os referidos motivos. Proteínas de fusão, compreendendo várias partes provenientes de diferentes proteínas MSP-3, podem ser incluídas nestas composições.

Considerando a conservação dos epitopos, os requerentes investigaram se os anticorpos citofílicos contra GLURP e MSP-3 estão envolvidos no desenvolvimento de imunidade para malária clínica numa população asiática de Myanmar, visto terem sido referidos como sendo em África, í. e., num cenário genético humano e parasítico diferente. Os resultados, divulgados no Exemplo 7 abaixo, mostram que os níveis de anticorpos lgG3 citofílicos contra regiões conservadas de MSP-3-1 e GLURP estão significativamente correlacionados com protecção clínica contra malária de P. falciparum. Em contraste, os níveis de anticorpos lgG4 não citofílicos contra GLURP aumentaram com o número de ataques de malária. Mais importante, existiu um efeito complementar dos anticorpos IgG3, específicos de MSP-3-1 e GLURP, na protecção contra a malária. Naqueles indivíduos não respondendo a um dos antigénios, uma forte resposta ao outro foi consistentemente detectada e associada a protecção, sugerindo que a indução de anticorpos contra MSP3 e GLURP poderia ser importante para o desenvolvimento de imunidade protectora.

De acordo com outra forma de realização da invenção, a composição polipeptídica antigénica adicionalmente compreende, por este motivo, uma molécula polipeptídica antigénica 18 compreendendo, pelo menos, 10 resíduos de aminoácidos consecutivos da região RO de GLURP.

Como anteriormente mencionado, uma composição polipeptídica antigénica de acordo com a invenção pode compreender um número limitado de moléculas, cada compreendendo uma variedade de epitopos ou uma variedade de moléculas, cada compreendendo um número limitado de epitopos. De acordo com uma particular forma de realização, a composição de polipéptidos antigénicos compreende desde 2, de um modo preferido, desde 3 a menos de 9 polipéptidos codificados pelos genes da invenção.

Um exemplo de composição polipeptídica antigénica de acordo com a última possibilidade é um mixotopo compreendendo uma variedade de péptidos sintéticos compreendendo a sequência: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-G-X9-X10-X11-X12 (SEQ ID N° 31), em que: XI = I, Y ou nenhum; X2 = L, F OU nenhum; X3 = E, D, P ou nenhum; X II D OU nenhum; X5 = G, A, L ou nenhum; X6 = W, G, S, I ou E; X7 = E, L OU A; X co II VI I, G, L ou S; X9 = G, S OU A; X10 = V, A, L v I ou S;

Xll =P, Y ou L; X12 = E, F ou nenhum. 19

Um "mixotopo" é uma biblioteca combinatória de péptidos que pode ser obtida numa única síntese, como descrito por (Gras-Masse, Georges et al. 1999).

Outro mixotopo derivado de MSP-3-b e que pode ser incluído numa composição polipeptídica antigénica de acordo com a invenção é um mixotopo compreendendo uma variedade de péptidos sintéticos compreendendo a sequência

Xi-X2-X3-W-E- X4-G-G-G-X5-P (SEQ ID N° 32), em que:

Xi = I ou Y: X2 = L ou F; X3 = G ou A; X4 = F ou I; e X5 = V ou A.

De um modo semelhante, outra composição polipeptídica antigénica de acordo com a invenção é um mixotopo compreendendo uma variedade de péptidos sintéticos compreendendo a sequência L-X1-X2-X3-X4-X3-X5-X6-X7-D-XS-X9-X10-I-X11-X12-X13-X14- X15-X16 (SEQ ID N° 33) , em que: XI = E ou S; X2 = L, H, S ou Q; X3 = I, V ou L; X4 = K, N, Y ou P; 20 Χ5 = Τ, S ou Ρ; Χβ = S ou L; Χ7 = Κ, W ou S; Χ8 = Ε, Κ, R ou I; Χ9 = Ε ou Ν; ΧΙΟ = D, Ν ou Q; XII = I, V, S, Ρ ou Α; Χ12 = Κ, D ou Ν; Χ13 = Η ou Ε; Χ14 = Ν ou S; XI5 = Ε ou D; Χ16 = D ou Q.

As composições polipeptídicas antigénicas anteriores podem ser uma mistura de, pelo menos 50, pelo menos 100, ou pelo menos 500 péptidos de diferentes sequências. Estas podem compreender também uma biblioteca combinatória de péptidos sintéticos correspondendo a cada das observadas e potenciais substituições. É também incluida na presente invenção uma composição antigénica, compreendendo uma mistura dos dois mixotopos descrito acimas.

Em qualquer dos polipéptidos antigénicos ou composições polipeptídicas antigénicas descrito acimas, uma molécula lipidica pode ser ligada a, pelo menos, parte das moléculas polipeptídicas. Um exemplo de molécula lipidica que pode ser utilizada é, por conseguinte, um resíduo palmitoilisilamida C-terminal.

Como já mencionado acima, pelo menos parte dos polipéptidos ou moléculas polipeptídicas no polipéptido antigénico de acordo com a invenção, podem ser ligados a um suporte constituindo, 21 desse modo, conjugados. Nesta forma de realização da invenção, os suportes preferidos são partículas virais, esférulas de nitrocelulose ou poliestireno e polímeros biodegradáveis, tais como lipofosfoglicanos ou ácido poli-L-láctico.

Outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma composição imunogénica compreendendo, como um imunogénio, um polipéptido ou uma composição polipeptídica especialmente preparado por recombinação, como qualquer daqueles descrito acimas.

Como discutido no Exemplo 5, a família génica aqui descrita apresenta uma característica notável que é a conservação de epitopo entre os vários membros da família, o que conduz a reactividade cruzada imunogénica entre os vários produtos da família génica. 0 potencial de vacinação de MSP-3-1 e os seus fragmentos, ilustrado nos Exemplos 2 e 3, juntamente com a conservação de epitopo e a reactividade cruzada anteriormente mencionada, são características notáveis que fazem desta família génica e das composições polipeptídicas derivadas desta, candidatos particularmente interessantes para vacinação contra a malária. Outro aspecto da presente invenção é, por este motivo, a utilização de um polipéptido ou uma composição polipeptídica, como descrito acimas, para a preparação de uma vacina contra a malária, assim como uma tal vacina, compreendendo, como um imunogénio, o referido polipéptido ou composição polipeptídica, em associação com um veículo farmacêutico adequado.

Uma composição imunogénica e uma vacina de acordo com a invenção podem adicionalmente compreender, pelo menos, um antigénio seleccionado de entre LSA-1 (Guerin-Marchand, Druilhe et al. 1987), LSA-3 (Daubersies, Thomas et al. 2000), LSA-5, 22 SALSA (Bottius, BenMohamed et al. 1996), STARP (Fidock, Bottius et al. 1994), TRAP (Robson, Hall et al. 1988), PfEXPI (Simmons, Woollett et al. 1987), CS (Dame, Williams et al. 1984), MSPl (Miller, Roberts et al. 1993), MSP2 (Thomas, Carr et al. 1990), MSP4 (Marshall, Tieqiao et al. 1998), MSP5 (Marshall, Tieqiao et al. 1998), AMA-1 (Peterson, Marshall et al. 1989; Escalante, Grebert et al. 2001), SERP (Knapp, Hundt et al. 1989) e GLURP (supra).

De acordo com uma particular forma de realização da invenção, a composição imunogénica ou a vacina é formulada para injecção intradérmica ou intramuscular. Nesse caso, a referida composição imunogénica ou vacina compreende, de um modo preferido, entre 1 e 100 pg de imunogénio por dose de injecção, de um modo mais preferido entre 2 e 50 pg. Alternativamente, a composição imunogénica ou a vacina pode ser formulada para administração oral, como descrito por (BenMohamed, Belkaid et al. 2002) . A composição imunogénica ou vacina da invenção pode também compreender adicionalmente SBAS2 e/ou Alúmen e/ou Montanida como um adjuvante.

Outros aspectos da presente invenção referem-se a anticorpos e fragmentos de anticorpos dirigidos contra os antigénios aqui divulgados. Como descrito acima e no Exemplo 5, a conservação de epitopo na família de MSP-3 conduz a reactividade cruzada dos anticorpos obtidos contra um antigénio. Por exemplo, um anticorpo sintético ou recombinante que reage de forma cruzada com MSP-3-3 e que medeia a inibição ou morte de crescimento do estádio sanguíneo de Plasmodium falciparum, no mecanismo ADCI, dependente de monócito, mediado por anticorpo, 23 sob condições in vítro, é um anticorpo particularmente interessante de acordo com a invenção.

Um agregado de anticorpos e/ou fragmentos de anticorpos dirigido contra polipéptidos de acordo com a invenção é também parte da invenção.

Outro agregado de anticorpos e/ou fragmentos de anticorpos de acordo com a invenção é dirigido contra uma composição polipeptidica, como descrita acima.

Os anticorpos preferidos (ou fragmentos) de acordo com a invenção são anticorpos humanos ou humanizados. Estes anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, em Lemna, assim como em milho, tabaco, células CHO e semelhantes. Quando produzidos em células CHO, podem ser obtidos, por exemplo, por utilização do método descrito no documento WO 03/016354. A presente invenção diz também respeito à utilização de uma composição compreendendo um anticorpo ou um agregado de anticorpos ou seus fragmentos, como descritos acima, para a preparação de um medicamento contra a malária. Certamente, um medicamento para a imunoterapia passiva da malária, compreendendo um tal anticorpo ou um agregado de anticorpos é também considerado como parte da invenção. Um tal medicamento pode compreender, adicionalmente, anticorpos dirigidos contra, pelo menos, um antigénio seleccionado de entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXPl, CS, MSPl, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP e GLURP. 24 São também incluídos na invenção métodos, para a profilaxia, a redução ou o tratamento de malária, por administração a um doente que dela necessita, de uma composição imunogénica, uma vacina ou um medicamento compreendendo anticorpos, como descrito acimas. A invenção diz também respeito a um método para o diagnóstico in vitro de malária num indivíduo susceptível de estar infectado por P. falciparum que compreende a colocação de uma amostra biológica do referido indivíduo em contacto com um polipéptido antigénico da invenção, sob condições possibilitando a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre o referido péptido ou polipéptido antigénico e os anticorpos possivelmente presentes na amostra biológica e a detecção in vitro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados. Neste método, o diagnóstico in vitro pode ser realizado por um ensaio ELISA. É também possível colocar a amostra biológica em contacto com um ou vários péptidos antigénicos provenientes de outros antigénios seleccionados de entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXPl, CS, MSP-3-1, MSP-3-2, MSP-3-5, MSP-3-6, MSPl, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP e GLURP, como uma etapa adicional do método.

Um método alternativo para o diagnóstico in vitro de malária num indivíduo susceptível de estar infectado por P. falciparum compreende a colocação de uma amostra biológica do referido indivíduo em contacto com anticorpos de acordo com a invenção, sob condições possibilitando a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre os referidos anticorpos e os antigénios específicos para P. falciparum possivelmente presentes na amostra biológica e a detecção in vitro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados. 25

Estão também contemplados kits para o diagnóstico de malária, com base nas particulares caracteristicas da família de MSP-3. Por exemplo, podem compreender, pelo menos, um péptido ou polipéptido de acordo com a invenção, possivelmente ligado a um suporte. Um tal kit pode compreender, adicionalmente, reagentes para possibilitar a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre o referido péptido ou polipéptido antigénico e os anticorpos possivelmente presentes numa amostra biológica, e reagentes possibilitando a detecção in vitro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados.

Outro kit para o diagnóstico in vitro de malária, de acordo com a invenção, compreende anticorpos como descritos acima e, se necessário, reagentes para possibilitar a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre os referidos anticorpos e antigénios das proteínas da família de MSP-3 possivelmente presentes numa amostra biológica e reagentes possibilitando a detecção in vitro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados. É também parte da presente invenção uma sequência nucleotídica recombinante codificando para um polipéptido antigénico de acordo com a invenção. São sequências particulares de acordo com a invenção, as sequências nucleotídicas da invenção compreendendo uma sequência codificando, pelo menos, dois motivos semelhantes a MSP-3-b e/ou semelhantes a MSP-3-c/d, em que, pelo menos, um dos referidos motivos é seleccionado de entre os motivos de SEQ ID N° 19 a 24 e 27 a 30 ou os seus variantes conservativos. Um exemplo é uma sequência nucleotídica recombinante, compreendendo uma sequência codificando uma proteína de fusão compreendendo vários motivos semelhantes a MSP-3-c/d, em que, pelo menos, dois dos referidos motivos são 26 seleccionados de entre os motivos de SEQ ID N° 25 a 30 e seus variantes conservativos. A invenção diz também respeito a um vector de clonagem e/ou expressão recombinante, compreendendo uma sequência nucleotidica da invenção como descrita acima que pode estar, por exemplo, sob o controlo de um promotor e elementos reguladores homólogos ou heterólogos, vis-à-vis, à célula hospedeira, para expressão na célula hospedeira.

Um vector de expressão como descrito no parágrafo anterior pode ser, de um modo vantajoso, utilizado para a preparação de um medicamento para imunização genética contra Plasmodium falciparum. A invenção diz também respeito a uma vacina de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica da invenção.

Uma célula hospedeira recombinante, por exemplo, uma bactéria, uma levedura, uma célula de insecto ou uma célula de mamífero que é transformada por um vector de expressão como descrito acima é também parte da presente invenção.

Diversos aspectos e vantagens da presente invenção são ilustrados nas seguintes figuras e dados experimentais. LEGENDAS DAS FIGURAS:

Figura 1: Organização de nove genes aglomerados na mesma região do cromossoma 10. Nove fases de leitura aberta estão separadas por regiões não codificantes e codificam numa 27 fileira (5' - 3') genes codificando proteínas denominadas primeiro GLURP, seguido de 1300 pares de bases por MSP-3 (agora denominado MSP-3-1) seguido de 7 outros genes denominados MSP-3-2, MSP-3-3, MSP-3-4, MSP-3-5, MSP-3-6, MSP-3-7, MSP-3-8.

Figura 2: Diversos péptidos derivados de MSP-3-1. A protecção estava associada a anticorpos para os péptidos b, c e d de MSP-3.

Figuras 3, 4 e 5: Estudos in vivo. Experiências de transferência passiva de anticorpos específicos para murganhos imunocomprometidos, infectados por P. falciparum, enxertados com RBCs humanas.

Verificou-se que os anticorpos para o péptido MSP 3-b, péptido MSP—3—d e para a região RO de GLURP foram todos, sob condições de transferência passiva in vivo, capazes de depurar uma parasitemia de P. falciparum estabelecida em murganhos SCID imunocomprometidos.

Figura 6: Estudos in vivo. Resultados de confirmação.

Um anticorpo recombinante humano dirigido para o epitopo de MSP-3-b, de reacção cruzada com a proteína recombinante MSP-3-2 que, após transferência passiva, pode depurar a parasitemia em murganhos SCID de P. falciparum.

Figura 7: Resultados obtidos utilizando anticorpos deduzidos por uma imunização artificial de voluntários humanos utilizando um Péptido Sintético Longo abrangendo a região dos péptidos b, c, d de MSP-3. 28 0 mesmo efeito é observado, sob condições in vitro e sob condições in vivo, no modelo de murganho SCID de P. falciparum.

Figura 8: Comparação entre o efeito biológico de IgG africana total com anticorpos anti-MSP-3-b purificados, ajustados à mesma concentração que na IgG africana total. É observado um efeito mais forte e mais completo só dos anticorpos anti-MSP-3-b, o que realça o seu potencial de vacina.

Figura 9: Alinhamento ClustalW das sequências nucleotidicas da família de MSP-3.

Figura 10: Alinhamento ClustalW das sequências peptídicas da família de MSP-3.

Figura 11: Comparação de sequências entre genes da família de MSP3.

Esta comparação mostra uma conservação muito invulgar dos epitopos entre membros da família, aqueles visados por anticorpos biologicamente activos, o que é crítico para protecção.

Figura 12: Motivos semelhantes a MSP-3-b.

Figura 13: Motivos semelhantes a MSP-3-c-d.

Figura 14: A. Padrão de respostas de anticorpo IgG3 contra cada um dos antigénios nos 30 indivíduos protegidos de OoDo 29 (médias e erros padrão das razões de respostas específicas de lgG3). B. Padrão de respostas de IgG3 em 7 habitantes de OoDo protegidos, com baixa resposta de IgG3 anti-MSP3 (valores de detecção de corte de IgG3 baixos foram definidos como aqueles abaixo dos limites inferiores do Intervalo de confiança de 95% da média, í. e., razões de IgG3 anti-MSP3b <2,30). C Padrão de respostas de IgG3 em 15 habitantes de OoDo protegidos, com baixa resposta de IgG3 anti-RO (valores de detecção de corte de IgG3 baixos foram definidos como aqueles abaixo dos limites inferiores do intervalo de confiança de 95% das razões de IgG3 médias, i. e., razões de IgG3 anti-RO de GLURP < 1,38). D. Alterações em intervalos de 5 anos em 7 indivíduos protegidos com elevadas respostas de igG3 MSP3 em 1998. E. Alterações em intervalos de 5 anos em 6 indivíduos protegidos com elevadas respostas de IgG3 anti-RO de GLURP em 1998.

Figura 15: Actividade de ADCI de anticorpos purificados por afinidade em diversas construções derivadas da família génica MSP-3. Os resultados são expressos como o SGI médio (índice inibitório de crescimento específico) em comparação a um controlo positivo, o agregado de imunoglobulinas africanas imunes (PIAG) que foi utilizado para transferência passiva em crianças tailandesas. As sequências utilizadas para purificação de afinidade correspondem à região C-terminal que é a parte mais homóloga entre os genes e a única muito bem conservada e são indicadas por uma linha debaixo da região C-terminal na Figura 18. 30

Os resultados mostram que todos os anticorpos específicos para cada região para cada dos 6 genes estão fortemente activos no mecanismo ADCI, tal como o agregado de imunoglobulinas africanas mostrou ser eficaz na depuração da transferência passiva de P. falciparum em indivíduos infectados.

Figura 16: Padrão de reactividade cruzada, de anticorpos purificados por afinidade na região C-terminal de cada dos membros da família de MSP-3, com outros membros da família de MSP-3. GLURP, 571 e BSA servem como controlos negativos.

Os resultados mostram que os anticorpos purificados por afinidade numa dada região C-terminal de um membro da família reage de forma cruzada, em diversos graus, com todos os outros membros da família de MSP-3. 0 padrão de reactividade cruzada mais forte é obtido com MSP-3-4, o que mostra um sinal positivo forte com todos os outros membros seguidos de MSP-3-8. Contudo, esta transferência dot meramente mostra epitopos de reactividade cruzada em cada dos membros da família de MSP-3.

Figura 17: Padrões de reactividade cruzada, de anticorpos purificados por afinidade na região C-terminal de cada um dos membros da família de MSP-3, com péptidos derivados dos membros de MSP-3-1 e de MSP-3-2 da família de MSP-3. Os péptidos são péptidos a, b, c, d e f de MSP-3-1 e de MSP-3-2. 0 C-terminal e BSA de MSP-3 recombinante servem como controlos positivo e negativo, respectivamente.

Os resultados mostram que os anticorpos para as reqiões C-terminais dos diversos membros da família reagem, em 31 diversos graus, com diversas regiões da extremidade C de MSP-3-1, particularmente b e c de MSP-3, e a resposta mais forte sendo obtida em MSP-3-f. A reactividade cruzada com diversos péptidos de MSP3-2 não é tão forte como aquela obtida com MSP-3-1. Finalmente, a reactividade cruzada muito forte obtida com MSP-3-1 CT, o C-terminal recombinante sugere também uma reactividade cruzada com um epitopo não definido por qualquer dos péptidos individuais mas, muito provavelmente, um epitopo conformacional produzido pelo C-terminal recombinante mais longo. Neste caso, a extensão da reactividade cruzada de qualquer anticorpo purificado por afinidade para qualquer dado membro da família, demonstra a homologia estrutural dos diversos membros dessa família e a existência de epitopos de reactividade cruzada, incluindo aqueles produzidos por conformação tridimensional. 0 mesmo se aplica para MSP-3-2.

Figura 18: Uma representação esquemática dos diversos membros da família de MSP-3. 0 sublinhado é a região C-terminal que foi utilizada para construir antigénios recombinantes que foram utilizados nos imunoensaios. 32 EXEMPLOS :

Exemplo 1: Morte do estádio sanguíneo in vitro de P. falciparum por anticorpos para os produtos génicos, pelo mecanismo ADCI

2.A. Materiais e métodos: o ensaio ADCI 2.A.I. Introdução 0 ensaio de Inibição Celular Dependente de Anticorpo (ADCI) é concebido de modo a avaliar a capacidade de os anticorpos inibirem o crescimento in vitro de Plasmodium falciparum na presença de monócitos. Estudos demonstraram que os anticorpos que provaram ser protectores contra os estádios sanguíneos de P. falciparum por transferência passiva em humanos são incapazes de inibir o parasita in vitro, a não ser que sejam capazes de cooperar com monócitos sanguíneos. Foi também demonstrado que os anticorpos que não eram protectores in vivo, não tinham qualquer efeito no crescimento de P. falciparum no ensaio ADCI. 0 ADCI é, por conseguinte, um ensaio in vitro cujos resultados reflectem o efeito protector de anticorpos anti-maláricos observado sob condições in vivo em humanos.

Os anticorpos capazes de cooperar com monócitos devem ser obviamente citofílicos: os isótipos igGl e IgG3 são eficientes em ADCI, enquanto IgG2, IgG4 e IgM não são eficientes. Isto é consistente com as conclusões que nos soros de indivíduos protegidos, os anticorpos citofílicos anti-P.falciparum são predominantes, enquanto em doentes não protegidos os anticorpos produzidos contra o parasita são maioritariamente não citofílicos. 33

Os resultados sugerem que o ADCI provavelmente envolve a seguinte sucessão de eventos: no momento da ruptura de esquizontes, o contacto entre algum componente de superfície merozoítica e anticorpos citofílicos ligados a monócitos por meio do seu fragmento Fc, provoca a libertação de mediadores solúveis que se difundem no meio de cultura e bloqueiam a divisão de parasitas intra-eritrocíticos circundantes.

As principais etapas envolvidas no protocolo ADCI são: (i) . Preparação de soro de IgG utilizando cromatografia de permuta iónica. (ii) . isolamento de monócitos a partir de um dador de sangue saudável. (iii) . Preparação de parasitas P. Falciparum, incluindo sincronização e enriquecimento de esquizonte. (iv) . Cultura de parasita, durante 96 h, na presença de anticorpos e monócitos. (v) . Efeito de inibição avaliado por observação microscópica e contagem de parasita. 2.A.2. Materiais

Preparação de JgG 1. Tampão Tris: Tris-HCl a 0,025 M, NaCl a 0,035 M, pH 8,8. 2. Solução Salina Tamponada com Fosfatos (PBS), pH 7,4. 3. Coluna de filtração GF-05-Trisacryl (IBF, Biothecnics, Villeneuve La Garenne, França). 34 4. Coluna de cromatografia de permuta iónica DEAE-Trisacryl (IBF) . 5. Coluna de Filtração G25. 6. Filtros e tubos Amicon para concentração de proteína (detecção de corte de Peso Molecular: 50000 Da). 7. Filtros estéreis Millex, tamanho de poro de 0,22 pm (Millipore Continental Water Systems, Bedford MA). 8. Espectrofotómetro equipado com lâmpada Ultra Violeta.

Preparação de Monócitos 1. Sangue heparinizado recolhido de um dador saudável, volume de 20-40 mL. 2. Gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Pharmacia LKB Uppsala, Suécia). 3. Solução de Hank, suplementada com NaHC03, pH 7,0. 4. Meio de cultura RPMI 1640, suplementado com Hepes a 35 mM e NaHCCh a 23 mM; preparar com água mineral; armazenar a 4 °C. 5. Reagentes para coloração de esterase não específica (NSE): solução de fixação, nitrito, corante, tampão e substrato. 6. Placas de plástico de 96 poços estéreis (TPP, Suíça). 7. Centrífuga refrigerada. 8. Incubadora de C02. 9. Microscópio invertido.

Preparação de Parasita 1. Meio de cultura RPMI 1640 (ver anteriormente). 2. Solução-mãe de Albumax a 10%; armazenar a 4 °C, até 1 mês. 3. Sorbitol a 5% para sincronização de parasita. 35 4. Plasmagel para enriquecimento de esquizonte. 5. Reagentes para fixação e coloração de esfregaços finos: metanol, eosina, azul de metileno. 2.A.3. Métodos

Preparação de IgG

As igGs são extraidas de soros humanos (ver a Nota 1) como se segue: 1. Diluir o soro a uma razão de 1 para 3 em tampão Tris. 2. Filtrar o soro diluído através de uma coluna de filtração em gel, GF-05 Trisacryl, anteriormente equilibrada no tampão Tris. Garantir que a razão de soro para gel de filtração é 1 volume de soro não diluído para 4 volumes de gel GF-05. 3. Agregar as fracções contendo proteína. 4. Carregar sobre uma coluna de cromatografia de permuta iónica, DEAE-Trisacryl, anteriormente equilibrada com tampão Tris. Garantir que a razão de soro para gel de filtração é 1 volume de soro não diluído para 4 volumes de gel DEAE. 5. Recolher fracções de 1 mL de volume. 6. Medir a densidade óptica (OD) de cada fracção utilizando um filtro de 280 nm. 7. Calcular a concentração de IgG como se segue:

Concentração de IgG (mg/mL) - QD 280 ΠΓΠ 1,4 8. Agregar as fracções contendo IgGs. 36 9. Concentrar a solução de IgG utilizando filtros Amicon. Os filtros Amicon são primeiro embebidos em água destilada, durante 1 hora e, depois, adaptados para tubos especiais, nos quais a solução de IgG é adicionada. 10. Centrifugar os tubos a 876 g, durante 2 h, a 4 °C. Isto conduz, habitualmente, a uma concentração de 25 vezes. 11. Realizar uma etapa final de filtração em gel utilizando uma coluna G25, anteriormente equilibrada em meio de cultura RPMI. 12. Recolher as fracções de IgG em RPMI. 13. Medir a densidade óptica (OD) de cada fracção utilizando um filtro de 280 nm. 14. Calcular a concentração de IgG. 15. Agregar as fracções contendo IgGs. 16. Esterilizar as fracções de IgG por filtração através de filtros de tamanho de poro de 0,22 pm. 17. Armazenar a solução de IgG estéril, a 4 °C, até 1 mês (ou adicionar Albumax para armazenamento mais longo - mas não recomendado).

Preparação de Monócitos O processo para a preparação de monócitos é baseado naquele descrito por Boyum (Scand J. Clin. Lab. Invest. 1968, 21, 77-89) e inclui as seguintes etapas: 1. Diluir o sangue heparinizado 3 vezes em solução de Hank. 2. Dispor cuidadosamente em camadas dois volumes de sangue diluido sobre 1 volume de Ficoll-Hypaque (volume máximo de 20 mL de sangue diluído por tubo). 3. Centrifugar a 560 g, durante 20 min, a 20 °C. 37 4. Remover a camada celular mononuclear na interface Ficoll/plasma. 5. Adicionar 45 mL de solução de Hank à suspensão celular mononuclear. 6. Centrifugar a 1000 g, durante 15 min, a 20 °C. 7. Cuidadosamente ressuspender as células sedimentadas em 45 mL de solução de Hank. 8. Centrifugar, de novo, a 1000 g, durante 15 min, a 20 °C. Repetir esta etapa de lavagem mais duas vezes. 9. Por fim, centrifugar a 180 g durante 6 min, a 20 °C, de modo a remover quaisquer plaquetas que permaneçam no sobrenadante. 10. Ressuspender as células mononucleares em 2 mL de RPMI. 11. Calcular a concentração celular mononuclear (i. e., linfócitos mais monócitos) na suspensão celular: diluir uma aliquota de 20 pL da suspensão celular 3 vezes em RPMI e contar o número de células utilizando um hemocitómetro (tipo Malassez, por exemplo). 12. Determinar o número de monócitos utilizando a técnica de coloração de Esterase Não Especifica (NSE): (i) . No microtubo A, adicionar 40 pL de suspensão celular mononuclear para 40 pL de solução de fixação. (ii) . No microtubo B, misturar os reagentes de coloração NSE na seguinte ordem: 60 pL de nitrito, 60 pL de corante, 180 pL de tampão e 30 pL de substrato. (iii) . Adicionar a mistura no microtubo B às células no microtubo A. (iv) . Tirar uma amostra de 20 pL das células coradas e medir a proporção de monócitos: linfócitos: os monócitos irão estar corados de castanho, enquanto os linfócitos não terão cor. Habitualmente, a proporção 38 de monócitos é 10-20% das células mononucleares totais. 13. Ajustar a suspensão celular para uma concentração de 2 x 105 monócitos por 100 pL, com RPMI. 14. Aliquotar a suspensão celular numa placa de 96 poços, a 100 pL/poço. 15. Incubar durante 90 min, a 37 °C, C02 a 5%. Durante esta incubação, os monócitos irão aderir ao plástico. 16. Remover as células não aderentes e lavar os monócitos por adição e removendo exaustivamente, de 200 pL de RPMI em cada poço. 17. Repetir este processo de lavagem 3 vezes, para remover todas as células não aderentes. 18. Pelo menos 95% das células recuperadas irá ser monócitos. Controlar a aparência celular e a homogeneidade relativa de distribuição celular nos diferentes poços por observação, utilizando um microscópio invertido (ver as Notas 2, 3 e 4).

Preparação de Parasita

As estirpes de P. falciparum são cultivadas em RPMI 1640, suplementado com Albumax a 0,5%.

Os parasitas são sincronizados por tratamentos de Sorbitol como se segue: 1. Diluir a solução-mãe de sorbitol para 5% em água mineral. 2. Centrifugar a suspensão da cultura de parasita assíncrona a 1200 rpm, durante 10 min, a 20 °C. 39 3. Ressuspender o sedimento na solução de sorbitol a 5%. Isto irá conduzir à lise selectiva de RBC infectadas por esquizonte, sem qualquer efeito nos anéis e trofozoítas jovens.

Quando requerido, os esquizontes são enriquecidos por flutuação em plasmagel, como se segue: 1. Centrifugar culturas contendo parasitas assíncronos a 250 g, durante 10 min, a 20 °C. 2. Ressuspender o sedimento a uma concentração final de glóbulos vermelhos (RBC) a 20%, RPMI a 30 o °r plasmagel a 50%. 3. Incubar a 37 °c, durante 30 min. As RBC infectadas por esquizontes irão permanecer no sobrenadante, enquanto os trofozoítas jovens infectados e as RBC não infectadas irão sedimentar. 4. Recolher cuidadosamente o sobrenadante, por centrifugação a 250 g, durante 10 min, a 20 °C. 5. Preparar um esfregaço fino a partir das células sedimentadas, corar e determinar a parasitemia por exame microscópico. 6. Habitualmente, utilizando este método, as RBC infectadas por esquizontes síncronos são recuperadas a -70% de parasitemia.

Para o ensaio ADCI, são utilizados parasitas esquizontes precoces. Habitualmente a parasitemia é 0,5-1,0% e o hematócrito 4%.

O Ensaio ADCI 1. Após a última etapa de lavagem, adicionar em cada poço contendo monócitos: 40 (i) . 40 pL de RPMI, suplementado com Albumax a 0,5% (meio de cultura). (ii) . 10 pL da solução de anticorpo a ser testada.

Habitualmente, as IgG são utilizadas a 10% da sua concentração original no soro (—20 mg/mL para adultos de áreas hiperendémicas e ~12 mg/mL para crianças de áreas endémicas e doentes de ataque primário). (ver a Nota 5) . (iii) . 50 pL de cultura de parasita, a 0,5% de parasitemia e hematócrito a 4%. 2. O controlo dos poços consiste no seguinte; (i) . Monócitos (MN) e parasitas com IgG normal (N IgG), preparados a partir do soro de um dador sem qualquer história de malária. (ii) . Cultura de parasita com IgG a ser testada, sem MN. 3. Manter a cultura a 37 °C, durante 96 h, num frasco de vidro (ou baixo 02, incubadora de C02 a 5%). 4. Adicionar 50 pL de meio de cultura a cada poço após 48 e 72 h. 5. Remover o sobrenadante após 96 h. Preparar esfregaços finos a partir de cada poço, corar e determinar a parasitemia por exame microscópico. Para garantir uma precisão relativa na contagem de parasita, um minimo de 50000 glóbulos vermelhos (RBC) deve ser contado e a percentagem de RBC infectadas calculada (ver Notas 6 e 7). 6. Calcular o índice Inibitório de Crescimento Especifico (SGI) tendo em conta a possível inibição induzida só por monócitos ou anticorpos: 41 SGI = 100 X (1 - [Percentagem de parasitemia com MN e Abs / Percentagem de parasitemia com Abs] / [Percentagem de parasitemia com MN + N igG / Percentagem de parasitemia com N IgG]) 2.A.4. Notas 1. A preparação de IgG a partir de soros a testar é uma etapa essencial, em virtude de uma inibição não dependente de anticorpo de crescimento parasítico ter sido frequentemente observada quando eram utilizados soros não fraccionados, provavelmente em virtude de lípidos oxidados. 2. A função de monócito (MN) em ADCI está dependente de diversos factores, tais como a água utilizada para preparar RPMI 1640. Água altamente purificada, tal como água Millipore, embora adequada para cultivo parasítico, conduz a um fraco rendimento no número de MN recuperados após aderência aos poços de plástico. Por outro lado, a água que contém vestígios de minerais, tal como a água comercialmente disponível Volvic ou a água destilada em vidro, proporciona consistentemente uma boa função monocítica. 3. A aderência monocítica melhorada pode ser obtida por revestimento dos poços de cultura com fibronectina, í. e., revestimento com plasma autólogo do dador de MN, seguido de lavagem com RPMI 1640, antes de incubação com células mononucleares. 4. MN de indivíduos com uma infecção virai (e. g., influenza) são frequentemente capazes de indução de uma inibição não 42 dependente de IgG do crescimento parasítico. Este efeito de inibição não específica poderia prevenir a observação da inibição dependente de IgG em ADCI. Por conseguinte, dadores de MN suspeitos de terem uma infecção virai, ou que tenham tido febre nos últimos 8 dias, devem ser evitados. Os resultados de ADCI não são fiáveis quando o efeito directo só de MN é superior a 50% de inibição. A preparação de MN em meio contendo soro heterólogo, tal como FCS, resulta na diferenciação de MN, sua transformação progressiva em macrófagos que perderam o seu efeito de promoção de ADCI. 5. Se requerido, a IgG murina pode ser testada em ADCI com MN Humanos. O isótipo lgG2a é capaz de se ligar ao receptor II de Fc y humano presente em monócitos que se demonstrou estarem envolvidos no mecanismo ADCI. 6. Uma variação possível do ensaio ADCI é a avaliação de um efeito de competição entre anticorpos citofílicos protectores (adultos de área hiperendémica), dirigidos para os antigénios de superfície merozoítica, e anticorpos não protectores (crianças de área endémica e doentes de ataque primário) que reconhecem os mesmos antigénios mas não são capazes de provocar a activação monocítica, em virtude de não se ligarem a receptores Fc gama. Por conseguinte, a Ig não citofílica dirigida para os antigénios "críticos", pode bloquear o efeito ADCI de anticorpos protectores. Cada fracção de IgG deve ser utilizada a 10% da sua concentração original no soro. 7. O protocolo do ensaio ADCI pode ser modificado e realizado como um ADCI de duas etapas, com activação de curto prazo de monócitos, de acordo com o seguinte processo: 43 (i) . Incubar MN, durante 12-18 hrs, com Ig de teste e RBC infectadas por esquizontes maduros síncronos, a 5-10% de parasitemia. Durante este primeiro tempo de cultura, ocorre a ruptura de RBC infectadas e são libertados merozoítos. (ii) . Recolher os sobrenadantes de cada poço e centrifugar os mesmos a 700 g. (iii) . Distribuir os sobrenadantes numa placa de 96 poços, a 100 pL/poço. (iv) . Adicionar a cada poço 100 pL de cultura assíncrona de P. falciparum contendo meio novo, a 0,5-1% de parasitemia, 5% de hematócrito (é tido particular cuidado para reduzir a um mínimo a contaminação leucocitária da preparação de RBC utilizada para esta segunda cultura). (v) . Às 36 h de cultura, adicionar 1 mCi de 3H hipoxantina a cada poço. (vi) . Às 48 h de cultura, recolher as células e estimar a absorção de 3H por contagem num contador de cintilação líquida. 44 2.Β. Resultados

Condições ADCI anticorpo volume MN (- ) MN (+) % de SGI % de SGII Adj Directo ADCI 02/03 17/1/03 RPMI 10 pL 7,8 7,1 0% 0% Estirpe de parasita 3D7 NIG dialisado 5 pL 7,5 6,3 8% 4% Preparação de MN conjugar PIAG (IFA 35000)Ali 10 pL 11, 8 5 53% 100% -51% Para. inicial (%) 0,5% assíncrono em AB+ RBC anti-MSP3.1 CT (MSP3 Simon) 10 pL 11, 8 5 53% 100 % -51% Para. final (%) 7, 8% anti-MSP3.4 CT 10 pL 12, 6 5,1 56% 104 % -62% Duração de ADCI 72 h 15 pL 9,4 5 42% 78% -21% Inibição de MN 9% anti-MSP3.7 CT 10 pL 9,9 5 45% 83% -27% % de dador MN Cito congelado 18/10/02 15 pL 11, 4 10 4% 7% -46% ADCI padrão anti-MSP3.1 CT (MSP3 antigo) 10 pL 11 4, 6 54% 101 % -41% 15 pL 11, 3 4, 6 55% 103% -45% placa 1 anti-MSP3.2 CT (MSP6) 10 pL 12, 5 3,4 70% 131 % 60% Todos os anticorpos foram ajustados 15 pL 9,8 4,5 50% 93% -26% para um título IFA de 1:200 anti-MSP3.8 CT 10 pL 12 4,4 60% 112 -54% 15 pL 8,2 7,7 -3% -6% -5% anti-MSP3.3 CT 10 pL 9,1 4,1 51% 94% -17% 15 pL 9,1 4,5 46% 85% -17%

Tabela 1: 45

As regiões C-terminais utilizadas para a produção dos anticorpos são indicadas na Figura 18 e correspondem às linhas horizontais debaixo de cada das proteínas. Foram clonados em E. coli utilizando o vector PTCR-His.

Exemplo 2: Ensaios in vivo por transferência passiva de anticorpos em murganhos

Os resultados in vitro mostrados no exemplo 1 foram confirmados sob condições in vivo por experiências de transferência passiva de anticorpos específicos para murganhos imunocomprometidos, infectados por P. falciparum, enxertados com RBC humanas.

Os materiais e métodos utilizados para realizar as experiências descritas no presente exemplo são descritos em (Brahimi, Perignon et al. 1993; Badell, Oeuvray et al. 2000). Em particular, os métodos para a obtenção dos anticorpos foram descritos por Brahimi et al.

Em virtude da complexidade do manuseamento deste modelo, não puderam ser testados todos os anticorpos até aqui, porém os anticorpos para o péptido MSP-3-b, péptido MSP-3-d e para a região RO de GLURP foram todos, sob condições de transferência passiva in vivo, capazes de depurar uma parasitemia de P. falciparum estabelecida em murganhos SCID imunocomprometidos (Figuras 3, 4 e 5) . Pode constatar-se que o efeito de depuração dos anticorpos anti-MSP-3-b e MSP-3-d é extremamente forte e, inversamente à depuração induzida por anticorpos anti-GLURP, ajustado à mesma concentração de anticorpo, é menos eficaz: o tempo para depuração de parasitas a seguir à transferência é 46 cerca de duas vezes mais longo com anti-GLURP do que o obtido com anticorpos anti-MSP-3. Aqui, de novo, por razões aqui descritas, a rede de reactividade cruzada entre os 6 genes descritos em detalhe, implica que os anticorpos dirigidos para os outros genes irão, muito provavelmente, ter o mesmo efeito biológico se transferidos em murganhos infectados por P. falciparum. Finalmente, este efeito in vivo foi adicionalmente confirmado por utilização de um anticorpo recombinante humano dirigido para o epitopo de MSP-3-b (Figura 6), de reacção cruzada com a proteína recombinante MSP-3-2 e que, após transferência passiva, pode depurar a parasitemia em murganhos SCID de P. Falciparum. Resultados essencialmente semelhantes foram também obtidos utilizando anticorpos deduzidos por imunização artificial de voluntários humanos utilizando um Péptido Sintético Longo, abrangendo a região dos péptidos b, c, d de MSP-3 que mostrou o mesmo efeito, sob condições in vitro e sob condições in vivo, no modelo de murganho SCID de P. falciparum (Figura 7).

Exemplo 3: Experiências de Imunização em macacos

Os dados protectores reunidos sob condições in vitro e in vivo foram adicionalmente confirmados de um modo independente, por demonstração de que os macacos aotus imunizados por MSP-3-1 na forma recombinante adjuvanteada por adjuvante completo de Freund, produziram anticorpos eficazes no mecanismo ADCI e que os macacos, quando provocados por uma inoculação no estádio sanguíneo de P. Falciparum virulento, foram capazes de controlar e depurar a sua parasitemia de P. falciparum, enquanto os macacos de controlo não o foram. 47

Exemplo 4: Comparação dos efeitos biológicos obtidos com IgG africana total e com anticorpos anti-MSP-3-b purificados A comparação do efeito biológico obtido com IgG africana total e com anticorpos anti-MSP-3-b purificados, ajustados à mesma concentração que na IgG africana total, mostra um efeito mais forte e mais completo só dos anticorpos anti-MSP-3-b, o que realça o seu potencial de vacina. No decurso de estudos anteriores e presentes, os requerentes observaram que os anticorpos purificados por afinidade para o péptido MSP-3-b aparentemente tinham um efeito mais rápido e mais forte do que a IgG africana total, a partir da qual foram extraídos. Esta observação foi extremamente intrigante, visto o P. falciparum ser composto por quase 6000 proteínas diferentes, e o péptido MSP-3-b ser apenas uma pequena região de uma delas, pode calcular-se que os anticorpos anti-MSP-3-b corresponderiam a menos de 1/10000 dos anticorpos totais deduzidos por exposição ao parasita.

Foram conduzidos estudos adicionais com IgG total ou com anticorpos anti-MSP-3-b e são resumidos na figura 8. É digno de nota que nestas experiências, a quantidade de anticorpos anti-MSP-3-b na IgG total ou na preparação purificada era exactamente a mesma. Estas experiências que correspondem à média + SD de 6 murganhos tratados por anticorpos anti-MSP-3-b e 6 murganhos tratados por IgG africana total purificada, confirmaram claramente que existiu: - um efeito muito mais rápido dos anticorpos anti-MSP-3-b, 48 um efeito mais completo dos anticorpos anti-MSP-3-b, visto que os mesmos conduziram a uma depuração completa da parasitemia em murganhos, enquanto a igG imune conduziu a uma diminuição mas sem efeito esterilizante, como foi o caso com a mesma preparação quando injectada em voluntários humanos (e, como é o caso, em dadores adultos africanos que mantêm uma parasitemia crónica, de baixo grau).

Esta observação implica que existem outros anticorpos presentes na IgG africana imune que competem ou bloqueiam o efeito inibitório de anticorpos anti-MSP-3. Esta interacção negativa entre diferentes anticorpos é reminiscente daquela referida, por exemplo, por Blackman e colaboradores para anticorpos anti-MSP-1. Pode estar também relacionada com a interferência de anticorpos não citofilicos dirigidos para outros antigénios de superfície merozoítica e que poderiam actuar indirectamente, por exemplo, por impedimento estereoquimico, reduzindo o acesso para antigénios de MSP-3 de anticorpos anti-MSP-3.

Em todo o caso, esta observação tem também implicações muito importantes para o desenvolvimento de vacinas: pode ser tomada como uma indicação de que a imunização por antigénios maláricos seleccionados pode deduzir respostas protectoras mais fortes do que aquelas resultando de exposição a todas as proteínas maláricas ou, pelo menos, a várias destas.

Por outras palavras, a imunização, por moléculas que estão identificadas como alvos de mecanismos protectores pode conduzir à indução de uma protecção mais forte do que aquela desenvolvida por exposição natural, a qual já é a protecção mais forte 49 conhecida contra estádios sanguíneos assexuados em humanos. É, deste modo, extremamente promissor para o desenvolvimento de uma futura vacina malárica eficiente.

Exemplo 5: Conservação de epitopo na família de MSP-3

Os materiais e métodos utilizados para realizar as experiências descritas no presente exemplo são descritos em (Brahimi, Perignon et al. 1993; Badell, Oeuvray et al. 2000). Em particular, os métodos para a obtenção dos anticorpos foram descritos por Brahimi et al.

Como uma consequência das homologias estruturais entre membros da família génica, a existência de reactividade cruzada imunológica entre as proteínas correspondentes foi confirmada: anticorpos humanos foram purificados por afinidade no produto de cada gene e reagiram para todos os restantes.

Os resultados mostram que os anticorpos induzidos contra uma única proteína da família de MSP-3 reagem também com outros antigénios, em imunotransferência (Figuras 16 e 17) e em ELISA (Tabela 2 abaixo). 50 MSP3.1 CT MSP3.2 CT MSP3.3 CT MSP3.4 CT MSP3.7 CT MSP3.8 CT 571-His BSA Anti- MSP3.1CT 100 6 33 4 35 23 3 4 Anti-MSP3.2CT 54 100 22 4 39 37 4 4 Anti-MSP3.3CT 117 45 100 5 100 47 5 5 Anti-MSP3.4CT 216 44 130 100 147 103 10 10 Anti-MSP3. 7CT 32 4 3 3 100 5 4 4 Anti-MSP3.8CT 73 23 26 8 53 100 6 5

Tabela 2: Os anticorpos para os sete produtos génicos são todos eficazes na mediação da morte do estádio sanguíneo de P. falciparum, no mecanismo ADCI dependente de monócito, mediado por anticorpo, sob condições in vitro. Os resultados mostram que os anticorpos para cada uma destas regiões são também eficazes no alcance da inibição de crescimento do estádio eritrocítico de P. falciparum sob condições in vitro.

Este estudo o qual ainda está em curso, demonstrou que os anticorpos purificados por afinidade no produto de um gene reagiram de forma cruzada com os produtos dos outros genes e vice-versa para cada deles, o que é também indirectamente demonstrado pelos resultados obtidos em ADCI (Exemplo 1). A consequência prática, ao nível imunológico e de desenvolvimento de vacinas, é que a imunização por qualquer dos membros da família génica irá induzir anticorpos reactivos para os mesmos e para todos os restantes produtos génicos. 51

Por conseguinte, isto constitui um tipo muito particular de família multigénica onde, em vez de polimorfismo de epitopo que é habitualmente a característica de famílias multigénicas descritas até à data, a conservação de epitopo é aqui a principal característica e onde, em caso de deleção, mutação num dado gene, outro ou todos os outros membros da família podem assumir a função antigénica. Adicionalmente, todos os genes são simultaneamente expressos por um dado parasita. É aqui proposto que isto constitui não apenas uma família de vacinas preferida mas também um mecanismo desenvolvido pelo parasita de modo a garantir a sua sobrevivência. 0 parasita pode apenas sobreviver desde que não mate o seu hospedeiro: por indução de anticorpos que reduzem a parasitemia através do mecanismo ADCI, o parasita garante um grau suficiente de protecção do hospedeiro imune e, por conseguinte, garante a sua própria sobrevivência. A duplicação de epitopo proporcionada pela família génica garante que mais do que um produto génico pode preencher esta tarefa essencial.

Exemplo 6: Resultados obtidos em adci com péptidos de MSP-3-2

Os resultados obtidos em ADCI com os péptidos a, b, c, d, e e F de MSP-3-2 são os mesmos que aqueles obtidos com os mesmos péptidos de MSP-3-1, í. e., os anticorpos dirigidos contra os péptidos b, c, d e e de MSP-3-2 têm uma actividade ADCI, enquanto aqueles dirigidos contra os péptidos a e f de MSP-3-2 não têm. 52

Exemplo 7: Complementaridade entre respostas para MSP3 e GLURP mostradas num estudo de acompanhamento longitudinal clínico e parasitológico

7.A. MATERIAIS E MÉTODOS 7.A.I. Área de estudo, população e vigilância clínica A aldeia de OoDo é uma região florestal repovoada de Myanmar, com um clima tropical, caracterizado por estações secas e quentes, secas e frias e monções. Verificou-se que, nesta área, a malária era estável e hiperendémica, com variação sazonal, a maioria das infecções deviam-se a Plasmodium falciparum (98%) e o Plasmodium vivax era responsável pelos restantes 2%. 0 ataque de malária foi definido de acordo com 4 critérios concomitantes: i)- temperatura axilar corrigida > 38,0 °C, ii)- ausência de outras doenças clínicas, iii)- presença de formas assexuadas de P. falciparum em filmes espessos e iv)- melhoria clínica e parasitológica após tratamento com cloroquina. Dois ataques febris eram considerados como dois episódios de malária diferentes se fossem separados por á72 h. Os resultados dos primeiros 33 meses de acompanhamento foram recentemente publicados (Soe, Khin Saw et al. 2001). A mesma população de estudo foi acompanhada durante mais um ano, até 31 de Dezembro de 1998, utilizando o mesmo protocolo. Amostras de sangue venoso foram retiradas durante Setembro de 1998 e as taxas de ataques de malária registados de 1 de Janeiro a 31 de Dezembro de 1998 foram utilizadas para analisar a relação com protecção clínica. 53 7.A.2. Amostragem sanguínea e estudo parasitológico A vigilância da infecção malárica foi efectuada por exame mensal sistemático de filmes sanguíneos espessos e finos de picada no dedo. Uma lâmina era considerada como negativa se não fosse visualizado qualquer parasita em 200 campos de óleo em filme espesso corado com Giemsa. Para os casos febris, foram examinados dois filmes de picada no dedo, antes e após tratamento de cloroquina. As amostras venosas foram recolhidas em vacutainers, os soros aliquotados assepticamente e armazenados a - 20°C, até serem testados. As amostras retiradas de um subgrupo representativo de 116 aldeões, a partir das quais mais de 60% dos filmes sanguíneos mensais estava disponível para dados parasitológicos, foram seleccionadas a partir da maior coorte de 292 residentes. 7.A.3. Antigénios

Os três antigénios de GLURP recombinantes eram derivados da região de não repetição N-terminal RO (GLURP27-500) r da região de repetição central Rl (GLURP489-705) e da região de repetição C-terminal R2 (GLURP705-1178) de P. falciparum F32 (Oeuvray, Theisen et al. 2000). O fragmento de 19 kDa C-terminal de MSPl, MSPlig, da estirpe Wellcome (MSPl-W-19) foi produzido como uma proteína de fusão GST recombinante em Escherichia coli e foi uma generosa oferta do Dr. A. Holder, UK. A cauda GST foi removida por clivagem enzimática e subsequente cromatografia de afinidade antes de utilização. O péptido sintético MSP3b (18 4-AKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEEN-210, SEQ ID N° 5) continha O epitopo de célula B MSP3b que reage com anticorpos humanos eficazes em ADCI (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun et al. 1994). 54 7.A.4. Ensaios de Anticorpo

Os níveis de anticorpos para os três antigénios derivados de P. Falciparum foram medidos por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), como descrito acima (Oeuvray, Theisen et al. 2000) . Resumidamente, as placas de microtitulação (Maxisorb, Nunc, Dinamarca) foram revestidas, de um dia para o outro, a 4 °C, com proteínas recombinantes ou péptido sintético, às seguintes concentrações: 0,5 pg/mL (RO e R2), 1 pg/mL (RI e MSPl) e 5 pg/mL (MSP3b) . Para os antigénios de GLURP, Na2C03 a 0,05 M, pH 9,6 e para MSPl e MSP3, solução salina tamponada com fosfatos (PBS), pH 7,4, foram utilizados como tampões de revestimento. No dia seguinte, as placas foram lavadas com PBS mais Tween 20 (PBST) a 0,05% e bloqueadas com 2,5% de leite magro em PBS, durante 2 h. Os soros diluídos em PBST contendo 1,25% (p/v) de leite magro foram adicionados a poços duplicados e incubados, durante 1 h, à temperatura ambiente. Foram preparadas várias diluições de soros para cada antigénio: 1:200 para GLURP, 1:100 para MSPl e 1:20 para MSP3. Estas diluições foram seleccionadas após estudos piloto preliminares que revelaram uma diferença superior a 10 vezes entre as amostras de controlo e de teste. O anticorpo ligado foi detectado por imunoglobulina de cabra anti-humana conjugada a peroxidase (Caltag Laboratories), diluída 1:3000. A cor foi revelada por O-fenilenodiamina (Sigma, St. Louis, Mo.) e H202 em tampão de citratos, pH 5, durante 30 min. A densidade óptica (OD) a 492 nm foi determinada num leitor de placas (Titertek Multiskan MCC 1340). As placas foram extensivamente lavadas com PBST entre cada etapa de incubação. Todos os testes ELISA incluíram 6 soros de controlo, aleatoriamente seleccionados entre dadores nunca expostos à malária. 55

Para determinação de subclasses de IgGl-4, foram utilizadas subclasses monoclonais de murganho anti-humano (clones NLl6=IgGl (Boehringer®), HP6002=IgG2 (Sigma®), Zg4=lgG3 e RJ4=IgG4 (ambas da Immunotech®) ) . Foram diluídas 1:2000, 1:10000, 1:10000 e 1:1000, respectivamente em 1,25% (p/v) de leite magro em PBST e incubadas, durante 1 h, à temperatura ambiente. igG de cabra anti-murganho conjugada a peroxidase (Caltag Laboratories®), diluída 1:3000 em 1,25% (p/v) de leite magro em PBST foi adicionada e incubada durante 1 h. O anticorpo marcado ligado foi revelado como descrito acima. As diluições de cada anticorpo monoclonal (MAb) especifico de isótipo tinham sido determinadas anteriormente como aquelas discriminando entre as subclasses de Ig humana, i. e., não produzindo reacções cruzadas entre subclasses (Oeuvray, Theisen et al. 2000). Os resultados para a IgG total, assim como os niveis de anticorpo de subclasse, foram expressos como razões de resposta de anticorpo que foram calculadas por divisão da OD média de teste pela média mais 3 SD dos 6 controlos normais corridos simultaneamente. Uma amostra com uma razão de ^ 1 era considerada positiva. 7.A.5. Análise estatística O teste U de Mann-Whitney e o coeficiente de correlação de ordenamento hierárquico de Spearman foram utilizados para os cálculos de valores P. A associação entre o risco de ataque de malária durante 1998 e os niveis de anticorpos (expressos em razões) foi testada com software JMP®, utilizando um modelo de regressão de Poisson, onde foi controlado o efeito de factores de confusão, tais como idade, género, tempo passado na aldeia e transmissão, ou uma análise de regressão logística (com ou sem ocorrência de ataque de malária). 56

7.8. RESULTADOS 7.B.I. Infecções de P. falciparum na coorte de estudo

Todos os 116 indivíduos na coorte de estudo eram da aldeia de OoDo, situada em Myanmar, Sudeste Asiático, onde a malária é hiperendémica (Soe, Khin Saw et al. 2001). A prevalência de parasitemia de P. falciparum flutuou em torno de 40%, de Janeiro a Julho e baixou para cerca de 20% de Agosto a Dezembro em 1998. A incidência de malária clínica que foi calculada como o número médio de ataques por mês na coorte de estudo e expresso em percentagem, variou consideravelmente ao longo do ano, com um pico em Junho. A taxa de inoculação ineficaz não foi determinada para OoDo, contudo, Tun-Lin, W et al. (Tun-Lin, Thu et al. 1995) verificaram 13,7 picadas infecciosas, por pessoa, por ano, numa aldeia localizada 15 km a Este da aldeia de OoDo. A verificação concorda bem com um número estimado de 11 picadas ineficazes, por pessoa, por ano, como calculada pelo método de (Beier,

Killeen et al. 1999). A maior parte das infecções (98%) deveram-se a P. falciparum (Soe, Khin Saw et al. 2001). Durante o período de 12 meses de vigilância clínica contínua, 86 (74%) dos 116 aldeões tiveram, pelo menos, um ataque de malária, como definido na secção de Material e Métodos e estes indivíduos foram considerados como sendo susceptíveis à malária. Durante o mesmo período de 12 meses, 30 (26%) dos aldeões não tiveram qualquer episódio de malária clinica e estes indivíduos foram considerados como clinicamente protegidos. 57 7.Β.2. Reconhecimento de anticorpo de antigénios de MSP3, GLURP e MSPl derivados de P. falciparum Níveis de IgG, e subclasses de IgG contra o péptido MSP3bi84-2io (MSP3b) e as quatro proteínas recombinantes representando as regiões C-terminais GLURP27-500 (RO), GLURP489-705 (RI) , GLURP705-1179 (R2) e MSPl-19-kDa foram determinados nos 116 soros recolhidos durante Setembro de 1998. 0 R2 foi o antigénio mais frequentemente reconhecido por anticorpos IgG (67,2%) seguido de Rl, MSP3b e MSPl (todos a 62%) e RO (58,6%). Os valores de OD mais elevados foram obtidos contra RO e R2, enquanto MSP3b produziu valores inferiores de OD. Níveis de IgG contra todas as três regiões GLURP e MSPl estavam significativamente associados a idade (coeficiente de correlação de ordenamento hierárquico de Spearman, R = 0,51, 0,26, 0,41 e 0,43 para RO, Rl, R2 e MSPl, respectivamente, P < 0,05), enquanto a resposta de IgG contra MSP3 era independente da idade (R = 0,16, P = 0,17). Quanto às respostas de subclasse, igGl e IgG4 contra MSPl, IgG2 contra MSP3, IgGl e IgG3 contra R0, IgG2 e IgG3 contra Rl e IgG4 contra R2, verificaram estar significativamente associadas a idade (Tabela 3) . Para qualquer dos antigénios testados, nem o nível nem a prevalência de resposta de anticorpo positiva variou com o género. 58

Antigénios Subclasses de IgG P R MSPl IgGl 0,0002 0,344 IgG4 0,0009 0,309 MSP3 IgG2 0,0090 0,242 Antigénios de GLURP RO IgGl 0,0220 0,213 IgG3 0,0040 0,268 RI IgG2 0,0040 0,268 IgG3 0,0008 0,313 R2 IgG4 0,0140 0,231

Tabela 3. Relação entre a idade e o nível de respostas de anticorpo de subclasse para cada um dos antigénios estudados. Os valores de P e R foram calculados pelo Coeficiente de Correlação de Ordenamento de Spearman 7.B.3. Respostas de anticorpo e protecção clínica

Uma diferença flagrante entre as respostas de subclasse de IgG foi observada para os três antigénios diferentes (Tabela 4). Por exemplo, a resposta de IgG contra o fragmento de 19 kDa C-terminal de MSPl foi quase exclusivamente da subclasse de igGl, com um valor mediano 8,6 vezes superior no grupo protegido do que no grupo susceptível, enquanto os anticorpos IgG3 predominaram contra o epitopo de MSP3b em indivíduos protegidos, com um valor mediano 6,5 vezes superior àquele verificado em indivíduos susceptíveis. Embora menos pronunciada, uma dissemelhança semelhante na resposta de subclasses de IgG citofílicas foi também observada para diferentes regiões de GLURP, os anticorpos igGl predominado contra a região RO de não repetição e os anticorpos IgG3 prevalecendo contra a região R2 de repetição. 59

Antigénio Subclasse de IgG Grupo protegido (n = 30) Grupo susceptível (n = 86) Valores de P Factor de diferença MSPl IgGl 9,5 (0,8-25,03) 1,1 (0,5-8,22) , 003 # 8,6 IgG2 0, 9 (0,8-1,26) 0,9 (0,8-1,09) >, 05 IgG3 0,9 (0,1-2,63) 0,4 (0,0-0,81) >, 05 IgG4 1,2 (0,8-3,01) 1,0 (0,7-1,47) ,01 MSP3 IgGl 1,4 (0,8-2,4) 0,7 (0,4-7,0) <,001* 2,0 IgG2 1,1 (0,9-1,57) 0, 8 (0,7-1,0) >, 05 IgG3 6, 5 (2, 5-14,03) 1,0 (0,6-1,49) <,001* 6, 5 IgG4 1,3 (1,0-1,82) 1,0 (0,9-1,35) <,001* 1,3 RO IgGl 3,9 (2,4-7,62) 1,8 (1,0-3,15) <,001* 2,2 IgG2 0,9 (0,4-2,5) 0, 8 (0,4-1,33) >, 05 IgG3 1,3 (0,6-3,76) 0,9 (0,3-1,44) , 019 IgG4 0,2 (0,2-2,05) 0,6 (0,2-1,07) >, 05 RI IgGl 0,3 (0,1-0,9) 0,2 (0,1-0,4) >, 05 IgG2 0,9 (0,4-1,64) 0,6 (0,4-0,91) >, 05 IgG3 1,2 (0,4-2,64) 0,5 (0,2-0,91) ,039 IgG4 0,2 (0,2-0,52) 0,7 (0,2-0,94) , 021 R2 IgGl 2, 0 (0,9-5,4) 1,1 (0,3-3,11) ,01 IgG2 2, 0 (1,0-4,02) 0, 9 (0,2-1,73) <,001* 2,2 IgG3 6, 4 (1,7-12,01) 0, 9 (0,3-2,83) <,001* 7,1 IgG4 1,0 (0,6-1,2) 0,6 (0,4-0,85) , 003

Tabela 4. Níveis medianos (e gama interquartil) de anticorpos de subclasse de igG para antigénios de MSPl, MSP3 e GLURP verificados em aldeões de OoDo considerados como protegidos, ou susceptíveis a, ataques de malária de P. falciparum ao longo de 1 ano de acompanhamento activo e contínuo. Dado o número de testes estatísticos efectuados, foi aplicado o factor de correcção de Bonferroni, de modo a determinar o nível de signif icância e apenas os valores de P < 0, 0025 foram considerados significativos (*). Os valores de P foram determinados a partir do teste U não paramétrico de 60

Mann-Whitney. Factor de diferença refere-se à razão de valores medianos dos dois grupos. # Valores marginalmente diferentes.

Visto que os títulos de anticorpos contra GLURP e MSPl aumentaram em função da idade, a correlação do estado clínico dos aldeões com diversos anticorpos foi reexaminada num modelo de regressão logístico, considerando a idade e todas as respostas de anticorpo (logaritmicamente transformadas) como variáveis explanatórias. Ao testar estes parâmetros no modelo e, em particular, quando a idade era controlada, de entre todas as respostas de anticorpo, os preditores mais fortes de protecção de malária identificados eram os níveis aumentados de IgG3 contra MSP3b (razão F = 67,5; P < 0, 0001) e contra RO de GLURP (razão F = 23,1; P < 0,0001). Outros anticorpos não estavam significativamente associados a protecção. Em contraste, a análise indicou que os níveis de IgG4 contra R0 (razão F = 4,4; P = 0, 038) e RI (razão F = 3,9; P = 0,051) aumentaram com o número de ataques de malária, í. e., foram, de certa forma, preditivos de susceptibilidade à malária. 7.B.4. Especificidade de antigénio de respostas de lgG3 em aldeões A Figura 14A mostra o padrão geral de respostas de anticorpo IgG3 verificado contra os diferentes antigénios de estádio sanguíneo em OoDo. Foi grande a gama de valores para a maioria de respostas de anticorpo específicas de antigénio e esta sugeriu que poderão existir diferentes subgrupos de "respondedores". Nem todos os soros de aldeões que estavam protegidos da malária clínica mostraram valores de IgG3 elevados 61 tanto contra MSP3b como RO de GLURP. Alguns indivíduos exibiram uma reactividade de lgG3 inesperadamente baixa contra um destes 2 antigénios. Numa tentativa de compreender de que modo estes aldeões estavam protegidos contra ataques de malária, foram identificados dois subgrupos, caracterizados por: a)- baixas respostas de lgG3 contra MSP3 (7 de 30 casos) ou b)- baixas respostas de IgG3 contra RO (15 de 30 casos) . Foram estimados os níveis de anticorpos IgG3 contra os outros três antigénios (Fig. 14B). Verificou-se que os 7 indivíduos protegidos (idade média ± 1 erro padrão = 33,9 ±7,0 anos) com uma baixa resposta de IgG3 para MSP3b (razão de IgG3 = 1,26 ± 0,22) tinham uma forte resposta de IgG3 para RO (razão de IgG3 = 9,09 ± 3,41) e para R2 (razão de lgG3 = 8,36 ± 5,86). No 2o subgrupo de 15 outros indivíduos (24,7 ± 4,3 anos de idade) também protegeram, apesar de uma baixa resposta de IgG3 para R0 de GLURP (razão de IgG3 = 0,55 ± 0,08), verificou-se a situação inversa (Figura 14C): foi observada uma elevada resposta de anticorpo IgG3 contra MSP3b (razão de IgG3 = 10,45 ± 2,07) e, em menor extensão, contra R2 de GLURP (razão de

IgG3 = 4,43 ± 0,80). Os títulos para aqueles respondendo a apenas um antigénio tenderam a ser superiores àqueles respondendo a ambos os antigénios (Tabela 4) . O número de anos gastos na aldeia de OoDo não diferiu significativamente entre os grupos de baixos respondedores a MSP3 (20, 43 ± 4,70 anos de residência) e R0 (18,7 ± 10,6 anos de residência).

Os soros de 13 dos 30 indivíduos considerados como protegidos em 1998 também tinham sido amostrados em 1993 e, por conseguinte, foram utilizados para comparar, em intervalos de 5 anos, os níveis relativos de anticorpos IgGl e IgG3 anti-MSP3 e anti-RO. Como mostrado na Fig 14D e 14E, não existiu qualquer alteração fundamental detectável nos níveis de IgGl específico 62 contra os dois antigénios. Em contraste, os níveis de anticorpos lgG3 tanto para MSP3 como GLURP aumentaram de 1993 para 1998. No subgrupo de 7 indivíduos com lgG3 elevada contra MSP3 em 1998 (Fig 14D), a diferença correspondeu a um aumento de 1,67 vezes (P = 0,11). No subgrupo de 6 indivíduos com IgG3 elevada contra RO em 1998 (Fig 14E), a diferença correspondeu a um mais importante, í. e., aumento de 3,93 vezes (P = 0,05). Os 6 indivíduos com elevadas respostas de IgG3 contra MSP3 em 1998 tinham também elevados títulos 5 anos antes, sugerindo que estavam já protegidos por meio de uma resposta de igG3 anti-MSP3 sustentada em 1993, quando tinham 18,2 ±9,8 anos de idade. Em contraste, para GLURP, os 7 indivíduos com uma forte resposta de IgG3 anti-RO, detectável em 1998, tinham respostas de lgG3 anti-R0 substancialmente inferiores 5 anos antes (P = 0,0157), quando tinham 23,7 ±6,9 anos de idade. Deste modo, existiu uma drástica alteração naqueles 7 indivíduos protegidos por meio de lgG3 para R0 em 1998 e a sua protecção, 5 anos antes, estava possivelmente relacionada com IgG3 contra MSP3.

7.C. DISCUSSÃO O presente estudo é o primeiro a mostrar uma associação entre as respostas de anticorpo específicas de antigénio e a protecção da malária clínica no S-E Asiático. Em OoDo, a prevalência de respostas de anticorpo positivas contra GLURP e MSP3 era elevada, variando entre 58,6 % (R0) e 67,2% (R2). Esta observação está em acordo com a constatção de que os epitopos de células B dentro de GLURP e MSP3 são altamente conservados entre as linhas laboratoriais de P. falciparum e isolados de campo de África e Ásia (Huber, Felger et al. 1997), (McColl e Anders 1997; de Stricker, Vuust et al. 2000). A prevalência de 63 anticorpos para MSPl-W-19 era também elevada, sendo quase duas vezes os valores verificados na Gâmbia e Serra Leoa (Egan, Morris et al. 1996) e no Gana (Dodoo, Theander et al. 1999), sugerindo que as estirpes aparentadas com a estirpe Wellcome poderão ser prevalecentes em OoDo.

Os títulos de ELISA mais elevados foram verificados contra as regiões RO e R2 de GLURP recombinante e MSP1. As diferenças nos títulos de ELISA de RO, Rl, R2 de GLURP e MSPl reflectiram, muito provavelmente, diferenças na reactividade de anticorpo sérico. Em contraste, o ELISA de MSP3 proporcionou sinais comparativamente inferiores, contudo esta discrepância poderá estar, pelo menos em parte, relacionada com a utilização de um curto péptido sintético, definindo um único ou número limitado, de epitopos, em comparação a proteínas recombinantes no caso de GLURP e MSPl que são conhecidos por definirem vários epitopos (Theisen, Soe et al. 2000).

Os níveis de IgG contra todas as regiões de GLURP e MSPl estavam significativamente associados à idade (P < 0,05), enquanto em contraste com esta situação, a resposta de IgG contra MSP3 verificou ser independente da idade. Em relação às respostas de subclasse de IgG, verificou-se que várias delas estavam também significativamente associadas à idade e estas variações poderiam reflectir a duração da exposição aos parasitas da malária, assim como a maturação gradual do sistema imunitário ao longo do tempo.

Existiu um aumento estatisticamente significativo nos níveis de IgG3 contra R0 e MSP3 entre os indivíduos protegidos vivendo em in OoDo, em comparação àqueles não protegidos. Estes resultados estão em concordância com aqueles de Dodoo et al. 64 (Dodoo, Theisen et al. 2000) que verificaram que as respostas de anticorpos citofilicos contra RO e R2 eram fortes preditores de protecção em crianças Ganesas, e aqueles de Oeuvray et al. que verificaram uma correlação consistente entre protecção e IgG3 elevada tanto contra RO de GLURP como R2 em Dielmo, África Ocidental (Oeuvray, Theisen et al. 2000). De modo semelhante, as respostas de IgG3 especificas de MSP3 foram anteriormente associadas a protecção contra malária clinica em Dielmo. No geral, estes resultados sugerem que a mesma subclasse de resposta de igG aos mesmos epitopos críticos está envolvida no desenvolvimento gradual de protecção contra malária de P. falciparum em populações africanas, assim como asiáticas, vivendo em áreas endémicas de malária. Adicionalmente, o presente estudo verificou uma correlação negativa significativa entre os níveis de anticorpos não citofilicos contra protecção clínica de R0 e Rl. Por conseguinte, por um lado, existe uma associação positiva entre as respostas de subclasse de IgG citofílica e protecção e, por outro lado, uma associação negativa entre as respostas de subclasse não citofílica com a mesma especificidade e protecção de epitopo. Este resultado epidemiológico está em concordância com a observação in vitro de que os anticorpos não citofilicos podem inibir a ligação de merozoítos e monócitos humanos por anticorpos citofilicos contra o mesmo alvo antigénico e, desse modo, reduzir a capacidade de os últimos controlarem a multiplicação parasítica pelo mecanismo ADCI (Bouharoun-Tayoun e Druilhe 1992).

Enquanto a maioria dos residentes protegidos de OoDo tinha respostas de igG3 elevadas contra MSP3 e GLURP, um determinado número de indivíduos com baixas, ou quase nenhumas, respostas de IgG3 contra qualquer um destes antigénios pareciam estar também protegidos. Os requerentes verificaram que todos os indivíduos 65 protegidos com baixa resposta de IgG3, especifica de RO de GLURP, tinham niveis significativamente elevados de anticorpos de lgG3 anti-MSP3 específicos e vice-versa. Esta observação sugere que os anticorpos contra GLURP e MSP3 podem actuar de uma maneira complementar, de modo a controlarem a multiplicação parasítica em indivíduos imunes. isto é relevante, em consideração do papel destes anticorpos no mecanismo ADCI. De facto, apenas a avaliação simultânea de diversos antigénios divulgou este efeito complementar. Esta verificação é a favor de testar simultaneamente diversos antigénios para efeitos complementares, como para possíveis efeitos antagónicos que poderiam ter consequências na concepção de vacinas combinadas.

Em conclusão, o presente estudo mostra que (1) - os epitopos criticos nos antigénios de MSP3 e GLURP que são muito conservados, são alvos de anticorpos protectores em áreas endémicas geograficamente distantes do mundo. (2)- Os anticorpos de IgG3 para MSP3 e RO de GLURP são os preditores mais fortes de protecção de malária clinica num cenário africano e também asiático. (3)- Para alcançar um estado de pré-imunização na Ásia, assim como em África, é necessário produzir uma subclasse citofílica de anticorpo contra antigénios críticos (nomeadamente, MSP3b e GLURP que induzem ambos anticorpos activos em ADCI). (4)- Parece ser um efeito de complementação entre estes dois antigénios. As respostas de lgG3 poderão ter efeitos semelhantes contra o risco de ataques maláricos, desde que estejam presentes contra um antigénio quando as respostas ao outro são baixas ou quase ausentes. (5) - As respostas a diferentes epitopos de células B num dado antigénio parecem evoluir independentemente e o nível de reconhecimento pode mudar ao longo do tempo. 66 A complementaridade de respostas observadas para os dois principais alvos de ADCI identificados até à data proporciona a primeira base racional para combinar estes dois antigénios numa formulação de vacina híbrida. Além do mais, estudos de imunogenicidade realizados em modelos animais pré-clinicos com a vacina híbrida conferem suporte adicional a esta combinação antigénica, ao mostrarem imunogenicidade melhorada com respostas equilibradas e bem balanceadas para cada molécula.

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Asp Ser Thr Leu Lys Asp Leu Vai Glu Glu Leu Ser Lys Tyr phe Lys 340 345 350

Asn His

<210> 3 <211> 1116 <212> ADN <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> característica_misc <222> (1)..(1116) <223> MSP 3.2 <400> 3 atgaataaga tttataatat tacttttctt ttcattcttt taaacttata tataaatgaa 60 aataacttta tcagaaatga acttataaac gaaaaaaacc ataatttaag aaatggttca 120 atgtataata acgataaaat attaagtaaa aatgaagtag atactaatat agaaagtaac 180 75 gaaaatagta ttcacgaatc tggacataag attgatgggg aagaagtttt aaaagctaat 240 gtagatgata taacatacaa aaaaaaaaat gttgatgatt cagaaattcc tttttctggt 300 tatgatatac aagcaacata tcaatttcct tctacatcag gaggaaataa tgtaattcca 360 cttcctataa aacaaagtgg agaaaatcaa tatactgtta catctatatc aggtattcaa 420 aagggagcaa atggtttaac tggtgcaaca gaaaatatta cacaagttgt acaagcaaac 480 tctgaaacaa ataaaaatcc tacttctcat agtaatagta ctacaacttc tctgaataat 540 aatatacttg gatgggaatt tggaggaggt gctcctcaaa atggagctgc agaagataaa 600 aagacagaat atttactaga acaaataaaa attccatcat gggatagaaa taacatcccc 660 gatgagaatg aacaagtaat agaggaccct caagaagata ataaagatga agatgaagat 720 gaagaaacag aaacagaaaa tttggaaaca gaagatgata ataatgaaga gatagaagaa 780 aatgaagaag atgacataga tgaagaaagc gtagaagaaa aggaagaaga ggaagaaaaa 840 aaggaagaag aagaaaaaaa ggaagaaaaa aaagaagaaa aaaaaccaga caatgaaatt 900 acaaatgaag ttaaagagga acaaaaatat agttcaccaa gtgatataaa tgcccaaaat 960 ttaatttcta ataagaataa aaagaatgat gaaacaaaaa agactgctga aaatatagtt 1020 aaaacattgg ttggattatt taatgaaaaa aatgagatag attctactat aaataattta 1080 gtacaagaaa tgatccatct atttagtaat aattaa 1116

<210> 4 <211> 371 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(371) <223> MSP 3.2 76 < 4 Ο Ο > 4

Met Asn Lys ile Tyr Asn ile Thr phe Leu Phe ile Leu Leu Asn Leu 1 5 10 15 Tyr He Asn Glu Asn Asn Phe ile Arg Asn Glu Leu Ile Asn Glu Lys 20 25 30 Asn HiS Asn Leu Arg Asn Gly ser Met Tyr Asn Asn Asp Lys Ile Leu 35 40 45 Ser Lys Asn Glu vai Asp Thr Asn Ile Glu Ser Asn Glu Asn Ser Ile 50 55 60 His Glu Ser Gly His Lys Ile ASp Gly Glu Glu Val Leu Lys Ala Asn 65 70 75 80 vai Asp Asp Ile Thr Tyr Lys uys Lys Asn val Asp Asp Ser Glu Ile 85 90 95 Pro Phe ser Gly Tyr Asp Ile Gin Ala Thr Tyr Gin Phe pro ser Thr 100 105 110 Ser Gly Gly Asn Asn val Ile Pro Leu Pro Ile Lys Gin ser Gly Glu 115 120 125 Asn Gin Tyr Thr vai Thr Ser He ser Gly ile Gin Lys Gly Ala Asn 130 135 140 Gly Leu Thr Gly Ala Thr Glu Asn ile Thr Gin val val Gin Ala Asn 145 150 155 160 Ser Glu Thr Asn Lys Asn pro Thr Ser His ser Asn Ser Thr Thr Thr 165 170 175 Ser Leu Asn Asn Asn ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Ala pro 180 185 190 Gin Asn Gly Ala Ala Glu Asp Lys Lys Thr Glu Tyr Leu Leu Glu Gin 195 200 205 lie Lys 210 Ile Pro Ser Trp ss Arg Asn Asn Ile Pro 220 Asp Glu Asn Glu 77

Gin val ile Glu Asp Pro Gin Glu Asp Asn Lys Asp Glu Asp Glu Asp 225 230 235 240 Glu Glu Thr Glu Thr Glu Asn Leu Glu Thr Glu ASp A$p Asn Asn Glu 245 250 255 Glu He Glu Glu Asn Glu Glu Asp ASp Ile Asp Glu Glu Ser Val Glu 260 265 270 Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Glu Glu Glu Glu Lys Lys Glu 275 280 285 Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Pro ASP Asn Glu Ile Thr Asn Glu val 290 295 300 Lys Glu Glu Gin Lys Tyr ser ser Pro Ser ASP Ile Asn Ala Gin Asn 305 310 315 320 Leu Ile Ser Asn Lys Asn Lys Lys Asn Asp Glu Thr Lys Lys Thr Ala 325 330 335 Glu Asn Ile val Lys Thr Leu Val Gly Leu Phe Asn Glu Lys Asn Glu 340 345 350 Ile Asp Ser Thr Ile Asn Asn Leu Val Gin Glu Met Ile His Leu Phe 355 360 365 Ser Asn Asn 370 < 210 > 5 <211> 1275

< 212 > ADN <213> Plasmodium Falcíparum <220> <221> característica__misc <222> (1)..(1275) <223> MSP 3.3 78 < 4 Ο Ο > 5 atgaaaaaaa tcgtgaatat aatattttat atcttatatt tatatatata taaaagaaac 60 ttagtacaaa acgaaaatgt aaataaatct aatctaagaa aaggattatc tactaataat 120 tcagaaaatg gaataaaaag tccaaaggat gaagatgaac atattaatat tataggagat 180 gatttttcag cattttctta tggtggttat cctatttatg aaactacagg aagtctagga 240 actggggttg aaagtgtaaa agctattgat ggggaaagtg gtacttcaat ggattctaaa 300 cctaaagaga ataaaattag tactgaacca ggagcagacc aggtgtctat tggattggtc 360 aacgaatccg atagtagttc agaaaatgat aaaaaaaaaa aagaaaacgt aaaaaaagaa 420 atgcttggta ctgaaaagga aggttctcca gatagtcatg atagttctaa ggaaaaatta 480 aatcttaacg acaattccaa atggtctgat tttcttaaaa atatcgtaac gtttggtggt 540 tttggtccta ctgtggttca tgatgttagt gatacccttt cagatatatc taaagatgaa 600 gttactcaaa aaacaactaa agatattggt agtactttac ttgacttttt tttaccatta 660 ccgactaaaa acactaatac atatgagaag aaaaatgaaa ataaaaatgt atcaaatgta 720 gattcaaaaa caaaatcaaa tgaaaaagga agacctccta catattctcc tattctggat 780 gatgggatag aatttagtgg tggtttatat tttaatgaga aaaagtcgac tgaagaaaat 840 aaacaaaaaa atgttttaga atcagtaaat ttaacatcgt gggataaaga ggatattgtt; 900 aaggaaaatg aggatgttaa agatgaaaag gatgaagatg atgaagaaga agaagaaaaa 960 tacgaaaacg aaattataaa gcaaccagaa gacatattgg atgaggaaga agtattagaa 1020 gaagaaatat tagaagaaaa taaaaatgat acagtagata caagtgattt agaaaagaaa 1080 aatataccag atttatcaaa cgataataat tattatagtt taatttataa gaactataag 1140 gataatgata aatcagaaaa aactgcacaa acattaatca cagctctgat aagtttatta 1200 aatggaaaaa atgaattaga tgctaccata agaagattaa aacataggtt tatggaattt 1260 tttacatata attaa 1275

<210> 6 <211> 424 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(424) <223> MSP 3.3 79 < 4 Ο Ο > 6

Met Lys Lys ile vai Asn ile lie Phe Tyr lie Leu Typ Leu Tvr lie 1 5 10 15

Tyr Lys Arg Asn Leu vai Gin Asn Glu Asn vai Asn Lys ser Asn Leu 20 25 30

Arg Lys Gly Leu Ser Thr Asn Asn Ser Glu Asn Gly ile Lys ser Leu 35 40 Lys Asp Glu ASP Glu His ile Asn 50 55 Phe Ser Tyr Gly Gly Tyr pro Ile 65 70 Thr Gly val Glu Ser 85 val Lys Ala Met Asp ser Lys pro Lys Glu Asn 100 Asp Gin val ser ile Gly Leu val 115 120 Asn ASp Lys Lys Lys Lys Glu Asn 130 135 Glu Lys Glu Gly Ser Pro ASp ser 145 150 Asn Leu Asn Asp Asn Ser Lys Trp 165 Thr phe Gly Gly 180 Phe Gly Pro Thr Leu ser ASp Ile ser Lys Asp Glu 195 200 45 ile Ile Gly Asp Asp Phe ser Ala 60

Tyr Glu Thr Thr Gly Ser Leu Gly 75 80

Ile Asp Gly Glu Ser Gly Thr ser 90 95

Lys ile ser Thr Glu Pro Gly Ala 105 110

Asn Glu Ser Asp ser Ser Leu Glu 125 vai Lys Lys Glu Met Leu Gly Thr 140

His Asp ser Ser Lys Glu Lys Leu 155 160

Ser Asp Phe Leu Lys Asn ile vai 170 175

Vai val His Asp vai ser Asp Thr 185 190 val Thr Gin Lys Thr Thr Lys Asp 205 80

Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asp Phe Phe Leu Pro Leu Pro Thr Lys Asn 210 215 220 Thr Asn Thr Tyr Glu Lys Lys Asn Glu Asn Lys Asn vai Ser Asn val 225 230 235 240 Asp Ser Lys Thr Lys Ser Asn Glu Lys Gly Arg Pro Pro Thr Tyr ser 245 250 255 Pro Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Phe Ser Gly Gly Leu Tyr Phe Asn 260 265 270 Glu Lys Lys Ser Thr Glu Glu Asn Lys Gin Lys Asn val Leu Glu Ser 275 280 285 Vai Asn Leu Thr Ser Trp Asp Lys Glu Asp ile vai Lys Glu Asn Glu 290 295 300 Asp Vai Lys ASp Glu Lys Asp Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Glu Asn Glu Ile Ile Lys Gin Pro Glu ASP ile Leu ASP Glu Glu 325 330 335 Glu Vai Leu Glu Glu Glu Ile Leu Glu Glu Asn Lys Asn Asp Thr Val 340 345 350 ASp Thr ser ASp Leu Glu Lys Lys Asn ile Pro Asp Leu Ser Asn Asp 355 360 365 Asn Asn Tyr Tyr ser Leu Ile Tyr Lys Asn Tyr Lys ASP Asn Asp Lys 370 375 380 Ser Glu Lys Thr Ala Gin Thr Leu ile Thr Ala Leu ile ser Leu Leu 385 390 395 400 Asn Gly Lys Asn Glu Leu Asp Ala Thr Ile Arg Arg Leu Lys His Arg 405 410 415 phe Met Glu Phe Phe Thr Tyr Asn 420 81 < 210 > 7

<211> 2094 <212> ADN <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> característica_misc <222> (1) . . (2094) <223> MSP 3.4 < 4 0 0 > 7 atgaagaaaa tatatagtat tttcttttct ttatttattt tgaatcttca tatatatata 60 aaaaatatca aatgcaatga cctaataaat tataatgatt cgaatctaag aaacggatta 120 ctaaataata gtttagattt aacaaatgga ttaaataaca aagataacag ttttattgat 180 tctaaaattg aagaacatga aaataaatct taccaaaata aagataataa tatctctatc 240 gttggacaag atgtgcctat tacatcggta tattcttcta aaattataaa tgctaatgat 300 ttagaaggaa atagtattga cgatactaaa ggtcttagtg ttactaatag tggatttgat 360 gatggtagtg cttttggtgg tggactccct ttttctggtt attctcctct acaaggaaat 420 cataataaat gtcctgatga aaatttttgt aagggtatta aaaatgtctt atcctgtcct 480 ccaaaaaatt ctactggtag aaatggggat tggattagtg tggctgttaa agaaagttca 540 accacaaata aaggtgttct tgttcccccc agaagaacaa aattatgtct aagaaatatt 600 aacaaggttt ggcatcgaat caaagacgag aaaaatttta aagaagaatt tgttaaagtt 660 gctttaggag aatcaaatgc tttaatgaaa cattataaag aaaaaaatct gaatgccctt 720 acagctataa aatatggatt ttcagatatg ggagatataa taaagggaac agacctaatt 780 gactatcaaa ttactaaaaa tataaatagg gcattagata aaatattacg taatgaaaca 840 agtaatgaca aaattaaaaa acgtgtagac tggtgggaag ctaataaaag tgcattctgg 900 gatgcattca tgtgtggata taaagttcat atcggaaata aaccatgtcc agaacatgat 960 aatatggaca gaataccaca atatcttaga tggtttagag aatggggaac atatgtttgc 1020 agcgaatata aaaataagtt tgaggatgta ataaaattat gtaatatcca acaatttaca 1080 aaccaggatg attcacaact attagaaata tcaaaaaagg ataaatgtaa agaagcatta 1140 aagcattatg aagaatgggt taatagaagg agacctgaat ggaaaggcca atgtgataaa 1200 tttgaaaaag aaaaaagtaa atatgaagat actaaaagta taactgctga aaaatattta 1260 82 aaagaaatat gttctgaatg tgattgtaaa tataaagatt tggataatac atttaaagaa tttaaagata acgttacact tcttaaagca gtaattgata acaaaaaaaa tcaagattct ctaacaacca cttctttatc aacgtctatt aatagtgtta gggattctag taatctagat caacgaggga atataacaac atctcaagga aattcacacc gtgcaactgt tgtgcaacaa gttgatcaaa ccaacagatt agataatgta aactctgtaa cgcaaagagg aaataataac tacaacaata atttagagcg tggattgggt tctggtgctc ttcctggtac aaatattatt actgaagaaa aatattctct agaattaata aaattaacat caaaggatga agaagatatt ataaagcata atgaggatgt gagagaagaa atagaagaac aacaagaaga catcgaggaa gatgaagaag aattggaaaa tgaaggagaa gaaacaaaag aagaagatga tgaagaaaag aatgaaacaa atgatacgga agatacggac gatactgaag atacggaaga tatagaagag gaaaataagg aaaaagaact cagtaatcaa caacaaagtg aaaaaaaaag tatttcaaaa gttgacgaag attcatatcg aatactatca gtaagttata aggacaataa tgaagtaaaa aatgttgctg aatctatagt gaaaaaacta tttagtttat ttaatgataa taataatttg gaaactattc ttaagggttt gacagaagat atgacagatt tatttcaaaa ataa

<210> 8 <211> 697 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(697) <223> MSP 3.4 <400> 8

Met Lys Lys lie Tyr Ser ile Phe Phe Ser Leu phe ile Leu Asn Leu 15 10 15

His ile Tyr ile Lys Asn ile Lys cys Asn Asp Leu lie Asn Tyr Asn 20 25 30 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2094 83 ASP Ser Asn Leu Arg Asn Gly Leu 35 40 Asn Gly Leu Asn Asn Lys Asp Asn 50 55 Glu His Glu Asn Lys Ser Tyr Gin 65 70 Vai ciy Gin Asp val Pro He Thr 85 Asn Ala Asn Asp Leu Glu Gly Asn 100 Ser val Thr Asn ser Gly Phe Asp 115 120 Leu pro phe ser Gly Tyr Ser Pro 130 135 pro ASP Glu Asn phe Cys Lys Gly 145 150 Pro Lys Asn ser Thr 165 Gly Arg Asn Lys Glu Ser Ser 180 Thr Thr Asn Lys Thr Lys Leu Cys Leu Arq Asn Ile 195 200 Asp Glu Lys Asn Phe Lys Glu Glu 210 215 Ser Asn Ala Leu Met Lys His Tyr 225 230 Thr Ala ile Lys Tyr 245 Gly Phe Ser Thr Asp Leu ile Asp Tyr Gin lie 260 Asp Lys He Leu Arg Asn GlU Thr 275 280 vai Asp Trp Trp Glu Ala Asn Lys 290 295

Leu Asn Asn ser Leu Asp Leu Thr 45 Ser Phe Ile Asp Ser Lys Ile Glu 60 Asn Lys Asp Asn Asn ile Ser Ile 75 80 ser val Tyr Ser Ser Lys ile Ile 90 95 ser Ile ASP Asp Thr Lys Gly Leu 105 110 ASP Gly Ser Ala Phe 125 Gly Gly Gly Leu Gin Gly Asn 140 His Asn Lys Cys Ile Lys Asn val Leu Ser Cys Pro 155 160 Gly Asp Trp ile Ser val Ala val 170 175 ciy val Leu val pro pro Arg Arg 185 190 Asn Lys val Trp HÍ 5 Arq ile Lys 205 Phe Val Lys val Ala Leu Gly Glu 220 Lys Glu Lys Asn Leu Asn Ala Leu 235 240 A5P Met Gly ASp ile Ile Lys Gly 250 255 Thr Lys Asn ile Asn Arq Ala Leu 265 270 ser Asn Asp Lys ile 285 Lys Lys Arg ser Ala Phe Trp A5P Ala phe Met 300 84 cys Gly Tyr Lys val HÍS ile Gly Asn Lys pro cys Pro Glu HIS Asp 305 310 315 320 Asn Met Asp Arg ile 325 Pro Gin Tyr Leu Arg 330 Trp Phe Arg Glu Trp 335 Gly Thr Tyr Val cys Ser Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Glu Asp val ile Lys 340 345 350 Leu Cys Asn Ile Gin Gin Phe Thr Asn Gin ASP Asp Ser Gin Leu Leu 355 360 365 Glu Ile Ser Lys Lys Asp Lys cys Lys Glu Ala Leu Lys His Tyr Glu 370 375 380 Glu Trp val Asn Arg Arg Arg pro Glu Trp Lys Gly Gin cys Asp Lys 385 390 395 400 Phe Glu Lys Glu Lys ser Lys Tyr Glu Asp Thr Lys Ser Ile Thr Ala 405 410 415 Glu Lys Tyr Leu Lys Glu Ile Cys Ser Glu cys Asp cys Lys Tyr Lys 420 425 430 Asp Leu Asp Asn Thr Phe Lys Glu Phe Lys ASp Asn val Thr Leu Leu 435 440 445 Lys Ala val ile Asp Asn Lys Lys Asn Gin ASP Ser Leu Thr Thr Thr 450 455 460 Ser Leu Ser Thr Ser ile Asn Ser Val Arg ASp Ser Ser Asn Leu Asp 465 470 475 480 Gin Arg Gly Asn Ile Thr Thr Ser Gin Gly Asn ser His Arg Ala Thr 485 490 495 Vai Val Gin Gin val Asp Gin Thr Asn Arg Leu Asp Asn val Asn Ser 500 505 510 vai Thr Gin Arg Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Glu Arg Gly 515 520 525 Leu Gly Ser Gly Ala Leu Pro Gly Thr Asn ile ile Thr Glu Glu Lys 530 535 540 Tyr Ser Leu Glu Leu ile Lys Leu Thr Ser Lys ASP Glu GlU ASP ile 545 550 555 560 ile Lys His Asn Glu ASP val Arg Glu Glu ile Glu Glu Gin Gin Glu 565 570 575 AS D Ile Glu Glu ASP Glu Glu Glu Leu Glu Asn Glu Gly Glu Glu Thr 580 585 590 85

Lys Glu Glu Asp Asp Glu Glu Lys Asn Glu Thr Asn Asp Thr Glu Asp 595 600 605 Thr Asp ASp Thr Glu Asp Thr Glu Asp He Glu Glu Glu Asn Lys Glu 610 615 620 Lys Glu Leu ser Asn Gin Gin Gin Ser Glu Lys Lys ser ile ser Lys 625 630 635 640 val Asp Glu Asp ser Tyr Arg ile Leu Ser Val Ser Tyr Lys Asp Asn 645 650 655 Asn Glu val Lys Asn val Ala Glu ser Ile val Lys Lys Leu Phe ser 660 665 670 Leu Phe Asn Asp Asn Asn Asn Leu Glu Thr Ile Phe Lys Gly Leu Thr 675 680 685 Glu Asp Met Thr Asp Leu Phe Gin Lys 690 695

<210> 9 <211> 2139 <212> ADN <213> Plasmodium Falciparum < 2 2 Ο > <221> característica_misc <222> (1)..(2139) <223> MSP 3.5 <400> 9 atgaaatata tattaagtat tagtcttttt ttaattcttt taaatttata taaatgtgct 60 agtatatcat gtgaaataga ttacacccct agtaccaata ttactagcaa tttaaattct 120 aatttaagaa gctgttcttc taatcttgtt ctttcttcaa atatagattc tactaaatta 180 86 gaaggaacat atggtgaaaa tttaaacgac agtgtatctt tgacgaataa tattaatgat 240 catacaacta acgaatcaaa tatatcaaat gtatcaaata tatcaaatga atcaaatata 300 tcaaatgaat caagtataac taaccagtca aatttatcta gcgaaacaaa tatatctagc 360 gaaacaaata tatctaacga atcaagtgta ccaaatgaaa gcagtgtcaa tgaggtacct 420 caacttgaag tacctaaaga tgcagtagaa aatcacacag aatccaaaga tgttttattg 480 aatgaaaagg aaaattttgc aaatggagtg gaaacacatg ttgatctagg atcccaagaa 540 caatattttg gatcttccta tgatatgaat atggacacag aaggaggaat aaaaaagttc 600 aaaaatgtgt ttcagtctta ttttaatcaa tccaaaggaa atagtggtac tgaaggtgat 660 ggatcaagtg tatttggatc catatttggt agcttattaa cccctataga ttcattgtta 720 gaaaaattta taggatctaa caatacaaat tcggattcta atgtgaagaa cacttctatg 780 ggaaatggac aaaataaata cgacaataat atatacttag atgaagaaga tgctttgagt 840 gatgcagaac attataatga tggtagtata agtttaggcg aagaagatga gttgagtgat 900 gcagaacatt ataatgatgg aagtataagt ttagatgaag aagatgagtt gagtgatgca 960 gaacattata atgatggagg tatatgttta ggtgaagaag atgagttaag tgatgcagaa 1020 cattataatg atggaggtat aagtttagat gaagaagatg tgttgagtga tgcagaacat 1080 tataatgatg gagatataag tttagatgaa gatgagttaa gtgatacaga aaattattat 1140 gatggaggta taagtttaga cgaatcagat gatttgagtg accccgaaag taaaacaaaa 1200 gaagataact accatttata ttattgggat gatttctatc atgaatataa accaacttat 1260 ttaaattatc atatgcatta tacactttat gaaccaaaca atttttatga tactactaat 1320 gaagaaacac acaattttta taatactact aatgaagaat cacacaattt ttacaaccct 1380 actcatgaag aatcacacaa tttttacaac cctactcatg aagaatcaca caatttttac 1440 aaccctactc atgaagaatc acacaatttt tacaacccta ctcatgaaga atcacacaat 1500 ttttacaacc ctactcatga agaatcacac aatttttaca accctactca tgaagaatca 1560 cacaattttt acaaccctac tcatgaagaa tcacacaatt tttacaaccc tactcatgaa 1620 gaatcacaca atttttacaa ccctactcat gaagaatcac acaattttta caaccctact 1680 catgaagaat cacacaattt ttacaaccct actcatgaag aatcacacaa tttttacacc 1740 cctactcatg aagaatcaca caatttttac aaccctactc atgaagaatc acacaatttt 1800 tacaacccta ctcatgaaga atcacacaat ttttacaacc ctactcatga agaatcacac 1860 aatttttaca accctactca tgaagaatca cacaattttt acaaccctac tcatgaagaa 1920 tcacacaatt tttacacccc tactcatgat gaatttaatg ttcctttaaa ttataaccat 1980 gactacgatt acaattactt tgaaaatgat aattataata ttcaaaatgt taaagacaat 2040 ttggtaaaaa aagttaatga tttcatggaa tcagataatt tattagttaa tacctttaaa 2100 ggtatagctg ggggtgttac tagttttttc ggatattaa 2139 87 <210> 10 <211> 712

< 212 > PRT <213> Plasmodium Falciparum < 2 2 0 > <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(712) <223> MSP 3.5 <400> 10

Met Lys Tyr lie Leu Ser ile Ser Leu Phe Leu Ile Leu Leu Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Lys cys Ala Ser xle Ser Cys Glu Ile Asp Tyr Thr pro ser Thr 20 25 30 Asn ile Thr Ser Asn Leu Asn Ser Asn Leu Arg Ser Cys Ser Ser Asn 35 40 45 Leu vai Leu Ser Ser Asn ile Asp Ser Thr Lys Leu Glu Gly Thr Tyr 50 55 60 Gly Glu Asn Leu Asn Asp Ser val Ser Leu Thr Asn Asn Ile Asn Asp 65 70 75 80 HÍS Thr Thr Asn Glu Ser Asn Ile Ser Asn Val Ser Asn ile Ser Asn 85 90 95 Glu ser Asn ile ser Asn Glu Ser Ser ile Thr Asn Gin Ser Asn Leu 100 105 110 Ser ser Glu Thr Asn ile ser ser Glu Thr Asn ile Ser Asn Glu Ser 115 120 125 Ser vai Pro Asn Glu Ser ser val Asn Glu Val Pro Gin Leu Glu val 130 135 140 pro Lys Asp Ala val Glu Asn His Thr Glu ser Lys Asp val Leu Leu 145 150 155 160 88

Asn Glu Lys Glu Asn Phe Ala Asn Gly vai Glu Thr His 165 170 val Asp Leu 175

Gly Ser Gin Glu Gin Tyr Phe Gly ser Ser Tyr Asp Met 180 185

Asn Met Asp 190

Thr Glu Gly Gly lie Lys Lys Phe Lys Asn vai Phe Gin 195 200 205 ser Tyr Phe

Asn Gin Ser Lys Gly Asn ser Gly Thr Glu Gly Asp Gly 210 215 220 ser ser val

Phe Gly Ser ile Phe Gly ser Leu Leu Thr Pro lie Asp 225 230 235

Ser Leu Leu 240

Glu Lys Phe ile Gly ser Asn Asn Thr Asn ser Asp Ser 245 250

Asn val Lys 255

Asn Thr Ser Met Gly Asn Gly Gin Asn Lys Tyr Asp Asn 260 265

Asn Ile Tyr 270

Leu Asp Glu Glu Asp Ala Leu ser Asp Ala Glu His Tyr 275 280 285

Asn Asp Gly ser lie Ser Leu Gly Glu Glu Asp Glu Leu Ser Asp Ala 290 295 300

Glu His Tyr

Asn Asp Gly ser lie Ser Leu Asp Glu Glu Asp Glu Leu 305 310 315 ser Asp Ala 320

Glu His Tyr Asn Asp Gly Gly lie Cys Leu Gly Glu Glu 325 330

Asp Glu Leu 335 ser Asp Ala Glu His Tyr Asn Asp Gly Gly Ile Ser Leu 340 345

Asp Glu Glu 350

Asp Vai Leu Ser Asp Ala Glu His Tyr Asn Asp Gly Asp 355 360 365

Ile Ser Leu

Asp Glu Asp Glu Leu Ser Asp Thr Glu Asn Tyr Tyr Asp 370 375 380

Gly Gly ile ser Leu Asp Glu ser Asp Asp Leu Ser Asp Pro Glu ser 385 390 395

Lys Thr Lys 400 89

Glu ASp Asn Tyr His Leu Tyr Tyr Trp Asp ASp Phe Tyr HiS Glu Tyr 405 410 415 Lys pro Thr Tyr Leu Asn Tyr His Met His Tyr Thr Leu Tyr Glu Pro 420 425 430 Asn Asn Phe Tyr Asp Thr Thr Asn Glu Glu Thr His Asn Phe Tyr Asn 435 440 445 Thr Thr Asn Glu Glu ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu 450 455 460 Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr 465 470 475 480 Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu 485 490 495 Glu ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe 500 505 510 Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr HiS 515 520 525 Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn 530 535 540 Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr 545 550 555 560 H1S Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser HÍS 565 570 575 Asn phe Tyr Thr Pro Thr His Glu Glu Ser HiS Asn Phe Tyr Asn Pro 580 585 590 Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser 595 600 605 His Asn Phe Tyr Asn pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn 610 615 620 pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu 625 630 635 640 ser His Asn Phe Tyr Thr pro Thr His Asp Glu Phe Asn Vai Pro Leu 645 650 655 90

Asn Tyr Α5Π His Asp Tyr ASp Tyr Asn Tyr Phe Glu Asn Asp Asn Tyr 660 665 670 Asn ile Gin Asn vai Lys Asp Asn Leu Vai Lys Lys vai Asn Asp Phe 675 680 685 Met Glu Ser Asp Asn Leu Leu vai Asn Thr Phe Lys Gly lie Ala Gly 690 695 700 Gly Vai Thr Ser Phe Phe Gly Tyr 705 710

<210> 11 <211> 1701 <212> ADN <213> Plasmodium Falciparum < 2 2 0 > <221> característica_misc <222> (1)..(1701) <223> MSP 3.6 < 4 0 0 > 11 atgttgaata tttttaatat gccaatggaa cactctctga aatttaagaa atggatattt atagaaaatg aaataaataa ttatatgata taaatgaaaa aataaagaac aaaaaaatga gaagtaaaaa cagaatatgt gaaataggtg aagaattaac gaattagttg aaaaagtaga aaagtagctg aagaagtaga aattttcttg ttgtttttaa aaatattgaa agtgctgaag aaataatact tattttaatg tacaaattat aatgaagtaa tattttccct gattattttt agaagtacca atgaaaatag atctgaaaaa aatgaggaag tgaaaaagta gatgaaaaag tgaagaagta gctgaagaat tcaaaaagta gatgaagaag taaacatata tatatgtgaa agatagatgc tttaaaaacg aagaaaacaa taatttaaat cagaagaaac taaagaagaa ttcttgatat ctttactgaa aagtagtaaa tgatggagaa tagaaaataa atcggaaact tacctgaaga agtagctgaa tagttgaaaa agtagatgaa taactgaaga attaattgaa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 91 aaagtagatg aagaagtaac tgaagaatta attgaaaaag tagatgaaga agttgctgaa 660 gaattaattg aaaaagtaga tgaagaagtt gctgaagaat taattgaaaa ggtagctgat 720 gaattaattg aaaaagtaga tgaagaagtt gctgaagaat taattgaaaa ggtagctgat 780 gaattagttg aaaaagtagc tgaagaatta gttgaaaaag tagatgaaga agtagctgaa 840 gaattagttg aaaaagtaga tgaaaaagta gctgaagaag tagatcaaaa agtagatgaa 900 gaagtaactg aagaattaat tgaaaaagta gatgaagaag taactgaaga attaattgaa 960 aaagtagatg aagaagttgc tgaagaatta attgaaaaag tagatgaaga agttgctgaa 1020 gaattaattg aaaaggtagc tgatgaatta gttgaaaaag tagctgaaga attagttgaa 1080 aaagtagatg aacaagtagc tgaagaatta gttgaaaaag tagatgaaca agtagctgaa 1140 gaattagttg aaaaagtaga tgaacaagta gttgaagaag tagctgaaga agtagctgaa 1200 gaagtagttg aagaaggtga aaaagtacct gaagaagtag ctgaagaagt agctgaagaa 1260 gtagctgaag aagtagctga agaagtagct gaagaattag ttgaaaaagt agatgaagaa 1320 gtagctgaaa aagtagttga agaagaaggt gaaaaagtac ctgaagaagt agttgaagaa 1380 gtagatgaag aagtagctga aaaagtagtt gaagaagaag gtgaaaaagt acttgaagaa 1440 gtaattgaag aagtagttga agaagtagcc gaagaagtag ctgaaaaagt agttgaagaa 1SOO caaggtgaaa aagtaaacaa aaatgattta aatgatgcat cttccgagga aattaaggat 1560 tctagtgatt ttaaagaatc tcatgaggaa ttatttaaag ttttcctgga gttaattaat 1620 aaaaacgatt tagttaaaga aaatttaaaa aagattacaa acaatttaaa tgaaatgcat 1680 ttaagcactt tatatccata a 1701

<210> 12 <211> 566 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(566) <223> MSP 3.6 92 < 4 Ο Ο > 12

Met Leu Asn Ile Phe Asn lie ile Phe Leu Leu Phe Leu He Asn ile 15 10 15

Tyr ile cys Glu Ala Asn Gly Thr Leu ser Glu Asn ile Glu ser Ala 20 25 30

Glu Glu ile Asp Ala Leu Lys Thr Asn Leu Arg Asn Gly Tyr Leu Asn 35 40 45

Asn Thr Tyr Phe Asn Glu Glu Asn Asn Asn Leu Asn ile Glu Asn Glu 50 55 60

Ile Asn Asn Thr Asn Tyr Asn Glu vai Thr Glu Glu Thr Lys Glu Glu 65 70 75 80

Leu Tyr Asp ile Asn Glu Asn ile Phe Pro Asp Tyr Phe Phe Leu Asp 85 90 95

Ile Phe Thr Glu Asn Lys Glu Gin Lys Asn Glu Glu vai Pro Met Lys 100 105 110

Ile Glu vai vai Asn Asp Gly Glu Glu vai Lys Thr Glu Tyr vai ser 115 120 125

Glu Lys Asn Glu Glu Vai Glu Asn Lys Ser Glu Thr Glu ile Gly Glu 130 135 140

Glu Leu Thr Glu Lys vai Asp Glu Lys vai Pro Glu Glu vai Ala Glu 145 150 155 160

Glu Leu val Glu Lys vai Asp Glu Glu vai Ala Glu Glu Leu vai Glu 165 170 175

Lys val Asp Glu Lys val Ala Glu Glu Val Asp Gin Lys val Asp Glu 180 185 190

Glu val Thr Glu Glu Leu Ile Glu Lys Val Asp Glu Glu Val Thr Glu 195 200 205

Glu Leu Ile Glu Lys Val Asp Glu Glu val Ala Glu Glu Leu Ile Glu 210 215 220

Lys val Asp Glu Glu val Ala Glu Glu Leu ile Glu Lys val Ala Asp 225 230 235 240

Glu Leu Ile Glu Lys val Asp Glu Glu val Ala Glu Glu Leu ile Glu 245 250 255

Lys val Ala Asp Glu Leu val Glu Lys val Ala Glu Glu Leu val Glu 260 265 270 93

Lys val ASP Glu Glu val Ala Glu Glu Leu Val Glu Lys val Asp Glu 275 280 285 Lys vai Ala Glu Glu val Asp Gin Lys Val Asp Glu Glu val Thr Glu 290 295 300 Glu Leu ile Glu Lys val Asp Glu Glu val Thr Glu Glu Leu ll e Glu 305 310 315 320 Lys Val Asp Glu GlU val Ala Glu Glu Leu 11 e Glu Lys val Asp Glu 325 330 335 Glu val Ala Glu 340 Glu Leu lie Glu Lys 345 val Ala ASp Glu Leu 350 val Glu Lys val Ala 355 Glu Glu Leu Val Glu 360 Lys val ASP Glu Gin 365 val Ala Glu Glu Leu val Glu Lys val Asp GlU Gin Val Ala Glu Glu Leu val Glu 370 375 380 Lys 385 val Asp Glu Gin val 390 val Glu Glu val Ala 395 Glu Glu Val Ala Glu 400 Glu val val Glu Glu Gly Glu Lys val pro Glu Glu Val Ala Glu Glu 405 410 415 vai Ala Glu Glu val Ala Glu Glu val Ala Glu Glu Val Ala Glu Glu 420 425 430 Leu val Glu Lys val Asp Glu Glu val Ala Glu Lys val val Glu Glu 435 440 445 Glu Gly Glu Lys val pro Glu Glu val val Glu Glu val Asp Glu Glu 450 455 460 vai Ala Glu Lys val val Glu Glu Glu Gly GlU Lys val Leu Glu Glu 465 470 475 480 Vai ile Glu Glu val val Glu Glu val Ala Glu Glu val Ala Glu Lys 485 490 495 Vai val Glu Glu Gin Gly Glu Lys val Asn Lys Α5Π Asp Leu Asn Asp 500 505 510 Ala ser Ser 515 Glu Glu ile Lys ASP 520 ser Ser ASP Phe & Glu Ser His Glu Glu Leu Phe Lys val Phe Leu Glu Leu Ile Asn Lys ASn Asp Leu 530 535 540 94

Vai Lys Glu Asn Leu Lys Lys Ile Thr Asn A$n Leu Asn Glu Met His 545 550 55S 560

Leu Ser Thr Leu Tyr pro 565

<210> 13 <211> 1218 <212> ADN <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> característica_misc <222> (1)..(1218) <223> MSP 3.7 <400> 13 atgaataagt ttttgaatat tatattttac atttttctaa tattaaattt ctctttcttc 60 caaagcaatg ccacaagtaa ggaaattcaa aaagatgaac aaaagaattt aagaaatggt 120 tcttcaataa ataataacaa aaatatagaa aataaaaatg ataatattga aactcaatat 180 gaagcttcag aatatataga aaaacaaaat gacattttaa atatgtataa tgatgaaaaa 240 gagaaaaata ataataattc attagataca aatgtaacaa aaaatactgt aattgataat 300 tcaaataaat ttcaatcaat tgaagacaat aatgtataca ataaaggtat atttgtaggt 360 actgggataa aattaaatga ttcacaaact acatctgata attacaaaaa tgaacgatat 420 caaatagacg atgaaaaatt gaagtatgga gggtcgtttg acacaatttt ttcaggtttt 480 gttaatttat taacaccatc aagtcctact caaaacgatg gatctacagg aagaaatgta 540 ccacctccta gtgaacctaa tgttgataca ccagatcctc caacagcacc cgcacctgta 600 aaggtacctg aagatgcaaa attatcaagt tctcctagac ctgaaggacc aagagcaaac 660 aatagaaatg aaaataatca aaatacagat ccatataacc actattttgc atgggaaatt 720 ggaggtggtg ctccaacgta taaacccgag aacaataaga acgataatat tttgctagaa 780 cacgtaaaaa ttacctcgtg ggataaagaa gatataatta aagaaaatga agacacaaaa 840 cgcgaagttc aagaaactga agacactgac gaaactgaag atactgacga aactgaagaa 900 acagaagata tggaagatga aaacgaaatt gtggaagatc aattacaaga aaatgaagat 960 95 gatgaggata atgtaaattt agaagatatt aataaaaata ctagaaatga tatatttgaa 1020 gaacaaataa aattagattc tacgcaagat gacaaagctc aaaaattaat ttctaatgaa 1080 tataaaaaaa ctgaagaaaa aaaatcatta gaagatcatg taaatctatt atttaatttt 1140 ttacaaacaa ataaccaact agatccttca ctaaaagatt tagaaaatga gttaactttt 1200 tttttaaata actattga 1218 <210> 14 <211> 405

<212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(405) <223> MSP 3.7 <400> 14

Met Asn Lys Phe Leu Asn ile lie Phe Tyr lie Phe Leu Ile Leu Asn 1 5 10 15 Phe ser Phe Phe Gin Ser Asn Ala Thr Ser Lys Glu Ile Gin Lys Asp 20 25 30 Glu Gin Lys Asn Leu Arg Asn Gly Ser ser ile Asn Asn Asn Lys Asn 35 40 45 ile Glu Asn Lys Asn Asp Asn lie Glu Thr Gin Tyr Glu Ala ser Glu 50 55 60 Tyr lie Glu Lys Gin Asn ASP lie Leu Asn Met Tyr Asn Asp Glu Lys 65 70 75 80 Glu Lys Asn Asn Asn Asn Ser Leu Asp Thr Asn vai Thr Lys Asn Thr 85 90 95 96

Vai Ile ASP Asn ser Asn •-ys Phe Gin Ser Ile Glu Asp Asn Asn val 100 105 110 Tyr Asn Lys Gly Ile Phe val Gly Thr Gly ile Lys Leu Asn Asp ser 115 120 125 Gin Thr 130 Thr ser ASp Asn Tyr 135 Lys Asn Glu Arg Tyr 140 Gin ile Asp Asp Glu Lys Leu Lys Tyr Gly Gly Ser Phe Asp Thr Ile Phe Ser Gly Phe 145 150 155 160 val Asn Leu Leu Thr Pro Ser ser Pro Thr Gin Asn Asp Gly Ser Thr 165 170 175 Gly Arg Asn val Pro Pro Pro Ser Glu Pro Asn Val Asp Thr Pro Asp 180 185 190 ΡΓΟ pro Thr Ala Pro Ala Pro val Lys val Pro Glu Asp Ala Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gly pro Arg Ala Asn Asn Arg Asn Glu 210 215 220 Asn Asn Gin Asn Thr Asp Pro Tyr Asn His Tyr Phe Ala Trp Glu ile 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ala Pro Thr Tyr Lys Pro Glu Asn Asn Lys Asn Asp Asn 245 250 255 ile Leu Leu Glu HlS val Lys Ile Thr Ser Trp Asp Lys Glu ASp Ile 260 265 270 Ile Lys Glu Asn Glu Asp Thr Lys Arg Glu val Gin Glu Thr Glu Asp 275 280 285 Thr ASP Glu Thr Glu Asp Thr ASp Glu Thr Glu Glu Thr Glu ASp Met 290 295 300 Glu ASp Glu Asn Glu Ile val Glu Asp Gin Leu Gin Glu Asn Glu Asp 305 310 315 320 ASp GlU ASP Asn val Asn Leu Glu Asp Ile Asn Lys Asn Thr Arg Asn 325 330 335 97 ASp lie Phe Glu Glu Gin ile Lys Leu Asp Ser Thr Gin Asp Asp Lys 340 345 350 Ala Gin Lys Leu Ile Ser Asn Glu Tyr Lys Lys Thr Glu Glu Lys Lys 355 360 365 Ser Leu Glu ASp His vai Asn Leu Leu Phe Asn Phe Leu Gin Thr Asn 370 375 380 Asn Gin Leu ASp Pro Ser Leu Lys Asp Leu Glu Asn Glu Leu Thr Phe 385 390 395 400

Phe Leu Asn Asn Tyr 405

<210> 15 <211> 2289 <212> ADN <213> Plasmodíum Falciparum <220> <221> característica_misc <222> (1)..(2289) <223> MSP 3.8 <400> 15 atgatatata ttttatctat tgtattttat atattttttt tacatattga tatatatgta 60 aacatttatt ctacatgttt tgttgtaaat gaggggaacc ctaatttaag aaataacata 120 attaatgatg atgaactaaa ggggaaagca tataataata ctatagatgc taataaccaa 180 aatatagaat ataataaaaa cttaaagcac aatgtaaact catctcatat atctaaattt 240 tcggatatta tggatcaaga agataaagga gataatgaaa attctcatga cataaaattt 300 gaagaaaaaa aaaatattaa taaatcttta gacgctgaat ccaattatgg tattaatgaa 360 attagtatta ctggtaatga tagtaatagt gataatagta atcagaatat ttttccagat 420 ggtagtgaat tagctggagg tattcctcgt tctatatata ctattaacct tggttttaat 480 98 aaatgtccta ctgaagagat ttgtaaagac tttagtaatc ttccacaatg tcgaaagaat 540 gtacatgaaa gaaataattg gttgggctca agtgtaaaaa atttttcaag tgataataag 600 ggggttcttg ttcctccaag aagacaatct ttatgtttaa gaattacatt acaagatttt 660 cgtacgaaaa agaaaaagga aggagatttt gaaaaattta tttattcata tgcatcatct 720 gaagctagaa aattaagaac catacacaat aataacttag aaaaagctca tcaagctata 780 agatatagtt ttgcagatat tggaaatatt attagaggag atgacatgat ggatacacct 840 acgtcaaaag aaaccataac atatttagaa aaagtactta aaatttataa tgaaaataat 900 gataaaccaa aagatgcaaa aaaatggtgg acagaaaaca ggcatcatgt ttgggaagca 960 atgatgtgcg gatatcagag tgcgcagaaa gataaccaat gtacaggtta tggtaacatt 1020 gatgatacac cacaattttt aaggtggttc agagagtggg gaacatatgt ctgtgaagaa 1080 agcgaaaaaa atatgaacac actaaaagct gtttgctttc cgaaacagcc aagaaccgaa 1140 gcgaatcctg cattgactgt acatgaaaat gaaatgtgct catcaacttt aaaaaaatat 1200 gaagaatggt ataataaaag gaaaactgaa tggactgaac aatctattaa atataacaat 1260 gacaaaatta attatacaga tataaaaaca ttatctcctt ctgaatattt aatagaaaaa 1820 tgtcctgaat gtaaatgtac caaaaaaaat ttgcaagatg tatttgaact tacatttgat 1380 ggaaaagctt tattagaaaa gctaaaaaaa gaagaatcac ctgtgagtaa tagtgtgaat 1440 gccttacctg aaccaggtca aattacatta cctgatcctt cattaaaaca aacaacacaa 1500 caggaaaatc aacctgttgt agaaacacct gttaccacag ctgttattaa tgaacatcaa 1560 ggacaaacag aaccgaataa aggtgacaac aataatgaaa gagaaaatca tgaaagtaat 1620 gttggtagca tccaagaagt aaaccaaggt agcgtgagcg aagaatcaca ttctaaaact 1680 atagatcctt ctaagattga cgaccgtttg gaattaagta gtgggtcatc atctcttgaa 1740 caacactcta aggaagatgt aaaaaaggga tgtgctttag aattggtacc tttatcttta 1800 tcggatattg aacagatagc taatgaaagc gaagatgtac tggaagagat agaagaagaa 1860 attaatacag atggggaaat agaatatata acagaagaag aaataaaaga agatatagaa 1920 gaagaaacag aagaagatat agaagaagaa acagaagaag aaacagaaga agaaacagaa 1980 gaagaagcag atgaagaaac agtaaaagaa atagaagaca aaccagaaca agaaattaaa 2040 aataaatcgc tagaagaaaa acaaatagat aaaaatacag ataccagtga aaagaaagga 2100 tttaataatt cagaaaaaga tgaaaaagct cgaaatttaa tttctaaaaa ttataaaaat 2160 tataatgaac tagataaaaa cgttcatact ttagtaaatt caattattag tttattagaa 2220 gaaggtaatg gaagtgattc taccttgaat agtttatcaa aagatattac aaatttattt 2280 aaaaattaa 2289 99

< 210 > 16 <211> 762 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum < 2 2 Ο > <221> CARACTERÍSTICAJMISC <222> (1)..(762) <223> MSP 3.8 <400> 16

Met lie Tyr Ile Leu Ser ile val Phe Tyr Ile Phe Phe Leu HÍS ile 1 5 10 15 Ο. ΙΟ < Ile Tyr Vai 20 Asn Ile Tyr ser Thr 25 Cys Phe val val Asn 30 Glu Gly Asn pro Asn Leu Arg Asn Asn Ile Ile Asn Asp Asp Glu Leu Lys Gly 35 40 45 Lys Ala Tyr Asn Asn Thr Ile Asp Ala Asn Asn Gin Asn ile Glu Tyr 50 55 60 Asn Lys Asn Leu Lys HÍS Asn val Asn ser Ser Hl 5 ile Ser Lys Phe 65 70 75 80 Ser ASp Ile Met Asp Gin Glu Asp Lys Gly ASP Asn Glu Asn ser His 85 90 95 Asp ile Lys Phe Glu Glu Lys Lys Asn Ile Asn Lys Ser Leu ASP Ala 100 105 110 Glu ser Asn Tyr Gly Ile Asn Glu Ile ser ile Thr Gly Asn ASp Ser 115 120 125 Asn Ser Asp Asn Ser Asn Gin Asn Ile phe pro Asp Gly ser GlU Leu 130 135 140 Ala 145 Gly Gly Ile Pro Ser ile Tyr Thr ile 155 Asn Leu Gly Phe Asn 160 100

Lys cys Pro Thr Glu Glu ile Cys Lys Asp Phe Ser Asn Leu Pro Gin 165 170 175 cys Arg Lys Asn val His Glu Arg Asn Asn Trp Leu Gly Ser Ser val 180 185 190 Lys Asn Phe Ser Ser Asp Asn Lys Gly val Leu Val Pro Pro Arg Arg 195 200 205 Gin ser Leu Cys Leu Arg Ile Thr Leu Gin Asp Phe Arg Thr Lys Lys 210 215 220 Lys Lys Glu Gly Asp Phe Glu Lys Phe Ile Tyr ser Tyr Ala Ser ser 225 230 235 240 Glu Ala Arg Lys Leu Arg Thr ile His Asn Asn Asn Leu Glu Lys Ala 245 250 255 HÍS Gin Ala ile Arg Tyr Ser Phe Ala Asp Ile Gly Asn Ile Ile Arg 260 265 270 Gly Asp Asp Met Met Asp Thr pro Thr Ser Lys Glu Thr Ile Thr Tyr 275 280 285 101

Leu Glu Lys val Leu Lys ile Tyr Asn Glu Asn Asn ASp Lys Pro Lys 290 295 300 Asp Ala Lys Lys Trp Trp Thr Glu Asn Arg His His Val Trp Glu Ala 305 310 315 320 Met Met cys Gly Tyr Gin ser Ala Gin Lys ASp Asn Gin Cys Thr Gly 325 330 335 Tyr Gly Asn Ile ASp Asp ile pro Gin Phe Leu Arg Trp Phe Arg Glu 340 345 350 Trp Gly Thr Tyr val cys Glu Glu Ser Glu Lys Asn Met Asn Thr Leu 355 360 365 Lys Ala val Cys Phe Pro Lys Gin Pro Arg Thr Glu Ala Asn Pro Ala 370 375 380 Leu Thr vai His Glu Asn Glu Met cys ser Ser Thr Leu Lys Lys Tyr 385 390 395 400 Glu Glu Trp Tyr Asn Lys Arg Lys Thr Glu Trp Thr Glu Gin Ser Ile 405 410 415 102

Lys Tyr Asn Asn Asp Lys ile Asn Tyr Thr Asp Ile Lys 420 425

Thr Leu ser 430 pro Ser Glu Tyr Leu ile Glu Lys Cys Pro Glu Cys Lys 435 440 445

Cys Thr Lys

Lys Asn Leu Gin Asp vai Phe Glu Leu Thr Phe Asp Gly 450 455 460

Lys Ala Leu

Leu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Glu Ser Pro vai ser Asn 465 470 475 ser vai Asn 480

Ala Leu Pro Glu pro Gly Gin ile Thr Leu Pro Asp Pro 485 490

Ser Leu Lys 495

Gin Thr Thr Gin Gin Glu Asn Gin Pro vai vai Glu Thr 500 505

Pro Vai Thr 510

Thr Ala vai Ile Asn Glu His Gin Gly Gin Thr Glu Pro 515 520 525

Asn Lys Gly

Asp Asn Asn Asn Glu Arg Glu Asn His Glu Ser Asn vai 530 535 540

Gly Ser Ile

Gin Glu vai Asn Gin Gly Ser vai Ser Glu Glu Ser His 545 550 555 ser Lys Thr 560

Ile Asp Pro ser Lys Ile Asp Asp Arg Leu Glu Leu ser 565 570

Ser Gly ser 575 ser ser Leu Glu Gin His Ser Lys Glu Asp vai Lys Lys 580 585

Gly cys Ala 590

Leu Glu Leu Vai Pro Leu Ser Leu Ser Asp Ile Glu Gin 595 600 605

Ile Ala Asn

Glu Ser Glu Asp vai Leu Glu Glu ile Glu Glu Glu Ile 610 615 620

Asn Thr Asp

Gly Glu Ile Glu Tyr Ile Thr Glu Glu Glu Ile Lys Glu 625 630 635

Asp Ile Glu 640

Glu Glu Thr Glu Glu Asp Ile Glu Glu Glu Thr Glu Glu 645 650

Glu Thr Glu 655

Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Asp Glu Glu Thr vai Lys 660 665

Glu Ile Glu 670 103

Asp Lys Pro Glu Gin Glu lie Lys Asn Lys ser Leu Glu Glu Lys Gin 675 680 685 lie Asp Lys Asn Thr Asp Thr Ser Glu Lys Lys Gly Phe Asn Asn ser 690 695 700

Glu Lys Asp Glu Lys Ala Arg Asn Leu Ile Ser Lys Asn Tyr Lys Asn 705 710 715 720

Tyr Asn Glu Leu Asp Lys Asn vai His Thr Leu vai Asn ser ile ile 725 730 735

Ser Leu Leu Glu Glu Gly Asn Gly Ser Asp Ser Thr Leu Asn ser Leu 740 745 750 ser Lys Asp ile Thr Asn Leu Phe Lys Asn 755 760

<210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(11) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-1 <400> 17 ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly vai Pro 1 5 10

<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum 104 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(11) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-2 <400> 18 ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Ala Pro 1 5 10

<210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(14) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-3 <400> 19 ile Leu Asp Asp Gly ile Glu Phe Ser Gly Gly Leu Tyr Phe 15 10

<210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum 105 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(11) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-4 <400> 20

Leu Glu Arg Gly Leu Gly Ser Gly Ala Leu Pro 1 5 10

<210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(11) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-4 <400> 21

Asp Asp Gly ser Ala Phe Gly Gly Gly Leu Pro 15 10

<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 106 <222> (1)..(11) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-7 <400> 22

Tyr Phe Ala Trp Glu He Gly Gly Gly Ala Pro 1 5 10

<210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(11) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-8 <400> 23

Arg Leu Glu Leu ser ser Gly Ser Ser Leu Glu 1 5 10

<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(11) <223> Motivo semelhante a MSP3b de MSP 3-8 107 < 4 Ο Ο > 24 ργο Asp Gly ser Glu Leu Ala Gly Gly ile Pro 1 5 10

<210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(20) <223> Motivo semelhante a MSP3c/d de MSP3-1 <400> 25

Leu ser His Leu Tyr vai ser Ser Lys Asp Lys Glu Asn lie Ser Lys 15 10 15

Glu Asn Asp Asp 20

<210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(20) <223> Motivo semelhante a MSP3c/d de MSP 3-2 108 < 4 Ο Ο > 26

Leu Glu Gin Ile Lys Ile Pro Ser Trp Asp Arg Asn Asn Ile Pro Asp 15 10 15

Glu Asn Glu Gin 20

<210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(20) <223> Motivo semelhante a MSP3c/d de MSP 3-3 <400> 27

Leu Glu Ser Vai Asn Leu Thr Ser Trp Asp Lys Glu Asp Ile Vai Lys 15 10 15

Glu Asn Glu Asp 20

<210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(20) <223> Motivo semelhante a MSP3c/d de MSP 3-4 109 < 4 Ο Ο > 28

Leu Glu Leu Ile Lys Leu Thr Ser Lys Asp Glu Glu Asp lie Ile Lys 15 10 15

His Asn Glu Asp 20

<210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(20) <223> Motivo semelhante a MSP3c/d de MSP 3-7 <400> 29

Leu Glu His vai Lys ile Thr Ser Trp Asp Lys Glu Asp ile ile Lys 15 10 15

Glu Asn Glu Asp 20

<210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum 110 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(20) <223> Motivo semelhante a MSP3c/d de MSP 3-8 <400> 30

Leu Glu Leu vai Pro Leu Ser Leu Ser Asp ile Glu Gin lie Ala Asn 15 10 15

Glu Ser Glu Asp 20

Lisboa, 27 de Janeiro de 2010 111

Claims (50)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido antigénico da proteína MSP3.3 de SEQ ID N° 6 compreendendo, pelo menos, o motivo semelhante a MSP-3-c/d, como definido na SEQ ID N° 27.
2. 2. Polipéptido antigénico da proteína MSP3.3 de SEQ ID N° 6 compreendendo, pelo menos, um motivo semelhante a MSP-3-c/d obtido por substituição conservativa de, pelo menos, um aminoácido de SEQ ID N° 27, sendo o referido motivo reconhecido por um anticorpo dirigido contra o motivo semelhante a MSP-3-c/d, como definido na SEQ ID N° 27, com a condição de o referido polipéptido antigénico não ser um fragmento de MSP-3-1 de SEQ ID N° 2 ou um fragmento de MSP-3-2 de SEQ ID N° 4.
3. 3. Polipéptido antigénico de acordo com a reivindicação 2 compreendendo, pelo menos, um motivo semelhante a MSP-3-c/d exibindo, pelo menos, 90% de identidade com o motivo, como definido na SEQ ID N° 27.
4. 4. Polipéptido antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 compreendendo adicionalmente, pelo menos, um motivo semelhante a MSP-3-b, tendo uma sequência seleccionada de entre as sequências de SEQ ID N° 17 a 24.
5. 5. Composição polipeptidica antigénica compreendendo um motivo semelhante a MSP-3-c/d, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e, pelo menos, outro motivo semelhante a MSP-3-c/d, seleccionado no grupo consistindo em: 1 a. SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30; b. um motivo semelhante a MSP-3-c/d, obtido por substituição conservativa de, pelo menos, um aminoácido numa sequência seleccionada no grupo consistindo em tendo uma sequência de SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29 OU SEQ ID N° 30, sendo o referido motivo reconhecido por um anticorpo dirigido contra qualquer dos motivos semelhantes a MSP-3-c/d, como definidos na SEQ ID N° 25 a SEQ ID N° 30; e c. um motivo semelhante a MSP-3-c/d exibindo, pelo menos, 90% de identidade com SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29 e SEQ ID N° 30.
6. 6. Composição polipeptidica antigénica de acordo com a reivindicação 5 compreendendo um motivo semelhante a MSP-3-c/d, como definido na SEQ ID N° 27 e, pelo menos, outro motivo semelhante a MSP-3-c/d, seleccionado no grupo consistindo na SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29 e SEQ ID N° 30.
7. 7. Composição polipeptidica antigénica de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que os referidos, pelo menos dois, motivos semelhantes a MSP-3-c/d diferentes são transportados por moléculas distintas.
8. 8. Composição polipeptidica antigénica de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que os referidos, pelo menos dois, motivos semelhantes a MSP-3-c/d diferentes são transportados por uma molécula única. 2
9. 9. Composição polipeptídica antigénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8 compreendendo, adicionalmente, um polipéptido antigénico compreendendo, pelo menos, 10 resíduos de aminoácidos consecutivos da região RO de GLURP.
10. 10. Composição polipeptídica antigénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, a qual é um mixotopo compreendendo péptidos sintéticos compreendendo a sequência: L-XiX2X3-X4-X3-X5-X6-X7-D-X8-X9-Xl0-I-Xll-Xl2Xl3-Xl4-Xl5-Xl6 (SEQ ID N° 33), em que: Xi = E ou S; x2 = L, H, S ou Q; χ3 = I, V ou L; X = K, N, Y ou p; Xs = T, S ou p; x6 = S ou l; x7 = K, w ou S; co X = E, K, R ou i; X9 = E ou N; Xio = D , N ou Q; Xn = I , V , S , P ou Xl2 = K , D ou N; Xl3 = H ou E; Xl4 = N ou s; Xl5 = E ou d; e Xl6 = D ou Q. 3
11. 11. Composição polipeptídica antigénica de acordo com a reivindicação 10, a qual é uma mistura de, pelo menos 50, pelo menos 100 ou, pelo menos 500 péptidos de diferentes sequências.
12. 12. Polipéptido antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou composição polipeptídica antigénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, em que uma molécula lipídica é ligada a, pelo menos, parte das moléculas polipeptídicas.
13. 13. Polipéptido antigénico ou composição polipeptídica de acordo com a reivindicação 12, em que a molécula lipídica é um resíduo de palmitoilisilamida C-terminal.
14. 14. Polipéptido antigénico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 ou composição polipeptídica antigénica de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 13, em que, pelo menos, parte das moléculas polipeptídicas é ligada a um suporte.
15. 15. Polipéptido antigénico ou composição polipeptídica de acordo com a reivindicação 14, em que o suporte são partículas virais, ou esférulas de nitrocelulose ou polistireno, ou um polímero biodegradável.
16. 16. Polipéptido antigénico ou composição polipeptídica de acordo com a reivindicação 15, em que o referido polímero biodegradável são lipofosfoglicanos ou ácido poli-L-láctico. 4
17. 17. Composição imunogénica compreendendo, como um imunogénio, um polipéptido antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 12 a 16 ou uma composição polipeptidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 15.
18. 18. Vacina contra a malária compreendendo, como um imunogénio, um polipéptido antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 12 a 16 ou uma composição polipeptidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 15, em associação com um veículo farmacêutico adequado.
19. 19. Composição imunogénica da reivindicação 17 ou vacina da reivindicação 18 compreendendo adicionalmente, pelo menos, um antigénio seleccionado de entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXPl, CS, MSPl, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP e GLURP.
20. 20. Composição imunogénica ou vacina de acordo com qualquer das reivindicações 17 a 20, a qual é formulada para injecção intradérmica ou intramuscular.
21. 21. Composição imunogénica ou vacina da reivindicação 20, compreendendo entre 1 e 100 pg de imunogénio por dose de injecção.
22. 22. Composição imunogénica ou vacina da reivindicação 20, compreendendo entre 2 e 50 pg de imunogénio por dose de injecção. 5
23. 23. Composição imunogénica ou vacina de qualquer uma das reivindicações 17 a 22 compreendendo, adicionalmente, SBAS2 e/ou Alúmen e/ou Montanida como um adjuvante.
24. 24. Utilização de um polipéptido antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 12 a 16, ou uma composição polipeptidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 16, para a preparação de uma composição de vacina contra a malária.
25. 25. Anticorpo sintético ou recombinante dirigido contra o motivo semelhante a MSP-3-c/d de um polipéptido antigénico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
26. 26. Agrupamento de anticorpos dirigidos contra uma composição polipeptidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 16.
27. 27. Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, ou um agrupamento de anticorpos de acordo com a reivindicação 26, em que os referidos anticorpos são anticorpos humanos ou humanizados.
28. 28. Utilização de uma composição compreendendo um anticorpo ou um agrupamento de anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, para a preparação de um medicamento contra a malária.
29. 29. Medicamento para a imunoterapia passiva de malária compreendendo um anticorpo ou um agrupamento de anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27. 6
30. 30. Medicamento da reivindicação 29 compreendendo, adicionalmente, anticorpos dirigidos contra, pelo menos, um antigénio seleccionado de entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXPl, CS, MSPl, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP e GLURP.
31. 31. Método para o diagnóstico in vítro de malária num indivíduo susceptivel de estar infectado por P. falcíparum, o qual compreende a colocação de uma amostra biológica do referido indivíduo em contacto com um polipéptido antigénico de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sob condições possibilitando a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre o referido péptido ou polipéptido antigénico e os anticorpos possivelmente presentes na amostra biológica e a detecção in vítro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados.
32. 32. Método da reivindicação 31, em que o diagnóstico in vitro é realizado por um ensaio ELISA.
33. 33. Método da reivindicação 31 ou 32, em que a amostra biológica é adicionalmente colocada em contacto com um ou vários péptidos antigénicos provenientes de outros antigénios seleccionados de entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXPl, CS, MSP-3-1, MSP-3-2, MSP-3-5, MSP-3-6, MSPl, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP e GLURP.
34. 34. Kit para o diagnóstico in vitro de malária compreendendo, pelo menos, um polipéptido antigénico, como definido em qualquer das reivindicações 1 a 4. 7
35. 35. Kit da reivindicação 34, em que o péptido ou polipéptido antigénico é ligado a um suporte.
36. 36. Kit da reivindicação 34 ou 35 compreendendo adicionalmente reagentes para possibilitar a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre o referido péptido ou polipéptido antigénico e os anticorpos possivelmente presentes numa amostra biológica, e reagentes possibilitando a detecção in vitro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados.
37. 37. Método para o diagnóstico in vitro de malária num indivíduo susceptível de estar infectado por P. falciparum, o qual compreende a colocação de uma amostra biológica do referido indivíduo em contacto com anticorpos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 25 a 27, sob condições possibilitando a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre os referidos anticorpos e os antigénios específicos para P. falciparum possivelmente presentes na amostra biológica e a detecção in vitro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados.
38. 38. Kit para o diagnóstico in vitro de malária compreendendo anticorpos como definidos em qualquer uma das reivindicações 25 a 27.
39. 39. Kit da reivindicação 38 compreendendo, adicionalmente, reagentes para possibilitar a formação de complexos de antigénio/anticorpo entre os referidos anticorpos e antigénios das proteínas da família de MSP-3 possivelmente presentes numa amostra biológica, e reagentes 8 possibilitando a detecção in vitro dos complexos de antigénio/anticorpo possivelmente formados.
40. 40. Sequência nucleotidica recombinante codificando um polipéptido antigénico, como definido em qualquer das reivindicações 1 a 4.
41. 41. Sequência nucleotidica recombinante de acordo com a reivindicação 40 compreendendo uma sequência codificando uma proteína de fusão compreendendo vários motivos semelhantes a MSP-3-c/d, em que, pelo menos, dois dos referidos motivos são seleccionados de entre os motivos de SEQ ID N° 25 a 30.
42. 42. Vector de clonagem e/ou expressão recombinante compreendendo uma sequência nucleotidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 41.
43. 43. Vector de clonagem e/ou expressão recombinante da reivindicação 42, em que a sequência nucleotidica está sob o controlo de um promotor e elementos reguladores para expressão numa célula hospedeira, sendo o referido promotor e elementos reguladores homólogos ou heterólogos, vis-à-vís, à célula hospedeira.
44. 44. Utilização de um vector de expressão de acordo com a reivindicação 43, para a preparação de um medicamento para imunização genética contra Plasmodium falciparum.
45. 45. Vacina de ADN compreendendo uma sequência nucleotidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 41. 9
46. 46. Célula hospedeira recombinante, a qual é transformada pelo vector da reivindicação 42 ou 43.
47. 47. Célula hospedeira da reivindicação 46, a qual é uma bactéria, uma levedura, uma célula de insecto ou uma célula de mamífero.
48. 48. Polipéptido antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 12 a 16 ou uma composição polipeptídica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 16, para utilização como uma composição de vacina contra a malária.
49. 49. Composição compreendendo um anticorpo ou um agrupamento de anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, para utilização como um medicamento contra a malária.
50. 50. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 42 ou 43, para utilização como um medicamento para imunização genética contra Plasmodium falciparum. Lisboa, 27 de Janeiro de 2010 10