PT1536810E - Extração de canabinóides farmaceuticamente ativos a partir de material vegetal - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"EXTRAÇÃO DE CANABINÓIDES FARMACEUTICAMENTE ATIVOS A PARTIR DE MATERIAL VEGETAL" A presente invenção refere-se à extração de componentes farmaceuticamente ativos a partir de materiais de plantas, e mais particularmente à preparação de uma substância para fármaco botânico (BDS) para incorporação num medicamento. Uma BDS de pureza determinada, para uso em formulações farmacêuticas também é descrita. Uma BDS compreendendo canabinóides obtidos por extração a partir de canábis é também descrita.

No documento WO 02/064109 a requerente divulga um método de preparação de um extrato medicinal à base de plantas (substância medicinal botânica) a partir de canábis medicinal. O processo compreende: 1. 1. um passo de aquecimento de forma a descarboxilar o ácido a partir dos canabinóides para a sua forma neutra; 2. 2. uma primeira extração com um volume especificado de dióxido de carbono liquido durante 6-8 horas; e 3. 3. um passo para reduzir a proporção de materiais não-alvo, referido como fregelização, cujo passo precipita ceras para extração.

Mais especificamente, o documento WO 02/064109 descreve um processo em que: o passo 1 compreende o aquecimento de canábis picada (2-3 mm) a 100-150 °C durante tempo suficiente para permitir a descarboxilação; o passo 2 compreende a extração de CO2 usando: 2 1. a) um pó grosseiro (as partículas passam através de uma malha de 3 mm); 2. b) uma densidade de empacotamento de 0,3; e 3. c) condições supercríticas de 600 bar a 35 °C durante 4 horas, embora as outras combinações de temperatura e de pressão que variam de 10-35 °C e 60-600 bar (ambas condições supercríticas e subcríticas) poderiam, reconhece-se, ser utilizadas; e o passo 3 compreende a realização de uma precipitação etanólica a -20 °C durante 24 horas, e a remoção do material ceroso mediante filtração. 0 método supercrítico divulgado no documento WO 02/064109 produziu: 1. a) um extrato de THC elevado contendo: 60% de tetra-hidrocanabinol (THC) 1-2% canabidiol (CBD) 4-5% de outros canabinóides menores, incluindo CBN (Os rendimentos quantitativos foram de 9% p/p com base no peso em seco de canábis medicinal); e 2. b) um extrato de CBD elevado contendo:

60% de CBD 4% de THC 2% de outros canabinóides (Os rendimentos quantitativos foram de 9% p/p com base no peso em seco de canábis medicinal).

Claramente, como a BDS resultante é para ser utilizada num produto farmacêutico, é essencial que o processo seja seguro e escalável para GMP e proporcione altos graus de consistência do produto e, de preferência, também bons rendimentos. 3

Os princípios da extração com fluido supercrítico (SFE) têm sido conhecidos desde o trabalho de Baron Cagniard de la Tour em 1822, quando foi observado que o limite de gás-líquido desaparecia quando a temperatura de certos materiais era aumentada pelo seu aquecimento num recipiente de vidro fechado. A partir deste trabalho inicial o ponto crítico de uma substância foi descoberto pela primeira vez. 0 ponto crítico é a temperatura acima da qual uma substância pode coexistir em fases gasosas, líquidas e sólidas. Mais tarde, foi descoberto que, ao tomar as substâncias a ou acima da sua temperatura e pressão críticas, elas poderiam ser utilizadas como solventes sofisticados para a extração e fracionamento de misturas complexas. A técnica é amplamente utilizada no negócio de processamento de combustíveis de petróleo e tem sido aplicada para, por exemplo, a purificação e separação de óleos vegetais e de peixe.

Uma caracterí st ica atrativa da SFE em relação ao uso de solventes convencionais é que o poder solvente (E°) pode ser variado através da manipulação da temperatura e pressão acima do ponto crítico.

Num diagrama típico de pressão-temperatura para uma substância, existem três linhas que definem o equilíbrio entre as duas fases. Essas linhas encontram-se no ponto triplo. As linhas definem a interface entre os estados líquido, gasoso, e sólido, e os pontos ao longo da linha definem o equilíbrio entre os pares de fases. Por exemplo, a curva da pressão de vapor (ponto de ebulição) começa no 4 ponto triplo e termina no ponto critico. A região critica começa neste ponto e um fluido supercrítico é qualquer substância que esteja acima da sua temperatura crítica (Tc) e da pressão crítica (Pc). A temperatura crítica é, portanto, a temperatura mais elevada, em que um gás pode ser convertido em líquido por meio de um aumento de pressão e a pressão crítica é a pressão mais alta na qual um líquido pode ser convertido num gás tradicional através do aumento da temperatura. Na denominada região critica, há apenas uma fase e que possui algumas das propriedades tanto de um gás como de um liquido. Há um número de solventes, que podem ser utilizados para a extração de substâncias ativas a partir de materiais vegetais, e a Tabela 1 mostra a temperatura e as pressões criticas para alguns destes solventes.

Tabela 1: Condições Críticas para Solventes

Solventes Temperatura Crítica (°C) | Pressão Crítica (bar) Dióxido de carbono 31,1 1 73,8 Etano 32,2 | 48,8 .Etileno 9,3 | 50,4 íPropano 96,7 | 42,5 :Propileno 91,9 | 46,2 :Ciclo-hexano 280,3 | 40,7 íIsopropanol 235,2 | 47,6 i Benzeno 289,0 | 48,9 S Tolueno 318,6 | 41,1 p-Xileno 343,1 j 35,2 Clorotrifluorometano 28,9 | 39,2 Triclorofluorometano 198,1 \—1 Amoníaco 132,5 | 112,8 Água 374,2 | 220,5 5 A requerente selecionou o dióxido de carbono como o solvente preferido, que tem uma temperatura critica de 31,1 °C e uma pressão critica de 73,8 bar. 0 dióxido de carbono é particularmente vantajoso porque está disponível em abundância a baixo custo, e pode, se necessário, ser reciclado. Eventuais perdas de C02 também são ecologicamente neutras. Para além disso, a extração de C02 é um método conservador de preparação e as moléculas bastante frágeis podem ser extraídas com precisão.

Uma consideração chave na seleção inicial de C02 líquido, como solvente para a produção de um extrato padronizado de alta potência da erva canábis foi o elevado grau de seletividade que pode ser alcançado. No sistema de C02, foi determinado que o poder de solvatação pode ser essencialmente considerado como sendo uma função da densidade e da temperatura, sendo a densidade do solvente o fator mais importante.

Ao contrário da expectativa, a requerente determinou que os canabinóides são melhor obtidos sob condições subcríticas do que em supercríticas.

Ao controlar cuidadosamente a temperatura e pressão abaixo da temperatura e pressão supercríticas, a requerente foi capaz de separar as frações lipofílicas ou hidrofílicas ricas em canabinóides com outros componentes que podem ser separados de forma relativamente fácil para se obter uma substância medicinal botânica (BDS) que contém os componentes desejáveis de uma forma que seja farmaceuticamente aceitável. Assim, os compostos que são 6 conhecidos por serem substâncias ativas podem ser separados a partir de misturas complexas que ocorrem no material botânico em bruto.

Além disso, muito boa reprodutibilidade de lote para lote pode ser obtida entre os lotes e constituintes indesejados, tais como os metais pesados, que podem estar presentes em graus diferentes no material botânico em bruto, e que podem ser deixados para trás no material esgotado.

As condições de extração podem também ser modificadas para rejeitar os resíduos de pesticidas que podem estar presentes no material original.

Os benefícios da utilização de condições subcríticas incluem o caráter seletivo da extração. Em contraste, a requerente verificou que com a SPE do solvente, bem como com a solubilização dos canabinóides desejáveis, solubilizou desvantajosamente outros materiais não-alvo que se revelaram difíceis de separar num passo de limpeza subsequente.

Para explicar, a densidade do C02 subcrítico é baixa, e continua a ser baixa, mesmo quando a pressão é aumentada até o ponto crítico do sistema ser atingido. Assim, embora o poder de solvatação do C02 subcrítico ser reduzido, um elevado grau de seletividade pode ser conseguido, uma vez que apenas os componentes mais solúveis são dissolvidos eficientemente pelo C02; neste caso, a fração de canabinóides. 0 resultado é a produção de um extrato relativamente simples contendo, bem como os canabinóides, apenas um número limitado de compostos não-alvo, muitos dos quais podem ser removidos de forma relativamente fácil, num 7 único passo. Para além disso, a economia nos custos conseguida pelo funcionamento a pressões e temperaturas relativamente baixas é ainda mais beneficiada.

Por outro lado, acima da temperatura critica de 31 °C, há um aumento significativo da densidade do CO2, uma vez que agora existe num estado de fluido supercritico. Isto tem o efeito de aumentar muito significativamente o poder de solvatação do solvente, o que, embora geralmente vantajoso na medida em que os canabinóides são solubilizados produzindo rendimentos elevados, na verdade, revela ser desvantajoso porque a seletividade reduzida dos solventes mais poderosos resulta numa solubilidade aumentada de uma gama de compostos não-alvo, o que torna o extrato resultante mais difícil de purificar. Por outras palavras, isto resulta n produção de extratos mais complexos, em que a concentração do composto alvo pode ser significativamente diluída (ou seja, a potência do extrato é diminuída).

Num primeiro aspeto, a invenção fornece um método de extração de canabinóides a partir de material vegetal de canábis compreendendo um passo de descarboxilação, uma extração com dióxido de carbono líquido (C02) , e um passo para reduzir a proporção de materiais não-alvo no extrato, caracterizado por a extração com C02 líquido ser conduzida sob condições subcríticas, a uma temperatura na gama de 5-15 °C e a uma pressão na gama de 50-70 bar. O método de acordo com a invenção pode ser usado para a preparação de um extrato rico em canabinóides a partir de material vegetal de canábis. Numa forma de realização preferida, o método pode ser usado para produzir um extrato de canábis que é uma substância medicinal botânica.

No contexto do presente pedido uma "substância medicinal botânica" é um extrato derivado de material vegetal de cannabis, em que o extrato cumpre com a definição de "substância medicinal botânica" fornecida no Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, Agosto de 2000, Departamento Americano para a Saúde e Serviços Humanos, Centro de Administração de Alimentos e Medicamentos para a Avaliação e Pesquisa de Fármacos de: "Uma substância medicinal derivada de uma ou mais plantas, algas ou fungos macroscópicos. É preparada a partir de matérias-primas botânicas por um ou mais dos seguintes processos: pulverização, decocção, expressão, extração aquosa, extração etanólica, ou outros processos semelhantes". "Material vegetal" é definido como uma planta ou parte de planta (por exemplo, casca, madeira, folhas, caules, raízes, flores, frutos, sementes, bagas ou partes dos mesmos), assim como exsudados, e inclui material que é abrangido pela definição de "matéria-prima botânica"no Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, Agosto de 2000, pelo Departamento Americano para a Saúde e Serviços Humanos, Centro de Administração de Alimentos e Medicamentos para a Avaliação e Pesquisa de Fármacos. O método da invenção pode ser usado para extrair os canabinóides a partir de qualquer material vegetal que se sabe conter tais canabinóides. Mais tipicamente, mas não necessariamente, o "material vegetal" será "material vegetal" ou "matéria-prima botânica", derivados a partir de uma ou mais plantas de canábis. 9 0 termo "planta(s) de Canábis" engloba a Cannabis sativa de tipo selvagem e também as suas variantes, incluindo a chemovars de canábis que contêm naturalmente diferentes quantidades dos canabinóides individuais, a subespécie da Cannabis sativa, indica, incluindo as variantes var.indica e var.kafiristanica, a Cannabis indica e também plantas que são o resultado de cruzamentos genéticos, auto-cruzamentos ou híbridos. O termo "material vegetal de Canábis" deve ser interpretado em conformidade como englobando material vegetal derivado de uma ou mais plantas de canábis. Para que não restem dúvidas faz-se constar que o "material vegetal de canábis" inclui a biomassa seca de canábis. A extração com C02 líquido é de preferência realizada a uma temperatura entre 8-12 °C, com mais preferência a uma temperatura de cerca de 10 °C. A extração com C02 líquido é de preferência realizada a uma pressão entre 55-65 bar, com mais preferência a uma pressão de cerca de 60 bar.

Com mais preferência, o C02 tem um fluxo de massa a partir de 1000-1500 Kg/h, com mais preferência um fluxo de massa de essencialmente 1250 Kg/h.

De preferência, a extração com C02 líquido é realizada até 10 horas, com mais preferência cerca de 8 horas.

Numa forma de realização preferida, C02 líquido é removido por despressurização e o extrato recuperado é mantido a uma temperatura na gama de -15 °C a -20 °C. 10 O passo para a redução da proporção de materiais não-alvo na substância medicinal botânica pode ser essencialmente qualquer tratamento que resulte na remoção seletiva de componentes indesejáveis (por oposição aos canabinóides), de tal modo que a quantidade dos componentes indesejáveis presentes no produto de substância medicinal botânica final seja reduzida. Materiais "não-alvo" são qualquer material derivado do material vegetal de partida, cuja presença não é desejada na substância medicinal botânica final. Numa forma de realização preferida, este passo pode compreender uma precipitação com um álcool C1-C5, em que o material a ser tratado no passo de precipitação com álcool é aquecido acima da temperatura ambiente, antes de o álcool C1-C5 ser adicionado. Tipicamente, o passo de redução da proporção de materiais não-alvo na substância medicinal botânica é realizado depois da extração com C02 liquido, caso em que o "material a ser tratado" na precipitação alcoólica é o produto da extração de C02 liquido. Este extrato é em si mesmo uma "substância medicinal botânica" no âmbito da definição dada em cima. O álcool C1-C5 é, de preferência etanol. O extrato é de preferência aquecido a uma temperatura na gama de desde 36 °C a 44 °C, mais preferivelmente a cerca de 40 °C. O aquecimento do material a ser tratado antes da adição do álcool C1-C5 tem o efeito de melhorar a mistura deste material com o álcool C1-C5, e, portanto, melhora o desempenho do passo de precipitação com álcool. numa O álcool C1-C5 é, de preferência adicionado numa quantidade de 3:1 a 1:1 de álcool C1-C5 em concentração ponderai do material a ser tratado, mais preferivelmente, 11 quantidade de cerca de 2:1 de álcool C1-C5 em concentração ponderai do material a ser tratado. A solução resultante da adição do álcool C1-C5 no material a ser tratado é refrigerada e os materiais não solúveis são deixados a precipitar. De preferência, a solução é arrefecida para uma temperatura na gama de -15 °C a -25 °C, e de preferência a solução é arrefecida até 52 horas. 0 precipitado de material não solúvel é então removido, tipicamente por filtração. De preferência, a filtração é realizada através de uma membrana de 20pm.

Numa forma de realização ainda mais preferida, o método pode compreender ainda uma evaporação de passos múltiplos, sob pressão reduzida. Isto pode ser feito por evaporação rotativa ou outras técnicas conhecidas.

Tipicamente, a evaporação de passos múltiplos é realizada sobre o produto do passo de precipitação de álcool C1-C5, de modo a remover substancialmente todo o álcool C1-C5 e água. De preferência, o álcool C1-C5 é removido em primeiro lugar e em seguida a água. 0 álcool C1-C5 é, de preferência removido por aquecimento a uma temperatura na gama de 58-62 °C para se obter uma temperatura de vapor na gama de 38-42 °C, sob um vácuo no intervalo de 168-172 mbar até que haja pouco ou nenhum condensado visível. A água é então removida, adicionalmente, de preferência, com uma redução gradual do vácuo em fases a cerca de 50 mbar. 12 0 passo de descarboxilação pode ser efetuado antes ou depois da extração com C02 líquido.

Numa forma de realização preferida, o passo de descarboxilação é realizado antes da extração com C02 líquido e é realizado pelo aquecimento do material vegetal a temperaturas e períodos de tempo que garantam pelo menos 95% de conversão dos canabinóides ácidos a partir da forma ácida, para a sua forma neutra, ao mesmo tempo garantindo a degradação térmica de THC para CBN em menos de 10%. A descarboxilação dos ácidos de canabinóides é uma função do tempo e da temperatura, portanto, a temperaturas mais elevadas um período de tempo mais curto será considerado para a descarboxilação completa de uma dada quantidade de ácido de canabinóides. Na seleção de condições adequadas para a consideração da descarboxilação deve, contudo, ser dada para minimizar a degradação térmica dos canabinóides farmacológicos desejáveis, em produtos de degradação indesejáveis, em particular a degradação térmica de THC em canabinol (CBN).

De preferência, a descarboxilação é realizada por um processo de aquecimento de várias etapas em que o material vegetal é: 1. i) aquecido para um primeira temperatura, durante um primeiro período de tempo (relativamente curto), para evaporar a água retida e permitir um aquecimento uniforme do material vegetal; e 2. ii) a temperatura é aumentada para uma segunda temperatura, durante um segundo período de tempo (tipicamente mais longo do que o primeiro período de 13 tempo), até que tenha ocorrido pelo menos 95% da conversão dos canabinóides ácidos na sua forma neutra.

De preferência, o primeiro passo é conduzido a uma temperatura na gama de 100 °C a 110 °C durante 10-20 min. De um modo mais preferido, a primeira temperatura é de cerca de 105 °C e o primeiro período de tempo é de cerca de 15 minutos.

Se o material vegetal for derivado de plantas de canábis com um teor elevado de CBD (definida como> 90% de CBD como uma percentagem do teor total de canabinóides), a segunda temperatura está de preferência no intervalo de 115 °C a 125 °C, de preferência cerca de 120 °C e o segundo período de tempo está na gama de 45-75 minutos, de preferência cerca de 60 minutos. Mais preferivelmente, a segunda temperatura é da ordem de 135 °C a 145 °C, de preferência 140 °C e o segundo período de tempo está na gama de 15 a 45 minutos, de preferência cerca de 30 minutos. Numa outra forma de realização, mais preferida para uma massa de material vegetal superior a 4 kg, a segunda temperatura está na gama de 140 °C a 150 °C, de preferência de 145 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 55-90 minutos. As últimas condições são preferidas para o processamento de quantidades de, por exemplo, 4-6 kg de material vegetal de partida e os valores exatos, em particular o tempo, podem variar um pouco com a massa aumentada.

Se o material vegetal for derivado de plantas de canábis com um teor elevado de THC (definido como> 90% de THC como uma percentagem do teor total de canabinóides) , a segunda temperatura está de preferência no intervalo de 115 °C a 125 °C, tipicamente cerca de 120 °C e o segundo período de 14 tempo está de preferência na gama de 45 minutos a 75 minutos, tipicamente cerca de 60 minutos. Mais preferivelmente, a segunda temperatura é da ordem de 100 °C a 110°C, tipicamente 105 °C e o segundo período de tempo está na gama de 60 a 120 minutos. Numa outra forma de realização, mais preferida para uma massa de material vegetal superior a 4 kg, a segunda temperatura está na gama de 140 °C a 150 °C, de preferência de 145 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 45 a 55 minutos.

Com mais preferência, o passo de descarboxilação é realizado a temperaturas e períodos de tempo que garantem pelo menos 97% de conversão dos canabinóides ácidos na sua forma neutra, ao mesmo tempo garantindo a degradação térmica de THC para CBN em menos de 5%.

As condições padrão para os ensaios de canabinóides, e os métodos de cálculo do teor de canabinóide (em %) são dados nos Exemplos anexos. O material vegetal utilizado como material de partida para o processo de extração é, de preferência triturado, moído ou de outro modo processado para se obter uma granulometria de menos de 2 mm, mas de preferência maior do que 1 mm. Tal tratamento resulta geralmente na extração melhorada de canabinóides a partir do material vegetal, tal como a densidade da embalagem é melhorada.

Numa forma de realização preferida, o método da presente invenção pode ainda compreender um passo de tratamento de um extrato (ou material de substância medicinal botânica) derivado do material vegetal com carvão ativado. 15

Tipicamente, este passo é realizado sobre o produto de uma precipitação com álcool C1-C5, em geral imediatamente a seguir à filtração para remover o precipitado. 0 produto liquido da precipitação alcoólica é classificado como uma "substância medicinal botânica" de acordo com a definição dada acima. Convenientemente, o tratamento com carvão ativado pode ser realizado pela passagem de material liquido a ser tratado por baixo de uma coluna de carvão ativado.

Tal como ilustrado nos exemplos anexos, o tratamento com carvão ativado, melhora significativamente a estabilidade das substâncias medicinais botânicas derivadas de material vegetal de canábis, melhorando significativamente a resistência à degradação térmica dos canabinóides ativos.

Numa forma de realização preferida, o método da presente invenção irá compreender os passos que se seguem, de preferência, levados a cabo pela ordem indicada a partir de material vegetal de canábis: 1. i) descarboxilação, 2. ii) extração com CO2 liquido, para produzir uma substância medicinal botânica em bruto, 3. iii) precipitação com álcool C1-C5 para reduzir a proporção de materiais não-alvo, 4. iv) filtração para remover o precipitado, 5. v) evaporação para remover o álcool C1-C5 e a água, para produzir uma substância medicinal botânica final (BDS).

Uma etapa de tratamento com carvão ativado pode ser incluída entre o passo iv) e passo v), resultando em maior estabilidade da BDS final. 16 A requerente determinou ainda que a adição de uma proporção do modificador ou solvente polar, por exemplo um álcool Cl-C5, tal como exemplificado pelo etanol, ao solvente de dióxido de carbono liquido pode aumentar ainda mais a seletividade do processo de extração.

Em consequência, um método de extração de canabinóides a partir de material vegetal compreendendo uma extração com CO2 liquido, caracterizado por um modificador orgânico ou solvente polar ser adicionado o dióxido de carbono é também descrito.

De preferência, o modificador ou solvente polar é adicionado em uma quantidade de até 10% em peso.

De preferência, o modificador é um álcool C1-C5, mais preferivelmente etanol.

As substâncias medicinais botânicas derivadas de material vegetal de canábis são também descritas. É descrita neste documento a substância medicinal botânica obtenível a partir de matéria-prima botânica de uma planta de canábis contendo elevado THC, contendo um teor de THC de, pelo menos, 90% p/p do conteúdo total de canabinóides, em que a referida substância medicinal botânica é um extrato derivado de uma planta de canábis de elevado THC compreendendo pelo menos 50% de THC p/p de extrato, não mais do que 5% de CBD p/p do conteúdo de THC, e não mais de 5% de canabinóides para além de THC e CBD p/p do teor de THC. O THC% p/p de extrato é mais preferivelmente de pelo menos 55%, e mais preferivelmente ainda de pelo menos 60%. Os 17 outros canabinóides e a metodologia de ensaio para determinar as quantidades são dados mais tarde. É também descrita neste documento uma substância medicinal botânica obtenível a partir de matéria-prima botânica de uma planta de canábis contendo elevado CBD, contendo um teor de CBD de, pelo menos, 90% p/p do conteúdo total de canabinóides, em que a referida substância medicinal botânica é um extrato derivado de uma planta de canábis de elevado CBD, cujo extrato compreende pelo menos 50% de CBD p/p de extrato, não mais do que 7,5% de THC p/p do conteúdo de CBD, e não mais de 5% de canabinóides para além de CBD e THC expressos como %p/p do Teor de CBD. O perito irá apreciar que as plantas de THC elevado, tais como, por exemplo, a espécie "Skunk" têm sido cultivadas, embora para uso recreativo, utilizando técnicas tradicionais de cruzamento, que podem do mesmo modo ser utilizadas para o desenvolvimento de plantas ricas em outros canabinóides, por exemplo, a CBD, por seleção natural ou por técnicas genéticas tal como os genes da síntese de cannabidiolato e síntese de THC foram identificados, ver JP 2001029082 e JP2000078979. A CPRO 921018 Land race Turkey é um exemplo de planta com elevado teor de CBD.

As substâncias medicinais botânicas podem ser obtidas a partir de material vegetal de canábis (matéria-prima botânica) usando o método de extração de acordo com a invenção.

Numa forma de realização preferida, a substância medicinal botânica não compreende mais do que 4ppb de aflatoxina. 18

Numa outra forma de realização preferida, a substância medicinal botânica não compreende mais do que 20 ppm de metais pesados totais.

Numa outra forma de realização preferida a substância medicinal botânica compreende não mais do que 15% p/p de solventes residuais, mais especificamente, não mais do que 15% p/p de etanol.

Numa outra forma de realização preferida, a substância medicinal botânica compreende não mais de 105 cfu/g TVC (Contagem Total Viável), não mais de 104 cfu/g de fungos, não mais do que 103 cfu/g de enterobactérias e outros organismos não gram-negativos, e não detetáveis de E. coli, Salmonella ou S. aureus.

Os parâmetros acima indicados referem-se à pureza da substância medicinal botânica e definem um nível de pureza que é preferido quando a substância medicinal botânica, deve ser incorporada num produto farmacêutico. As substâncias medicinais botânicas tendo o nível desejado de pureza podem ser obtidas usando o processo de extração de acordo com a invenção, em particular, utilizando as condições de operação e procedimentos de controlo de qualidade descritos nos exemplos anexos. Técnicas de ensaio padrão para utilização na determinação dos níveis de alfatoxina, metais pesados, solventes residuais e contaminantes bacterianos numa substância medicinal botânica são conhecidos na arte (por exemplo, procedimentos Ph.Eur padrão) e são fornecidos mais pormenores nos Exemplos em anexo. 19

As substâncias medicinais botânicas preparadas a partir de material vegetal de canábis de acordo com os métodos da invenção podem ser formuladas com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes ou excipientes, ou podem ser depositadas sobre uma superfície farmaceuticamente aceitável para a vaporização, a fim de produzir formulações farmacêuticas contendo canabinóides como os agentes farmaceuticamente ativos.

Por isso, um método para a produção de uma composição farmacêutica compreendendo, como agente ativo, uma substância medicinal botânica que é um extrato de pelo menos uma variedade vegetal de canábis, método esse que compreende a preparação de uma substância medicinal botânica contendo canabinóides a partir da pelo menos uma variedade vegetal de canábis utilizando o método de extração de acordo com a invenção, e a formulação da substância medicinal botânica com um ou mais diluentes, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, ou a deposição da substância medicinal botânica numa superfície farmaceuticamente aceitável para a vaporização para a produção de uma composição farmacêutica também é aqui descrito.

As substâncias medicinais botânicas separadas podem ser preparadas a partir de variedades vegetais simples de canábis tendo diferentes conteúdos de canabinóides (por exemplo plantas com elevado grau de THC e de CBD) sendo, em seguida, misturadas em conjunto antes da formulação para produzir a composição farmacêutica final. Esta abordagem é preferida se, por exemplo, se desejar atingir uma proporção definida em peso de canabinóides individuais na formulação final. Alternativamente, a matéria-prima botânica a partir 20 de uma ou mais variedades vegetais de canábis de conteúdo canabinóide definido pode ser misturada antes da extração de uma substância medicinal botânica simples com o conteúdo de canabinóides desejado, o qual pode então ser formulado numa composição farmacêutica final. A substância medicinal botânica pode ser formulada com quaisquer diluentes, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis convenientes para a produção de uma composição farmacêutica. A escolha dos diluentes, veículos ou excipientes vai depender da forma de dosagem desejada, a qual pode por sua vez ser dependente da via de administração pretendida para um paciente. As formas de dosagem preferidas incluem, inter alia,, as formas de dosagem liquidas para administração por via da bomba-ação ou sprays de aerossóis, comprimidos, pastilhas, geles, cápsulas, supositórios, pós, etc, e vaporizadores. Tais formas de dosagem podem ser preparadas de acordo com princípios de formulação farmacêutica padrão, conhecidos pelos peritos na arte. As formas de dosagem preferidas, e os métodos de preparação de tais formas de dosagem, são descritos no pedido Internacional da requerente co-pendente WO 02/064109.

As formulações líquidas são particularmente preferidas. Uma formulação particularmente preferida para administração de canabinóides, embora não se pretenda que seja limitativa para a presente invenção, é uma formulação líquida que compreende a substância medicinal botânica, etanol e propileno-glicol e, opcionalmente, um aromatizante, tal como óleo de hortelã-pimenta. Essa formulação pode ser convenientemente administrada à mucosa bucal ou sublingual, 21 através de um pulverizador de bomba-ação, e proporciona a absorção eficiente dos canabinóides ativos.

Os diferentes aspetos da invenção são ainda ilustrados, a titulo de exemplo apenas, por meio dos exemplos que se seguem, juntamente com as figuras em anexo, nas quais: - A Figura 1 ilustra a perda de THC ao longo do tempo a 40 °C para a substância medicinal botânica THC padrão (BDS) e BDS de THC tratada com carvão ativado (BDS purificada). Eixo Y: quantidade de THC (expressa como percentagem do valor), eixo x: tempo em meses. A Figura 2 ilustra a perda de CBD ao longo do tempo a 40 °C para a substância medicinal botânica CBD padrão (BDS) e BDS CBD tratada com carvão ativado (BDS purificada). Eixo Y: quantidade de CBD (expressa como percentagem do valor), eixo x: tempo em meses. A Figura 3 ilustra a formação de canabinol (CBN) ao longo do tempo a 40 °C para a substância medicinal botânica de THC padrão (BDS) e BDS de THC tratada com carvão ativado (BDS purificada). Eixo Y: quantidade de CBN (expressa como percentagem do valor), eixo x: tempo em meses.

Abreviaturas

As abreviaturas geralmente aceites para a maioria dos canabinóides são as seguintes:

Tetrahidrocanabinol (THC), A9-tetrahidrocanabinol (THC ou A9-THC), A8-tetrahidrocanabinol (A8-THC), A9-análogo propilo de tetrahidrocanabinol (THCV), canabidiol (CBD) , análogo 22 propilo de canabidiol (CBDV), canabinol (CBN), canabicromeno (CBC), análogo propilo de canabicromeno (CBCV) e canabigerol (CBG),

Exemplo 1 - Desenvolvimento de um processo para a extração de canabinóides a partir de plantas de canábis

Seleção de chemovars de cannabis A GW Pharma Ltd desenvolveu variedades distintas de híbridos de plantas de Canábis para maximizar a saída dos constituintes químicos específicos, os canabinóides. Dois tipos de plantas são usados; um chemovar produz principalmente THC e um outro chemovar produz predominantemente CBD. No entanto, variedades alternativas podem ser obtidas - ver, por exemplo, Fenótipos comuns de canabinóides em 350 lotes de canábis, Small e Beckstead, LLoydia vol 36b 1973 P144-156 e criados usando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica para maximizar o teor canabinóide.

Existem semelhanças químicas e estruturais entre THC e CBD. Devido a estas semelhanças, juntamente com a origem botânica dos materiais de partida, cada um deles pode ser considerado como sendo permutável com respeito ao desenvolvimento de processos para a extração de canabinóides.

De preferência, cada chemovar de Canábis é processado e controlado separadamente para produzir as duas BDSs distintas. No entanto, é possível misturar o material vegetal a partir de dois ou mais chemovars ou utilizar uma variedade que vai produzir a proporção desejada de certos 23 canabinóides antes da extração, e, assim, preparar uma BDS individual.

Produção de matéria-prima botânica A BDS é preparada a partir de extratos de Cannabis sativa L. (família das Cannabidaceae). A Cannabis sativa foi descrita na Farmacopeia Britânica de 1934. A canábis é cultivada sob licença do United Kingdom Home Office sob o controlo da GW Pharma Ltd no Reino Unido. As instalações crescentes estão equipadas com sombras e controlo climático completo (temperatura, humidade e iluminação de alta intensidade) para que diversas culturas possam ser produzidas por ano em condições de cultivo quase idênticas, garantindo a continuidade do fornecimento.

Cultivo:

As plantas de Canábis são propagadas a partir de estacas retiradas da planta mãe, proveniente de uma única fonte de semente. Portanto, uma cultura é produzida através de propagação assexuada, onde as plantas são todas do sexo feminino. A propagação utilizando estacas controla a consistência do genótipo.

As estacas estão enraizadas em adubo fornecido sem pesticidas. As plantas são regadas e o fertilizante de libertação sustentada é aplicado durante o ciclo de crescimento. Através de condições de crescimento controladas as plantas demoram cerca de 12 semanas para atingir a maturidade.

As plantas são irrigadas durante todo o seu ciclo de crescimento com qualidade da água potável. 24 Não são usados quaisquer herbicidas ou pesticidas sintéticos no cultivo de plantas de canábis.

Adubo: 0 cultivo eficiente de canábis exige o fornecimento de um meio de crescimento uniforme fiável. 0 adubo proporciona uma textura macia, alta porosidade de ar, humedecimento imediato, baixa condutividade e fornecimento de nutrientes equilibrado. 0 adubo consiste em turfa e minerais naturais adicionados, incluindo a cal (carbonatos de cálcio e magnésio) , para proporcionar um controlo de pH do composto durante o ciclo de crescimento das plantas de Canábis. 0 adubo contém um suprimento adequado de minerais essenciais e um mínimo de minerais com conhecidos efeitos negativos sobre as plantas. Alguns minerais incluindo manganês podem estar presentes numa forma insolúvel em adubo e ser libertados numa forma livremente solúvel ao longo do tempo. 0 controlo do pH do adubo e a monitorização da irrigação para evitar encharcamento irá controlar os níveis de manganês solúvel. 0 PH do adubo é mantido acima de 5,5. 0 adubo é declarado como isento de pesticidas, visto não haver pesticidas ou herbicidas adicionados.

Fertilizante: 0 adubo contém fertilizantes identificável em duas formas distintas, um fertilizante de base e um fertilizante de libertação lenta. Um outro fertilizante de libertação lenta é aplicado nas plantas durante o crescimento. 25

Controlo de Doenças e Pragas: Não são usados herbicidas ou pesticidas artificiais durante o cultivo. Condições de higiene rigorosas reduzem a entrada de pragas e doenças.

Ao controlar as condições de crescimento, stresses ambientais tais como a seca, luz insuficiente e temperaturas desfavoráveis reduz o risco de doença. A inspeção regular das plantas durante o ciclo de crescimento permite a deteção de quaisquer plantas invasoras e pragas. As plantas invasoras masculinas podem surgir, embora as ervas daninhas devam estar ausentes devido às condições e meios controlados de cultura. As inspeções frequentes e métodos de controlo biológico são usados para gerir quaisquer pragas ou doenças que possam ocorrer.

Recolha das Plantas:

Com o controlo rigoroso das condições de crescimento, as plantas de Canábis alcançam a maturidade em cerca de 12 semanas. Nas últimas semanas de crescimento desenvolvem-se densas flores resinosas. Até ao final de aproximadamente a semana 11, a biossíntese canabinóide diminuiu significativamente, e as plantas estavam prontas para a colheita.

Toda a planta é cortada e seca num ambiente de temperatura e humidade controladas. • Aproximadamente 21 °C. • Aproximadamente 38 - 45% HR. 26 A planta seca é avaliada em termos físicos para o ponto final.

Os THC e CBD são os constituintes bioativos principais nas BDS. No entanto, estes componentes estão presentes como ácidos carboxílicos biologicamente inativos na BRM.

• THCA

• CBDA

As formas do ácido descarboxilam lentamente ao longo do tempo durante a secagem. As folhas e flores são retiradas das hastes maiores para fornecer a Matéria-Prima Botânica (BRM) .

Armazenamento da BRM:

Sob condições de armazenamento, a perda por secagem atinge o equilíbrio de aproximadamente 10%. As condições de armazenamento para a BRM seca dependerão do estado físico da BRM.

Condições gerais de armazenamento da BRM: • Protegida da luz.

• Aproximadamente 15 - 25 °C ou -20 °C • Aproximadamente 38 - 42% HR. 27

Sumário - produção de uma BRM:

Colheita, de plantas 1’

Secagem (exclusão de luz) 1

BSM (contém: THCâ-f-CBBA) Ψ

Moagem cara menos de 2000 μπι para reduzir dimensão de ©articula .. 1

De3carboxiiação da forma ácida de canafeinoides (THC&+CBBS.) para produzir carsahinoides neutros {THC+CBD)

Uma especificação de BRM típica, derivada de uma variedade com elevado teor de CBD é ilustrada na Tabela 2:

Teste Método Especificação Identificação: -A Visual Em conformidade -B TLC Corresponde ao padrão ( para CBD & CBDA) Positivo a CBDA -c HPLC/UV Ensaio: In-house NLT 90% de canabinóides testados por CBDA + CBD (HPLC/UV) área de pico Perda por Secagem: Ph.Eur. NMT 15% ÍAflatoxina * método UKAS NMT 4ppb Microbiana:** Ph.Eur. -TVC NMT 107 cfu/g 28 Teste Método j Especificação

Fungos ΝΜΙ 105 cfu/g E.coli NMT 102 cfu/g

Matéria Estranha

Ph.Eur NMT 2 %

Herbicidas e

Ph.Eur

Em conformidade

Pesticidas Residuais:*** Métodos Analíticos:

Identificação por Visual:

As características macroscópicas permitem que as caracteristicas da planta Canábis sejam distinguidas de adulterantes potenciais e substitutos. É uma identificação visual contra um padrão fotográfico.

Identificação por TLC: A TLC usa tanto o tempo de retenção como a cor local caracteristica para identificar efetivamente a variedade de Canábis. Amostras de laboratório são preparados para análise por TLC pela extração da erva seca. Uma aliquota é colocada numa placa de TLC, ao lado de amostras de referência para THC e CBD. Após a exposição ao reagente Fast Blue B, o THC e THCA apresentam-se como manchas cor de rosa, enquanto que o CBD e CBDA são de cor laranja. Os Neutros podem ser distinguidos dos ácidos, por comparação do valor de Rf com o obtido para os padrões. A identidade é confirmada por comparação de Rf e a cor do ponto de amostra, com a obtida para o padrão apropriado.

Identificação por HPLC: A HPLC usa a comparação do tempo de retenção dos canabinóides para identificar efetivamente a variedade de 29

Canábis. 0 método de HPLC de fase inversa é especificado para CBD e CBDA e por isso pode ser usado com um teste de identidade. As amostras de biomassa são extraídas e centrifugadas. A deteção de todos os analitos é conseguida a 220 nm com confirmação adicional de analitos acídicos a 310 nm.

Ensaio (CBD + CBDA):

Este ensaio é usado para monitorizar o teor de CBD e CBDA na planta. O ensaio de CBD a CBDA é determinado usando um método de HPLC. A Eficácia do processo de descarboxilação é determinada pela divisão do teor % em termos de p/p de CBD pelo total do teor CBD+CBDA.

Perda por Secagem: A perda por secagem é avaliada usando o método de teste Ph-Eur.

Aflatoxina: A aflatoxina é analisada usando um método acreditado pelo United Kingdom Accreditation Service (UKAS).

Microbiana: A qualidade microbiológica é determinada usando uma metodologia Ph.Eur.

Matéria Estranha: A matéria estranha é avaliada usando o método de teste Ph.Eur. As flores, folhas e caules laterais são espalhados numa camada fina sobre uma superfície limpa de laboratório. A matéria estranha é separada à mão tão completamente 30 quanto possível, e é pesada. Os resultados são expressos como %p/p de Matéria Estranha na amostra de biomassa de ervas. A Matéria Estranha não pode compreender mais do que 2% da biomassa.

Herbicidas e Pesticidas Residuais:

As plantas de Canábis são cultivadas num ambiente bem controlado. Não são usados nem necessários herbicidas ou pesticidas artificiais durante o cultivo.

Uma especificação de BRM (comparar com a tabela 2) é derivada de uma variedade de THC elevada e métodos analíticos idênticos seguidos, exceto que o THC/THCA substitui O CBD/CBDA.

Descarboxilação

Os THC e CBD são os constituintes bioativos principais na Canábis. No entanto, estes constituintes estão presentes como ácidos carboxílicos biologicamente inativos nas plantas de Canábis. A fim de extrair o THC ou CBD a partir de material vegetal de canábis, é necessário converter os compostos precursores de armazenamento de THCA e CBDA nas suas formas mais facilmente extraiveis e farmacologicamente ativas. Os ácidos THC e CBD lentamente descarboxilam naturalmente ao longo do tempo. A maneira tradicional de aumentar a taxa de descarboxilação é através da aplicação de calor. No entanto, o THCA é convertido não só para THC, mas também a outro canabinóide, canabinol (CBN). c ΓΚ€Α os CBDA {CíLsHaeQs} EHC os CBD {CíiHsbOzÍ 31 0 processo de descarboxilação é geralmente realizado dentro da preparação do material de partida ou da matéria-prima botânica (BRM), antes do inicio do processo de extração.

Estudos de Laboratório - descarboxilação

As porções de material vegetal moido seco foram sujeitas a calor (cerca de 0,25 g, com tamanho de partícula de 1 - 2 mm) . Um sistema experimental de escala piloto foi estabelecido, com o objetivo de determinar parâmetros para a conversão ótima de THCA ou CBDA em THC e CBD, respetivamente, com uma perda mínima concomitante destes compostos seguintes, nos seus produtos de degradação térmica, no caso do THC, formação de CBN.

Breve Descrição dos Materiais e Métodos:

Porções (0,25 g) de material vegetal moído (tamanho de partícula de aproximadamente 1-2 mm) tanto de THCA como de CBDA foram colocadas em frascos de vidro de 20 mL e os frascos foram fechados hermeticamente com vedantes de borracha butilo com revestimento de cobertura em Teflon. Os frascos selados foram aquecidos a uma de três temperaturas, por períodos de até 4 horas, como se segue: 105 °C, 120 °C, 140 °C durante 0,5, 1,0, 2,0 e 4,0 horas. O aquecimento foi realizado num forno com circulação forçada de ar. As condições do forno demonstraram ser de uma precisão de 0,5-1,0 grau nas três temperaturas utilizadas.

Após o processo de aquecimento, amostras representativas da erva descarboxilada foram avaliadas usando HPLC, GC e 32 técnicas de TLC. Padrões de THC, CBD e CBN foram incluídos nas sequências de HPLC e GC.

Resultados e Discussões: A análise por HPLC dos extratos de solvente foi capaz de demonstrar o desaparecimento tanto de CBDA como de THCA como uma função do tempo, nas duas temperaturas mais baixas. A 140 °C, as amostras temporais iniciais a 0,5 hora continham níveis muito modestos de uma eluição de pico a tempos de retenção de CBDA ou THCA.

As Tabelas 3 e 4 apresentam dados de HPLC que quantificam a conversão de CBDA ou THCA nos compostos livres; também são apresentados dados mostrando o teor de CBD ou THC e a proporção de CBD/CBDA + CBD ou THC/THCA + THC. A conversão das formas de ácido carboxílico com a forma correspondente descarboxilada pode ser monitorizada através da comparação do rácio descarboxilado/descarboxilado mais não-descarboxilado com o conteúdo absoluto dos compostos descarboxilados. Assim, quando a relação atinge um valor máximo (> 0,95), o ponto de tempo/temperatura mais antigo em que o teor de THC ou de CBD também é máximo, deve ser ótimo para o processo de conversão.

Assim, para a erva contendo CBD, 1 hora a 120 °C ou 0,5 horas a 140 °C, foi adequado.

Isto é confirmado pela análise do cromatograma de TLC para os extratos de solventes e a CBDA está ausente após 1 hora a 120 °C, ou em qualquer ponto de tempo, a 140 °C.

Para o THC existe um 3o critério, a formação de CBN, onde é desejável minimizar a formação deste composto durante o 33 processo de descarboxilação térmica. A Tabela 5 fornece os dados de Cromatograf ia de Gás (GC) em que uma razão de CBN/THC pode ser derivada. Tomados em consideração, conjuntamente com a razão THC/THCA + THC e o teor máximo de THC, a formação minima de CBN ocorre depois de 0,5 ou 1,0 horas a 120 °C. A 140 °C, até 0,5 hora dá um maior teor de CBN do que qualquer um dos dois pontos mais baixos de tempo/temperatura.

Portanto, os estudos laboratoriais demonstram as condições ideais para a descarboxilação de:

Chemovar produzindo principalmente CBD é de 1 hora a 120 °C ou 0,5 hora a 140 °C.

Chemovar produzindo principalmente THC para minimizar a formação de CBN, é de 1 a 2 horas à temperatura de 105 °C ou 1 hora a 120 °C. A cromatografia em camada fina revelou que praticamente todas as THCA desapareceram depois de 4 horas a 105 °C e depois de 1 hora a 120 °C. Nenhum THCA é visível em qualquer ponto de tempo quando a erva é aquecida a 140 °C. Uma pequena quantidade de coloração residual neste valor de retenção em TLC e a presença de níveis baixos de um pico coincidente com THCA em análise por HPLC pode indicar a presença de um canabinóide menor do que o THCA residual.

Tabela 3:

Dados de HPLC a partir da Descarboxilação de Material Vegetal CBDA Temperatura Tempo (horas) ! CBD/CBD + CBDA Área de pico CBD/0,lg de erva — Zero i 0,15 0,5 0,22 4769 5262 34

Dados de HPLC a partir da Descarboxilação de Material Vegetal CBDA

Temperatura ! Tempo (horas) i CBD/CBD + CBDA Área de pico CBD/0,lg de erva 1 1 , 0 | 0,86 5598 105°C | 2,0 j 0,93 5251 I 4,0 1 0,98 5242 1 0,5 j 0,91 5129 | i,o | 0,97 5217 120°C j 2,0 j 0,99 5037 j 4,0 j 1,00 5200 1 0,5 ! 0,96 5440 1 2'° ! 1,00 5105 140° | 2,0 | 1,00 5157 | 4,0 j 1,00 5005

Tabela 4:

Dados de HPLC a partir da Descarboxilação de Material Vegetal THCA

Temperatura Tempo (horas) j THC/THC + THCA Área de pico THC/0, lg de erva j Zero 0,17 992,9 j 0,5 0,87 5749 ! 1,0 0,93 5273 j 105°C 2,0 0,98 7734 j 4,0 0,99 7068 | -----------------------------------; 0,5 ]0,97 7189 i 120°C 1,0 j 0, 99 6391 j 2,0 j 0, 99 6500 i 35 iDados de HPLC a partir da Descarboxilação de Material Vegetal THCA ÍTemperatura jTempo (horas) ÍTHC/THC + THCA jÁrea de pico THC/0,lg de erva | j 4,0 !l,00 j 5870 0,5 1,00 j 6724 1,0 1,00 5981 2,0 1,00 5361 4,0 1,00 j 4787

Tabela 5:

Dados de GC a partir da Descarboxilação de Material Vegetal THC i Temperatura i Tempo (horas) | CBN/THC (%) ; ! Zero 2,4 | 1 0,5 1 3,5 i 105°C 1 1,0 4,2 | i 2,0 3,7 | | 4,0 ; 5,6 ; 0,5 ! 3,2 1,0 | 4,1 | 4,0 | 11,3 j 0,5 | 5,7 : 1,0 j 13,0 140°C !__________________________________________________________________________________[_________________________________________ 2.0 i 17,5 4.0 ! 23,8 36

As condições de descarboxilação para uma escala em lotes de cerca de 4 kg de matéria-prima botânica (BRM) são as seguintes:

Aproximadamente 4 kg de BRM moida (seja THCA ou CBDA) a ser descarboxilada foi inicialmente aquecida a 105 °C e mantida a esta temperatura durante cerca de 15 minutos para evaporar a água retida e para permitir o aquecimento uniforme da BRM. O lote foi então adicionalmente aquecida a 145 °C e mantido a esta temperatura durante 45 minutos, para permitir que a descarboxilação seja concluída a uma eficácia superior a 95%. O tempo de aquecimento para BRM de CBDA foi estendido para 55 minutos a 145 °C, pois tornou-se evidente a partir dos resultados que a CBDA era ligeiramente mais resistente à descarboxilação do que a THCA. Esta diferença entre CBD e THC seria ainda mais pronunciada em lotes em lotes à escala comercial. O tempo de aquecimento da BRM de THC foi mantido a 145 °C durante 45 minutos.

As condições utilizadas em escala piloto refletem essas condições determinadas como ideais a partir dos estudos de laboratório. As diferenças podem ser explicadas por meio de transferência de calor mais lenta e menos eficiente através dos recipientes e através da BRM, no tamanho do lote aumentado para a escala piloto.

As Tabelas 6 e 7 fornecem dados para demonstrar a eficiência da descarboxilação medida em termos de conteúdo do canabinóide biologicamente ativo, a THC ou CBD.

Tabela 6: 37

iEficiência da Descarboxilação para BRM CBD i Número de lote de CBD ij% de Eficiência da Especificação da ! !i Descarboxilação >95% ÍA j 98,8 :B 199,5 C ] 98,3 jl) ! 100,0 j E 1100,0 |f ] 100 |g 1 96, 9 !h |100,0 0 aumento no número de lote de BRM de CBD de aproximadamente 4kg para 6kg resultou numa necessidade de aumentar o tempo de descarboxilação. 0 tempo de descarboxilação a 145 °C foi aumentado de 55 minutos para 90 minutos. Tabela 7: j Número de lote % de Eficiência da Especificação da Descarboxilação ide THC >95% jl 99,4 j J i 97,3 jK 98,5 ;L |100,0 \M 1 97,8 j N í 99, 9 i° 100,0 38

Visão Geral do Processo de Extração: A BDS é extraída a partir da BRM descarboxilada usando a metodologia do dióxido de carbono líquido. Isso envolve a passagem contínua de dióxido de carbono liquefeito através da biomassa triturada, que é contida num recipiente de alta pressão. 0 extrato em bruto é dissolvido em etanol, arrefecido para uma temperatura baixa e é então filtrado para se removerem constituintes precipitados, tal como ceras. A remoção de etanol e de água em vácuo produz uma BDS contendo concentrações mais elevadas de CBD ou THC, dependendo da biomassa usada. 39

Diagrama de fluxo do processo de extração típico: S BRM é desca rtooxilada através de aquecimento a aproximadamesite 105 ®C duraste 15 minutos, seguido de aprcxiiaadaiaeate 145 °C por um mia imo de 55 minutos sara THCâ e 90 minutos para CBSA. 1

Extração com drcxrdo de carbono liquido ÍCO2) [Grau alimentar] ate 10Si Condições: pressão aproximada de €0 bar ± 10 toar e 10®C±5®C i

Remoção do COs por despressarrzaçao para recuoerar o· extrato as broto ; "Fregelizaçao" - Dissolução· do extrato em bruto ess etarsol segui do de solução de refrigeração [-23 »C ± 5 *C/ até 52 horas) para pracioitar ceras indeseiadas 1

Remoção de material cemso inciesa^ ado por filtração a trio (filtro de 20 i

Remoção de et and e agua a. partir do filtrado por evaporação por película fina sob pressão reduzida (feOeC±2°C, com vapor a. 40°C±2"C / 272' inbar s 72 iabar±4 abar) i

BBS

(Armazenado a -20 °C ± 5 ®C

Extração ne 1 0 primeiro estágio no processo de fabrico é a Extração usando C02 liquido, sob condições subcriticas.

As experiências indicaram que tanto o THC como o CBD poderiam ser extraídas do material vegetal de Canábis com alta eficiência usando C02 subcrítico a baixa temperatura, de aproximadamente 10 °C ± 5 °C usando uma pressão de aproximadamente 60 bar ± 10 bar.

A Tabela 8 seguinte mostra dados comparativos gerados para uma BDS rica em THC 40

Carregamento iPressão em:Temperatura em: %p/p de cera j%thc p/p após n° jbar i°C j removida j fregelização Acl202 1400 ! 60 i 8,2 j 67,2 Acl205 1400 ! 60 (6,1 í 67, 0 Acl206 1400 i 60 I 6,1 j 68, 0 Três ciclos ] 60 10 i 2,2 - 4,8 5 59, 9-73,7 : média de cerca j média de cerca de j de 3 i 65% A partir dos resultados, pode-se observar que não há perda de seletividade, tal como indicado pela elevada carga de cera sob condições supercriticas. Embora a fregelização possa remover grandes quantidades de cera, o processamento é difícil porque, por exemplo, os filtros bloqueiam.

Resultados semelhantes foram obtidos com a CBD.

As condições preferidas para a extração com CO2 líquido são as seguintes: A matéria-prima botânica descarboxilada é acondicionada numa única coluna e é exposta ao C02 líquido sob pressão. • Tamanho do lote: Aproximadamente 60 kg • Pressão: 60 bar ± 10 bar

• Temperatura: 10 °C ± 5 °C • Tempo: Aproximadamente 8 horas • Fluxo de massa de C02 1250kg/hr ± 20%. 41

Os parâmetros de processo preferidos para a produção de BDS são: tempo de extração > 10 horas, pressão de CO2 50-70 bar, temperatura de extração 5-15 °C, massa de C02 167 kg/kg de BRM.

Após a despressurização e ventilação para remoção de C02, o extrato em bruto de BDS é recolhido em recipientes fechados. A BRM inicial reduz para cerca de 10% p/p de extrato em bruto de BDS. O extrato em bruto de BDS é mantido a -20 °C ± 5 °C. 0 extrato em bruto de BDS contém ceras e as moléculas de cadeia longa. A remoção é feita por procedimento de "fregelização" (extração 2), em que o extrato de BDS em bruto é aquecido, por exemplo, para 40 °C + 4 °C para liquefazer o material. Adiciona-se etanol na proporção de 2:1 volume de etanol ao peso do extrato em bruto de BDS. A solução etanólica é então arrefecida para -20 °C ± 5 °C e mantida a esta temperatura durante aproximadamente 48 horas.

No final da fregelização, o precipitado é removido por filtração a frio através de um filtro de 20ym.

Extração na 2 O segundo estágio do processo de fabrico é a Extração n° 2, referido como "fregelização" utilizando etanol. O extrato BDS em bruto é produzido a partir da Extração n° 1 que contém constituintes, tais como ceras. O etanol efetivamente extrai moléculas de cadeia longa a partir do extrato em bruto. 42

Estudos :

Verificou-se por meio de aquecimento do extrato de BDS em bruto a aproximadamente 40 °C que a capacidade de mistura do extrato em bruto com solvente foi melhorada.

Foi preferido refrigerar a solução de "fregelização" a -20 °C durante cerca de 48 horas.

Os parâmetros de processo preferidos para a produção de BDS são: temperatura de extração 36-44 °C, proporção de etanol:produto de aproximadamente 2:1, temperatura do congelador de -25 °C a -15 °C, tempo de 48-54 horas.

Filtração A solução etanólica produzida no segundo estágio de extração requer a filtração para remover a precipitação resultante. O tamanho do filtro é, de preferência 20 pm.

Os parâmetros de processo preferidos para produção de BDS são: tempo de filtração total> 6 horas.

Evaporação O estágio final do processo de fabrico é a remoção do etanol e de qualquer água que possa estar presente. De preferência, esta é levada a cabo por aquecimento a 60 °C ± 2 °C para se obter uma temperatura de vapor de 40 °C ± 2 °C, sob um vácuo de 172 mbar ± 4 mbar. A destilação sob estas condições continua até que haja pouco ou nenhum condensado visivel. A redução adicional do vácuo, por fases, para cerca de 50 mbar, completa a remoção de água. Após a conclusão, a BDS é transferida para recipientes selados de aço inoxidável e é armazenada num congelador a -20 °C ± 5 °C. 43

Os parâmetros de processo preferidos para a produção de BDS são: temperatura de evaporação de vapor 38-42 °C, remoção de etanol por pressão a vácuo 167-177 mbar, remoção de água por pressão a vácuo 70-75 mbar, 62-58 mbar, 52-48 mbar, tempo <8 horas.

Caracterização da BDS A BDS de THC é um extrato semissólido castanho viscoso, que consiste em pelo menos 60% de constituintes de canabinóides. Os constituintes de canabinóides incluem THC, pelo menos a 90%, cerca de 1,5% de CBD sendo o restante constituído por outros canabinóides menores. A composição química da Canábis tem sido exaustivamente estudada com mais de 400 compostos identificados (Hendricks et al, 1975; Turner et al, 1980). Mais de 60 canabinóides foram identificados, com CBDA e THCA (os precursores de CBD e THC) sendo os mais abundantes. Geralmente, os componentes não-canabinóides compreendem até 50% de extratos, dependendo do processo de extração. As classes químicas identificadas incluem alcanos (de cadeia de carbono 25-30), compostos nitrogenados, aminoácidos, açúcares, aldeídos, álcoois e cetonas, flavonóides, glicosídeos, vitaminas, pigmentos e terpenos. Cerca de 95 mono-e sesquiterpenos, foram identificados na Canábis e são responsáveis pelo odor característico.

Trabalho considerável tem sido realizado para elucidar completamente sobre a estrutura tanto da CBD como da THC (resumidas nos documentos acima) e ambas já foram preparadas sinteticamente. A THC pura foi isolada com sucesso, em quantidade suficiente, a partir da BDS para ser 44 usada como material de referência para a identificação e quantificação.

Impurezas: A substância BDS é um extrato seletivo de folhas secas descarboxiladas e capítulos de chemovars específicos da Cannabis sativa. Uma gama de mais de 400 compostos, incluindo mais de 60 canabinóides, foi encontrada em plantas de Canábis (Turner 1980). Uma vez que estes são de ocorrência natural, não se considera necessária a consideração de qualquer um destes componentes, como impurezas. As principais impurezas, pois, ocorrem em quatro áreas, pesticidas introduzidos durante o processo de crescimento, aflatoxinas, quaisquer novos produtos formados pela descarboxilação e os materiais que não os canabinóides, que compõem a BDS. 0 processo de crescimento é rigorosamente controlado utilizando as diretrizes do GAP e ocorre num ambiente de crescimento interior com clima controlado. Nenhum pesticida é aplicado às culturas durante o crescimento, todo o controlo de pragas sendo gerido por meios biológicos. Nenhum pesticida é incorporado no meio de cultura. Para garantir que nenhum resíduo de pesticidas é introduzido no produto, o meio de cultura é periodicamente testado quanto a pesticidas conhecidos e usados pelo fornecedor do meio de crescimento.

Assim que o material de planta é colhido e seco, mais amostras são periodicamente testadas utilizando uma tela de pesticida geral, para assegurar que não ocorreu qualquer contaminação da cultura, sendo as impurezas potenciais controladas adequadamente no estágio de BRM. 45

Embora as condições de crescimento sejam cuidadosamente controladas para evitá-lo, a matéria-prima tem o potencial de contaminação microbiológica resultando em aflatoxinas no produto. A BRM e a BDS são, portanto, testadas periodicamente quanto a conteúdo de aflatoxinas. A forma de ocorrência natural de THC na planta recentemente crescida é a THCA ácida, embora pequenas quantidades de THC neutra ocorram. Antes da extração, a THCA é descarboxilada por aquecimento para produzir a THC neutra. 0 processo é eficiente, mas uma pequena quantidade de THCA permanece e esta é monitorizada durante o teste final da BDS. A degradação térmica da THCA e THC durante o processo de descarboxilação é possível produzir CBNA e CBN. Estas são monitorizadas na BDS.

Os componentes não-canabinóides que formam a porção de lastro da BDS incluem ceras de hidrocarbonetos e triglicéridos, pigmentos vegetais e terpenos. Estes são componentes comuns de muitos outros extratos de plantas medicinais e são considerados como tendo pouca importância toxicológica e farmacológica. A gama de outros componentes presentes é ampla, mas os mesmos estão, geralmente, presentes em apenas pequenas quantidades. A quantidade de lastro é reduzida pelo processo de fregelização que precipita as ceras. Os materiais de lastro são considerados como um diluente dos constituintes ativos e não são testados ou controlados. 46

Tabela 9 Especificações para o controlo de BDS elevada em CBD: jTeste j Método dejLimites j ;j teste I | íAparência jIn-house jSemissólido castanhol | | |viscoso | jIdentificação: -A ÍTLC 1 Pontos têm |característico e cores, RE I j-B 5 HPLC/UV jem comparação com padrão dej |CBD, positivo para CBD Teor de CBD ijIn-house jNLT 55% p/p do extrato 1(HPLC-UV) Canabinóides relacionados: |In-house 5 - Teor de THC j (HPLC/UV) jNMT 7,5% do teor de CBD 5 -Outros (total) jNMT 5% do teor de CBD 1 Aflatoxina: * |tba jNMT 4 ppb 5 jTotal de Metais Pesados:** |Ph.Eur. ÍNMT 20 ppb ; j ; 5 Solventes residuais: |In-house -Etanol :j jNMT 5% p/p i Microbiana: *** |Ph.Eur. -TVC ÍNMT 105 cfu/g -Fungos ÍNMT 104 cfu/g -Outras enterobactérias & certos jNMT 103 cfu/g outros organismos gram-positivos -E.coli jAusente em lg 5 -Salmonela jAusente em lOg i-S.aureus jAusente em Ig j

Procedimentos analíticos

Identificação, Ensaio e Canabinóides Relacionados: 0 teor de THC, CBD e de Canabinol (CNB) na BRM e BDS é quantitativamente determinado por extração com metanol ou metanol/clorofórmio (9:1). A Cromatografia Líquida de Alta 47

Eficiência de fase inversa (HPLC) com deteção de UV a 220nm é o método de quantificação. Todas as análises devem ser executadas sob luz âmbar porque os compostos de interesse são conhecidos como sendo sensíveis.

Equipamento e Condições de Cromatografia:

Equipamento \Sistema Agilent (HP)1100 HPIC com detetor de UV comi icomprimento de onda variável ou detetor com sistema! \de díodos. j Coluna de HPLC jDiscovery C8 5pm 15cm x 0,46cm l Pré-Coluna jKingsorb C18 5pm 3cm x 0,46cm \ Fase Móvel \Acetonitrilo: Metanol: 0,25% p/p ácido !(16:7:6 em volume) acético! Temperatura da Coluna 125°C ! Taxa de Fluxo ! 1,0 mL min”1 Deteção |220nm 600mA f.s.d. Segundo comprimento j310nm de onda j Volume de injeção jlOpL Tempo de ciclo !20-25 minutos (pode ser prolongado para |contendo pequenas quantidades de picos de itardia) amostras! eluição\ Ordem se Eluição | CBD, CBDA, Δ9 THCV, CBN, Δ9 THC, CBC, Δ9 THCA \

Preparação Padrão:

Soluções padrão de armazenamento de CBD, CBN e Δ9 THC em metanol a aproximadamente lmg inL-1 são armazenadas a -20°C.

Padrões de funcionamento diluídos (0,1 mg/mL para Δ9 THC e CBD e 0,01 mg/mL para CBN) são preparados em metanol a partir dos padrões em armazenamento e são armazenados a -20 °C (período máximo de doze meses após a preparação inicial). Após a preparação, as soluções padrão devem ser submetidas a alíquota em frascos para reduzir a quantidade de padrão exposto à temperatura ambiente. Antes da numero utilização em ensaio de amostra de HPLC, o 48 necessário de frascos padrao é removido e deixado a obter equilíbrio até à temperatura ambiente.

Preparação da amostra:

Em todas as preparações, os pesos e volumes alternativos podem ser usados para dar as mesmas diluições finais.

Matéria-Prima Botânica • Pesar com precisão cerca de 100 mg de material seco picado e homogéneo para um frasco volumétrico de 10 mL. • Dispersar o material em metanol: clorofórmio (9:1 v/v) e completar o volume no mesmo solvente. • Extrair a amostra num banho de ultrassons durante 15 minutos. • Centrifugar uma alíquota a 3000 rpm durante cerca de 2 minutos. • Diluir 100 uL do sobrenadante a 1 mL com metanol num frasco de amostra adequado de HPLC. (Diluição adicional pode ser necessária, se a concentração de canabinóides principal estiver fora do intervalo de trabalho linear).

Matéria-Prima Botânica Descarboxilada:

No que toca à Matéria-Prima Botânica.

Substância medicinal Botânica: • Pesar com precisão cerca de 80mg de BDS num frasco volumétrico de 50 mL. • Dissolver a BDS e completar o volume com metanol. • Diluir 100 uL do sobrenadante preparado a 1 mL com metanol num frasco de amostrador automático adequado de HPLC. 49

Procedimento de Cromatografia:

As amostras são colocadas na prateleira do amostrador automático em ordem de entrada na lista de sequências no equipamento Agilent ChemStation. As soluções padrão são utilizadas para fornecer os dados de tempo de retenção e quantitativo. Estes podem ser tipicamente injetados em duplicado ou triplicado, antes da injeção de quaisquer soluções de amostra e, em seguida, individualmente a intervalos adequados durante o funcionamento, com um máximo de 10 amostras de ensaio entre padrões.

Critérios de Aceitação Cromatográfica:

Tabela 10 - Janelas de tempo de retenção e Tempo de

Retenção Relativo (RRT) para A9THC para cada analito:

Canabinóide j Tempo de Retenção (Minutos) RRT (THC) j | CBD | 3,1-5,8 0,58 \ ] CBN ! 7,4-8,3 0,83 j ] Δ9 THC ! 9,0-10,0 1,00 j CBDA ! 5,5-6,2 0,615 j Δ9 THCV | 5,9-6,6 0,645 | I CBC 11,6-12,8 1,30 | Δ9 THCA | 14,6-16,0 1,605 j Tabela 11 - Forma de Pico (Fator de Simetria de o método da Farmacopeia Britânica): Acordo com Canabinóide Fator de Simetria CBD <1,30 CBN <1,25 | Δ9 THC <1,35 50 Cálculo:

Matéria-Prima Botânica: A seguinte equação é usada para obter um resultado para a pureza do canabinóide principal como uma % dos canabinóides ensaiáveis atuais (CBD, CBDA, CBN, Δ9 THC & Δ9 THCA) no lote:

Para material de elevado Δ9 THC:

%THC= _.Soasa de área de pico ds THC & 'ISCA_ :x ISO

Soma de ár«a d« pico de canabinóides ensaiáveis

Para material com elevado CBD, CBD & CBDA substituem THC & THCA na linha superior da equação.

Matéria-Prima Botânica Descarboxilada: A equação que se segue é usada para calcular a eficiência do processo de descarboxilação:

Para material de elevado Δ9 THC: % Eficiência de descarboxilação = _área de pico de THC_ x 100

Sons área de pico de THC & THCA

Para material com elevado CBD, CBD & CBDA substituem THC & THCA na equação.

Substância Medicinal Botânica:

As equações que se seguem são usadas para calcular a concentração da amostra de substância medicinal, a concentração de a mostra individual de canabinóide, o teor em % dos canabinóides ensaiáveis na substância medicinal, a quantidade de canabinóides principais como % dos canabinóides ensaiáveis atuais e a quantidade de 51 canabinóides principais no peso total da substância medicinal extraída.

Para material de elevado Δ9 THC:

Cojsceritração ds assstrs de ssiostâncis = Peso da amostra

Faetar de diluição

Em que o fator de diluição = 50 x 10 = 500

Cor:cer:tração THC amostra = coisc THC padrão área de amostra THC média Àrsa padrão THC média %p/p teor THC de ssibst. saediciaal = cooceotraoão da amostra THC x 100

Cone. da ãSvO stra da sbbst., medicinal CBD e CBN podem ser substituídos em todas estas equações, em vez de Δ9 THC, para se obterem resultados quantitativos para ambos. Δ9 THCA e CBDA são também calculados usando as concentrações padrão para Δ9 THC ou CBD, na ausência de padrões de referência específicos dos mesmos.

As Substâncias Relacionadas são definidas como a soma dos valores médios %p/p para CBN, Δ9 THCA e CBDA.

THC GOIB.G ΐ do ta tal = _lp/p teor de THC_ κ SOO

Caisabisóides easaiàveis soma %p/p dí todos os sasãbiiróides ensaiáveis A quantia total de Δ THC presente em todo o extrato da substância medicinal é obtida. 52

Exemplo 2 - Investigação da estabilização da substância medicinal botânica (BDS) pela purificação parcial usando carvão ativado

Os resultados dos estudos de estabilidade de formulações de THC indicam que o THC sob a forma de BDS é instável, mesmo a temperaturas de armazenamento tão baixas como 5 °C. Isto contrasta com o comportamento de THC purificado (Dronabinol USP) em cápsulas gelatinosas moles de Marinol, para as quais uma vida útil de 2 anos à temperatura ambiente fresca é aceite. Deve também notar-se que a vida útil de soluções padrão de THC em metanol, fornecidas pela Sigma-Aldrich é reivindicada para ser de 4 anos quando armazenada em ambiente refrigerado e protegido da luz.

Essa aparente discrepância entre a estabilidade da BDS (THC) e o THC purificado levou a especulações de que algum componente da BDS era desestabilizador do canabinóide principal.

Uma solução para este problema seria a de purificar a BDS (THC) , para se obter um canabinóide de alta pureza, de preferência cristalino. No entanto, os custos de transformação adicionais incorridos em transformar a BDS em canabinóide puro iria aumentar substancialmente o custo de produtos farmacêuticos acabados incorporando os canabinóides.

Por conseguinte, a requerente procurou desenvolver um simples passo de purificação o qual produziria BDS com estabilidade melhorada, mas que não aumenta os custos de processamento de forma proibitiva. 53 A requerente determinou que um passo de limpeza por carvão pode ser convenientemente levado a cabo em estreita ligação com o processo de "fregelização" fazendo passar a solução etanólica fregelizada através de um leito de filtro para remover as ceras precipitadas e, em seguida, diretamente através de uma coluna de carvão num único passo e em que a utilização de carvão ativado aumenta significativamente a vida útil.

Detalhe Experimental

As soluções tanto de BDS (THC) como de BDS (CBD) , a uma concentração de 100 mg/mL em etanol absoluto BP foram passadas através de uma coluna cheia com carvão ativado e o eluato foi recolhido. Estes foram, em seguida, diluídos com mais etanol absoluto a fim de atingir uma concentração de ca. 25 mg/mL de canabinóides. A solução foi então transferida para um frasco do tipo 10 mL AXl (isto é, vidro âmbar) e cápsula selada. Estas amostras foram designadas de BDS purificada por carvão.

As amostras das soluções de BDS (THC) e de BDS (CBD) que não tinha sido passadas através da coluna de carvão foram similarmente diluídas para dar uma concentração de canabinóides 25 mg/mL e foram, em seguida, seladas num frasco de vidro âmbar do mesmo tipo. Estas amostras foram designadas de "BDS padrão" e serviram como um controlo para o estudo de estabilidade.

Os frascos contendo BDS padrão e BDS purificada com carvão de cada tipo foram armazenados num incubador de estabilidade a 40 °C e, em seguida, as amostras foram retiradas periodicamente durante o período de 1-12 meses 54 para a análise por HPLC do teor de canabinóides e de perfis de TLC.

A análise de TLC de fase normal empregou as seguintes condições: Fase Estacionária: Silica Gel G

Fase Móvel: 80:20 hexano/acetona Desenvolvimento: Visualização: 2 x 8 cm i.e. desenvolvimento duplo Emersão em 0,1% p/v em Fast Blue B (aq) A análise de TLC de fase inversa empregou as seguintes condições: Fase Estacionária: Silica Gel Revestido C18

Fase Móvel: j 6:7:16 0,25% v/v ácido acético (aq)/metanol/acetonitrilo j Desenvolvimento: | 2 x 8 cm i.e. desenvolvimento duplo

Visualização: j Emersão em 0,1% p/v em Fast Blue B (aq)

Para cada amostra, um volume de solução contendo aproximadamente 5 pg de canabinóide total foi aplicado na placa de TLC.

Resultados e Discussões:

As soluções etanólicas de BDS padrão (THC) e BDS padrão (CBD) são de um amarelo bastante intenso. A passagem das soluções de BDS através do carvão ativado descolorou de forma eficaz as soluções, presumivelmente pela adsorção de pigmentos de plantas co-extraídos com os canabinóides durante a preparação de BDS a partir da erva canábis por extração de C02 liquido.

Os resultados da análise de HPLC para as diferentes soluções de BDS são tabulados abaixo, na Tabela 12, e são 55 também apresentados na forma de gráfico (Figuras 1-3) . Todos os dados são apresentados como % do ensaio tO. Os valores de CBN são incluídos para as soluções de BDS (THC) visto que este composto foi identificado como um marcador da degradação térmica de THC em estudos de estabilidade anteriores.

Tabela 12: Valores de Ensaio de Canabinóides para Soluções de BDS Padrão e Purificada durante o Período de 1-12 Meses a 40 °C L...------... |l 4 6 12 ÍTHC 97,3% 92,4% 85,3% 74,0% ÍCBN 104% 119% 133% 154% ÍTHC 102,9% 107,4% 96,0% 88,6% ÍCBN | 94% 111% 111% 120% ÍCBD {100,3% 103,6% 93,3% 91,0% CBD |101,0% 100,7% 97,2% 96,9% 1

Meses BDS padrão (THC) BDS purificada (THC) BDS padrão (CBD) BDS purificada (CBD) A partir dos dados revelados em cima, torna-se bastante claro que, tanto para BDS (THC), como para BDS (CBD) existe um componente do lastro, que pode ser removido pelo carvão, o que é destabilizador dos canabinóides. A comparação dos níveis de degradação atingidos após 12 meses a 40 °C para a BDS padrão e para a BDS purificada por carvão correspondente, indica que tanto para os extratos de THC como de CBD, a purificação por carvão aumenta a resistência à degradação térmica em mais de 50%.

Para a BDS (THC), o nível de CBN é observado a aumentar em função da perda do canabinóide principal (Fig. 3). Tal como 56 observado para outras formulações contendo THC, o nível de CBN é novamente confirmado como sendo um marcador da degradação térmica. A comparação entre as regiões de canabinóides de cromatogramas HPLC de amostras de BDS padrão (CBD) e BDS purificada (CBD) ao fim de 12 meses a 40 °C (dados não mostrados) não revelou qualquer informação significativa. Contudo, uma comparação semelhante dos cromatogramas de HPLC da BDS padrão e purificada (THC) após a degradação foi informativa. A CBN estava presente a um nível superior na BDS padrão não purificada mais altamente degradada, mas um segundo produto de degradação significativo foi também observada, que está novamente presente em ambas as amostras, mas que é mais abundante na amostra mais degradada. O espetro deste produto de degradação foi novamente essencialmente idêntico ao da CBN e com base neste e no tempo de retenção parece ser um dos análogos de CBN.

Conclusão É conseguido um melhoramento significativo na resistência à degradação térmica com um simples tratamento com carvão.

Exemplo 3- Efeito da adição de modificador orgânico na extração de C02 do material vegetal de canábis O seguinte exemplo descreve uma investigação sobre o efeito da adição de um co-solvente polar sobre as características de um extrato produzido a partir de material vegetal de canábis (chemovar G5), utilizando a extração de CO2 57 líquido, e ilustra a diferença de seletividade obtida utilizando a extração de CO2 subcrítica vs supercrítica.

Detalhe Experimental.

Experiências de extração foram conduzidas usando um aparelho com 1 litro de capacidade de extração de CO2. C02 de grau alimentar e etanol absoluto de grau BP foram utilizados como solventes.

Um lote de canábis G5 (um chemovar de elevada CBD) foi utilizado. 0 teor de CBD foi de 7,3% p/p após a descarboxilação. A análise do conteúdo de canabinóide dos extratos foi efetuada por HPLC.

Resultados e Discussões:

Os dados relacionados com a composição do extrato final obtido após um tempo de extração de 4 horas, sob as condições específicas, são apresentados na Tabela 13:

Tabela 13: Dados da Composição e Rendimento para Extratos Produzidos sob Diferentes Condições de Extração. AMOSTRA CONDIÇÕES DE % P/P DO % DE CBD 0 O EXTRAÇÃO EXTRATO (p/p) RECUPERAÇÃO CBD AC47 0 10 °C/60 BAR 8,4% !63,6% 72, 9% AC471 40 °C/100 BAR 10,7% 154,4% 79, 5% AC472 40 °C/100 BAR + 10,3% 164,6% 91,0%

12% DE ETANOL 58 A eficiência de recuperação é baseada na CBD disponível em material vegetal descarboxilado carregado no vaso, para cada extração.

Os resultados mostram que a alteração das condições de extração de subcríticas para supercríticas aumenta o poder de solvatação do C02 e resultam numa maior recuperação da CBD disponível. No entanto, o C02 supercrítico pode agora solubilizar uma vasta gama de compostos, bem como a extração destes composto adicionais tem o efeito de diluir a concentração de CBD no extrato, a tal ponto que é agora menor que o obtido para a extração subcrítica. Consequentemente, a recuperação marginal adicional de CBd disponível a partir da matéria-prima não ultrapassaria este inconveniente e demonstra que o uso de condições supercríticas não é desejável. A adição de 2% p/p de etanol absoluto ao C02 supercrítico como um modificador aumenta a recuperação da CBD disponível para > 90%. Presumivelmente, o canabinóide relativamente polar é mais solúvel no extrato de polaridade aumentada. É interessante notar que a concentração de CBD no extrato é aumentada ligeiramente por adição de um modificador polar. Isto parece indicar que o material co-extraível não-canabinóide presente no material vegetal é menos polar do que o canabinóide alvo e, portanto, a extração deste material (o "lastro") não é selecionada quando a polaridade é aumentada. Assim, a extração de material vegetal de canábis com C02 supercrítico + 2% p/p de etanol proporciona um aumento na recuperação do alvo ativo com nenhuma penalidade de perda de seletividade. 59

Em resumo: 1. 1. Uma comutação de condições subcríticas para supercríticas produz pouca vantagem em termos da recuperação global de canabinóides a partir da matéria-prima, mas tem como resultado a desvantagem de reduzir o teor ativo do extrato. 2.2. A adição do modificador de 2% de etanol absoluto ao C02 supercritico resulta numa melhoria significativa na recuperação dos canabinóides a partir da matéria-prima, sem penalização de diluição do conteúdo ativo pelo material co-extraído.

Lisboa,

Claims (44)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de extração de canabinóides a partir de material vegetal de cannabis compreendendo um passo de descarboxilação, uma extração com dióxido de carbono líquido (CO2) , e um passo para reduzir a proporção de materiais não-alvo no extrato, caracterizado por a extracção com CO2 líquido ser conduzida sob condições sub-críticas, a uma temperatura na gama de 5 até 15 °C e a uma pressão na gama de 50 a 70 bar.

2. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que o passo de descarboxilação é realizado após a extração com CO2 líquido.

3. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que o passo de descarboxilação é realizado antes da extração com C02 líquido.

4. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a temperatura se encontra na gama de 8 a 12 °C.

5. Um método de acordo com a reivindicação 4, em que a temperatura é essencialmente 10 °C.

6. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pressão se encontra na gama de 55 a 65 bar.

7. Um método de acordo com a reivindicação 6, em que a pressão é essencialmente 60 bar. 2

8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o CO2 tem um fluxo de massa na gama de 1000-1500 Kg/h.

9. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que o CO2 tem um fluxo de massa de essencialmente 1250 Kg/h.

10. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a extração é realizada até 10 horas.

11. Um método de acordo com a reivindicação 10, em que a extração é realizada durante cerca de 8 horas.

12. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o C02 é removido por despressurização e o extrato recuperado é mantido a uma temperatura na gama de -15 °C a -20 °C.

13. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo de redução da proporção de materiais não-alvo no extrato, é uma precipitação com um álcool C1-C5, em que o material a ser tratado é aquecido acima da temperatura ambiente antes da adição do álcool C1-C5.

14. Um método de acordo com a reivindicação 13, em que o álcool C1-C5 é etanol.

15. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 14, em que o extrato é aquecido para uma temperatura na gama de 36 °C a 44 °C. 3

16. Um método de acordo com a reivindicação 15, em que o extrato é aquecido até cerca de 40 °C.

17. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, em que o álcool C1-C5 é adicionado a uma quantidade de 3:1 a 1:1 de álcool C1-C5, em concentração ponderai do material a ser tratado.

18. Um método de acordo com a reivindicação 17, em que o álcool C1-C5 é adicionado a uma quantidade de cerca de 2:1 de álcool C1-C5, em concentração ponderai do material a ser tratado.

19. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-18, em que a solução resultante da adição do álcool C1-C5 no material a ser tratado é refrigerada e os materiais não solúveis são deixados a precipitar.

20. Um método de acordo com a reivindicação 19, em que a solução resultante da adição do álcool C1-C5 no material a ser tratado é refrigerada para uma temperatura na gama de -15 °C a -25 °C.

21. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, em que a solução resultante da adição do álcool C1-C5 no material a ser tratado é refrigerada até 52 horas.

22. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, em que o precipitado de materiais não solúveis é removido por filtração. 4

23. Um método de acordo com a reivindicação 22, em que a filtração é feita através de uma membrana de 20pm.

24. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-23, compreendendo ainda uma evaporação de múltiplos passos sob pressão reduzida.

25. Um método de acordo com a reivindicação 24, em que primeiramente o álcool C1-C5 é removido e então a água é removida.

26. Um método de acordo com a reivindicação 25, em que o álcool C1-C5 é removido por aquecimento a uma temperatura na gama de 58-62 °C para dar uma temperatura de vapor na gama de 38-42 °C sob um vácuo na gama de 168-172 mbar, até que não exista quase, ou nenhum, condensado visível.

27. Um método de acordo com a reivindicação 25, ou 26, em que ér adicionalmente removida água numa redução de vácuo passo-a-passo, em estágios de cerca de 50 mbar.

28. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 27, em que o passo de descarboxilação é realizado antes da extração com COy2 líquido e é realizado pelo aquecimento do material vegetal a temperaturas e períodos de tempo que garantam pelo menos 95% de conversão dos canabinóides ácidos na sua forma neutra, ao mesmo tempo garantindo a degradação térmica de THC para CBN em menos de 10%. 5

29. Um método de acordo com a reivindicações 28, no qual um processo de aquecimento de vários passos é conduzido, no qual o material vegetal é: i) aquecido para um primeira temperatura, durante um primeiro período de tempo, para evaporar a água retida e permitir um aquecimento uniforme do material vegetal; e ii) a temperatura é aumentada para uma segunda temperatura, durante um segundo período de tempo, até que tenha ocorrido pelo menos 95% da conversão dos canabinóides ácidos na sua forma neutra.

30. Um método de acordo com a reivindicação 29, em que o primeiro passo é conduzido a uma temperatura na gama de 100 °C a 110 °C durante 10-20 min.

31. Um método de acordo com a reivindicação 30, em que a primeira temperatura é de cerca de 105 °C e o primeiro período de tempo é de cerca de 15 minutos.

32. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-31, em que o material vegetal tem um elevado teor de CBD, a segunda temperatura está na gama de 115 °C a 125 °C, de preferência de 120 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 45 minutos a 75 minutos, de preferência cerca de 60 minutos.

33. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-31, em que o material vegetal tem um elevado teor de CBD, a segunda temperatura está na gama de 135 °C a 145 °C, de preferência de 140 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 15 minutos a 45 minutos, de preferência cerca de 30 minutos. 6

34. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-31, em que o material vegetal tem um elevado teor de CBD, a segunda temperatura está na gama de 140 °C a 150 °C, de preferência de 145 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 55-90 minutos.

35. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-31, em que o material vegetal tem um elevado teor de THC, a segunda temperatura está na gama de 115 °C a 125 °C, de preferência de 120 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 45 minutos a 75 minutos, de preferência cerca de 60 minutos.

36. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, em que o material vegetal tem um elevado teor de THC, a segunda temperatura está na gama de 10 0 °C a 110 °C, de preferência de 105 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 60 a 120 minutos.

37. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, em que o material vegetal tem um elevado teor de THC, a segunda temperatura está na gama de 14 0 °C a 150 °C, de preferência de 145 °C, e o segundo período de tempo está na gama de 45 a 55 minutos.

38. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-37, em que o passo de descarboxilação é realizado a temperaturas e períodos de tempo que garantam pelo menos 97% de conversão dos canabinóides ácidos na sua forma neutra, ao mesmo tempo garantindo a degradação térmica de THC para CBN em menos de 5%. 7

39. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o material veqetal é triturado, moído, ou processado de outro modo, para uma dimensão inferior a 2 mm.

40. Um método de acordo com a reivindicação 39, em que a granulometria é superior a 1 mm.

41. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-40 compreendendo ainda o passo de tratamento de um extrato derivado de material vegetal com carvão ativado.

42. Um método de acordo com a reivindicação 41, em que o extrato derivado do material vegetal é dissolvido numa solução alcoólica.

43. Um método de acordo com a reivindicação 42, em que a solução alcoólica é uma solução etanólica.

44. Um método de acordo com a reivindicação 43, em que o tratamento com carvão ativado segue um passo de precipitação etanólica. Lisboa