PT1549329E

PT1549329E - Extracto que apresenta uma actividade anticancerosa e uma actividade antitóxica

Info

Publication number: PT1549329E
Application number: PT03757940T
Authority: PT
Inventors: Jean-Claude Braekman; Pierre Guissou; Janique Dewelle; Francis Darro; Robert Kiss; Odile Germaine Nacoulma; Mohamed El Yazidi; Rob Van Ginkel; Marc Van Damme
Original assignee: Unibioscreen Sa; Univ Bruxelles
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2007-03-30
Also published as: ZA200502790B; CA2501240A1; CN100522184C; JP2006503872A; AU2003273973A1; DE60310742T2; DE60310742D1; ES2279157T3; JP4944380B2; US20060057237A1; DK1549329T3; WO2004032947A1; WO2004032948A1; EP1549329A1; MXPA05003634A; ATE349221T1; EP1549329B1; AU2002342808A1; HK1082663A1; CN1711099A

Description

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DESCRIÇÃO

"EXTRACTO QUE APRESENTA UMA ACTIVIDADE ANTICANCEROSA E UMA ACTIVIDADE ANTITÓXICA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao campo médico. A invenção refere-se em um primeiro aspecto a extractos da planta Calotropis procera, com uma actividade farmacológica, em particular uma actividade anti-tumor e/ou actividade antitóxica e aos compostos activos isolados a partir dos mesmos. Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos para a obtenção dos referidos extractos. A invenção r efere-se ainda em um terceiro aspecto a uma composição farmacêutica para o tratamento do cancro que compreende uma quantidade eficaz dos referidos extractos ou de um seu composto activo. Em um quarto aspecto, a presente invenção diz respeito à utilização dos referidos extractos ou de um seu composto activo como um medicamento e à utilização dos referidos extractos ou de um seu composto activo para a preparação de um medicamento para o tratamento do cancro.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro desenvolve-se em um dado tecido quando alguma mutação genómica perturba a cinética do ciclo celular pelo aumento da proliferação das células ou o decréscimo da morte das células, ou ambos. Essa perturbação conduz ao crescimento desenfreado de uma população de células transformadas genomícamente. Algumas células a partir dessa população transformada de células podem mudar para o fenótipo angiogénico, permitindo-lhes que recrutem células endoteliais do tecido saudável e conduzindo ao crescimento contínuo do 2 tecido tumoral neoplásíco em desenvolvimento. Subsequentemente, algumas células migram para o tecido tumoral neoplásíco e colonizam novos tecidos, utilizando os vasos sanguíneos ou linfáticos como vias principais de migração. Esse processo é também conhecido como processo metastático.

Na prática, a maior parte dos agentes utilizados hoje em dia em hospitais para tratar doentes com cancro são fármacos, que incidem mais ou menos directamente sobre a cinética das células, isto é, a proliferação das células, do cancro a ser combatido. 0 mecanismo de trabalho de tais fármacos anti-cancro refere-se essencialmente à interrupção do desenvolvimento de células malignas mediante actuação sobre a cinética das células. Estes fármacos incluem agentes de alquilação, agentes cfe intercalação, antimetabolitos, etc., a maioria dos quais tem como alvo o ADN ou enzimas que regulam o processo de duplicação e de alongamento do ADN. Estes fármacos atacam o ADN. 0 inconveniente principal desses fármacos reside no facto de os mesmos não actuarem de uma maneira selectiva, isto é, eles não escolhem entre as células normais e as neoplásicas. Eles são usados de acordo com o facto de o ADN de células que proliferam rapidamente, isto é, células de cancro, ser mais sensível a esse tipo de agente do que o ADN de células que proliferam menos rapidamente, isto é, células normais. No entanto, os tumores que crescem rapidamente nem sempre são tumores que exibem níveis elevados de proliferação celular. Os tumores com crescimento rápido podem também incluir tumores que exibem níveis baixos de morte celular em comparação com a população de células normais a partir da qual esses tumores resultam. Para esses tipos de tumores com crescimento rápido, os fármacos mencionados não são eficazes.

Além disso, a grande maioria dos fármacos utilizados no tratamento convencional do cancro que utilizam a abordagem, à cinética das células têm o inconveniente de serem tóxicos ou mesmo altamente tóxicos, isto é que envolvem muitos efeitos prejudiciais para os tecidos, as células e os órgãos saudáveis, e isso limita a sua utilização clínica a um número relativamfente reduzido de administrações por doente. Além disso, têm de se associar vários desses compostos em uma administração poliquimioterapêutica a fim de se obter qualquer efeito observável contra o cancro. Como é evidente tais associações de fármacos anti-cancro aumentam prejudicialmente a toxicidade do tratamento e também limitam o número de administrações que se podem administrar.

Alguns fármacos anti-cancro naturais, tais como, por exemplo, compostos anti-tubulína, que utilizam uma abordagem terapêutica diferente da abordagem à cinética das células, foram propostos. Os referidos fármacos procuram prevenir a migração das células de cancro que escapam da massa tumoral e invadem primeiramente o tecido vizinho estabelecendo por consequência metástases. No entanto, os compostos desse tipo conhecidos até à data apresentam grandes efeitos secundários tóxicos, o que limita a sua utilização durante períodos longos de tratamento.

Consequentemente, permanece na técnica uma necessidade urgente relativamente à procura de melhores fármacos anti-cancro, que ultrapassem pelo menos alguns dos inconvenientes citados anteriormente. Por consequência, constitui um objectivo geral da presente invenção proporcionar fármacos 4 anti-cancro aperfeiçoados. Em particular, a presente invenção procura proporcionar um fármaco anti-cancro aperfeiçoado, que apresente efeitos secundários mínimos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma forma de realização da presente invenção é um extracto da planta Calotropis procera, caracterizado pelo facto de o extracto apresentar actividade farmacológica, em particular actividade anti-tóxica. Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz por consequência respeito à utilização de uma composição que compreende um extracto de Calotropis procera de acordo com a reivindicação 1..

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um processo de extracção para obtenção de um extracto que possui componentes biologicamente activos de acordo com a reivindicação 12.. Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um extracto activo de acordo com a reivindicação 13..

Uma forma de realização da presente invenção diz respeito a um extracto tal como descrito anteriormente obtido mediante a utilização de um processo de extracção, o qual compreende as fases que consistem em: a) extracção do material inicial da referida planta Calotropis procera, sendo o referido material inicial escolhido de entre frutos, partes aéreas, partes subterrâneas, e suas misturas, no seio de um álcool alifático, mediante a dissolução do material inicial no referido álcool obtendo-se desse modo uma suspensão do citado material no citado álcool, agitação da referida suspensão e 5 filtração da referida suspensão através de vidro sinterizado, obtendo-se desse modo um primeiro filtrado e uma primeira parte sólida; b) extracção da referida primeira parte sólida no seio de um álcool alifático obtendo-se desse modo um segundo filtrado e uma segunda parte sólida; c) associação dos referidos, primeiro e segundo, filtrados obtendo-se deste modo um filtrado em associação, e evaporação do referido filtrado em associação sob vazio para se obter desse modo o referido extracto.

Uma outra forma de realização da presente invenção é um extracto tal como descrito anteriormente obtido mediante a utilização de um processo de extracção que compreende as fases que consistem em: a) moagem do material inicial de folhas, hastes, cascas e raízes de Calotropis procera, para se obter um pó fino da planta, b) extracção do pó resultante da fase a) com diclorometano durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, c) decantação do diclorometano resultante da fase b) , e evaporação do filtrado, após filtração, para se obter uma goma.

Uma outra forma de realização da presente invenção é um extracto tal como se descreveu anteriormente obtido medi.ante utilização de um processo de extracção que compreende as fases que consistem em: 6 a) moagem do material inicial de folhas, hastes, cascas e raízes de Calotropis procera para se obter um pó fino da planta, b) extracção do pó resultante da fase a) com diciorometano durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, c) decantação do diciorometano resultante da fase b) e evaporação do filtrado, após filtração, para se obter uma goma, d) extracção do resíduo resultante da fase c) com metanol durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, e) decantação do metanol da fase d) , evaporação do filtrado, após filtração, para se obter um goma, f) submissão da goma resultante da fase e) a cromatografia em coluna utilizando gel de sílica para cromatografia rápida e diclorometano-metanol como solvente, e g) isolamento de uma primeira fracção e evaporação da referida fracção para se obter uma goma que comporta componentes biologicamente activos.

Uma outra forma de realização da presente invenção é um extracto conforme descrito anteriormente obtido mediante utilização de um processo de extracção que compreende as fases que consistem em: a) moagem do material inicial de folhas, hastes, cascas e raízes de Calotropis procera para se obter um pó fino da planta, b) extracção do pó resultante da fase a) com diciorometano durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, 7 c) decantação do diclorometano resultante da fase b) e evaporação do filtrado, após filtração, para se obter uma goma, d) extracção do resíduo resultante da fase c) com metanol durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, e) decantação do metanol da fase d) , evaporação do filtrado, após filtração, para se obter um goma, f) submissão da goma resultante da fase e) a cromatografia em coluna utilizando gel de sílica flash e diclorometano-metanol como solvente, g) isolamento de uma primeira fracçâo, que comporta componentes biologicamente activos, h) aplicação da fracção concentração da fase g) em cromatografia de coluna utilizando gel de sílica flash e hexano-acetona como solvente para se obter duas fracções, e i) lavagem da coluna após a fase h) com metanol para se obter uma terceira fracção, a qual comporta componentes biologicamente activos.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição que compreende: - um extracto de Calotropis prócera tal como descrito anteriormente, e - pelo menos um composto terapêutico e/ou um tratamento físico que exerce efeitos secundários prejudiciais relevantes sobre células, tecidos ou órgãos normais, não cancerosos afins.

Uma outra forma de realização da presente invenção é um produto que contém - um extracto de Calotropis procera tal como descrito anteriormente, e - pelo menos um composto terapêutico e/ou um tratamento físico que exerce efeitos secundários prejudiciais relevantes sobre células, tecidos ou órgãos normais, não cancerosos afins sob a forma de uma preparação em associação para a administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente ou um produto tal como descrito anteriormente em que um dos referidos extractos compreende pelo menos dois compostos activos escolhidos de entre o grupo que compreende asclepina, calactina, vorushrarina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, usharina, -usharidina e 2' oxo-vorusharina.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produto tal como descrito anteriormente, em que um dos referidos extractos compreende pelo menos um dos compostos que se encontra representado no Quadro 1.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente ou um produto tal como descrito anteriormente em que a proporção em peso de extracto: composto terapêutico se encontra compreendido entre 0,001 : 1 e 1000 : 1.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produzo tal como descrito anteriormente, para utilização como medicamento. 9

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produto tal como descrito anteriormente, para utilização como medicamento para o tratamento do cancro.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição ou um produto tal como descritos anteriormente, em que o referido cancro é escolhido do grupo que consiste em cancro da mama, linfoma, sarcoma, cancro pancreático, melanoma, cancro colorrectal, glioma, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro da pele, cancro ósseo, cancro dos ovários, cancro do sistema nervoso central, cancro renal, cancro da bexiga, cancro da cabeça e do pescoço, cancro da próstata, cancro do fígado e cancros hematológicos.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente ou um produto tal como descrito antes que compreende ainda um ou mais compostos terapêuticos adicionais.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produto tal como descrito anteriormente, em que o(s) composto(s) terapêutico(s) é(são) um agente anticanceroso.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produto tal como descrito anteriormente, em que o referido composto terapêutico é escolhido de entre o grupo que compreende adriamicina, alkeran, ara-c, bleomicina, BICNU (carmustina), bussulfam, CCNU (lomustine), camptotecina, carboplatína, cisplatína, ciclofosfamida, citoxano, daunorubicina, DTIC 10 (dacarbazina), 5-FU (fluorouracilo), fludarabina, gemcitabina (gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hydrea, idarubicina, ifosfamida, irinotecan (camptosar, CPT-11), leustatin, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforano, navelbine, azoto de mostarda, oxaliplatina, rituxano, STI-571 (imatinib), estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano (hicamtina), velbano, vincristina, VP-16 (etoposido), xeloda (capecitabina) ou zevelina.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produto tal como descrito anteriormente, em que o referido composto terapêutico é escolhido de entre o grupo que compreende adriamicina, vincrisina, camptotecina e oxaliplatina.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produto tal como descrito anteriormente, em que o(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s) é(são) um anticorpo citotóxico ou um seu fragmento.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tal como descrita anteriormente, ou um produto tal como descrito anteriormente, em que o(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s) é(são) um péptido citotóxico ou um seu fragmento.

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma composição tai como descrita anteriormente que compreende ainda um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou um produto tal como descrito anteriormente em que a composição e/ou os composto(s) terapêutico(s) compreende(m) ainda um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 11

Orna outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto de Calotropis procera tal como descrito anteriormente para a preparação de um medicamento para o alívio dos efeitos secundários de um ou mais compostos terapêuticos.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto de Calotropis procera tal como descrito anteriormente para a preparação de um medicamento para aumentar a dose administrada a um indivíduo de um ou mais compostos terapêuticos.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s) possuem actividade anti-cancro.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o(s) referido(s) composto (s) terapêutico(s) é(são) escolhidos de entre o grupo que compreende adriamicina, alkeran, ara-c, bleomicina, BICNU, bussulfam, CCNU, carboplatina, cisplatina, ciclofosfamida, citoxano, daunorubicina, DTIC, 5-FU, fludarabina, gemcitabina (gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hydrea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan (camptosar, CPT-11), leustatin, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforano, navelbine, azoto de mostarda, oxaliplatina, rituxano, STI-571, estreptozocina, taxai, taxotere, topotecano (hicamtina), velbano, vincristina, VP--16, xeloda (capecitabina) ou zevelina. 12

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o (s) referido(s) composto(s) terapêutico(s) é(são) escolhido(s) de entre o grupo que compreende adriamicina, vincristina, camptotecina e oxaliplatina.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o (s) referido(s) composto(s) terapêutico (s) é(são) um anticorpo citotóxico ou um seu fragmento.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o(s) referido(s) composto(s) terapêutico (s) é(são) uma hormona citotóxica ou um seu fragmento.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s) é(são) um péptido citotóxico ou um seu fragmento.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o referido extracto compreende pelo menos dois compostos actívos escolhidos de entre o grupo que compreende asclepina, calactina, vorusgarina, calotropina, calopagenina, uzarigenina, calotoxina, usharína e usharidina. 13

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o referido extracto contém ainda pelo menos um dos compostos que se encontram representados no Quadro 1.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o referido extracto é administrado antes do(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s).

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o referido extracto é administrado após o(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s).

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que o referido extracto é administrado ao mesmo tempo que o(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s).

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto tal como descrito anteriormente em que a proporção em peso de extracto:composto terapêutico se encontra compreendida entre 0,001:1 e 1000:1.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo de extracção para a obtenção de um extracto com componentes biologicamente activos que compreende as fases que consistem em: a) extracção do material inicial da referida planta de Calotrcpis procera, sendo o referido material inicial 14 escolhido de entre frutos, partes aéreas, partes subterrâneas e as suas misturas, no seio de um álcool alifático, mediante dissolução do material inicial no referido álcool para se obter deste modo uma suspensão do referido material no referido álcool, agitação da referida suspensão; e filtração da referida suspensão através de vidro sinterizado obtendo-se deste modo o primeiro filtrado e uma primeira parte sólida; b) extracção da referida primeira parte sólida num álcool alifático obtendo-se deste modo um segundo filtrado e uma segunda parte sólida; c) associação do referido primeiro e do referido segundo filtrados para se obter desse modo um filtrado em associação; e d) evaporação do referido filtrado em associação sob vazio para se obter desse modo o referido extracto.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo de extracção para a obtenção de diversos extractos que incluem componentes biologicamente activos presentes substancialmente nas folhas, hastes, cascas e raízes de Calotropis procera, que compreende as fases seguintes que consistem em; a) moagem do material inicial constituído por folhas, hastes, cascas e raízes de Calotropis procera para se obter um pó fino da planta, b) extracção do pó resultante da fase a) com diclorometano durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, e c) decantação do diclorometano resultante da fase b) e evaporação do filtrado, após filtração, para se obter uma goma. 15

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo de extracção tal como descrito anteriormente que compreende ainda as fases que consistem em: d) extracção do resíduo resultante da fase c) com metanol durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, e) decantação do metanol da fase d), evaporação do filtrado, após filtração, para se obter um goma, f) submissão da goma resultante da fase e) em cromatografia de coluna utilizando gel de sílica flash e diclorometano-metanol como solvente, e g) isolamento de uma primeira fracção, que comporta componentes biologicamente actlvos e evaporação do eluente para se obter o referido extracto.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito ao processo de extracção tal como descrito anteriormente, que compreende ainda as fases que consiste em h) aplicação da fracção concentração da fase g) em cromatografia de coluna utilizando gel de sílica flash e hexano-acetona como solvente para se obter duas fracções, i) lavagem da coluna após a fase h) com metanol para se obter uma terceira fracção, a qual comporta componentes biologicamente activos.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que se realiza a fase b) a uma temperatura de processamento compreendida entre 20 e 80 °C. 16

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que se repete a referida fase b) entre uma e cinco vezes.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processe tal como descrito anteriormente, em que a duração da fase b) se encontra compreendida entre 4 horas e 48 horas.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que a fase sólida da fase d) é gel de sílica.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que o eluente da fase d) é um eluente binário, encontrando-se a proporção entre os dois componentes do eluente compreendida entre 100:0 e 0:100.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que os componentes do referido eluente binário compreendem um solvente alcoólico e um solvente não polar.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que se realiza a fase e) a uma temperatura de processamento compreendida entre 20 e 50 °C.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que a fase sólida da fase f) é gel de sílica. 17

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que o eluente da fase f) é um eluente binário, encontrando-se a proporção entre os dois componentes do eluente compreendida entre 100:0 e 0:100.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que os componentes do eluente binário são um solvente não polar e um solvente mais polar.

Uma outra forma de realização da presente invenção é um processo tal como descrito anteriormente, era que a proporção entre os dois componentes do eluente, não polar:polar, se encontra compreendida entre 50:50 e 100:0.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um processo tal como descrito anteriormente, em que o solvente da fase h) é o metanol.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um extracto activo isolado pelo processo conforme descrito anteriormente.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto activo tal como descrito anteriormente como medicamento. 18

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de um extracto activo tal como descrito anteriormente para a preparação de um medicamento no tratamento do cancro.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito à utilização de uma composição de acordo com a reivindicação i. para a preparação de um medicamento para o tratamento do cancro, em que o referido cancro é escolhido de entre o grupo que compreende em cancro da mama, linfoma, sarcoma, cancro pancreático, melanoma, cancro colorrectal, gliorna, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro da pele, cancro ósseo, cancro dos ovários, cancro do sistema nervoso central, cancro renal, cancro da bexiga, cancro da cabeça e do pescoço, cancro da próstata, cancro do fígado e cancros hematológicos. A presente invenção diz ainda respeito a um kit de acordo com a reivindicação 14.. Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um kit que compreende um recipiente no qual se encontra presente um extracto de

Calotropis procera tal como descrito anteriormente e um recipiente no qual se encontra presente um composto terapêutico.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a extractos da planta

Calotropis procera. Em uma primeira forma de realização a presente invenção diz respeito a extractos da planta

Calotropis procera, que possuem actividade farmacológica, em particular actividade anti-tumor e/ou actividade antitóxica. Surpreendentemente, pelo menos um dos extractos de acordo com 19 a presente invenção combina um efeito anti-tumor com uma actividade anti-tóxica.

De acordo com a presente invenção, a expressão "actividade anti-tumor", refere-se a efeitos anti-tumor tanto in vitro como in vivo exercidos por pelo menos um dos extractos ou os seus compostos isolados. Os efeitos antí-tu-mor incluem essencialmente maS não ficam limitados a estes, um decréscimo dramático do crescimento das células e um efeito pró-apoptótico. De um modo importante, os extractos de acordo com a presente invenção exibem actividade anti-tumor sobre um grande número de tipos de cancro, tais como cancro da mama, melanoma ou linfoma, entre outros.

Uma outra característica dos extractos de acordo com a presente invenção diz respeito à sua actividade antitóxica. A expressão "actividade anti-tóxica" refere-se à capacidade dos extractos de acordo com a presente invenção onde os seus compostos isolados para atenuar ou inverter os efeitos de compostos ou tratamentos terapêuticos. Um "composto terapêutico", tal como utilizado na presente memória descritiva, refere-se a um composto que exerce um ou mais efeitos tóxicos relevantes prejudiciais sobre células, tecidos ou órgãos normais, isto é, não cancerosos afins. A expressão "composto terapêutico" pode assim incluir igualmente um composto, um fármaco, um tratamento físico ou um medicamento, utilizados para tratar uma doença particular que exerce efeitos secundários tóxicos prejudiciais. Tais efeitos secundários são conhecidos dos peritos na especialidade e incluem, mas sem ficarem limitados a estes, fadiga, náusea, vómitos, feridas, feridas da boca, pele seca, pele sensível, queda de cabelo, contagem reduzida de glóbulos vermelhos e glóbulos brancos. Tais compostos terapêuticos 20 incluem, mas sem ficarem limitados a estes, agentes quimioterapêuticos, anticorpos e hormonas.

Os compostos terapêuticos úteis de acordo com a presente invenção incluem os utilizados em quimioterapia ou são citotóxicos. Eles incluem, mas sem ficarem limitados a qualquer destes, adriamicina, alkeran, ara-c, bleomicina, BICNU, bussulfam, CCNU, carboplatina, cisplatina, cielofosfamida, citoxano, daunorubi c.ina, DTIC, 5-FU, fludarabina, gemcitabina (gemzar), herceptína, hexametilmelamina, hydrea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan (camptosar, CPT-11) , leustatin, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforano, navelbine, azoto de mostarda, oxaliplatina, rituxano, STI-571, estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano (hicamtina), velbano, vincristina, VP-16, xeloda (capecitabina) ou zevelina.

Constitui um outro aspecto da presente invenção um agente terapêutico que compreende um ou rnais agentes anti-cancro os quais são derivados de um extracto de acordo com a presente invenção. Os compostos anti-cancerosos possíveis de acordo com a presente invenção são quaisquer extraídos de Calotropis procera tais como asclepina, calactina, voruscharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, uscharina e uscharidina.

Em uma outra forma de realização da invenção, os compostos anti-cancerosos são quaisquer extraídos de Calotropis procera tais como 2"oxo-voruscharina, e os seus derivados conforme se índica no Quadro 2. 21

Constitui um outro aspecto cia presente invenção um agente terapêutico o qual é um extracto de acordo com a presente invenção. 0 referido extracto pode ser idêntico a um extracto que possui uma actividade anti-tóxica. Como alternativa, o referido extracto pode ser idêntico a um extracto que possui uma actividade anti-tóxíca, com a excepção da ausência de um ou mais compostos activos provenientes de qualquer extracto. Como alternativa, o referido extracto pode ser idêntico a um extracto que possui actividade antitóxica, com a excepção da presença de um ou mais compostos activos adicionais em qualquer extracto. Como alternativa, o referido extracto pode ser idêntico a um extracto que possui uma actividade antitóxica, com a excepção da diferença na concentração de um ou mais compostos activos em qualquer extracto.

Constitui um outro aspecto da mesma invenção, o composto terapêutico que é um anticorpo ou um seu fragmento. 0 referido anticorpo demonstra actividade cítotóxica. Exemplos de anticorpos terapêuticos incluem, mas sem ficarem limitados a estes, HerceptinR, Prostascint, Rituximab e Trastuzumab.

Constitui um outro aspecto da presente invenção, o composto terapêutico que é uma hormona ou um seu fragmento. Ά referida hormona demonstra actividade cítotóxica. Exemplos de hormonas terapêuticas incluem, mas sem ficarem limitadas a estas, buserelina, fluoximesterona, flutamida, formestano, noretandrolona, noretisterona, prednisolona, prednisona e tarnoxif eno.

Constitui um outro aspecto da presente invenção, o composto terapêutico que é um péptido ou um seu fragmento. 0 referido péptido demonstra actividade citotóxica. 22

Por fragmento com referência a um anticorpo, hormona ou péptido, pretende-se significar um péptido que compreende uma porção do anticorpo, hormona ou péptido que é susceptível de reconhecer o alvo do anticorpo, hormona ou péptido completos. 0 fragmento é ígualmente capaz de reconhecer o alvo do anticorpo, hormona ou péptido completos. A porção pode compreender igualmente substituições, eliminações ou inserções de aminoácidos que não alterem de maneira substancial o reconhecimento do alvo pela porção. 0 número de substituições, eliminações ou inserções pode ser inferior a 2, 3, 4 5 r -O 6/ 7, 8 , 9, 10, 11/ 12, 13, 14, 15, 16, 17/ 18, 19/ 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ou 500.

Constitui um outro aspecto da presente invenção, a actividade anti-tóxica dos extractos que permite a administração de uma dose mais elevada do composto terapêutico. Pela administração de uma dose mais elevada do composto terapêutico, o cancro pode ser mais rápido e eficazmente tratado. O indivíduo que recebe uma dose mais elevada, em combinação com um extracto da invenção, beneficiaria de efeitos secundários reduzidos do composto terapêutico.

Constitui um outro aspecto da invenção a actividade anti-tóxica dos extractos que permite a administração de uma combinação de compostos terapêuticos. Uma terapia de combinação incidiria sobre diferentes aspectos do cancro simultaneamente, de modo a conduzir a um tratamento mais eficaz e eficiente. Pela administração da combinação de acordo com a presente invenção, o paciente sofreria menos efeitos secundários e beneficiaria da eficácia da terapia de associação.

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito aos compostos activos, isolados a partir dos extractos. As expressões "compostos activos" ou "componentes activos" dos extractos são utilizadas na presente memória descritiva como sinónimos, e referem-se aos compostos presentes nos extractos, os quais exibem uma actividade que é similar a pelo menos uma das actividades definidas anteriormente dos extractos.

De acordo ainda com uma outra forma de realização, a presente invenção refere-se a processos para a obtenção dos extractos da planta de Calotropis procera.

Devido ao facto de pelo menos um dos extractos de acordo com a presente invenção exercer uma actividade anti-tumor os extractos de acordo com a invenção são particularmente úteis para o tratamento de doenças tais como o cancro. Por consequência, de acordo com um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem um dos extractos descritos anteriormente ou pelo menos um seu composto activo.

Além disso, visto que os extractos de acordo com a presente invenção exercem igualmente uma actividade anti-tóxica, é também particularmente apropriado que se associem a outros compostos terapêuticos, tais como outros medicamentos, os quais apresentam efeitos secundários tóxicos. Por consequência, de acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende um dos extractos descritos anteriormente ou 24 pelo menos um seu composto activo, e um segundo composto, o qual exerce uma actividade farmacológica com efeitos tóxicos secundários.

Além disso, a presente invenção diz respeito à utilização de um dos referidos extractos e/ou pelo menos um seu composto activo como medicamento. A presente invenção refere-se ainda à utilização de um dos extractos ou de pelo menos um seu composto activo na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças, em particular o cancro.

Outros objectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição pormenorizada seguinte tomada em conjunto com os desenhos anexos.

FIGURAS A figura 1 descreve o crescimento global de diferentes tipos de tumores em função da concentração de um extracto de acordo com a invenção.

As fig. 2 a 11 mostram os efeitos in vitro de um extracto de acordo com a presente invenção sobre diferentes tipos de linhas de células de cancro humano, que são linhas de células de cancro da mama na Figura 2, linhas de células de sarcoma na Figura 3, linhas de células de cancro pancreático na Figura 4, linhas de células de melanoma na Figura 5, linhas de células de cancro do cólon na Figura 6, linhas de células de cancro de glioma na Figura 7, linhas de células de cancro do pulmão na Figura 8, linhas de células de cancro na bexiga na Figura 9, linhas de células de cancro da próstata na Figura 10 e linhas de células de cancro da cabeça e do pescoço na Figura 11. 25

As figuras 12 a 16 representara os efeitos in vitro de um extracto de acordo com a presente invenção sobre a cinética do ciclo celular de células que correspondem a cinco linhas de células humanas diferentes, HCT-15 (Figura 12), RPMI (Figura 13), A172 (Figura 14), J82 ( Figur a 15) e Hs683 (figura 16) . A parte superior das figuras mostra o crescimento global das células, como uma percentagem de células de cancro vivas para células de controlo, para diferentes doses do extracto. As partes média inferior das figuras mostram o efeito sobre a cinética do ciclo das células do referido extracto para diferentes concentrações após 24 horas e 72 horas, respectivamente. A significância estatística foi avaliada com o ensaio t de Student em que *: p<0,05; p<0,01; ***. P<0,001.

As figuras 17 a 20 representam os efeitos de um extracto de acordo com a presente invenção que induzem in vitro a apoptose e necrose sobre células que correspondem a quatro linhas de células humanas diferentes, HCT-15 (figura 17), Ά172 (figura 18), J82 (figura 19) e Hs683 (figura 20). A parte superior das figuras mostra os efeitos que induzem apoptose e induzem necrose do referido extracto para diferentes doses após 24 horas, e a parte inferior das figuras após 72 horas. A figura 21 representa os efeitos de um extracto de acordo com a invenção sobre um modelo de cancro d_e linfoma in vivo. Administrou-se o referido extracto mediante injecção intraperitoneal para as doses de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg e 10 mg/kg de extracto em murganhos que comportam o tumor de linfoma P388. A figura 21A representa os efeitos do referido extracto sobre o peso de murganhos de controlo (não tratados) e em murganhos tratados. A figura 21B representa os efeitos do referido extracto sobre o crescimento do tumor em murganhos de controlo e em murganhos tratados. 26 A figura 22 representa os efeitos de um extracto de acordo com a invenção sobre um modelo de cancro de linfoma in vivo. Administrou-se o referido extracto por injecção intraperitoneal para as doses de 0,63 mg/kg: 1,25 mg/kg e 2,5 mg/kg de extracto em murganhos que comportam o tumor de linfoma P388. A figura 22A. representa os efeitos do referido extracto sobre o peso de murganhos de controlo e de murganhos tratados. A figura 22B representa os efeitos do referido extracto sobre o crescimento do tumor em murganhos de controlo e em murganhos tratados. A figura 23 representa os efeitos de um extracto de acordo com a invenção sobre um modelo de cancro de melanoma in vivo. Administrou-se o referido extracto por via intraperitoneal para as doses de 2,5 mg/kg; 1,25 mg/kg e 0,63 mg/kg de extracto em murganhos que comportam o melanoma B16. A figura 23A representa os efeitos do referido extracto sobre o peso de murganhos de controlo (não tratados) e murganhos tratados. A figura 23B representa os efeitos do referido extracto sobre o crescimento do tumor em murganhos de controlo e em murganhos tratados. A figura 24 representa os efeitos de um extracto de acordo com a invenção sobre um modelo de cancro de melanoma in vivo. Administrou-se o extracto per os para as doses de 0,63 mg/kg; 1,25 mg/kg e 2,5 mg/kg de extracto em murganhos que apresentam melanoma 316. A figura 24A representa os efeitos do referido extracto sobre o peso de murganhos de controlo e de murganhos tratados. A figura 24B representa os efeitos do referido extracto sobre o crescimento do tumor em murganhos de controlo e ern murganhos tratados. A figura 25 representa os efeitos de um extracto de acordo com a invenção sobre um modelo de cancro da mama m vivo. Administrou-se o extracto mediante injecção intraperitoneal para as doses de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg e 10 27 mg/kg de extracto em murganhos que comportam cancro da mama MXT-HI. A figura 25A representa os efeitos do referido extracto sobre o peso de murganhos de controlo (não tratados) e de murganhos tratados. A figura 25B representa os efeitos do referido extracto sobre o crescimento do tumor em. murganhos de controlo e em murganhos tratados. A figura 26 representa um ajustamento geral estatístico para os murganhos que comportam o cancro da mama MXT-HI dos grupos de ensaio (isto é, injecção intraperitoneal dos murganhos para as doses de extracto de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg e 10 mg/kg) e o grupo de controlo, relativamente à sobrevivência (análise estatística de Kaplan-Meier). A figura 27 representa os efeitos de um extracto de acordo com a invenção para as doses de 5 mg/kg e 1,25 mg/kg sobre a quantidade de glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, concentração de hemoglobina e de hematócritos no dia três após a injecção intraperitoneal em murganhos em comparação com os murganhos de controlo (Na figura a dose de extracto representada a "branco" é 1,25 mg/kg).

As figuras 28 a 35 ilustram os efeitos anti-tóxicos de extractos de acordo com a invenção quando combinados com os compostos anti-tumor adriamicina ou vincristina ou camptotecina ou oxaliplatina.

Propriedades do extracto A planta Calotropis procera, que pertence à família das Asclepiadaceae, é uma planta que cresce em África e na Ásia. Essa planta utiliza-se em medicina popular tradicional e tem sido estudada relativamente a um número considerável de utilizações tais como antipirético, antimalárico, antidiarreico, analgésico, anti-inflamatório gástrico, protector das mucosas e como insecticida, antitússico, 28 antibacteriano, cicatrizante de feridas e relaxante muscular. As hastes, flores e folhas da planta Calotropis procera são conhecidas por conterem certos compostos designados por cardenólidos. Recentemente, atribuiu-se actividade cardiotóxica a estes cardenólidos e eles são explorados em terapias humanas para o tratamento de insuficiências cardíacas.

Inesperadamente, a presente invenção diz respeito a pelo menos um extracto de acordo com a invenção da planta Calotropis procera que apresenta um outro tipo de actividade, em particular uma "actividade anti-tumor". Além disso, demonstrou-se que pelo menos um extracto de acordo com a invenção mostra tanto in vitro como ín vivo efeitos anti-tumor. 0 referido extracto de acordo com a invenção induz uma redução dramática no crescimento das células e mostra uma actividade pró-apoptótica. Estas propriedades são ainda ilustradas nos exemplos 3 e 4. Além disso, os inventores mostraram in vivo que pelo menos um dos referidos extractos de acordo com a invenção que é altamente activo contra diversos tipos de cancros. Conforme se ilustra nos exemplos que se descrevem a seguir, o referido extracto de acordo com a presente invenção, exerce efeitos anti-tumor significativos sobre diversos modelos de tumor ensaiados, que representam um amplo painel de tipos de tumor histológicos, incluindo cancro da mama, linfomas e melanomas. Estes modelos são clinicamente relevantes visto que eles imitam estágios clínicos específicos de cancros humanos.

De maneira surpreendente, o referido extracto de acordo com a presente invenção é altamente activo para doses relativamente baixas. 0 referido extracto pode exercer uma actividade anti-tumor para doses baixas ria gama compreendida 29 entre 0,4 e 2,2 mg/kg e de preferência na gama compreendida entre 0,5 e 2 mg/kg. A actividade anti-tumor elevada para doses reduzidas indica que o referido extracto é altamente activo. De maneira surpreendente, e tal como se tornará igualmente mais claro quando da leitura dos exemplos que se apresentam a seguir, o referido extracto de acordo com a presente invenção apresenta efeitos anti-tumor significativamente mais elevados quando ensaiado para doses cronicamente reduzidas, isto é, compreendidas entre 0,6 mg/kg e 1,25 mg/kg, do que para doses elevadas, isto é doses compreendidas entre 5 mg/kg e 10 mg/kg. O índice da Dose Tolerada Máxima (MTD) do referido extracto de acordo com a invenção, com referência à quantidade máxima do referido extracto, que pode ser administrado com rigor a animais saudáveis, é de 20 mg/kg de extracto. Este valor indica que o referido extracto de acordo com a invenção tem uma ampla janela terapêutica. O termo "toxicidade" ou a expressão "efeitos tóxicos" referem-se aos efeitos prejudiciais que um composto pode apresentar sobre células, tecidos ou órgãos saudáveis. Uma outra propriedade importante de um extracto de acordo com a invenção inclui o seu reduzido nível de toxicidade.

Demonstrou-se que o referido extracto não induz in vivo alterações hematológicas, não induz perda de peso e mostra efeitos secundários mínimos sobre diferentes tipos de órgãos e tecidos. De facto, o nível de toxicidade do referido extracto de acordo com a invenção é surpreendentemente baixo. 0 referido extracto de acordo com a invenção combina as características essenciais de uma boa actividade anti-tumor, com um reduzido nível de toxicidade e uma indução mínima de efeitos secundários prejudiciais. 30

Além disso, os extractos da planta Calotropis procera de acordo com a invenção mostram igualmente uma "actividade anti-tóxica". Tal como se mencionou anteriormente, a expressão "actividade anti-tóxica", tal como utilizada na presente memória descritiva, refere-se à capacidade dos extractos de acordo com a presente invenção para atenuarem ou inverterem os efeitos secundários prejudiciais dos compostos. De maneira surpreendente, os inventores demonstraram que a combinação de um extracto de acordo com a invenção com outros compostos terapêuticos com efeitos secundários prejudiciais possibilita a redução dos efeitos secundários indesejáveis do composto terapêutico. Por exemplo, o exemplo 8 ilustra que a combinação de um extracto de acordo com a invenção com compostos anti-cancro bem conhecidos, tais como vincristina ou adriamicina, camptotecina ou oxaliplatina, permite a redução de alguns efeitos secundários provocados pela toxicidade às células normais induzidos por esses compostos anti-cancro. A actividade anti-tóxica é evidente quando pelo menos um dos extractos de acordo com a invenção é administrado antes do composto terapêutico, isto é, eles são administrados de maneira sequencial. Constitui um aspecto da invenção administrar um extracto antes de qualquer tempo antes da administração do composto terapêutico. Constitui um outro aspecto da invenção a administração de um extracto não mais do que 336, 312, 288, 264, 240 72, 48, , 24, 20, 16, 12, ao 216, 192, 168, 144, 120, 96 2, 1 ou 0,5 horas antes d. administração do composto terapêutico. A actividade anti-tóxica é igualmente evidente quando se administra pelo menos um dos extractos de acordo com a invenção ao mesmo tempo que o composto terapêutico, isto é, 31 sob a forma de uma composição, mediante administração simultânea ou separada. A actividade anti-tóxica é também evidente quando pelo menos um dos extractos de acordo com a invenção é administrado após o composto terapêutico, isto é, eles serem administrados de maneira sequencial. Constitui um aspecto da invenção administrar um extracto em qualquer altura após o composto terapêutico ter sido administrado. Constitui um outro aspecto da invenção administrar o extracto antes de 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312 ou 366 horas após o composto terapêutico ter sido administrado.

Na administração sequencial, pode administrar-se os referidos extractos de uma vez, ou em qualquer número de vezes e em várias doses antes e/ou após a administração dc composto terapêutico. A administração sequencial pode ser combinada com uma administração simultânea ou sequencial.

Composição do extracto

Os extractos de acordo com a presente invenção compreendera um ou mais compostos activos, isto é, os compostos presentes em um extracto de acordo com a presente invenção, os quais exibem uma actividade semelhante a pelo menos uma das actividade definidas anteriormente de um extracto de acordo com a invenção. As actividade principais de pelo menos um dos extractos são uma actividade anti-tumor e uma actividade antitóxica. Como será entendido por um perito na especialidade, um composto activo presente nos referidos extractos pode exercer apenas uma destas propriedades, ou mesmo ambas as propriedades. 32

De acordo cm uma outra forma de realização, pelo menos um dos extractos de acordo com a invenção compreende pelo menos dois dos compostos act.ivos escolhidos de entre o grupo que compreende asclepina, calactina, voruscharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, caiotoxina, uscharina e uscharidina, 2"oxo-voruscharina.

Como será entendido, os extractos de acordo com a invenção podem conter ainda um ou mais compostos activos, os quais não pertencem ao grupo dos cardenólidos, e outros compostos. De acordo com uma forma de realização, os extractos contém pelo menos um dos compostos representados no Quadro 1.

Quadro 1 Alguns dos compostos contidos em pelo menos um dos extractos de acordo com a invenção

Compostos presentes no extracto de acordo com a invenção

3-O-ACETIL-CALOTROPINA, ALFA-AMIRINA, BENZOATO DE ALFA-AMIRINA, ALFA-CALOTROPEOL, ALFA-LACTOCEROL, ACETATO DE ALFA-LACTUCERILO, ISOVALERATO DE ALFA--LACTUCERILO, CINZA, BENZOILISOLINEOLONA, BENZOILINEOLONA, BETA-AMIRINA, BENZOATO DE BETA--AMIRINA, BETA-CALOTROPEOL, BETA-SITOSTEROL, BORRACHA, COROGLAUCOGENINA; COROTOXIGENINA; D--GLUCOSAMINA, FRUGOSIDE, GIGANTEOL, GIGANTINA, GLUCOSE, HISTAMINA, ISOGIGANTEOL, ISOLCTUCEROL, ISOLINEOLONA, LAURANO LINEOLONA, ÁCIDO LINOLEICO, ÁCIDO LINOLÉNICO, ÁLCOOL MELISSÍLICO, MUDARINA, ÁCIDO OLEICO, ÁCIDO PALMÍTICO, PROCEROSIDE, PSEUDOCALOTROPAGENINA, RAMNOSE ESTIGMASTEROL, ESIRIOGENINA TARAXASTEROL, BENZOATO DE TERAXASTEROL, TRIPSINA

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um composto activo isolado a partir dos extractos de acordo com a mesma invenção. 33

De acordo com uma outra forma de realização, um composto activo do extracto é a 2"oxo~voruscharina. Um aspecto da invenção é a actividade anti-cancro e/ou anti-tóxica do referido composto (composto A) e os seus derivados (compostos B a H) conforme ilustrado no Quadro 2.

Quadro 2: Estrutura Química de 2"oxo-voruscharina (Composto A) e os seus derivados (Compostos B a H)

Η H Fórmula geral I Ri r2 r3 Rí Rs Composto A 2"oxo- voruscharina -COH -OH -OH =0 -H Composto B -ch2oh -OH -OH =0 -H Composto C -CHjOAc -OH -OH =0 -H Composto D CH2OOCfenilo -OH -OH =0 -H Composto E -ch2oh -OH -OH Ligação dupla1 -H Composto F -CH20ãc -OH -OH Ligação dupla1 -H Composto G CHsOOCfenilo -OH -OH Ligação dupla1 -H Composto H -CM; OH -OH -OH "Λο -H 1 significa uma ligação dupla entre o átomo de azoto e o átomo de carbono do anel heterocíclico que contém azoto de fórmula geral I. 34

Processos de extracção

De acordo com uma outra forma de realização, pode obter--se um extracto de acordo com a invenção mediante uma extracção alcoólica, em particular mediante uma extracção com metanol.

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito ao processo para a obtenção do extracto de acordo com a invenção que compreende as fases que consistem em: a) extracção do material inicial da referida planta Calotropis procera, sendo o referido material inicial escolhido de entre frutos, partes aéreas, partes subterrâneas, e as suas misturas, no seio de um álcool alifático, mediante a dissolução do material inicial no referido álcool obtendo-se deste modo uma suspensão do referido material no referido álcool, agitação da referida suspensão; e filtração da referida suspensão através de vidro sinterizado, obtendo-se deste modo um primeiro filtrado e uma primeira parte sólida; b) extracção da referida primeira parte sólida no seio de um álcool alifático obtendo-se deste modo um segundo filtrado e uma segunda parte sólida; c) associação dos referidos, primeiro e segundo, filtrados obtendo-se deste modo um filtrado combinado; e d) evaporação do referido filtrado combinado sob vazio para se obter deste modo o resíduo oleoso.

De acordo com uma forma de realização preferida, escolhe-se o referido material inicial da referida planta 35

Calotropis procera de entre as partes subterrâneas, em particular a partir das raízes.

Numa outr a forma de realização, o álcool alífático utilizado para extrair o material inicial de acordo com a invenção é o metanol. De acordo com uma outra forma de realização, o resíduo obtido no processo de extracção é extraído com um solvente , em particular no seio de um solvente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um processo para a obtenção de extractos de acordo com a invenção, que compreende as fases que consistem em: a) moagem do material inicial constituído por folhas, hastes, cascas e raízes de Calotropis procera para se obter um pó fino da planta, b) extracção do pó resultante da fase a) com diclorometano durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, c) decantação do diclorometano resultante da fase b) e evaporação do filtrado, após filtração, para se obter uma goma, d) extracção do resíduo resultante da fase c) com metanol durante pelo menos 6, 12, 18 ou de preferência 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, e) decantação do metanol da fase d), evaporação do filtrado, após filtração, para se obter uma goma, f) submissão da goma resultante da fase e) em cromatografia de coluna utilizando gel de sílica flash e diclorometano-metanoi como solvente, g) isolamento de uma primeira fracção, 36 h) aplicação da fracção concentrada resultante da fase g) em cromatografia de coluna utilizando gel de sílica flash e hexano-acetona como solvente para se obter duas fracções, i) lavagem, da coluna após a fase h) com metanol para se obter uma terceira fracção.

Os extractos de acordo com a presente invenção incluem os obtidos a partir das fases c), fase g) e fase i).

Constitui um aspecto da presente invenção que as extracções sejam realizadas de uma maneira compatível com a conservação da integridade dos compostos biologicamente activos contidos no referido extracto. Tais precauções são conhecidas dos especialistas na matéria.

Aplicabilidade dos extractos

Devido às propriedades interessantes de pelo menos um dos extractos descritos na presente memória descritiva, em particular a sua actividade anti-tumor, a sua actividade antitóxica e/ou o seu reduzido nível de toxicidade e/ou a sua elevada actividade para doses pequenas, o(s) extracto(s) de acordo com a presente invenção ou os seus compostos activos são particularmente apropriados para utilização como medicamento para o tratamento de doenças, e em particular para o tratamento do cancro.

De acordo com uma outra forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um extracto de acordo com a invenção, ou de um seu composto activo, como medicamento.

De acordo ainda com uma outra forma dc realização, a invenção refere~se também à utilização de pelo menos um 37 extracto de acordo com a invenção, ou de um seu composto actívo, para a preparação de um medicamento no tratamento do cancro. Em particular, o referido extracto de acordo com a invenção, ou um seu composto actívo é utilizado para a preparação de um medicamento no tratamento de cancros. Exemplos de cancros que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem, mas sem ficarem limitados a estes, cancro da mama, linfoma, sarcoma, cancro pancreático, melanoma, cancro colorrectal, glioma, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro da pele, cancro dos ossos, cancro dos ovários, cancro do sistema nervosos central, cancro renal, cancro da bexiga, cancro da cabeça e do pescoço, cancro da próstata, cancro do fígado e cancro hematológico.

Conforme se mencionou anteriormente, os extractos de acordo com a presente invenção compreendem igualmente uma actividade anti-tóxica. Os inventores demonstraram que uma combinação de um extracto de acordo com a invenção ou os seus compostos activos com um segundo composto com efeitos secundários prejudiciais relevantes permite a redução da actividade tóxica deste segundo composto, sem reduzir a sua actividade terapêutica. Por consequência, os extractos de Calotropis procera de acordo com a invenção podem também ser combinados num medicamento com outros compostos, em particular com outros compostos anti-cancro.

Composições farmacêuticas que compreendem o extracto

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para o tratamento do cancro que compreende uma quantidade terapeuticamente actíva de um extracto de Calotropis procera de acordo com a 38 presente invenção ou um seu composto activo, e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para o tratamento do cancro que compreende - uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extracto de Calotropis procera de acordo com a invenção ou um seu composto activo, - uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico, e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" tal como utilizada na presente memória descritiva significa a quantidade de pelo menos um extracto ou de um composto activo ou de um agente farmacêutico que elicia a resposta biológica ou medicinal em um tecido, sistema, animal ou ser humano que se encontra a ser investigado por um investigador, veterinário, médico ou outro clínico, que inclui o alivio dos sintomas da doença a ser tratada.

Pode preparar-se a composição farmacêutica por uma maneira conhecida do especialista na matéria. Para esta finalidade, um extracto de acordo com a invenção e/ou qualquer seu composto activo, um ou mais veículos farmacêuticos sólidos ou líquidos e, eventualmente, em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos, são transformados numa forma de administração ou forma de dosagem apropriada que pode então ser utilizada como um produto farmacêutico em medicina humana ou em veterinária. 39

As formas particulares da composição farmacêutica podem ser, por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, cremes, comprimidos, cápsulas, sprays nasais, lipossomas ou mícro-re-servatórios, especialmente composições em forma oral para ingestão ou injectável estéril, por exemplo, sob a forma de suspensões aquosas ou oleaginosas injectáveis estéreis ou supositórios. A forma preferida da composição contemplada é a forma sólida seca, a qual inclui cápsulas, grânulos, comprimidos, pastilhas, bolus e pós. 0 veiculo sólido pode compreender um ou mais veículos, por exemplo lactose, diluentes, agentes desagregantes, aglutinantes, por exemplo, celulose, carboximetilcelulose ou amido ou agentes lubrificantes, por exemplo estearato de magnésio, para impedir que os comprimidos adiram ao equipamento de compressão. Podem formar-se os comprimidos, as pastilhas e os bolus de modo que se desagreguem rapidamente ou que proporcionem uma libertação lenta do componente actívo.

Além disso, devido à sua actividade anti-tóxica, os extractos de acordo com a invenção ou os seus compostos activos, são também particularmente apropriados para se associarem a outros compostos terapêuticos que exercem uma actividade terapêutica com efeitos secundários tóxicos, tais como outros medicamentos, que apresentam efeitos secundários tóxicos. 0 "composto terapêutico, que exerce uma actividade farmacológica com efeitos secundários tóxicos" pode incluir qualquer composto que seja utilizado para o tratamento de qualquer doença mas que inclua efeitos tóxicos indeseiados. De preferência, tais compostos são compostos que se utilizam no tratamento do cancro. Por exemplo, um extracto de acordo com a presente invenção ou os seus compostos activos pode 40 associar-se com um ou mais do que um outro composto que possui um efeito anti-tumor. visto que se combinam dois ou mais compostos com uma actividade anti-tumor, pode obter-se uma actividade anti-tumor melhorada. Além disso, tais associações permitem também reduzir os efeitos secundários tóxicos, que são induzidos por um ou vários dos compostos anti-tumor.

Uma associação de um extracto de acordo com a presente invenção ou dos seus compostos activos com um outro composto terapêutico pode envolver um uso separado do referido extracto ou um seu composto activo e o outro composto terapêutico. Em particular a associação pode envolver o uso de um extracto de acordo com a presente invenção ou os seus compostos activos antes (pré-tratamento) de, ou ao mesmo tempo, ou após (pós-tratamento) do uso do outro composto terapêutico.

Como alternativa, uma associação de um extracto ou os seus compostos activos com um outro composto terapêutico pode também envolver uma mistura de ambos os elementos. Por consequência, de acordo com uma forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende um primeiro componente, sendo esse referido primeiro componente, o extracto descrito anteriormente ou pelo menos o seu composto activo, e um segundo componente, compreendendo o referido segundo componente um composto terapêutico, o qual exerce uma actividade farmacológica com efeitos secundários tóxicos. 41

Produto

Um aspecto da presente invenção é um produto que contém um extracto de Calotropis procera e um composto terapêutico para a administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo. Constitui um aspecto da invenção que o produto possa ser utilizado de acordo com a mesma invenção.

Por administração simultânea pretende-se significar que os dois componentes são administrados a um indivíduo ao mesmo tempo. Por exemplo, sob a forma de uma mistura dos dois componentes. Exemplos incluem, mas sem ficarem limitados a estes, uma solução administrada por via intravenosa, um comprimido, um líquido, um creme tópico, etc., em que cada preparação compreende ambos os componentes.

Por administração separada pretende-se significar que os dois componentes são administrados a um indivíduo ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo, mas que os componentes se encontram presentes no produto sob a forma de preparações separadas, não misturadas. Por exemplo, os dois componentes podem encontrar-se presentes no produto sob a forma de comprimidos individuais. Os comprimidos podem ser administrados ao indivíduo mediante engolimento de ambos os comprimidos ao mesmo tempo, ou um comprimido directamente após o outro.

Por administração sequencial pretende-se significar que os dois componentes são administrados a um indivíduo sequencialmente e os comprimidos se encontram presentes no produto sob a forma de preparações separadas, não misturadas. Existe um intervalo de tempo entre doses. Por exemplo, um componente pode ser administrado até 336, 312, 288, 264, 240, 42 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1 ou 0,5 horas após o outro componente.

Na administração sequencial, o extracto pode ser administrado uma vez, ou qualquer número de vezes e em diversas doses antes e/ou após a administração do composto terapêutico. A administração sequencial pode ser combinada com administração simultânea ou sequencial.

Kit

Um outro aspecto da presente invenção é um kit que compreende um recipiente em que um extracto de Calotropis procera se encontra presente, e um recipiente em que um composto terapêutico se encontra presente. Um extracto de acordo com a invenção e o composto terapêutico de acordo com a invenção encontram-se descritos anteriormente.

Ao mencionar um kit que compreende um recipiente em que um extracto de Calotropis procera se encontra presente e um recipiente em que o composto terapêutico se encontra presente, deve entender-se que o kit pode conter uma dose individual, ou uma pluralidade de doses, reflectidas em dois recipientes individuais, dois recipientes individuais cada um dos quais é susceptível de conter uma pluralidade de doses ou uma pluralidade de recipientes individuais cada um dos quais susceptível de conter uma dose individual. Deve entender-se que o kit pode compreender mais do que um composto terapêutico, cada composto terapêutico em um recipiente separado, ou uma mistura de compostos terapêuticos em um recipiente individual. 43

Os recipientes podem ser quaisquer conhecidos na técnica farmacêutica. Eles podem ser frascos, embalagens de blisters, seringas, garrafas que podem ser voltadas a fechar, garrafas com meios de distribuição, aspiradores, garrafas conta-gotas, emplastros, aplicadores, supositórios.

Os recipientes separados permitem extrair o composto terapêutico a ser administrado de maneira simultânea, separado ou sequencial.

Utilizações

Devido às propriedades anti-tumor favoráveis de pelo menos um dos extractos de acordo com a presente invenção, os referidos extractos são particularmente úteis no tratamento de indivíduos que sofrem de cancro. Devido ao seu reduzido nível de toxicidade e aos seus efeitos secundários mínimos, a utilização de um referido extracto em uma composição farmacêutica para o tratamento do cancro envolverá efeitos secundários mínimos. Como consequência, um extracto de acordo com a presente invenção pode ser utilizado durante um intervalo de tempo mais longo durante o tratamento do cancro.

Em particular, em uma forma de realização preferida, a presente invenção refere-se à utilização de uma composição de acordo com a_j^^vindicação J-- para _ a preparação de um medic.am.ento para o tratamento do cancro, em que o cancro é escolhido de entre o grupo que compreende, mas não fica limitado a estes, cancro da mama, iinfoma, sarcoma, cancro pancreático, melanoma, cancro colorrectal, glioma, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro da pele, cancro dos ossos, cancro dos ovários, cancro do sistema nervoso central, cancro renal, 44 cancro da bexiga, cancro da cabeça e do pescoço, cancro da próstata, cancro do fígado e cancro hematológico.

Com esses objectivos, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode administrar-se por via oral, parentérica, isto é, inclui injecções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injecção intra-externa ou técnicas de perfusão, mediante spray para inalação, ou por via rectal, que contêm agentes de transporte, adjuvantes e veículos convencionais não tóxicos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

De acordo com a presente invenção, a referida composição farmacêutica pode ser administrada separadamente em instantes de tempo diferentes no decurso da terapia ou concorrentemente em formas de combinação divididas ou individuais. A presente invenção deve, portanto, ser entendida como englobando todos esses regimes de tratamento simultâneo ou alternado e o termo "administração" deve ser interpretado de conformidade.

Essencialmente, os modos de tratamento principais de cancros de tumor sólido compreendem cirurgia, terapia de radiação e quimioterapia, separadamente ou em combinação. Os extractos de acordo com a invenção são apropriados para utilização em combinação com estas técnicas clínicas. Os extractos de acordo com a invenção podem ser úteis no aumento da sensibilidade de células de tumor à radiação em radioterapia e também na potencial.ização ou intensificação dos danos provocados nos tumores pelos agentes quimioterapêuticos. Os extractos de acordo com a presente invenção podem também ser úteis para a sensibilização de células de tumor resistentes a fármacos múltiplos. Os extractos de acordo com a invenção são compostos terapêuticos 45 úteis para administração em associaçao com outros compostos terapêuticos que danificam o ADN para potenciar o seu efeito.

Deverá entender-se que a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada a seres humanos em níveis de doses específicos e com uma frequência de dosagem específica que pode ser variada para qualquer paciente particular e que dependerá de uma variedade de factores que incluem a idade, o peso do corpo, o estado geral de saúde, o sexo, a dieta, o modo e o tempo de administração, a velocidade de excreção, a combinação de fármacos e a gravidade do estado particular do paciente submetido à terapia.

Com os exemplos seguintes pretende-se ilustrar a presente invenção. Estes exemplos não devem ser considerados como limitativos do âmbito da invenção. 0 primeiro exemplo ilustra a extracção de extractos de acordo com a invenção a partir da Cãlotropis procera. Os exemplos 2 a 4 referem-se à caracterização anti-tumor in vítro de um extracto de acordo com a invenção. Os exemplos 5 a 7 descrevem a caracterização anti-tumor ir vivo de um extracto de acordo com a invenção. 0 exemplo 8 ilustra os efeitos anti-tóxicos de extractos de acordo com a presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Processo de extracção de extractos de acordo com a invenção a partir da planta Cãlotropis procera

Isolou-se um extracto (Extracto A) de acordo com a presente invenção a partir de raízes da planta Cãlotropis procera (família Asclepiadiaceae) por meio de metanol. 0 46 referido extracto é ainda referido como Extracto A (para adaptar). Colocaram-se cerca de 10 gramas de planta em um erlenmeyer com 150 ml de metanol. Agitou-se a suspensão magneticamente durante 12 horas e então filtrou-se através de um vidro sinterizado. Extraiu-se o sólido remanescente uma segunda vez com metanol durante 2 horas. Reuniram-se ambos os filtrados e evaporaram-se sob vazio utilizando um evaporador rotativo. O resíduo, constituído pelo extracto metanólico, é referido na presente memória descritiva como Extracto A. A análise do Extracto A revelou a presença de diversos tipos de compostos. Um grupo particular de compostos identificados no referido Extracto A compreende cardenólidos tais como asclepina, calactina, vorusharina, calotropina,

ca'lotropagenina, uzarigenina, usharina e usharidina. Além disso, alguns outros compostos, presentes no Extracto A compreende, mas sem ficarem limitados a estes, 3-O-ACETIL--CALOTROPIWA, ALFA-AMIRINA, BENZOATO DE ALFA-AMIRINA, ALFA--CALOTROPEOL, ALFA-LACTUCEROL, ACETATO DE ALFA-LACTUCERILO, ISOVALERATO DE ALFA-LACTUCERILO, CINZA, BENZOILISOLINEOLONA, BENZOILINEOLONA, BETA-AMIR1NA, BENZOATO DE BETA-AMIRTNA, BETA-CALOTROPEOL, BETA-SITOSTEROL, BORRACHA, COROGLAUCOGENINA; COROTOXIGENINA; D-GLUCOSAMINA, FRUGOSIDE, GIGANTEOL, GIGANTINA, GLUCOSE, HISTAMINA, ISOGIGANTEOL, ISOLCTUCEROL, ISOLINEOLONA, LAURANO LINEOLONA, ÁCIDO LINOLEICO, ÁCIDO LINOLÉNICO, ÁLCOOL MELISSÍLICO, MUDARINA, ÁCIDO OLEICO, ÁCIDO PALMÍTICO, PROCEROSIDE, PSEUDOCALOTROPAGENINA, RAMNOSE ESTIGMASTEROL, ESIRIOGENINA TARAXASTEROL, BENZOATO DE TERAXASTEROL, TRIPSINA.

Isolaram-se outros extractos de acordo com a presente invenção através de um processo que compreende as fases que consistem em: 47 a) moagern do material inicial constituído por folhas, hastes, cascas e raízes de Calotropis procera para se obter um pó fino da planta, b) extracção do pó resultante da fase a) com diclorometano durante 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, c) decantação do diclorometano resultante da fase b) e evaporação do filtrado (após filtração) para se formar uma goma, d) extracção do resíduo resultante da fase c) com metanol durante 24 horas utilizando um extractor de Soxhlet, e) decantação do metanol da fase d), evaporação do filtrado (após filtração) para se formar uma goma, f) submissão da goma resultante da fase e) em cromatografia de coluna utilizando gel de sílica flash e diclorometano-metanol como solvente, g) isolamento de uma primeira fracção, h) aplicação da fracção concentrada resultante da fase g) em cromatografia de coluna utilizando gel de sílica flash e hexano-acetona como solvente para se obter duas fracções, i) lavagem da coluna após a fase h) com metanol para se obter uma terceira fracção. 0 extracto isolado na fase c) é referido no seguimento como Extracto B. 0 extracto isolado na fase g) é referido no seguimento como Extracto C. 0 extracto isolado na fase i) é referido no seguimento como extracto D. 48

Exemplo 2 Efeito de vm extxacto de acordo com a presente invenção sobre o crescimento global das células de uma linha de células

Este exemplo ilustra as actividades anti-tumor do

Extracto A de acordo com a invenção sobre diferentes tipos de cancro. A fim de caracterizar as actividades in vitro do Extracto A, realizaram-se ensaios MTT. 0 ensaio MTT, que é um ensaio bem conhecido na técnica, constitui uma técnica indirecta que mede rapidamente, isto é, no decurso de 5 dias, o efeito de um determinado produto sobre o crescimento global de uma linha de células. Este ensaio mede o número de células vivas, metabolicamente activas, que são susceptiveis de transformar o produto MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2,5-difenii-tetrazólio), com uma cor amarelada, do produto azul formazano mediante redução mitocondrial realizada apenas pelas células vivas. A quantidade de formazano obtido no final da experiência é medida com um espectrofotómetro e é directamente proporcional ao número de células vivas.

Ensaiaram-se quarenta e oito linhas de células de cancro humano, descritas no Quadro 2, na presença de Extracto A. Estas linhas de células cobriam dez tipos histológicos, que sâo pancreático, sarcoma, cancro da mama, melanoma, cancro do cólon, glioma, cancro do pulmão, cancro da bexiga, cancro da próstata e cancro da cabeça e do pescoço. Deixaram-se crescer as células em micro-placas de 96 microcavidades de fundo plano com 100 μ.. de suspensão de células por cavidade e entre 3000 e 5000 células/cavidade dependendo do tipo de célula. Semeou-se cada linha e células no seu próprio meio de cultura conforme se indica no Quadro 2. 49

Quadro 2 Linhas de células de cancro humano e meio de cultura das células correspondentes utilizados para experiências MTT

Linhas de células Código ATCC Tecido Meio BxPC-3 CRL-1687 Pancreático RMPI 10% soro MiaPACA-2 CRL-1420 Pancreático DM.EM glucose 10% PANC-1 CRL-1469 Pancreático OPTIMEM 5% CAPAN-1 HTB-79 Pancreático RPMI 10% soro CFPAC-l CRL-1918 Pancreático Iscove/s 10% soio Hs766T BTB-134 Pancreático OPTIMEM 5% SUi86.86 CRL-1837 Pancreático RPMI 10% soro SK-IMS-l HTB-88 Sarcoma MEM 10% soro SK-OT-1B HTB-115 Sarcoma MEM 10% soro AA HT-1080 CCL-121 Sarcoma MEM 5% soro Hs729 HTB-153 Sarcoma MEM 10% soro AA MÊS-SA CRL-1976 Sarcoma MEM 5% soro RD CCL-136 Sarcoma MEM 5% soro A204 HTB-82 Sarcoma MEM 5% soro MCF-7 HTB-22 Mama MEM 51 soro T-47D HTB-133 Mama MEM 5% soro MDA-MB-231 HTB-26 Mama DMEM Nut mistura 10% soro ZR-75-1 CRL-1500 Mama MEM 5% soro Hs578T HTB-126 Mama MEM 5% soro SK-MEL-28 HTB-72 Melanoma RPMI 10% soro HT-144 HTB-63 Melanoma MEM 10% soro AA C-32 CRL-1585 Melanoma MEM 5% soro Malme-3M HTB-64 Melanoma MEM 5% soro G-361 CRL-1424 Melanoma OPTIMEM 51 soro HCT-15 CCL-225 Cólon MEM 5% soro LoVo CCL-229 Cólon MEM 5% soro DLD-l CCL-221 Cólon MEM 10% soro AA Ls-174T Cl.-188 Cólon MEM 101 soro AA HT29 IiTB-38 Cólon MEM 10% soro AA WiDR CCL-218 Cólon MEM 10% soro AA SW948 CCL-237 Cólon OPTIMEM 5% soro AI 72 CRI-1620 Glioma MEM 5% soro H4 BTB-148 Glioma MEM 51 soro Hs683 HTB-138 Glioma MEM 5% soro 50

Quadro 2 Linhas de células de cancro humano e meio de cultura das células correspondentes utilizados para experiências MTT (Cont.)

SW1088 HTB-12 Glioma MEM 5% soro U-118 MG HTB-15 Glioina MEM 5% soro U-87 MG HTB-14 Glioma MEM 5% soro U-373 MG HTB-17 G1ioma MEM 5% soro A427 HTB-53 Pulmão MEM 5| soro A549 CCL-185 Pulmão MEM 5% soro J82 HTB-1 Bexiga MEM 5% soro T24 HTB-4 Bexiga MEM 51 soro PC3 CRL-1435 Próstata MEM 5% soro Detroit CCL-138 Cabeça e pescoço MEM 10% soro AA RFMI CCL-30 C3.Í3ÔÇ3. Ô pescoço MEM 10% soro AA FaDu HTB-43 Cabeça e pescoço MEM 10% soro AA SCC9 CRL-1629 Cabeça e pescoço MEM 10% soro AA SCC25 CRL-1628 Cabeça e pescoço MEM 10% soro AA

Em que AA significa "Aminoácidos"

Decorrido um período de 24 horas à temperatura de 37 °C substituiu-se o meio de cultura por 100 μΐ de meio fresco em que se dissolveu Extraeto A para as diferentes concentrações de 0,01 pg/ml, 0,05 μς/π\1, 1 μς/πιΐ, 5 μς/ιτιΐ, 10 μς/ιπΐ, 50 μς/πιΐ e 100 μ9/ml. Realizou-se cada condição experimental em sextuplicado.

Decorridas 72 horas de incubação à temperatura de 37 °C com o fármsco, isto é, condições experimentais ou sem o fármaco, isto é controlo, substituiu-se o meio por 100 μΐ de MTT para a concentração de 1 μς/ml dissolvido em RPMI. Jncubaram-se então as microcavidades durante 3 horas à 51 temperatura de 37 °C e centrifugaram-se a 400 g durante 10 minutos. Removeu-se o MTT e dissolveram-se os cristais de formazano formados em 100 μΐ de DMSO. Agitaram-se as inicrocavidades durante 5 minutos e leram-se num espectrof otóruetro a 2 comprime ritos de onda a 570 nm que correspondem ao comprimento de onda de absorvância máximo de formazano e a 630 nm, que é o comprimento de onda do ruído de fundo.

Para cada situação experimental calculou-se a DO média associada ao erro padrão da média (SEM) para cada situação, isto é, 6 cavidades. Calculou-se a percentagem de células vivas remanescentes em comparação com o controlo. Os resultados destas experiências encontram-se representados nas figuras 1 a 11. A figura 1 representa os resultados globais para os dez tipos histológicos. Conforme se indicou, o Extracto A exerceu um efeito anti-tumor sobre todos os tipos histológicos ensaiados. As linhas de células de tumor humano provenientes da bexiga apresentaram uma sensibilidade ao Extracto Δ que é mais fraca do que os restantes nove tipos histológicos. Determinou-se a concentração para a qual o extracto da planta eliminou 501 da população de células, o denominado valor de CI5o. O referido valor de CI50 encontra-se compreendido entre 0,5 pg/ml o 1 pg/ml para as linhas de células resultantes das linhas de células do pulmão e do pâncreas. Obteve-se um efeito anti-tumor mais importante com um valor de CI50 de 0,5-0,1 pg/ml para linhas de células de cancro de sarcoma, melanoma, glioma, pulmão, cabeça e pescoço e colorrectal. As células de cancro da próstata PC3 exibiram uma sensibilidade acentuada com um valor da CI5c na gama compreendida entre 0,01 e 0,05 pg/ml. 52

Conforme se ilustra na figura 1, o valor médio de CI5Q de 5 linhas de células de cancro da mama variou entre 0,5 e 1 μg/ml. O crescimento global das 5 linhas de células individuais de cancro da mama, T-47D, MDA-MB-231, ZR-75-1, MCF-7 e Hs578H, encontra-se ainda ilustrado na figura 2. As linhas de células T-47D, MDA-MB-231, ZR-75-1 e Hs578T apresentaram sensibilidades semelhantes ao Extracto A, enquanto que as células MCF-7 tinham o seu crescimento global reduzido mais rapidamente do que os restantes quatro modelos de cancro da mama.

Tal como se ilustrou na figura 1, o valor médio da CI5o das 7 linhas de células de cancro de sarcoma (ver o Quadro 2) variou entre 0,5 e 0,1 μg/ml. O crescimento global das linhas de células individuais é ainda ilustrado na figura 3. O Extracto A induziu o efeito anti-tumor mais importante sobre a linha de células A204. De facto, o valor da CI50 apareceu compreendido entre 0,1 e 0,05 μ9/ηα1. A linha de células Hs729 foi considerada como a menos sensível das 7 linhas de células de sarcoma. No entanto apresentou valores de CI50 para o Extracto A compreendidos entre 1 e 5 μg/ml.

Conforme se ilustra na figura 1, o valor médio de CI50 das 7 linhas de células de cancro pancreático (ver o Quadro 2) variou entre 0,5 e 0,1 pg/ml. Observaram-se crescimentos globais semelhantes para 6 das 7 linhas de cancro pancreático (Figura 4). Destas 7 linhas de células, a Pane—1 pareceu ser a mais sensível ao Extracto A e a Hs766T a menos. Os valores de CI50 destas duas 2 linhas variaram entre 0,1 e 0,5 pg/ml e entre 1 e 5 μς/πιΐ, respectivamente.

Conforme se ilustra na figura 1, o valor médio da Ciso das 5 linhas de células de cancro de melanoma (ver o Quadro 53 2) variou entre 0,5 e 0,1 μς/ιηΐ. O extracto de acordo com a invenção reduziu o crescimento global de todas as linhas de células de melanoma de mais de 60% para concentrações iguais ou superiores a 5 μς/ιηΐ (figura 5) . Malme-3M e G-361 eram as mais sensíveis das 5 linhas de células de melanoma. Elas exibiram um crescimento global similar, com o valor da Ciso compreendido entre 0,1 e 0,5 μα/ml.

Conforme se ilustra na figura 1, o valor médio da CI50 das 7 linhas de células de cancro do cólon (ver o Quadro 2) variou entre 0,5 e 0,1 μg/ml. Das diferentes linhas de células de cancro colorrectal ensaiadas (Figura 6) a linha LoVo tinha um valor de CI50 de cerca de 0,1 μg/ml e foi considerada como a linha colorrectal mais sensível. A linha de células de tumor SW948 foi considerada como sendo a menos sensível, com um valor de CI50 compreendido entre 0,5 e 1 μς/πιΐ.

Conforme se ilustra na figura 1, o valor médio da CI50 das 7 linhas de células de cancro de glioma humano (ver o Quadro 2) variou entre 0,5 e C,1 μg/ml. A Hs683 era a linha de células mais sensíveis ao extracto (Figura 7). O seu valor de CI50 era próximo de 0,05 μg/ml. Pelo contrário, o crescimento das células A172 não foi afectado pelo Extracto A para concentrações compreendidas entre 0,01 e 10 μς/πιΐ. O valor da CI50 variou entre 10 e 50 μg/ml.

Conforme se ilustra na figura i, o valer médio da CI50 das 2 linhas de células de cancro de pulmão humano de células não pequenas (NSCLC) variou entre 0,1 e 0,5 μς/ιηΐ. A figura 8 mostra que ambas as linhas foram sensíveis ao Extracto A. 54

Conforme se ilustra na figura 1, o valor médio da Cl50 das 2 linhas de células de cancro da bexiga humano (ver o Quadro 2} variou entre 50 e 100 pg/m.l. As 2 linhas exibiram diferenças acentuadas em termos de sensibilidade ao Extracto A. (Figura 9) . De facto, 5 pg/ml de extracto A reduziram o crescimento global da linha de células T24de mais do que 80% enquanto o crescimento global da linha de células J82 apenas foi reduzido de 32% para 100 pg/ml. A linha de células J82 pareceu ser muito fracamente sensível ao Extracto A.

Avaliou-se o crescimento global de 1 linha de células de cancro da próstata (a linha de células PC3) através do ensaio MTT quando as células tinham sido tratadas com Extracto A. 0 Extracto A induziu uma inibição no crescimento global de cerca de 90% para valores compreendidos entre 100 pg/ml e 0,5 pg/ml. Q valor da CI50 era de cerca de 0,1 pg/ml.

Conforme se ilustra na figura 1, o valor médio de CI5o das 5 linhas de células do cancro da cabeça e do pescoço variou entre 0,1 e 0,5 pg/ml. Observaram-se crescimentos globais semelhantes para 4 das 5 linhas de células do cancro da cabeça e do pescoço (Figura 11) . Destas 5 linhas de células, a SCC9 pareceu ser a menos sensível. Não obstante, apresentou valores de CI50 para o Extracto A de cerca de 5 pg/ml.

Em resumo, o Extracto A de acordo com a invenção exerce um efeito anti-tumor dramático sobre quarenta e seis das quarenta e oito linhas de células de cancro humano ensaiadas nas experiências descritas anteriormente. Estes efeitos anti-tumor correspondera a decréscimos acentuados do crescimento global destes modelos de cancro humano que representa um painel muito amplo de tipos histológicos. 55

Exemplo 3 Efeito de um extracto de acordo com a presente invenção sobre a cinética celular

Este exemplo ilustra o efeito citostático do Extracto A de acordo com a invenção. De acordo com as experiências realizadas por meio do ensaio coiorimétrico MTT descrito no exemplo 2, é evidente que o Extracto A reduz dramaticamente o crescimento global da maior parte das quarenta e oito linhas de células de cancro humano submetidas ao ensaio MTT. Nos exemplos que se seguem investigou-se se este extracto que induz o decréscimo do crescimento global corresponde quer a modificações que ocorrem nos níveis da cinética do ciclo celular (exemplo 3), ou à indução de apoptose (ver o exemplo 4), ou ambos. 0 ciclo celular encontrar-se de uma maneira geral dividido em diversas fazes que compreendem uma fase GO/Gl, S e G2/M. As modificações que têm lugar em torno das proteínas que controlam a proliferação celular e/ou a morte celular podem constituir um alvo para os compostos activos, presentes no Extracto A. As modificações da cinética do ciclo celular podem ser investigadas por meio de citometría de fluxo utilizando diferentes fluoróforos, isto é, iodeto de propídio, laranja de acridina e brometo de etídio, etc.. A citometría do fluxo permite que cada célula cancerosa (sem interrupção até vários milhares) seja localizada no ciclo das células.

Utilizam-se assim alterações do padrão de histograma do ADN para caracterizar o mecanismo de acção de diversos compostos terapêuticos. Os valores que resultam da análise de c.itometria de fluxo são processados graficamente ou matematicamente a fim. de derivar estimativas significativas 56 dos compartimentos Gl, S e G2/M. A maior parte do processamento matemático baseia-se em certos modelos e suposições.

Semearam-se linhas de células em frascos (área de 25 crrb) que contêm 7 ml de meio de cultura. Decorridas 48 horas de incubação à temperatura de 37 °C substituiu-se o meio de cultura de células por meio fresco em que se tinha dissolvido o Extracto A para concentrações que matam 50% (CI5o) , 30% (=CIso) e 10¾ (CI50) da população das células. Decorridas 24 ou 72 horas do tratamento colheram-se as células em suspensão, lavaram-se com Soro Fisiológico Tamponado com Fosfato (PBS) à temperatura de 4 °C e permeabilizaram-se com etanol a 70% (à temperatura de 4 °C) durante a noite à temperatura de -20 °C. Lavaram-se então as células com PBS e incubaram-se com uma solução de iodeto de propídio (80 pg/ml) durante 30 minutos à temperatura de 37 °C e em seguida mantiveram-se à temperatura de 4 °C durante a noite. Adicionou-se Ribonuclease A (3% V/V) para induzir uma ruptura do cordão duplo do ADN. 0 retrato do ciclo das células foi estabelecido para cada amostra. Utilizou-se um programa de computador específico incorporado no citómetro de fluxo para definir exactamente a percentagem de células nas diferentes fases do ciclo das células. Cada fase do ciclo das células foi referida em termos de superfície do pico e calculada como uma percentagem. A superfície do ciclo global das células foi de 1001. Realizou-se cada experiência 3 vezes. Calculou-se a percentagem média e cada fase diferente e o erro padrão da média relacionada. Comparou-se cada fase de ciclo celular de uma determinada condição com a mesma fase de ciclo celular de células de controlo, isto é células não tratadas. 57 0 Extracto A é altamente eficaz contra linhas de células de tumor humano. As concentrações utilizadas nas nossas experiências de citometria de fluxo foram escolhidas de acordo com os resultados MTT (exemplo 2} . Ensaiaram-se as cinco linhas de células de cancro humano Hs683 (glíoma), J82 (bexiga), A172 (glioma), RPMI (cabeça-e-pescoço) e HCT-15 (cólon) e determinaram-se as doses que matavam 10, 30 e 50 por cento das· células (Quadro 3) a fim de investigar se o Extracto A promovia uma acumulação numa das fases do ciclo celular quando as culturas foram tratadas durante 24 ou 72 horas com concentrações crescentes de Extracto A.

Quadro 3 Doses de Extracto A de acordo com a invenção que matam 10, 30 e 50% das células em cinco linhas de células

Linhas de células ci50 Cl 50 Ciso HCT-15 0,25 μg/ml 0,1 \xqíml 0,05 μ9/πι1 RPMI 0,25 μg/ml 0,1 μς/ιηΐ 0,05 μg/ml AI 7 2 25 μg/ml — 10 μg/ml J82 “-- 50 μg/ml 10 μς/ιηΐ Hs683 0,05 μg/ml — 0,025 μς/ιηΐ

As análises do ciclo das células HCT-15 (Figura 12) mostrou que a distribuição da população de células era similar ao controlo decorridas 24 horas de tratamento independentemente das concentrações ensaiadas. Por outro lado, apareceu uma população S proeminente das células tratadas com 0,25 pg/ml de extracto durante 72 horas. A fracção S representava 21% das células em controlo e atingiu 59% após tratamento com o Extracto A para a dose de 0,25 μς/πιΐ. O aumento da fracção S foi acompanhado por uma perda 58 de células na fracção G0/G1. A população G0/G1 sofreu um decréscimo acentuado de 71% para 29%.

As análises do ciclo de células RPMI (Figura 13) mostraram que a distribuição da população de células tratadas com o Extracto A para 0,05 μς/ιηΐ era semelhante ao controlo decorridas 24 horas de tratamento. Observou-se um aumento fraco na fase S a 0,1 e 0,25 μq/ml. Pelo contrario, ocorreu um aumento grande na população S quando se incubou a linha de células RPMI durante 72 horas com o Extracto A para as três concentrações ensaiadas. Havia cerca de 71%, 69% e 62% de células na fase S quando se ensaiou o Extracto A para 0,05 μμ/πιΐ, 0,1 μμ/ml e 0,25 μμ/πιΐ, respectivamente.

Concomitantemente, a percentagem de células na fase G0/G1 diminuiu acentuadamente e a fase G2/M aumentou ligeiramente, atingindo 29% da população de células.

Tratou-se a linha de células A172 com o Extracto A para 10 e 25 μς/ταί, o que corresponde à CIio e CI50. Os resultados (Figura 14) mostraram que quaisquer que fossem as concentrações ensaiadas o Extracto A induzia um aumento na fase G0/G1 após 24 horas de tratamento. Trinta e nove por cento das células encontravam-se na fase G0/G1 no controlo enquanto as células tratadas com o Extracto A atingiram 60%. Concomitantemente com a acumulação na fase G0/G1, observou-se uma ligeira acumulação na fase G2/M para a concentração mais elevada ensaiada. O efeito observado decorridas 24 horas de tratamento desapareceu decorridas 72 horas. Na verdade, não se observou qualquer alteração significativa nas diferentes fases do ciclo celular. A linha de células J82 é dificilmente sensível ao extracto (conforme o ensaio de MTT). As concentrações 59 escolhidas para a citometria de fluxo correspondiam a cerca de CIio e CI50 (Figura 15). Decorridas 24 horas de tratamento obteve-se uma ligeira acumulação na fase G0/G1 qualquer que fosse a concentração ensaiada. Por outro lado, 30 e 47%, respectivamente da população de células encontrava-se na fase S, quando as células foram tratadas durante 72 horas com o Extracto A para 50 e 100 μς/ιηΐ enquanto a condição de controlo atingia apenas 18%. Para 100 μρ/ιηΐ, foi igualmente possível observar uma acumulação na fase G2/M.

Decorridas 24 horas de tratamento com o Extracto A para 0,05 μς/ml as células Hs683 tinham acumulado na fase G0/G1 e atingiram 70% em comparação com o controlo (58%) (Figura 16). Observou-se concomitantemente uma redução da percentagem de células na fase S. Do mesmo modo, para ambas as concentrações, a maior parte das células encontravam-se na fase G0/G1 decorridas 72 horas de tratamento. Na verdade, rnais do que 60% das células encontravam-se nesta fase enquanto as células nesta fase no controlo representavam 46% da população de células.

Em conclusão, o Extracto A induz principalmente uma acumulação na fase G0/G1 e sob tais circunstâncias isto indica que o Extracto A tem um efeito citostático.

Exemplo 4 Efeito pró-apoptático de um extracto de acordo com a invenção

Este exemplo ilustra o efeito pró-apcptótico do Extracto A de acordo com a presente invenção. A morte das células pode ocorrer de duas maneias diferentes, quer acidentalmente ou programada geneticamente. 60 A morte acidental das células, também referida como necrose, ocorre essencíalmente como resulta de por exemplo, agressão física ou biológica. A apoptose refere-se à forma de morte das células que é a morte de células programadas geneticamente e que ocorre sob condições fisiológicas normais. Após a indução de apoptose, induz-se uma cascata de acontecimentos na célula, que compreende a activação dos receptores da morte da célula, a activação de uma série de proteases citosóiicas, a formação de corpos apoptóticos, e a fragmentação do ADN.

Investigou-se o efeito do Extracto A sobre a via de apoptose sobre quatro linhas de células de cancro humano: Hs683 (glioma), J82 (bexiga), A172 (glioma) e HCT-15 (cólon).

Semearam-se células em frascos (25 cm2 de área) contendo 7 ml de meio de cultura. Após uma incubação durante 48 horas à temperatura de 37 °C substituiu-se o meio de cultura das células por meio fresco no qual se dissolveu o Extracto A de acordo com a invenção para diferentes concentrações que matavam 50% e 30% da população de células. Decorridas 24 ou 72 horas de tratamento colheram-se as células em suspensão e contaram-se. Centrifugaram-se 250000 células durante 10 minutos a 1700 rpm à temperatura de 4 °C. Lavou-se o grânulo com PBS a temperatura de 4 °C e incubou-se com anexina V-FITC e uma solução de iodeto de propídio durante 15 minutos à temperatura de 4 °C no escuro. Para cada amostra, registou-se numa escala logarítmica aproximadamente 10000 células. Utilizou-se o programa de computadores incorporado no citómetro de fluxo para definir exactamente a percentagem de células em via apoptótíca e/ou necrótica e as células normais. Realizou-se cada experiência duas vezes. Calculou-se a média da percentagem quer a via apoptótica ou a via 61 necrótica e o erro padrão da média relacionada. Comparou-se cada condição com o controlo, que corresponde a células não tratadas.

Observou-se um aumento de quatro vezes de células apoptóticas HCT-15 quando as células foram tratadas com o Extracto Λ para 0,25 pg/ml durante 24 horas em comparação com as células de controlo (Figura 17). A linha de células Ά172 parecia encontrar-se envolvida na via de apoptose e de necrose quando as células foram tratadas durante 24 horas com o Extracto A para 25 pg/ml (Figura 18). Esta tendência manteve-se após 72 horas de tratamento. 0 tratamento com o Extracto A induziu a apoptose e células J82 de uma maneira dependente da concentração, que é particularmente evidente 72 horas após o tratamento (Figura 19) . Também se observou um aumento da percentagem de células necróticas para ambas as concentrações às 72 horas. Obteve-se um aumento de 2,5 vezes na percentagem de células apoptóticas Hs2683 após 24 horas de tratamento com o Extracto A para 0,025 pg/ml (Figura 20). Após 72 horas de tratamento a percentagem de células apoptóticas aumentou de uma maneira dependente da concentração.

Em conclusão, o Extracto A induz principalmente um aumento da percentagem de células apoptóticas. Obteve-se um efeito sobre a via de necrose sobre certas condições.

Exemplo 5 Dose máxima, tolerada no extracto de acordo a presente invenção

Mo presente exemplo, determinou-se o índice de MTD para o Extracto A de acordo com a invenção. A Dose Tolerada Máxima (MTD) de um dado fármaco é definida como a quantidade máxima 62 de um fárraaco que pode ser administrada de forma aguda, isto é, uma dose intraperitoneal, intravenosa, subcutânea ou uma dose individual per os, a animais saudáveis, isco é animais não enxertados com tumores.

As condições experimentais para determinar o índice de MTD do Extracto A foram as seguintes. Registaram-se os tempos de sobrevivência de murganhos, que não se encontram enxertados com um tumor, até 14 dias após a injecção. Utilizaram-se seis doses diferentes de Extracto A para a determinação do índice MT D. A dose administrada mais elevada aos murganhos que comportam o tumor foi de 160 mg/kg. Outras doses incluíam 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg e 80 mg/kg. Cada grupo experimental era constituído por dois murganhos para a determinação do índice MTD. O Quadro 4 mostra os resultados obtidos para o índice MTD utilizando o Extracto A.

Quadro 4 Determinação do índice MTD para o Extracto A de acordo com a invenção

Doses de extracto administrado (mg/kg) Dia 1 após a administração Dia 14 após a administração 1x5 - - 1 x 10 - - 1 x 20 - - 1 x 40 X 1 x 80 XX 1 x 160 XX em que x significa um murganho morto e ......... significa que todos os animais permaneceram vivos

De acordo com a definição dada anteriormente, o índice MTD para o Extracto A é de 20 mg/kg para uma única 63 administração em murganhos. Deste modo, o índice de Dose Máxima Tolerada (MTD) do Extracto A, com referência â quantidade máxima deste Extracto A, que pode ser administrada de maneira aguda a animais saudáveis, é de 20 mg/kg de extracto. Este valor indica que o Extracto A tem uma janela terapêutica ampla.

Exemplo 6 Efeitos in vivo de um extracto de acordo com a presente invenção avaliados sobre três modelos de cancro

Este exemplo ilustra os efeitos, in vivo, do Extracto A de acordo com a invenção sobre três modelos de cancro diferentes.

Estudaram-se os efeitos, in vivo, do Extracto A sobre murganhos enxertados com diferentes tipos de tumores, incluindo um cancro de linfoma, um cancro de melanoma e um cancro da mama. Avaliaram-se os efeitos, in vivo, com três tipos de parâmetros: - a toxicidade cumulativa, que é avaliada pelo registo dos pesos dos murganhos com tumor durante o tratamento - o efeito anti-tumor real exercido para o nível de crescimento do tumor que é avaliado pela medição do tamanho do tumor três vezes por semana por meio de um compasso calibrador. O crescimento real do tumor é expresso como uma área (mm2) mediante multiplicação dos dois diâmetros perpendiculares maiores. - o ganho de sobrevivência para os murganhos tratados, que é calculado por meio do índice T/C. Este índice é a razão entre o tempo médio da sobrevivência do grupo de murganhos tratados (T) e o do grupo de controlo (C) . O extracto é considerado como sendo activo se o valor de T/C for superior 64 a 130% (P<0,05), muito activo para o valor superior a 150% (P<0,01) e tóxico para o valor inferior a 70%.

Efeitos In vivo do Extracto A sobre um modelo de cancro de 1ínfoma

Avaliou-se o Extracto A sobre o modelo de cancro de linfoma agressivo P388. Numa primeira experiência compararam-se três doses, 10 mg/kg, 5 mg/kg e 2,5 mg/kg com o controlo. Inocularam-se por via subcutânea os murganhos com IO6 células P388 no dia DO e trataram-se nove vezes durante as três semanas seguintes nos dias D5, D7, D9, D12, D14, Dl6, Dl9, D21 e D23 após o enxerto. Cada grupo experimental continha nove murganhos. A figura 21A ilustra que o Extracto A não influenciou o peso do corpo dos murganhos. A figura 21B mostra que o Extracto A induziu significativamente um decréscimo do crescimento do linfoma P388. Os valores do indice T/C para a escala de administração de 7x10 mg/kg proporcionou um índice T/C de 111%, os valores do indice T/C para a escala de 6 x 5 mg/kg proporcionaram um indice T/C de 100% e os valores do índice T/C para a escala de 8 x 2,5 mg/kg proporcionaram, um índice T/C de 121%. Em conclusão, estes resultados indicaram que a administração de Extracto A reduziu o crescimento do cancro de linfoma P388 mas não prolongou significativamente a sobrevivência dos murganhos com linfoma P388 para as concentrações ensaiadas.

Um segundo conjunto de experiências, aumentou-se o número de administrações de nove para dezasseis, acompanhado por um decréscimo concomitante da dose por administração individual. As doses administradas por via subcutânea foram 65 de 2,5 rag/kg, 1,25 mg/kg e 0,63 mg/kg. O Extracto A foi administrado diariamente, cinco vezes por semana, durante cinco semanas consecutivas (5 x 5 = 25). A figura 22B mostra que estas doses de Extracto activo A de 0,63 mg/kg e 1,25 mg/kg tinham efeitos tóxicos desprezáveis dado que os murganhos com linfoma P388 não perderam qualquer peso durante o tratamento. A figura 22A mostra que o Extracto A reduz de maneira acentuada o crescimento do linfoma P388 para doses de tanto 0,63 mg/kg como 1,25 mg/kg. Além disso, os valores do índice T/C para a escala de administração de 15 x 2,5 mg/kg proporcionaram o índice T/C de 137%, que os valores do índice T/C para a escala de 15 x 1,25 mg/kg proporcionaram um índice T/C de 137% e que os valores do índice T/C para a escala de 13 x 0,63 mg/kg proporcionaram um índice T/C de 116%. Deste modo, as 15 administrações de 2,5 mg/kg de Extracto A e as 15 administrações de 1,25 mg/kg de Extracto A aumentaram signifícativamente a sobrevivência destes murganhos com linfoma P388 de 37%. Por consequência, os tratamentos para as doses de 2,5 mg/kg e 1,25 mg/kg com Extracto A prolongaram a sobrevivência dos murganhos com linfoma P388.

Em conclusão, o Extracto A de acordo com a invenção exerce efeitos anti-tumor significativos sobre o modelo de cancro de linfoma agressivo P388 sem qualquer perda de peso do corpo nos animais em questão. De igual modo, de maneira inesperada, o Extracto A de acordo com a invenção exerce uma actividade anti-tumor mais elevada quando ensaiado cronicamente para doses pequenas, isto é de cerca de 1,25 a 0,63 mg/kg, do que para doses elevadas, isto é de cerca de 10 mg/kg a 5 mg/kg. 66

Efeitos ín vivo do Extracto A sobre um modelo de cancro de melanoma

Avaliou-se o Extracto A sobre o modelo de cancro de melanoma agressivo B16. Administrou-se o Extracto A por vía subcutânea a murganhos para as doses de 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg e 0,63 mg/kg. Administrou-se o Extracto A diariamente, cinco vezes por semana, durante cinco semanas consecutivas. A figura 23A mostra que as doses administradas tinham efeitos tóxicos desprezáveis visto que os murganhos com melanoma BI6 não perderam qualquer peso do corpo durante o tratamento. A figura 23B mostra que as administrações de Extracto A distribuídas a 2,5 ou 1,25 mg/kg reduziram significativamente o crescimento do melanoma B16. Além disso, os valores do índice T/C para a escala de administração de 20 x 2,5 mg/kg proporcionaram um índice de T/C de 117%, os valores do índice T/C para a escala de 20 x 1,25 mg/kg proporcionaram um índice T/C de 117% e os valores do índice T/C para a tabela de 25 x 0,63 mg/kg proporcionaram um índice T/C de 140%'. Deste modo, o Extracto A reduziu o crescimento do melanoma BI 6 e prolongou de maneira significativa a sobrevivência dos murganhos com melanoma B16, especialmente quando o Extracto A foi administrado 25 vezes para 0,63 mg/kg quando se atingiu o nível de signifícância. CJm segundo conjunto de experiências, administrou-se o

Extracto A por via oral (per os). A figura 24A mostra que estas doses administradas tinham efeitos tóxicos desprezáveis visto que os murganhos com melanoma B16 não perderam qualquer peso do corpo durante o tratamento. A figura 24B mostra que as administrações de Extracto A per os a 2,5 ou 1,25 mg/kg reduziram 67 significativamente o crescimento do melanoma B16 até 25 dias após o enxerto. Além disso, os valores do índice T/C para a tabela de administração de 19 x 2,5 mg/kg mostraram um índice T/C de 114%, os valores do índice T/C para a tabela de 15 x 1,25 mg/kg apresentaram um índice T/C de 100% e os valores do índice T/C para a tabela de 16 x 0,63 mg/kg apresentaram um índice T/C de 1041. Deste modo, o Extracto A induziu um decréscimo do crescimento do tumor de melanoma B16 e prolongou ligei ramente a sobrevivência dos murganhos com melanoma B16 para 2,5 mg/kg.

Em conclusão, os dois conjuntos de experiências proporcionaram uma prova de que o Extracto A de acordo com a invenção exerce efeitos anti-tumor significativos sobre o modelo de melanoma BI 6 independentemente do modo de administração.

Efeitos in vivo do Extracto A sobre um modelo de cancro da mama

Avaliou-se o Extracto A sobre o modelo de cancro da mama MXT-HI, isto é uma variante de cancro da mama insensível às hormonas. O modelo MXT-HI corresponde a um carcinoma indiferenciado com processos metastáticos dramáticos em relação ao fígado. Corresponde, por consequência, a estágios clínicos tardios de cancro da mama humana. O MXT-HI representa um modelo de tumor biológico muito agressivo. 0 cancro da mama MXT-HI é induzido em murganhos mediante injecção subcutânea de fragmentos de tumor MXT nos flancos de murganhos B6D2F1. Sem tratamento, os murganhos inoculados morrem entre a quarta e a sétima semanas após a inoculação.

Ensaiou-se o Extracto A para 10 mg/kg, 5 mg/kg e 2,5 mg/kg 68 com nove administrações, isto é três vezes semanas durante três semanas consecutivas. A figura 25A indica que as diversas escalas de tratamento com Extracto A utilizadas pelas presentes experiências não induziram essencialmente quaisquer efeitos citotóxicos maiores visto que os murganhos com tumor MXT-HI não apresentaram uma perda significativa de peso. A figura 25B mostra que nove administrações de 2,5 mg/kg reduziram significativamente o crescimento do tumor MXT-HI. Os valores do índice T/C para a escala de administração 9 x 10 mg/kg proporcionaram um índice T/C de 103%, os valores dc índice T/C para a escala de 9 x 5 mg/kg proporcionaram um índice T/C de 103% e os valores do índice T/C para a tabela de 9 x 2,5 mg/kg proporcionaram o índice T/C de 119%. Deste modo, para a dose de 2,5 mg/kg, o Extracto A prolongou a sobrevivência dos murganhos com MXT-HI.

Na figura 26 indica-se o número de murganhos com cancro da mama MXT-HI, que morreram durante a experiência no controlo (não tratados) e grupos de ensaio (tratados com extracto). Utilizou-se a análise estatística de Kaplan--Meier e representa a taxa de mortalidade dos nove murganhos em cada grupo. O valor estatístico sublinha o ajustamento geral do grupo de ensaio em comparação com o ajustamento geral do grupo de controlo relativamente à sobrevivência.

Em conclusão, as experiências descritas anteriormente proporcionam prova de que o Extracto A exerce efeitos anti--tumor significativos sobre o tumor do cancro da mama MXT-HI. 69

Cqnclusoes do exemplo 6 0 Extracto A de acordo com a invenção tem um efeito anti-tumor significativo sobre os modelos de cancro ensaiados. Estes modelos representam um painel amplo de tipos de tumor de histológicos, incluindo carcinomas, linfomas e melanomas. Estes modelos são clinicamente relevantes visto que eles imitam os estágios clínicos específicos de cancros humanos. Ã parte disto, eles são igualmente biologicamente agressivos e invasivos visto que dois de entre eles formam dramaticamente metástases no fígado.

Embora tendo um efeito anti-tumor muito significativo, o Extracto A de acordo com a invenção exibe efeitos tóxicos desprezáveis visto que os murganhos com tumor não perderam peso do corpo durante os tratamentos. 0 extracto semi--purificado pode portanto incluir um "antídoto" além do composto anti-tumor responsável por todas as actividades anti-tumor referidas aqui.

De maneira surpreendente, o Extracto A induz actividades anti-tumor signifícativamente superiores quando ensaiado cronicamente para doses pequenas, isto é cerca de 1,25 a 0,63 mg/kg, do que para doses elevadas, isto é cerca de 10 mg/kg a 5 mg/kg.

Exemplo 7 Efeitos toxicológicos in vivo de um extracto de acordo com a presente invenção

Este exemplo ilustra os efeitos toxicológícos do Extracto A de acordo com a invenção, em particular a hematotoxicídade in vivo e a toxicidade geral. 70

Hematotoxicidade

Avaliou-se a hematotoxicidade estabelecendo perfis hematológicos para cada espécie animal. Dedícou-se uma atenção particular ao número de plaquetas sanguíneas, glóbulos vermelhos e leucócitos. Avaliou-se o efeito do Extracto A para duas doses, isto é 5 mg/kg e 1,25 mg/kg, pela administração intraperitoneal a murganhos. A tabela de administração foi de cinco administrações por semana para cinco semanas consecutivas do que resultou um número total de injecções de vinte cinco. Sacríficaram-se os animais três dias após a última injecção. Havia dez murganhos por grupo.

Quando comparados com o controlo (Figura 27), não se observaram quaisquer alterações estatisticamente significativas em relação aos parâmetros hematológicos após o tratamento com o Extracto A. Não se observaram quaisquer alterações significativas sobre o volume médio das células dos glóbulos vermelhos, a hemoglobina corpuscular média, a concentração média de hemoglobina corpuscular e as plaquetas após os tratamentos.

Toxicidade geral

Ensaiou-se histologicamente a toxicidade geral do Extracto A sobre murganhos por meio de análises histopatológicas convencionais de lâminas histológicas coradas com hematoxilina-eosina obtidas a partir de tipos diferentes de órgãos e tecidos. Avaliou-se o efeito do Extracto A para 5 mg/kg e para 1,25 mg/kg mediante administração intraperitoneal. A escala de administração foi de cinco administrações por semana durante cinco semanas consecutivas do que resultou um número total de injecções de 71 vinte cinco. Sacrificou-se os animais três dias após a última injecção. Isolou-se o cérebro, o coração, o fígado, o pâncreas, o estômago, os intestinos e os ovários. Havia dez murganhos por grupo. 0 exame dos órgãos recolhidos mostrou que o grupo de controlo (não tratado) não mostrou qualquer modificação particular nos órgãos. Também nos murganhos tratados o cérebro, o coração, o fígado, o pâncreas, o estômago, os intestinos e os ovários não foram afectados pelos tratamentos com o Extracto A para as doses de 5 mg/kg ou 1,25 mg/kg, o que é indicativo de que o Extracto A não tem o efeito tóxico geral.

Exemplo 8 Efeitos antitóxicos dos extractos de acordo com a presente invenção

Este exemplo ilustra o efeito anti-tóxico dos extractos de acordo com a invenção. Injectaram-se murganhos fêmeas com 4 a 5 semanas de idade com duas a quatro vezes a dose tolerável máxima dos dois fármacos anti-tumor bem. conhecidos e clínicamente utilizados (MTDx4) para adriamicina e (MTDx2) para vincristina. Aos murganhos administrou-se uma injecção intraperitoneal única com 40 mg/kg de peso do corpo de adriamicina ou uma injecção intraperitoneal única de 20 mg/kg de peso do corpo de vincristina no Dia 0. O lote 1 na figura 28 mostra a curva de sobrevivência dos murganhos injectados com quer a MTDx2 de vincristina ou a MTDx4 de adriamicina.

Injectou-se por via intraperitoneal o Extracto A de acordo com a presente invenção para a dose de 10 mg/kg de peso do corpo antes da injecção dos fármacos anti-tumor. Aplicaram-se as seguintes escaladas diferentes. 72 - Injectou-se o Extracto A no mesmo dia (isto é no Dia 0), mas 4 horas antes da injecção do composto terapêutico adriamicina ou vincrist.i na.. Os resultados deste tratamento são representados pelo lote 2, na Figura 28. - Injectou-se o Extracto A uma vez ao dia durante oito dias antes do dia da injecção do composto terapêutico adriamicina ou vincristína. Os resultados deste tratamento são representados pelo lote 3, na Figura 28. - Injectou-se o Extracto A uma vez ao dia durante oito dias antes do dia da injecção do composto terapêutico adriamicina ou vincristína e uma vez mais ao dia durante sete dias após a injecção dos fármacos anti-tumor. Os resultados deste tratamento são representados pelo lote 4, na Figura 28.

Como se pode ver na Figura 28, todas as escalas em que o Extracto A foi utilizado em combinação com um composto terapêutico prolongam significativamente a sobrevivência dos murganhos quando comparados com a injecção dos compostos terapêuticos como agentes individuais.

Um segundo exemplo ilustra o efeito anti-tóxico do Extracto A com uma outra escala de administração. Aos murganhos foi administrada uma injecção intraperitoneal individual com 20 mg/kg de peso do corpo de vincristína no Dia 0. O lote 1 na Figura 29 mostra a curva de sobrevivência dos murganhos injectados com vincristína.

Injectou-se o Extracto a por via intraperitoneal para uma dose de 10 mg/kg de peso do corpo antes ou ao mesmo tempo que a injecção do fármaco anti-tumor. Aplicaram-se as seguintes escalas diferentes. 73 - Injectou-se o Extracto A no mesmo dia (isto é no Dia 0), mas 6 horas antes da injecção do composto terapêutico vincristina. Os resultados deste tratamento são representados pelo lote 2, na Figura 29. - Injectou-se o Extracto A no mesmo dia (isto é no Dia 0), mas 4 horas antes da injecção do composto terapêutico vincristina. Os resultados deste tratamento são representados pelo lote 3, Figura 29. - Injectou-se o Extracto A no mesmo dia (isto é no Dia 0), mas 2 horas antes da injecção do composto terapêutico vincristina. Os resultados deste tratamento são representados pelo lote 4, Figura 29. - Injectou-se o Extracto A no mesmo dia (isto é no Dia 0) e ao mesmo tempo que a injecção do composto terapêutico vincristina. Os resultados deste tratamento são representados pelo lote 5, Figura 29. 0 parâmetro, que foi aplicado para a determinação do efeito protector, isto é anti-tóxico do Extracto A, sobre os efeitos tóxicos induzidos pelos fármacos anti-tumor consistiu no "prolongamento da sobrevivência". Realizou-se a análise estatística por meio das estatísticas de Kaplan--Meier. O nível de significância foi p<0,05.

Como se pode verificar na figura 29, a escala em que o Extracto A foi injectado 4 horas antes da injecção de vincristina (lote 3) prolonga significativamente a sobrevivência dos murganhos quando comparados com a injecção do composto terapêutico como agente individual.

Pode assim concluir-se que o Extracto A permite proteger de maneira significativa os murganhos dos efeitos tóxicos de uma dose mortal de um composto anti-tumor frequentemente 74 utilizado tal como adriamicina ou vincristina. 0 Extracto A de acordo com a invenção apresenta deste modo um efeito anti-tóxico, pelo que permite reduzir os efeitos tóxicos de compostos anti-tumor bem conhecidos.

Um terceiro exemplo ilustra o efeito anti-tóxico do Extracto B. Injectaram-se murganhos fêmeas com 4 a 5 semanas de idade com quatro compostos anti-tumor bem conhecidos e clinicamente utilizados: adriamicina, vincristina, oxaliplatina e camptotecina. Aos murganhos administrou-se uma injecção intraperitoneal única com 20 mg/kg de peso do corpo de adriamicina ou uma injecção intraperitoneal única de 20 mg/kg de peso do corpo de vincristina ou uma injecção intraperitoneal única de 40 mg/kg de peso do corpo de oxaliplatina ou uma injecção intraperitoneal única de 20 mg/kg de peso do corpo de camptotecina no Dia 0. O lote 1 nas Figura 30, Figura 31, Figura 32 e Figura 33 mostra a curva de sobrevivência dos murganhos injectados com quer adriamicina ou vincristina ou oxaliplatina ou camptotecina. O lote 2 nas figuras 30 a 33 mostra "ponto de sobrevivência" dos murganhos injectados com Extracto B a 10 mg/kg. 0 lote 3 nas figuras 30 à 33 mostra a curva de sobrevivência dos murganhos injectados por via intraperitoneal com o Extracto B a 10 mg/kg de peso do corpo no mesmo dia (isto é no Dia 0) mas 4 horas antes da injecção do composto terapêutico. 75

Como se pode ver nas figuras 30 a 33, o Extracto B utilizado em combinação com um composto terapêutico prolonga significativamente a sobrevivência dos murganhos quando se compara com a injecção do composto terapêutico como agentes individuais. 0 Extracto B não mostra propriedades citotóxicas. De facto, nenhum murganho morreu quando foi injectado com o Extracto B como agente individual. Realizou-se a análise estatística por meio da estatística de Kaplan-Meier. 0 nível de significância foi de p<0,05 para cada combinação de Extracto B e composto terapêutico.

Pode assim concluir-se que o Extracto B proporciona uma protecção significativa aos murganhos dos efeitos tóxicos de uma dose mortal de fármacos anti-tumor utilizados frequentemente. O Extracto B tem assim um efeito anti-tóxico, o que permite a redução dos efeitos tóxicos de fármacos anti-tumor bem conhecidos. A actividade antitóxica foi preservada no Extracto B tal como no Extracto A.

Um quarto exemplo ilustra o efeito anti-tóxico do

Extracto C. Utilizou-se o Extracto C em combinação com adriamicina para 20 mg/kg de peso do corpo. O lote 1 na figura 34 mostra a curva de sobrevivência dos murganhos ínjectados com 20 mg/'kg de peso do corpo de adriamicina. O lote 2 na figura 34 mostra a curva de sobrevivência dos murganhos ínjectados com Extracto C para 10 mg/kg no mesmo dia (isto é no Dia 0) mas 4 horas antes da injecção do composto terapêutico.

Como se pode ver na Figura 34, a injecção do Extracto C induziu um prolongamento significativo da sobrevivência dos murganhos em comparação com a injecção do composto 76 terapêutico como agente único. Pode assim concluir-se que o Extracto C. mostra propriedades anti-tóxicas tal como o Extracto B anterior.

Um. quinto exemplo ilustra o efeito anti-tóxico do Extracto D. Injectaram-se murganhos fêmeas com 4 a 5 semanas de idade com adriamícina. Aos murganhos administrou-se uma injecção única por via intraperítoneal coirt 20 mg/kg de peso do corpo de adriamícina no Dia 0 (Lote 1 na Figura 35) . O Lote 2 na figura 35 mostra a curva de sobrevivência dos murganhos injectados com o Extracto D por via intraperitoneal para uma dose de 5 mg/kg de peso do corpo no mesmo dia (isto é no Dia 0), mas 4 horas antes da injecção do composto terapêutico adriamícina.

Como se pode ver na figura 35, a injecção do Extracto D induziu um prolongamento significativo da sobrevivência dos murganhos em comparação com a injecção do composto terapêutico como agente individual. Pode assim concluir-se que o Extracto D mostra propriedades anti-tóxicas tal como o Extracto C anterior.

Em conclusão, estas experiências ilustram que os extractos purificados de acordo com a invenção prolongam de maneira significativa a sobrevivência dos murganhos quando comparados com os murganhos injectados com o composto terapêutico como agente individual. 0 Extracto D, o extracto mais purificado, mostrou propriedades anti-tóxicas sobre os efeitos tóxicos induzidos pelos fármacos anti-tumor.

Lisboa, 5 de Março de 2007

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição que compreende um extracto de Calotrcpis procera, e pelo menos um composto terapêutico escolhido de entre o grupo que consiste em um agente anticanceroso, um anticorpo citotòxico ou um seu fragmento, uma hormona citotóxica ou um seu fragmento e um péptído citotòxico ou um seu fragmento; para a preparação de um medicamento para o tratamento do cancro.
2. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 1., em que se obtém o referido extracto mediante utilização de um processo de extracção, que compreende as fases que consistem em: a) extracção do material inicial da referida planta Calotropis procera, sendo o referido material inicial escolhido de entre frutos, partes aéreas, partes subterrâneas, e suas misturas, no seio de um álcool alifático, mediante a dissolução do material inicial no referido álcool obtendo-se desse modo uma suspensão do referido material no referido álcool, agitação da referida suspensão e filtração da referida suspensão através de vidro sinterizado, obtendo-se desse modo um primeiro filtrado e uma primeira parte sólida; b) extracção da referida primeira parte sólida no seio de um álcool alifático obtendo-se desse modo um segundo filtrado e uma segunda parte sólida; c) mistura dos referidos, primeiro e segundo, filtrados obtendo-se desse modo um filtrado reunido, e evaporação do referido filtrado reunido sob vazio para se obter desse modo o referido extracto. 2
3. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 1. ou 2., em que o referido extracto compreende pelo menos dois compostos actívos escolhidos de entre o grupo que compreende asclepína, calactina, vorusharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, usharina, usharidina e 2"-oxo-vorusharina.
4. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 3., era que a proporção em peso entre extracto: composto terapêutico se encontra compreendida entre 0,001 : 1 e 1000 : 1.
5. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 4., em que o referido cancro é escolhido de entre o grupo que compreende cancro da mama, linfoma, sarcoma, cancro pancreático, melanoma, cancro colorrectal, glioma, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro da pele, cancro dos ossos, cancro dos ovários, cancro do sistema nervoso central, cancro renal, cancro do bexiga, cancro da cabeça e do pescoço, cancro da próstata, cancro do fígado e cancros hematológicos.
6. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 5., em que o(s) referido(s) composto (s) terapêutico(s) é(são) um agente anti-cancro.
7. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 6., em que o referido composto terapêutico é escolhido de entre o grupo que compreende adriamicina, alkeran, ara-c, bleomicina, carmustina, bussulfam, lomustxna, camptotecina, carboplatina, cisplatina, ciclofosfamida, citoxano, daunorubicína, dacarbazina, fluorouracilo, fludarabina, gernc.i tabina (gemzar) , herceptina, 3 hexametilmelamina, hydrea, i darrubicina, ifosfamida, irínotecan (camptosar, CPT-11), leustatin, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforano, naveIbine, azoto de mostarda, oxaliplatina, rituxano, imatinib, estreptozocina, taxoi, taxotere, topotecano (hicamtina), velbano, vincristina, etoposido, xeloda (capecitabina) ou zevelina.
8. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 6., em que o(s) referido (s) composto (s) terapêutico(s) é(são) um anticorpo citotóxico ou um seu fragmento.
9. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 6., em que o(s) referido (s) composto(s) terapêutico(s) é(são) uma hormona citotóxica ou um seu fragmento.
10. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 6., em que o(s) referido (s) composto(s) terapêutico(s) é(são) um péptido citotóxico ou um seu fragmento.
11. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 10., em que se administra o referido extracto antes, após ou ao mesmo tempo que o(s) referido(s) composto(s) terapêutico(s).
12. Processo de extracção para a obtenção de um extracto que comporta componentes biologicamente activos, que compreende as fases que consistem em: 4 a) extracção do material inicial da referida planta Calotropis procera, escolhendo-se o referido material inicial de entre frutos, partes aéreas, partes subterrâneas, e suas misturas, no seio de um álcool alifátíco, mediante dissolução do material inicial no referido álcool, obtendo-se desse modo uma suspensão do referido material no referido álcool, agitação da referida suspensão; e filtração da referida suspensão através de vidro sinterizado obtendo-se desse modo um primeiro filtrado e uma primeira parte sólida; b) extracção da referida primeira parte sólida no seio de um álcool alifátíco obtendo-se desse modo um segundo filtrado e uma segunda parte sólida; c) mistura dos referidos, primeiro e segundo, filtrados obtendo-se desse modo um filtrado reunido; e d) evaporação do referido filtrado reunido sob vazio para se obter desse modo o referido extracto.
13. Extracto activo isolado a partir do processo de acordo com a reivindicação 12..
14. Kit que compreende um recipiente no qual se encontra presente um extracto de Calotropis procera tal como definido em uma qualquer das reivindicações 1. a 11. e um recipiente no qual se encontra presente um composto terapêutico tal como definido na reivindicação 1.. Lisboa, 5 de Março de 2007