PT1560929E - Polinucleótidos para a amplificação e detecção de chlamydia trachomatis e neisseria gonorrhoeae - Google Patents
Polinucleótidos para a amplificação e detecção de chlamydia trachomatis e neisseria gonorrhoeae Download PDFInfo
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Description
ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
DESCRIÇÃO "POLINUCLEÓTIDOS PARA A AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE Chlamydia trachomatis E Neisseria gonorrhoeae"
CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a Chlamydia trachomatis. Em particular, o presente invento refere-se a composições de polinucleótidos e métodos para amplificação e detecção de Chlamydia trachomatis.
CONTEXTO DO INVENTO A Chlamydia trachomatis (C. trachomatis ou CT) é um agente causador de doenças sexualmente transmitidas vulgares. A CT causa linfogranuloma venéreo, várias patologias inflamatórias dos sistemas urogenitais masculino e feminino, e tracoma, uma doença crónica que afecta 500 milhões de pessoas e pode conduzir a cegueira. Quando não diagnosticada e tratada precocemente através de terapia adequada, a uretrite e cervicite induzidas por CT podem conduzir a uma variedade de inflamações crónicas, tais como, p.ex., vaginite, salpingite e inflamação pélvica que podem resultar em esterilidade e gravidez extra-uterina. Para além disso, os recém-nascidos de mães infectadas podem contrair infecções pulmonares e/ou oculares durante o parto.
Considerando o impacto que estes organismos têm, testes de diagnóstico rápidos e específicos são da maior importância. O diagnóstico com base em crescimento selectivo da bactéria patogénica tem sido o padrão, mas a cultura de células é demorada e muitos isolados clínicos são difíceis de crescer in vitro. A infecção com bactérias resulta na formação de uma variedade de anticorpos com especificidade de serogrupo, espécie, subespécie, serovar (serotipo) e auxotipo. 0 soro de pacientes com infecções do tracto genital foi utilizado para diagnosticar infecção por CT, no entanto ensaios baseados em marcadores serológicos são por natureza não quantitativos e sujeitos a dificuldades na interpretação. Por exemplo, os títulos de anticorpos podem ser indetectáveis em infecções agudas (falsos negativos), podem persistir em 2 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ indivíduos não infectados com uma história passada de infecção (falsos positivos) , podem produzir uma indicação falso-positiva devido à presença de espécies que reagem de forma cruzada (p.ex., infecção respiratória por diferentes espécies de Chlamydia) , ou podem não se desenvolver de todo (falsos negativos) dependendo de outros factores (Ngeow, Ann. Acad. Med. Singapore 25: 300, 1996; Black et al., J. Clin.
Microbiol. 29: 1312, 1991). Por estas razões, a serologia sozinha é inadequada para o diagnóstico de infecções por CT.
As infecções bacterianas podem também ser diagnosticadas através da detecção de sequências de ácido nucleico particulares ao organismo infeccioso. Dependendo da sequência de ácido nucleico seleccionada para detecção, um ensaio de diagnóstico pode ser específico para todo um género, mais de um género, uma espécie ou subespécie, um auxotipo, serovar (serotipo), uma estirpe ou outro subconjunto de organismos. Esta selectividade pode ser explorada no desenvolvimento de testes de diagnóstico de confiança simples para espécies de C. trachomatis de patogénios bacterianos. A EP 0630971 A divulga iniciadores e sondas oligonucleotídicos para a detecção de C. trachomatis incluindo GGGATTCCTG TAACAACAAG utilizado como iniciador directo, CCTCTTCCCC AGAACAATAA GAACAC utilizado como iniciador inverso e CATAGCACTA TAGAACTCTG CAAGCC utilizada como sonda de detecção, um método de detecção de C. trachomatis numa amostra através de amplificação por PCR utilizando tais iniciadores e sonda, e composições e estojos de PCR contendo estes oligonucleótidos.
Esta informação contextuai é proporcionada com o fim de tornar conhecida informação que o requerente crê ser de possível relevância para o presente invento. Não se pretende inevitavelmente admitir, nem como tal deve ser interpretado, que qualquer da informação precedente constitui técnica anterior contra o presente invento.
SUMÁRIO DO INVENTO reagentes Chlamydia O presente invento proporciona polinucleotídicos úteis para a detecção de 3 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ trachomatis. Em particular, o presente invento proporciona iniciadores e sondas para amplificação de ácidos nucleicos e procedimentos de detecção, que detectam especificamente e sensivelmente várias subespécies ou serotipos e auxotipos de C. trachomatis. O presente invento proporciona composições compreendendo um primeiro polinucleótido consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ NO:l, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 e um segundo polinucleótido consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:4. O presente invento proporciona também um conjunto iniciador/sonda seleccionado de entre os conjuntos iniciador/sonda que consistem em:
Conjunto de Iniciador e Sonda 1 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 2 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 3 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 4 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 5 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 6 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 7 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 7; Conjunto de Iniciador e Sonda 8 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 7; Θ Conjunto de Iniciador e Sonda 9 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 7 . O presente invento proporciona ainda um método de detecção de Chlamydia trachomatis numa amostra de teste, compreendendo o referido método: (a) a formação de uma mistura reaccional compreendendo reagentes de amplificação de ácidos nucleicos, uma amostra de teste potencialmente contendo uma sequência de Chlamydia trachomatis, e um conjunto iniciador/sonda, seleccionado de entre o grupo que consiste em:
Conjunto de Iniciador e Sonda 1 consistindo em SEQ NOs: 1, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 2 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 3 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 4 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 5 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 6 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 7 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 7; Conjunto de Iniciador e Sonda 8 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 7;e Conjunto de Iniciador e Sonda 9 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e ! 7 r 4 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ (b) a sujeição da mistura a condições de amplificação para gerar pelo menos uma cópia de uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo; (c) a hibridação da sonda com uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo, de modo a formar um híbrido compreendendo a sonda e a sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo; e (d) a detecção do híbrido como indicação da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste.
Adicionalmente, o presente invento proporciona um estojo compreendendo: (a) um conjunto iniciador/sonda, seleccionado de entre o grupo que consiste em:
Conjunto de Iniciador e Sonda 1 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 2 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 5; Conjunto κ · de Iniciador e Sonda 3 consistindo em (SEQ i ID NOs:3, 4 e u , Conjunto de Iniciador e Sonda 4 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 5 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 6 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 7 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 7; Conjunto de Iniciador e Sonda 8 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 7; Θ Conjunto de Iniciador e Sonda 9 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 7; e (b) reagentes de amplificação. O presente invento proporciona também um iniciador possuindo uma sequência consistindo em SEQ ID NO:4.
Os conjuntos iniciador/sonda aqui proporcionados compreendem dois iniciadores e são úteis para a amplificação de sequências alvo, p.ex., em PCR. Os iniciadores designados SEQ ID NOs:l-3 e SEQ ID NO: 4 amplificam especif icamente C. trachomatis.
As sequências aqui identificadas como SEQ ID NOs:5-7 são sequências sonda úteis para detecção de Chlamydia trachomatis amplificada, p.ex., quando Chlamydia trachomatis é amplificada através de iniciadores possuindo as sequências identificadas por SEQ ID NOs:l-3 e 4. 5 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
De preferência, ο conjunto de iniciador e sonda compreende duas sequências iniciadoras e uma sequência sonda. De maior preferência, o conjunto de iniciador e sonda é utilizado para PCR. Conjuntos iniciador/sonda específicos que podem ser empregues para amplificar e detectar C. trachomatis incluem os conjuntos iniciador/sonda 1-9, que são expostos abaixo. O método para detecção de C. trachomatis compreenderá (a) a formação de uma mistura reaccional compreendendo reagentes de amplificação de ácidos nucleicos, um conjunto iniciador/sonda tal como mencionado acima, e uma amostra de teste potencialmente contendo pelo menos uma sequência alvo; (b) a sujeição da mistura a condições de amplificação para gerar pelo menos uma cópia de uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo; (c) a hibridação da sonda com uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo, de modo a formar um híbrido compreendendo a sonda e a sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo; e (d) a detecção do híbrido como indicação da presença de C. trachomatis na amostra de teste.
Mais, quando a amplificação é PCR, ou um processo de amplificação de ciclos térmicos semelhante, o passo (b) pode ser repetido múltiplas vezes para aumentar o número de cópias da sequência alvo. De acordo com outra concretização, C. trachomatis pode ser detectada numa única mistura reaccional utilizando conjuntos iniciador/sonda, que consistem em SEQ ID NOs:1, 4 e 6.
Os polinucleótidos utilizados no presente invento podem também ser proporcionados como parte de um estojo útil para amplificação e/ou detecção de C. trachomatis. Os estojos compreendem um ou mais recipientes adequados contendo um ou mais conjuntos iniciador/sonda ou combinações iniciador/sonda de acordo com o presente invento, uma enzima possuindo actividade polimerásica e desoxinucleótidos-trifosfato. Pelo menos uma sequência possui de preferência um marcador.
Noutro aspecto do presente invento, um polinucleótido alvo de controlo e uma sonda polinucleotídica de controlo são incluídos em qualquer um dos métodos ou estojos aqui 6 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ proporcionados. Neste aspecto do presente invento, o conjunto iniciador é de preferência complementar à sequência alvo bem como ao alvo de controlo, enquanto a sonda alvo é de preferência substancialmente complementar apenas à sequência polinucleotidica alvo e a sonda de controlo é de preferência substancialmente complementar apenas ao alvo de controlo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento proporciona composições compreendendo polinucleótidos que podem hibridar especificamente com uma sequência de ácido nucleico, ou complemento desta, de Chlamydia trachomatis (C. trachomatis ou CT).
Estes polinucleótidos podem ser utilizados para amplificar Chlamydia trachomatis, e para detectar especificamente a presença de cada organismo para a exclusão do outro. Presentemente, são conhecidas dezasseis estirpes de Chlamydia trachomatis, e o método detecta adequadamente e especificamente todas as estirpes conhecidas. O termo "hibrida especificamente" tal como aqui se utiliza refere-se à capacidade de um ácido nucleico para se ligar de forma detectável e especificamente a um segundo ácido nucleico. Os polinucleótidos hibridam especificamente com cadeias de ácido nucleico alvo sob condições de hibridação e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não específicos. As condições rigorosas que podem ser utilizadas para alcançar hibridação específica são conhecidas na arte.
Uma "sequência alvo" ou "sequência de ácido nucleico alvo" tal como aqui se utiliza significa uma sequência de ácido nucleico de CT ou complementar desta, que é amplificada, detectada ou ambas amplificada e detectada utilizando um ou mais dos polinucleótidos aqui proporcionados. Adicionalmente, embora o termo sequência alvo se refira por vezes a uma sequência de ácido nucleico de cadeia dupla, os peritos na especialidade reconhecerão que a sequência alvo pode também ser de cadeia simples. Em casos onde o alvo é de cadeia dupla, as sequências iniciadoras polinucleotídicas do presente invento amplificarão de 7 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ preferência ambas as cadeias da sequência alvo. Pode ser seleccionada uma sequência alvo que seja mais ou menos especifica para um determinado organismo. Por exemplo, a sequência alvo pode ser especifica para um género inteiro; para mais de um género, para uma espécie ou subespécie, um serogrupo, auxotipo, serotipo, uma estirpe, um isolado ou outro subconjunto de organismos. As sequências polinucleotidicas do presente invento são seleccionadas pela sua capacidade para hibridarem especificamente com uma variedade de subespécies, ou serotipos ou auxotipos de CT. O termo "amostra de teste" tal como aqui se utiliza, significa uma amostra tomada de um organismo ou fluido biológico que é suspeito de conter ou potencialmente contém uma sequência alvo de CT. A amostra de teste pode ser tomada de qualquer origem biológica, tal como por exemplo, tecido, sangue, saliva, esputo, muco, suor, urina, esfregaços uretrais, esfregaços cervicais, esfregaços urogenitais ou anais, esfregaços da conjuntiva, fluido do cristalino ocular, fluido cerebrospinal, leite, fluido de ascites, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico, caldos de fermentação, culturas celulares, misturas de reacções químicas e semelhantes. A amostra de teste pode ser utilizada (i) directamente tal como obtida da origem ou (ii) após um pré-tratamento para modificar o carácter da amostra. Assim, a amostra de teste pode ser pré-tratada antes de utilizar, por exemplo, através de preparação de plasma ou soro do sangue, rompimento de células ou partículas virais, preparação de líquidos a partir de materiais sólidos, diluição de fluidos viscosos, filtração de líquidos, destilação de líquidos, concentração de líquidos, inactivação de componentes interferentes, adição de reagentes, purificação de ácidos nucleicos e semelhantes. O termo "marcador" tal como aqui se utiliza significa uma molécula ou porção possuindo uma propriedade ou característica que seja capaz de detecção e, opcionalmente, de quantificação. Um marcador pode ser directamente detectável, tal como, por exemplo (e sem limitação), com radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas, partículas coloidais, micropartículas fluorescentes e semelhantes; ou um marcador pode ser indirectamente 8 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ detectável, tal como, por exemplo, com membros de ligação específica. Será entendido que os marcadores directamente detectáveis podem requerer componentes adicionais tais como, por exemplo, substratos, reagentes desencadeadores, porções de extinção, luz e semelhantes para permitir a detecção e/ou quantificação do marcador. Quando são utilizados marcadores indirectamente detectáveis, são tipicamente utilizados em combinação com um “conjugado". Um conjugado é tipicamente um membro de ligação específica que foi unido ou conjugado com um marcador directamente detectável. As químicas de conjugação para síntese de um conjugado são bem conhecidas na especialidade e podem incluir, por exemplo, qualquer meio químico e/ou meio físico que não destrua a propriedade de ligação específica do membro de ligação específica nem a propriedade detectável do marcador. Tal como aqui se utiliza, "membro de ligação específica" significa um membro de um par de ligação, i.e., duas moléculas diferentes onde uma das moléculas, por exemplo, através de meios químicos ou físicos se liga especificamente à outra molécula. Para além dos pares de ligação específica antigénio e anticorpo, outros pares de ligação específica incluem, mas não se pretende que estejam limitados a, avidina e biotina; haptenos e anticorpos específicos para haptenos; sequências nucleotídicas complementares; cofactores ou substratos de enzimas e enzimas; e semelhantes.
Um polinucleótido, no contexto do presente invento, é um polímero de ácido nucleico de ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN), ARN ou ADN modificado, ou imitadores de ARN ou ADN (tais como, sem limitação PNAs) e derivados destes, e homólogos destes. Assim, polinucleótidos incluem polímeros compostos por nucleobases de ocorrência natural, açúcares e ligações covalentes internucleosídicas (esqueleto) bem como polímeros possuindo porções de ocorrência não natural que funcionem de forma semelhante. Tais polímeros de ácido nucleico modificados ou substituídos são bem conhecidos na especialidade e para os fins do presente invento, são referidos como "análogos". Para facilidade de preparação e familiaridade do perito, os polinucleótidos são de preferência polímeros modificados ou não modificados de ácido desoxirribonucleico ou ácido ribonucleico. 9 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
Análogos de polinucleótidos que são úteis no presente invento incluem polímeros com esqueletos modificados ou ligações internucleosídicas não naturais. De acordo com o presente invento, esqueletos modificados incluem os que mantêm um átomo de fósforo no esqueleto, tais como fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo e outros alquilos, bem como os que já não possuem um átomo de fósforo, tais como esqueletos formados por ligações internucleosídicas de alquilo ou cicloalquilo de cadeia curta, ligações internucleosídicas de heteroátomos mistos e de alquilo ou cicloalquilo, ou uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Um exemplo de tal esqueleto não contendo fósforo é uma ligação de morfolino (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5185444, 5034506 e 5142047). Tal como é conhecido na arte, polímeros de ácido nucleico modificados (análogos) podem conter uma ou mais porções açúcar modificadas. Por exemplo, as porções açúcar podem ser modificadas através de substituição na posição 2' com um grupo 2-metoxietoxi (2-MOE) (ver, por exemplo, Martin et al., Helv. Chim. Acta 78 : 486- 504 1995) . O presente invento contempla análogos que são imitadores de ARN ou ADN, nos quais tanto o açúcar como a ligação internucleosídica das unidades nucleotídicas são substituídos por grupos novos. Nestes imitadores as unidades base são mantidas para hibridação com a sequência alvo. Um exemplo de um tal imitador, que se mostrou ter propriedades de hibridação excelentes, é um ácido nucleico peptídico (PNA) (Nielsen et al., Science 254: 1497-1500, 1991; Pedido
Internacional de Patente WO 92/20702). Em compostos de PNA, o esqueleto de açúcar de um oligonucleótido é substituído por um esqueleto contendo amida, por exemplo um esqueleto de aminoetilglicina. As nucleobases são mantidas e ligadas directamente ou indirectamente aos átomos aza-azoto da amida.
Os polinucleótidos contemplados para utilizar no presente invento incluem ainda derivados em que a molécula de ácido nucleico foi covalentemente modificada através de substituição, por meio químico, enzimático ou outro apropriado com uma porção diferente de um nucleótido de 10 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ ocorrência natural, por exemplo, com uma porção que funcione como marcador, tal como aqui descrito. 0 presente invento engloba ainda a utilização de homólogos dos polinucleótidos possuindo sequências de ácido nucleico expostas em SEQ ID NOs:l-7. Os homólogos são ácidos nucleicos possuindo pelo menos uma alteração na sequência primária, que não destrói a capacidade do polinucleótido para hibridar especificamente com uma sequência alvo, tal como descrito acima. Concordantemente, uma sequência primária pode ser alterada, por exemplo, através de inserção, adição, deleção ou substituição de um ou mais dos nucleótidos, por exemplo, de SEQ ID NOs:l-7. Assim, os homólogos que são fragmentos de uma sequência divulgada em SEQ ID NOs:l-7 podem ter uma sequência consecutiva de pelo menos cerca de 7, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais nucleótidos das sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO:l-7, e manterão a capacidade para hibridar especificamente com uma sequência alvo, tal como descrito acima.
Vulgarmente, os homólogos terão uma sequência de ácido nucleico possuindo pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade da sequência de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico exposta SEQ ID NOs:l-7. A identidade em relação a tais sequências é aqui definida como a percentagem de nucleótidos na sequência candidata que são idênticos aos polinucleótidos conhecidos após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a percentagem de identidade máxima. Deleções, extensões ou inserções terminais (5' ou 3') ou internas na sequência nucleotidica não deverão ser entendidas como afectando a identidade.
Os polinucleótidos utilizados no presente invento compreendem assim iniciadores e sondas que hibridam especificamente com uma sequência alvo do presente invento, por exemplo as moléculas de ácido nucleico possuindo qualquer uma das sequências de ácido nucleico expostas em SEQ ID N0s:l-7, incluindo análogos e/ou derivados das referidas sequências de ácido nucleico, e homólogos destas, que podem hibridar especificamente com uma sequência alvo do presente invento. Tal como descrito abaixo, os polinucleótidos do 11 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ presente invento podem ser utilizados como iniciadores e/ou sondas para amplificar ou detectar Chlamydia trachomatis.
Os polinucleótidos utilizados de acordo com o presente invento podem ser preparados através de técnicas convencionais bem conhecidas dos peritos na arte. Por exemplo, os polinucleótidos podem ser preparados utilizando síntese em fase sólida convencional utilizando equipamento comercialmente disponível, tal como o disponível em Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, Califórnia), DuPont, (Wilmington, Del.) ou Milligen (Bedford, Mass.). Polinucleótidos modificados, tais como fosforotioatos e derivados alquilados, podem também ser facilmente preparados através de métodos semelhantes conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5464746; 5424414; e 4948882.
Os polinucleótidos utilizados de acordo com o presente invento podem ser empregues directamente como sondas para a detecção ou quantificação, ou ambas, de ácidos nucleicos de CT e/ou NG numa amostra de teste. A amostra de teste é posta em contacto com pelo menos um dos polinucleótidos do presente invento sob condições de hibridação adequadas e a hibridação entre a sequência alvo e pelo menos um dos polinucleótidos é então detectada através de métodos bem conhecidos na arte.
Os polinucleótidos utilizados no presente invento podem incorporar um ou mais marcadores detectáveis. Marcadores detectáveis são moléculas ou porções possuindo uma propriedade ou característica que possa ser detectada directamente ou indirectamente e são escolhidos para que a capacidade do polinucleótido para hibridar com a sua sequência alvo não seja afectada de forma adversa. Os métodos de marcação de sequências de ácido nucleico são bem conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, Ausubel et al., (1997 & actualizações) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley & Sons, New York).
Os marcadores de detecção têm a mesma definição que os "marcadores" anteriormente definidos e os "marcadores de captura" são tipicamente utilizados para separar produtos de extensão e sondas associadas com quaisquer tais produtos, de outros reagentes de amplificação. Os membros de ligação 12 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ específica (como anteriormente definidos) estão bem adequados a este fim. Também, as sondas utilizadas de acordo com este método podem ser bloqueadas nas suas extremidades 3' para que não sejam prolongadas sob condições de hibridação. Os métodos para impedir a extensão de uma sonda são bem conhecidos e são uma questão de escolha para um perito na arte. Tipicamente, a adição de um grupo fosfato à extremidade 3' da sonda bastará para fins de bloqueio da extensão da sonda.
Em casos onde os marcadores são empregues para detectar produtos amplificados por iniciadores, as sequências iniciadoras podem opcionalmente ser marcadas com um marcador de captura ou um marcador de detecção. A sequência da sonda é utilizada para hibridar com a sequência gerada pela sequência iniciadora e híbrida tipicamente com uma sequência que não inclui a sequência iniciadora. Semelhantemente à sequência iniciadora, a sequência da sonda pode também ser marcada com um marcador de captura ou um marcador de detecção com a restrição de que quando o iniciador é marcado com um marcador de captura, a sonda é marcada com um marcador de detecção, e vice-versa. Após formação dos híbridos sequência de cópia/sonda, os marcadores diferenciais (i.e., marcadores de captura e detecção) na sequência de cópia e na sequência da sonda podem ser utilizados para separar e detectar tais híbridos. Numa concretização do presente invento, a detecção é efectuada de acordo com os protocolos utilizados pela instrumentação de Abbott LCx® (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL) comercialmente disponível.
Os polinucleótidos utilizados de acordo com o presente invento são também adequados para utilizar como sondas de captura em ensaios de tipo sanduíche. As sondas de captura e os ensaios de hibridação em sanduíche são bem conhecidos na arte. Resumidamente, a sonda de captura polinucleotídica é unida a um suporte sólido e colocada em contacto com uma amostra de teste sob condições de hibridação adequadas para que se forme um híbrido sonda:alvo entre a sonda de captura e qualquer ácido nucleico alvo presente na amostra de teste. Após um ou mais passos de lavagem apropriados, o híbrido sonda:alvo é detectado, habitualmente por meio de uma segunda sonda de "divulgação" ou através de um anticorpo específico que reconheça a molécula híbrida. A utilização dos 13 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ polinucleótidos de CT e/ou NO do presente invento como sonda de captura ou sonda de divulgação, ou ambas, em tais ensaios de hibridação em sanduíche é assim considerada como estando dentro do âmbito do presente invento. O presente invento contempla também a utilização dos polinucleótidos em ensaios de hibridação de ácidos nucleicos modificados. Por exemplo, a Patente U.S. N°. 5627030 divulga um método para amplificar o sinal de detecção num ensaio de hibridação de ácidos nucleicos. No ensaio divulgado, uma primeira sequência de sonda polinucleotidica híbrida sob condições adequadas com uma sequência alvo, o híbrido sonda:alvo é subsequentemente imunocapturado e imobilizado. Uma segunda sonda polinucleotidica que contém muitas unidades de repetição de sequência híbrida então com o componente sonda do híbrido sonda:alvo. A detecção é alcançada através de hibridação de muitas sondas marcadas da sequência de ácido nucleico, uma para cada uma das unidades de repetição de sequência na segunda sonda. A união de múltiplas sondas marcadas à segunda sonda amplifica assim o sinal de detecção e aumenta a sensibilidade do ensaio. A utilização dos polinucleótidos do presente invento em ensaios de hibridação modificados deste tipo, directamente como primeira sonda, ou como segunda sonda após modificação para incorporar unidades de repetição de sequência adicionais através de técnicas padrão, é assim considerada como estando dentro do âmbito do presente invento.
i) Amplificação e detecção de sequências nucleotidicas de CT
Os polinucleótidos utilizados no presente invento são utilizados como iniciadores ou sondas para amplificar e/ou detectar CT numa amostra de teste. Os conjuntos iniciador/sonda aqui proporcionados compreendem dois iniciadores e pelo menos uma sonda. Estes conjuntos iniciador/sonda podem ser empregues de acordo com técnicas de amplificação de ácidos nucleicos. Deste modo, os iniciadores em qualquer conjunto iniciador/sonda particular podem ser empregues para amplificar uma sequência alvo. Na maioria dos casos, a sonda híbrida com as cópias da sequência alvo geradas por um dos iniciadores e geralmente facilita a detecção de quaisquer cópias da sequência alvo geradas 14 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ durante ο curso da reacção de amplificação. Todos os conjuntos iniciador/sonda podem ser empregues de acordo com procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos para detectar especificamente e sensivelmente CT quando são combinados os iniciadores e sondas apropriados. Está contemplado que os iniciadores e sondas individuais dos conjuntos iniciador/sonda aqui proporcionados podem ser alternativamente utilizados em combinação com iniciadores e/ou sondas diferentes dos descritos nos conjuntos iniciador/sonda aqui proporcionados.
Os procedimentos de amplificação são bem conhecidos na especialidade e incluem, mas não se limitam a, reacção em cadeia da polimerase (PCR), TMA, amplificação em circulo rolante, amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA), e amplificação por deslocamento da cadeia (SDA). Um perito na especialidade compreenderá que para utilizar em certas técnicas de amplificação pode ser necessário que os iniciadores sejam modificados, por exemplo, para SDA o iniciador compreende nucleótidos adicionais próximo da sua extremidade 5' que constituem um local de reconhecimento para uma endonuclease de restrição. Semelhantemente, para NASBA o iniciador compreende nucleótidos adicionais próximo da extremidade 5' que constituem um promotor de ARN-polimerase. Os polinucleótidos assim modificados são considerados como estando dentro do âmbito do presente invento.
Tal como é bem conhecido na arte, é necessário ter em consideração certos critérios quando se selecciona um iniciador para uma reacção de amplificação. Por exemplo, quando é necessário um par de iniciadores para a reacção de amplificação, os iniciadores devem ser seleccionados de modo a que a probabilidade de formação de duplexes 3' seja minimizada, e de modo a que as temperaturas de fusão (Tf) sejam suficientemente semelhantes para optimizar a ligação à sequência alvo e minimizar a quantidade de ligação não especifica. Neste contexto, os polinucleótidos de acordo com o presente invento são proporcionados em combinações que podem ser utilizadas como iniciadores em reacções de amplificação para amplificar especificamente sequências de ácido nucleico alvo. 15 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ Ο método de amplificação do presente invento compreende geralmente (a) a formação de uma mistura reaccional compreendendo reagentes de amplificação de ácidos nucleicos, pelo menos um conjunto iniciador/sonda do presente invento, e uma amostra de teste suspeita de conter pelo menos uma sequência alvo e (b) a sujeição da mistura a condições de amplificação para gerar pelo menos uma cópia de uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo. O passo (b) dos métodos de cima pode ser repetido um qualquer número adequado de vezes (antes do passo (c) no método de detecção), p.ex., através de ciclos térmicos da mistura reaccional entre 10 e 100 vezes, tipicamente entre cerca de 20 e cerca de 60 vezes, mais tipicamente entre cerca de 25 e cerca de 45 vezes.
Os reagentes de amplificação de ácidos nucleicos incluem reagentes que são bem conhecidos e podem incluir, mas não se limitam a, uma enzima possuindo pelo menos actividade polimerásica, cofactores enzimáticos tais como magnésio ou manganésio; sais; nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD); e desoxinucleótidos-trifosfato (dNTPs) tais como por exemplo desoxiadenina-trifosfato, desoxiguanina-trifosfato, desoxicitosina-trifosfato e desoxitimina-trifosfato.
Condições de amplificação são condições que promovem geralmente a ligação e extensão de uma ou mais sequências de ácido nucleico. É bem conhecido que tal ligação é dependente de um modo bastante previsível de vários parâmetros, incluindo temperatura, força iónica, comprimento da sequência, complementaridade e teor de G:C das sequências. Por exemplo, o abaixamento da temperatura no ambiente de sequências de ácido nucleico complementares promove a ligação. Para qualquer dado conjunto de sequências, a temperatura de fusão, ou Tf, pode ser estimada através de qualquer um de vários métodos conhecidos. Tipicamente, as aplicações de diagnóstico utilizam temperaturas de hibridação que são de cerca de 10°C (p.ex., 2°C a 18°C) abaixo da temperatura de fusão. A força iónica ou concentração de "sal" tem também impacto na temperatura de fusão, uma vez que os catiões pequenos tendem a estabilizar a formação de duplexes negando a carga negativa no esqueleto fosfodiéster. As 16 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ concentrações de sal típicas dependem da natureza e valência do catião mas são facilmente entendidas pelos peritos na arte. Semelhantemente, sabe-se também que o elevado teor de G:C e um maior comprimento da sequência estabilizam a formação de duplexes porque os emparelhamentos G:C envolvem 3 ligações de hidrogénio enquanto os pares A:T têm apenas duas e porque as sequências mais longas têm mais ligações de hidrogénio a manter as sequências juntas. Assim, um elevado teor de G:C e um maior comprimento da sequência têm um impacto nas condições de hibridação ao elevar a temperatura de fusão.
Uma vez seleccionadas as sequências para uma dada aplicação de diagnóstico, o teor de G:C e o comprimento serão conhecidos e podem contribuir para determinar com exactidão que condições de hibridação englobará. Uma vez que a força iónica é tipicamente optimizada quanto à actividade enzimática, o único parâmetro deixado variar é a temperatura. Geralmente, é seleccionada uma temperatura de hibridação próxima ou na Tf dos iniciadores ou da sonda. Assim, a obtenção de condições de hibridação adequadas para um determinado conjunto iniciador/sonda está bem dentro da vulgar perícia de um praticante desta arte.
Tal como mencionado acima, as sequências iniciadoras (SEQ ID NOs:l-4) de qualquer conjunto iniciador/sonda particular podem, por si próprias ou com polinucleótidos adicionais, ser utilizadas como iniciadores de amplificação de acordo com procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos bem conhecidos na arte. Tais reacções incluem, mas não se pretende que estejam limitados à reacção em cadeia da polimerase (PCR) descrita nas Patentes U.S. Nos. 4683195 e 4683202, à reacção em cadeia da ligase (LCR) descrita em EP-A-320308, e à LCR de intervalo (GLCR) descrita na Patente U.S. N° . 5427930. Cada uma destas reacções de amplificação exemplares gera múltiplas cópias de uma sequência alvo de ADN.
Numa concretização do presente invento, o método de detecção compreende geralmente (a) a formação de uma mistura reaccional compreendendo reagentes de amplificação de ácidos nucleicos, pelo menos um conjunto iniciador/sonda do presente 17 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ invento, e uma amostra de teste suspeita de conter pelo menos uma sequência alvo; (b) a sujeição da mistura a condições de amplificação para gerar pelo menos uma cópia de uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo; (c) a hibridação da sonda com uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo, de modo a formar um híbrido compreendendo a sonda e a sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo; e (d) a detecção do híbrido como indicação da presença da sequência alvo (CT e/ou NG e/ou uma sequência de controlo) na amostra.
Os amplicões específicos produzidos através de amplificação das sequências de ácido nucleico alvo utilizando os polinucleótidos do presente invento, tal como descrito acima, podem ser detectados através de uma variedade de métodos conhecidos na arte. Por exemplo, um ou mais dos iniciadores utilizados nas reacções de amplificação podem ser marcados de modo a que um amplicão possa ser directamente detectado através de técnicas convencionais subsequentes à reacção de amplificação. Alternativamente, uma sonda consistindo numa versão marcada de um dos iniciadores utilizados na reacção de amplificação, ou um terceiro polinucleótido distinto das sequências iniciadoras que foi marcado e é complementar a uma região da sequência amplificada, pode ser adicionada após a reacção de amplificação estar completa. A mistura é então submetida a condições de hibridação e lavagem apropriadas e o marcador é detecção através de métodos convencionais. O produto de amplificação produzido tal como acima pode ser detectado durante ou subsequentemente à amplificação da sequência alvo. Os métodos para detecção da amplificação de uma sequência alvo durante a amplificação estão delineados acima e são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° . 5210015. Pode ser empregue electroforese em gel para detectar os produtos de uma reacção de amplificação após o seu término. Alternativamente, os produtos de amplificação são hibridados com sondas, depois separados de outros componentes da reacção e detectados utilizando micropartículas e sondas marcadas. 18 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
Será facilmente apreciado que um procedimento que permite que a amplificação e detecção de sequências de ácido nucleico alvo ocorram concorrentemente num único vaso reaccional sem abertura será vantajoso. Um tal procedimento evitaria o risco de "transportar" contaminação para os passos de processamento pós-amplificação, e facilitaria também a pesquisa ou ensaios de elevada tiragem e a adaptação do procedimento a automação.
Para além disso, este tipo de procedimento permite a monitorização em "tempo real" da reacção de amplificação bem como a monitorização "final" mais convencional. O presente invento inclui assim a utilização dos polinucleótidos num método para amplificar e detectar especificamente sequências de ácido nucleico alvo numa amostra de teste no formato de um único tubo. Isto pode ser alcançado, por exemplo, incluindo no vaso reaccional um corante intercalante tal como SYBR Green ou um anticorpo que detecte especificamente a sequência de ácido nucleico amplificada. Alternativamente, pode ser incluído na reacção um terceiro polinucleótido distinto das sequências iniciadoras, que seja complementar a uma região da sequência amplificada, tal como quando é utilizado um conjunto iniciador/sonda do presente invento.
Para utilizar num ensaio tal como descrito acima, no qual tanto a amplificação com iniciadores polinucleotídicos como a detecção de sequências alvo utilizando uma sonda polinucleotídica, ocorrem concorrentemente num único vaso reaccional sem abertura, a sonda polinucleotídica necessita possuir certas propriedades. Por exemplo, uma vez que a sonda estará presente durante a reacção de amplificação, não deverá interferir com o progresso desta reacção e deverá ser também estável sob as condições reaccionais. Adicionalmente, para a monitorização de reacções em tempo real, a sonda deverá ser capaz de se ligar à sua sequência alvo sob as condições da reacção de amplificação e de emitir um sinal apenas após ligação a esta sequência alvo. Exemplos de moléculas sonda que são particularmente bem adequados a este tipo de procedimento incluem sondas de engodo molecular e sondas TaqMan®. 19 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ Ο presente invento contempla, portanto, a utilização dos polinucleótidos como sondas TaqMan®. Tal como é conhecido na arte, as sondas TaqMan® são sondas de ácido nucleico fluorogénicas duplamente marcadas compostas por um polinucleótido complementar à sequência alvo que é marcada no seu terminal 5' com um fluoróforo e no seu terminal 3' com um extintor. As sondas TaqMan® são tipicamente utilizadas como sondas em tempo real em reacções de amplificação. Na sonda livre, a intima proximidade do fluoróforo e do extintor asseguram que o fluoróforo é extinto internamente. Durante a fase de extensão da reacção de amplificação, a sonda é clivada através da actividade nucleásica 5' da polimerase e o fluoróforo é libertado. O fluoróforo libertado pode então fluorescer e assim produzir um sinal detectável. O presente invento contempla ainda a utilização dos polinucleótidos como sondas "de engodo molecular". As sondas de engodo molecular são bem conhecidas na arte, por exemplo, ver Patentes U.S. Nos. 6150097; 5925517 e 6103476. Basicamente, os engodos moleculares são sondas polinucleótidicas capazes de formar uma estrutura caule-volta (gancho). A volta é uma estrutura de cadeia simples contendo sequências complementares à sequência alvo, enquanto o caule tipicamente não está relacionado com a sequência alvo e auto-hibrida para formar uma região de cadeia dupla. Os nucleótidos que são complementares à sequência alvo e podem auto-hibridar podem também fazer parte da região caule. Unido a um braço do caule está uma porção fluorófora e ao outro braço uma porção extintora. Quando o polinucleótido adopta uma forma em gancho, o fluoróforo e o extintor estão em intima proximidade e a energia emitida pelo fluoróforo é assim absorvida pelo extintor e oferecida como calor, resultando em extinção interna do fluoróforo. Após ligação do polinucleótido à sua sequência alvo, o fluoróforo e o extintor tornam-se espacialmente separados e fluoróforo pode fluorescer produzindo um sinal detectável. De preferência, os iniciadores e as sondas do presente invento são seleccionados para que a sonda se ligue estavelmente (p.ex., sejam deslocados menos de 5% da sonda ligada ao amplicão em 24 horas sob as condições de hibridação para a sonda com o amplicão) ao amplicão quando a reacção é arrefecida de uma temperatura de desnaturação, p.ex., de 90°C a 96°C, até uma 20 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ temperatura abaixo da Tf para a ligaçao da sonda com o amplicão. O presente invento contempla ainda a utilização de polinucleótidos utilizados no presente invento como sondas lineares em conjunto com um fluoróforo e um extintor de elevada eficiência, tal como Black Hole Quenchers (BHQ™; Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA). Tal como é conhecido na arte, a elevada eficiência de extinção e a falta de fluorescência nativa dos corantes BHQ™ permite que ocorra extinção “random-coil" em sondas lineares marcadas num terminal com um fluoróforo e no outro com um corante BHQ™ assegurando assim que o fluoróforo não fluoresce quando a sonda está em solução. Após ligação à sua sequência alvo, a sonda alarga-se, o fluoróforo e o extintor ficam assim espacialmente separados e o fluoróforo fluoresce. Um perito na especialidade apreciará que os corantes BHQ™ podem também ser utilizados como a porção extintora nas sondas de engodo molecular ou TaqMan®.
Fluoróforos e extintores adequados para utilizar com os polinucleótidos utilizados no presente invento podem ser facilmente determinados por um perito na especialidade (ver também, Tyagi et al., Nature Biotechnol. 16: 49-53, 1998; Marras et al., Genet. Anal.: Biomolec. Eng. 14: 151-156, 1999). Muitos fluoróforos e extintores estão comercialmente disponíveis, por exemplo em Molecular Probes (Eugene, OR) ou Biosearch Technologies, Inc. (Novato, CA). Exemplos de fluoróforos que podem ser utilizados no presente invento incluem, mas não se limitam a, fluoresceína e derivados de fluoresceína tais como um di-halo-(Ci a Cs)dialcoxicarboxi-fluoresceína, ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS), cumarina e derivados de cumarina, amarelo Lúcifer, vermelho Texas, tetrametilrodamina, tetracloro-6-carboxifluorosceína, 5-carboxirodamina, corantes de cianina e semelhantes. Extintores incluem, mas não se limitam a, DABCYL, ácido 4'-(4-dimetilaminofenilazo)benzóico (DABSYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida (DABMI), tetrametilrodamina, carboxtetrametilrodamina (TAMRA), corantes BHQ™ e semelhantes. Os métodos de união de fluoróforos e extintores a ácidos nucleicos são bem conhecidos na arte. 21 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
Numa concretização do presente invento, as sondas são sondas de engodo molecular. Tal como é conhecido na especialidade, é necessário verificar certos critérios para que uma sonda de engodo molecular tenha sucesso na monitorização ou detecção de uma reacção de amplificação. O presente invento proporciona, portanto, sondas de engodo molecular que compreendem polinucleótidos do presente invento juntamente com regiões flanqueadoras auto-complementares. Os polinucleótidos do presente invento podem constituir a região de volta do engodo molecular, ou podem constituir a região de volta e parte da região de caule. Assim, as sequências de caule auto-complementares podem não estar relacionadas com a sequência alvo ou podem conter um ou mais nucleótidos que sejam complementares à sequência alvo.
Um perito na especialidade compreenderá que a selecção de iniciadores a utilizar com a sonda de engodo molecular requer também que sejam verificados certos critérios. Por exemplo, é importante que não existam áreas de complementaridade que possam fazer com que o engodo molecular se ligue a um iniciador, o que resultaria num elevado sinal de fundo. O presente invento proporciona: combinações, compreendendo dois iniciadores e pelo menos uma sonda, que podem ser utilizadas para amplificar e detectar especificamente sequências de ácido nucleico numa amostra de teste. Numa concretização relacionada, são proporcionados conjuntos iniciador/sonda para a amplificação e detecção de sequências de ácido nucleico alvo através de PCR com engodo molecular.
Tal como é conhecido na arte, as sondas de engodo molecular podem ser utilizadas para monitorizar o progresso de uma reacção de amplificação em tempo real. Durante o curso de uma reacção de amplificação, tal como uma PCR, o engodo molecular interage com a sua sequência alvo na temperatura de ligação para a sonda, e é gerado um sinal fluorescente. Como o número de cadeias alvo produzidas na reacção de amplificação aumenta, o número de engodos moleculares ligados ao seu alvo aumenta concomitantemente, tal como a força do sinal fluorescente. 22 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
Portanto, de acordo com o presente invento, as combinações de dois iniciadores e pelo menos uma sonda, tal como descrito acima, podem ser utilizadas em amplificação final e ensaios de detecção, em que a força do sinal detectável é medida na conclusão da reacção de amplificação, ou em amplificação em tempo-real e ensaios de detecção, nos quais a força do sinal detectável é monitorizada através do curso da reacção de amplificação. São conhecidos na especialidade vários tipos de padrões de ensaios quantitativos. Por exemplo, o padrão pode consistir numa curva padrão compilada por amplificação e detecção de quantidades conhecidas de ácidos nucleicos de CT sob as condições de ensaio. Alternativamente, pode ser incluido na reacção um padrão interno. Tais padrões internos compreendem geralmente uma sequência de ácido nucleico alvo de controlo e uma sonda polinucleotídica de controlo. O padrão interno pode ainda incluir opcionalmente um par adicional de iniciadores. A sequência primária destes iniciadores de controlo pode não estar relacionada com os polinucleótidos do presente invento e ser especifica para a sequência de ácido nucleico alvo de controlo.
Alternativamente, não necessita de ser utilizado qualquer iniciador adicional se a sequência alvo de controlo for desenhada para se ligar numa extremidade com um iniciador de um primeiro conjunto iniciador/sonda dirigido a uma primeira sequência alvo (por exemplo, CT) e ligar-se na outra extremidade com um iniciador para um segundo conjunto iniciador/sonda dirigido a uma segunda sequência alvo (por exemplo, NG), de modo a que sejam geradas cópias sob condições de amplificação.
No contexto do presente invento, uma sequência de ácido nucleico alvo de controlo é uma sequência de ácido nucleico que: (a) pode ser amplificada através de um iniciador ou par de iniciadores de CT a utilizar numa determinada reacção ou através de iniciadores de controlo distintos; (b) híbrida especificamente com a sonda de controlo sob condições adequadas; e (c) não híbrida com uma sonda específica de CT sob as mesmas condições. 23 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
No contexto do presente invento, para além de satisfazer os requisitos padrão para moléculas sonda, a sonda polinucleotidica de controlo para utilizar em reacções de quantificação: (a) híbrida especificamente com a sequência de controlo sob condições adequadas; (b) não híbrida com uma sequência de CT, com a sonda específica de CT ou com os iniciadores específicos de CT sob as mesmas condições, quando se está a detectar uma sequência alvo de CT; (c) incorpora um marcador detectável que é distinto do marcador incorporado noutras sondas (por exemplo sondas de CT) em utilização na mesma mistura reaccional. Os sinais gerados por estes vários marcadores quando se ligam às suas respectivas sequências alvo podem assim ser distinguidos e quantificados separadamente.
Um perito na especialidade reconhecerá que a sequência de ácido nucleico real da sequência de ácido nucleico alvo de controlo e a sonda de controlo não é importante desde que verifiquem ambas os critérios delineados acima.
No contexto do presente invento, a quantidade de ácido nucleico alvo numa amostra de teste pode ser quantificada utilizando métodos "finais" ou métodos em "tempo real". Um perito na especialidade apreciará que quando utilizados como sondas específicas de CT em ensaios quantitativos, os polinucleótidos do presente invento podem ser sondas de hibridação convencionais, sondas BHQ™ lineares, sondas TaqMan®, sondas de engodo molecular, ou combinações ou versões modificadas destas. Numa concretização do presente invento, os polinucleótidos são utilizados como sondas de engodo molecular. O presente invento contempla também o proporcionar de qualquer um ou mais dos conjuntos iniciador/sonda do presente invento juntamente com uma sequência de ácido nucleico alvo de controlo, que pode ser amplificada pelo par de iniciadores especificado, e uma sonda polinucleotídica de controlo para as reacções quantitativas. O presente invento proporciona ainda a inclusão de iniciadores de controlo, que amplificam especificamente a sequência de ácido nucleico alvo de 24 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ controlo, nas reacções quantitativas. Os métodos de amplificação e/ou detecção nos quais os polinucleótidos de acordo com o presente invento podem ser empregues são adequados para adaptação como ensaios de elevada tiragem. Os ensaios de elevada tiragem proporcionam a vantagem de processamento de muitas amostras simultaneamente e diminuem significativamente o tempo necessário para pesquisar um grande número de amostras. O presente invento contempla, portanto, a utilização da composição de polinucleótidos do presente invento em pesquisa ou ensaio de elevada tiragem para detectar e/ou quantificar ácidos nucleicos de CT numa pluralidade de amostras de teste.
Para ensaios de elevada tiragem, os componentes da reacção são habitualmente guardados num suporte ou plataforma de múltiplos recipientes, tal como uma placa de microtitulação de múltiplos poços, que permita que uma variedade de reacções de ensaio contendo diferentes amostras de teste seja monitorizada no mesmo ensaio. O presente invento contempla também ensaios de elevada tiragem altamente automatizados para aumentar a eficiência do processo de pesquisa ou ensaio. Muitos sistemas de pesquisa ou ensaio de elevada tiragem estão actualmente comercialmente disponíveis, tal como o estão capacidades de automatização para muitos procedimentos tais como pipetagem de amostras e reagentes, dispensa de líquidos, incubações temporizadas, formatação de amostras em microarrays, ciclos térmicos em microplacas e leituras em microplacas num detector apropriado, resultando em tempos de tiragem muito mais rápidos.
Os conjuntos iniciador/sonda de acordo com o presente invento podem ser proporcionados como parte de um estojo que permita a detecção e/ou quantificação de ácidos nucleicos de CT. Tais estojos compreendem um ou mais dos conjuntos iniciador/sonda do presente invento.
Numa concretização do presente invento, os polinucleótidos são proporcionados nos estojos em combinações para utilizar como iniciadores para amplificar especificamente ácidos nucleicos de CT numa amostra de teste. Numa concretização relacionada, os polinucleótidos são proporcionados em combinações que compreendem as sequências 25 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ de ácido nucleico tal como expostas em SEQ ID NOs:1 e 4; e/ou SEQ ID NOs:8 e 9.
Noutra concretização, nos estojos os conjuntos iniciador/sonda compreendem sequências de ácido nucleico tal como expostas em SEQ ID NOs:1,4 e 5; SEQ ID NOs:2,4 e 5; SEQ ID NOs:3,4 e 5, SEQ ID NOs:l,4 e 6; SEQ ID NOs:2,4 e 6.
Os estojos para a detecção de ácidos nucleicos de CT podem conter adicionalmente uma sequência de ácido nucleico alvo e uma sonda polinucleotídica de controlo. Assim, numa concretização do presente invento, os estojos compreendem uma das combinações de polinucleótidos de cima compreendendo pelo menos dois iniciadores e pelo menos uma sonda, juntamente com uma sequência de ácido nucleico alvo, que pode ser amplificada através do par de iniciadores especificado, e uma sonda polinucleotídica de controlo. O presente invento proporciona ainda estojos que incluem iniciadores de controlo, que amplificam especificamente a sequência de ácido nucleico alvo de controlo.
Os estojos podem incluir opcionalmente reagentes de amplificação, componentes de reacção e/ou vasos reaccionais. Tipicamente, pelo menos uma sequência possui um marcador, mas a detecção é possível sem este. Assim, um ou mais dos polinucleótidos proporcionados no estojo podem ter um marcador detectável incorporado ou o estojo pode incluir reagentes para marcação dos polinucleótidos. Um ou mais dos componentes do estojo podem ser liofilizados e o estojo pode compreender ainda reagentes adequados para a reconstituição dos componentes liofilizados. O estojo pode conter adicionalmente instruções para utilização. A composição de polinucleótidos, métodos e estojos do presente invento são úteis em cenários clínicos ou de investigação para a detecção e/ou quantificação de ácidos nucleicos de CT. Assim, nestes cenários os polinucleótidos podem ser utilizados em ensaios para diagnosticar infecção de CT num sujeito, ou para monitorizar a quantidade de uma sequência de ácido nucleico alvo de CT num sujeito infectado 26 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ com CT. A monitorização da quantidade de bactérias num sujeito é particularmente importante na identificação ou monitorização da resposta à terapia anti-bacteriana.
Os iniciadores e as sondas úteis para amplificação e/ou detecção de Chlamydia trachomatis (CT) ou Neisseria gonorrhoeae (NG)* são apresentados abaixo na Tabela 1. TABELA 1
Polinucleótido Sequência (5'-3') SEQ ID NO Iniciador directo de CT GCGATTCCTG TAACAACAAG TCAGG 1 Iniciador directo de CT alternativo GGGATTCDTG TAACAACAAG TCAGG (em que D não é C) 2 Concretização preferida de SEQ ID NO:2 GGGATTCGTG TAACAACAAG TCAGG, 3 Iniciador inverso de CT GCTTGCACGA AGTACTCTAAG GAG 4 Sonda de CT ATAGCACTAT AGAACTCTGC AA 5 Sonda de CT alternativa CATAGCACTA TAGAACTCTG CAAGCC 6 Sonda de engodo de CT ctggcATAGC ACTATAGAAC TCTGCAAgcc ag 7 Iniciador directo de NG* CGACGTACCG GTTTTTGTTC 8 Iniciador inverso de NG* CGGCTCCTTA TTCGGTTTGA CC 9 Sonda de NG* ACACCGCCCG GAACCCGA 10 Sonda de NG alternativa* GAAACACCGC CCGGAACCCG AT 11 Sonda de engodo de NG* ctcggACACC GCCCGGAACC CGAg 12 *não é do invento reivindicado
Na Tabela 1, as sequências polinucleotidicas sonda complementares às sequências bacterianas estão indicadas em letras maiúsculas; os nucleótidos em minúsculas são auto-complementares para formar um caule de uma sonda de engodo sob condições adequadas; e nalguns casos, os nucleótidos complementares às sequências bacterianas fazem também parte do caule da sonda de engodo auto-complementar.
Os ácidos nucleicos possuindo sequências polinucleotidicas da Tabela 1 podem ser combinados em combinações adequadas para formar um conjunto iniciador/sonda útil no contexto do presente invento. Conjuntos iniciador/sonda adequados incluem, mas não se limitam a: 27 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
Conjunto de Iniciador e Sonda 1 SEQ ID NOs:1, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 2 SEQ ID NOs:2, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 3 SEQ ID NOs:3, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 4 SEQ ID i—1 M o 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 5 : SEQ ID NOs:2 t 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 6 SEQ ID NOs:3, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 7 SEQ ID NOs:1, 4 e 7; Conjunto de Iniciador e Sonda 8 SEQ ID NOs:2, 4 e 7; e Conjunto de Iniciador e Sonda 9 SEQ ID NOs:3, 4 e 7 φ
Os seguintes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não deverão ser entendidos como limitando de modo algum o âmbito deste invento.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos demonstram a detecção de vários subtipos de CT e NO utilizando os conjuntos iniciador/sonda descritos acima. Estes iniciadores e sondas de ADN compreendendo os conjuntos iniciador/sonda são identificados como SEQ ID NOs: 1-7 e são específicos para CT.
Nos seguintes exemplos, SEQ ID NOs:1 e 4 são utilizadas como iniciadores de amplificação de consenso específicos para a sequência alvo de CT. SEQ ID NO: 6 ou 7 é utilizada como sonda de hibridação interna de consenso para o produto de amplificação de CT. A parte dos exemplos que se refere à detecção de NG não faz parte do invento reivindicado. EXEMPLO 1
PREPARAÇÃO DE INICIADORES E SONDAS A. Iniciadores de Consenso de CT e NG
Os iniciadores de consenso foram desenhados para detectar todos os subtipos de CT conhecidos através de PCR de hibridação de oligonucleótidos. Nos seguintes exemplos, estes iniciadores foram SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:4 para CT, e SEQ ID NO: 8 e SEQ NO: 9 para NG. Verificou-se que SEQ ID NO:3 tem 28 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ algumas vantagens relativamente a SEQ ID NO:l para algumas concretizações do presente invento, que se referem à facilidade de purificação destes polinucleótidos. No entanto, essas concretizações não estão ilustradas abaixo, e os inventores preferem a utilização de SEQ ID NO:l à utilização de SEQ ID NO:3.
B. Sondas de Consenso de CT
Foram desenhadas sondas de consenso para hibridar com a sequência alvo amplificada de CT ou NG através de hibridação de oligonucleótidos. Estas sequências sonda foram modificadas para utilizar como sondas num ensaio de engodo molecular através da adição de nucleótidos terminais para gerar extremidades 5' e 3' auto-complementares, e de porções fluorescentes (fluo) e extintoras em extremidades opostas do polinucleótido (ver Tabela 2). Assim a sequência da sonda de CT de SEQ ID NO:6 foi a base da sonda de engodo molecular de SEQ ID NO:7, e a sequência da sonda de NG de SEQ ID NO:10 foi a base da sonda de engodo molecular de SEQ ID NO:12. Quando foi utilizada mais de uma sonda de engodo simultaneamente no mesmo ensaio de engodo molecular, porções fluorescentes com diferentes perfis de excitação-emissão foram utilizadas para distinguir entre os diferentes sinais das sondas.
As sequências das sondas foram sintetizadas utilizando metodologia padrão de síntese de oligonucleótidos. TABELA 2
Sequência (5'-3') Sonda de engodo de CT Fluor-ctggcATAGC ACTATAGAAC TCTGCAAgcc ag-extintor Sonda de engodo de NG Fluor-ctcggACACC GCCCGGAACC CGAg-extintor EXEMPLO 2
PREPARAÇÃO DO ADN DA AMOSTRA ADN de CT foi isolado a partir do serotipo de CT Ba, estirpe Apace-2 (ATCC VR-347. Rockville, Maryland) utilizando 29 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ métodos conhecidos na arte, e utilizado para avaliar a sensibilidade, especificidade e reactividade cruzada dos conjuntos iniciador/sonda de consenso de CT. ADN de NG foi preparado semelhantemente e utilizado para avaliar a sensibilidade, especificidade e reactividade cruzada dos conjuntos iniciador/sonda de consenso de CT.
Em amostras de controlo negativo ("Neg"), um volume igual de diluente substituiu a amostra de ADN. Foram incluídas várias concentrações de ADN da amostra de uma concentração conhecida como controlo positivo ("0,12x", "lx", " 10 x ") .
Um polinucleótido alvo de controlo interno (Cl) foi desenhado como controlo positivo para amplificação, para utilizar com iniciadores de CT e NG. A seguência alvo para amplificação foi complementar a um iniciador de CT numa extremidade e a um iniciador de NG na outra extremidade, para que na presença de ambos os iniciadores a sequência de controlo fosse amplificada sob condições de amplificação. O polinucleótido foi desenhado para produzir um amplicão complementar a uma sonda de controlo, por exemplo uma sonda de engodo molecular, mas não complementar às sondas em utilização para a detecção de CT ou NG. Este polinucleótido alvo de controlo foi preparado utilizando métodos bem conhecidos na arte. EXEMPLO 3
SENSIBILIDADE DA DETECÇÃO DE CT ADN de CT foi preparado tal como descrito no Exemplo 2. O conjunto iniciador/sonda 7 foi avaliado (i.e., SEQ ID NOs:1 e 4 foram utilizadas como iniciadores e SEQ ID NO: 7 como sonda). Todas as sequências foram preparadas tal como descrito no Exemplo 1.
Diluições do ADN de CT isolado foram amplificadas por PCR e detectadas utilizando o conjunto iniciador/sonda 7. Foi efectuada PCR em Tampão GeneAmp® PCR Gold lx, EDTA 0,25 mM e EGTA 0,125 mM. Foi utilizada ADN-polimerase Amplitaq Gold® a uma concentração de 10 unidades/reacção, com dNTPs (dATP, 30 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ dGTP, dTTP e dCTP) presentes a uma concentração final de 0,20 mM cada. Foi utilizada uma concentração final de MgCl2 8 mM num volume reaccional total de 0,1 ml. Os volumes de amostra foram de 50 μΐ, contendo nenhum ou 10^106 corpos elementares de Chlamydia (CE)/reacção. Os iniciadores foram utilizados a uma concentração de 200-400 nM cada, e as sondas de engodo a uma concentração de 100 nM cada. Uma sequência alvo de controlo interno (Cl) e uma sonda de controlo estavam presentes a uma concentração final de 500 cópias/reacção e 100 nM, respectivamente.
As misturas reaccionais foram amplificadas num Perkin-Elmer Thermal Cycler. As misturas reaccionais foram primeiro incubadas a 95°C durante 9,5 minutos. Amplificação por PCR foi então alcançada em 45 ciclos com cada ciclo sendo de 95°C durante 30 segundos depois 59°C durante 60 segundos. Após as misturas reaccionais terem sido sujeitas aos ciclos térmicos, as misturas foram mantidas a 95 °C durante 3 minutos que depois foi baixado para 25°C durante 10 minutos para hibridação da sonda. Os produtos da reacção foram detectados num leitor de fluorescência robótico de microplacas utilizando os seguintes máximos de emissão e larguras de banda (em nm): TABELA 3 1° Fluor 2o Fluor 3o Fluor Excitação 485/20 534/8 585/8 Emissão 517/8 562/12 612/12
Os dados desta experiência são apresentados na TABELA 4 e mostram a detecção de CT serotipo Ba a concentrações tão baixas como 10 CE/reacção utilizando o conjunto iniciador/sonda 3. TABELA 4 [CT] (CE/reacção) Fluorescência Medida 0 2559 10 10441 100 12451 1000 12760 10,000 14819 1,000,000 17243 31 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
Assim, este Exemplo mostra uma boa resposta ao alvo ao longo de um intervalo de 10 a 106 CE/reacção. EXEMPLO 4
REACTIVIDADE CRUZADA ENTRE CT E NG
Para testar a reactividade cruzada entre conjuntos iniciador/sonda de CT e NG, ADN alvo e conjuntos iniciador/sonda para ambas CT e NG foram combinados em cada mistura reaccional para detectar simultaneamente ADN de CT e de NG em amostras de teste. ADN de CT e NG foi preparado como no Exemplo 2, e as amostras preparadas tal como delineado abaixo. O conjunto iniciador/sonda de CT #7 (SEQ ID NOs:l e 4 como iniciadores e SEQ ID NO: 7 como sonda) e o conjunto iniciador/sonda de NG #12 (SEQ ID NOs:8 e 9 como iniciadores e SEQ ID NO:12 como sonda) foram preparados tal como descrito no Exemplo 1 e utilizados juntos ou separadamente para amplificar e detectar as diluições de ADN de CT e NG.
As amostras incluíram 2 painéis de reactividade cruzada (amostras 1-58 e amostras 1B-23B) bem como controlos negativos (Neg) e positivos (0,12χ, lx e 10x). Cada mistura reaccional compreendeu uma concentração final de 0,40 μΜ de iniciador directo de CT (SEQ ID NO:l), 0,20 μΜ de iniciador inverso de CT (SEQ ID NO:4), 0,10 μΜ de sonda de engodo de CT (SEQ ID NO: 7), 0,20 μΜ de iniciador directo de NG (SEQ ID NO:8), 0,20 μΜ de iniciador inverso de NG (SEQ ID NO:9), 0,10 μΜ de sonda de engodo de NG (SEQ ID NO: 12), 5 unidades de ADN-polimerase Amplitaq, dNTPs 1 mM, e MgCl2 8 mM em Tampão II de PCR lx. Reacções de 100 μΐ foram sujeitas a 45 ciclos de 95°C/30 s e 59°C/1 min para amplificação do ADN, seguido de 1 ciclo de 95°C/3 min e 25°C/10 min para desnaturação final e ligação da sonda.
Significativamente, a detecção de CT não foi alterada pela inclusão do conjunto iniciador/sonda de NG com o conjunto iniciador/sonda de CT nas misturas reaccionais de CT, com a sensibilidade a permanecer a aproximadamente 107 organismos por reacção. Semelhantemente, a detecção de NG não foi alterada pela inclusão do conjunto iniciador/sonda de CT com o conjunto iniciador/sonda de NG nas misturas reaccionais 32 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ de NG, com a sensibilidade a permanecer a aproximadamente 107 organismos por reacção.
Os reagentes do ensaio de NG detectaram NG, mas não detectaram nenhuma das mais de 50 outras estirpes não sexualmente transmissíveis (não DST) de Neisseria, nem 3 estirpes de Chlamydia (trachomatis, pneumoniae e psittaci) . EXEMPLO 5
DETECÇÃO DE SEROVAR DE CT
Para determinar se e com que sensibilidade os iniciadores e sondas do presente invento podiam detectar uma variedade de serovares de CT, foi testado um painel de diluição de 15 serotipos de CT em reacções que incluíram conjuntos iniciador/sonda para CT e NG e amostras de controlo negativo (Neg) e positivo (lx e 0,12x) adequadas. O conjunto iniciador/sonda de CT #7 e o conjunto iniciador/sonda de NG #12 foram preparados tal como descrito no Exemplo 1, e o ADN de controlo de CT e NG foi preparado tal como no Exemplo 2.
As amostras de serovar de CT estiveram presentes nas misturas reaccionais a concentrações finais no intervalo de 10-1000 moléculas por reacção. Cada mistura reaccional compreendeu uma concentração final de 0,40 μΜ de iniciador directo de CT (SEQ ID NO:l), 0,20 μΜ de iniciador inverso de CT (SEQ ID NO: 4), 0,10 μΜ de sonda de engodo de CT (SEQ ID NO:7), 0,45 μΜ de iniciador directo de NG (SEQ ID NO:8), 0,25 μΜ de iniciador inverso de NG (SEQ ID NO:9), 0,10 μΜ de sonda de engodo de NG (SEQ ID NO:12), 3 unidades de ADN-polimerase Amplitaq, 1 mM de dNTPs, e 8 mM de MgCl2 em Tampão II de PCR lx. Reacções de 100 μΐ foram sujeitas a 45 ciclos de 95°C/30 s e 59°C/1 min para amplificação do ADN, seguido de 1 ciclo de 95°C/3 min e 25°C/10 min para desnaturação final e ligação da sonda.
Foram detectados dezasseis serovares de Chlamydia trachomatis utilizando conjuntos iniciador/sonda do presente invento ao longo de concentrações de 10-1000 cópias por reacção. 33 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Abbott Laboratories Pabish, Edward K.
Marshall, Ron L.
Yu, Hong
<120> POLINUCLEÓTIDOS PARA A AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS E NEISSERIA GONORRHOEAE <130> 6873.US.01 <140> Ainda Não Atribuído <141> 2002-11-12 <160> 12 <170 > FastSEQ for Windows Yersion 4.0 <210 > 1 <211 > 25 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <220> <223> Iniciador directo de CT <400> 1 gggattcctg taacaacaag tcagg 25 <210> 2 <211 > 25 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador directo de CT preferido <2 21 > mise_feature <222> (8)...(8) <223> d = a ou g ou t/u na posição 8 <400> 2 gggattcdtg taacaacaag tcagg 25 34 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ
<210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador directo de CT mais preferido <400> 3 gggattcgtg taacaacaag tcagg 25
<210> 4 <211>2 3 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador inverso de CT <400> 4 gcttgcacga agtactctag gag 23
<210> 5 <211>2 2 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de CT <400> 5 atagcactat agaactctgc aa 22
<210> 6 <211>2 6 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de CT alternativa <400> 6 catagcacta tagaactctg caagcc 26 35 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ <210 > 7 <211>3 2 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de engodo de CT <400> 7 ctggcatagc actatagaac tctgcaagcc ag 32 <210> 8 <211>2 0 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador directo de <400> 8 cgacgtaccg gtttttgttc 20 <210 > 9 <211>2 2 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador inverso de <400> 9 cggctcctta ttcggtttga cc 22 <210 > 10 <211>1 8 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de NG <400> 10 acaccgcccg gaacccga 18 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ 36 <210 > 11 <211 > 22 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de NG alternativa <400> 11 gaaacaccgc ccggaacccg at 22
<210> 12 <211>2 4 <212> ADN
Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de engodo de NG <400> 12 ctcggacacc gcccggaacc cgag 24
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Abbott Laboratories Pabish, Edward K.
Marshall, Ron L.
Yu, Hong
<120> POLINUCLEÓTIDOS PARA A AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS E NEISSERIA GONORRHOEAE <130> 6873W001 <140> Ainda Não Atribuído <141> 2003-11-07 <150> 10/292,420 <151> 2002-11-12 <160> 12 <170 > FastSEQ for Windows Version 4.0 37 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ <210 > 1 <211 > 25 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador directo de <400> 1 gggattcctg taacaacaag tcagg 25
<210> 2 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador directo de CT preferido <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> d = a ou g ou t/u na posição 8 <400> 2 gggattcdtg taacaacaag tcagg 25
<210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador directo de CT mais preferido <400> 3 gggattcgtg taacaacaag tcagg 25
<210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 >
<223> Iniciador inverso de CT 38 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ <400> 4
gcttgcacga agtactctag gag 23 <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de CT <400> 5 atagcactat agaactctgc aa 22
<210> 6 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de CT alternativa <400> 6 catagcacta tagaactctg caagcc 26
<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de engodo de CT <400> 7
ctggcatagc actatagaac tctgcaagcc ag 32 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
<223> Iniciador directo de NG 39 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ <400> 8 cgacgtaccg gtttttgttc 20 <210 > 9 <211 > 22 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador inverso de <400> 9 cggctcctta ttcggtttga cc 22 <210 > 10 <211 > 18 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda de 1 NG <400> 10 acaccgcccg gaacccga 18 <210 > 11 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sonda de NG alternat <400> 11 gaaacaccgc ccggaacccg at 22
<210 > 12 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
<223> Sonda de engodo de NG 40 ΕΡ 1 560 929/ΡΤ <400> 12 ctcggacacc gcccggaacc cgag 24
Lisboa, 2010-07-28
Claims (10)
- ΕΡ 1 560 929/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo um primeiro polinucleótido consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 e um segundo polinucleótido consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:4.
- 2. Composição da reivindicação 1 compreendendo um primeiro polinucleótido consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, e um segundo polinucleótido consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:4.
- 3. Conjunto iniciador/sonda seleccionado de entre os conjuntos iniciador/sonda que consistem em: Conjunto NOs:1, 4 de Iniciador e 5; e Sonda 1 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:2, 4 de Iniciador e 5; e Sonda 2 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:3, 4 de Iniciador e 5 ; e Sonda 3 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:1, 4 de Iniciador e 6; e Sonda 4 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:2, 4 de Iniciador e 6; e Sonda 5 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:3, 4 de Iniciador e 6; e Sonda 6 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:1, 4 de Iniciador e 7; e Sonda 7 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:2, 4 de Iniciador e 7; e e Sonda 8 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:3, 4 de Iniciador e 7. e Sonda 9 consistindo em SEQ ID
- 4. Conjunto iniciador/sonda da reivindicação 3, em que o conjunto iniciador/sonda é o Conjunto de Iniciador e Sonda 4 consistindo em SEQ ID NOS:l, 4 e 6.
- 5. Método de detecção de Chlamydia trachomatis numa amostra de teste, compreendendo o referido método: (a) a formação de uma mistura reaccional compreendendo reagentes de amplificação de ácidos nucleicos, uma amostra de ΕΡ 1 560 929/ΡΤ 2/3 teste contendo potencialmente uma sequência de Chlamydia trachomatis, e um conjunto iniciador/sonda, seleccionado de entre o grupo que consiste em: Conjunto de Iniciador e Sonda 1 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 2 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 3 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 5; Conjunto de Iniciador e Sonda 4 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 5 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 6 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 6; Conjunto de Iniciador e Sonda 7 consistindo em SEQ 117 NOs:1, 4 e 7; Conjunto de Iniciador e Sonda 8 consistindo em SEQ ID NOs:2, 4 e 7; e Conjunto de Iniciador e Sonda 9 consistindo em SEQ ID NOs:3, 4 e 7; (b) a sujeição da mistura a condições de amplificação para gerar pelo menos uma cópia de uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo; (c) a hibridação da sonda com a sequência de ácido nucleico complementar à sequência alvo, de modo a formar um híbrido compreendendo a sonda e a sequência de ácido nucleico complementarmente à sequência alvo; e (d) a detecção do híbrido como indicação da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste.
- 6. Método da reivindicação 5, em que o conjunto iniciador/sonda é o Conjunto de Iniciador e Sonda 4 consistindo em SEQ ID NOs:l, 4 e 6;
- 7. Método de qualquer uma das reivindicações 5 e 6 em que a referida mistura reaccional compreende ainda um polinucleótido alvo de controlo e uma sonda polinucleotídica de controlo. ΕΡ 1 560 929/ΡΤ 3/3
- 8. Estojo compreendendo: (a) um conjunto iniciador/sonda, seleccionado de entre o grupo que consiste em: Conjunto NOs:1, 4 de Iniciador e 5; e Sonda 1 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:2, 4 de Iniciador e 5; e Sonda 2 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:3, 4 de Iniciador e 5; e Sonda 3 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:1, 4 de Iniciador e 6 ; e Sonda 4 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:2, 4 de Iniciador e 6 ; e Sonda 5 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:3, 4 de Iniciador e 6 ; e Sonda 6 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:1, 4 de Iniciador e 7; e Sonda 7 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:2, 4 de Iniciador e 7; e e Sonda 8 consistindo em SEQ ID Conjunto NOs:3, 4 de Iniciador e 7; e e Sonda 9 consistindo em SEQ ID (b) reagentes de amplificaçao.
- 9. Estojo de acordo com a reivindicação 8 compreendendo: (a) Conjunto de Iniciador e Sonda 4 consistindo em SEQ ID NOs:1, 4 e 6; e (b) reagentes de amplificação.
- 10. Iniciador possuindo uma sequência consistindo em SEQ ID NO:4. Lisboa, 2010-07-28
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