PT1570060E - ''sistema de expressão indutível de l-ramnose'' - Google Patents

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Bernhard Hauer
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Description

1
DESCRIÇÃO "SISTEMA DE EXPRESSÃO INDUTÍVEL DE L-RAMNOSE" A presente invenção refere-se a um processo para a expressão de sequências de ácidos nucleicos em células hospedeiras procarióticas, em que se incorpora pelo menos uma construção de ADN epissómico replicável na referida célula hospedeira que compreende uma sequência de ácidos nucleicos a expressar sob o controlo de transcrição de um promotor indutivel de L-ramnose na referida célula hospedeira, em que o referido promotor é heterólogo em relação à referida sequência de ácidos nucleicos, e se induz a expressão da referida sequência de ácidos nucleicos por meio de adição de L-ramnose, caracterizado por a célula hospedeira procariótica ser pelo menos deficiente em relação a uma isomerase de L-ramnose. A invenção refere-se além disso a células hospedeiras procarióticas que são pelo menos deficientes em relação a uma isomerase de L-ramnose e que contêm pelo menos uma construção de ADN replicável na referida célula hospedeira, a qual compreende uma sequência de ácidos nucleicos a expressar sob controlo de transcrição de um promotor indutivel por meio de L-ramnose, em que o referido promotor é heterólogo em relação à referida sequência de ácidos nucleicos. A expressão heteróloga de genes é uma possibilidade económica para preparar enzimas e outras proteínas para fins de utilização farmacêutica e industrial. As expressões referidas são realizadas de acordo com a prática anterior com estirpes de Escherichia coli. Para a preparação de proteínas recombinantes são conhecidos diversos sistemas, que utilizam diferentes organismos hospedeiros e blocos 2 integrados de expressão genética. Se bem que estejam descritos numerosos sistemas e processos para a expressão de proteínas recombinantes em sistemas microbianos, os sistemas de expressão para bactérias gram-negativas como Escherichia coli baseiam-se num reportório muito limitado de promotores bacterianos. Os mais divulgados são o promotor de lactose [lac] (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103-109) e o promotor de triptofano [trp] (Goeddel et ai. (1980) Nature (London) 287: 411-416) bem como promotores de hibridomas dos anteriormente citados [lac e trp] (Brosius (1984) Gene 27:161-172; Amanna & Brosius (1985) Gene 40: 183-190). Outros exemplos são os promotores PL e PR do fago λ (Elvin et al. (1990) Gene 37:123-126), o promotor do fago T7 (Tabor & Richardson (1998) Proc Natl Acad Sei USA 82:1074-1078) e o promotor da fosfatase alcalina [pho] (Chang et al. (1986) Gene 44:121-125). À expressão heteróloga estão ligados diferentes problemas, como por exemplo a toxicidade do produto genético, as taxas de expressão demasiado reduzidas ou a formação de agregados proteicos insolúveis ("inclusion bodies") . Muitos dos promotores atrás descritos não são apropriados para a utilização, tendo nestes as proteínas recombinantes a expressar uma actividade tóxica no respectivo hospedeiro. Nestes casos, é desejável uma regulação da expressão tão estrita quanto possível. Para este fim podem ser utilizados os chamados sistemas de promotores indutíveis, que podem ser induzidos por meio da adição de um indutor ou de um outro estímulo exógeno (por exemplo, calor). Os referidos sistemas de promotores indutíveis são em regra constituídos por uma combinação promotor/regulador, em que o regulador representa por exemplo uma proteína, a qual induz a transcrição a partir do promotor correspondente com um 3 estímulo exógeno. A título de exemplo, refira-se a combinação de um promotor com um repressor, como por exemplo o repressor lac (Studier FW et al. (1990) Methods in Enzymol 185:60-89; Dubendorff JW & Studier FW (1991) J Mol Biol 219:45-59). O efeito de repressão deste repressor pode ser neutralizado por meio da adição de um indutor natural (por exemplo, lactose) ou de um indutor sintético (por exemplo, isopropil-p-tiogalactopiranósido; IPTG) e a expressão pode assim ser iniciada. O IPTG não pode ser metabolizado, ao contrário da lactose, e garante assim uma indução durável. Um outro exemplo para este promotor indutível é o promotor araB indutível pela arabinose (US 5 028 530; Guzman LM et al. (1995) J Bacteriol 177:4121-4130). O IPTG e outros indutores sintéticos são muito caros e têm o inconveniente de actuarem parcialmente sobre o crescimento dos organismos, o que torna não rentável uma utilização em escala industrial.
Os indutores fisiológicos como os ácidos aminados (por exemplo, triptofano) e os açúcares (arabinose) são em regra bastante económicos, mas são metabolizados pelo organismo, de tal modo que devem ser adicionados em quantidades consideráveis e/ou doseados posteriormente num ensaio com células, em especial no caso de fermentação de elevada densidade celular. Além disso, os metabolitos destes compostos podem também ser inconvenientes para a cultura posterior, por exemplo pela formação de acetato a partir de açúcares . O documento WO 01/73082 descreve um processo para a 4 expressão de proteínas recombinantes sob o controlo do promotor indutível araB num organismo hospedeiro E. coli, que apresenta uma deficiência para o transporte activo do indutor arabinose. Como vantagem acontece neste caso que não pode ter lugar qualquer transporte activo mas sim apenas um transporte passivo (por meio de difusão) . Deste modo a concentração intracelular de arabinose e por conseguinte também a indução da expressão podem ser controladas mais eficientemente. Em alguns dos exemplos apresentados utiliza-se uma estirpe de E. coli (EI04) que apresenta uma deficiência na enzima ribonuclease que metabolizam a arabinose (AraB) e na epimerase de L-ribulose-5-fosfato (AraD). De acordo com os dados de expressão, esta deficiência não tem, no entanto, qualquer consequência substancial sobre o grau de expressão. 0 sistema indutível por arabinose tem diferentes desvantagens. a) A arabinose tem já a partir de concentrações superiores a 0,1 mM um efeito inibidor do crescimento sobre a cultura bacteriana, que apenas pode ser compensada condicionalmente também com o processo descrito no documento WO 01/73082 (cfr. Quadro 4, WO 01/73082) . b) O promotor indutível por arabinose não fica completamente inactivo na ausência de arabinose, mas ainda apresenta uma actividade basal bastante elevada (cfr. Quadro 5, WO/73082). c) A qualidade das proteínas recombinantes expressas depende da densidade celular e diminui com o aumento da densidade celular (De Lisa MP et al. 5 (1999) Biotechnol Bioeng 65:54-64).
Está descrita a estirpe de Escherichia coli JB1204 (CGSC6999, Bulawa & Raetz (1984) J Biol Chem 259: 11257-11264), que apresenta a inserção do transposão "rha--14::TnlO", não sendo referidos quaisquer dados exactos para a sequência ou a função de "rha-14".
Descreve-se a excepção e o metabolismo da L-ramnose em bactérias como E. coli. A L-ramnose é absorvida pelas células através de um sistema de transporte activo (RhaT), é transformada com uma isomerase (RhaA)em L-ramnulose, que em seguida é fosforilada adicionalmente por meio de fosfatase de l-ramnulose (RhaB) e é hidrolisada por meio de uma aldolase (RhaD), dando origem a fosfato de di--hidroxiacetona e lactaldeido. 0 gene rhaBAD forma um operão e é transcrito com o auxilio do chamado promotor rhaPBAD- 0 sistema de ramnose distingue-se em comparação com outros sistemas por serem necessários dois activadores RhaS e RhaR para a regulação. Os dois formam uma unidade de transcrição e são transcritos em sentido inverso dando origem a rhaBAD. Na presença de L-ramnose, o RhaR liga-se ao promotor rhaPRS e dá início à sua própria expressão como também à expressão de RhaS. 0 RhaS por sua vez liga-se após activação por meio de L-ramnose como efector ao promotor rhaPBAD e ao promotor separado rhaPT do gene rhaT e activa a transcrição do gene estrutural (Moralejo P et al. (1993) J Bacteriol 175:5585-5594; Tobin JF et al. (1990) J Mol Biol 211:1-4; Chen YM et al. (1987) J Bacteriol 169:3712-3719; Egan SM et al. (1993) J Mol Biol 243:87-98) . A combinação dos dois activadores é condição para um controlo de expressão estrito pouco habitual por meio do promotor rhaPBAD· Uma comparação do promotor indutível por arabinose 6 araB com o promotor rhaPBAD indutível por ramnose mostra que o último é regulado de modo substancialmente mais estrito e na ausência do indutor ramnose representa um fenótipo quase nulo (Haldimann A et al. (1998) J Bacteriol 180(5):1277-1286). 0 documento WO 01/32890 descreve a preparação de hidrolase de L-pantolactona com Escherichia coli TGl pDHE681 ou com derivados, em que a L-ramnose é utilizada como indutor para a expressão genética da enzima. Uma vez que a L-ramnose de E. coli é bem metabolizada, a L-ramnose transformada deve ser compensada por meio de adição como nutriente. Isto significa um considerável esforço experimental e aumenta o custo do meio nutriente. São ainda descritos sistemas de expressão para a fermentação sob elevada densidade celular com utilização do promotor rhaBAD indutivel por L-ramnose e uma estirpe de E. coli que apresenta uma deficiência introduzida especificamente na cinase de L-ramnulose rhaB (Stumpp T et al. (2000) Biospectrum 6 (1):33—36; Wilms B et al. (2001) Biotechnol Bioeng 73(2): 95-103). Seleccionou-se neste caso conscientemente RhaB, uma vez que é o primeiro passo irreversível do metabolismo da L-ramnose (cfr. Wilms B et al. (2001) Biotechnol Bioeng 73(2) pág. 98, coluna da esquerda, cap. 4-8). É possível atingir uma indução óptima neste sistema com concentrações de L-ramnose de 2 g/L (cfr. Wilms B et al. (2001) Biotechnol Bioeng 73(2) pág. 102, coluna da esquerda, 2.a secção cap. 1-4.) Estas concentrações são ainda assim muito elevadas Com um preço médio de cerca de 100 €/kg de L-ramnose, os custos apenas para a L-ramnose para um fermentador de 10 m3 seriam ainda de 2 000 €. 7
Estão ainda descritos sistemas de expressão indutíveis por ramnose estritamente regulados, nos quais o operão de ramnose (BAD) localizado por detrás do promotor endógeno rhaPBAD por meio de recombinação homóloga foi permutado pelo gene PhoB (activador de transcrição) (Haldimann A et ai. (1998) J Bacteriol 180(5):1277-1286). O sistema aqui descrito é com efeito muito apropriado a fim de efectuar estudos do regulador, uma vez que está garantida uma regulação muito critica. Este sistema é, no entanto, pouco apropriado para a sobreexpressão - em especial sob condições de cultura celular de alta densidade - uma vez que - em virtude da permuta do operão cromossómico da ramnose - apenas se pode incorporar em cada caso uma cópia do bloco integrado de expressão comandado pelo promotor rhaPBAD- Além disso, a permuta de genes por meio de recombinação homóloga é custosa e requer uma selecção e uma caracterização trabalhosas do correspondente organismo modificado. Isto torna o processo descrito inútil para a utilização rotineira.
Existe a necessidade de encontrar um processo melhorado para a expressão de ácidos nucleicos - e de preferência proteínas recombinantes - que permita elevados níveis de expressão com reduzidas quantidades de L-ramnose. Este objectivo é alcançado através da presente invenção.
Um primeiro objecto da presente invenção refere-se a um processo para a expressão de sequências de ácidos nucleicos em células hospedeiras procarióticas em que a) em que se incorpora na referida célula hospedeira pelo menos uma construção de ADN epissómico replicável na referida célula hospedeira que compreende uma sequência de ácidos nucleicos a expressar sob o controlo de transcrição de um promotor indutivel de L-ramnose, em que o referido promotor é heterólogo em relação a referida sequência de ácidos nucleicos e b) se seleccionam células hospedeiras procarióticas que contêm a referida construção de ADN sob forma epissómica e c) se induz a expressão da referida sequência de ácidos nucleicos por meio de adição de L-ramnose de modo a obter uma cultura da referida célula hospedeira seleccionada, caracterizado por a célula hospedeira procariótica ser pelo menos deficiente em relação a isomerase de L-ramnose.
Numa forma de concretização preferida, a expressão da sequência de ácidos nucleicos a expressar condiciona produção de uma proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos, de tal modo que o processo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para a preparação de proteínas recombinantes.
Numa outra forma de concretização preferida, pode existir uma deficiência adicional numa ou em várias outras proteínas que metabolizem ou que transportem L-ramnose.
Um outro objecto da invenção refere-se a uma célula hospedeira procariótica que é pelo menos deficiente em relação a uma isomerase de L-ramnose e que contém pelo menos uma construção de ADN replicável na referida célula 9 hospedeira, a qual compreende uma sequência de ácidos nucleicos a expressar sob controlo de transcrição de um promotor indutivel por meio de L-ramnose, em que o referido promotor é heterólogo em relação à referida sequência de ácidos nucleicos.
Numa forma de concretização preferida, pode existir na célula hospedeira procariótica de acordo com a presente invenção uma deficiência adicional numa ou em várias outras proteínas que metabolizem ou que transportem L-ramnose.
Para além disso, a invenção refere-se a um processo para a preparação de proteínas recombinantes, enzimas e outros produtos de química fina como por exemplo a ácidos carboxílicos quirais com utilização de uma das células hospedeiras de acordo com a presente invenção ou de uma preparação destas. O processo de acordo com a presente invenção tem diferentes vantagens: 1. É de fácil aplicação, uma vez que pode ser gerada a partir de uma estirpe hospedeira por meio de uma transformação fácil da correspondente estirpe de expressão, sem que seja necessária uma inserção por meio de recombinação homóloga no genoma (como em Haldimann A et al. (1998) J Bacteriol 180(5):1277-1286) e uma selecção trabalhosa dos organismos correctamente modificados. 2. Os blocos integrados de expressão e vectores de expressão disponíveis no âmbito da invenção são de manuseamento fácil. A título de exemplo, o promotor rhaPBAD tem um comprimento de apenas 123 pares de 10 bases . 3. Uma vez que a ramnose, em especial em fermentações limitadas pela fonte de carbono, é metabolizada por E. coli, nos processos normais ocorre um consumo elevado de L-ramnose (adição como nutriente) e em consequência elevados custos do meio. Por meio da reduzida necessidade de L-ramnose do processo de acordo com a presente invenção (< 1% em comparação com as estirpes que metabolizam a L-ramnose), os custos para o meio de fermentação e em consequência da preparação de biocatalisador são consideravelmente reduzidos. Por meio da disponibilização do processo de acordo com a presente invenção, é possível a preparação de proteínas recombinantes (por exemplo, nitrilase, hidrolase de L-pantolactona) por meio de fermentação de alta densidade celular (por exemplo, da estirpe de E. coli proporcionada) sem adição de ramnose como nutriente adicional. 4. Verificou-se que a regulação do sistema descrito é extremamente densa e dá mesmo com concentrações reduzidas do indutor L-ramnose de até 0,05 g/L a máxima indução como anteriormente, enquanto que na ausência do indutor não é possível detectar qualquer actividade do promotor. Deste modo, o sistema também é apropriado de modo extraordinário para a expressão de proteínas potencialmente tóxicas e possibilita uma produção económica em especial sob condições industriais, uma vez que apenas são necessárias concentrações reduzidas de L-ramnose.
No âmbito desta invenção, "célula hospedeira procariótica" ou "organismo hospedeiro procariótico" significa bactérias 11 gram-positivas ou gram-negativas, em especial as bactérias gram-positivas ou gram-negativas que estão em condições de metabolizar naturalmente a L-ramnose como fonte de carbono. A L-ramnose pode ser utilizada como fonte de carbono pela maioria dos organismos procarióticos.
De preferência, significa uma célula hospedeira procariótica ou um organismo hospedeiro procariótico que qualquer género e espécie das enterobacteriacea e das familias dos actinomycetales, de modo muito especialmente preferido dos géneros de enterobacteriacea Escherichia, Serratia, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Edwardsielle, Citrobacter, Morganella,
Providencia e Yersinia.
Especialmente preferidos são os géneros Pseudomonas, Burkholderia, Nocardia, Acetobacter, Gluconobacter,
Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Rho-dococcus e Penicillium. São muito especialmente preferidas as espécies de
Escherichia, em especial Escherichia coli. "Promotor indutivel por L-ramnose" significa em geral os promotores que na presença de L-ramnose apresentam uma actividade de expressão mais elevada, do que na ausência de L-ramnose. A expressão na presença de L-ramnose é pelo menos dupla, de preferência pelo menos quíntupla, de modo especialmente preferido pelo menos décupla, de modo muito especialmente preferido pelo menos cêntupla do que na ausência de L-ramnose. De preferência utilizam-se no âmbito da investigação da grandeza da expressão sequências de ácidos nucleicos em acoplamento funcional com o promotor a indagar, que codifica para proteínas facilmente quantificáveis. São especialmente preferidas para este fim 12 proteínas relatoras (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1): 29-44) como a "green fluorescence protein” (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325—330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23 (5):912-8), a transferase de cloranfenicol, a luciferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), a β-glucuronidase ou a β-galactosidase.
Neste caso a concentração de L-ramnose no meio pode situar--se em geral entre os limites de aproximadamente 0,0001 g/L até aproximadamente 50 g/L, de preferência de 0,001 g/L até 5 g/L, de modo especialmente preferido de 0,01 g/L até 0,5 g/L. É especialmente preferido o promotor rhaPBAD do operão rhaBAD de L-ramnose em E. coli (Egan & Schleif (1994) J Mol Biol 243:821-829), bem como os seus equivalentes funcionais de outros organismos procarióticos, em especial organismos da família das enterobacteriaceae. São muito especialmente preferidos promotores que contêm pelo menos um elemento de ligação RhaS de acordo com a SEQ ID NO: 5 ou um equivalente funcional do mesmo como também um fragmento equivalente funcional do anteriormente referido. São especialmente preferidos promotores que contêm uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 2, 3 ou 4 bem como equivalentes funcionais da mesma como também fragmentos equivalentes funcionais das anteriormente referidas.
Equivalentes funcionais de um promotor que compreende uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 2, 3, 4 ou 5 compreendem 13 de preferência os promotores que a) apresentam substancialmente uma actividade promotora igual à do promotor que compreende uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 2, 3, 4 ou 5 e b) apresentam uma homologia de pelo menos 50%, de preferência 70%, de um modo preferido pelo menos 80%, de modo especialmente preferido pelo menos 90%, de modo muito especialmente preferido pelo menos 95%, de modo ainda mais especialmente preferido pelo menos 99%, com uma sequência do referido promotor, em que a homologia se prolonga ao longo de um comprimento de pelo menos 30 pares de bases, de preferência pelo menos 50 pares de bases, de modo especialmente preferido pelo menos 100 pares de bases.
Equivalentes funcionais de um promotor que compreende uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 2, 3, 4 ou 5 significa em especial mutações naturais ou sintéticas do referido promotor bem como sequências homólogas e sequências funcionalmente equivalentes de outros organismos, de preferência de outros organismos procarióticos, em especial organismos da família das enterobacteriaceae, que apresentam essencialmente uma actividade promotora igual à do referido promotor. "Essencialmente uma actividade promotora igual à do referido promotor" significa a capacidade de indução da actividade de expressão por meio de L-ramnose de acordo com a definição geral acima dada para promotores indutíveis por L-ramnose.
Conforme descrito anteriormente, a proteína RhaR na presença de L-ramnose liga-se ao promotor rhaPRS e dá 14 início à sua própria expressão como também à expressão de RhaS. 0 RhaS, por sua vez, liga-se com a L-ramnose como efector ao promotor rhaPBAD e activa então o promotor rhaPBAB e por conseguinte a transcrição da sequência de ácidos nucleicos regulada por meio do referido promotor. Estes dispositivos anteriores - constituídos por RhaR, RhaS e o promotor rhaPRS - podem ser disponibilizados de modo natural por meio do organismo hospedeiro procariótico, inseridos no respectivo genoma por meio de processos de engenharia genética ou, porém, postos à disposição por meio da construção de ADN utilizada no âmbito da invenção. Um bloco integrado de promotor apropriado neste contexto é a sequência o descrita por meio de SEQ ID NO: 1.
Quando a absorção de L-ramnose necessária para a indução nas células não é suficiente, pode ser vantajoso em organismos que, por exemplo, não expressam qualquer L--ramnose naturalmente, provocar a expressão por meios transgénicos. As experiências efectuadas até agora mostram, no entanto, que o transporte activo de ramnose não deve representar qualquer dimensão limitativa para a eficácia do sistema de expressão de acordo com a presente invenção.
Por "isomerases de L-ramnose" entende-se em geral as proteínas que são capazes de converter a L-ramnose em outras hexoses. De preferência isomerases de L-ramnose significa as proteínas que são capazes de transformar a L--ramnose em L-ramnulose (EC 5.3.1.14). É especialmente preferido o gene RhaA de organismos da família das enterobacteriaceae, em especial E. coli. De modo muito especialmente preferido isomerase de L-ramnose significa a proteína de acordo com SEQ ID NO: 9, bem como sequências homólogas de outros organismos, de preferência de outros 15 organismos procarióticos.
Equivalentes funcionais de isomerases de L-ramnose de acordo com SEQ ID NO: 9 incluem de preferência as sequências que a) apresentam substancialmente uma actividade enzimática igual à da isomerase de L-ramnose de acordo com SEQ ID NO: 9 e b) apresentam uma homologia de pelo menos 50%, de preferência 70%, de um modo preferido pelo menos 80%, de modo especialmente preferido pelo menos 90%, de modo muito especialmente preferido pelo menos 95%, de modo ainda mais especialmente preferido pelo menos 99% com a sequência da isomerase de L-ramnose de acordo com SEQ ID NO: 9, em que a homologia se prolonga ao longo de um comprimento de pelo menos 30 ácidos aminados, de preferência pelo menos 50 ácidos aminados, de modo especialmente preferido pelo menos 100 ácidos aminados, de modo muito especialmente preferido pelo menos 200 ácidos aminados e de modo ainda mais especialmente preferido ao longo de todo o comprimento da proteína.
Além da isomerase de L-ramnose podem ainda ocorrer outras deficiências no que se refere a genes que têm uma função de metabolizar a L-ramnose. Em especial podem citar-se a este respeito a deficiência da 1-fosfatase/cinase de ramnulose (por exemplo, RhaB; descrita por exemplo por meio da SEQ ID NO: 11), uma deficiência da aldolase de ramnulofosfato (por exemplo, RhaD; descrita por exemplo por meio da SEQ ID NO: 13) ou uma deficiência em pelo menos uma dos elementos que controlam por regulação a expressão das proteínas referidas 16 (como, por exemplo, promotor, regulador ou outras).
Em determinadas condições, pode ainda ser vantajoso obter uma deficiência num sistema activo de transporte de ramnose (por exemplo, RhaT; por exemplo descrito por meio de SEQ ID NO: 19). "Deficiência" significa, em relação a uma isomerase de L--ramnose ou uma outra enzima da absorção/metabolismo de L--ramnose, a interrupção essencialmente completa dependendo dos diferentes mecanismos biológicos celulares ou o bloqueio da expressão do gene alvo correspondente ou do ARNm deste derivado e/ou do produto proteico codificado pelo mesmo ou a alteração da sequência proteica do produto genético de um modo que a respectiva função e/ou actividade é essencialmente interrompida ou alterada de tal modo que a L-ramnose deixa essencialmente de poder ser transformada.
Uma interrupção ou um bloqueio no sentido da invenção abrange em especial a redução drástica de um ARNm expresso por um gene alvo e/ou do produto proteico codificado pelo mesmo até uma ausência substancialmente completa deste. Neste caso, a expressão de um determinado ARNm e/ou do produto proteico codificado pelo mesmo numa célula ou num organismo em comparação com a mesma célula ou organismo que não tenha sido submetido ao processo, é reduzida de preferência em mais de 50%, de modo especialmente preferido em mais de 80%, de modo muito especialmente preferido em mais de 90% e de modo ainda mais especialmente preferido em mais de 95%.
De modo muito especialmente preferido, redução significa a inactivação completa de um gene endógeno (mutação "knock- 17 out") .
Uma interrupção ou um bloqueio pode depender de diferentes mecanismos. De preferência, a interrupção ou o bloqueio depende de uma mutação no gene alvo correspondente, em que a mutação pode consistir numa substituição, eliminação e/ou adição de um ou mais nucleótidos. É especialmente preferida uma interrupção ou um bloqueio por mutagénese promovida por meio de um transposão ou através de knock-out direccionado. A redução pode ser determinada por meio de processos bem conhecidos dos especialistas. Deste modo, a redução da quantidade de proteína pode ser determinada, por exemplo, por meio de detecção imunológica da proteína. Além disso, podem ser utilizadas técnicas como hibridação de Northern, "nuclease protection assay", transcrição inversa (RT-PCR quantitativa), ELISA ("enzyme linked immunosorbent assay"), Western-Blotting, Radioimmunoassay (RIA) ou outros immunoassays bem como "fluorescence activated cell analysis" (FACS). De acordo com o tipo de produto proteico reduzido, pode também ser avaliada a sua actividade ou a influência sobre o fenótipo do organismo ou das células. "Quantidade de proteína" significa a quantidade de um determinado polipeptídeo num organismo, num tecido, numa célula ou num compartimento celular. "Redução da quantidade de proteína" significa a redução da quantidade de um determinado poli-peptídeo num organismo, num tecido, numa célula ou num compartimento celular em comparação com o tipo selvagem da mesma espécie e género que não tenha sido submetido a este processo, sob condições de resto iguais (como, por exemplo, condições de cultura, 18 idade, adição de nutrientes, etc.). A redução é neste caso de pelo menos 50%, de preferência de pelo menos 70%, de modo especialmente preferido de pelo menos 90%, de modo muito especialmente preferido de pelo menos 95%, de modo ainda mais especialmente preferido de pelo menos 99%. Os processos para a determinação da quantidade de proteina são conhecidos dos especialistas. A titulo de exemplo podem citar-se: O processo de micro-biureta (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), o método de folina-Ciocalteu (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) ou a medição da absorção de CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254). A redução da actividade de isomerase de L-ramnose pode em especial ser determinada por meio de sistemas de ensaio enzimáticos. Os sistemas de ensaio correspondentes são conhecidos dos especialistas (Bhuiyan SH et al. (1997) J Ferment Bioeng 84(4):319-323). "Construção de ADN epissómico replicável em células hospedeiras procarióticas" significa todas as construções de ADN que são diferentes do ADN cromossómico da célula hospedeira referida e que existem na célula hospedeira em paralelo a estas e que possuem a capacidade de se replicarem na referida célula hospedeira sob utilização de mecanismos de replicação próprios das células ou outros (por exemplo codificado pela própria construção de ADN). A construção de ADN pode representar uma estrutura de ADN de cadeia simples ou de cadeia dupla. De preferência a construção de ADN tem pelo menos temporariamente (ou seja, até um determinado momento do seu ciclo de replicação) uma estrutura de ADN de cadeia dupla. 19
De preferência as construções de ADN epissómico replicáveis referidas encontram-se numa célula hospedeira num número de cópias de pelo menos 1, de preferência de pelo menos 5, de modo especialmente preferido de pelo menos 10. "Selecção de células hospedeiras procarióticas que contêm a referida construção de ADN sob forma epissómica" significa a escolha de células hospedeiras que contêm a referida construção de ADN sob forma epissómica. A escolha pode ser realizada por exemplo utilizando um dos marcadores de selecção adiante descritos. De preferência a construção de ADN não é inserida no ADN cromossómico da célula hospedeira. Esta inserção pode por exemplo ser evitada por a construção de ADN não apresentar qualquer sequência que seja idêntica à sequência cromossómica da célula hospedeira ao longo de um amplo intervalo.
De preferência as construções de ADN epissómico replicáveis referidas possuem uma dimensão ou um comprimento de no máximo 100.000 bases ou pares de bases, de modo especialmente preferido de no máximo 50.000 bases ou pares de bases, de modo muito especialmente preferido de no máximo 10.000 bases ou pares de bases (o número de bases ou pares de bases tem em conta se a construção de ADN representa uma estrutura de ADN de cadeia simples ou dupla).
De preferência trata-se de uma construção de ADN constituída por um vector. Os vectores podem ser a título de exemplo plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, retrovírus ou também agrobactérias. De preferência o vector é um plasmídeo circular que compreende sob forma recombinante a sequência de ácidos nucleicos a expressar e que é capaz de 20 replicação autónoma na célula hospedeira procariótica. O vector pode caracterizar-se, no âmbito da presente invenção, também como vector recombinante ou vector de expressão recombinante. São conhecidas dos especialistas diferentes sequências que permitem a replicação de ADN em procariontes. A titulo de exemplo podem citar-se ORI (origin of DNA replication) , a ori de pBR322 ou a ori de P15A (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
De modo correspondente, origens de replicação apropriadas que garantem um número de cópias reduzido ("low-copy") podem ser isoladas a partir de BAC (Bacterial artificial chromosoms), plasmideos F, cosmideos como, por exemplo, pWE15. De modo correspondente, origens de replicação apropriadas que garantem um número de cópias médio ("médium-copy") podem ser isoladas, por exemplo, a partir de pBR322 (Lin-Chao S, Bremer H, Mol Gen Genet 1986 203(1): 143-149) e derivados, como a série pJOE, pKK223-3, pQE30, pQE40 ou plasmideos com uma origem RI como pRSFlOlO e derivados como, por exemplo, pML122, pl5A e pSClOl. De modo correspondente, origens de replicação apropriadas que garantem um número de elevado cópias ("high-copy") podem ser isoladas, por exemplo, a partir de fagemideos como pBluescript II SK/KS+/-, pGEM etc.. O número de cópias presente numa célula em cada caso é em parte determinado por meio da chamada origem de replicação (também referida como replicão). Os plasmideos da série pBR322 contêm a origem de replicação ColEl de pMBl. Esta é fortemente controlada relativamente e tem como resultado um número de cópias de cerca de 25 por célula. Os plasmideos de pUC compreendem uma versão mutada de ColEl e podem encontrar- 21 -se em 200 a 700 cópias de plasmídeo por célula. Alguns plasmideos compreendem a origem de replicação pl5a, que tem como resultado um reduzido número de cópias.
Como vectores podem citar-se a titulo de exemplo: a) em E. coli são preferidos pQE70, pQE60 e pQE-9 (QIAGEN, Inc.); vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech, Inc.); pLG338, PACYC184, pBR322, pUCl8, pUCl9, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, Àgtll ou pBdCI, b) em Streptomyces são preferidos plJlOl, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361, c) em Bacillus são preferidos pUBUO, pC194 ou pBD214, d) em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, ou derivados dos plasmideo anteriormente citados. Os plasmideos referidos representam uma reduzida selecção dos plasmideos possíveis. Outros plasmideos são bem conhecidos dos especialistas e podem, por exemplo, ser consultados no livro Cloning Vektors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdão-Nova Iorque-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). "Transformação" ou "transformado" significa a introdução de materiais genéticos, como, por exemplo, um vector (por exemplo um plasmídeo) numa célula hospedeira procariótica. Para este fim estão disponíveis para os especialistas 22 diferentes processos descritos em pormenor mais adiante. Uma célula hospedeira procariótica, em que foi introduzido o material genético referido, como também a "descendência" e as colónias resultantes destas células, que compreendem o referido material genético, são designadas como "transformantes". "Transdução" ou "transduzido" significa a introdução de material genético numa célula hospedeira procariótica com origem no material genético dum bacteriófago. Uma célula hospedeira procariótica, em que foi introduzido o material genético referido, como também a "descendência" e as colónias resultantes destas células, que compreendem o referido material genético, são designadas como "transdutantes". "Proteína recombinante" significa qualquer produto proteico que possa ser expresso a partir da sequência de ácidos nucleicos a expressar sob controlo funcional da promotor indutível de L-ramnose e inclui peptídeos, polipeptídeos, proteínas, oligoproteínas e/ou proteínas de fusão. De preferência "proteína recombinante" significa uma proteína de origem microbiana, bacteriana, animal ou vegetal. "Proteína de fusão" significa uma fusão da proteína pretendida e de sequências guia que possibilitam uma expressão em determinados compartimentos (por exemplo, periplasma ou citoplasma) da célula hospedeira ou no meio circundante. A título de exemplo pode citar-se a sequência guia pelB (US 5,576,195; US 5,846,818). "Bloco integrado de expressão significa em cada caso a combinação de um promotor com pelo menos uma sequência de 23 ácidos nucleicos que se pode transcrever sob o seu controlo. "Heterólogo" significa, em relação com a relação do promotor indutivel de L-ramnose e da sequência de ácidos nucleicos a expressar sob o controlo do referido promotor, ou um bloco integrado de expressão ou um vector de expressão todos estes obtidos por meio de métodos de manipulação genética, em que ou a) pelo menos uma das sequências de ácidos nucleicos a expressar ou b) pelo menos um dos promotores indutiveis de L-ramnose, que comanda a expressão da referida sequência de ácidos nucleicos a expressar, ou c) (a) e (b) que não se encontra no seu ambiente genético natural (por exemplo no seu local cromossómico natural) ou foi modificado por métodos de manipulação genética, em que a modificação pode abranger, por exemplo, substituições, adições, eliminações, inversões ou inserções de um ou vários resíduos de nucleótidos.
No processo de acordo com a presente invenção as células hospedeiras procarióticas de acordo com a invenção são cultivadas num agente que possibilita o crescimento destes organismos. Este meio pode ser um meio sintético ou natural. Conforme cada organismo, são utilizados pelos especialistas meios conhecidos. Para o crescimento dos microorganismos, os meios utilizados contêm uma fonte de 24 carbono, uma fonte de azoto, sais inorgânicos e eventualmente pequenas quantidades de vitaminas e de oligoelementos.
De modo vantajoso, são fontes de carbono, por exemplo, polióis como a glicerina, açúcares como monossacáridos, dissacáridos ou polissacáridos como a glucose, a sacarose, a rafinose, amidos ou celulose, fontes de açúcares complexas como melaços, fosfatos de açúcares como o 1,6--bisfosfato de frutose, açúcares-álccois como o manitol, álcoois como o metanol ou o etanol, ácidos carboxilicos como o ácido citrico, o ácido láctico, o ácido acético, gorduras como óleo de soja ou óleo de colza, ácidos aminados como uma mistura de ácidos aminados, por exemplo os chamados ácidos casaminicos (Difco) ou ácidos aminados isolados como a glicina ou o ácido aspártico ou aminoaçúcares, podendo estes últimos também ser usados como fonte de azoto. De modo especialmente preferido são polióis, em especial glicerina.
De preferência o meio utilizado como meio básico não contém qualquer L-ramnose, a fim de garantir uma regulação o mais precisa possivel da expressão. A L-ramnose é então adicionada em caso de necessidade até ao momento ou densidade celular pretendidos na concentração pretendida em cada caso. São fontes de azoto vantajosas compostos azotados orgânicos ou inorgânicos ou materiais que contêm estes compostos. São exemplos sais de amónio como NH4C1 ou (NH4)2S04, nitratos, ureia ou fontes de azoto complexas como água de maceração de milho, autolisado de cerveja, farinha de sementes de soja, glúten de trigo, extracto de levedura, extracto de 25 carne, hidrolisado de caseína, leveduras ou proteínas da batata, que frequentemente podem também servir simultaneamente de fontes de azoto. São exemplos para sais inorgânicos os sais de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdénio, manganês, potássio, zinco, cobre e ferro. Como anião destes sais são de citar em especial o ião cloro, sulfato e fosfato. Um factor importante para a elevação da produtividade no processo de acordo com a presente invenção é o controlo da concentração de iões Fe2+ ou Fe3+ no meio de produção.
Eventualmente são adicionados ao meio nutriente outros factores de crescimento, como por exemplo vitaminas ou promotores de crescimento como a biotina, 2-KLG, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato ou piridoxina, ácidos aminados como alanina, cisteína, prolina, ácido aspártico, glutamina, serina, fenilalanina, ornitina ou valina, ácidos carboxílicos como ácido cítrico, ácido fórmico, ácido pimélico ou ácido láctico, ou substâncias como o ditiotreitol.
As proporções de mistura dos nutrientes referidos depende do tipo de fermentação e é determinada em cada caso. Os componentes do meio podem estar presentes todos no início da fermentação, depois do que em caso de necessidade foram esterilizados separadamente ou em conjunto, ou, no entanto, são adicionados em contínuo ou descontinuamente de acordo com a necessidade durante a fermentação.
As condições de cultura são estabelecidas de tal modo que o organismo cresce de modo que se consegue o rendimento mais elevado possível (o que é avaliado, por exemplo, por meio 26 da quantidade de actividade da proteína recombinante expressa). De preferência a temperatura da cultura situa-se entre 15 °C e 40 °C. São especialmente vantajosas temperaturas entre 25 °C e 37 °c. De preferência o valor do pH é conservado num intervalo de 3 a 9. De modo especialmente vantajoso os valores de pH estão entre 5 e 8. Em geral, é suficiente uma duração de incubação de poucas horas até vários dias, de preferência de 8 horas até 21 dias, de modo especialmente preferido de 4 horas até 14 dias. Durante este período, concentra-se no meio a máxima quantidade de produto.
Uma vez que os meios podem vantajosamente ser optimizados, os especialistas podem, por exemplo, seguir o livro de texto Applied Microbiol Physiology, "A Practical Approach (Eds. PM Rhodes, PF Stanbury, IRL-Press, 1997, páginas 53 -73, ISBN 0 19 963577 3). O processo de acordo com a presente invenção pode ser levado a efeito de modo contínuo ou descontínuo pelo método de batch ou de fed-batch. "Mutação" ou "mutações" significa a substituição, adição, eliminação, inversão ou inserções de um ou vários resíduos de ácidos aminados ou bases/pares de bases. "Homologia" entre duas sequências de ácidos nucleicos significa a identidade da sequência de ácidos nucleicos ao longo do respectivo comprimento da sequência, que é calculada por meio de comparação com o auxílio do algoritmo do programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, EUA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) sob 27 regulação dos seguintes parâmetros 27 50
Gap Weight: 50 Average Match: 10
Length Weight: 3 Average Mismatch: 0 A título de exemplo entende-se por uma sequência que apresenta uma homologia de pelo menos 50% na base de ácidos nucleicos com a sequência SEQ ID NO: 2, uma sequência que numa comparação com a sequência SEQ ID NO: 2 apresenta de acordo com o algoritmo do programa referido acima com o conjunto de parâmetros anterior uma homologia de pelo menos o o . 50 "Homologia" entre dois polipeptídeos significa a identidade da sequência de ácidos aminados ao longo do respectivo comprimento da sequência, que é calculada por meio de comparação com o auxílio do algoritmo do programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, EUA) sob regulação dos seguintes parâmetros:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2,003 A título de exemplo entende-se por uma sequência que apresenta uma homologia de pelo menos 50% na base de proteína com a sequência SEQ ID NO: 9, uma sequência que numa comparação com a sequência SEQ ID NO: 9 apresenta de acordo com o algoritmo do programa referido acima com o conjunto de parâmetros anterior uma homologia de pelo menos 50%.
Para uma expressão óptima de genes heterólogos em 28 organismos pode ser vantajoso alterar as sequências de ácidos nucleicos de modo correspondente à "codon usage" especifica utilizada no organismo. A "codon usage" pode ser facilmente avaliada por meio de interpretação por computador de genes conhecidos do organismo em questão. A construção de ADN que compreende o promotor indutivel de L-ramnose e a sequência de ácidos nucleicos a expressar sob o respectivo controlo garante, com base num acoplamento funcional do referido promotor e da referida sequência de ácidos nucleicos, a transcrição e/ou a tradução da referida sequência de ácidos nucleicos.
Por um acoplamento funcional entende-se em geral uma disposição em que uma sequência de controlo genética pode exercer a sua função em relação à sequência de ácidos nucleicos a expressar. A função pode neste caso significar, por exemplo, o controlo da expressão, isto é, da transcrição e/ou da tradução da sequência de ácidos nucleicos. 0 controlo abrange neste caso, por exemplo, o inicio, a intensificação, a regulação ou a supressão da expressão, isto é da transcrição e eventualmente da tradução. Por um acoplamento funcional entende-se, por exemplo, a disposição de um promotor, da sequência de ácidos nucleicos e eventualmente de outros elementos de regulação como, por exemplo, um terminador, de modo que cada elemento de regulação possa preencher a sua função na expressão da sequência de ácidos nucleicos. São conhecidos dos especialistas diferentes vias a fim de obter uma construção de ADN de acordo com a presente invenção. A preparação pode ser realizada por meio de técnicas de recombinação e de clonagem comuns, como são descritas, por exemplo em T Maniatis, EF Fritsch e J Sambrook, Molecular 29
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) bem como em TJ Silhavy, ML Berman e LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, and Wiley Interscience (1987) A referida construção de ADN pode conter outros elementos funcionais. 0 conceito de elementos funcionais deve ser entendido no seu sentido amplo e significa todas as sequências que têm uma influência sobre s formação, 0 crescimento ou a função da construção de ADN ou organismos de acordo com a presente invenção. Os elementos funcionais garantem, intensificam, regulam ou modificam, por exemplo, a transcrição e eventualmente a tradução em organismos hospedeiros correspondentes.
Os elementos funcionais estão, por exemplo, descritos em "Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)" ou "Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, eds.: Glick and Thompson, Capítulo 7, 89-108" bem como nos trabalhos aí citados. De acordo com cada organismo hospedeiro ou organismo inicial descrito mais em pormenor no que se segue, que é transformado por meio de incorporação do bloco integrado de expressão ou de vectores num organismo geneticamente modificado ou transgénico, são apropriadas diferentes sequências de controlo.
As "sequências de controlo genético" abrangem, por exemplo, a região não traduzida a 5' ou a região a 3' não 30 codificadora dos genes. "Sequências de controlo genético" significa além disso sequências que codificam para proteínas de fusão constituídas por uma sequência de peptídeo de sinal. A título de exemplo, sem porém restringir o seu âmbito, podem citar-se: a) marcadores de selecção
Os marcadores de selecção são, em regra, necessários a fim de seleccionar eficazmente células transformadas e reduzir a perda da construção de ADN das células hospedeiras no decurso do tempo e da divisão celular. Esta perda pode ocorrer neste caso em especial quando a proteína recombinante codificada pela sequência de ácidos nucleicos a expressar tem um efeito tóxico sobre o organismo procariótico. O marcador seleccionável incorporado com a construção de expressão transmite às células transformadas com êxito uma resistência contra um biocida (por exemplo um antibiótico como, por exemplo, ampicilina, canamicina ou higromicina). A título de exemplo podem citar-se como marcadores de selecção:
Amp (resistência à ampicilina; b-lactamase)
Cab (resistência à carbenicilina)
Cam (resistência ao cloranfenicol)
Kan (resistência à canamicina)
Rif (resistência à rifampicina)
Tet (resistência à tetraciclina)
Zeo (resistência à zeomicina)
Spec (espectinomicina) A pressão de selecção é mantida por meio das correspondentes quantidades do antibiótico. A título de 31 exemplo podem citar-se: Ampicilina 100 mg/L, carbenicilina 100 mg/L, cloranfenicol 35 mg/L, canamicina 30 mg/L, rifampicina 200 mg/L, tetraciclina 12,5 mg/L, espectinomicina 50 mg/L.
Os marcadores de selecção abrangem ainda os genes e os produtos genéticos que, por exemplo, por meio de complementação de uma deficiência genética na síntese de ácidos aminados ou de nucleótidos, possibilitam uma selecção de uma célula hospedeira transformada correspondente. Para este fim, utilizam-se entre outros meios que não contêm os referidos ácidos aminados ou os referidos elementos nucleótidos. São conhecidos dos técnicos da especialidade diferentes sistemas deste tipo. A título de exemplo podem citar-se as deficiências na biossíntese do triptofano (por exemplo, trpC), da leucina (por exemplo, leuB), da histidina (por exemplo, hisB), como as que estão presentes, por exemplo, na estirpe de E. coli KC8 (Clontech). Estas deficiências podem ser complementadas, entre outros, pelos marcadores de selecção TRP1, Leu2 e HISS3. b) Terminadores de transcrição O terminador de transcrição reduz uma transcrição indesejável e aumenta a estabilidade do plasmídeo e do ARNm. c) Sequências de Shine-Dalgarno É necessária uma sequência de Shine-Dalgarno (SD) para a iniciação da tradução e é complementar da extremidade 3' do ARN ribossómico 16S. A eficácia da iniciação da tradução no 32 codão de início depende da sequência efectiva. Uma sequência de consenso apropriada para E. coli é, por exemplo: 5'-TAAGGAGG-3'. Esta sequência está localizada a cerca de 4 a 14 nucleótidos a montante do codão de início, estando de modo óptimo a 8 nucleótidos. A fim de evitar a formação de estruturas secundárias (que podem reduzir a expressão), esta região deve de preferência ser rica em nucleótidos A/T. d) Codão de início 0 codão de início é o ponto de começo da tradução. Em E. coli o codão de início utilizado na maioria dos casos é ATG; também se pode utilizar GTG em alternativa. e) "Tags" e proteínas de fusão
Podem ser5 vantajosas fusões terminais em N ou em C da proteína recombinante a expressar com peptídeos mais curtos ("tags") ou outras proteínas (parceiros de fusão). Estas podem, por exemplo, possibilitar uma expressão, uma solubilidade, uma capacidade de detecção e uma pureza melhoradas. De preferência estas fusões são combinadas com sequências de cisão de protease (por exemplo, para trombina ou factor X), que possibilitam a remoção do "tag" do parceiro de fusão após a expressão e purificação. f) Regiões de clonagem múltipla (Multiple cloning site; MCS) permitem e facilitam a inserção de uma ou várias sequências de ácidos nucleicos. g) Codão de paragem/terminadores de tradução 33
Dos três possíveis codões de paragem é preferido o TAA, uma vez que no caso de TAG e de TGA sob determinadas circunstâncias pode ocorrer uma "continuação da leitura" ("read-through") sem interrupção da tradução. Podem também ser de seguida empregues vários codões de paragem a fim de garantir uma terminação segura. h) Genes relatores
Os genes relatores codificam para proteínas facilmente quantificáveis, que garantem uma avaliação da eficácia da transformação, do grau de expressão e da qualidade ou do momento de expressão por meio de uma coloração própria ou de uma actividade enzimática. Os genes relatores podem, por exemplo, codificar para as seguintes proteínas: hidrolases, proteínas fluorescentes, proteínas bioluminescentes, glucosidases ou peroxidases. São preferidas luciferases, β-galactosidases, β-glucoronidases, "Green Fluorescence Protein”, acetiltransferases, fosfotransferases ou adeniltransferases (ver também Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44).
No caso de marcadores de selecçâo ou proteínas relatoras, a sequência de ácidos nucleicos que codifica para as referidas proteínas está de preferência acoplada a um promotor funcional nos organismos hospedeiros procarióticos correspondentes e eventualmente a outras sequências de controlo funcionais a um bloco integrado de expressão. Os promotores e sequência de controlo vantajosos são em geral conhecidos dos especialistas. A título de exemplo podem citar-se promotores como o promotor cos, tac, trp, tet, lpp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR- ou λ-PL. 34 A preparação de uma célula hospedeira transformada ou de um organismo hospedeiro transformado requer que o correspondente ADN (por exemplo um dos blocos integrados de expressão ou dos vectores de acordo com a presente invenção) seja incorporado na célula hospedeira correspondente. Para este processo, que é designado como transformação, existe uma variedade de métodos à disposição (ver também Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). Deste modo, é possível introduzir o ADN a título de exemplo por meio de microinjecção directa, electroporação ou por meio de bombardeamento com micropartículas revestidas com ADN (processo biolístico com o canhão de genes "partícle bombardment”. Também é possível permeabilizar as células por via química, por exemplo com polietilenoglicol, de tal modo que o ADN possa chegar às células por difusão. O ADN pode também seguir por meio de fusão com outras unidades que contenham outros ADN, como minicélulas, células, lisossomas ou lipossomas. A electroporação é um outro método apropriado para a introdução de ADN, no qual as células são permeabilizadas de modo reversível por meio de um impulso eléctrico. Como métodos gerais preferidos podem citar-se transformação mediada por fosfato de cálcio, transformação mediada por DEAE-dextrano, transformação mediada por lípidos catiónicos, electroporação, transdução e infecção. Estes processos são correntes para os especialistas e estão descritos a título exemplificativo (Davis et al. (1986) Basic Methods In Molecular Biology; Sambrook J et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel FM et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons; Glover DM et al. (1995) DNA Cloning Vol. 1, IRL Press ISBN 019-963476-9). 35
As células transformadas, isto é as que contêm o ADN introduzido, podem ser seleccionadas das não transformadas, quando um marcador seleccionável é um componente do ADN introduzido. Foram acima descritos diferentes marcadores de selecção. 0 processo de acordo com a presente invenção não se restringe no que se refere ao tipo e sequência da sequência de ácidos nucleicos a expressar ou da proteína recombinante expressa daí resultante. As sequências de ácidos nucleicos expressas sob o controlo do promotor de L-ramnose indutível podem ser de numerosos tipos. Expressão significa neste contexto transcrição e eventualmente tradução. Para além da expressão de sequências de ácidos nucleicos que codificam para proteínas recombinantes, podem também ser expressas sequências de ácidos nucleicos que, por exemplo, condicionam a transcrição de um ARN anti-sentido e deste modo restringem a expressão de um gene endógeno da célula hospedeira procariótica. Podem ser expressas tanto sequências de origem procariótica como também eucariótica. De preferência são expressas sequências que codificam para proteínas recombinantes que são preparadas em grandes proporções. A título de exemplo, sem porém restringir o seu âmbito, podem citar-se: a) Enzimas, como por exemplo quimosina, proteases, polimerases, sacaridases, desidrogenases, nucleases, glucanases, glucoseoxidass, a-amilase, oxidoredutases (como peroxidases ou lacases), xilanases, fitases, celulases, colagenases, hemicelulasee e lipases. São especialmente preferidas
Enzimas como as que são utilizadas em agentes de lavagem ou outros detergentes como, por exemplo, 36 peroxidase de Meerrettich, proteases, amilases, lipases, esterases ou celulases
Enzimas como as que são utilizadas nas indústrias alimentares como proteases, lipases, lactases, b-glucanases, celulases ou pectinases
Enzimas como as que são utilizadas em processos industriais como lipases, a-amilases, amiloglucosidases, glucoamilases, pululanases ou isomerases de glucose,
Enzimas como as que são utilizadas em processos industriais para a preparação de produtos químicos e produtos de química fina como lipases, amidases, hidratases de nitrilo, esterases ou nitrilases Enzimas como as que são utilizadas na nutrição animal como β-glucanases
Enzimas como as que são utilizadas na indústria do papel e de curtumes como amilases, colagenases, celulases ou xilanases. b) Proteínas de mamíferos como, por exemplo, proteínas sanguíneas (por exemplo, albumina sérica, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor de plasminogénio tecidual, proteína C, factor de von Willebrandt, anti--trombina 111 ou eritropoietina), "Colony
Stimulating Factors" (CFS) (por exemplo, "Granulocyte colony-stimulating factor" (G-CSF), "Macrophage colony-stimulating factor" (M-CSF) ou "Granulocyte macrophage colony-stimulating factor" (GM-CSF)), citocinas (por exemplo, interleucina), integrina, adressina, selectina, anticorpos ou fragmentos de anticorpos, proteínas estruturais (por exemplo, colagénio, fibroína, 37 elastina, tubulina, actina ou miosina), factores de crescimento, proteínas do ciclo celular, inóculos, fibrinogénio, trombina, insulinas.
Com especial preferência, a sequência de ácidos nucleicos a expressar, codifica uma proteína recombinante seleccionada do grupo constituído pelas quimosinas, proteases, polimerases, sacaridases, desidrogenases, nucleases, glucanases, glucoseoxidases, α-amilases, oxiredutases, peroxidases, lacases, xilanases, fitases, celulases, colagenases, hemicelulases, lipases, lactases, pectinases, amiloglucosidases, glucoamilases, pululanases, glucoseisomerases, nitrilases, esterases, hidratases de nitrilo, amidases, oxigenases, oxinitrilases, liases, lactonases, carboxilases, colagenases, celulases, albuminas de soro, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factores plasminogénio dos tecidos, proteína C, factores von Willebrand, antitrombinas, eritropoietinas, „Colony Stimulating Factors", citoquinas, interleuquinas, insulinas, integrinas, adressina, selectinas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas estruturais, colagénio, fibroínas, elastinas, tubulinas, actinas, miosinas, factores de crescimento, proteínas do ciclo celular, soros, fibrinogénios e trombinas.
Numa concretização preferida, a proteína recombinante é uma nitrilase, de preferência uma nitrilase descrita por uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos seleccionada do grupo a) uma sequência de ácidos nucleicos com a sequência representada na SEQ ID NO: 6, b) sequências de ácidos nucleicos derivadas em 38 resultado do código genético degenerado da sequência de ácidos nucleicos representada na SEQ ID NO: 6. c) derivados da sequência de ácidos nucleicos representados na SEQ ID NO: 6 que codificam os polipeptídeos com as sequências de aminoácidos representadas com a SEQ ID NO:7 e apresentam pelo menos 35% de homologia ao nível dos aminoácidos sem que o efeito enzimático do polipeptídeo seja substancialmente reduzido.
Um outro objecto da presente invenção refere-se à utilização das células ou organismos hospedeiros de acordo com a presente invenção, anteriormente descritos para a preparação de produtos alimentares ou rações, produtos farmacêuticos ou de química fina. Produtos de química fina significa de preferência proteínas, enzimas, vitaminas, aminoácidos, açúcares, ácidos gordos, aromatizantes, odorantes e corantes naturais e sintéticos.
Além disso, a presente invenção refere-se ao processo para a preparação de proteínas recombinantes, enzimas e outros produtos de química fina, como por exemplo aldeídos, cetonas ou ácidos carboxílicos (de preferência ácidos carboxílicos quirais) com utilização de uma das células hospedeiras procariotas de acordo com a presente invenção ou preparações das mesmas. As proteínas e enzimas preferidas encontram-se indicadas anteriormente.
Neste caso, a célula hospedeira procariota pode encontrar-se num estado de crescimento, repouso, imobilizado ou de exclusão. Por células excluídas designam-se por exemplo as células que são tornadas permeáveis por meio de um 39 tratamento com, por exemplo, solventes ou células que foram abertas por meio de um tratamento enzimático, de um tratamento mecânico (por exemplo, French Press ou ultra-sons) ou por meio de outros métodos. Os extractos em bruto obtidos desta forma são vantajosamente adequados para o processo de acordo com a presente invenção. Até preparações enzimáticas parcialmente purificadas podem ser utilizadas neste processo. São igualmente adequados microorganismos ou enzimas imobilizados que podem ser vantajosamente utilizados na reacção.
Um outro objecto da presente invenção refere-se ao processo para a preparação de ácidos carboxilicos quirais, em que se faz reagir um nitrilo racémico (ou em alternativa os seus aldeídos precursores e ácido ciânico/sal de cianeto) dos ácidos carboxilicos quirais por meio de tratamento com uma célula hospedeira procarionte, que é pelo menos deficiente no que se refere a uma isomerase de L-ramnose e contém pelo menos uma construção de ADN replicável nas células hospedeiras mencionadas, a qual abrange uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a nitrilase sob o controlo de transcrição de um promotor indutível por L-ramnose, em que o promotor mencionado é heterólogo relativamente à sequência de ácidos nucleicos mencionada. A sequência de ácidos nucleicos que codifica a nitrilase é de preferência seleccionada do grupo das sequências codificadoras das nitrilases anteriormente mencionadas.
Os ácidos carboxilicos quirais são compostos procurados para a síntese química orgânica. São produtos de partida para múltiplas substâncias activas farmacêuticas ou substâncias activas para a protecçao de plantas. Os ácidos carboxilicos quirais podem ser utilizados na cisão de 40 racematos clássica por meio dos sais de diastereómeros. Assim, o ácido mandélico R-(-) ou S-(-) é utilizado por exemplo para a cisão do racemato de aminas racémicas. O ácido mandélico R-(-) é ainda utilizado como produto intermediário na síntese.
Numa concretização preferida, os ácidos carboxílicos quirais da fórmula geral I são preparadas a partir de um nitrilo racémico da fórmula geral II. R* R1 I ! r2-C*-COOH (I) R2-C-CN (II) I ! R3 R3 * um centro opticamente activo R1, R2, R3 independentemente uns dos outro, representam hidrogénio, alquil-Ci-Cio, alcenil-C2-Cio substituído ou não substituído, de cadeia ramificada ou linear, arilo, hetarilo, OR4 ou NR4R5 substituído ou não substituído e em que os resíduos R1, R2 e R3 sã sempre diferentes, R4 representa hidrogénio, alquil-Ci-Cio, alcenil-C2-Cio, alquilcarbonil-Ci-Cio, alcenilcarbonil-C2“Cio, arilo, arilcarbonilo, hetarilo ou hetarilcarbonilo substituído ou não substituído ou de cadeia ramificada ou linear, R5 representa hidrogénio, alquil-Ci-Cio, alcenil-C2-Cio, arilo ou hetarilo substituído ou não substituído, de cadeia ramificada ou linear.
Como nitrilo os mais preferidos são mandelonitrilo, o-cloromandelonitrilo, p-cloromandelonitrilo ou m-cloromandelonitrilo. Como ácidos carboxílicos quirais os 41 mais preferidos são ácido R-mandélico, ácido S-mandélico, ácido R-p-cloromandélico, ácido S-p-cloromandélico, ácido R-m-cloromandélico, ácido S-m-mandélico, ácido R-o-cloromandélico ou ácido S-o-cloromandélico.
Os pormenores da realização destas reacções ou para a purificação dos produtos, etc. são descritos detalhadamente por exemplo em WO 00/23577. Faz-se expressamente referência aos eductos, produtos e parâmetros processuais ai descritos.
Exemplos
Processos gerais de preparação de ácidos nucleicos, como por exemplo, clonagem, cisões de restrição, electroforese em gel de agarose, acoplagens de fragmentos de ADN, transformação de microorganismos, cultivo de bactérias e análise de sequências de ADN recombinante foram executados tal como descrito por Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). A sequenciação de moléculas de ADN recombinantes foi realizada com um sequenciador de ADN de fluorescência laser da firma ABI segundo o método de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463-5467). Os fragmentos resultantes de uma reacção em cadeia de polimerase foram sequenciados e verificados para evitar erros de polimerase em construções para expressar.
Exemplo 1: Caracterização da estirpe E. coli JB1204 Segundo a literatura, a Escherichia coli JB1204 (CGSC6999, Bulawa CE & Raetz CRH (1984) J Biol Chem 259:11257-11264) possui uma inserção transposonina „rha-14::TnlO", não se tendo indicado dados exactos acerca da sequência ou função de „rha-14". JB1204 (um derivado de K12), devido a 42 numerosas outras mutações em estirpes de crescimento como TG1 e W3110 está subjacente, por esse motivo não é ele próprio sujeito à preparação técnica de proteínas.
Para testar se a estirpe E. coli JB1204 ainda metaboliza ramnose e se a indução de um sistema de expressão dependente da ramnose é influenciada em E. coli JB1204 preparam-se células JB1204 competentes e transformadas com o plasmídeo pDHE1650, que é um derivado pJOE e possui o gene de uma nitrilase sob o controlo do promotor de ramnose (o plasmídeo corresponde pDHE19.2 em DE 19848129). Após cultivo durante 15 h a 37 °C em LB-ampicilina-tetraciclina com ou sem ramnose, mediu-se a densidade óptica das culturas e testou-se a actividade da nitrilase após lavagem das células na análise de "Resting-Cell" (vide quadro 1).
No caso de cultivo em presença de L-ramnose verifica-se no caso de JB1204, tal como na estirpe de comparação TG1 uma expressão de nitrilase que não se verifica sem L-ramnose.
Quadro 1
Amostra Adição de ramnose [g/L] Consumo de ramnose DO Reacção ao mandelonitrilo 1 2 - 5,9 + 1 0 - 5,7 - 2 2 + 11,9 + 2 0 - 8,0 - 1. E. coli JB1204 pDHEl650 em LB Amp Tet; 2. E. coli TG1 pDHE1650 em LB Amp (controlo positivo)
Condições de ensaio: Tris HC1 10 mM, mandelonitrilo 6 mM, 40°C
Análise: Parar as amostras com 40 pL HC1 1 M/mL e, após separação das células por meio de HPLC analisar tal como descrito em DE 19848129. 43
Exemplo 2: Preparação da estirpe hospedeira deficiente em ramnose TG10 para a produção de proteínas recombinantes A estirpe TGl utilizada para a preparação de biocatalisadores recombinantes foi modificada por meio de transdução PI de tal forma que já não metaboliza ramnose mas o sistema de expressão baseado na indução de ramnose dos vectores pJOE e pDHE funciona ainda sem ser afectado (designação destes novos derivados da estirpe: TG10).
Para se poder realizar um processo de fermentação económico e com elevado rendimento é importante a selecção da estirpe de E. coli. Para tal foi seleccionada a estirpe hospedeira E. coli TGl que é conhecida pelas fermentações de células de elevada densidade produtivas (Korz et al. (1995) J Biotechnol 39:59-65). A deficiência em ramnose de JB1204 foi transferida por meio de transdução PI e selecção em tetraciclina (15 pg/mL) para TGl pDHE1650 (=TG10 pDHE1650= Lul0569). 15 2.1 Protocolo de transdução PI para transferência da deficiência de ramnose de JB1204 (rhal4::TnlO) em TGl a) Preparação do lisado do dador a) Preparação do lisado do dador
Recolher do dador, portanto JB1204 em 3 mL LB Tet (15 pg/mL) durante cerca de 15 h a 37 °C (cultura precursora).
Incubar 3 mL de Lb-Tet + 5 mM de CaCl2 + 60 pL de cultura precursora (= 1:50) até OD600= 0,3 - 0,5 a 37 °C (cerca de 45 min) + 100 pL (fresco) de lisado dos fagos Pl, agitar bem 44 durante 10-120 min até à lise celular (transparência, em lisados velhos até 5 min) + 60 yL de clorofórmio, 30 s vórtex até à morte das células residuais, armazenagem a 4 °c. b) Infecção dos receptores
Recolher os receptores, portanto TGl pDHEl650
(=Lu9682) em 3 mL LB-Amp cerca de 15 h a 37 °C (cultura precursora) incubar 5 mL de LB-Amp + 5 mM de CaCl2 + 10 mM MgCl2 + 10 mM MgS04 + 100 yL cultura precursora(=1:50) até D06oo= 0,3 - 0,5 a 37 °C (cerca de 30 min), restante cultura precursora em gelo
Colher a cultura precursora e cultura principal, ressuspender em 2,5 mL de LB-Amp-Ca-Mg Incubar em cada recipiente 2 x 100 mL misturar com 0,5, 30, 100 yL de lisado dador bem como um controlo sem recipiente + 100 yL de lisado do dador e 8 min ou 24 min sem agitar a 30 °C (infecção)
Centrifugar + 100 yL citrato de Na de 1 M, pH 7, 0,2 min a 7000 rpm, lavar em 1 mL de tampão de citrato 0,1 M, pH 7,0 por 2-3 x e ressuspender, 1 h 37°C sem agitar
Colher, ressuspender em 100 yL, citrato de Na 0,02 M, pH 7,0
Distribuir cada 80 yL por placas sobre LB-Amp-Tet bem como cada 10 yL da mistura sem adição de lisado dador sobre LB/Amp, incubação de um dia para o outro a 37 °C
Sobre LB-Amp obtém-se erva (controlo). Colher as colónias de LB-Amp-Tet e verificar as resistências, deficiência e capacidade de indução de ramnose, 45 actividade.
Paralelamente, transduziu-se também TG1 pDHE1650 pAgro4 pHSG575, o Pendant de TGl pDHEl650 com co-expressão Chaperon (GroESL), (+espectinomicina 50 pg/mL e cloranfenicol 10 pg/mL em meio; Designação TG10 pDHE1650 pAgro4 pHSG575=Lul0571).
Após cultivo de um dia para outro dos clones obtidos em 3 mL de LB-ampicilina-ramnose (cerca de 2 g/L)-meio (± tetraciclina 10 pL/mL) determinaram-se as densidades ópticas (9=600 nm) das culturas. A análise HPLC do sobrenadante da cultura revelou que a estirpe E. coli obtida TG10 pDHE1650 ramnose não pode metabolizar. As células foram em seguida lavadas em tampão e ensaiadas em Resting-Cell-Assay quanto à sua actividade nitrilo (quadro 2). Os clones deficientes em ramnose revelam uma actividade saponificadora do nitrilo como a estirpe de comparação correspondente (TglpDHEl650). A concentração de ramnose quase que não diminui no clones.
Quadro 2
Amostra resíduo de ramnose [g/L] Cone. celular [x vezes] Tempo incub. [min] Ácido [mM] Actividade (lx) [U/L] DOgoo Actividade DOfflo MW [U/L] Em branco - 0 60 0,01 0 TG10 pDHE1650 1,71 0,01 60 1,02 1700 6,01 324 0,05 10 1,10 2200 TGl pDHE1650 0 0,01 60 0,84 1400 7,90 180 0,05 10 0,72 1440 TG10 pDHE1650 pAgropHSG 1,67 0,01 60 0,78 1300 5,01 295 0,05 10 0,83 1660 TGl pDHE1650 pAgropHSG 0,34 0,01 60 1,18 1967 7,51 297 0,05 10 1,25 2500
Condições de ensaio:
Tris HCl 110 mM, mandelonitrilo 6 mM, 40 °C 46
Análise: Parar as amostras com 40 yL HC1 1 M/mL e, após separação das células por meio de HPLC analisar tal como descrito em DE 19848129 (1U = 1 pmol ácido mandélico/min.
Exemplo 3: "Curing" da estirpe hospedeira deficiente em ramnose TGl pDHEl650 A execução da transdução com E. coli TGl pDHE1650 trouxe a vantagem da selecção contra a estirpe original JB1204 com ampicilina. Para outros trabalhos utilizou-se porém uma estirpe hospedeira isenta de plasmideos, isto é o plasmideo pDHE1650 deve ser removido de TG10 pDHE1650 („Curing" de TG pDHE1650) . Com esse fim inoculou-se E. coli TG10 pDHE1650 tirado de gelo em 3 mL de LB sem ampicilina e incubou-se ÍJN a 37 °C. Destes inocularam-se culturas principais de 3 mL 1:100 em LB-Tet, que foram submetidas a um choque de calor (2,5 min a 42°C). Após 16 h de agitação a 37°C o OD60o da cultura era de 1,3 (corresponde a cerca de l,3xl09 células/mL) . A cada 100 pL das etapas de diluição IO'4 a 10“7 foram colocadas em placas sobre LB-Tet e as colónias obtidas (560+140+15+0) transferidas sobre LB-Tet com ampicilina. Um clone que teve ai um fraco desenvolvimento foi uma vez mais pincelado sobre LB-Amp-Tet. Não cresceu em LB-Amp-Tet e após minipreparação não revelou qualquer ADN plasmideo. Este clone sensível à ampicilina foi designado como TG10 (=Lul0568) e serviu como estirpe de partida para novas estirpes de superexpressão. 47
Exemplo 4: Preparação de hidrolase de L-pantolactona recombinante com a estirpe hospedeira deficiente em ramnose E. coli TG10
Prepararam-se células competentes de E. coli TG10 e transformaram-se com o plasmídeo pDHE681, pAgro4 e pHSG575 (amostra 1 no quadro 3). Após cultivo de um dia para outro a 37 °C as células revelaram uma elevada actividade de L-pantolactona em comparação com a estirpe de controlo correspondente (TG1 pDHE681 pAgro4 pHSG575 = amostra 2 no quadro 3), cuja actividade máxima i.d. R. foi atingida passadas 6 a 7 h de incubação (cerca de 1500 U/L) que diminuiu intensamente por meio de uma incubação mais longa. A ramnose (0,5 g/L) não foi metabolizada por TG10 pDHE681 pAgro4 pHSG575.
Quadro 3
Amostra resíduo de ramnose [g/L] 8 s o Cone. celular [x vezes] Tempo incub [h] Ácido [mM] Actividade (lx) [U/L] Actividade ODfflo [U/L] branco - 0 1,0 1,74 - 1 0,52 6,35 0,2 1,0 29,9 2344,2 369,2 2 0 6,64 0,2 1,0 6,27 377,5 56,9 1. TG10 pDHE681 pAgro4 pHSG575; LB com ampicilina (Amp; 100 pg/mL) tetraciclina (Tet 10 pg/mL), L-ramnose(Rha 0,5 g/L) e isopropiltiogalactosídeo (IPTG 0,15 mM) 2. TG1 pDHE681 pAgro4 pHSG575; LB com ampicilina (Amp; 100 pg/mL), L-ramnose (Rha 0,5 g/L) e isopropilgalactosídeo (IPTG 0,15 mM) O ensaio foi repetido mais pormenorizadamente A adição de tetraciclina (15 pg/mL) ao meio não é necessária para se obter a deficiência de ramnose. 48
Exemplo 5: Determinação da dependência da indução da concentração de L-ramnose A estirpe E. coli TG10 (pDHEl650, pAgro4, pHSG575) foi recolhida de forma análoga ao exemplo 1 em LB ampicilina (100 mg/L), cloranfenicol 10 mg/L, espectiomicina (50 mg/L), IPTG 0,15 mM em presença de diferentes quantidades de ramnose (0 a 2 g/L de ramnose) e foi examinada quanto a uma actividade de nitrilo especifica (dupla determinação) . Mesmo uma concentração de 0,01 g/L de L-ramnose produz uma indução da expressão significativa em média, enquanto que na ausência de ramnose não foi possível detectar uma expressão significativa (pela actividade enzimática).
Cf. também fig. 1: A: Representação da actividade relativa (% act. rei.) proporcionalmente à concentração de L-ramnose (conc. em g/L) B: Representação da actividade específica relativa (% act. espec. rei.) proporcionalmente à concentração de L-ramnose (conc. em g/L) 49 Quadro 4 Cone de ramnose OD60o Activ. rei, .Activ 0,00 5,4 0,1% 0,1% 0,01 6,2 66% 65% 0,02 5,8 70% 73% 0,04 5,7 85% 92% 0,05 5,2 83% 98% 0,07 5, 9 90% 93% 0,10 6,0 97% 98% 0,15 5,6 101% 111% 0,20 5,6 100% 108% 0,30 5,3 99% 115% 0,40 5,7 107% 114% 0,50 6,2 102% 100% 1,00 5,8 101% 108% 2,00 6,1 100% 100% 0 + Tet 4,7 0% 0% 0,5 + Tet 5,1 81% 98% 2,0 + Tet 4,5 86% 117% rei. [g/L]
Exemplo 6: Análise do tipo de integração do transposão em estirpe de E. coli TG10 deficiente em L-ramnose isomerase
Para caracterizar o tipo de integração do transposão TnlO mais detalhadamente analisaram-se os genes de ramnose rhaT, rhaB, rhaA e rhaD por meio de PCR (polimerase Pfu) em comparação de TG1 (pDHE681) e TG10 (pDHE681). Com a amplificação de rhaA (isomerase de L-ramnose) ou a região rhaA-rhaD com os iniciadores MKe259/260 ou MKe 258/259 não se obteve com a estirpe mutada TG10, ao contrário da estirpe selvagem TG1, um amplificado especifico. MKe258 5'-CCCAAGC7TGGATCATGTTTGCTCCTTACAG (rhaD 3'Ende + Hlndiil) ΜΚό25θ ^GCGAATTCGCATGACCACTCAAGTGGAACA (rhaA 5’Ende + EcõRS} MKe260 5-CCCAAGCTTACCCGCGGCGACTCAAAATTT {rhaA 3’Ende + Hlndiil) 50
Exemplo 7: Preparação de uma estirpe de E. coli deficiente em isomerase de L-ramnose por meio de knockout orientado
Para a inactivação da isomerase de L-ramnose (rhaA) o gene rhaA é primeiro amplificado com os iniciadores MkeOOl e Mke002 e clonado em pBluescriptSK+ (digestão e ligação Xbal/Hindlll). Em seguida, por meio de digestão de restrição com BamHI e reacção de enchimento com fragmento de Klenow, bem como subsequente ligação introduz-se um frameshift e o fragmento rha* no vector de substituição do gene pK03 (Link et al. (1997) J Bacteriol 179:6228-6237). O knockout do gene rhaA em TG1 pDHE1650 por meio de recombinação homóloga com a construção rha* foi realizado segundo Link et al. ((Link et al. (1997) J Bacteriol 179:6228-6237)) por meio de selecção em cloranfenicol, a 43 °C, replicação em placas sobre sacarose a 30°C e subsequente verificação sobre agar de McConkey com 1 g/L de ramnose. MKe001: S'ATAAGAATGCGGCCGCATGACCACTCAACTGGAACA-3’ M KeOG2: δ'ΌΤΑΘΟΤCTAGATTACCCGCGGCGÁCTCAA-S’
Exemplo 8: Preparação de nitrilase recombinante com a estirpe hospedeira deficiente em ramnose TG10 A fermentação Fed-Batch de derivados de TG10, como TG10 pDHE1650 pAgro4 pHSG575 é realizada num meio de Riesenberg modificado, com glicerina como fonte C e ramnose como indutor para a superexpressão da proteína alvo, neste caso a nitrilase. Com a estirpe conseguiram-se densidades celulares e actividades enzimáticas comparáveis e superiores 51 8.1 Fermentação de E. coli TG 1 A fermentação do Escherichia coli (TG1 pDHE1650 pAgro4 pHSG575) foi realizada no biorreactor de 20 L. O reactor com volumes de trabalho de 10 L foi inoculado com 200 mL de cultura precursora a partir de balões de agitação. O meio da cultura precursora corresponde ao meio da cultura principal.
Meio: 40 g 15 g 13,3 g 5 g 4 g 1,7 g 1,1 g 1 mL 0,1 mL 0,062 g 10 mg Até 1 L
Glicerina 99,5% triptona di-hidrogenofosfato de potássio Extracto de fermento Hidrogenofosfato de di-amónio ácido cítrico
Sulfato de magnésio hepta-hidratado
Solução de elementos vestigiais SL Korz 1000 C
Antiespumante Tego KS 911
Sulfato de ferro (II) hepta-hidratado
Cloridrato de tiamina Água PU O meio foi esterilizado durante 30 min a 121 °C. Em seguida adiciona-se 0,1 g de ampicilina em condições estéreis Solução de elementos vestigiais ácido cítrico *H20 20 g
Cloreto de cobalto (II) hexaclorado (C0CI2 * 6H20) 2,5 g
Cloreto de manganês (II) tetraclorado (MnCl2 * 4H20) 3,0 g
Cloreto de cobre (II) di-hidratado (CuCl2 * 2H20) 0,3 g Ácido bórico (H3B03) 0,6 g
Molibdato de sódio di-hidratado (Na2Mo04 * 2H20) 0,5 g
Acetato de zinco di-hidratado (Zn(CH3COO)2 * 2H20) 2,6 g
Até 1 L H20 PU 52
Solução de alimentação de glicerina
2 L Água PU 211 g sulfato de sódio 13,6 g Sulfato de ferro (II) hepta-hidratado 8,8 kg Glicerina 99,5 % 220 mL Solução de elementos vestigiais
Solução de alimentação de ramnose 703 g Água PU 297 g mono-hidrato de ramnose A fermentação é realizada a uma temperatura de 37°C. A gaseificação é regulada entre 8 a 30 L/min, o número de rotações entre 400 e 1500 L/min a fim de não ultrapassar um pC>2 de 20 %. Após 1 h de tempo de fermentação a cultura é induzida com IPTG (0,15 mM) . Em seguida, adicionam-se 76 mL de solução de alimentação de ramnose. No caso de uma concentração insuficiente de ramnose no fermentador, de 1,0 g/L acrescenta-se mais solução de alimentação de ramnose. Depois de consumida a quantidade de glicerina colocada previamente, alimenta-se de forma continua com mais glicerina.
Resultados: 53
Tempo po2 BTM ramnose Solução de alimentação de ramnose glicerina [h] [%] [g/L] [g/L] [g] [g/L] 0 0 0 0 0 40.0 2 75,8 2,3 1,70 76 35.9 5 20,5 7,5 1,54 115 33.6 8 33,7 17,3 1, 96 244 25.4 11 39,3 15,7 3,11 365 17.0 14 22,6 18,8 2,71 364 8.6 17 30,1 21,4 1,87 404 0 20 35,1 24,8 1,36 474 0 23 21,5 31,8 1,18 673 0 26 23, 9 28,7 1,80 970 0 29 36,4 42,2 0,48 1234 0 32 28,5 38,7 1,20 1639 0 35 29,8 47,0 1,22 2033 0 38 44,3 49,2 1,19 2474 0 41 47,6 45, 4 1,45 2879 0 44 46,2 45,2 1,80 3237 0
Actividade passadas 44 h: 57200 U/L 8.2 Fermentação de E. coli TG 10 A fermentação do Escherichia coli TG10 (pDHE1650 pAgro4 pHSG575) é realizada segundo as mesmas instruções do exemplo 1 com a diferença da indução ser realizada com 18,5 g de solução de alimentação de ramnose. Não se realizou qualquer dosagem posterior de ramnose.
Resultados: 54
Tempo p02 BTM ramnose Solução de alimentação de ramnose glicerina [h] [%] [g/L] [g/L] [g] [g/L] 0 0 0 0,00 0 40,0 2 71,4 2,7 0,58 18,5 38,6 5 20,7 7,0 0,59 18,5 36,5 8 21,7 13,2 0,59 18,5 26,4 11 1 31,1 16,9 0,57 18,5 13,2 14 44,6 19,0 0,60 18,5 0 17 50,5 24,0 0,58 18,5 0 20 35,9 26,1 0,57 18,5 0 23 33,9 33,4 0,58 18,5 0 26 40,4 36,0 0,57 18,5 0 29 38,2 40,8 0,55 18,5 0 32 34,3 45,3 0,58 18,5 0 35 45,7 48,7 0,50 18,5 0 38 40,0 50,7 0,50 18,5 0 41 31,8 52,5 0,44 18,5 0 44 29,5 50,0 0,44 18,5 0 Actividade passadas 44h: 59200 U/L 8.3 Ensaio de actividade: A 880 pL de tampão de sódio-potássio-fosfato (10 mM) são pipetados 50 pL de suspensão de células e tempera-se a 30°C. A reacção é iniciada por meio da adição de 20 pL de solução de mandelonitrilo metanólica (12%). Passados 10 min pára-se a reacção enzimática por meio da adição de 50 pL de HCl 1M. A massa celular é separada por centrifugação e a concentração de ácido mandélico em sobrenadante é medida por meio de HPLC (ODS Hypersil 100*2,0 mm, eluente: 75% H3PO4 (14,8 mM) / 25% metanol; caudal: 0,5 mL/min; volumes de injecção: 2 pL; temperatura da coluna: 40 °C; detecção: 210 nm; tempo de retenção do ácido mandélico: 0,9 min). 55 8.4 Determinação da concentração de ramnose:
Para uma recolha online de amostra do fermentador recorre-se a um filtro cerâmico e uma bomba peristáltica continua. A programação do aparelho de HPLC é feita de forma que após cada análise concluída tenha lugar uma nova injecção. Entretanto, o filtrado é bombeado do fermentador para um recipiente de resíduos.
HPX 87 H, l,í H2S04 0,005 M 0,5 mL/min 1 μ L 55 °C RI x 300 mm
Condições da cromatografia: Coluna:
Eluente:
Caudal:
Volumes de injecção: Temperatura da coluna: Detecção: PROTOCOLO DE SEQUÊNCIAS <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Sistema de expressão indutível por L ramnose <130> AE20020689 <140> <141> <160> 19 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 2046 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> característica div <222> (288).. (1121) 56 <223> codifica para rhaS (regulador positivo do operão rhaBAD) <2 2 0> <221> caracteristica div <222> (1108) .. (2043) <223> codifica para rhaR (regulador positivo do operão rhaRS) <2 2 0> <221> ligação proteica <222> (56)..(72) <223> sitio potencial de ligação de RhaS <2 2 0> <221> ligação proteica <222> (89)..(105) <223> sitio potencial de ligação de RhaS <2 2 0> <221> ligação proteica <222> (172)..(203) <223> sítio potencial de ligação de RhaR <220> <221> ligação proteica <222> (210) ..(241) <223> sítio potencial de ligação de RhaR <220> <221> caracteristica div <222> (24) <223> início potencial da transcrição (complemento) <400> 1 aatgtgatcc tgctgaattt cattacgacc ctcgttactg acaggaaaat gggccattgg cacaatttgc tgaattgtgg tgatgtgatg atcttgaaaa atcgacgttt tttacgtggt acctcgtgat tactatttcg ccgtgttgac atagtgtgga tttttttccg tctggtaacg aggcggattt tcctgaacat catcatgatt cgggtattca tgtgtttaat gggcagccct tacgcgatca tgatcggcat ctgtatgaac agtctaaaaa gcgcctgaat tcgcgacctt 60 caaccaggga aagatgaacg tgatgatgtt 120 ctcaccgcat ttcctgaaaa ttcacgctgt 180 tttccgtcga aaatttaagg taagaacctg 240 gacatcagga ggccagtatg accgtattac 300 cgtccgtggc gatagaaccc cggctcccgc 360 ttcatgaaat tgtgattgtc gaacatggca 420 ataccatcac cggtggcacg gtctgtttcg 480 ataccgataa tctgtgtctg accaatgtgc 540 57 tgtatcgctc gccggatcga tttcagtttc tcgccgggct gaatcagttg ctgccacaag 600 agctggatgg gcagtatccg tctcactggc gcgttaacca cagcgtattg cagcaggtgc 660 gacagctggt tgcacagatg gaacagcagg aaggggaaaa tgatttaccc tcgaccgcca 720 gtcgcgagat cttgtttatg caattactgc tcttgctgcg taaaagcagt ttgcaggaga 780 acctggaaaa cagcgcatca cgtctcaact tgcttctggc ctggctggag gaccattttg 840 ccgatgaggt gaattgggat gccgtggcgg atcaattttc tctttcactg cgtacgctac 900 atcggcagct taagcagcaa acgggactga cgcctcagcg atacctgaac cgcctgcgac 960 tgatgaaagc ccgacatctg ctacgccaca gcgaggccag cgttactgac atcgcctatc 1020 gctgtggatt cagcgacagt aaccactttt cgacgctttt tcgccgagag tttaactggt 1080 caccgcgtga tattcgccag ggacgggatg gctttctgca ataacgcgaa tcttctcaac 1140 gtatttgtac gccatattgc gaataatcaa cttcgttctc tggccgaggt agccacggtg 1200 gcgcatcagt taaaacttct caaagatgat ttttttgcca gcgaccagca ggcagtcgct 1260 gtggctgacc gttatccgca agatgtcttt gctgaacata cacatgattt ttgtgagctg 1320 gtgattgtct ggcgcggtaa tggcctgcat gtactcaacg atcgccctta tcgcattacc 1380 cgtggcgatc tcttttacat tcatgctgac gataaacact cctacgcttc cgttaacgat 1440 ctggttttgc agaatattat ttattgcccg gagcgtctga agctgaatct tgactggcag 1500 ggggcgattc cgggatttaa cgccagcgca gggcaaccac actggcgctt aggtagcatg 1560 gggatggcgc aggcgcggca ggttatcggt cagcttgagc atgaaagtag tcagcatgtg 1620 ccgtttgcta acgaaatggc tgagttgctg ttcgggcagt tggtgatgtt gctgaatcgc 1680 catcgttaca ccagtgattc gttgccgcca acatccagcg aaacgttgct ggataagctg 1740 attacccggc tggcggctag cctgaaaagt ccctttgcgc tggataaatt ttgtgatgag 1800 gcatcgtgca gtgagcgcgt tttgcgtcag caatttcgcc agcagactgg aatgaccatc 1860 aatcaatatc tgcgacaggt cagagtgtgt catgcgcaat atcttctcca gcatagccgc 1920 ctgttaatca gtgatatttc gaccgaatgt ggctttgaag atagtaacta tttttcggtg 1980 gtgtttaccc gggaaaccgg gatgacgccc agccagtggc gtcatctcaa ttcgcagaaa 2040 gattaa 2046
<210> 2 <211> 287 <212> ADN <213> Escherichia coli <2 2 0> <221> promotor <222> (1)..(287)
<223> fragmento do promotor rhaBAD contendo sítios de ligação rhaS e rhaR 58 <4Ο0> 2 aatagtaatc acgaggtcag gttcttacct 60 cgtcgatttt tcaagataca gcgtgaattt 120 caattcagca aattgtgaac atcatcacgt 180 ttcctgtcag taacgagaag gtcgcgaatt 240 ttcagcagga tcacatt 287 actggcctcc tgatgtcgtc aacacggcga taaattttcg acggaaaacc acgtaaaaaa tcaggaaatg cggtgagcat cacatcacca tcatctttcc ctggttgcca atggcccatt caggcgcttt ttagactggt cgtaatgaaa
<210> 3 <211> 125 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> promotor <222> (1) .. (125)
<223> fragmento do promotor rhaBAD contendo sítio de ligação RhaS <400> 3 ttgtgaacat catcacgttc atctttccct ggttgccaat ggcccatttt cctgtcagta 60 acgagaaggt cgcgaattca ggcgcttttt agactggtcg taatgaaatt cagcaggatc 120 acatt 125
<210> 4 <211> 123 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> promotor <222> (1)..(123)
<223> fragmento do promotor rhaBAD contendo sítio de ligação RhaS <400> 4 atcaccacaa ttcagcaaat tgtgaacatc atcacgttca tctttccctg gttgccaatg 60 gcccattttc ctgtcagtaa cgagaaggtc gcgaattcag gcgcttttta gactggtcgt 120 aat 123
<210> 5 <211> 51 <212> ADN <213> Escherichia coli 59 <220> <221> característica div <222> (1) . . (51) <223> sítio de ligação RhaS palindrómico do promotor rhaBAD <400> 5 atctttccct ggttgccaat ggcccatttt cctgtcagta acgagaaggt c 51
<210> 6 <211> 1071 <212> ADN <213> Alcaligenes faecalis <220>
<221> CDS <222> (1) .. (1068) <223> codifica para nitrilase <400> 6 atg cag aca aga aaa ate gtc cgg gca gee gee gta cag gee gee tet 48 Met Gin Thr Arg Lys Ile Vai Arg Ala Ala Ala Vai Gin Ala Ala Ser 1 5 10 15 ccc aac tac gat ctg gca acg ggt gtt gat aaa acc att gag ctg gct 96 Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Vai Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala 20 25 30 cgt cag gee ege gat gag ggc tgt gac ctg ate gtg ttt ggt gaa acc 144 Arg Gin Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Vai Phe Gly Glu Thr 35 40 45 tgg ctg ccc gga tat ccc ttc cac gtc tgg ctg ggc gca ccg gee tgg 192 Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Vai Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp 50 55 60 tcg ctg aaa tac agt gee ege tac tat gee aac tcg etc tcg ctg gac 240 Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp 65 70 75 80 agt gca gag ttt caa ege att gee cag gee gca cgg acc ttg ggt att 288 Ser Ala Glu Phe Gin Arg Ile Ala Gin Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile 85 90 95 ttc ate gca ctg ggt tat age gag ege age ggc ggc age ctt tac ctg 336 Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu 100 105 110 ggc caa tgc ctg ate gac gac aag ggc gag atg ctg tgg tcg cgt ege 384 Gly Gin Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg 115 120 125 60 aaa ctc aaa ccc acg cat gta gag ege acc gta ttt ggt gaa ggt tat 432 Lys Leu Lys Pro Thr His Vai Glu Arg Thr Vai Phe Gly Glu Gly Tyr 130 135 140 gcc cgt gat ctg att gtg tcc gac aca gaa ctg gga ege gtc ggt gct 480 Ala Arg Asp Leu Ile Vai Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Vai Gly Ala 145 150 155 160 cta tgc tgc tgg gag cat ttg tcg ccc ttg age aag tac gcg ctg tac 528 Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr 165 170 175 tcc cag cat gaa gcc att cac att gct gcc tgg ccg tcg ttt tcg cta 576 Ser Gin His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu 180 185 190 tac age gaa cag gcc cac gcc ctc agt gcc aag gtg aac atg gct gcc 624 Tyr Ser Glu Gin Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Vai Asn Met Ala Ala 195 200 205 tcg caa ate tat tcg gtt gaa ggc cag tgc ttt acc ate gcc gcc age 672 Ser Gin Ile Tyr Ser Vai Glu Gly Gin Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser 210 215 220 agt gtg gtc acc caa gag acg cta gac atg ctg gaa gtg ggt gaa cac 720 Ser Vai Vai Thr Gin Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Vai Gly Glu His 225 230 235 240 aac gcc ccc ttg ctg aaa gtg ggc ggc ggc agt tcc atg att ttt gcg 768 Asn Ala Pro Leu Leu Lys Vai Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala 245 250 255 ccg gac gga ege aca ctg gct ccc tac ctg cct cac gat gcc gag ggc 816 Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly 260 265 270 ttg ate att gcc gat ctg aat atg gag gag att gcc ttc gcc aaa gcg 864 Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala 275 280 285 ate aat gac ccc gta ggc cac tat tcc aaa ccc gag gcc acc cgt ctg 912 Ile Asn Asp Pro Vai Gly His Tyr Ser F Pro Glu Ala Thr Arg Leu 290 295 Lys 300 gtg ctg gac ttg ggg cac cga gac ccc atg act cgg gtg cac tcc aaa 960 Vai Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Vai His Ser Lys 305 310 315 320 age gtg acc agg gaa gag gct ccc gag caa ggt gtg caa age aag att 1008 Ser Vai Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Vai Gin Ser Lys Ile 325 330 335 gcc tea gtc gct ate age cat cca cag gac tcg gac aca ctg cta gtg 1056 Ala Ser Vai Ala Ile Ser His Pro Gin Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val 340 345 350 61 caa gag ccg tct tga 1071
Gin Glu Pro Ser 355
<210> 7 <211> 356 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis <400> 7
Met Gin Thr Arg Lys O» 1-1 1—1 Vai Arg Ala Ala Ala Vai Gin Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Asn Tyr ASp Leu Ala Thr Gly Vai Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala 20 25 30 Arg Gin Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Vai Phe Gly Glu Thr 35 40 45 Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Vai Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp 50 55 60 Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp 65 70 75 80 Ser Ala Glu Phe Gin Arg Ile Ala Gin Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile 85 90 95 Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu 100 105 110 Gly Gin Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg 115 120 125 Lys Leu Lys Pro Thr His Vai Glu Arg Thr Vai Phe Gly Glu Gly Tyr 130 135 140 Ala Arg Asp Leu Ile Vai Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Vai Gly Ala 145 150 155 160 Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr 165 170 175 Ser Gin His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu 180 185 190 62
Tyr Ser Glu Gin Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Vai Asn Met Ala Ala 195 200 205 Ser Gin Ile Tyr Ser Vai Glu Gly Gin Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser 210 215 220 Ser Vai Vai Thr Gin Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Vai Gly Glu His 225 230 235 240 Asn Ala Pro Leu Leu Lys Vai Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala 245 250 255 Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly 260 265 270 Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala 275 280 285 Ile Asn Asp Pro Vai Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu 290 295 300 Vai Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Vai His Ser Lys 305 310 315 320 Ser Vai Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Vai Gin Ser Lys Ile 325 330 335 Ala Ser Vai Ala Ile Ser His Pro Gin Asp Ser Asp Thr Leu Leu Vai 340 345 350 Gin Glu Pro Ser 355 <210> 8 <211> 1260
<212> ADN <213> Escherichia coli <2 2 0> <221> CDS <222> (1) .. (1257) <223> codifica para rhaA (isomerase de L-ramnose) 63 <4Ο0> 8 atg Acc act caa ctg gaa cag gee tgg gag cta gcg aaa cag cgt ttc 48 Met Thr Thr Gin Leu Glu Gin Ala Trp Glu Leu Ala Lys Gin Arg Phe 1 5 10 15 gcg gcg gtg ggg att gat gtc gag gag gcg ctg ege caa ctt gat cgt 96 Ala Ala Vai Gly Ile Asp Vai Glu Glu Ala Leu Arg Gin Leu Asp Arg 20 25 30 tta ccc gtt tea atg cac tgc tgg cag ggc gat gat gtt tcc ggt ttt 144 Leu Pro Vai Ser Met His Cys Trp Gin Gly Asp Asp Vai Ser Gly Phe 35 40 45 gaa aac ccg gaa ggt teg ctg acc ggg ggg att cag gee aca ggc aat 192 Glu Asn Pro Glu Gly Ser Leu Thr Gly Gly Ile Gin Ala Thr Gly Asn 50 55 6 0 tat ccg ggc aaa gcg cgt aat gee agt gag cta cgt gee gat ctg gaa 240 Tyr Pro Gly Lys Ala Arg Asn Ala Ser Glu Leu Arg Ala Asp Leu Glu 65 70 75 80 cag gct atg cgg ctg att ccg ggg ccg aaa cgg ctt aat tta cat gee 288 Gin Ala Met Arg Leu Ile Pro Gly Pro Lys Arg Leu Asn Leu His Ala 85 90 95 ate tat ctg gaa tea gat acg cca gtc teg ege gac cag ate aaa cca 336 Ile Tyr Leu Glu Ser Asp Thr Pro Vai Ser Arg Asp Gin Ile Lys Pro 100 105 110 gag cac ttc aaa aac tgg gtt gaa tgg gcg aaa gee aat cag etc ggt 384 Glu His Phe Lys Asn Trp Vai Glu Trp Ala Lys Ala Asn Gin Leu Gly 115 120 125 ctg gat ttt aac ccc tcc tgc ttt teg cat ccg cta age gee gat ggc 432 Leu Asp Phe Asn Pro Ser Cys Phe Ser His Pro Leu Ser Ala Asp Gly 130 135 140 ttt acg ctt tcc cat gee gac gac age att ege cag ttc tgg att gat 480 Phe Thr Leu Ser His Ala Asp Asp Ser Ile Arg Gin Phe Trp Ile Asp 145 150 155 160 64 cac tgc aaa gee age cgt ege gtt teg gee tat ttt ggc gag caa etc 528 His Cys Lys Ala Ser Arg Arg Vai Ser Ala Tyr Phe Gly Glu Gin Leu 165 170 175 ggc aca cca teg gtg atg aac ate tgg ate ccg gat ggt atg aaa gat 576 Gly Thr Pro Ser Vai Met Asn Ile Trp Ile Pro Asp Gly Met Lys Asp 180 185 190 ate acc gtt gac cgt etc gee ccg cgt cag cgt ctg ctg gea gea ctg 624 Ile Thr Vai Asp Arg Leu Ala Pro Arg Gin Arg Leu Leu Ala Ala Leu 195 200 205 gat gag gtg ate age gag aag cta aac cct gcg cac cat ate gac gee 672 Asp Glu Vai Ile Ser Glu Lys Leu Asn Pro Ala His His Ile Asp Ala 210 215 220 gtt gag age aaa ttg ttt ggc att ggc gea gag age tac acg gtt ggc 720 Vai Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ala Glu Ser Tyr Thr Vai Gly 225 230 235 240 tcc aat gag ttt tac atg ggg tat gee acc age ege cag act gcg ctg 768 Ser Asn Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Ala Thr Ser Arg Gin Thr Ala Leu 245 250 255 tgc ctg gac gee ggg cac ttc cac ccg act gaa gtg att tcc gac aag 816 Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr Glu Vai Ile Ser Asp Lys 260 265 270 att tcc gee gee atg ctg tat gtg ccg cag ttg ctg ctg cac gtc age 864 Ile Ser Ala Ala Met Leu Tyr Vai Pro Gin Leu Leu Leu His Vai Ser 275 280 285 cgt ccg gtt ege tgg gac age gat cac gta gtg ctg ctg gat gat gaa 912 Arg Pro Vai Arg Trp Asp Ser Asp His Vai Vai Leu Leu Asp Asp Glu 290 295 300 acc cag gea att gee agt gag att gtg cgt cac gat ctg ttt gac cgg 960 Thr Gin Ala Ile Ala Ser Glu Ile Vai Arg His Asp Leu Phe Asp Arg 305 310 315 320 65 gtg cat ate ggc ctt gac ttc ttc gat gee tet ate aac ege att gee 1008 Vai His Ile Gly Leu Asp Phe Phe Asp Ala Ser Ile Asn Arg Ile Ala 325 330 335 gcg tgg gtc att ggt aca ege aat atg aaa aaa gee ctg ctg cgt gcg 1056 Ala Trp Vai Ile Gly Thr Arg Asn Met Lys Lys Ala Leu Leu Arg Ala 340 345 350 ttg ctg gaa cct acc gct gac gtg ege aag ctg gaa gcg gcg ggc gat 1104 Leu Leu Glu Pro Thr Ala Asp Vai Arg Lys Leu Glu Ala Ala Gly Asp 355 360 365 tac act gcg cgt ctg gea ctg ctg gaa gag cag aaa teg ttg ccg tgg 1152 Tyr Thr Ala Arg Leu Ala Leu Leu Glu Glu Gin Lys Ser Leu Pro Trp 370 375 380 cag gcg gtc tgg gaa atg tat tgc caa cgt cac gat acg cca gea ggt 1200 Gin Ala Vai Trp Glu Met Tyr Cys Gin Arg His Asp Thr Pro Ala Gly 385 390 395 400 age gaa tgg ctg gag age gtg cgg gct tat gag aaa gaa att ttg agt 1248 Ser Glu Trp Leu Glu Ser Vai Arg Ala Tyr Glu Lys Glu Ile Leu Ser 405 410 415 ege ege ggg taa 1260 Arg Arg Gly
<210> 9 <211> 419 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9
Met Thr Thr Gin Leu Glu Gin Ala Trp Glu Leu Ala Lys Gin Arg Phe 15 10 15
Ala Ala Vai Gly Ile Asp Vai Glu Glu Ala Leu Arg Gin Leu Asp Arg 20 25 30 66
Leu Pro Vai Ser Met His Cys Trp Gin Gly Asp Asp Vai Ser Gly Phe 35 40 45 Glu Asn Pro Glu Gly Ser Leu Thr Gly Gly Ile Gin Ala Thr Gly Asn 50 55 60 Tyr Pro Gly Lys Ala Arg Asn Ala Ser Glu Leu Arg Ala Asp Leu Glu 65 70 75 80 Gin Ala Met Arg Leu Ile Pro Gly Pro Lys Arg Leu Asn Leu His Ala 85 90 95 Ile Tyr Leu Glu Ser Asp Thr Pro Vai Ser Arg Asp Gin Ile Lys Pro 100 105 110 Glu His Phe Lys Asn Trp Vai Glu Trp Ala Lys Ala Asn Gin Leu Gly 115 120 125 Leu Asp Phe Asn Pro Ser Cys Phe Ser His Pro Leu Ser Ala Asp Gly 130 135 140 Phe Thr Leu Ser His Ala Asp Asp Ser Ile Arg Gin Phe Trp Ile Asp 145 150 155 160 His Cys Lys Ala Ser Arg Arg Vai Ser Ala Tyr Phe Gly Glu Gin Leu 165 170 175 Gly Thr Pro Ser Vai Met Asn Ile Trp Ile Pro Asp Gly Met Lys Asp 180 185 190 Ile Thr Vai Asp Arg Leu Ala Pro Arg Gin Arg Leu Leu Ala Ala Leu 195 200 205 Asp Glu Vai Ile Ser Glu Lys Leu Asn Pro Ala His His Ile Asp Ala 210 215 220 Vai Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ala Glu Ser Tyr Thr Vai Gly 225 230 235 240 Ser Asn Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Ala Thr Ser Arg Gin Thr Ala Leu 245 250 255 Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr Glu Vai Ile Ser Asp Lys 260 265 270 Ile Ser Ala Ala Met Leu Tyr Vai Pro Gin Leu Leu Leu His Vai Ser 275 280 285 67 Arg Pro Vai Arg Trp Asp Ser Asp His Vai Vai Leu Leu Asp Asp Glu 290 295 300 Thr Gin Ala Ile Ala Ser Glu Ile Vai Arg His Asp Leu Phe Asp Arg 305 310 315 320 Vai His Ile Gly Leu Asp Phe Phe Asp Ala Ser Ile Asn Arg Ile Ala 325 330 335 Ala Trp Vai Ile Gly Thr Arg Asn Met Lys Lys Ala Leu Leu Arg Ala 340 345 350 Leu Leu Glu Pro Thr Ala Asp Vai Arg Lys Leu Glu Ala Ala Gly Asp 355 360 365 Tyr Thr Ala Arg Leu Ala Leu Leu Glu Glu Gin Lys Ser Leu Pro Trp 370 375 380 Gin Ala Vai Trp Glu Met Tyr Cys Gin Arg His Asp Thr Pro Ala Gly 385 390 395 400 Ser Glu Trp Leu Glu Ser Vai Arg Ala Tyr Glu Lys Glu Ile Leu Ser 405 410 415 Arg Arg Gly <210> 10 <211> 1470 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1) . . (1467) <223> codifica para : rhaB (ramnolucinase) <400> 10 atg acc ttt cgc aat tgt gtc gcc gtc gat ctc ggc gca tcc agt ggg 4 8 Met Thr Phe Arg Asn Cys Vai Ala Vai Asp Leu Gly Ala Ser Ser Gly 15 1 5 10 68 cgc gtg atg ctg gcg cgt tac gag cgt gaa tgc cgc age ctg acg ctg 96 Arg Vai Met Leu Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Cys Arg Ser Leu Thr Leu 20 25 30 cgc gaa ate cat cgt ttt aac aat ggg ctg cat agt cag aac ggc tat 144 Arg Glu Ile His Arg Phe Asn Asn Gly Leu His Ser Gin Asn Gly Tyr 35 40 45 gtc acc tgg gat gtg gat age ctt gaa agt gee att cgc ctt gga tta 192 Vai Thr Trp Asp Vai Asp Ser Leu Glu Ser Ala Ile Arg Leu Gly Leu 50 55 60 aac aag gtg tgc gag gaa ggg att cgt ate gat age att ggg att gat 240 Asn Lys Vai Cys Glu Glu Gly Ile Arg Ile Asp Ser Ile Gly Ile Asp 65 70 75 80 acc tgg ggc gtg gac ttt gtg ctg ctc gac caa cag ggt cag cgt gtg 288 Thr Trp Gly Vai Asp Phe Vai Leu Leu Asp Gin Gin Gly Gin Arg Vai 85 90 95 ggc ctg ccc gtt gct tat cgc gat age cgc acc aat ggc cta atg gcg 336 Gly Leu Pro Vai Ala Tyr Arg Asp Ser Arg Thr Asn Gly Leu Met Ala 100 105 110 cag gea caa caa Gin caa ggc aaa cgc gat att tat caa cgt age ggc 384 Gin Ala Gin Gin - Gly Lys Arg Asp Ile Tyr Gin Arg Ser Gly 115 ctc 120 125 Leu ate cag ttt ctg ccc ttc aat acg ctt tat cag ttg cgt gcg ctg acg 432 Ile Gin Phe Leu Pro Phe Asn Thr Leu Tyr Gin Leu Arg Ala Leu Thr 130 135 140 gag caa caa cct gaa ctt att cca cac att gct cac gct ctg ctg atg 480 Glu Gin Gin Pro Glu Leu Ile Pro His Ile Ala His Ala Leu Leu Met 145 150 155 160 ccg gat tac ttc agt tat cgc ctg acc ggc aag atg aac tgg gaa tat 528 Pro Asp Tyr Phe Ser Tyr Arg Leu Thr Gly Lys Met Asn Trp Glu Tyr 165 170 175 69 acc aac gcc acg acc acg caa ctg gtc aat ate aat age gac gac tgg 576 Thr Asn Ala Thr Thr Thr Gin Leu Vai Asn Ile Asn Ser Asp Asp Trp 180 185 190 gac gag tcg cta ctg gcg tgg age ggg gcc aac aaa gcc tgg ttt ggt 624 Asp Glu Ser Leu Leu Ala Trp Ser Gly Ala Asn Lys Ala Trp Phe Gly 195 200 205 cgc ccg acg cat ccg ggt aat gtc ata ggt cac tgg att tgc ccg cag 672 Arg Pro Thr His Pro Gly Asn Vai Ile Gly His Trp Ile Cys Pro Gin 210 215 220 ggt aat gag att cca gtg gtc gcc gtt gcc age cat gat acc gcc age 720 Gly Asn Glu Ile Pro Vai Vai Ala Vai Ala Ser His Asp Thr Ala Ser 225 230 235 240 gcg gtt ate gcc tcg ccg tta aac ggc tea cgt gct gct tat ctc tct 768 Ala Vai Ile Ala Ser Pro Leu Asn Gly Ser Arg Ala Ala Tyr Leu Ser 245 250 255 tct ggc acc tgg tea ttg atg ggc ttc gaa age cag acg cca ttt acc 816 Ser Gly Thr Trp Ser Leu Met Gly Phe Glu Ser Gin Thr Pro Phe Thr 260 265 270 aat gac acg gea ctg gea gcc aac ate acc aat gaa ggc ggg gcg gaa 864 Asn Asp Thr Ala Leu Ala Ala Asn Ile Thr Asn Glu Gly Gly Ala Glu 275 280 285 ggt cgc tat cgg gtg ctg aaa aat att atg ggc tta tgg ctg ctt cag 912 Gly Arg Tyr Arg Vai Leu Lys Asn Ile Met Gly Leu Trp Leu Leu Gin 290 295 300 cga gtg ctt cag gag cag caa ate aac gat ctt ccg gcg ctt ate tcc 960 Arg Vai Leu Gin Glu Gin Gin Ile Asn Asp Leu Pro Ala Leu Ile Ser 305 310 315 320 gcg aca cag gea ctt ccg gct tgc cgc ttc att ate aat ccc aat gac 1008 Ala Thr Gin Ala Leu Pro Ala Cys Arg Phe Ile Ile Asn Pro Asn Asp 325 330 335 70 gat cgc ttt att aat cct gag acg atg tgc age gaa att cag gct gcg 1056 Asp Arg Phe Ile Asn Pro Glu Thr Met Cys Ser Glu Ile Gin Ala Ala 340 345 350 tgt cgg gaa acg gcg caa ccg ate ccg gaa agt gat gct gaa ctg gcg 1104 Cys Arg Glu Thr Ala Gin Pro Ile Pro Glu Ser Asp Ala Glu Leu Ala 355 360 365 cgc tgc att ttc gac agt ctg gcg ctg ctg tat gee gat gtg ttg cat 1152 Arg Cys Ile Phe Asp Ser Leu Ala Leu Leu Tyr Ala Asp Vai Leu His 370 375 380 gag ctg gcg cag ctg cgc ggt gaa gat ttc teg caa ctg cat att gtc 1200 Glu Leu Ala Gin Leu Arg Gly Glu Asp Phe Ser Gin Leu His Ile Vai 385 390 395 400 ggc gga ggc tgc cag aac acg ctg ctc aac cag cta tgc gee gat gee 1248 Gly Gly Gly Cys Gin Asn Thr Leu Leu Asn Gin Leu Cys Ala Asp Ala 405 410 415 tgc ggt att cgg gtg ate gee ggg cct gtt gaa gee teg acg ctc ggc 1296 Cys Gly Ile Arg Vai Ile Ala Gly Pro Vai Glu Ala Ser Thr Leu Gly 420 425 430 aat ate ggc ate cag tta atg acg ctg gat gaa ctc aac aat gtg gat 1344 Asn Ile Gly Ile Gin Leu Met Thr Leu Asp Glu Leu Asn Asn Vai Asp 435 440 445 gat ttc cgt cag gtc gtc age acc acc gcg aat ctg acc acc ttt acc 1392 Asp Phe Arg Gin Vai Vai Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Thr Phe Thr 450 455 460 cct aat cct gac agt gaa att gee cac tat gtg gcg cag att cac tet 1440 Pro Asn Pro Asp Ser Glu Ile Ala His Tyr Vai Ala Gin Ile His Ser 465 470 475 480 Aca cga cag aca aag gag ctt tgc gea tga 1470 Thr Arg Gin Thr Lys Glu Leu Cys Ala <210> 11 485 71
<211> 489 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 11
Met Thr Phe Arg Asn Cys Vai Ala Vai Asp Leu Gly Ala Ser Ser Gly 1 5 10 15 Arg Vai Met Leu Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Cys Arg Ser Leu Thr Leu 20 25 30 Arg Glu Ile His Arg Phe Asn Asn Gly Leu His Ser Gin Asn Gly Tyr 35 40 45 Vai Thr Trp Asp Vai Asp Ser Leu Glu Ser Ala Ile Arg Leu Gly Leu 50 55 60 Asn Lys Vai Cys Glu Glu Gly Ile Arg Ile Asp Ser Ile Gly Ile Asp 65 70 75 80 Thr Trp Gly Vai Asp Phe Vai Leu Leu Asp Gin Gin Gly Gin Arg Vai 85 90 95 Gly Leu Pro Vai Ala Tyr Arg Asp Ser Arg Thr Asn Gly Leu Met Ala 100 105 110 Gin Ala Gin Gin Gin Leu Gly Lys Arg Asp Ile Tyr Gin Arg Ser Gly 115 120 125 Ile Gin Phe Leu Pro Phe Asn Thr Leu Tyr Gin Leu Arg Ala Leu Thr 130 135 140 Glu Gin Gin Pro Glu Leu Ile Pro His Ile Ala His Ala Leu Leu Met 145 150 155 160 Pro Asp Tyr Phe Ser Tyr Arg Leu Thr Gly Lys Met Asn Trp Glu Tyr 165 170 175 Thr Asn Ala Thr Thr Thr Gin Leu Vai Asn Ile Asn Ser Asp Asp Trp 180 185 190 Asp Glu Ser Leu Leu Ala Trp Ser Gly Ala Asn Lys Ala Trp Phe Gly 195 200 205 Arg Pro Thr His Pro Gly Asn Vai Ile Gly His Trp Ile Cys Pro Gin 210 215 220 72
Gly Asn Glu Ile Pro Vai Vai Ala Vai Ala Ser His Asp Thr Ala Ser 225 230 235 240 Ala Vai Ile Ala Ser Pro Leu Asn Gly Ser Arg Ala Ala Tyr Leu Ser 245 250 255 Ser Gly Thr Trp Ser Leu Met Gly Phe Glu Ser Gin Thr Pro Phe Thr 260 265 270 Asn Asp Thr Ala Leu Ala Ala Asn Ile Thr Asn Glu Gly Gly Ala Glu 275 280 285 Gly Arg Tyr Arg Vai Leu Lys Asn Ile Met Gly Leu Trp Leu Leu Gin 290 295 300 Arg Vai Leu Gin Glu Gin Gin Ile Asn Asp Leu Pro Ala Leu Ile Ser 305 310 315 320 Ala Thr Gin Ala Leu Pro Ala Cys Arg Phe Ile Ile Asn Pro Asn Asp 325 330 335 Asp Arg Phe Ile Asn Pro Glu Thr Met Cys Ser Glu Ile Gin Ala Ala 340 345 350 Cys Arg Glu Thr Ala Gin Pro Ile Pro Glu Ser Asp Ala Glu Leu Ala 355 360 365 Arg Cys Ile Phe Asp Ser Leu Ala Leu Leu Tyr Ala Asp Vai Leu His 370 375 380 Glu Leu Ala Gin Leu Arg Gly Glu Asp Phe Ser Gin Leu His Ile Vai 385 390 395 400 Gly Gly Gly Cys Gin Asn Thr Leu Leu Asn Gin Leu Cys Ala Asp Ala 405 410 415 Cys Gly Ile Arg Vai Ile Ala Gly Pro Vai Glu Ala Ser Thr Leu Gly 420 425 430 Asn Ile Gly Ile Gin Leu Met Thr Leu Asp Glu Leu Asn Asn Vai Asp 435 440 445 Asp Phe Arg Gin Vai Vai Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Thr Phe Thr 450 455 460 73
Pro Asn Pro Asp Ser Glu Ile Ala His Tyr Vai Ala Gin Ile His Ser 465 470 475 480
Thr Arg Gin Thr Lys Glu Leu Cys Ala 485
<210> 12 <211> 825 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>
<221> CDS <222> (1)..(822) <223> codifica para rhaD (aldolase de ramnulose-fosfato) <400> 12 atg caa aac att act cag tcc tgg ttt gtc cag gga atg ate aaa gcc 48 Met Gin Asn Ile Thr Gin Ser Trp Phe Vai Gin Gly Met Ile Lys Ala 1 5 10 15 acc acc gac gcc tgg ctg aaa ggc tgg gat gag cgc aac ggc ggc aac 96 Thr Thr Asp Ala Trp Leu Lys Gly Trp Asp Glu Arg Asn Gly Gly Asn 20 25 30 ctg acg cta cgc ctg gat gac gcc gat ate gca cca tat cac gac aat 144 Leu Thr Leu Arg Leu Asp Asp Ala Asp Ile Ala Pro Tyr His Asp Asn 35 40 45 ttc cac caa caa ccg cgc tat ate ccg ctc age cag ccc atg cct tta 192 Phe His Gin Gin Pro Arg Tyr Ile Pro Leu Ser Gin Pro Met Pro Leu 50 55 60 ctg gca aat aca ccg ttt att gtc acc ggc teg ggc aaa ttc ttc cgt 240 Leu Ala Asn Thr Pro Phe Ile Vai Thr Gly Ser Gly Lys Phe Phe Arg 70 75 80 65 74 aac gtc cag ctt gat cct gcg gct aac tta ggc ate gta aaa gtc gac 288 Asn Vai Gin Leu Asp Pro Ala Ala Asn Leu Gly Ile Vai Lys Vai Asp 85 90 95 age gac ggc gcg ggc tac cac att ctt tgg ggg tta acc aac gaa gee 336 Ser Asp Gly Ala Gly Tyr His Ile Leu Trp Gly Leu Thr Asn Glu Ala 100 105 110 gtc ccc act tcc gaa ctt ccg gct cac ttc ctt tcc cac tgc gag ege 384 Vai Pro Thr Ser Glu Leu Pro Ala His Phe Leu Ser His Cys Glu Arg 115 120 125 att aaa gee acc aac ggc aaa gat cgg gtg ate atg cac tgc cac gee 432 Ile Lys Ala Thr Asn Gly Lys Asp Arg Vai Ile Met His Cys His Ala 130 135 140 acc aac ctg ate gee etc acc tat gta ctt gaa aac gac acc gcg gtc 480 Thr Asn Leu Ile Ala Leu Thr Tyr Vai Leu Glu Asn Asp Thr Ala Vai 145 150 155 160 ttc act ege caa ctg tgg gaa ggc age acc gag tgt ctg gtg gta ttc 528 Phe Thr Arg Gin Leu Trp Glu Gly Ser Thr Glu Cys Leu Vai Vai Phe 165 170 175 ccg gat ggc gtt ggc att ttg ccg tgg atg gtg ccc ggc acg gac gaa 576 Pro Asp Gly Vai Gly Ile Leu Pro Trp Met Vai Pro Gly Thr Asp Glu 180 185 190 ate ggc cag gcg acc gea caa gag atg caa aaa cat teg ctg gtg ttg 624 Ile Gly Gin Ala Thr Ala Gin Glu Met Gin Lys His Ser Leu Vai Leu 195 200 205 tgg ccc ttc cac ggc gtc ttc ggc age gga ccg acg ctg gat gaa acc 672 Trp Pro Phe His Gly Vai Phe Gly Ser Gly Pro Thr Leu Asp Glu Thr 210 215 220 ttc ggt tta ate gac acc gea gaa aaa tea gea caa gta tta gtg aag 720 Phe Gly Leu Ile Asp Thr Ala Glu Lys Ser Ala Gin Vai Leu Vai Lys 225 230 235 240 75 gtt tat tcg atg ggc ggc atg aaa cag Vai Tyr Ser Met Gly Gly Met Lys Gin 245 ata gcg ctc ggc aag cgt ttc ggc gtt
Ile Ala Leu Gly Lys Arg Phe Gly Vai 260 265 gcg ctg taa Ala Leu
<210> 13 <211> 274 <212> PRT <213> Escherichia coli acc ate age cgt gaa gag ttg 768 Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu 250 255 acg cca ctc gee agt gcg ctg 816 Thr Pro Leu Ala Ser Ala Leu 270 825 <400> 13 Met Gin Asn Ile Thr Gin Ser Trp Phe 1 5 Thr Thr Asp Ala Trp Leu Lys Gly Trp 0 25 Leu Thr Leu Arg Leu Asp Asp Ala Asp 35 40 Phe His Gin Gin Pro Arg Tyr Ile Pro 50 55 Leu Ala Asn Thr Pro Phe Ile Vai Thr 65 70 Asn Vai Gin Leu Asp Pro Ala Ala Asn 85 Ser Asp Gly Ala Gly Tyr His Ile Leu 100 105 Vai Pro Thr Ser Glu Leu Pro Ala His 115 120
Vai Gin Gly Met Ile Lys Ala 10 15 Asp Glu Arg Asn Gly Gly Asn 30 Ile Ala Pro Tyr His Asp Asn 45 Leu Ser Gin Pro Met Pro Leu 60 Gly Ser Gly Lys Phe Phe Arg 75 80 Leu Gly Ile Vai Lys Vai Asp 90 95 Trp Gly Leu Thr Asn Glu Ala 110 Phe Leu Ser His Cys Glu Arg 125 76
Ile Lys Ala Thr Asn Gly Lys Asp Arg Vai Ile Met His Cys His Ala 130 135 140 Thr Asη Leu Ile Ala Leu Thr Tyr Vai Leu Glu Asn Asp Thr Ala Vai 145 150 155 160 Phe Thr Arg Gin Leu Trp Glu Gly Ser Thr Glu Cys Leu Vai Vai Phe 165 170 175 Pro Asp Gly Vai Gly Ile Leu Pro Trp Met Vai Pro Gly Thr Asp Glu 180 185 190 Ile Gly Gin Ala Thr Ala Gin Glu Met Gin Lys His Ser Leu Vai Leu 195 200 205 Trp Pro Phe His Gly Vai Phe Gly Ser Gly Pro Thr Leu Asp Glu Thr 210 215 220 Phe Gly Leu Ile Asp Thr Ala Glu Lys Ser Ala Gin Vai Leu Vai Lys 225 230 235 240 Vai Tyr Ser Met Gly Gly Met Lys Gin Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu 245 250 255 Ile Ala Leu Gly Lys Arg Phe Gly Vai Thr Pro Leu Ala Ser Ala Leu 260 265 270 Ala Leu <210> 14 <211> 939 <212> DNA <213> Escherichi a coli <220> <221> CDS <222> (1)..( 936) <223> codifica para : chaR (regulador positivo < Io operão rhaRS) < 4 Ο Ο > 14 77 atg gct ttc tgc aat aac gcg aat ctt ctc aac gta ttt gta cgc cat 48 Met Ala Phe Cys Asn Asn Ala Asn Leu Leu Asn Vai Phe Vai Arg His 1 5 10 15 att gcg aat aat caa ctt cgt tet ctg gee gag gta gee acg gtg gcg 96 Ile Ala Asn Asn Gin Leu Arg Ser Leu Ala Glu Vai Ala Thr Vai Ala 20 25 30 cat cag tta aaa ctt ctc aaa gat gat ttt ttt gee age gac cag cag 144 His Gin Leu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Phe Phe Ala Ser Asp Gin Gin 35 40 45 gca gtc gct gtg gct gac cgt tat ccg caa gat gtc ttt gct gaa cat 192 Ala Vai Ala Vai Ala Asp Arg Tyr Pro Gin Asp Vai Phe Ala Glu His 50 55 60 aca cat gat ttt tgt gag ctg gtg att gtc tgg cgc ggt aat ggc ctg 240 Thr His Asp Phe Cys Glu Leu Vai Ile Vai Trp Arg Gly Asn Gly Leu 65 70 75 80 cat gta ctc aac gat cgc cct tat cgc att acc cgt ggc gat ctc ttt 288 His Vai Leu Asn Asp Arg Pro Tyr Arg Ile Thr Arg Gly Asp Leu Phe 85 90 95 tac att cat gct gac gat aaa cac tcc tac gct tcc gtt aac gat ctg 336 Tyr Ile His Ala Asp Asp Lys His Ser Tyr Ala Ser Vai Asn Asp Leu 100 105 110 gtt ttg cag aat att att tat tgc ccg gag cgt ctg aag ctg aat ctt 384 Vai Leu Gin Asn Ile Ile Tyr Cys Pro Glu Arg Leu Lys Leu Asn Leu 115 120 125 gac tgg cag ggg gcg att ccg gga ttt aac gee age gca ggg caa cca 432 Asp Trp Gin Gly Ala Ile Pro Gly Phe Asn Ala Ser Ala Gly Gin Pro 130 135 140 cac tgg cgc tta ggt age atg ggg atg gcg cag gcg cgg cag gtt ate 480 His Trp Arg Leu Gly Ser Met Gly Met Ala Gin Ala Arg Gin Vai Ile 145 150 155 160 78 ggt cag ctt gag cat gaa agt agt cag cat gtg ccg ttt gct aac gaa 528 Gly Gin Leu Glu His Glu Ser Ser Gin His Val Pro Phe Ala Asn Glu 165 170 175 atg gct gag ttg ctg ttc ggg cag ttg gtg atg ttg ctg aat ege cat 576 Met Ala Glu Leu Leu Phe Gly Gin Leu Vai Met Leu Leu Asn Arg His 180 185 190 cgt tac acc agt gat teg ttg ccg cca aca tcc age gaa acg ttg ctg 624 Arg Tyr Thr Ser Asp Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ser Glu Thr Leu Leu 195 200 205 gat aag ctg att acc cgg ctg gcg gct age ctg aaa agt ccc ttt gcg 672 Asp Lys Leu Ile Thr Arg Leu Ala Ala Ser Leu Lys Ser Pro Phe Ala 210 215 220 ctg gat aaa ttt tgt gat gag gea teg tgc agt gag ege gtt ttg cgt 720 Leu Asp Lys Phe Cys Asp Glu Ala Ser Cys Ser Glu Arg Val Leu Arg 225 230 235 240 cag caa ttt ege cag cag act gga atg acc ate aat caa tat ctg cga 768 Gin Gin Phe Arg Gin Gin Thr Gly Met Thr Ile Asn Gin Tyr Leu Arg 245 250 255 cag gtc aga gtg tgt cat gcg caa tat ctt ctc cag cat age ege ctg 816 Gin Vai Arg Vai Cys His Ala Gin Tyr Leu Leu Gin His Ser Arg Leu 260 265 270 tta ate agt gat att teg acc gaa tgt ggc ttt gaa gat agt aac tat 864 Leu Ile Ser Asp Ile Ser Thr Glu Cys Gly Phe Glu Asp Ser Asn Tyr 275 280 285 ttt teg gtg gtg ttt acc cgg gaa acc ggg atg acg ccc age cag tgg 912 Phe Ser Vai Vai Phe Thr Arg Glu Thr Gly Met Thr Pro Ser Gin Trp 290 295 • 300 cgt cat ctc aat teg cag aaa gat taa 939 Arg His Leu Asn Ser Gin Lys Asp 305 310 <210> 15 79
<211> 312 <212> PRT <213> Escherichia coli <4 0 0> 15
Met Ala Phe Cys Asn Asn Ala Asn Leu Leu Asn Vai Phe Vai Arg His 1 5 10 15 Ile Ala Asn Asn Gin Leu Arg Ser Leu Ala Glu Vai Ala Thr Vai Ala 20 25 30 His Gin Leu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Phe Phe Ala Ser Asp Gin Gin 35 40 45 Ala Vai Ala Vai Ala Asp Arg Tyr Pro Gin Asp Vai Phe Ala Glu His 50 55 60 Thr His Asp Phe Cys Glu Leu Vai Ile Vai Trp Arg Gly Asn Gly Leu 65 70 75 80 His Vai Leu Asn Asp Arg Pro Tyr Arg Ile Thr Arg Gly Asp Leu Phe 85 90 95 Tyr Ile His Ala Asp Asp Lys His Ser Tyr Ala Ser Vai Asn Asp Leu 100 105 110 Vai Leu Gin Asn Ile Ile Tyr Cys Pro Glu Arg Leu Lys Leu Asn Leu 115 120 125 Asp Trp Gin Gly Ala Ile Pro Gly Phe Asn Ala Ser Ala Gly Gin Pro 130 135 140 His Trp Arg Leu Gly Ser Met Gly Met Ala Gin Ala Arg Gin Vai Ile 145 150 155 160 Gly Gin Leu Glu His Glu Ser Ser Gin His Vai Pro Phe Ala Asn Glu 165 170 175 Met Ala Glu Leu Leu Phe Gly Gin Leu Vai Met Leu Leu Asn Arg His 180 185 190 Arg Tyr Thr Ser Asp Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ser Glu Thr Leu Leu - 195 200 205 Asp Lys Leu Ile Thr Arg Leu Ala Ala Ser Leu Lys Ser Pro Phe Ala 210 215 220 80 80 Leu Asp Lys Phe Cys Asp Glu Ala Ser Cys Ser Glu Arg Vai Leu Arg 225 230 235 240 Gin Gin Phe Arg Gin Gin Thr Gly Met Thr Ile Asn Gin Tyr Leu Arg 245 250 255 Gin Vai Arg Vai Cys His Ala Gin Tyr Leu Leu Gin His Ser Arg Leu 260 265 270 Leu Ile Ser Asp Ile Ser Thr Glu Cys Gly Phe Glu Asp Ser Asn Tyr 275 280 285 Phe Ser Vai Vai Phe Thr Arg Glu Thr Gly Met Thr Pro Ser Gin Trp 290 295 300 Arg His Leu Asn Ser Gin Lys Asp 305 310
<210> 16 <211> 837 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1) . . (834) <223> codifica para rhaS (regulador positivo do operão rhaBAD) <400> 16 atg acc gta tta cat agt gtg gat ttt ttt ccg tct ggt aac gcg tcc 48
Met Thr Vai Leu His Ser Vai Asp Phe Phe Pro Ser Gly Asn Ala Ser 15 10 15 gtg gcg ata gaa ccc cgg ctc ccg cag gcg gat ttt cct gaa cat cat 96
Vai Ala Ile Glu Pro Arg Leu Pro Gin Ala Asp Phe Pro Glu His His 20 25 30 cat gat ttt cat gaa att gtg att gtc gaa cat ggc acg ggt att cat 144
His Asp Phe His Glu Ile Vai Ile Vai Glu His Gly Thr Gly Ile His 40 45 35 81 gtg ttt aat ggg cag ccc tat acc ate acc ggt ggc acg gtc tgt ttc 192 Vai Phe Asn Gly Gin Pro Tyr Thr Ile Thr Gly Gly Thr Vai Cys Phe .50 55 60 gta cgc gat cat gat cgg cat ctg tat gaa cat acc gat aat ctg tgt 240 Vai Arg Asp His Asp Arg His Leu Tyr Glu His Thr Asp Asn Leu Cys 65 70 75 80 ctg acc aat gtg ctg tat cgc teg ccg gat cga ttt cag ttt ctc gcc 288 Leu Thr Asn Vai Leu Tyr Arg Ser Pro Asp Arg Phe Gin Phe Leu Ala 85 9 0 95 ggg ctg aat cag ttg ctg cca caa gag ctg gat ggg cag tat ccg tet 336 Gly Leu Asn Gin Leu Leu Pro Gin Glu Leu Asp Gly Gin Tyr Pro Ser 100 105 110 cac tgg cgc gtt aac cac age gta ttg cag cag gtg cga cag ctg gtt 384 His Trp Arg Vai Asn His Ser Vai Leu Gin Gin Vai Arg Gin Leu Vai 115 120 125 gca cag atg gaa cag cag gaa ggg gaa aat gat tta ccc teg acc gcc 432 Ala Gin Met Glu Gin Gin Glu Gly Glu Asn Asp Leu Pro Ser Thr Ala 130 135 140 agt cgc gag ate ttg ttt atg caa tta ctg ctc ttg ctg cgt aaa age 480 Ser Arg Glu Ile Leu Phe Met Gin Leu Leu Leu Leu Leu Arg Lys Ser 145 150 155 160 agt ttg cag gag aac ctg gaa aac age gca tea cgt ctc aac ttg ctt 528 Ser Leu Gin Glu Asn Leu Glu Asn Ser Ala Ser Arg Leu Asn Leu Leu 165 170 175 ctg gcc tgg ctg gag gac cat ttt gcc gat gag gtg aat tgg gat gcc 576 Leu Ala Trp Leu Glu Asp His Phe Ala Asp Glu Vai Asn Trp Asp Ala 180 185 190 gtg gcg gat caa ttt tet ctt tea ctg cgt acg cta cat cgg cag ctt 624 Vai Ala Asp Gin Phe Ser Leu Ser Leu Arg Thr Leu His Arg Gin Leu 195 200 205 82 aag cag caa acg gga ctg acg cct cag cga tac ctg aac cgc ctg cga 672
Lys Gin Gin Thr Gly Leu Thr Pro Gin Arg Tyr Leu Asn Arg Leu Arg 210 215 220 ctg atg aaa gcc cga cat ctg cta cgc cac age gag gee age gtt act 720
Leu Met Lys Ala Arg His Leu Leu Arg His Ser Glu Ala Ser Vai Thr 225 230 235 240 gac ate gcc tat cgc tgt gga ttc age gac agt aac cac ttt teg acg 768
Asp Ile Ala Tyr Arg Cys Gly Phe Ser Asp Ser Asn His Phe Ser Thr 245 250 255 ctt ttt cgc cga gag ttt aac tgg tea ccg cgt gat att cgc cag gga 816
Leu Phe Arg Arg Glu Phe Asn Trp Ser Pro Arg Asp Ile Arg Gin Gly 260 265 270 cgg gat ggc ttt ctg caa taa 837
Arg Asp Gly Phe Leu Gin 275
<210> 17 <211> 278 <212> PRT <213> Escherichia coli <4 0 0> 17 Met Thr Vai Leu His Ser Vai Asp Phe Phe Pro Ser Gly Asn Ala Ser 1 5 10 15 Vai Ala Ile Glu Pro Arg Leu Pro Gin Ala Asp Phe Pro Glu His His 20 25 30 His Asp Phe His Glu Ile Vai Ile Vai Glu His Gly Thr Gly Ile His 35 40 45 Vai Phe Asn Gly Gin Pro Tyr Thr Ile Thr Gly Gly Thr Vai Cys Phe 50 55 6 0 Vai Arg Asp His Asp Arg His Leu Tyr Glu His Thr Asp Asn Leu Cys 65 70 75 80 83
Leu Thr Asn Vai Leu Tyr Arg Ser Pro Asp Arg Phe Gin Phe Leu Ala 85 90 95 Gly Leu Asn Gin Leu Leu Pro Gin Glu Leu Asp Gly Gin Tyr Pro Ser 100 105 110 His Trp Arg Vai Asn His Ser Vai Leu Gin Gin Vai Arg Gin Leu Vai 115 120 125 Ala Gin Met Glu Gin Gin Glu Gly Glu Asn Asp Leu Pro Ser Thr Ala 130 135 140 Ser Arg Glu Ile Leu Phe Met Gin Leu Leu Leu Leu Leu Arg Lys Ser 145 150 155 160 Ser Leu Gin Glu Asn Leu Glu Asn Ser Ala Ser Arg Leu Asn Leu Leu 165 170 175 Leu Ala Trp Leu Glu Asp His Phe Ala Asp Glu Vai Asn Trp Asp Ala 180 185 190 Vai Ala Asp Gin Phe Ser Leu Ser Leu Arg Thr Leu His Arg Gin Leu 195 200 205 Lys Gin Gin Thr Gly Leu Thr Pro Gin Arg Tyr Leu Asn Arg Leu Arg 210 215 220 Leu Met Lys Ala Arg His Leu Leu Arg His Ser Glu Ala Ser Vai Thr 225 230 235 240 Asp Ile Ala Tyr Arg Cys Gly Phe Ser Asp Ser Asn His Phe Ser Thr 245 250 255 Leu Phe Arg Arg Glu Phe Asn Trp Ser Pro Arg Asp Ile Arg Gin Gly 260 265 270 Arg Asp Gly Phe Leu Gin 275
<210> 18 <211> 1035 <212> DNA <213> Escherichia coli <2 2 0>
<221> CDS 84 <222> (1) . . (1032) <223> codifica para rhaT (proteína de transporte de ramnose) <400> 18 atg agt aac gcg att acg atg ggg ata ttt tgg cat ttg ate ggc gcg 48 Met Ser Asn Ala Ile Thr Met Gly Ile Phe Trp His Leu Ile Gly Ala 1 5 10 15 gcc agt gea gcc tgt ttt tac gct ccg ttc aaa aaa gta aaa aaa tgg 96 Ala Ser Ala Ala Cys Phe Tyr Ala Pro Phe Lys Lys Vai Lys Lys Trp 20 25 30 tca tgg gaa acc atg tgg tca gtc ggt ggg att gtt teg tgg att att 144 Ser Trp Glu Thr Met Trp Ser Vai Gly Gly Ile Vai Ser Trp Ile Ile 35 40 45 ctg ccg tgg gcc ate age gcc ctg tta cta ccg aat ttc tgg gcg tat 192 Leu Pro Trp Ala ile Ser Ala Leu Leu Leu Pro Asn Phe Trp Ala Tyr 50 55 60 tac age teg ttt agt ctc tet acg cga ctg cct gtt ttt ctg ttc ggc 240 Tyr Ser Ser Phe Ser Leu Ser Thr Arg Leu Pro Vai Phe Leu Phe Gly 65 70 75 80 gct atg tgg ggg ate ggt aat ate aac tac ggc ctg acc atg cgt tat 288 Ala Met Trp Gly Ile Gly Asn Ile Asn Tyr Gly Leu Thr Met Arg Tyr 85 90 95 ctc ggc atg teg atg gga att ggc ate gcc att ggc att acg ttg att 336 Leu Gly Met Ser Met Gly Ile Gly Ile Ala Ile Gly Ile Thr Leu Ile 100 105 110 - gtc ggt acg ctg atg acg cca att ate aac ggc aat ttc gat gtg ttg 384 Vai Gly Thr Leu Met Thr Pro Ile Ile Asn Gly Asn Phe Asp Vai Leu 115 120 125 att age acc gaa ggc gga ege atg acg ttg ctc ggc gtt ctg gtg gcg 432 Ile Ser Thr Glu Gly Gly Arg Met Thr Leu Leu Gly Vai Leu Vai Ala 130 135 140 85 ctg att ggc gta ggg att gta act ege gcc ggg cag ttg aaa gag ege 480 Leu Ile Gly Vai Gly Ile Vai Thr Arg Ala Gly Gin Leu Lys Glu Arg 145 150 155 160 aag atg ggc att aaa gcc gaa gag ttc aat ctg aaa aaa ggg ctg gtg 528 Lys Met Gly Ile Lys Ala Glu Glu Phe Asn Leu Lys Lys Gly Leu Val 165 170 175 ctg gcg gtg atg tgc ggc att ttc tet gcc ggg atg tcc ttt gcg atg 576 Leu Ala Vai Met Cys Gly Ile Phe Ser Ala Gly Met Ser Phe Ala Met 180 185 190 aac gcc gea aaa ccg atg cat gaa gcc gct gcc gea ctt ggc gtc gat 624 Asn Ala Ala Lys Pro Met His Glu Ala Ala Ala Ala Leu Gly Vai Asp 195 200 205 cca ctg tat gtc gct ctg cca age tat gtt gtc ate atg ggc ggc ggc 672 Pro Leu Tyr Vai Ala Leu Pro Ser Tyr Vai Vai Ile Met Gly Gly Gly 210 215 220 gcg ate att aac ctc ggt ttc tgt ttt att cgt ctg gea aaa gtg aag 720 Ala Ile Ile Asn Leu Gly Phe Cys Phe Ile Arg Leu Ala Lys Val Lys 225 230 235 240 gat ttg teg cta aaa gcc gac ttc teg ctg gea aaa teg ctg ate att 768 Asp Leu Ser Leu Lys Ala Asp Phe Ser Leu Ala Lys Ser Leu Ile Ile 245 250 255 cac aat gtg tta ctc teg aca ctg ggc ggg ttg atg tgg tat ctg caa 816 His Asn Vai Leu Leu Ser Thr Leu Gly Gly Leu Met Trp Tyr Leu Gin 260 265 270 ttc ttt ttc tat gcc tgg ggc cac gcc ege att ccg gcg cag tat gac 864 Phe Phe Phe Tyr Ala Trp Gly His Ala Arg Ile Pro Ala Gin Tyr Asp 275 280 285 tac ate agt tgg atg ctg cat atg agt ttc tat gta ttg tgc ggc ggt 912 Tyr Ile Ser Trp Met Leu His Met Ser Phe Tyr Vai Leu Cys Gly Gly 290 295 300 86 ate gtc ggg ctg gtg ctg aaa gag tgg aac aat gea gga ege cgt ccg 960 Ile Vai Gly Leu Vai Leu Lys Glu Trp Asn Asn Ala Gly Arg Arg Pro 305 310 315 320 gta acg gtg ttg age ctc ggt tgt gtg gtg att att gtc gee gct aac 1008 Vai Thr Vai Leu Ser Leu Gly Cys Vai Vai Ile Ile Val Ala Ala Asn 325 330 335 ate gtc ggc ate ggc atg gcg aat taa 1035 Ile Vai Gly Ile Gly Met Ala Asn 340
<210> 19 <211> 344 <212> PRT <213> Escherichia coli < 4 0 0 > 19
Met Ser Asn Ala Ile Thr Met Gly Q) 1—1 1—1 Phe Trp His Leu Ile Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Cys Phe Tyr Ala Pro Phe Lys Lys Val Lys Lys Trp 20 25 30 Ser Trp Glu Thr Met Trp Ser Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Ile Ile 35 40 45 Leu Pro Trp Ala Ile Ser Ala Leu Leu Leu Pro Asn Phe Trp Ala Tyr 50 55 60 Tyr Ser Ser Phe Ser Leu Ser Thr Arg Leu Pro Val Phe Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ala Met Trp Gly Ile Gly Asn Ile Asn Tyr Gly Leu Thr Met Arg Tyr 85 90 95 Leu Gly Met Ser Met Gly Ile Gly Ile Ala Ile Gly Ile Thr Leu Ile 100 105 110 Val Gly Thr Leu Met Thr Pro Ile Ile Asn Gly Asn Phe Asp Val Leu 115 120 125 87 Ile Ser Thr Glu Gly Gly Arg Met Thr Leu Leu Gly Vai Leu Vai Ala 130 135 140 Leu Ile Gly Vai Gly Ile Vai Thr Arg Ala Gly Gin Leu Lys Glu Arg 145 150 155 160 Lys Met Gly Ile Lys Ala Glu Glu Phe Asn Leu Lys Lys Gly Leu Vai 165 170 175 Leu Ala Vai Met Cys Gly Ile Phe Ser Ala Gly Met Ser Phe Ala Met 180 185 190 Asn Ala Ala Lys Pro Met His Glu Ala Ala Ala Ala Leu Gly Vai Asp 195 200 205 Pro Leu Tyr Vai Ala Leu Pro Ser Tyr Vai Vai Ile Met Gly Gly Gly 210 215 220 Ala Ile Ile Asn Leu Gly Phe Cys Phe Ile Arg Leu Ala Lys Vai Lys 225 230 235 240 Asp Leu Ser Leu Lys Ala Asp Phe Ser Leu Ala Lys Ser Leu Ile Ile 245 250 255 His Asn Vai Leu Leu Ser Thr Leu Gly Gly Leu Met Trp Tyr Leu Gin 260 265 270 Phe Phe Phe Tyr Ala Trp Gly His Ala Arg Ile Pro Ala Gin Tyr Asp 275 280 285 Tyr Ile Ser Trp Met Leu His Met Ser Phe Tyr Vai Leu Cys Gly Gly 290 295 300 Ile Vai Gly Leu Vai Leu Lys Glu Trp Asn Asn Ala Gly Arg Arg Pro 305 310 315 320 Vai Thr Vai Leu Ser Leu Gly Cys Vai Vai Ile Ile Vai Ala Ala Asn 325 330 335 Ile Vai Gly Ile Gly Met Ala Asn
Lisboa 31 de Agosto de 2007

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a expressão de sequências de ácidos nucleicos em células hospedeiras procariotas em que a) se introduz pelo menos uma construção de ADN epissómico replicável nas células hospedeiras mencionadas, incluindo uma sequência de ácidos nucleicos de expressão, sob o controlo de transcrição de um promotor indutivel de L-ramnose, sendo o promotor mencionado heterólogo em relação à sequência de ácidos nucleicos, nas células hospedeiras mencionadas e b) se selecciona células hospedeiras procariotas que contêm a construção de ADN mencionada em forma epissómico e c) se induz a expressão da sequência de ácidos nucleicos mencionada por meio da adição de L-ramnose a uma cultura das células hospedeiras seleccionadas, caracterizado por as células hospedeiras procariotas serem deficientes pelo menos em relação a isomerase de L-ramnose.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as células hospedeiras procariotas são seleccionadas dos tipos da família das enterobactérias ou da ordem dos actinomicetais.
3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em que as células hospedeiras procariotas são Escherichia coli.
4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que o promotor indutivel por L-ramnose do promotor rhaPBÃD é de E. coli ou um equivalente funcional do mesmo ou um fragmento equivalente funcional dos anteriores. 2
5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que o promotor indutivel por L-ramnose é pelo menos um elemento RhaSB de acordo com a SEQ ID NO: 5 ou um equivalente funcional do mesmo ou um fragmento equivalente funcional dos anteriores.
6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que o promotor indutivel por L-ramnose contém pelo menos uma sequência descrita pelas SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4.
7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, em que a isomerase de L-ramnose é descrita pela sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 9 ou um equivalente funcional da mesma.
8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, em que a construção de ADN replicável epissómico tem um tamanho de no máximo 100000 bases ou pares de bases.
9. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, em que a construção de ADN replicável epissómico é seleccionado do grupo constituído por vectores de plasmídeos circulares, fagemídeos e cosmídeos.
10. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em que as células hospedeiras procariotas têm pelo menos uma outra deficiência relativamente a um gene que tem uma função da metabolização da ramnose, codificando o gene mencionado uma proteína seleccionada do grupo constituído pela 1-fosfatase de ramnulose (RhaB) e a aldolase de ramnulosefosfato (RhaD).
11. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 10 3 em que a expressão da sequência de ácidos nucleicos exprimida condiciona a produção de uma proteína codificada pela sequência de ácidos nucleicos mencionada. glucanases, peroxidases, colagenases, pectinases, pululanases,
12. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, em que a sequência de ácidos nucleicos a expressar, codifica uma proteína recombinante seleccionada do grupo constituído pelas quimosinas, proteases, polimerases, sacaridases, desidrogenases, nucleases, glucoseoxidases, α-amilases, oxiredutases, lacases, xilanases, fitases, celulases, hemicelulases, lipases, lactases, amiloglucosidases, glucoamilases, glucoseisomerases, nitrilases, esterases, hidratases de nitrilo, amidases, oxigenases, oxinitrilases, liases, lactonases, carboxilases, colagenases, celulases, albuminas de soro, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factores plasminogénio dos tecidos, proteína C, factores de von Willebrand, antitrombinas, eritropoietinas, „Colony Stimulating Factors", citocinas, interleucinas, insulinas, integrina, adressina, selectinas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas estruturais, colagénio, fibroínas, elastinas, tubulinas, actinas, miosinas, factores de crescimento, proteínas do ciclo celular, inóculos, fibrinogénios e trombinas.
13. Células hospedeiras procarióticas que são pelo menos deficientes em relação a uma isomerase de L-ramnose e que contêm pelo menos uma construção de ADN replicável na referida célula hospedeira, a qual compreende uma sequência de ácidos nucleicos a expressar sob controlo de transcrição de um promotor indutível por meio de L-ramnose, em que o referido promotor é heterólogo em relação à referida 4 sequência de ácidos nucleicos.
14. Utilização de uma célula hospedeira procariota de acordo com a reivindicação 13 para a preparação de alimentos ou rações, enzimas, produtos químicos, farmacêuticos ou de química fina.
15. Processo para a preparação de proteínas recombinantes, enzimas e produtos de química fina, recorrendo a uma célula hospedeira procariota de acordo com a reivindicação 13 ou uma preparação da mesma. Lisboa,
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