PT1781703E

PT1781703E - Anticorpos específicos para protofibrilhas de péptido betaamiloide solúveis e utilizações destes

Info

Publication number: PT1781703E
Application number: PT57536724T
Authority: PT
Inventors: Lars Lannfelt; Pär GELLERFORS
Original assignee: Bioarctic Neuroscience Ab
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2015-08-24
Also published as: DK1781703T3; AU2005254928B2; US20120230912A1; US8999936B2; CA2570130C; US20130236452A1; SI1781703T1; EP1781703A1; CY1116776T1; EP1781703B1; US8106164B2; CA2570130A1; US8404459B2; WO2005123775A1; US20090155246A1; US20150307601A1; ES2537001T3; PL1781703T3; AU2005254928A1; HUE025628T2

Description

DESCRIÇÃO "Anticorpos específicos para protofibrilhas de péptido beta-amiloide solúveis e utilizações destes"

1. CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se ao diagnóstico, à prevenção e ao tratamento de doenças neurodegenerativas, em particular a doença de Alzheimer, e outras doenças semelhantes. Mais precisamente, a anticorpos que se ligam especificamente à proteína beta-amiloide (A ) na sua conformação de protofibrilha, tal como definido nas reivindicações.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo e irreversível que causa deficiências cognitivas, de memória e comportamentais. É a causa mais comum de demência na população idosa afetando cerca de 5% da população acima dos 65 anos e 20% acima de 80 anos de idade. A DA é caracterizada por um início insidioso e deterioração progressiva em múltiplas funções cognitivas. A neuropatologia envolve depósitos proteicos argirofílicos tanto extracelulares como intracelulares. Os depósitos extracelulares, referidos como placas neuríticas, consistem principalmente em proteína beta-amiloide (A ) rodeada por neurites distróficas (processos neuronais distorcidos e inchados). A A dentro destes depósitos extracelulares é de caráter fibrilhar com uma estrutura de folha -plissada. A A nestes depósitos pode ser corada com certos corantes p. ex. Vermelho Congo e exibe uma supraestrutura fibrilhar. Estas características, adotadas pela A na sua estruturfibrilhar de placas neuríticas, são a definição do termo genérico amiloide. A lesão patológica intracelular da DA clássica é o emaranhado neurofibrilhar (NFT) que consiste em estruturas filamentosas chamadas filamentos helicoidais emparelhados (PHF) compostos por cadeias torcidas de proteína tau hiperfosforilada associada a microtúbulos. As placas neuríticas frequentes e os depósitos de emaranhado neurofibrilhar no cérebro são critérios de diagnóstico para DA, tal como realizado post mortem. Os cérebros de DA também exibem atrofia macroscópica do cérebro, perda de células nervosas, inflamação local (microgliose e astrocitose) e frequentemente angiopatia amiloide congofílica (CAA) nas paredes dos vasos cerebrais.

Duas formas de péptidos A , A 40 e A ãá2^ssespécies dominantes nas placas neuríticas de DA (Masters 1985), enquanto A 4Cé a espécie proeminente na amiloide cerebrovascular associada a DA (Glenner 1984) . As atividades enzimáticas permitem que A seja continuamente formada a partir de uma proteína maior denominada proteína precursora de amiloide (APP) tanto em indivíduos saudáveis como afetados por DA em todas as células do corpo. Dois principais eventos de processamento de APP ao longo das atividades de e -secretase permitem a produção de A , enquanto a atividade de uma terceira enzima denominada -secretase impede a geração de A através de clivagem dentro da sequência de A (Selkoe, 1994; US5604102) . O A 4é um péptido com quarenta e dois aminoácidos de comprimento, ou seja, dois aminoácidos mais longo no terminal C, em comparação com A 40. A é42iais hidrófobo, e agrega-se mais facilmente em estruturas maiores de péptidos A tais como dímeros de A , teôneros de A , oligómeros de A , protof ibrilhas de A ou fibrilhas de A .As fibrilhas de A são hidrófobas e insolúveis, enquanto as outras estruturas são todas menos hidrófobas e solúveis. Todas estas estruturas moleculares superiores dos péptidos A ã© definidas individualmente com base na sua aparência biofísica e estrutural, p. ex. em microscopia eletrónica, e as suas características bioquímicas, p. ex., através de análise com cromatografia de exclusão de tamanho/Western blot. Estes péptidos A , particularmente A 42, montar-se-ão gradualmente em várias estruturas moleculares superiores de A durante o tempo de vida. A DA, que é um distúrbio altamente dependente da idade, ocorrerá mais cedo na vida, se este processo de montagem ocorrer mais rapidamente. Este é o núcleo da "hipótese de cascata amiloide" da DA que reivindica que o processamento de APP, os níveis de A 42 e a sua montagem em estruturas moleculares mais elevadas é uma causa central da DA. Toda a outra neuropatologia do cérebro de DA e sintomas de DA, tais como demência são causados de alguma forma por A ou formas montadas desta. A pode existir em diferentes comprimentos, ou seja, 1-39, 1-40, 1-42 e 1-43 e tamanhos de fragmentos i.e. 1-28, 3- 40/42, 11-40/42, 17-40/42 e 25-35. Todos estes péptidos podem agregar-se e formar intermediários solúveis e fibrilhas insolúveis, cada forma molecular possuindo uma conformação estrutural e propriedade biofísica únicas. A -42 monomérico, por exemplo, é um péptido com 42 aminoácidos de comprimento, solúvel e não tóxico, que é sugerido estar envolvido em funções normais das sinapses. Sob certas condições, o A 1-42 pode agregar-se em dimeros, trimeros, tetrâmeros, pentâmeros até 12-meros e formas oligoméricas superiores, todas com a sua propriedade fisico-quimica distinta tal como o tamanho molecular, a estrutura em ME e a forma molecular em AFM (microscopia de força atómica). Um exemplo de uma forma oligomérica de A solúvel de peso molecular mais elevado é a protofibrilha (Hartley 1999, Walsh 1999), que tem um peso molecular aparente >100 kDa e uma estrutura curvilinea de 4-11 nm de diâmetro e <200 nm de comprimento. Foi recentemente demonstrado que os péptido A oligoméricos solúveis tais como as protofibrilhas de A prejudicam a potencção a longo prazo (LTP) (Hartleyr 1999), uma medida de plasticidade sináptica que se pensa refletir a formação da memória no hipocampo (Walsh, 2001). Além disso, os péptidos Ártica A oligoméricos apresentam um efeito inibidor muito mais profundo que wtA em LTP no cérebro, provavelmente devido à sua forte propensão para formar protofibrilhas de A Klyuhin 2003) .

Existem também outras formas oligoméricas solúveis descritas na literatura que são distintamente diferentes das protofibrilhas. Uma tal forma oligomérica é ADDL (Ligando Difusivel Derivado de Amiloide) (Lambert 1998). A análise de AFM de ADDL revelou predominantemente menos espécies globulares de 4,7-6,2 nm ao longo do eixo dos zz com pesos moleculares de 17-42 kDa. (Stine 1996). Outra forma é chamada de ASPD (Amiloidesferoides). A ASPD são oligómeros esferoides de A 1-40. Estudos de toxicidade mostraram que ASPD esférica >10 nm era mais tóxica que formas moleculares inferiores (Hoshi 2003) . A fibrilha de A como a principal espécie neurotóxica é inconsistente com a fraca correlação entre a densidade de placas neuriticas e a pontuação de demência da DA e também com os modestos sinais de neurodegeneração em ratinhos transgénicos para APP atuais. Espécies intermediárias de A neurotóxicas solúveis e o seu local subcelular apropriado de formação e distribuição podem ser o elo perdido que explicará melhor a hipótese amiloide. Esta ideia ganhou o apoio da recente descoberta da mutação Ártica (E693) de APP, que causa DA de inicio precoce (US 2002/0162129 Al; Nilsberth et al.r 2001) . A mutação está localizada dentro da sequência do péptido A . Os portadores da mutação gerarão deste modo variantes de péptidos A , p. ex. , A 40 Ártica e A 42 Ártica. Tanto A 1 Ártica como A 42 Ártica montar-se-ão muito mais facilmente em estruturas moleculares superiores (protofibrilhas) que são solúveis e não fibrilhares. Assim, o mecanismo patogênico da mutação Ártica sugere que as protofibrilhas moleculares superiores solúveis estão a causar DA. 2.1 Diagnóstico da doença de Alzheimer 2.1.1 Diagnóstico clínico O diagnóstico clinico da doença de Alzheimer (DA) é difícil de fazer, especialmente nos estádios iniciais da doença. Hoje em dia, o diagnóstico baseia-se na história médica típica combinada com a exclusão de outras causas de demência.

Os centros clínicos com alta especialização podem ter uma precisão de diagnóstico de 85-90% em comparação com o diagnóstico neuropatológico. Nos estádios iniciais da doença, o quadro clínico é vago e marcadores de diagnóstico precisos ainda não foram identificados (McKhann 1984) . O desenvolvimento de marcadores de diagnóstico bioquímicos é importante por várias razões: para apoiar o diagnóstico clínico, para permitir que os médicos deem informação adequada aos seus pacientes e seus familiares, para iniciar o tratamento farmacológico e prestação de cuidados, e em vários aspetos da investigação clínica. 2.1.2 Péptido -Amiloide

Mutações patogénicas nos genes de APP e presenilina (PS) foram descobertas em famílias com DA de início precoce herdada como uma característica dominante (Hardy 1992) . Os efeitos de algumas destas mutações são agora razoavelmente bem compreendidos. A mutação Sueca da DA (Mu 11 an 1992; Axelman 1994; Lannfelt 1994) revelou um mecanismo patogénico para o desenvolvimento da DA. Quando uma construção de ADNc com esta mutação foi transfetada para linhas de células humanas deu origem a uma libertação de A solúvel aproximadamente seis vezes mais elevada (Citron 1992, Cai 1993) . Além disso, os fibroblastos de indivíduos com a mutação Sueca segregaram três vezes mais A para o meio em comparação com fibroblastos de não portadores (Johnston 1994) . A sobreprodução de A pareceu portanto ser um fator importante na patogénese da doença nesta família Sueca. Assim, esperava-se que níveis de A medidos no líquido cefalorraquidiano (LCR) de membros da família diferenciassem portadores de não portadores da mutação. No entanto, não se verificou diferença nos níveis de A total entre os grupos (14,5±3,3 ng/ml versus 14,9±2,3 ng/ml) (Lannfelt 1995) . Uma explicação para esse resultado pode ser que A seja eliminada do LCR através da agregação com amiloide no cérebro. No entanto, houve uma forte correlação entre o tempo de demência e os níveis decrescentes de A . Estas medidas foram realizadas com anticorpos que reconhecem A monéífiico solúvel. Com anticorpos monoclonais específicos de protofibrilhas serão possíveis medições mais precisas das espécies tóxicas. 2.1.3 A no plasma A verifica-se numa forma solúvel no plasma e outros tecidos (Seubert 1992), e não como anteriormente presumido, apenas nos cérebros dos casos de DA. Os níveis plasmáticos de A em membros da família com a mutação Sueca revelaram que tanto A 40 como A 42 estavam 2-3 vezes aumentados em portadores da mutação (Scheuner 1996) . A proporção de A 42 no A total foi de aproximadamente 10% em ambos os grupos, o que está de acordo com as experiências realizadas em culturas de células com a mutação Sueca. Os portadores da mutação abaixo da idade de início esperado da doença tinham os mesmos níveis de A que os casos já afetados. Isto indica que o metabolismo errado de APP pode desempenhar um papel importante na patogénese precoce da doença. 2.1.4 A 42 no LCR na dofa de Alzheimer ELISA medindo especificamente A 40 e A 42 no LCR em casos de DA deram resultados diferentes. Alguns investigadores (Pirttilã 1994; Motter 1995) verificaram menos A 42 em DA, enquanto um grupo verificou níveis elevados em casos iniciais na progressão da doença. Os casos mais dementes num estudo tinham todos níveis muito baixos de A 42. Em conclãs, é muito provável que A 42 estivessaumentado no início do processo da doença e os níveis de A 42 e A 40 diminuíssem durante a progressão da doença. O desenvolvimento de marcadores bioquímicos precisos de DA precoce é importante especialmente quando estiverem disponíveis no futuro tratamentos farmacológicos eficazes. A terapêutica farmacológica deve provavelmente ser iniciada num estádio precoce da doença, antes de ocorrer danos cerebrais graves. Uma terapia tornando possível prevenir a progressão da doença para os seus estádios tardios seria, portanto, muito desejada. 2.2 Prevenção e tratamento da doença de Alzheimer

Anticorpos que são específicos para diferentes conformações de A , tais como fibrilhas de A ' NiífQllain 2002), A micelarK&yed 2003), ADDL (M93, M94) (Lambert 2001) foram também descritos. Vários estudos pré-clínicos em modelos animais transgénicos mostraram menor carga de placas e melhorias na função da memória após imunização ativa ou passiva com anticorpos produzidos contra fibrilhas (Shenk 1999, Janus 2000, Morgan 2000, Weiner 2000, Sigurdsen 2001) . Uma vez que as fibrilhas estão presentes em depósitos patológicos que ocorrem tardiamente do processo da doença de Alzheimer, os anticorpos de Shenk só podem ser usados para retardar a progressão da doença de Alzheimer quando já atingiu os seus estádios tardios.

Recentemente, um ensaio clínico de fase II em pacientes de Alzheimer com demência ligeira a moderada foi realizado pela Elan Pharmaceuticals com a sua vacina AN 1792, que é uma preparação de agregados de wtA 42 humano. O estudo teve de ser interrompido devido aos efeitos secundários em 5% dos pacientes. 0 efeito secundário foi considerado ser devido ao a meningoencefalite induzida por linfócitos T (Nicholl 2003) .

Os alvos do fármaco da vacina de ELAN eram fibrilhas insolúveis verificadas em placas dentro do cérebro e depósitos nas paredes dos vasos sanguíneos do cérebro (Angiopatia Amiloide Congofílica, CAA), que são características comuns da doença de Alzheimer. Assim, uma resposta imunitária contra fibrilhas insolúveis poderia ser responsável pela inflamação invasiva nas paredes dos vasos sanguíneos do cérebro levando a meningoencefalite. W002/203911 divulga a descoberta da mutação Ártica numa família Sueca levando ao aparecimento precoce da doença de Alzheimer (55,6 anos). A mutação Ártica (Glu>Gly), que se localiza na posição 22 do péptido beta-amiloide (A ) , em combinação com várias experiências conduziram à compreensão de que o péptido A era muito mais propenso a oligomerizar e formar protofibrilhas em comparação com A 4fle tipo selvagem. A descoberta indicou pela primeira vez que a protofibrilha é um componente central no processo da doença, e que a DA pode ser tratada através da redução da quantidade de protofibrilhas no cérebro. Esta propriedade única da mutação Ártica poderia então ser utilizada para gerar protofibrilhas. W002/203911 sugeriu então que as referidas protofibrilhas poderiam ser usadas para imunizar um ratinho ou outro animal, para gerar anticorpos, após o que qualquer anticorpo monoclonal específico de protofibrilhas poderia identificar e rastrear.

Os referidos anticorpos devem então ser específicos para um péptido A de SEQ ID No:l (página 7, terceiro parágrafo), isto é, um péptido possuindo a mutação Ártica e tendo uma conformação de protofibrilha.

Assim, tendo em conta as técnicas anteriores para a prevenção e o tratamento da doença de Alzheimer, existe a necessidade de uma técnica que permite a deteção precoce de marcadores da doença de Alzheimer. Se os referidos marcadores pudessem ser evitados sem causar efeitos secundários negativos, isto seria um meio para prevenir e tratar a doença de Alzheimer num estádio inicial. Qualquer tratamento da doença de Alzheimer que reduza a quantidade de protofibrilhas no cérebro de pacientes de DA, seria de significativo valor terapêutico.

3. DESCRIÇÃO DO INVENTO

As protofibrilhas ocorrem cedo na doença de Alzheimer, quando ocorreu pouco dano cerebral. Um tratamento de anticorpos que reduza os níveis de protofibrilhas no cérebro salvará o cérebro da destruição neuronal e será assim mais vantajoso para pacientes de Alzheimer. 0 presente invento descreve o desenvolvimento de tais anticorpos terapêuticos específicos de protofibrilhas.

De acordo com um aspeto, o presente invento refere-se a anticorpos que têm a propriedade de se ligar tanto a protof ibrilhas de A 42 de tipo selvagem como de A 42arc (anticorpos específicos da conformação) e que são adequados para desenvolvimento em fármacos para a doença de Alzheimer, tendo como alvo protof ibrilhas de A 42 de tipo selvagem. A ideia atual no campo da investigação da doença de Alzheimer é que as fibrilhas de A ã® a principal causa da doença. Assim, a abordagem do presente invento contradiz a opinião geral no campo.

De acordo com um outro aspeto, o presente invento refere-se também a uma composição compreendendo o referido anticorpo e, opcionalmente, um transportador ou excipiente.

Para imunizar e rastrear anticorpos anti-protofibrilhas específicos da conformação, é necessário produzir protofibrilhas A 42arc e A 42 puras (>95% de grau de pureza).

Para se obter a referida preparação de protofibrilhas puras, é também necessário ser capaz de estabilizar as protofibrilhas, de modo a que estas se mantenham protof ibrilhas e não se separem em monómeros ou se agreguem em fibrilhas. É também necessário encontrar um solvente que torne possível separar as protofibrilhas através de cromatografia em coluna. Outra necessidade é a capacidade de testar a referida pureza antes da imunização. As capacidades acima mencionadas são essenciais, uma vez que o grau de pureza do antigénio (protofibrilhas) decide a possibilidade de produzir anticorpos anti-protofibrilhas específicos da conformação, que por sua vez decide a possibilidade de rastrear anticorpos com especificidade útil. No caso da preparação conter por exemplo 50% de monómero A e 50% de protofibrilhas de A , é apenas possível reivindicar que o anticorpo que se liga à referida preparação pode ligar-se a ambas as formas ou a apenas uma. Todas as referidas características necessárias são proporcionadas pelo presente invento. A características acima mencionadas não eram possíveis quando W002/203911 foi apresentado. O método de análise de HPLC descrito no presente pedido ou qualquer outro método de análise não tinha sido desenvolvido, portanto não era possível determinar se o péptido A 42arc formava de facto protofibrilhas, provavelmente devido à falta de ligação a protofibrilhas. Foi apenas uma hipótese na altura. As principais razões pelas quais W002/203911 não pôde analisar e purificar a preparação de protofibrilhas até um grau de pureza >95%. E também devido ao facto de que eles não sabiam como estabilizar protofibrilhas. A este respeito, deve também ser mencionado que as protofibrilhas são muito difíceis de manusear em comparação com, por exemplo, os péptidos A 40. A 42, ©as particular o péptido A 42Arc, é extremamente difícil de manusear, uma vez que aderem aos tubos de ensaio e colunas e agregam-se em fibrilhas. Estes últimos problemas foram resolvidos pelo presente invento através da provisão de métodos para estabilizar as protofibrilhas envolvendo baixas temperaturas e solventes selecionados. W002/203911 também não teve meios para testar a pureza das protofibrilhas antes da imunização. Isto é possível com o presente invento pela provisão de um novo método de HPLC (exclusão de tamanho). Em adição a isto, W002/203911 não proporcionou quaisquer meios para verificar a especificidade das protofibrilhas dos anticorpos rastreados. O presente invento torna isso possível proporcionando um novo método de ELISA. W002/203911 só podia produzir protofibrilhas de A 40arc impuras e transientes, não úteis para o desenvolvimento monoclonal de anticorpos específicos de protofibrilhas (W002/203911 descreve apenas a análise dos péptidos A 40 e A 40Arc, ver Exemplo 3).

Os anticorpos de acordo com o presente invento são particularmente adequados para o tratamento da doença de Alzheimer, uma vez que: i) serão dirigidos a, e eliminarão a forma de A maisó&ica (protofibrilha), ii) proporcionarão uma oportunidade para tratar a doença precocemente uma vez que as protofibrilhas se desenvolvem precocemente no processo da doença, iii) evitarão os efeitos secundários uma vez que não reagirão significativamente de forma cruzada com as fibrilhas de A presentes na parede dos vasos sanguíneos do cérebro (CAA = Angiopatia Amiloidogénica Congofílica).

Os anticorpos de acordo com o presente invento podem ser humanos ou humanizados, monoclonais ou policlonais. 0 presente invento refere-se também a fragmentos biologicamente ativos dos referidos anticorpos, com a condição de que ainda tenham as propriedades reivindicadas.

Os anticorpos específicos das protofibrilhas de A de acordo com o presente invento podem também ser utilizados para quantificar protofibrilhas de A 42 de tipo selvagem em fluidos biológicos, assim os anticorpos serão adequados para o diagnóstico clínico numa fase precoce da doença e adequados como um biomarcador para monitorizar a eficácia em ensaios clínicos.

Além disso, o invento descreve procedimentos para gerar protofibrilhas de A 42 de tipo selvagem e A 42arc como antigénios para imunização e para reagentes para rastreio de anticorpos que se liguem a protofibrilhas de A 42arc e A 42 de tipo selvagem. É muito importante determinar a pureza do antigénio (protofibrilha) nas experiências de rastreio de anticorpos, uma vez que afetam as determinações da especificidade dos anticorpos através de ELISA.

Para avaliar a pureza da preparação de antigénio (protofibrilhas de A 42arc e A 42 de tipo selvagem) , foi desenvolvido um método de HPLC de exclusão por tamanho. 0 método de HPLC inventado utiliza um detergente, com baixa interferência ótica em cromatografia. 0 detergente tem a vantagem de eliminar as interações de protofibrilhas de A 42arc e A 42 de tipo selvagem com a matriz da coluna, impedindo a perda de material e a adesão do material à coluna, e estimativas erróneas da pureza das protofibrilhas. Além disso, o detergente é compatível com protof ibrilhas de A eãa as solubiliza em monómeros de A ou altera o seu perfil biónico. Verificou-se que o polissorbato (Tween) é um detergente adequado, em particular o Polissorbato-80 (Tween-80). Outros detergentes com propriedades semelhantes são também úteis. 0 anticorpo de acordo com o presente reage de forma cruzada em menos de 50% com as fibrilhas de A .0 referido anticorpo pode detetar tanto protofibrilhas de A de tipo selvagem como protofibrilhas de A Ártica num ELISA num intervalo de concentração de 1000-10 ng/ml (ver Exemplo 5 e Figuras 4A-C). Num ELISA otimizado ou através de outros sistemas de deteção com maior sensibilidade, por exemplo ligação de proximidade, o referido nivel de deteção podia provavelmente ser trazido para baixo para um nivel de deteção de 1-0,1 ng/ml. O presente invento proporciona um método para criar anticorpos que sejam específicos para protofibrilhas de amiloide (A ) (oligómeros de A não fibrilharesolúveis de elevado peso molecular). Os anticorpos são criados contra A na sua conformação de protofibrilha. Estes anticorpos serão administrados aos pacientes de DA para reduzir os níveis de protofibrilhas no cérebro, o que será de significativo valor terapêutico. A diminuição dos níveis de protofibrilhas poderia ocorrer através da eliminação do antigénio quando ligado a um anticorpo, por meio de fagocitose mediada pela microglia. Este é um processo biológico bem documentado, que ocorre através da ligação da região constante do anticorpo (Fc) a um recetor de Fc nas células microgliais. A ligação induz fagocitose (internalização e destruição) do anticorpo e do seu antigénio ligado (protofibrilha) levando a níveis reduzidos de protofibrilhas no cérebro. Podem também ocorrer outros processos mediados pelo receptor não-Fc para eliminar o antigénio (protofibrilha).

Outro aspeto do invento refere-se a um método para sintetizar protofibrilhas de A queã® para ser usadas como antigénio para imunização. A síntese pode ser feita a partir de A de tipo selvagem (wtA ) ou, alternativamente, a partir de formas de A não de tipo selvagem, mutadas ou modificadas. Numa concretização preferida do invento, mas não limitada à referida concretização, a síntese é iniciada através da dissolução de wtA -12 num agente de dissociação, por exemplo NaOH, para conseguir uma solução homogénea de A , de cerca de 50-500 M de concentração de péptido, mas não limitada a esta concentração. Agentes alternativos com capacidade de dissociação são por exemplo dimetilsulfóxido, DMSO;

hexafluoroisopropanol, HFIP; ácido trifluoroacético, TFA. A truncagem pode ser de 1-10 aminoácidos, dando formas de wtA tais como: wtA 2-42, wtA -42, wtA 5-42 e assim por diante. O péptido wtA 1-42 dissolvido é subsequentemente neutralizado através de PBS ou tampão fisiológico semelhante e incubado a temperatura mais elevada, de preferência a 37°C, durante um período de tempo suficiente para que ocorra a formação de protofibrilhas, por exemplo durante a noite. Isto produzirá protofibrilhas de A de tipo selvagem. O invento proporciona também um método de determinação do tamanho molecular (peso molecular) para avaliar a formação e pureza de protofibrilhas, de preferência, mas não se limitando a, um método de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). O método de síntese de antigénio de protofibrilhas de tipo selvagem (wtA 42) puro, compreende os passos de disso$ão de um wtA 42 usando um agente de dissocção, tal como NaOH (pH>10), dimetilsulfóxido, DMSO; hexafluoroisopropanol, HFIP; ácido trifluoroacético e TFA, para conseguir uma solução monodispersa, neutralizando a solução através de PBS (pH 7-8) ou tampões biocompatíveis semelhantes, para conseguir uma solução fisiológica, incubando a solução neutralizada de péptido wtA 42 a uma concentção de proteína elevada entre 1-1000 M, de preferência 440 M, durante 6 horas ou mais a 20-40°C, de preferência a 37°C, para formar protofibrilhas de A 42wt, diluindo as protofibrilhas étaproximadamente 1-500 M, de preferência 50 M, centrifugando a velocidade e tempo suficientes para sedimentar as fibrilhas de wtA 42, que normalmente levam 5 minutos a 17000 xg, a +4°C, avaliando a pureza da preparação de protofibrilhas através de HPLC para controlar que a pureza é >95%, utilizando por exemplo HPLC de exclusão de tamanho, utilizando um tampão fisiológico tal como PBS a pH neutro como tampão de corrida, incluindo um detergente, tal como Polissorbato (Tween), ou um detergente semelhante, para evitar a aderência das protofibrilhas à matriz da coluna e dissociação.

Outro aspeto do invento refere-se à síntese de protofibrilhas de A ão de tipo selvagem utilizando A 1-42, ou formas truncadas no terminal N (truncagens 1-10) com a mutação Ártica G22E (US 2002-0162129 Al), a mutação Holandesa E22Q, a mutação Flamenga A21G, a mutação Italiana E22K, a mutação do Iowa D23N, e combinações destas. Numa concretização preferida do invento, é utilizado o péptido A 42arc (i.e., compreendendo a mutação ártica). O método para produzir protofibrilhas de A 42aré semelhante ao das protofibrilhas de wtA 42 exceto que as protof ibrilhas de A 42arc não são incubadas a 37°C de um dia para o outro, uma vez que se formam espontaneamente após o passo de neutralização. O método de síntese de antigénio de protofibrilhas de A 42arc puro compreende os passos de dissolução de um péptido A 42arc usando um agente de dissociação, tal como NaOH (pH>10), dimetilsulfóxido, DMSO; hexafluoroisopropanol, HFIP; ácido trifluoroacético e TFA para obter uma solução monodispersa, neutralização da solução através de PBS (pH 7-8) ou tampões biocompatíveis semelhantes, para conseguir uma solução fisiológica, estabilização das protofibrilhas formadas espontaneamente mantendo-as abaixo de 20°C, de preferência a 0-5°C, centrifugação das protofibrilhas, à mesma temperatura que no passo de estabilização, a uma velocidade e tempo suficientes para sedimentar as fibrilhas de A 42arc, o que normalmente leva 5 minutos a 17000 xg a +4°C, avaliação da pureza da preparação de protofibrilhas através de HPLC para controlar que a pureza é >95%, utilizando por exemplo HPLC de exclusão de tamanho, utilizando um tampão fisiológico tal como PBS a pH neutro como tampão de corrida, incluindo um detergente, tal como polissorbato (Tween), ou um detergente semelhante, para evitar a adesão das protofibrilhas à matriz da coluna e dissociação.

Outro aspeto do invento refere-se ao desenvolvimento de anticorpos que reagem de forma cruzada com protofibrilhas de A 42 de tipo selvagem após imunização com protofibrilhas de A 42arc. Outro aspeto do invento refere-se a um método para estabilizar protofibrilhas de A e em que a estabilição pode ser avaliada através de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) . As protof ibrilhas de A eluem àp 12-13 minutos num pico uniforme numa coluna de exclusão de tamanho Superdex 75 ou semelhante. A estabilidade da conformação pode também ser avaliada através de coloração com vermelho Congo (microscopia eletrónica), onde as protofibrilhas atingem uma estrutura curvilínea de 6-10 nm de diâmetro e <200 nm de comprimento. Uma temperatura reduzida tem um efeito significativo na estabilidade da conformação das protofibrilhas de A .As amostras devem ser de preferência mantidas abaixo de 20°C, de preferência abaixo de 5°C, e ainda entre 0°C e 5°C. Além disso, agentes que diminuam a polaridade ou a tensão superficial ou aumentem a viscosidade têm efeitos de estabilização na conformação das protofibrilhas de A . Por exemplo, glicerol a 10-50% ou Polissorbato (Tween) a 0,6-5%, têm efeitos estabilizadores sobre as protofibrilhas de A . Estes agentes e tratamentos podem ser adicionados à preparação de protofibrilhas A de preferência após o passo de neutralização no método para sintetizar protofibrilhas de A descrito acima. A adição destes agentes antes deste passo também é possível. O aumento da estabilidade das protofibrilhas é vantajoso quando se desenvolvem anticorpos monoclonais e quando as protofibrilhas de A ãs utilizadas como reagentes em imunoensaios, tais como ELISA, radioimunoensaio (RIA), Western blotting ou dot blotting. O método de estabilização das protofibrilhas de A inclui a sua mistura com um agente que diminua a polaridade do solvente ou um que reduza a tensão superficial, tal como glicerol ou Polissorbato (Tween), ou uma combinação dos referidos agentes. A estabilização pode também ser alcançada mantendo as protofibrilhas a uma temperatura abaixo de 20 °C, de preferência 0-5°C. Os referidos métodos podem também ser combinados. O invento refere-se também à utilização de anticorpos específicos anti-protofibrilhas de A para determiçães de protofibrilhas de A em tecidos humanos e animais, por exemplo, fluido cerebrospinal, sangue, soro, urina e tecido cerebral, mas não está limitado a estes tecidos, proporcionando um possível método de diagnóstico para a doença de Alzheimer. Métodos adequados para ensaiar protofibrilhas de A nestes tecidos, bem como em culturas celulares utilizando um anticorpo anti-protofibrilhas de A ãs imunoensaios, tais como ELISA, RIA, Western blotting, dot blotting ou ligação de proximidade. 0 método seria adequado para seguir a eficácia do tratamento (redução de protofibrilhas) em ensaios clínicos e adequado como teste de diagnóstico para a doença de Alzheimer ou síndroma de Down. 0 método de diagnóstico ou monitorização da doença de Alzheimer (DA) ou síndroma de Down compreende os passos de marcação do anticorpo de acordo com o presente invento com um agente que pode gerar um sinal mensurável, administração do referido anticorpo de acordo com um sujeito tendo ou suspeito de ter DA ou síndroma de Down, medição da quantidade de protofibrilhas ligadas ao anticorpo através da medição do sinal gerado pelo agente. 0 invento refere-se também à utilização de um anticorpo anti-protofibrilhas de A em imagiologia para deÇio, localização e quantificação de protofibrilhas de A em tecidos humanos e animais. 0 anticorpo anti-protofibrilhas de A pode ser marcado com um ligando radioativo tal como I131, C14, H3 ou Gálio58, mas não está limitado a estes radioisótopos, para fins de deteção. Para além da marcação com marcadores radioativos, ADN, moléculas fluorescentes, enzimas que convertem um substrato de modo a que a sua absorvância possa ser medida, poderiam também ser utilizados. 0 método será adequado como ferramenta de diagnóstico para a doença de Alzheimer ou síndroma de Down, demência de Lewybody, demência vascular, e outros distúrbios neurodegenerativos.

Um outro aspeto do invento refere-se à utilização de um anticorpo anti-protofibrilhas de A para a prevção ou o tratamento da doença de Alzheimer. Estudos pré-clínicos em modelos animais transgénicos demonstraram efeitos na carga de placas (Bard 2000), reversão de défices de memória (Dodard 2002) e drenagem de A a partir do SNC após tratamento com anticorpo anti-A . No entanto, os anticorpos utilizados nestes estudos não eram específicos para as protofibrilhas de A .A administração de um anticorpo anti-protofibrilhas de A , sem ou com pouca reatividade cruzada com monómeros e fibrilhas de A seria particularmente adequado para o tratamento e a prevenção da doença de Alzheimer. Em primeiro lugar, não se ligaria significativamente a formas fibrilhares de A e evitaria a interação com depósitos fibrilhares que são prevalentes nas paredes dos vasos sanguíneos, evitando imunorreações greves com concomitante inflamação grave do cérebro e encefalite, que foi verificada no estudo de vacinação de ELAN (ver no final dos Antecedentes) com a sua vacina AN-1792 (Nicoll 2004) . Em segundo lugar, um anticorpo anti- protofibrilha de A com baixa reatividade cruzada com monómeros de A 1-40 e A 1-42 não se ligaria nem interferiria com as suas funções biológicas normais, evitando assim efeitos secundários.

No referido método de prevenção ou tratamento da doença de Alzheimer ou síndroma de Down de um sujeito tendo ou suspeito de ter doença de Alzheimer, síndroma de Down, demência de Lewybody, demência vascular, e outros distúrbios neurodegenerativos, é administrado o anticorpo ou a composição de acordo com o presente invento. O invento proporciona também uma técnica através da qual anticorpos anti-protofibrilhas de A podem ser utilizados para identificar e selecionar epitopos presentes em protofibrilhas de A mas menos em monómeros de A e fibrilhas de A ou outras formas conformacionais de A . Oétoodo é geral e é aplicável a outros amiloides que formem protofibrilhas tais como, mas não limitados a, péptido da proteína amiloide dos ilhéus (IAPP, amilina) associado a diabetes Tipo-2, proteína prião (PrP), alfa-sinucleína (Parkinson) . Considerando o papel central de protofibrilhas de beta-amiloide (A ) na doença de Alzheimer, estes anticorpos podem ser utilizados para diagnosticar ou tratar a doença de Alzheimer. Existe a necessidade de um método que possa especificamente determinar protofibrilhas em diferentes tecidos humanos e animais, tais como líquido cefalorraquidiano (LCR), plasma, sangue, urina e tecido cerebral, mas não está limitado a estes tecidos. Um tal método poderia ser utilizado como um método de diagnóstico para a doença de Alzheimer mas também para doenças semelhantes que formem protofibrilhas de amiloide incluindo Parkinson (alfa-sinucleína), diabetes Tipo 2 (polipéptido amiloide dos ilhéus, IAPP) (W003/092619 A2) , e Doença de Creutzfeldt-Jacob e a doença animal correspondente chamada doença das vacas loucas (proteína Prião) (DeMarco 2004), mas não está limitado a estas doenças.

De acordo com outro aspeto, o presente invento refere-se à utilização de anticorpos anti-protofibrilhas de A para rastreio in vitro ou in vivo de substâncias que inibam ou modulem os niveis e/ou a atividade em culturas celulares ou modelos animais de protofibrilhas de A , sendo potenciais fármacos de Alzheimer. Sistemas de rastreio adequados seriam, mas não estão limitados a, culturas celulares (células HEC ou de neuroblastoma) ou por exemplo o modelo de ratinho transgénico Thy-1 APPSweArc, (Nilsson, L. et ai. Pedido de patente Sueca 0400707-6, 2004) que expressa a Proteína

Precursora de Amiloide (APP) humana com a mutação Ártica (E693G) proporcionando maior produção de protofibrilhas de A Os candidatos a fármacos de Alzheimer podem ser administrados a estas culturas celulares ou modelos animais transgénicos e os seus efeitos nos níveis de protofibrilhas de A medidos através de um imunoensaio, utilizando um anticorpo anti-protofibrilhas de A como reagente. Tal método seria idealmente adequado para a identificação de potentes candidatos a fármacos de Alzheimer. O referido método para rastreio in vitro ou in vivo de substâncias que inibam ou modulem os níveis de protofibrilhas de A e/ou a atividade em culturas celulares ou modelos animais, compreende os passos de administração de potenciais candidatos a fármacos a uma cultura celular ou um modelo animal, administração do anticorpo de acordo com o presente invento, marcado com um agente que possa gerar um sinal mensurável, à referida cultura celular ou modelo animal, avaliação do efeito dos referidos candidatos a fármacos através da medição da quantidade de protofibrilhas ligadas ao anticorpo através da medição do sinal gerado pelo agente.

De acordo com outro aspeto, o presente invento refere-se a um método de deteção de protofibrilhas de A in vitro, compreendendo a marcação de acordo com o presente invento com um agente que possa gerar um sinal mensurável, colocação em contacto do referido anticorpo ou composição compreendendo o anticorpo com uma amostra biológica suspeita de conter protofibrilhas solúveis, medição da quantidade de protofibrilhas ligadas ao anticorpo através da medição do sinal gerado pelo agente. O referido método pode ser um imunoensaio.

As amostras biológicas testadas podem ser selecionadas a partir de plasma, LCR, cérebro e outros tecidos de origem animal ou humana. A marcação inclui marcação com marcadores radioativos, ADN, moléculas fluorescentes, enzimas que convertem um substrato de modo a que a sua absorvância possa ser medida.

Todas as percentagens na descrição referem-se a percentagem em volume, a menos que indicado de outra forma.

4. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Cromatografia de exclusão de tamanho {SEC) de

Monómeros de A 40, Protofibrilhas de A 42Arc, Protofibrilhas de wtA 42 e prepapães de Fibrilhas d3 wtA QBumanos

Monómeros de A e protofibrilhas de A humanos a eluir em 19-20 minutos e em 12-13 minutos, respetivamente. As preparações de protofibrilhas (B e C) são essencialmente livres (<3%) de contaminação de outras formas de conformação de A A análise da preparação de fibrilhas (D) foi feita após centrifugação a 17900 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi analisado demonstrando a quase completa ausência de quaisquer formas de A solúveis na preparação de fibrilhas.

Figura 2. Estudo de estabilidade das protofibrilhas A estabilidade das preparações de Protofibrilhas de A 42Arc e Protofibrilhas de wt42 foi medida através de SEC. Uma conversão das protofibrilhas em fibrilhas foi avaliada através de uma diminuição na área do pico das protofibrilhas (diminuição da absorvância (UA) a 214 nm, tempo de eluição de 12-13 minutos) . A adição de glicerol a 10-50%, Tween-20 a 0,6% ou armazenamento a 0-5°C, aumentaram todos significativamente a estabilidade das protofibrilhas.

Figura 3. Titulação de soro de ratinho após imunização com protofibrilhas de wtA 42

Os ratinhos foram imunizados com uma preparação de protofibrilhas de wtA 42 em adjuvante completo de Freund (primeira injeção) e adjuvante incompleto de Freund (5-6 reforços). O sangue foi colhido e os títulos de anticorpo contra as protofibrilhas de A foram determinados. Os Ratinhos #2 e #4 mostraram os títulos mais elevados.

Figura 4. Método ELISA em sanduíche usando anti-mAb 258 para determinação das protofibrilhas de A 0 mAb 258 foi revestido de um dia para o outro numa placa de microtitulação. As preparações de protofibrilhas de wtA 42, protofibrilhas de A 42Arc, rnómeros de wtA 40 e fibrilhas de wtA 42 foram adicionadas em concentrações decrescentes e incubadas durante 1 hora a +4°C. O anticorpo secundário anti-A (6E10) foi adicionado. Finalmente, foi adicionado a cada poço um anticorpo conjugado com ALP (fosfatase alcalina) de deteção (anti-IgG). A deteção foi conseguida através da adição de substrato de ALP. A formação de cor foi medida a 405 nm e 492 nm. 0 mAb 258 ligou-se a protofibrilhas de wtA 42 e ligeiramente menos a protofibrilhas de A 42Arc. ãH foi observada ligação a monómeros de wtA 40. A ligeira ligação a fibrilhas de wtA 4¾ provavelmente devida a uma ligeira contaminação com protofibrilhas de wtA 42 (ver Figura 1D).

5. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustração e não se destinam a limitar o invento aos exemplos específicos fornecidos.

Exemplo: 1 Síntese de péptido amiloide beta humano (A ) de diferentes conformações

Formas humanas de tipo selvagem ou mutantes sintéticas dos péptidos A 1-42 ou A 1-40 foram adquiridas a Polypeptide Laboratories GmbH. Os péptidos foram sintetizados através de um procedimento de síntese de péptidos em fase sólida padrão.

Os péptidos foram subsequentemente purificados com RP-HPLC até uma pureza no intervalo de 90-95%. Fornecedores alternativos que produzam péptidos A com pureza semelhante ãs também possíveis de usar.

Sintese de monómeros de A -HO tipo selvagem humanos

Um péptido sintético wtA -10 foi dissolvido em 1 volume de NaOH 10 mM, pH>10, e 1 volume de PBS 2x frio (pH 7-8) a uma concentração de 50 Μ. A preparação do monómero de wtA 1-40 foi centrifugada a 17900 xg, a +4°C durante 5 minutos antes da análise (Figura 1). Síntese de protofibrilhas de A -H2 de tipo selvagem humanas

Um péptido wtA -12 sintético foi dissolvido em 9 volumes de NaOH 10 mM, pH>10, sujeito a vórtice durante 2 minutos e diluiu-se com um volume de PBS 10x (pH 7-8). A concentração de péptido final era neste momento 443 Μ. O péptido foi ainda incubado durante a noite a 37 °C. Após a incubação de um dia para o outro, o péptido foi ainda diluído com PBS a 50 M. A amostra foi centrifugada durante 17900 xg durante 5 minutos antes da análise e imunização. Síntese de protofibrilhas de A -H2Arc humanas

Um péptido A -42Arc (E22G) sintético foi dissolvido em 1 volume de NaOH 10 mM, pH>10 e 1 volume de PBS 2x frio (pH 7-8) até uma concentração de péptido final de 50 M. As protofibrilhas A l-42Arc foram formadas imediatamente e as protofibrilhas de A l-42Arc foram estabilizadas mantendo a solução a 0-4°C antes da análise ou imunização. A amostra foi centrifugada a 17000 xg durante 5 minutos a +4°C antes da análise. Formas alternativas para estabilizar as protofibrilhas de A l-42Arc foram adicionar glicerol até uma concentração final de 5-50% ou adicionar Tween-20 até uma concentração final de 0,6%. Síntese de fibrilhas de A -H2 de tipo selvagem humanas

Um péptido wtA -12 sintético foi dissolvido em 1 volume de água duplamente destilada, sujeito a vórtice durante 2 minutos e diluiu-se com 1 volume de PBS 2x (pH 7-8) e sujeitou-se novamente a vórtice durante 2 minutos. A concentração de péptido final neste ponto era de 50 Μ. A preparação de protof ibrilhas de wtA 1-42 foi incubada a 37°C, durante 48 horas antes da análise. A amostra foi centrifugada a 17900 xg durante 5 minutos antes da análise através de SEC. Ο sobrenadante foi analisado após centrifugação. Não foi realizada nenhuma centrifugação quando as preparações de fibrilhas de A 1-42 foram analisadas através de ELISA ondot blotting.

Análise da preparação de A atréb de Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC)

Um sistema de HPLC LaChrom D-7000 de Merck Hitachi, possuindo um detetor de matriz de díodos (DAD) modelo L-7455 e uma bomba modelo L-7100, foi utilizado para a análise cromatográfica das preparações de protofibrilhas em combinação com uma coluna Superdex 75 PC3.2/30 (Amersham Pharmacia

Biotech, Uppsala, Suécia). 0 sistema cromatográfico separa os monómeros de A ad protofibrilhas, que estão a eluir no volume de vazio da coluna. A coluna foi equilibrada com Na2HPC>4 50 mM-NaH2PC>4 (pH 7,4) com NaCl 0,15 M (PBS) e Tween 20 a 0,6% e eluída com o mesmo tampão a um caudal de 0,08 ml/min (a pressão foi de 5-6 bars) à temperatura ambiente (22°C). Dez (10 1) de uma amostra de A 50 M-100 M foram submetidos a análise utilizando um varrimento de comprimentos de onda entre 200-400 nm. Foi adicionado Tween 20 à amostra para dar uma concentração final de 0,6% antes da cromatografia. Os dados foram extraídos a partir de medições a 214 e 280 nm. As áreas dos picos foram integradas utilizando o modelo D-7000 do suporte lógico da Estação de Dados de Cromatografia de Merck Hitachi. A Figura 1 mostra cromatogramas do monómero de wtA -10, protofibrilhas de wtA 1-42, protofibrilhas de A l-42Arc e preparações de fibrilhas de wtA 1-42.

Cada preparação era essencialmente livre (<3%) de outras formas conformacionais de A contaminantes exceto a preparação de monómero de wtA -10 que continha protof ibrilhas a 6,4% (tempo de eluição de 12-13 minutos).

Exemplo 2: Desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos de protofibrilhas

Um procedimento padrão foi utilizado para o desenvolvimento monoclonal. Os ratinhos foram injetados com uma preparação de protofibrilhas de wtA 1-42.

Alternativamente, podiam ser utilizadas protofibrilhas de A 1-42Arc. Cada protofibrilha de wtA 1-42 foi ensaiada através de SEC e Vermelho do Congo (liga-se às estruturas de folha nas proteínas) antes da imunização para verificar a pureza das protofibrilhas e que a preparação continha uma estrutura de folha . 0 procedimento utilizado para imunizar ratinhos foi um protocolo padrão envolvendo injeções s.c. na presença de adjuvante de Freund. Cada um dos seis ratinhos foi imunizado com 10 g de protof ibrilhas de wtA 1-42 e subsequentemente reforçado com 30 g. A amostra foi misturada 1:1 com adjuvante completo de Freund antes da primeira injeção. Para as subsequentes 5 injeções de reforço foi utilizado adjuvante incompleto de Freund. O ratinho n não foi imunizado (controlo).

Os ratinhos foram sangrados e o sangue colhido para determinações do título de anticorpos (Figura 3) . Foi dado mais um reforço (30 g) aos ratinhos que foram depois sacrificados e o baço foi colhido para desenvolvimento de hibridomas. O método de preparação do hibridoma utilizado foi de acordo com o procedimento padrão (Harlow 1988) .

Exemplo 3: Rastreio de anticorpos específicos de protofibrilhas de wtA -Ϊ2

Foi desenvolvido um método de ELISA através do qual os sobrenadantes de hibridoma foram pesquisados quanto a anticorpos que se liguem a protofibrilhas de A 1-42. O sobrenadante de hibridoma #258 mostrou elevada especificidade para as protof ibrilhas (Figura 3) . O hibridoma #258 foi novamente semeado e pesquisado para verificar uma linha celular homogénea. O anticorpo monoclonal que foi produzido a partir do hibridoma #258 foi definido como anticorpo monoclonal 258 (mAb258). Alternativamente, a pesquisa (ligação a protofibrilhas de A mas não a monómeros ou fibrilhas de A ) pode ser realizada contra uma biblioteca de apresentação fágica de anticorpos, onde a biblioteca foi feita a partir de ARN isolado a partir de animais imunizados com protofibrilhas.

Exemplo 4. Caracterização do mAb 258 através de análise de Western blot O objetivo da experiência foi determinar se o mAb 258 reage de forma cruzada com a proteína precursora de amiloide de tipo selvagem (wtAPP) humana ou APP humana mutada, APPswe, APP swe-arc (Nilsberth 2001, Mullan 1992) as quais contêm todas A 1-42 não clivado. As células foram transfetadas com plasmideos expressando wtAPP humana, APPswe e APPswe-arc. As células foram subsequentemente colhidas e solubilizadas e as proteínas celulares separadas através de SDS-PAGE e transferidas para papéis de filtro de nitrocelulose e subsequentemente incubadas com mAb 258 ou mAb 6E10. A ligação especifica destes anticorpos contra proteínas celulares separadas foi detetada através de incubação dos papéis de filtro numa solução de anticorpo secundário anti-IgG/IgM de ratinho e subsequente revelada através de incubação com super sinal de Pierce (art. nr. 34080-P) e uma película sensível à luz . 0 mAb 258 não apresentou ligação a wtAPP, APPswe ou APPswe-arc nem ao monómero de wtA 40. O mAk6E10 comercial ligou-se a todas estas formas.

Exemplo 5: ELISA em sanduíche para caracterização e determinações das protofibrilhas A especificidade do mAb 258 foi determinada através de um ELISA em sanduíche.

Uma placa de ELISA de 96 poços foi revestida com mAb 258 durante a noite a +4°C. Após o revestimento, os poços foram bloqueados com BSA durante 1 hora à temperatura ambiente. As amostras de A , isto é, os monómeros de wtA 40, as protofibrilhas de wtA 42, as protofibrilhas de wtA 42-Arc e as fibrilhas de wtA 42, foram adicionados à placa de microtitulação, em diluições de 5* partindo de 10 g/ml. As amostras foram incubadas durante 1 hora a +4°C, após o que foram adicionados 10 ng/poço de um anticorpo secundário comercial, 6E10 (Signet) e se incubou durante 1 hora à temperatura ambiente. A deteção foi conseguida através de incubação com um anticorpo anti-IgG conjugado com ALP-comercial durante 1 hora à temperatura ambiente e subsequente incubação com o substrato à temperatura ambiente durante uma hora de acordo com o procedimento do fabricante. As amostras foram lidas num leitor de placas de microtitulação (Spectra max 190 Molecular Devices, Sunyvale, EUA) a 405 nm e 492 nm. Figura 4A. 0 mAb 258 mostrou pouca ou nenhuma reatividade cruzada com monómeros de wtA 40 ou fibrilhas de wtA 42. ConcehêSâ de protofibrilhas de wtA 42 étlO ng/ml eram mensuráveis. A ligação de um anticorpo especifico anti-protofibrilhas de A 42arc (7E4) (A 42arc na confçãoiade protof ibrilhas foi utilizado como antigénio durante a imunização) foi medida no ELISA em sanduíche revestido com concentrações crescentes de protofibrilhas de wtA 42. A detção foi conseguida através quer de um mAb específico de A (1C3) como anticorpo de deteção secundário (Figura 4B) ou através do mAb comercial 6E10, como anticorpo secundário (Figura 4C). Uma forte ligação do mAb 7E4 foi alcançada para protofibrilhas de wtA 42. ÍMeis de concentração tão baixos quanto 2-5 ng/ml de protofibrilhas de wtA 42 eram mensuráveis. Os anticorpos monoclonais 4E11 e 10F7 mostram ligação menos forte às protofibrilhas de wtA 42 (Figura 4B e 4C). REFERÊNCIAS:

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Lisboa, 2015-07-09

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo ou fragmento deste que se liga tanto a protofibrilhas de A 42 de tipo selvagem como a protofibrilhas de A 42arc e com reduzida reatividade cruzada com o mómero de A 42, em que o referido anticorpo ou fragmento deste é obtenível através da utilização de protofibrilhas de A 42Arc ou A 42wt com mais de 95% de pureza para imunição e rastreio.
2. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo ou fragmento deste pode detetar tanto protofibrilhas de A de tipo selvagem como protofibrilhas de A Ártica num ELISA no intervalo de concentrações de 1000-10 ng/ml.
3. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo ou fragmento deste pode detetar tanto protofibrilhas de A de tipo selvagem como protofibrilhas de A Ártica num ELISA no intervalo de concentrações de 1000-0,1 ng/ml.
4. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido anticorpo é policlonal.
5. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido anticorpo é monoclonal (mAb).
6. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com as reivindicações 1-5, em que o referido anticorpo ou fragmento deste foi criado contra protofibrilhas compreendendo os referidos péptidos A contendo uma ou ávias mutações selecionadas a partir do grupo que consiste na mutação Ártica G22E, a mutação Holandesa E22Q, a mutação Flamenga A21G, a mutação Italiana E22K, a mutação do Iowa D23N, e combinações destas.
7. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com as reivindicações 1-6, em que o referido anticorpo ou fragmento deste é humano ou foi humanizado.
8. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com as reivindicações 1-7, em que o anticorpo ou fragmento deste é marcado.
9. Composição compreendendo um ou mais anticorpos ou fragmentos destes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 .
10. Composição da reivindicação 9 compreendendo ainda um transportador ou excipiente.
11. Método de deteção de protofibrilhas de A in vitro, compreendendo os passos de: - marcação do anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 ou a composição de acordo com a reivindicação 9 ou a reivindicação 10 com um agente que pode gerar um sinal mensurável; - adição do referido anticorpo marcado ou composição compreendendo um anticorpo a uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender protofibrilhas de A ; - medição da concentração do complexo formado entre a referida protofibrilha de A e o referido anticorpo ou fragmento deste.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o referido método de deteção é um imunoensaio.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o referido método de deteção é um ensaio de ligação de proximidade.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, em que a referida amostra biológica é selecionada a partir de plasma, LCR, cérebro e outros tecidos de origem animal ou humana.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, em que o anticorpo ou fragmento deste é marcado com marcadores radioativos, ADN, moléculas fluorescentes, ou enzimas que convertem um substrato de modo a que a sua absorvância possa ser medida.
16. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 ou a composição de acordo com a reivindicação 9 ou a reivindicação 10 para utilizar na prevenção ou tratamento da doença de Alzheimer ou síndroma de Down num sujeito tendo ou suspeito de ter doença de Alzheimer ou síndroma de Down.
17. Método para pesquisa in vitro de substâncias que inibam ou modulem os níveis de protofibrilhas de A e/ou a atividade em culturas celulares, compreendendo os passos de: - administração de potenciais candidatos a fármacos a uma cultura celular, - administração de um anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 ou na composição de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, marcado com um agente que possa gerar um sinal mensurável, à referida cultura celular, - avaliação do efeito dos referidos candidatos a fármacos através da medição da quantidade de protofibrilhas ligadas ao anticorpo ou fragmento deste através da medição do sinal gerado pelo agente.
18. Método de diagnóstico ou monitorização da doença de Alzheimer (DA) ou síndroma de Down, compreendendo os passos de: - adição do anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 a uma amostra biológica de um sujeito tendo ou suspeito de ter DA ou síndroma de Down, - medição da quantidade de protofibrilhas ligadas ao anticorpo ou fragmento deste utilizando ELISA, RIA, Western blotting, dot blotting ou ligação de proximidade.
19. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 para utilizar num método de diagnóstico da doença de Alzheimer, o método compreendendo: - marcação do anticorpo ou fragmento deste definido em qualquer uma das reivindicações 1-8 com um agente que possa gerar um sinal mensurável; - adição do referido anticorpo marcado a uma amostra tomada a partir de um sujeito; e - medição da concentração do complexo formado entre o referido anticorpo ou fragmento deste e quaisquer protofibrilhas de A na referida amostra.
20. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 para utilizar num método de diagnóstico de síndroma de Down, demência de Lewybody ou demência vascular, o método compreendendo: - marcação do anticorpo ou fragmento deste definido em qualquer uma das reivindicações 1-8 com um agente que possa gerar um sinal mensurável; - adição do referido anticorpo marcado a uma amostra tomada a partir de um sujeito; e - medição da concentração do complexo formado entre o referido anticorpo ou fragmento deste e quaisquer protofibrilhas de A na referida amostra. Lisboa, 2015-07-09