PT1931697E - Antagonistas de il-17a e il-17f e processos para a sua utilização - Google Patents

Description

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Descrição "Antagonistas de IL-17A e IL-17F e processos para a sua utilização"

Antecedentes da Invenção

As citocinas são pequenas proteínas solúveis que medeiam uma variedade de efeitos biológicos incluindo a regulação do crescimento e diferenciação de muitos tipos de células (Rev, por exemplo, Arai et al., Annu. Ver. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul e Seder, Cell 76:241 (1994)). As proteínas que constituem o grupo das citocinas incluem interleucinas, interferões, factores de estimulação de colónias, factores de necrose tumoral, e outras moléculas reguladoras. Por exemplo, a interleucina-17 humana e uma citocina que estimula a expressão da interleucina-6, molécula 1 de adesão intracelular, interleucina-8, factor de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos, e expressão de prostaglandina E2 e desempenha uma função na maturação preferencial de precursores hematopoiéticos CD34+ em neutrófilos (Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).

Os receptores que se ligam a citocinas são compostos tipicamente por uma ou várias proteínas integrais de membrana que ligam a citocina com elevada afinidade e traduzem este evento de ligação para a célula através das porções citoplásmicas de determinadas subunidades receptoras. Os receptores de citocinas foram agrupados em várias classes com base em semelhanças dos domínios de ligação de ligandos extracelulares.

As actividades demonstradas in vivo por citocinas e seus receptores ilustram o potencial clínico e necessidade de outras citocinas, receptores de citocinas, agonistas de 2 citocinas e antagonistas de citocinas. Por exemplo, actividades demonstradas in vivo da família das citocinas pro-inflamatórias ilustra o enorme potencial clínico de, e necessidade de antagonistas de moléculas pro-inflamatórias. 0 pedido de patente de invenção internacional WO 2005/010044 revela anticorpos e pequenas moléculas para inibir IL-17A e IL-17F. O pedido de patente de invenção internacional WO 2005/06571 revela receptores de IL-17 quiméricos e seus ligandos. Contudo, não é revelado nenhum receptor solúvel IL-17C e IL-17F que se ligue especificamente a IL-17A e IL-17F.

Breve Descrição das Figuras

As figuras IA e 1B são representações gráficas da estrutura do exão de IL-17RCxl humano (SEQ ID N° 2) . Para aqueles aminoácidos em que o codão foi unido (spliced) através de uma junção exão/intrão, a junção foi movida para incluir o codão completo.

As figuras 2A e 2B são representações gráficas da estrutura do exão de IL-17RCxl humano (SEQ ID N° 166). A figura 3 é uma representação gráfica da estrutura do exão da IL-17RA humano (SEQ ID N° 21).

As figuras 4A e 4B são representações gráficas da estrutura do exão de um polipéptido solúvel preferido da presente invenção como aqui descrito e na SEQ ID N° 157 e 158. Este polipéptido solúvel compreende exões de IL-17RA humano (SEQ ID N° 21) e de IL-17RCxl humano (SEQ ID N° 2). A figura 5 é uma representação gráfica de um resultado típico de um ensaio utilizando o protocolo descrito no Exemplo 34. O gráfico foi gerado utilizando o programa de software Prizm. Os valores de Y representam a MFI normalizada para o máximo e mínimo (100% e 0%) baseada nos poços apenas com ligando e poços sem ligando/ sem receptor solúvel de controlo, 3 e assim a ligação percentual do ligando às células. 0 software calcula o IC50 para cada curva.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção diz respeito a estas necessidades disponibilizando antagonistas para as citocinas pro-inflamatórias IL-17A e IL-17F. Especificamente, as citocinas pro-inflamatórias IL-17A e IL-17F possuem um elevado grau de semelhança de sequência, partilham muitas propriedades biológicas, e são ambas produzidas por células T activadas. Ambas foram implicadas em factores que contribuem para a progressão de várias doenças autoimunitárias e inflamatórias incluindo artrite reumatóide e asma. De facto, reagentes que negam a função IL-17A melhoram significativamente a incidência da doença e a gravidade em vários modelos no ratinho da doença humana. IL-17A medeia o seu efeito, através da interacção com o seu factor cognato, o receptor IL-17 (IL-17R), mas o receptor para IL-17F não tinha sido ainda identificado. Anteriormente, tínhamos divulgado que o IL-17RC é um receptor tanto para IL-17A e IL-17F, e liga-se a ambos com uma afinidade elevada semelhante. Por outro lado, o IL-17R, liga-se a IL-17A com uma elevada afinidade, mas liga-se a IL-17F com uma afinidade muito baixa. Consistente com este facto foi demonstrado que uma forma solúvel de IL-17R bloqueia a ligação de IL-17A e a sinalização em células que expressam cada um dos receptores, mas não interfere com a ligação, ou a função de IL-17F para IL-17RC.

Desde que a intervenção de IL-17A foi proposta como uma terapia eficaz para várias doenças autoimunitárias, utilizando os antagonistas da presente invenção, que podem bloquear, inibir, reduzir, antagonizar, ou neutralizar a actividade de ambos os IL-17A e IL-17F vão possuir vantagens em relação a terapias que têm como alvo apenas uma daquelas duas citocinas. 4 A invenção ainda disponibiliza as suas utilizações em doenças inflamatórias, assim como composições e processos relacionados. A) Panorâmica

Doenças relacionadas com o sistema imunitário e doenças inflamatórias são a manifestação, ou consequência de mecanismos muito complexos, frequentemente metabolismos biológicos múltiplos interligados que na fisiologia normal são criticos na resposta ao insulto ou ferimento, iniciar a reparação do insulto ou ferimento e montar a defesa inata, ou adquirida contra organismos estranhos. A doença, ou patologia ocorre, quando estes metabolismos fisiológicos normais provocam um insulto ou ferimento adicionais relacionados directamente com a intensidade da resposta, como consequência de uma regulação anormal, ou estimulação excessiva, como uma reacção ao próprio, ou como uma combinação destas.

Apesar da génese destas doenças envolver frequentemente vias de passos múltiplos e frequentemente sistemas biológicos/metabolismos diferentes, a intervenção em pontos criticos num ou vários destes metabolismos pode possuir um efeito de melhoria, ou terapêutico. A intervenção terapêutica correr por antagonismo de um processo/metabolismo prejudicial, ou estimulação de um processo/metabolismo benéfico. São conhecidas muitas doenças relacionadas com o sistema imunitário que foram estudadas extensivamente. Tais doenças incluem doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imunitário (tal como a artrite reumatóide, doença renal mediada pelo sistema imunitário, doenças hepato-biliares, doença inflamatória dos intestinos (IBD), psoriase e asma), doenças inflamatórias que não são mediadas pelo sistema imunitário, 5 doenças infecciosas, doenças de deficiência imunitária, neoplasias etc.

Os linfócitos T (células T) são uma componente importante de uma resposta imunitária de um mamífero. As células T reconhecem antigénios que se encontram associados com uma molécula própria codificada pelos genes do maior complexo de histocompatibilidade (MHC). 0 antigénio pode ser apresentado conjuntamente com moléculas MHC à superfície das células que apresentam o antigénio, células infectadas pelos vírus, células cancerosas, enxertos, etc. 0 sistema de células T elimina estas células alteradas que colocam uma ameaça a nível da saúde ao mamífero hospedeiro. As células T incluem células T auxiliares e células T citotóxicas. As células T auxiliares proliferam extensivamente como consequência do reconhecimento de um complexo de antigénio MHC, ou de uma célula que apresenta um antigénio. As células T também secretam uma variedade de citocinas, i.e, linfocinas que desempenham um papel central na activação de células B, células T citotóxicas e uma variedade de outras células que participam na resposta imunitária.

Um acontecimento central em respostas imunitárias humorais e mediadas por células é a activação da expansão clonal de células T auxiliares. A activação de células auxiliares T é iniciada pela interacção do receptor de células T, complexo (TCR)-CD3 com um antigénio MHC à superfície de uma célula que apresenta um antigénio. A interacção medeia uma cascata de acontecimentos bioquímicos que induzem a célula T auxiliar em repouso a entrar num ciclo celular (transição GO para transição Gl) e resulta na expressão de um receptor de elevada afinidade para IL-2 e algumas vezes para IL-4. A célula T activada progride, através do ciclo proliferando e diferenciando-se em células de memória, ou em células efectoras. 6

Para além dos sinais mediados, através de TCR, a activação das células T envolve uma co-estimulação adicional induzida pelas citocinas libertadas pela célula que apresenta um antigénio, ou através de interacções com moléculas ligadas à membrana da célula que apresenta o antigénio e à célula T. Foi demonstrado que as citocinas IL-1 e IL-6 fornecem um sinal de co-estimulação. Também a interacção entre a molécula B7 expressa sobre a superfície de uma célula que apresenta um antigénio e as moléculas CD28 e CTLA-4 expressas sobre a superfície da célula T afectam a activação de células T. Células T activadas expressam um número acrescido de moléculas de adesão celulares, tais como ICAM-1, integrinas, VLA-4, LFA-1, CD56, etc. A proliferação de células T numa cultura de linfócitos misturada ou reacção de linfócitos misturada (MLR) é uma indicação estabelecida da capacidade de um composto de estimular o sistema imunitário. Em muitas respostas imunitárias, células inflamatórias infiltram o local de ferimento, ou infecção. As células migradoras podem ser neutrofílicas, eosinofílicas, monocíticas, ou linfocíticas, como pode ser determinado pelo exame histológico dos tecidos afectados. Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.

Doenças imunitárias relacionadas poderiam ser tratadas suprimindo a resposta imunitária. A utilização de receptores solúveis e/ou a neutralização dos anticorpos que inibem moléculas que possuem actividade estimuladora imunitária seria benéfica para o tratamento das doenças mediadas pelo sistema imunitário e doenças inflamatórias. Podem ser utilizadas moléculas que inibem a resposta imunitária (directamente proteínas, ou através da utilização de agonistas de anticorpos) para inibir a resposta imunitária e melhorar deste modo doenças relacionadas com o sistema imunitário. 7 A interleucina-17 (IL-17A) foi identificada como um ortólogo celular de uma proteína codificada pelo linfócito T do vírus de Herpes Saimri (HSV) [ver Rouvier et al., J. Immunol., 150(12):5445-5456 (1993); Yao et al., J. Immunol., 122 (12):5483-5486 e Yao et al., Immunity, 3(6):811-821 (1995)]. A subsequente caracterização mostrou que esta proteína é uma citocina potente que actua para induzir respostas pro-inflamatórias numa larga variedade de tecidos periféricos. IL-17A é uma citocina homodimérica ligada por uma ponte dissulfídica de cerca de 32 kDa que é sintetizada e secretada apenas pelas células de memória CD4+ activadas (revistas em Fossiez et al., Int. Ver. Immunol., 16: 541-551 [1998]). Especificamente a IL-17 é sintetizada como um polipéptido precursor de 155 aminoácidos com uma sequência N-terminal de 19-33 resíduos e é secretada como uma glicoproteína homodimérica de ligação dissulfídica. A IL-17A é revelada na W09518826 (1995), WO9715320 (1997) e WO 9704097 (1997), assim como a patente de invenção N° 6,063,372.

Apesar da sua distribuição restrita no tecido, IL-17A exibe actividades biológicas pleitrópicas em vários tipos de células. Verificou-se que a IL-17A estimula a produção de muitas citocinas. Induz a secreção de IL-6, IL-8, IL-12, factor de inibição da leucemia (LIF), prostaglandina E2, MCP-1 e G-GSF por células aderentes como os fibroblastos, queratinócitos, células epiteliais e endoteliais. A IL-17A possui a capacidade de induzir a expressão à superfície de ICAM-1, proliferação de células T, e crescimento e diferenciação de CD34.sup+ progenitoras humanas em neutrófilos. A IL-17A foi implicada no metabolismo dos ossos, e sugeriu-se desempenhar um papel importante nas condições patológicas caracterizadas pela presença de célula T activadas e produção de TNF-alfa, tal como artrite reumatóide e perda de δ implantes do osso (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14:1513-1521 [1999]). Verificou-se que células T activadas do tecido sinovial derivadas de doentes de artrite reumatóide segregavam quantidades mais elevadas de IL-17A do que as derivadas de indivíduos normais ou de doentes de osteoartrite (Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42: 963-970 [1999]). Foi sugerido que esta citocina pro-inflamatória contribui activamente para a inflamação sinovial na artrite reumatóide. Para além deste papel pro-inflamatório, a IL-17A parece contribuir para a patologia da artrite reumatóide, através de ainda um outro mecanismo. Por exemplo, verificou-se que a IL- 17A induzia a expressão do factor de diferenciação do osteoclasto (ODF) ARNm em osteoblastos (Kotake et al., J. Clin. Invest., 103: 1345- 1352 [1999]). 0 ODF estimula a diferenciação de células progenitoras em osteoclase, as células envolvidas na reabilitação óssea.

Uma vez que o nível da IL-17A é aumentado significativamente no fluido sinovial dos doentes de artrite reumatóide parece que a formação de osteoclastos induzida por IL-17A desempenha um papel crucial na reabsorção óssea na artrite reumatóide. Também se considera que a IL-17A desempenha um papel chave em determinadas desordens auto-imunitárias, tais como a esclerose múltipla (Matusevicius et al., Mult. Scler., 5:101-104 [1999]). Foi ainda demonstrado que a IL-17A por sinalização intracelular estimula o influxo Ca.sup.2+ e uma redução no [cAMP], nos macrófagos humanos (Jovanoviv et al., J. Immunol., 160:3513 [1998]). Os fibroblastos tratados com IL-17A induzem a activação de NF-kappa. B, [Yao et al., Immunity, 3:811(1995), Jovanovic et al., supra] , enquanto que os macrófagos tratados com ela activam NF-kappa. B e proteínas cinases activadas por 9 mitogénios (Shalom-Barek e tal., J. Biol. Chem., 273:27467 [1998]) .

Além disso, a IL-17A também partilha semelhança da sequência com factor 7 de mamíferos semelhantes a citocina que se encontra envolvido no crescimento dos ossos e da cartilagem. Outras proteínas com as quais os polipéptidos IL-17A partilham semelhança de sequência são o factor relacionado com a interleucina derivado do embrião humano (EDIRF) e a interleucina-20.

Consistente com a larga gama de efeitos da IL-17A, verificou-se que o receptor da superfície da célula para a IL-7A era largamente expresso em muitos tecidos e tipos de células (Yao et al., Cytokine, 9:794 [1997]). Enquanto que a sequência de aminoácidos do receptor de IL-17A humana (IL-17R) (866 aminoácidos) prevêem uma proteína com um domínio transmembranar único e um domínio intracelular longo de 525 aminoácidos, a sequência do receptor é única e não é semelhante à de qualquer dos receptores da família das citocinas/factor de crescimento. Isto acoplado com a falta de semelhança da própria IL-17A em relação a outras proteínas conhecidas indica que a IL-17A e o seu receptor pode fazer parte de uma nova família de proteínas de sinalização e receptores. Demonstrou-se que a actividade de IL-17A é mediada, através da ligação ao seu único receptor da superfície celular, quando estudos prévios demonstraram que contactando células T com uma forma solúvel do polipéptido receptor de IL-17A inibia a proliferação de células T e a produção de IL-2 induzida por PHA, concanavalina A e anticorpo monoclonal anti-TCR (Yao et al., J. Immunol., 155:5483-5486 [1998]). Como tal, existe um interesse significativo em identificar e caracterizar novos polipéptidos que possuem homologia com os receptores conhecidos da citocina, especificamente os receptores de IL-17A. 10 O padrão de expressão de IL-17F parece ser semelhante ao de IL-17A, de modo a incluir apenas células CD4 + activadas e monócitos. (Starnes et al. J. Immunol. 167:4137-4140 [2001]). Demonstrou-se que IL-17F induzia G-CSF, IL-6 e IL-8 em fibroblastos (Hymowitz et al., EMBO J. 20:5322-5341 [2001]) e TGF-b em células endoteliais (Starnes et al. J. Immunol. 167:4137-4140 [2001]). Foi recentemente reportado que a IL-23, uma citocina produzida por células dendritica pode mediar a produção de IL-17A e IL-17F, principalmente em células T de memória (Aggarwal et al. J. Biol. Chem. 278:1910-1914 [2003]).

Além disso, a sobre-expressão ou regulação para cima da IL-17A e IL-17F foi demonstrada em indivíduos com artrite e asmáticos (revisto em Moseley et al. Cytokine Growth Factor Ver 14:155-174 [2003]). No que diz respeito à artrite, estas citocinas actuam de uma maneira caracteristica da destruição da cartilagem e das articulações que se encontra associada com a artrite reumatóide e osteoartritica. Por exemplo, demonstrou-se que a IL-117A e IL-17F aumentam a degradação da matriz em explantes de cartilagem articular, através da libertação de fragmentos de proteoglicanos e glicosaminoglicanos da cartilagem e fragmentos de colagénio, inibindo a síntese de novos proteoglicanos e colagénios (Cai et al. Cytokine 16:10-21 [2001]; Attur et al. Arthritis Rheum 44: 2078-2083 [2001]). À semelhança da IL-17A, demonstrou-se também que a sobre-expressão de IL-17A em ratinhos aumenta o recrutamento de neutrófilos dos pulmões e resulta numa expressão acrescida de citocinas associadas a Th-I nos pulmões, incluindo IL-β, IFN-gama, IP-10 e MIG (Starnes et al. J. Immunol. 167:4137-4140 [2001]) . A IL-17F é também regulada para cima em células T de asmáticos desafiados por alergenos (Kawaguchi et al. J. Immunol 167:4430-4435 [2001]), e verificou-se induzir a produção de IL-6 e IL-8 em NHBE. Em contraste com a IL-17A, 11 IL-17F parece inibir a angiogénese in vitro (Starnes et al. J. Immunol. 167:4137-4140 [2001]). O ARNm de IL-7F não foi detectado por transferência de Northern em vários tecidos humanos, mas foi dramaticamente induzida por activação de células T CD4+ e de monócitos. Verificou-se que em ratinhos células Th2 e células mastr expressam IL-17F, quando activadas. Ver Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3) (2003). Verificou-se também que tal como a IL-17A, a expressão de IL-17Fera regulada para cima por IL-23 em ratinhos.

As famílias de citocinas ΙΙ-17/receptores parecem representar um sistema de sinalização único na rede de citocinas que vai oferecer estratégias inovadoras na manipulação de respostas imunitárias e inflamatórias. Neste contexto, a presente invenção encontra-se baseada na descoberta numa nova família de receptores de IL-17, IL-RC e a sua capacidade de se ligar a IL-17a e IL-17F.

IL-17RC foi inicialmente identificada utilizando uma estratégia bioinformática para pesquisar proteínas relacionadas com IL-17RA e identificadas, através de um ADNc que codifica para a proteína IL-17RC relacionada com o receptor IL-17. Apesar da sua semelhança óbvia com o receptor IL-17 (IL-17RA), que se liga ao membro fototípico IL-17A da família IL-17, e a identificação dos outros 5 membros da família das citocinas IL-17, um ligando específico para IL-17RC ainda não tinha sido anteriormente divulgado. Contudo, a IL-17A e IL-17F forma identificados como ligandos específicos para IL-17RC como descrito no pedido de patente de invenção US N° 11/150,533, registado no dia 10 de Junho de 2005 e publicado como patente de invenção N° 20060002925. Especificamente, estes ligandos foram identificados utilizando células de rins de hamster bebés (BHK) que foram transfectados de forma estável com construções que codificam para o IL-17RA 12 humano (hIL-17RA) ou IL-17RC (hIL-17RC). A expressão de receptores à superfície foi confirmada por análise FACS utilizando um anticorpo monoclonal para hIL-17RA ou um antisoro policlonal para hIL-17RC. Para avaliar a ligação à citocina, foram utilizadas formas biotiniladas da IL-17A humana, C, D, E, e F e estreptavidina conjugada com fluorocromo para detectar a ligação da citocina a células transfectadas por citometria de fluxo. Estes resultados mostraram claramente que células BHK transfectadas de forma estável que expressam hIL-17RA se ligam claramente à IL-17A humana (hIL-17A) como esperado, enquanto as transfectadas com um vector de expressão vazio não conseguiram ligar-se a qualquer dos membros da família IL-17 testada. Foi observada uma ligação relativamente fraca de IL-17F humana (hIL-17F) a células transfectadas hIL-17RA, mas não houve uma ligação significativa a outros membros da família de IL-17 testados. Foram examinados outros membros da família IL-17, quanto à ligação de células de hIL-17RC transfectadas e foi verificado que estas células apresentaram uma ligação significativa a hIL-17F. Além disso, foi observada uma ligação significativa de hIL-17A a estas células, mas nenhuma ligação a hIL-17C, D, ou E. Estes dados mostraram que hIL-17RC era o receptor de hIL-17F e hIL-17A.

Além disso, foi examinado o nível de fluorescência numa gama de concentrações de citocinas para determinar as afinidades relativas de hIL-17A e F para hIL-17RA e hIL-17RC. Comparando as intensidades de fluorescência médias das citocinas individuais em cada transfectante, verificou-se que hIL-17A se ligava muito melhor a hIL-17RA do que a hIL-17F, mas ambas as citocinas pareciam ligar-se igualmente bem a células hlL-17RC transfectadas. É interessante o facto da ligação de citocinas a células que expressavam ambos os receptores pareciam ser aditivas sem evidência de cooperação. 13 A seguir foi investigada a especificidade desta ligação tentando competir com a ligação com uma citocina não marcada. Células BHK transfectadas foram incubadas com uma concentração fixa de citocina biotinilada e concentrações acrescidas de citocina não marcada e a quantidade de material biotinilado marcado foi quantificado por FACS. Verificou-se que a ligação de IL-17A e F a hIL-17RC era especifica, uma vez que concentrações acrescidas de citocina não marcada interferiam com a ligação de material não biotinilado. De facto, hIL-17A e não marcado e F competiram eficazmente de forma cruzada para a inibição de formas biotiniladas de ambas as citocinas para células transfectadas hIL-17RC, sugerindo que as duas citocinas se estavam a ligar a hIL-17RC com afinidades semelhantes, e que se estavam a ligar em sobreposição, no caso de não serem locais idênticos. A hIL-17A não marcada também competia eficazmente para a ligação de hIL-17A e F biotiniladas a células hIL-17RA transfectadas, enquanto hlL-17F não marcada não apresentaram essencialmente capacidade de competir para a ligação de hIL-17A a hIL-17RA. Este facto indicou que apesar de hIL-17F não apresentava ligação especifica a hIL-17RA, a capacidade desta interacção parecia ser significativamente mais baixa do que a interacção de hlL-17A e hIL-17RA.

Foram efectuados estudos de ligação de saturação para medir a afinidade de hIL-17A e F a hIL-17RC e hIL-17RA. Linhas celulares BHK que exprimem de forma estável hIL-17RA ou hlL-17RC foram incubadas com hIL-17A ou F iodada em condições de saturação de ligação para determinar constantes de afinidade de cada citocina para cada receptor. hIL-17A ligou-se a hlL-17RA e hIL-17RC com afinidades comparáveis (Tabela 1) . Foram utilizadas especificamente, células BHK transfectadas com o receptor indicado para estabelecer valores de Kd para hIL-17A e hIL-17F como descrito na Parte Experimental. Os resultados 14 de Kd apresentados são os valores médios derivados de determinações em triplicado.

Tabela 1

hIL-17A hIL-17F hIL-17RC(xl)1 0,6 nM 1, OnM hIL-17RA 1,9 nM 1,5 DM 1 Representa a variante xl de união da hIL-17RC

Além disso, a capacidade de hIL-17F para hIL-17RC foi muito semelhante à afinidade de hIL-17A para este receptor (ver tabela 1 acima). Contudo consistente com estes resultados obtidos utilizando citocinas biotiniladas, a afinidade de hlL-17F para hIL-17RA foi aproximadamente 1000 vezes mais baixa em relação a outras afinidades medidas (Ic?) . Isto indica que a hIL-17A e F ligam-se a hIL-17RC com afinidades semelhantes, mas as suas afinidades para hIL-17RA diferem dramaticamente. A observação de que hIL-17RC se liga a hIL-17a e F com uma elevada afinidade sugere que as células que expressam hlL-17RC deveriam ser igualmente capazes de responder a hIL-17A e F. Por outro lado, uma vez que hIL-17RA se ligou a hIL-17A com uma elevada afinidade, mas menos 1000 vezes bem do que a hlL-17F se iria ligar, a implicação é que células que expressam hIL-17RA iriam em condições fisiológicas responder menos bem a hIL-17A. Anteriormente mostrou-se que hIL-17RA é expresso de forma ubíqua, mas foi reportado que a sua expressão mais elevada em células hematopoiéticas com expressão mais baixa noutros tecidos. Por isso a expressão de hIL-17RC foi examinada para determinar a extensão da sobreposição nos padrões de expressão. A análise de transferência de Northern mostrou que a hIL-17RC foi expressa em níveis elevados em tecidos glandulares, tais como a glândula adrenal, próstata, 15 fígado, e tiróide sem expressão detectável nos tecidos hematopoiéticos.

Para continuar a investigar a expressão destes receptores em células hematopoiéticas, a ligação de hlL-17A biotinilada e F a células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por análise de multiparâmetros FACS foi também examinada. Os resultados indicaram que a hIL-17A se liga virtualmente a todos os subgrupos PBMC examinados, enquanto que a hIL-17F não apresentou ligação detectável com qualquer uma destas populações. Este facto é consistente com a capacidade da hlL-17RA de se ligar a hIL-17A com uma afinidade elevada, mas não com hIL-17F, e com a para detectar ARNm de hIL-17RC em PBMC. Colectivamente estes dados indicam que a IL-17RC é preferencialmente expressa em tecidos não hematopoiéticos, enquanto que a IL-17RA é preferencialmente expressa em células hematopoiéticas. A elevada afinidade de ligação de hIL-17A e F a células hIL-17RC transfectadas sugere que uma terapêutica eficaz possa ser uma forma solúvel de hIL-17RC. Uma tal molécula seria um antagonista eficaz destas duas citocinas. Para testar isto directamente, foi produzida uma forma solúvel de hIL-17RC como uma proteína de fusão Fc e testada, quanto à sua capacidade de inibir a ligação de hIL-17A e F. Estes efeitos foram então comparados com os resultados obtidos utilizando uma forma solúvel de hIL-17RA. Concentrações crescentes de hIL17RC-Ig ou hIL-17RA-Ig foram incluídas em reacções de ligação e análise FACS foi utilizada para avaliar os efeitos de receptores solúveis na ligação de citocinas biotiniladas a células BHK transfectadas de forma estável. A hIL-17RC solúvel inibiu a ligação de hIL-17A e F numa extensão semelhante, enquanto que a proteína de fusão Fc de um outro membro da família IL-17R, hIL-17RD, não possuía nenhum efeito. Por outro lado, a hlL-17RA solúvel bloqueou eficazmente a ligação de hIL-17A, mas 16 não possuía essencialmente nenhum efeito na ligação de hlL-17F. Resultados semelhantes foram obtidos examinando a ligação de hIL-17A a células hematopoiéticas. Esta ligação foi eficazmente bloqueada utilizando hlL-17RA-lg e hlL-17RC-Ig, mas não quando se utilizou hIL-17RD-Ig. Estes dados são consistentes com os resultados obtidos a partir de medidas de afinidade e indicam que os receptores solúveis se comportam da mesma maneira que as suas formas ancoradas nas membranas.

Como uma avaliação adicional da capacidade da hIL-17RC-Ig humana de se ligar a hIL-17A e F, a afinidade do receptor solúvel para estas citocinas foi avaliada utilizando análise Biacore. 0 hIL-17RC solúvel ligou-se a hIL-17A e F com elevada afinidade (Tabela 2), fornecendo suporte adicional à ideia de utilizar este reagente como antagonista para os efeitos de hIL-17A e F in vivo. Especificamente, os receptores solúveis foram capturados em chips e foram efectuadas experiências de ligação como descrito abaixo: ND= sem ligação detectável.

Tabela 2

hIL-17RC-Ig Ka (dentro-velocidade) Ka (fora-velocidade) KD mIL17A ND mIL17F ND hILl7A 1, 05E+06 1,24E+06 4,90E-04 4,38E-04 0,469nM 0,352nM hIL17F 9,91E+05 1,11E+06 4,31E-04 3,84E-04 0,435nM 0,436nM mL-17RA-Ig Ka (dentro-velocidade) Ka (fora-velocidade) KD mIL17A 9,78E+05 1,12E+06 6,79E-05 7,99E-05 0,069nM 0,072nM mILl7F ND 0 número de variantes de união nos humanos é muito maior e por isso efectuámos as nossas experiências iniciais em apenas um subconjunto destas moléculas. Aquelas escolhidas para esta análise também diferiam na sua inclusão ou exclusão 17 do exão 7, mas ao contrário do ratinho, todas as variantes de união incorporavam todo o exão 8. 0 aceitador de união críptico encontrado no meio da sequência do exão 8 do ratinho não se encontra presente no exão 8 humano. Contudo, as outras variantes de união testadas incluíam ou excluíam hIL-17RC no exão 12. Estas variantes foram designadas como hIL-17RCxl (idênticas na composição do exão em relação ao ratinho xl acima), hIL-17RCx4 (idêntica na composição do exão em relação ao ratinho x4 acima), hIL-17RCx2, e hIL-17RCx7. Novamente estas variantes de união foram expressas de forma transiente em células 293F e foram testadas, quanto à sua capacidade de se ligarem a ratinhos biotinilados e a IL-17A e F humanas e os resultados são sumarizados na Tabela 3.

Tabela 3

Exões Ligação de Citocinas Variante 7 8 12 hlL- 17A hlL- 17F mlL- 17A mlL- 17F Humano IL- 17RCx4 + + + + + — + IL- 17RCxl — + + + + — — IL- 17RCx2 — + — — — IL- 17RCx7 + + — — — — — -1-1-1-1-1-1-1-1--- 1-Designa exões completamente incluídos no transcrito. (+) indicam uma ligação das citocinas detectável e significativa determinada por um aumento significativo na fluorescência por FACS. (-) indica nenhuma alteração significativa na fluorescência.

Consistente com as experiências apresentadas anteriormente, hIL-17RCxl ligou-se a hIL-17A e F, mas não se ligou com as citocinas do ratinho. A hIL-17RCx4 também se ligou a ambas as citocinas humanas e como as suas correspondentes do ratinho ligou-se a MIL-17F, mas não a MIL- 18 17Α, hIL-17RCx2 e 7x não se ligaram a qualquer uma das quatro citocinas testadas, apesar de serem claramente expressas à superfície das células transfectadas, uma vez que um antisoro policlonal contra hIL-17RC corou as células CD8+ (dados não apresentados). Estes resultados de ligação foram reproduzidos fielmente em células BHK transfectadas de forma estável. Colectivamente estes dados suportam as conclusões no que diz respeito a porções essenciais da proteína IL-17RC necessária para a ligação às citocinas humanas.

Numerosas publicações implicaram IL-17A e, numa menor extensão IL-17F como contribuindo para a progressão da doença e severidade na artrite induzida pelo colagénio de ratinho (CIA) e artrite reumatóide humana. Foi examinada a expressão de MIL-17A e F nas articulações ou nos nódulos linfáticos de drenagem dos ratinhos (DLN) que tinham sido imunizados com colagénio para induzir CIA. A análise por PCR de tempo real demonstrou que ambas as citocinas foram reguladas para cima em ambos os tecidos em ratinhos doentes em relação a controlos não imunizados, indicando claramente que a expressão correlacionava-se com a doença. Para além disso, a expressão relativa de MIL-17RA e MIL-17RC foi também examinada nos mesmos tecidos. Contudo, neste caso, não houve uma correlação reprodutível da expressão de cada receptor com a doença. Além disso, o que era óbvio era a discrepância em expressão comparada com DLN em tecido não hematopoiético (pata traseira). Consistente com os resultados anteriores e olhando para a expressão dos receptores humanos, constatou-se que MIL-17RA possuía uma expressão mais elevada em tecido hematopoiético, e mIL-17RC e a MIL-17RC possuía uma expressão mais elevada em tecido não hematopoiético. Estes dados sugerem que a expressão de MIL-17A e MIL-17F correlaciona-se com a doença, que ambos os receptores necessários encontram-se presentes em tecido doente e normal, e sugere que a 19 neutralização destas citocinas pode ser uma terapia eficaz para evitar a progressão da doença.

Neste contexto, verificou-se que o receptor cognato para IL-17A e F era IL-17RC. Em particular, o hlL-17RC liga-se ao hIL-17A e F com afinidades semelhantes. Uma vez que estes dois membros da família IL-17 partilham 55% de identidade de sequência não é por isso surpreendente que partilhem receptores. Contudo, a hIL-17RA liga-se a hIL-17A com uma elevada afinidade, mas liga-se a hIL-17F com uma afinidade que é praticamente 1000 vezes mais baixa, sugerindo que sob condições fisiológicas, hIL-ITRA não se iria ligar a hIL-17F. A implicação é que células que expressam hIL-17RC deveriam responder a hIL-17A e F, enquanto que células que expressam apenas hIL-17RA vão apenas responder a IL-17A. Esta diferença possui o potencial de influenciar como estas citocinas afectam diferentes tecidos. Através da análise da expressão foi verificado que apesar de IL-17RA ser expresso de forma ubíqua possui uma maior expressão em células hematopoiéticas, em que a IL-17RC tende a ser expressa em tecidos não hematopoiéticos sem expressão em células hematopoiéticas. De forma consistente, todos os subconjuntos das células mononucleares do sangue periférico ligam-se a hIL-17A, mas não se ligam a hlL-17F. Além disso, isto sugere que os tecidos não hematopoiéticos deveriam responder a IL-17A e F, enquanto que as células hematopoiéticas deveriam apenas responder a IL-17A.

Este exame da ligação das citocinas às diferentes variantes de IL-17RC revelou duas porções do receptor que são essenciais para a ligação a citocinas, e existem diferenças subtis nas características de ligação do ratinho e das citocinas humanas. Além disso, estas características são consistentes para as citocinas independentemente das espécies de receptores examinados. Como é verificado a partir dos dados apresentados na Tabela 3, o exão 12 e todos os exões 8 são 20 necessários para a hIL-17A e F se ligarem ao IL-17RC, uma vez que estas citocinas apenas se ligam às variantes humanas xl e às variantes x4 humanas. Cada um destes isomorfos inclui todo o exão 8 e exão 12, apesar de diferirem em relação ao facto do exão 7 estar incluído, ou não. Isto implica que o exão 7 é dispensável para a ligação às citocinas humanas. A importância de gerar um antagonista para as funções de IL-17A e IL-17F parece clara a partir da informação disponível que apresenta uma forte correlação entre a expressão de IL-17A e F e a progressão de várias doenças autoimunitárias e inflamatórias. Estas duas citocinas induzem outras citocinas inflamatórias e quimocinas, assim como metaloproteases de matriz, que contribuem para a destruição do colagénio e do osso na artrite auto-imunitária. Este reagente deveria servir como um agente terapêutico eficaz para a artrite reumatóide e para outras doenças inflamatórias em que hL-17A e F desempenham um papel.

Assim, formas solúveis de IL-17RC humana foram desenvolvidas para servirem como antagonistas para IL-17A e IL-17F.

Do ponto de vista terapêutico estes polipéptidos IL-17RC solúveis eram eficazes. Contudo, devido a numerosos factores, IL-17RC solúvel não é facilmente secretado a partir dos numerosos e variados sistemas de produção disponíveis no estado da técnica. Nem é secretado nas quantidades adequadas necessárias para fabricação. Assim existe a necessidade no estado da técnica de desenvolver antagonistas para IL-17A e IL-17F que podem ser expressos e secretados em quantidades em que se pode fazer o aumento de escala para fabrico.

Neste contexto, a presente invenção responde à necessidade de disponibilizar antagonistas de IL-17A e IL-17F que podem ser expressos e secretados. Especificamente, a presente invenção encontra-se baseada no desenvolvimento e 21 descoberta de um polipéptido solúvel isolado compreendendo os exões 8-16 de IL-17RC (resíduos de aminoácidos 193-447 da SEQ ID N° 2) e exões 1-6 de IL-17RA, em que o dito polipéptido solúvel se liga especificamente a IL-17A e IL-17F.

Assim, antagonistas da actividade IL-17F e IL-17a, tal como o receptor IL-17RC/IL-17RA da presente invenção são úteis no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias, particularmente como antagonistas de IL-17F e IL-17A isoladamente, ou conjuntamente no tratamento de doenças que envolvem estas moléculas. Além disso os antagonistas da actividade de IL-17A e IL-17F são úteis no tratamento terapêutico de outras doenças inflamatórias para por exemplo se ligarem, bloquearem, inibirem, reduzirem, antagonizarem ou neutralizarem IL-75F e IL-17a (individualmente, ou conjuntamente) no tratamento da psoríase, da dermatite de contacto, IBD, IBS, colite, artrite, artrite reumatóide, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), doença inflamatória dos intestinos, tal como colite ulcerativa e doença de Crohn, esclerose múltipla, rejeição alográfica de órgãos e rejeição de transplantes do rim, pulmão, coração, etc.

Subunidades de receptores de citocinas são caracterizadas por uma estrutura de multidomínios compreendendo um domínio de ligação de ligandos e um domínio efector que se encontra envolvido tipicamente na transdução de sinal. Receptores multiméricos de citocinas incluem monómeros, homodímeros (por ex., receptor PDGF isoformas αα e ββ, receptor de eritropoietina, MPL [receptor de trombopoietina], e receptor GCSF) , heterodímeros cujas subunidades possuem cada uma ligação de ligandos e domínios efectores (por ex. receptor PDGF isoforma αβ), e multímeros que possuem subunidades componentes de diferentes funções (por ex., IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, e receptores GM-CSF). Algumas subunidades de 22 receptores são comuns a uma pluralidade de receptores. Por exemplo, a subunidade ALC2B, que não pode ligar-se por si só a ligandos, mas inclui um dominio de transdução de sinal intracelular é um componente de IL-3 e de receptores GM-CSF. Muitos receptores de citocinas podem ser colocados numa de quatro familias relacionadas com base nas suas estruturas e funções. Receptores hematopoiéticos de Classe I, por exemplo, são caracterizados pela presença de um dominio contendo resíduos de cisteína conservados e o motivo WSXWS. Encontram-se presentes em determinados receptores hematopoiéticos domínios adicionais, incluindo domínios da proteína cinase; domínios do tipo III de fibronectina; e domínios de imunoglobulina que são caracterizados por laços de ligações dissulfídicas. A estrutura dos receptores das citocinas foi revista por Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991 e Cosman, Cytokine 5:95-106, 1993. Geralmente considera-se que sob uma pressão selectiva para os organismos adquirirem novas funções biológicas, surgiram novos membros da família de receptores da duplicação de genes de receptores existentes conduzindo à existência de famílias multi-génicas. Os membros da família contêm assim vestígios do gene ancestral, e estes traços característicos pode ser explorado no isolamento e identificação de membros adicionais da família.

Neste contexto, a presente invenção é dirigida para um polipéptido solúvel isolado compreendendo os exões 8-16 de IL-17RC (resíduos de aminoácidos 193-447 da SEQ ID N°:2) e os exões 1-6 de IL-17RA em que o dito polipéptido solúvel se liga a IL-17A e IL-17F. O receptor IL-17RC possui um grande número de variantes de união baseados na inclusão ou exclusão de exões específicos. Como descrito abaixo, alguns destes exões são necessários para a ligação de ligandos (IL-17A e/ou IL-17F). 23 A presente invenção encontra-se baseada em parte da descoberta da semelhança estrutural ("domínios") entre IL-17RC e ouros membros da família de IL-17, tais como IL-17RA (SEQ ID N°:21). Especificamente foram identificados três domínios: 1) Domínio 1 (SEQ ID N°s 159 e 160) compreende os exões 8-10 de IL-17RC. Isto corresponde aos resíduos de aminoácidos IL-17RCxl 193-276 da (SEQ ID N° 2) e os resíduos de aminoácidos IL-17RCx4' 208-291 da (SEQ ID N°: 166). 2) Domínio 2 (SEQ ID N°s 161 e 162) compreende os exões 11-13 de IL-17RC. Isto corresponde aos resíduos de aminoácidos IL-17RCxl 277-370 da (SEQ ID N° 2) e os resíduos de aminoácidos IL-17RCx4' 292-385 da (SEQ ID N°: 166). 3) Domínio 3 (SEQ ID N°s 163 e 164) compreende os exões 14-16 de IL-17RC. Isto corresponde aos resíduos de aminoácidos IL-17RCxl 371-447 da (SEQ ID N° 2) e os resíduos de aminoácidos IL-17RCx4' 386-462 da (SEQ ID N°: 166). A presente invenção também disponibiliza o polipéptido solúvel da presente invenção para utilização em doenças inflamatórias humanas e autoimunitárias. O polipéptido solúvel da presente invenção pode ser utilizado para bloquear, inibir, reduzir antagonizar, ou neutralizar a actividade de IL-17A e IL-17F no tratamento da inflamação e das doenças inflamatórias, tais como da psoríase, artrite reumatóide, IBD, IBS, colite, asma, rejeição alográfica, esclerose múltipla e outras condições inflamatórias aqui reveladas.

Uma sequência nucleótidica ilustrativa que codifica para a IL-17RC humana ("IL-17RCxl") é disponibilizada pela SEQ ID N°:l; o polipéptido codificado é apresentado na SEQ ID N° 2. IL-17RC funciona como receptor tanto para a IL-17A (SEQ ID N°: 13 e 14) e IL-17F (SEQ ID N° 15 e 16). A IL-17RC pode actuar como um monómero, como um homodímero, ou um 24 heterodímero. Como descrito no presente documento, o polipéptido solúvel da presente invenção compreende IL-17RC e porções de IL-17RA ("IL-17RC/IL-17RA"). Como tal a presente invenção abrange receptores solúveis que compreendem porções de IL-17RC em combinação com IL-17RA, IL-17RC é revelada no pedido de patente de invenção US N° 10/458,647, e publicação WIPO do mesmo requerente WO 01/04304. A análise de um clone de ADNc humano que codifica para IL-17RC (SEQ ID N° 1) revelou uma grelha de leitura aberta que codifica para 692 aminoácidos (SEQ ID N° 2) compreendendo uma sequência de sinal putativa de aproximadamente 20 resíduos de aminoácidos (resíduos de aminoácidos 1 a 20 da SEQ ID N° 2) um domínio extracelular de ligação de ligandos de aproximadamente 431 resíduos de aminoácidos (resíduos de aminoácidos 21-452 da SEQ ID N° 2; SEQ ID N° 3) , um domínio transmembranar de aproximadamente 0 resíduos de aminoácidos (resíduos de aminoácidos 453-473 da SEQ ID N° 2), e um domínio intracelular de aproximadamente 203 resíduos de aminoácidos (resíduos de aminoácidos 474 a 677 da SEQ ID N° 2).

Além disso, um domínio de ligação dos ligandos é representado pela SEQ ID N° 22.

No entanto, uma outra sequência nucleótidica ilustrativa que codifica para a variante humana IL-17RC, designada como "IL-17RCx4" é disponibilizada pela SEQ ID N° 165, o polipéptido codificado é apresentado na SEQ ID N° 166. Os péptidos de sinalização previstos são dos resíduos 1-60 da SEQ ID N°:165 e 1-20 da SEQ ID N°: 166; o domínio extracelular dos resíduos 61-1401 da SEQ ID N°:165 e 21-467 da SEQ ID N°:166; o domínio transmembranar vai dos resíduos 1402-1464 da SEQ ID N° 165 e 468-488 da SEQ ID N° 166; e o resíduo intracelular é dos resíduos 1465-21-21 da SEQ ID N° 165 e 489-707 da SEQ ID N° : 166. 25

Ainda uma outra sequência nucleótidica ilustrativa que codifica para uma variante humana de IL-17RC, designada como "IL-17RC-1" é disponibilizada pela SEQ ID N° 4, o polipéptido codificado é apresentado na SEQ ID N° 5. IL-17RC-1 é revelada no pedido de patente de invenção da mesma requerente N° 10/458,647, e a publicação WIPO da mesma requerente WO 01/04304 . A análise da sequência revelou que a IL-17RC-1 é uma forma truncada de um polipéptido receptor. Isto é, à IL-17RC-1 faltam resíduos de aminoácidos 1-113 da SEQ ID N° 2. A SEQ ID N° 10 apresenta uma sequência de aminoácidos de um polipéptido IL-17RC-1 que inclui a porção N-terminal de IL-17RC.

Uma comparação das sequências de aminoácidos da IL-17RC e IL-17RC-1 também indicou que os dois polipéptidos representam alternativamente variantes de união. A sequência de aminoácidos da IL-17RC inclui um segmento de 17 aminoácidos (resíduos de aminoácidos 339 a 355 da SEQ ID N° 2) que falta a IL-17RC, enquanto que a IL-17RC falta os aminoácidos seguintes 479, um segmento de aminoácidos 13 encontrado em IL-17RC-1 (resíduos de aminoácidos 350 a 362 a SEQ ID N° 5). Um polipéptido que contém ambos os segmentos de aminoácidos é disponibilizado pela SEQ ID N° 11, em que a SEQ ID N° 12 apresenta a sequência de aminoácidos de um polipéptido a que falta os segmentos de aminoácidos 13 e 17.

No entanto, uma outra sequência nucleótidica ilustrativa que codifica para uma variante humana de IL-17RC, designada como "IL-17RC-6" não contém os resíduos de aminoácidos desde o resíduo 94 ao resíduo do aminoácido 118 da SEQ ID N° 2. A análise de um clone de ADNc humano que codifica para IL-17RC-6 (SEQ ID N°:23) revelou um domínio extracelular de ligação aos ligando de aproximadamente 427 resíduos de aminoácidos (resíduos de aminoácidos 1-427 da SEQ ID N°:24), um domínio transmembranar de aproximadamente 20 resíduos de aminoácidos 26 (resíduos de aminoácidos 428-448 da SEQ ID N° 24), e um domínio intracelular de aproximadamente 218 resíduos de aminoácidos (resíduos de aminoácidos 449 a 667 da SEQ Na 24).

Uma sequência nucleótidica ilustrativa que codifica para uma variante IL-17RC de murino é disponibilizada pela SEQ ID N°:25; o polipéptido codificado é apresentado na SEQ ID N°:26. IL-17RC de murino funciona como um receptor para IL-17A de murino (SEQ ID Nos: 17 & 18) e murino IL-17F (SEQ ID N°s 19 & 20). A análise de um clone de ADNc de murino que codifica para IL-17RC (SEQ ID N°25) revelou um domínio de ligação extracelular do ligando de aproximadamente 449 resíduos de aminoácidos SEQ ID N°:27).

Além disso um domínio de ligação de ligandos é apresentado pela SEQ ID N° 29; o polipéptido codificado é apresentado na SEQ ID N° 30. O gene de IL-17RC reside no cromossoma 3p25-3p24. Como discutido abaixo, esta região encontra-se associada com várias desordens e doenças. A análise de Northern indicou que existe uma forte expressão do gene IL-17RC na tiróide, glândula adrenal, próstata, e tecidos do fígado, e menor expressão no coração, intestino delgado, estômago e tecidos da traqueia. Em contraste a expressão é reduzida, ou não existe expressão no cérebro, placenta, pulmão, músculo-esquelético, rim pâncreas, baço, timo, testículos, ovários cólon, leucócitos do sangue periférico, medula espinal, nódulo linfático, e medula óssea. Estas observações mostram que as sequências de IL-17RC podem ser utilizadas para diferenciar diferentes tecidos. A presente invenção ainda inclui moléculas de ácidos nucleicos isolados que codificam para o polipéptido isolado da presente invenção. 27

Estes e outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes por referência à seguinte descrição detalhada. Além disso várias referências são identificadas abaixo. B) Definições

Na descrição que se segue vários termos são utilizados intensivamente. As definições seguintes são disponibilizadas para facilitar a compreensão da invenção. Quando aqui utilizado, "ácido nucleico", ou "molécula de ácido nucleico" diz respeito a polinucleótidos, tais como o ácido desóxiribonucleico (ADN), ou ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos gerados pela reacção em cadeia da polimerase (PCR), e fragmentos gerados por qualquer acção de ligação, cisão, ou da endonuclease, e acção da exonuclease. As moléculas de ácido nucleico podem ser compostas por monómeros que são nucleótidos de ocorrência natural (tais como ADN e ARN) , ou análogos de nucleótidos de ocorrência natural, ou uma combinação de ambos. Nucleótidos modificados podem possuir alterações em residuos de açúcar e/ou resíduos das bases de purina, ou pirimidina. Modificações de açúcar incluem, por exemplo substituição de um ou vários grupos hidroxilo com halogéneos, grupos alquilo, aminas e grupos azido, ou açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, o resíduo completo de açúcar pode ser substituído com estruturas estéricas e electronicamente semelhantes, tais como açúcares azo e análogos carbocíclicos de açúcares. Exemplos de modificações num resíduo de base incluem purinas alquiladas e pirimidinas, purinas aciladas, ou pirimidinas, ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Os monómeros de ácidos nucleicos podem ser ligados por ligações fosfodiésteres, ou análogos de tais ligações. Análogos de ligações fosfodiésteres incluem fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, 28 fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforoamidato, e análogos. 0 termo " molécula de ácido nucleico" também inclui os chamados "ácidos nucleicos peptidicos", que compreendem bases de ocorrência natural ou modificadas de ácido nucleico ligados a um esqueleto de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples, ou dupla. 0 termo "complemento de uma molécula de ácido nucleico" diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que possui uma sequência nucleótidica complementar e uma orientação inversa, quando comparada com uma sequência nucleótidica de referência. Por exemplo a sequência 5' ATGCACGGG 3' é complementar a 5' CCCGTGCAT 3'. 0 termo "sequência nucleótidica degenerada" designa uma sequência de nucleótidos que inclui um ou vários codões degenerados, quando comparada com uma molécula de ácido nucleico de referência que codifica para um polipéptido. Codões degenerados contêm tripletos diferentes de nucleótidos, mas codificam para o mesmo resíduo d aminoácidos (i.e, tripletos GAU e GAC cada um codificam para Asp. 0 termo "gene estrutural" diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que é transcrita para um mensageiro ARN (ARNm), que é então traduzido para uma sequência de aminoácidos caracteristica de um polipéptido específico.

Uma "molécula de ácido nucleico isolado" é uma molécula de ácido nucleico que não se encontra integrada no ADN genómico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de ADN que codifica para um factor de crescimento que foi separado do ADN genómico de uma célula é uma molécula de ADN isolada. Um outro exemplo de uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico que não se encontra integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucleico que foi isolada a partir de uma determinada espécie é mais pequena do 29 que a molécula de ADN completa de um cromossoma daquela espécie.

Uma "construção de ácido nucleico" é uma molécula de ácido nucleico de cadeia simples ou de cadeia dupla que foi modificada, através de intervenção humana para conter segmentos de ácido nucleico combinados e justapostos numa disposição que não existe na natureza. "ADN linear" designa moléculas de ADN não circulares que possuem terminais livres 5' e 3' . 0 ADN linear pode ser preparado a partir de moléculas de ADN fechadas, tais como plasmideos, através de digestão enzimática ou quebra física. 0 "ADN complementar (ADNc)" é uma molécula de ADN de cadeia simples que é formada a partir de um molde de ARNm pela enzima da transcriptase reversa. Tipicamente, um iniciador complementar a porções de ARNm é utilizado para a iniciação da transcrição reversa. Os peritos no estado da técnica também utilizam o termo "ADNc" para se referirem a uma molécula de ADN de cadeia dupla constituída por uma tal molécula de ADN de cadeia simples e a sua cadeia de ADN complementar. O termo "ADNc" também diz respeito a um clone de uma molécula de ADNc sintetizada a partir de um molde de ARN.

Um "promotor" é uma sequência nucleótidica que dirige a transcrição de um gene estrutural. Tipicamente um promotor encontra-se localizado na região não codificante 5', proximal do local de iniciação de transcrição de um gene estrutural.

Elementos de sequências nos promotores que funcionam na iniciação da transcrição são muitas vezes caracterizados por sequência nucleótidicas consensus. Estes elementos promotores incluem locais de ligação da polimerase a ARN, sequências TATA, sequências CAAT, elementos de diferenciação específicos (DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de resposta cíclicos AMP (CREs), elementos de resposta do soro (SREs; Treisman, Seminars in Câncer Biol. 30 1:47 (1990)), elementos de resposta glucocorticoide (GREs) e locais de ligação para outros factores de transcrição, tal como CRE/ATF (O' Reilly et al., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, elemento de resposta AMPc da proteína de ligação (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) e factores octameros (ver, em geral, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4a ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), e Lemaigre e Rousseau, Biochem. J. 30:1 (1994)). Se o promotor for um promotor indutível, então a velocidade de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste a velocidade de transcrição não é regulada por um agente indutor, se o promotor for um promotor constitutivo. São também conhecidos promotores repressivos.

Um "promotor nuclear" contém sequências nucleótidicas essenciais para a função promotora, incluindo a caixa TATA e a iniciação da transcrição. Através desta definição, um promotor nuclear pode ou não possuir uma actividade detectável na ausência de sequências específicas que podem aumentar a actividade ou conferir uma actividade específica do tecido.

Um "elemento regulador" é uma sequência nucleótidica que modula a actividade do promotor nuclear. Por exemplo, um elemento regulador contém uma sequência nucleótidica que se liga a factores celulares permitindo exclusivamente a transcrição, ou preferencialmente em células particulares, tecidos, ou organelos. Estes tipos de elementos reguladores encontram-se normalmente associados a genes que são expressos de uma forma "específica da célula", "específica do tecido", ou "específica do organelo".

Um "amplificador" é um tipo de elemento regulador que pode aumentar a eficiência da transcrição, independentemente da distância ou orientação do amplificador em relação ao local de iniciação da transcrição. 31 "ADN heterólogos" diz respeito a uma molécula de ARN, ou a uma população de moléculas de ADN, que não existe naturalmente numa determinada célula hospedeira. Moléculas de ADN heterólogas em relação a uma célula hospedeira particular pode conter ADN derivado de espécies de células hospedeiras (i.e ADN endógeno) desde que o ADN hospedeiro seja combinado com ADN não hospedeiro (i.e ADN exógeno).

Por exemplo, uma molécula de ADN contendo um segmento de ADN não hospedeiro que codifica para um polipéptido operacionalmente ligado a um segmento de ADN hospedeiro compreendendo um promotor de transcrição é considerado ser uma molécula de ADN heteróloga. Por sua vez, uma molécula de ADN heteróloga pode compreender um gene endógeno ligado operacionalmente a um promotor exógeno. Como outra ilustração, uma molécula de ADN compreendendo um gene derivado de uma célula do tipo selvagem é considerada ser um ADN heterólogo se aquela molécula de ADN for introduzida numa célula mutante a que lhe falta o gene de tipo selvagem.

Um "polipéptido" é um polímero de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas, quer sejam produzidas naturalmente, ou sinteticamente. Polipéptidos com menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácidos são referidos habitualmente como "péptidos".

Uma "proteína" é uma macromolécula compreendendo uma ou várias cadeias polipéptidicas. Uma proteína pode também compreender componentes peptídicos, tais como grupos de hidratos de carbono. Hidratos de carbono e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula em que a proteína é produzida e vai variar com o tipo de células. As proteínas são aqui definidas em termos das suas estruturas do esqueleto de aminoácidos; os substituintes, tais como grupos de hidratos de carbono não são 32 geralmente especificados, as podem no entanto encontrar-se presente.

Um péptido ou polipéptido codificado por uma molécula de ADN não hospedeira é um péptido ou polipéptido "heterólogo".

Um "vector de clonagem" é uma molécula de ácido nucleico, tal como um plasmideo, cosmideo, ou bacteriófago que possui a capacidade de se replicar de forma autónoma numa célula hospedeira. Vectores de clonagem contêm tipicamente um, ou um pequeno número de locais de reconhecimento pela endonuclease de restrição que permite a inserção de uma molécula de ácido nucleico de uma forma determinada sem a perda e uma função biológica essencial do vector, assim como sequências nucleótidicas que codificam para um gene marcador que é adequado para utilização na identificação e selecção de células transformadas com o vector de clonagem. Muitos marcadores incluem tipicamente genes que disponibilizam resistência à tertraciclina ou à ampicilina.

Um "vector de expressão" é uma molécula de ácido nucleico que codifica para um gene que é expresso numa célula hospedeira. Tipicamente, um vector de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene, e um terminador de transcrição. A expressão genica é colocada geralmente sob o controlo de um promotor, e um tal gene diz-se encontrar " ligado de forma funcional" ao promotor. De forma semelhante, um elemento regulador e um promotor nuclear encontram-se operacionalmente ligados se o elemento regulador modula a actividade do promotor nuclear.

Um "hospedeiro recombinante" é uma célula que contém uma molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como um vector de clonagem, ou um vector de expressão. No presente contexto, um exemplo de um hospedeiro recombinante é uma célula que produz IL-17RC a partir de um vector de expressão. Em contraste, IL- 33 17RC pode ser produzido por uma célula que é uma "fonte natural" da IL-17RC, e a que lhe falta um vector de expressão. "Transformantes integrados" são células hospedeiras recombinantes, em que o ADN heterólogo ficou integrado no ADN genómico das células.

Uma "proteína de fusão" é uma proteína híbrida expressa por uma molécula de ácido nucleico compreendendo sequências nucleótidicas de pelo menos dois genes. Por exemplo, uma proteína de fusão pode compreender pelo menos parte de um polipéptido IL-17RC fundido com um polipéptido que se liga a uma matriz de afinidade. Uma tal proteína de fusão fornece meios de isolar grandes quantidades de IL-17RC utilizando cromatografia de afinidade. 0 termo "receptor" designa uma proteína associada a uma célula que se liga a uma molécula bioactiva designada "ligando". Esta interacção medeia o efeito do ligando na célula. Os receptores podem ser ligados à membrana, citosólicos, ou nucleares; monoméricos (por ex. receptor que estimula a hormona da tiróide, receptor beta-adrenérgico) ou multimérico (por ex., receptor PDGF, receptor da hormona de crescimento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor de eritropoietina e receptor IL-6) . Receptores ligados a membrana são caracterizados por uma estrutura de multi-domínio compreendendo um domínio extracelular de ligação de ligandos e um domínio efector intracelular que se encontra tipicamente envolvido na transdução de sinal. Em determinados receptores ligados à membrana, o domínio extracelular de ligação aos ligandos e o domínio efector intracelular encontram-se localizados em polipéptidos separados que compreendem o receptor funcional completo.

Em geral a ligação do ligando ao receptor resulta numa alteração conformacional no receptor que causa uma interacção entre o domínio efector e outra (s) molécula(s) na célula, que 34 por sua vez conduz a uma alteração no metabolismo da célula. Acontecimentos metabólicos que se encontram frequentemente ligados a interacções receptor ligando incluem transcrição genica, fosforilação, desfosforilação, aumentos na produção de AMP cíclico, mobilização do cálcio celular, mobilização de líquidos de membrana, adesão celular, hidrólise de lípidos do inositol e hidrólise de fosfolípidos.

Um "receptor solúvel" é um polipéptido receptor que não se encontra ligado a uma membrana celular. Receptores solúveis são habitualmente polipéptidos receptores de ligação de ligandos a que lhes falta domínios transmembranares e citoplasmáticos e outras ligações à membrana celular, tal como através de glicofosfoinisitol (gpi). Receptores solúveis podem compreender resíduos de aminoácidos adicionais, tais como tags de afinidade que servem para purificar o polipéptido ou fornecem locais de ligação do polipéptido a um substrato, ou sequências de regiões constantes da imunoglobulina. Muitos receptores da superfície celular possuem correspondentes solúveis de ocorrência natural que são produzidos por proteólise, ou traduzidas a partir de ARNms de união alternativos. Receptores solúveis podem ser monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos, ou multiméricos, com receptores multiméricos não compreendendo em geral mais do que 9 subunidades, preferencialmente não compreendendo mais do que 6 subunidades, e mais preferencialmente não compreendendo mais do que 3 subunidades. Diz-se que polipéptidos receptores se encontram substancialmente livres de segmentos transmembranares e intracelulares, quando lhes falta porções suficientes destes segmentos para disponibilizar ancoragem à membrana ou tradução de sinal, respectivamente. Receptores solúveis de receptores de citocinas compreendem geralmente o domínio de ligação extracelular das citocinas de um domínio transmembranar e intracelular. Por exemplo, receptores 35 solúveis representativos incluem receptores solúveis para IL-17RA como indicado nas SEQ ID N°s:167 (polinucleótido) e 21 (polipéptido). Encontra-se bem ao nivel de um perito no estado da técnica delinear, quais as sequências de uma sequência receptora de uma citocina conhecida compreende o domínio extracelular de ligação das citocinas livre de um domínio transmembranar e intracelular. Além disso, um perito no estado da técnica utilizando o código genético pode determinar facilmente polinucleótidos que codificam para tais polipéptidos receptores solúveis. 0 termo "sequência de sinalização secretora" designa uma sequência de ADN que codifica para um péptido (um "péptido secretor"), que como componente de um polipéptido maior, dirige o polipéptido maior através de um metabolismo secretor de uma célula, através do qual é sintetizado. 0 polipéptido maior é habitualmente cindido para remover o péptido secretor durante o trânsito, através do metabolismo secretor.

Um "polipéptido isolado" é um polipéptido que se encontra essencialmente livre de componentes celulares contaminantes, tais como hidratos de carbono, lípidos, ou outras impurezas proteináceas associadas com o polipéptido na natureza. Tipicamente, uma preparação de um polipéptido isolado contém o polipéptido numa forma altamente purificadas, i.e. pelo menos 80% pura, pelo menos 90% pura, pelo menos cerca de 95% pura, mais do que 95% pura, tal como 96%, 97%, ou 98%, ou mais pura, ou superior a 98%. Uma forma de mostrar que uma preparação particular de proteína contém um polipéptido isolado é através da aparência de uma única banda numa electroforese em gel de poliacrilamida -dodecil sulfato de sódio (SDS) de uma preparação de proteína e coloração do gel com azul de Coomassie. Contudo, o termo "isolado" não exclui a presença de algum polipéptido em formas físicas alternativas, tais como 36 dímeros, ou formas glicosiladas alternativamente ou derivatizadas.

Os termos " terminal amino" e "terminal carbóxilo" são utilizados para designar posições nos polipéptidos. Sempre que o contexto o permitir, estes termos são utilizados em referência a uma sequência particular, ou porção de um polipéptido para significar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma determinada sequência posicionada no terminal carbóxilo, em relação a uma sequência de referência num polipéptido encontra-se localizada proximal ao terminal carbóxilo da sequência de referência, mas não necessariamente no terminal carbóxilo do polipéptido completo. 0 termo "expressão" diz respeito à biossintese de um produto génico. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural em ARNm e a tradução do ARNm num ou vários polipéptidos. 0 termo "variante de união" é aqui utilizado para designar formas alternativas de ARN transcrito a partir de um gene. Uma variação de união surge naturalmente, através da utilização de locais alternativos de união (splicing) numa molécula de ARN transcrita, ou menos habitualmente entre moléculas de ADN transcritas separadamente, e pode resultar em vários ARNms transcritos a partir do mesmo gene. Variantes de união podem codificar para polipéptidos que possuem uma sequência de aminoácidos alterada. 0 termo variante de união é também aqui utilizado para designar um polipéptido codificado por uma variante de união de um ARNm transcrito a partir de um gene.

Quando aqui utilizado, o termo "imunomodulador" inclui citocinas, factores de crescimento de células estaminais, linfotoxinas, moléculas co-estimuladoras, factores hematopoiéticos, e semelhantes, e análogos sintéticos destas moléculas. 37 0 termo "par complemento/anti-complemento" designa resíduos não idênticos que formam um par estável não associado covalentemente em condições adequadas. Por exemplo, biotina e avidina (ou estreptamicina) são membros prototípicos de um par complemento/anti-complemento. Outro exemplo de pares complemento/anti-complemento incluem pares receptores/ligando, anticorpo/antigénio (ou hapteno, ou epitopo), pares nucleótidos sentido/anti-sentido, e semelhantes. Quando é desejável a dissociação subsequente do par complemento/anticomplemento, o par complemento/anti-complemento possui preferencialmente uma afinidade de ligação de menos do que 109 M-1.

Um "anticorpo anti-idiotipo" é um anticorpo que se liga a um domínio de uma região variável de uma imunoglobulina. No presente contexto, um anticorpo anti-idiotipo liga-se com a região variável de um anticorpo anti-IL-17RC, e assim, um anticorpo anti-idiotipo mimetiza um epitopo de IL-17RC.

Um "fragmento de anticorpo" é uma porção de um anticorpo, tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, e semelhantes. Independentemente da estrutura um fragmento de anticorpo liga-se com o mesmo antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto. Por exemplo, um fragmento de anti-corpo monoclonal anti-lL-17RC liga-se a um epitopo de IL-17RC. 0 termo "fragmento de anticorpo" também inclui um polipéptido sintético ou submetido a engenharia genética que se liga a um antigénio específico, tais como polipéptidos constituídos pela região variável da cadeia leve, fragmentos "Fv" constituídos pelas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, moléculas polipeptídicas recombinantes de cadeia simples em que as regiões variáveis da cadeia leve e pesada estão ligadas por um agente de ligação peptídico (" proteínas scFV") e unidades de reconhecimento mínimo constituídas pelos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável. 38

Um "anticorpo quimérico" é uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis e regiões determinantes da complementaridade derivadas de um anticorpo de roedor, enquanto que a restante molécula de anticorpo deriva de um anticorpo humano. "Anticorpos humanizados" são proteínas recombinantes em que regiões determinantes da complementaridade de murino de um anticorpo monoclonal foram transferidas de cadeias variáveis pesadas e leves da imunoglobulina de murino num domínio variável humano. Construção de anticorpos humanizados para utilização terapêutica em humanos que são derivados de anticorpos de murino, tais como os que se ligam ou neutralizam uma proteína humana encontra-se no âmbito dos conhecimentos de um perito no estado da técnica.

Quando aqui utilizado, "um agente terapêutico" é uma molécula ou átomo que está conjugada com um resíduo de anticorpo para produzir um conjugado que é útil para terapia. Exemplos de agentes terapêuticos incluem drogas; toxinas, imunomoduladores, quelantes, compostos de boro, agentes fotoactivos ou corantes, e radioisótopos.

Um "marcador detectável" é uma molécula ou átomo que pode ser conjugada com um resíduo de anticorpo para produzir uma molécula útil para diagnóstico. Exemplos de marcadores detectáveis incluem quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iões paramagnéticos, ou outros resíduos de marcadores. 0 termo "etiqueta de afinidade" é aqui utilizado para designar um segmento polipeptídico que pode ser ligado a um segundo polipéptido para efectuar a purificação, ou detecção do segundo polipéptido, ou disponibilizar locais para a ligação do segundo polipéptido a um substrato. Em princípio, qualquer polipéptido ou proteína para o qual um anticorpo ou outro agente específico de ligação está disponível pode ser 39 utilizado como uma etiqueta de afinidade. Etiquetas de afinidade incluem um tracto de poli-histidina, uma proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al.,

Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutationa S transferase (Smith e Johnson, Gene 67: 31 (1988)), Glu-Glu etiqueta de afinidade (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952 (1985)), substância P, péptido FLAG (Hopp et al.,

Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de ligação da estreptavidina, ou outro epitopo antigénico, ou domínio de ligação. Ver em geral, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Moléculas de ADN que codificam para etiquetas de afinidade encontram-se disponíveis em fornecedores comerciais (por ex., Pharmacia Biotech,

Piscataway, NJ).

Um "anticorpo nu" é um anticorpo completo que não se encontra conjugado com um agente terapêutico. Anticorpos nus incluem anticorpos policlonais e monoclonais, assim como determinados anticorpos recombinantes, tais como anticorpos quiméricos e humanizados.

Quando aqui utilizado, o termo "componente de anticorpo" inclui um anticorpo completo e um fragmento de anticorpo.

Um "imunoconjugado" é um conjugado de um componente de anticorpo com um agente terapêutico, ou um marcador detectável.

Quando aqui utilizado, o termo "anti-corpo de proteína de fusão" diz respeito a uma proteína recombinante que compreende um componente de anticorpo e um componente polipéptido IL-17RC. Exemplos de uma proteína de fusão de um anticorpo inclui uma proteína que compreende um domínio extracelular de IL-17RC, e ou um domínio Fc, ou uma região de ligação do antigénio.

Um "polipéptido alvo", ou um "péptido alvo" é uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos um epitopo, 40 e que é expresso numa célula alvo, tal como uma célula tumoral, ou uma célula que transporta um antigénio de um agente infeccioso. Células T reconhecem epitopos peptídicos apresentados por uma molécula complexa de histocompatibilidade principal para um polipéptido alvo, ou para um péptido alvo e que lisam tipicamente a célula alvo ou recrutam outras células imunitárias para o local da célula alvo, matando deste modo a célula alvo.

Um "péptido antigénico" é um péptido que se vai ligar a uma molécula complexa de histocompatibilidade principal para formar um complexo MHC-péptido que é reconhecido por uma célula T induzindo deste modo uma resposta de linfócitos citotóxicos por apresentação à célula T. Assim, péptidos antigénicos são capazes de se ligarem a uma molécula complexa de histocompatibilidade principal e induzir uma resposta de células T citotóxicas; tal como lise celular, ou libertação de citocinas especificas contra a célula alvo que se liga, ou expressa o antigénio: o péptido antigénico pode ser ligado no contexto de uma molécula complexa de histocompatibilidade principal de classe I ou classe II, numa célula que apresenta antigénios, ou numa célula alvo.

Nos eucarióticos, a ARN polimerase II catalisa a transcrição de um gene estrutural para produzir ARNm. Uma molécula de ácido nucleico pode ser desenhada para conter um molde de uma ARN polimerase II em que o transcrito de ARN possui ma sequência que é complementar à especifica de um ARNm. 0 transcrito de ARN é designado de "ARN anti-sentido" e uma molécula de ácido nucleico que codifica para o ARN anti-sentido é designado um "gene anti-sentido". Moléculas de ARN anti-sentido são capazes de se ligarem a moléculas de ARNm, resultando numa inibição da tradução de ARNm.

Um oligonucleótido anti-sentido especifico para IL-17RC", ou um "oligonucleótido anti-sentido" é um nucleótido que 41 possui uma sequência (a) capaz de formar um triplex estável com uma porção do gene IL-17RC, ou (b) capaz de formar um duplex estável com uma porção de um transcrito de ARNm do gene de IL-17RC.

Uma "ribozima" é uma molécula de ácido nucleico que contém um centro catalítico. 0 termo inclui enzimas de ARN, ARNs de auto-união, ARNs de auto-clivagem, e moléculas de ácidos nucleicos que efectuam estas funções catalíticas. Uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma ribozima é designado um "gene ribozima".

Uma "sequência guia externa" é uma molécula de ácido nucleico que dirige a ribozima endógena. RNase P, para uma espécie particular de ARNm intracelular, resultando na cisão do ARNm pela RNase P. Uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma sequência guia externa é designada "um gene de sequência guia externa". 0 termo " gene variante IL-17RC" refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam para um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos que é uma modificação da SEQ ID N° 2. Tais variantes incluem polimorfismos de ocorrência natural de genes IL-17RC, assim como genes sintéticos que contêm substituições de aminoácidos conservadoras da sequência de aminoácidos SEQ ID N° 2. Formas variantes adicionais de genes de IL-17RC são moléculas de ácidos nucleicos que contêm inserções ou supressões das sequências nucleótidicas aqui descritas.

Um gene variante de IL-17RC pode ser identificado, por exemplo, determinando se o gene hibridiza com uma molécula de ácido nucleico que possui a sequência nucleótidica da SEQ ID N°:l ou SEQ ID N° 4, ou o seu complemento sob condições severas.

Alternativamente, genes de variantes de IL-17RC podem ser identificados por comparação de sequências. Duas sequências de 42 aminoácidos possuem "100% de identidade de sequências de aminoácidos" se os residuos de aminoácidos das duas sequências de aminoácidos forem os mesmos, quando alinhados para uma correspondência máxima. De forma semelhante, duas sequências nucleótidicas possuem "100% de identidade de sequência" se os residuos nucleótidicos das duas sequências nucleótidicas são as mesmas, quando alinhadas para a correspondência máxima. Comparações de sequências podem ser efectuadas utilizando programas de software padrão, tais como aqueles incluídos no pacote de cálculo bioinformático LASERGENE produzido pela DNASTAR (Madison, Wisconsin). Outros processos para comparar duas sequências nucleótidicas ou de aminoácidos determinando o alinhamento óptimo são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins" in Methods in Gene Biotechnology, págs 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), e Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2a edição (Academic Press, Inc. 1998)). São descritos abaixo métodos em particular, para determinar a identidade de sequência.

Independentemente do processo em particular para identificar uma variante do gene IL-17RC ou variante do polipéptido IL-17RC, um gene variante ou polipéptido codificado por um gene variante pode ser funcionalmente caracterizado pela capacidade de se ligar a um anticorpo anti-IL-17RC. Uma variante do gene IL-17RC ou variante do polipéptido IL-17RC pode ser funcionalmente caracterizada pela capacidade de se ligar ao seu ligando, por exemplo; IL-17A e/ou IL-17F, utilizando um ensaio biológico, ou bioquímico aqui descrito. O termo "variante alélica" é aqui utilizado para designar, qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossomal. A variação alélica 43 surge naturalmente, através de mutação, e pode resultar em polimorfismo fenótipico nas populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem alteração do polipéptido codificado), ou podem codificar para polipéptidos com uma sequência de aminoácidos alterada. 0 termo variante alélica é também aqui utilizado para designar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. 0 termo "ortólogo" designa um polipéptido, ou proteína obtida a partir de uma espécie que é a parte funcional de um polipéptido ou proteína de uma diferente espécie. Diferenças em sequências entre ortólogos são o resultado de especiação. "Paralogos" são proteínas distintas, mas estruturalmente relacionadas produzidas por um organismo. Pensa-se que os paralogos surjam, através de duplicação genica. Por exemplo, a-globina, β-globina, e mioglobina são paralogos uns dos outros. A presente invenção inclui fragmentos funcionais de genes IL-17RC. No contexto desta invenção, um "fragmento funcional" de um gene de IL-17RC diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma porção de um polipéptido IL-17RC que é um domínio aqui descrito, ou que se liga especificamente com um anticorpo anti-IL-17RC.

Entende-se que devido à imprecisão de métodos analíticos padrão, pesos moleculares e comprimentos de polímeros são valores aproximados. Quando um valor é expresso como cerca de "X" ou "aproximadamente" X, o valor declarado para X deverá ser entendido como possuindo uma precisão de +10%.

C) Produção dos Polinucleótidos ou Genes IL-17RA e IL-17RC

Moléculas de ácidos nucleicos que codificam para um IL-17RA humano ou um gene IL-17RC ou polinucleótidos que 44 codificam para qualquer um dos polipéptidos solúveis da presente invenção pode ser obtido rastreando um ADNc humano ou biblioteca genómica utilizando as sondas polinucleótidicas baseadas na SEQ ID N° 1, SEQ ID N°4. Estas técnicas são técnicas padrão e bem estabelecidas e podem ser realizadas utilizando kits de clonagem disponíveis nos fornecedores comerciais. Ver, por exemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3a Edição, John Wiley & Sons 1995; Wu et al., Methods in Gene Biotecnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv e Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408 (1972); Huynh et al., "Construction and Screening ADNc Libraries in %gtl0 e xgtll, "in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), pág. 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) nas pág. 47-52.

Moléculas de ácidos nucleicos que codificam para um gene humano IL-17RA ou IL-17RC podem também ser obtidos utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores oligonucleótidicos que possuem sequências nucleótidicas que são baseadas em sequências do gene IL-17RA ou IL-17RC ou ADNc. Processos gerais para pesquisar bibliotecas com PCR são disponibilizadas por, por exemplo, Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries, "in Methods in Molecular Biology, vol.15: PCR Products: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993. Além disso, técnicas para utilizar PCR para relacionar genes isolados são descritas por, por exemplo, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family members, in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.) Humana Press, Inc. 1993. Como uma alternativa, um gene IL-17RA ou IL-17RC pode ser obtido sintetizando moléculas de ácido nucleico utilizando oligonucleótidos longos de iniciação mútua e as sequências 45 nucleótidicas aqui descritas (ver, por exemplo, Ausubel (1995)) . Técnicas estabelecidas utilizando a reacção em cadeia da polimerase disponibilizam a capacidade de sintetizar moléculas de ADN pelo menos com duas kilobases de comprimento (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dilon et al., "Use of the Polymerase Chain reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes, " in Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and

Applications, White 8ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), e Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)) . Para revises na síntese de polinucleótidos, ver por exemplo, Glick e Pasternak, Molecular Biotecnology, Principies and Applications of Recombinat DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Ver. Biochem. 53:323 (1984), e Climie et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:633 (1990).

D) Produção de variantes genicas de IL-17RA ou IL-17RC A presente invenção disponibiliza uma variedade de moléculas de ácidos nucleicos, incluindo moléculas de ADN e de ARN que codificam para os polipéptidosIL-17RA ou IL-17RC aqui revelados. Os peritos no estado da técnica vão imediatamente reconhecer que considerando a degenerescência do código genético, uma variação considerável da sequência é possível entre estas moléculas polinucleótidicas. Além disso, a presente invenção também disponibiliza polipéptidos receptores isolados solúveis monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos e multiméricos que compreendem pelo menos uma porção de IL-17RC que é substancialmente homóloga ao polipéptido receptor da SEQ ID N:2. Assim, a presente invenção contempla moléculas de ácidos nucleicos que codificam para os polipéptidos IL-17RA ou IL-17RC compreendendo os nucleótidos 46 degenerados da SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 4 e os seus equivalentes de ARN.

Os peritos no estado da técnica irão imediatamente reconhecer que devido à degenerescência do código genético é possível uma variação considerável nas sequências entre estas moléculas polinucleótidicas. A SEQ ID N° 7 é uma sequência nucleótidica degenerada que compreende todas as moléculas de ácido nucleico que codificam para o polipéptido IL-17RC da SEQ ID N°2. Os peritos no estado da técnica vão reconhecer que a sequência degenerada da SEQ ID N° 7 também disponibiliza todas as sequências de ARN que codificam para a SEQ ID N° 2, substituindo U por T. Assim, a presente invenção contempla moléculas de ácidos nucleicos que codificam para o polipéptido IL-17RC compreendendo desde o nucleótido 154 ao nucleótido 222 9 da SEQ ID N° 1, e os seus equivalentes do ARN. De forma semelhante, a sequência degenerada de IL-17RC-1 da SEQ ID N° 6 também disponibiliza todas as sequências de ARN que codificam para a SEQ ID N° 5, substituindo U por T. A tabela 4 apresenta os códigos de uma letra para designar posições nucleótidicas. "Resoluções" são os nucleótidos designados por uma letra de código. "Complemento" indica o código para os nucleótido(s) complementares. Por exemplo, o código Y designa C ou T, e o seu complemento R designa A ou G, sendo o A complementar a T, e sendo G complementar a C. 47

Tabela 4

Nucleótido Resolução Complemento Resolução A A T T C C G G G G C C T T A A R A/G Y C/T Y C/T R A/G M A/C K G/T K G/T M A/C S C/G S C/G W A/T W A/T H A/C/T D A/G/T B C/G/T V A/C/G V A/C/G B C/G/T D A/G/T H A/C/T N A/C/G/T N A/C/G/T

Os codões degenerados, compreendendo todos os codões possíveis para um determinado aminoácido são apresentados na Tabela 5. 48

Tabela 5

Aminoácido Código de uma letra Codões Codão degenerado Cys c TGC TGT TGY Ser s AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACA ACG ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gin Q CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG Ile I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Vai V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG Ter TAA TAG TGA TRR Asn/Asp B RAY Glu/Gin Z SAR Any X NNN 49

Um perito no estado da técnica vai compreender que é introduzida alguma ambiguidade na determinação de um codão degenerado representativo de todos os codões possíveis que codificam para um aminoácido. Por exemplo, o codão degenerado para a serina (WSN) pode nalgumas circunstâncias codificar para a arginina (ARG), e o codão degenerado para a arginina (MGN) pode nalgumas circunstâncias codificar para a serina (AGY). Existe uma relação semelhante entre os codões que codificam para uma fenilalanina e leucina.

Assim, alguns polinucleótidos abrangidos pela sequência degenerada pode codificar para sequências de aminoácidos variantes, mas um perito no estado da técnica pode facilmente identificar tais sequências variantes com base nas sequências de aminoácidos da SEQ ID N° 6. Sequências variantes podem ser facilmente testadas, quanto à funcionalidade como aqui descrito.

Espécies diferentes podem exibir "utilização preferencial de codões". Ver em geral Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al. Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-

Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean e Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp e Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol 6:494 (1995), e Makrides, Microbio/. Rev. 60:512 (1966). Quando aqui utilizado, o termo "utilização preferencial de codão" ou "codões preferenciais" é um termo do estado da técnica que se refere a codões de tradução de proteínas que são mais frequentemente utilizados em células de uma determinada espécie, favorecendo deste modo um ou alguns representantes dos codões possíveis que codificam para cada aminoácido (ver Tabela 5) . Por exemplo, o aminoácido treonina (Thr) pode ser codificado pela ACA, ACC, ACG, ou ACT, mas em células de mamíferos ACC é o codão mais frequentemente utilizado; noutras 50 espécies, por exemplo, células de insectos, leveduras, vírus ou bactérias, diferentes codões Thr podem ser preferenciais. Codões preferenciais para uma espécie particular podem ser introduzidos nos polinucleótidos da presente invenção, através de vários processos conhecidos no estado da técnica. Introdução de sequências de codão preferenciais em ADN recombinante pode, por exemplo, aumentar a produção da proteína tornando a tradução da proteína mais eficiente num particular tipo de células ou espécies. Por isso, as sequências de codão degeneradas aqui reveladas servem de molde para optimizar a expressão de polinucleótidos em vários tipos de células e espécies habitualmente utilizadas no estado da técnica e aqui reveladas. Sequências contendo codões preferenciais podem ser testadas e optimizadas para a expressão em várias espécies, e testadas, quanto à sua funcionalidade como aqui reveladas.

Um ADNc que codifica para IL-17RA ou IL-17RC pode ser isolado, através de uma variedade de processos, tal como, a utilização de uma sonda de ADNc completo ou parcial ou com um ou vários conjuntos de sondas degeneradas baseadas nas sequências reveladas. Um ADNc pode também ser clonado utilizando a reacção em cadeia da polimerase com iniciadores desenhados a partir de sequências humanas representativas de IL-17RA ou IL-17RC aqui reveladas. Para além disso, uma biblioteca de ADNc pode ser utilizada para transformar ou transfectar as células do hospedeiro, e expressão do ADNc de interesse pode ser detectada com um anticorpo dos polipéptidos IL-17RA ou IL-17RC transfectado.

Os peritos no estado da técnica vão reconhecer que a sequência revelada na SEQ ID N° 1 representa um alelo único de IL-17RC humano, e que se espera que ocorra variação alélica e união alternativa. Variantes alélicas desta sequência podem ser clonadas sondando bibliotecas de ADN ou genómicas de 51 diferentes indivíduos de acordo com os procedimentos padrão. Variantes alélicas das sequência nucleótidicas aqui reveladas, incluindo aquelas que incluem mutações silenciosas e aquelas em que as mutações resultam em alterações nas sequências de aminoácidos encontram-se no âmbito da presente invenção, assim como proteínas que são variantes alélicas das sequências de aminoácidos aqui reveladas. Moléculas de ADNc geradas a partir de ARNms de união alternativas que retêm as propriedades do polipéptido IL-17RC encontram-se no âmbito da presente invenção, assim como os polipéptidos codificados por tais ADNcs e ARNms. Variantes alélicas e variantes de união destas sequências podem ser clonadas sondando bibliotecas de ADN ou genómicas de diferente indivíduos ou tecidos de acordo com procedimentos padrão conhecidos no estado da técnica.

Utilizando os processos discutidos acima, um perito no estado da técnica pode preparar um polipéptido da presente invenção. 0 polipéptido da presente invenção pode ser produzido em células hospedeiras recombinantes seguindo técnicas convencionais. Para expressar um gene IL-17RC/IL-17RA, uma molécula de ácido nucleico que codifica para o polipéptido tem que ser ligada de forma funcional a sequências reguladoras que controlam a expressão transcricional num vector de expressão e depois, introduzidas numa célula hospedeira. Para além de sequências reguladoras transcricionais, tais como promotores e amplificadores, os vectores de expressão podem incluir sequências reguladoras transcricionais e um gene marcador que é adequado para a selecção de células que transportam o vector de expressão.

Os vectores de expressão que são adequados para a produção de uma proteína estranha em células eucarióticas contêm tipicamente (1) elementos de ADN procarióticos que codificam para uma origem de replicação bacteriana e um 52 marcador de resistência a antibióticos para providenciar para o crescimento e selecção do vector de expressão num hospedeiro bacteriano; (2) elementos de ADN eucarióticos que controlam a iniciação da transcrição, tal como um promotor; e (3) elementos de ADN que controlam o processamento de transcritos, tal como a sequência de terminação da transcrição/poliadenilação. Como discutido acima os vectores de expressão podem também incluir sequências nucleótidicas que codificam para uma sequência de secreção que dirige um polipéptido heterólogo no metabolismo secretor de uma célula hospedeira. Por exemplo, um vector de expressão pode compreender um gene de IL-17RC/IL-17RA e uma sequência secretora derivada de qualquer gene secretado. 0 polipéptido da presente invenção pode ser expresso em células de mamíferos. Exemplo de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem células de rim do macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células embriónicas de rim humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), rins de hamster bebé (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de rim de caninos (MDCK; ATCC CCL 34), Células do ovário do hamster chinês (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555.1986)), células da pituitária do rato (GHl; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células do hepatoma do rato (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) células de rim de macaco transformadas SV-40 (COS-1; ATCC CRL 1650) e células embriónicas de murino (NIH-3T3; ATCC CRL 1658) .

Para um mamífero hospedeiro, os sinais reguladores de transcrição e de tradução podem ser derivados de formas virais de mamíferos, por exemplo, adenovírus, vírus do papiloma de bovino, vírus simiano, ou análogos, em que os sinais reguladores estão associados com um gene particular que possui um elevado nível de expressão. Sequências reguladoras de transcrição e de tradução adequadas podem também ser obtidas a 53 partir de genes de mamíferos, por exemplo, actina, colagénio, miosina, e genes da metalotioneína.

Sequências reguladoras de transcrição incluem uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da síntese de ARN. Promotores eucarióticos adequados incluem o promotor do gene metalotioneína I (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), o promotor adicional de SV40 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), o promotor do vírus do sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:6777 (1982)), o promotor do citomegalovírus (Foecking et al., Gene 45:101 (1980)), e o vírus do tumor mamário do ratinho (ver em geral, Etcheverry, Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture, "in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)) .

Alternativamente um promotor procariótico, tal como um promotor bacteriófago T3 ARN da polimerase pode ser utilizado para controlar a expressão genética em células de mamíferos se o promotor procariótico for regulado por um promotor eucariótico (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), e Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).

Em determinadas concretizações, uma sequência de ADN que codifica para o polipéptido receptor solúvel encontra-se ligada de forma funcional com outros elementos genéticos necessários para a sua expressão, incluindo geralmente um promotor de transcrição e um terminador num vector de expressão. O vector vai conter igualmente um ou vários marcadores seleccionados e uma ou várias origens de replicação, apesar de os peritos no estado da técnica reconhecerem que podem ser fornecidos dentro de certos sistemas marcadores seleccionáveis em vectores separados e a replicação do ADN exógeno pode ser disponibilizada por integração no genoma da célula hospedeira. 54 A selecção de promotores, terminadores, marcadores seleccionáveis, vectores e outros elementos é uma questão de concepção de rotina no âmbito das capacidades de um vulgar perito no estado da técnica. Muitos destes elementos são descritos na literatura e encontram-se disponíveis através de fornecedores comerciais. Componentes múltiplos de um complexo de receptor solúvel pode ser co-transfectado em vectores individuais de expressão, ou podem estar contidos num vector de expressão único. Tais técnicas de expressão de componentes múltiplos de complexos de proteínas são bem conhecidos do estado da técnica.

Um vector de expressão pode ser introduzido em células hospedeiras utilizando uma variedade de técnicas padrão incluindo transfecção por fosfato de cálcio, transfecção mediada por lipossoma, administração mediada por micro-projécteis, electroporação, e semelhantes. As células transfectadas podem ser seleccionadas e propagadas para disponibilizar células hospedeiras recombinantes que compreendem o vector de expressão integrado de forma estável no genoma da célula hospedeira. Técnicas para introduzir vectores em células eucarióticas e técnicas para seleccionar estes transformantes estáveis utilizando um marcador seleccionável dominante são descritos, por exemplo, por Ausubel (1995) e por Muray (ed.), Gene Transfer and Expression Potocols (Human Press 1991) .

Por exemplo, um marcador adequado seleccionável é um gene que disponibiliza resistência à neomicina antibiótica. Neste caso a selecção é efectuada na presença de um fármaco do tipo da neomicina, tal como G-48, ou semelhantes. Sistemas de selecção podem também ser utilizados para aumentar o nível de expressão do gene de interesse, um processo referido como "amplificação". A amplificação é efectuada, através da cultura de transfectantes na presença de um baixo nível de agente de 55 selecção e depois aumentando, a quantidade de agente selectivo para células que produzem elevados niveis de produtos dos genes introduzidos. Um marcador seleccionável amplificável adequado é a dihidrofolao redutase (DHFR), que confere resistência ao metotrexato. Podem também ser utilizados outros genes de resistência ao fármaco (por ex. resistência à higromicina, resistência a multi-fármacos, puromicina acetil-transferase). Alternativamente, marcadores que introduzem um fenótipo alterado, tal como uma proteína fluorescente verde, ou proteínas da superfície celular, tais como CD4, D8, Classe I MHC, fosfatase alcalina da placenta podem ser utilizados para separar células transfectadas das células não transfectadas, através de meios como selecção FACS ou tecnologia de separação, através de células magnéticas. 0 polipéptido da invenção pode também ser produzido cultivando células de mamíferos utilizando um sistema de administração virai. Exemplos de vírus para este fim incluem adenovírus, retrovírus, vírus de herpes, vírus de vacinas e vírus adenoassociados (AAV). Um adenovírus um vírus de cadeia dupla de ADN é actualmente o vector de transferência de genes mais estudado para a administração de ácidos nucleicos heterólogos (para um revisão, ver Becker e tal., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), e Douglas e Curiel, Science & Medicine 444 (1997)). Vantagens do sistema de adenovírus incluem a acomodação de inserções de ADN relativamente grandes, a capacidade de fazer crescer títulos elevados, a capacidade de infectar uma larga gama de células de mamíferos, e flexibilidade que permite a utilização com um elevado número de vectores disponíveis contendo promotores diferentes.

Eliminando porções do genoma de adenovírus, podem ser acomodadas grandes inserções (até 7 kb) de ADN heterólogo. Estas inserções podem ser incorporadas no ADN virai através de ligação directa ou por recombinação homóloga com um plasmídeo 56 co-tansfectado. Uma opção é eliminar o gene EI essencial do vector virai, que resulta na falta de capacidade d se replicar a não ser que o gene El seja disponibilizado pela célula hospedeira. Vectores de adenovírus infectados com células humanas 293 (ATCC N°s CRL-1573, 45505, 45505), por exemplo, podem ser feitas crescer como células aderentes ou em cultura de suspensão com uma densidade de células relativamente elevada para produzir quantidades significativas de proteínas (ver Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)). O polipéptido da invenção pode também ser expresso noutras células eucarióticas superiores, tais como de aves, fungos, insectos, leveduras, ou células de plantas. O sistema de baculovírus disponibiliza meios eficientes de introduzir genes clonados em células de insectos. Vectores de expressão adequados são baseados no vírus de polihedrose nuclear múltipla de Autographa californica (Ac-MNPV), e contém promotores bem conhecidos, tais como o promotor da proteína (hsp) 7 0 do choque de calor da Drosophila, promotor do gene imediato (ie-1) do vírus da polihedrose nuclear de Autographa californica e promotor precoce 39K atrasado, promotor plO de baculovírus, e o promotor da metaloteína da Drosophila. Um segundo processo de preparação de baculovírus recombinante utiliza um sistema baseado em transposão descrito por Luckow, e tal., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema que utiliza vectores de transferência é vendido no kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza um vector de transferência, PFASTBAC (Life Technologies) contendo um transposão Tn7 para passar um ADN que codifica para um polipéptido para um genoma de baculovírus mantido em E. coli como um grande plasmídeo designado por "bacmido" ver, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning e tal., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), e Chazenbalk, e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Para além disso, os vectores 57 de transferência podem incluir uma fusão na estrutura com um ADN que codifica para uma etiqueta de epitopo no terminal C ou N do polipéptido expresso, por exemplo, uma etiqueta de epitopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7952 (1985)). Utilizando uma técnica conhecida do estado da técnica um vector de expressão contendo um gene que codifica para um polipéptido da presente invenção é transformado na E. coli e pesquisado para "baemidos" que contêm um gene interrompido lacZ indicador de um baculovirus recombinante. 0 ADN de baemido contendo o genoma do baculovirus recombinante é então isolado utilizando técnicas comuns. 0 vector ilustrativo PFASTBAC pode ser modificado até a um grau considerável. Por exemplo, um promotor de polihedrina pode ser removido e substituído pelo promotor da proteina básica do baculovirus (também conhecido como Pcor, p.6.9 ou promotor MP) que é expresso mais cedo na infecção pelo baculovirus, e foi demonstrado ser vantajoso para a expressão de proteínas secretadas (ver, por exemplo, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), e Chazenbalk e Rapoport J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Além disso, os vectores de transferência podem incluir uma fusão na estrutura com ADN que codifica para uma etiqueta de epitopo no terminal C- ou N do polipéptido expresso, por exemplo, uma etiqueta de epitopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7952 (1985)). Utilizando a técnica conhecida do estado da técnica, um vector de transferência contendo um gene que codifica para um polipéptido da presente invenção é transformado em E. coli, e pesquisado para baemidos que contêm um gene LacZ interrompido indicativo de um baculovirus recombinante. O ADN de baemido contendo o genoma de baculavirus recombinante é então isolado utilizando técnicas comuns. 58 0 vector PFASTBAC ilustrativo pode ser modificado até a um grau considerável. Por exemplo, o promotor de polihedrina pode ser removido e substituído com o promotor da proteína básica de baculovírus (também conhecido como Pcor, p6.9 ou promotor MP) que é anteriormente expresso na infecção do baculovírus, e foi demonstrado ser vantajoso para expressar proteínas secretadas (ver, por exemplo, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Em tais construções de vectores de transferência, pode ser utilizada uma versão curta, ou longa do promotor da proteína básica. Além disso podem ser construídos vectores de transferência que substituem as sequências de sinalização secretoras nativas com sequências de sinalização secretoras derivadas de proteínas de insectos. Por exemplo, uma sequência secretora de sinalização de Ecdysteroid Glucosyltransferase (EGT), melitina das abelhas (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), ou baculovírus gp67 (PharMingen: San Diego, CA) pode ser utilizada em construções para substituir a sequência de sinalização secretora nativa de IL-17RC.

O vírus recombinante ou bacmido é utilizado para transferir células hospedeiras. Células hospedeiras de insecto adequadas incluem linhas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, uma linha celular do ovário da pupa de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE, e Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), assim como células de Drosophila Schneider-2, e a linha celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente US N° 5,300;435). Meios disponíveis comercialmente isentos de soro podem ser utilizados para crescer e manter as células. Meios adequados são Sf900 II™ (Life Technologies) ou ESF 921™ (Expression Systems) para as células Sf9; e Ex-cell 0405™ (JRH 59

Biosciences, Lenexa, KS) ou Express FiveOTM (Life Technologies) para as células T. ni. Quando é utilizado um vírus recombinante, as células são tipicamente feitas crescer a partir de uma densidade de inoculação de aproximadamente 2-5xl05 células até a uma densidade de 1-2 x 106 células sendo nessa altura adicionado um stock virai recombinante numa multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 a 10, mais tipicamente próximo de 3. Técnicas estabelecidas para produzir proteínas recombinantes em sistemas de baculovírus são disponibilizadas por Bailey et al., "Manipulation of Baculovírus Vectors, " em Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), por Patel et al., "The baculovírus expression system", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a Edição, Glover et al. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) nas páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.) Baculovírus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), e por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) . Células fúngicas, incluindo células de leveduras, podem também ser utilizadas para expressar os genes aqui descritos. Espécies de leveduras de particular interesse neste aspecto incluem Saccharomyces cerevisae, Pichia pastoris, e Pichia methanolica. Promotores adequados para a expressão na levedura incluem promotores de GALl (galactose), PGK (fosforilglicerato cinase), ADH (álcool desidrogenase), AOX1 (álcool oxidase), HIS4 (histidinol desidrogenase), e análogos. Muitos vectores de clonagem foram designados e encontram-se facilmente disponíveis. Estes vectores incluem vectores baseados em Ylp, tais como vectores Ylp5, vectores YRp, tais como YRp 17, 60 vectores YEp tais como YEpl3 e vectores YCp, tais como YCpl9. Processos para transformar células de S. cerevisiae com ADN exógeno que produz os seus péptidos recombinantes são revelados, por exemplo, por Kawasaki, Patente US N° 4,599,311, Kawasaki e tal., Patente de invenção US N° 4,931,373, Brake, Patente de invenção US N° 4,870,008, Welch et al., Patente US N° 5,037,743, e Murray et al., Patente US N° 4,845,075. Células transformadas são seleccionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador seleccionável, habitualmente a resistência a fármacos, ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular (por ex., leucina) . Um sistema de vector adequado para utilização na Saccharomyces cerevisiae é o sistema de vector POT1 revelado por Kawasaki e tal. (Patente de invenção N° US 4,931,373), que permite a células transformadas serem seleccionadas, através de crescimento em meios contendo glucose. Promotores adequados adicionais e terminadores para utilização em leveduras incluem aqueles de genes de enzimas glicoliticas (ver, por ex. Kawasaki, Patente de invenção US N° 4,599,311, Kingsman et al., Patente de invenção US N° 4,615,974, e Bitter, Patente de invenção US N° 4,977,092) e genes da álcool desidrogenase. Ver patente de invenção US N° 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936, e 4,661,454.

Sistemas de transformação para outras leveduras incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa são conhecidas do estado da técnica. Ver, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986), e Cregg, Patente de invenção US N° 4,882,279. Células de Aspergillus podem ser utilizadas de acordo com os processos de McKnight et al., Patente de invenção US N° 4,935,349. Processos para transformar Acremonium chrysogenum são revelados por Sumino et al., Patente US N° 5,162,228. Processos para transformar 61

Neurospora são revelados por Lambowitz, Patente de Invenção N° 4,486,533.

Por exemplo, a utilização de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é revelada por Raymond Patente de invenção US N° 5,716,808, Raymond Patente de invenção US N° 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998), e nas publicações internacionais N°s WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, e WO 98/02565. Moléculas de ADN para utilização na transformação de P. methanolica vão habitualmente ser preparadas como de cadeia dupla, plasmídeos circulares que são preferencialmente linearizadas antes da transformação. Para a produção em P. methanolica, o promotor e terminador no plasmídeo pode ser o de um gene de P. methanolica, tal como o gene de utilização do álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2). Outros promotores úteis incluem aqueles da dihidróxiacetona sintase (DHAS), formato desidrogenase (FMD), e genes da catalase (CAT). Para facilitar a integração do ADN no cromossoma do hospedeiro é preferido possuir o segmento completo da expressão do plasmídeo flanqueado em ambos os lados pelas sequências hospedeiras de ADN. Um marcador seleccionável adequado para utilização em Pichia methanolica é um gene ADE2 de P. methanolica que codifica para a fosforibosil-5-aminoimidazole carboxilase (AIRC: EC 4.1.121), e que permite a células hospedeiras ade2 de crescerem na ausência de adenina. Para processos industriais de grande escala, onde é desejável minimizar a utilização de metanol, podem ser utilizadas células hospedeiras em que a utilização de genes de metanol (AUG1 e AUG2) são suprimidos. Para a produção de proteínas secretadas, células hospedeiras podem ser deficientes em genes da protease vacuolar (PEP4 e PRBl). É utilizada a electroporação para facilitar a introdução de um plasmídeo contendo ADN que codifica para um polipéptido de interesse em células de P. 62 methanolica. Células de P. methanolica podem ser transformadas por electroporação utilizando um campo eléctrico pulsado de decaimento exponencial possuindo uma força de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferencialmente cerca de 3,75 kv/cm, e uma constante de tempo (t) de 1 a 40 milisegundos, mais preferencialmente de cerca de 20 milisegundos.

Vectores de expressão podem também ser introduzidos num tecido de planta incluindo a infecção directa ou co-cultura de tecido de planta com Agrobacterium tumefaciens, administração mediada por microprojéctil, injecção de ADN, electroporação, e semelhante. Ver, por exemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotecnology 10:268 (1992), e Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign ADN into Plants, "in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).

Alternativamente, os genes que codificam para o polipéptido da presente invenção pode ser expresso em células de um hospedeiro procariótico. Promotores adequados que podem ser utilizados para exprimir o polipéptido num hospedeiro procariótico são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica e incluem promotores capazes de reconhecer as polimerases T4, T3, Sp6 e T7, os promotores PR e PL do bacteriófago lambda, o trc, recA, choque de calor, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, pHoA, e promotores lacZ de E. coli., promotores de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, o promotor int do bacteriófago lambda, o promotor bla de pBR322, e o promotor CAT do gene da cloroanfenicol acetil transferase. Foram revistos os promotores procarióticos por Glick J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology do

Gene, 4a Ed. (Benjamin Cummins 1987), e por Ausubel et al. (1995) . 63 Hóspedes procarióticos adequados incluem E. coli e Bacillus subtilus. Estirpes adequadas de E. coli incluem BL21 (DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DHlOB/p3, DHllS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RP1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, e ER1647 (ver, por exemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Estirpes adequadas de Bacillus subtilus incluem BR151, YB886, MI119, MI120, e B170 (ver, por exemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods, "in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).

Quando se expressa um polipéptido da presente invenção em bactérias tais como E. coli, o polipéptido pode ser retido no citoplasma, tipicamente como grãos insolúveis, ou pode ser dirigido para o espaço periplasmático, através de uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são lisadas e os grânulos são recobertos e desnaturados utilizando, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou ureia. 0 polipéptido desnaturado pode então ser novamente dobrado e dimerizado diluindo o desnaturante, tal como por diálise contra uma solução de ureia e uma combinação de glutationa reduzida e oxidada, seguida de diálise contra uma solução salina tamponizada. No último caso, o polipéptido pode ser recoberto a partir do espaço periplasmático numa forma solúvel e funcional destruindo as células (através de por exemplo, sonicação, ou choque osmótico) para libertar o conteúdo do espaço periplasmático e recuperar a proteína, obviando deste modo à necessidade de desnaturação e renaturação.

Processos para expressar proteínas em hospedeiros procarióticos são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Williams et al. "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific policlonal antibodies, "in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a Edição, Glover et al. 64 (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995). Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), e Georgiou, "Expression of Proteins in Bactéria," in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)) . São fornecidos processos padrão para introduzir vectores de expressão em células bacterianas, de leveduras, insectos e plantas, por exemplo por Ausubel (1995) . São disponibilizados processos gerais para expressar e recuperar proteínas estranhas produzidas por um sistema de células de mamíferos, por exemplo, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein, Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). São disponibilizadas técnicas padrão para recuperar proteína produzida por um sistema bacteriano, através de, por exemplo, Grisshammer et al., "Purification of over produced proteins de E. coli cells," in DNA cloning 2: Expression Systems, 2a Edição Glover et al. (eds.) páginas 59-92 (Oxford University Press 1995) . Processos estabelecidos para isolar proteínas recombinantes a partir de um sistema de baculovirus são descritos por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Human Press, Inc. 1995).

Como alternativa, o polipéptido da presente invenção pode ser sintetizado exclusivamente, através de síntese de fase sólida, processos parciais de fase sólida, condensação de fragmentos ou síntese de solução clássica. Estes processos de síntese são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase peptide Synthesis" (2a Edição), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer e Rapp, Chem. Pept. 65

Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields and Colowick, "Solid Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289 ((Academic Press 1997), e Lloyd-Wiliams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Variações nas estratégias totais de síntese, tais como "ligação química nativa" e "ligação de proteína expressa" são também padrão (ver, por exemplo, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng e tal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287:34 (1997), Muir et al. Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 95:6705 (1998), e Severinov e Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)) . A presente invenção também contempla composições modificadas quimicamente, em que o polipéptido se encontra ligado com um polímero. Tipicamente o polímero é solúvel na água de modo a que o conjugado não precipite num meio aquoso, tal como um meio fisiológico. Um exemplo de um polímero adequado é um que foi modificado para possuir um único grupo reactivo, tal como um éster activo para acilação, ou um aldeído para alquilação. Deste modo, o grau de polimerização pode ser controlado. Um exemplo de um aldeído reactivo é polietileno glicol propionaldeído, ou mono-(C1-C10) alcóxi, ou seus derivados de arilóxi (ver, por exemplo, Harris, et al., Patente de Invenção US N° 5,252,714). O polímero pode ser ramificado, ou não ramificado. Além disso uma mistura de polímeros pode ser utilizada para produzir os conjugados.

Os conjugados da presente invenção utilizados para terapia podem compreender resíduos poliméricos solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis. Polímeros solúveis em água adequados incluem polietileno glicol (PEG), monometóxi-PEG, mono-(C1-C10)alcóxi-PEG, arilóxi-PEG, poli-(N-

vinilpirrolidona)PEG, tresil monometóxi PEG, PEG 66 propionaldeído, bis-succinimidil carbonato PEG, homopolímeros de propileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/ óxido de etileno, poliois polioxietilados (por ex. glicerol), álcool polivinílico, dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em hidratos de carbono. PEG adequado pode ter um peso molecular de cerca de 600 a cerca de 60.000, incluindo, por exemplo, 5,000, 12000, 20,000 e 25,000. O conjugado pode também compreender uma mistura de tais polímeros solúveis em água.

Um exemplo de um conjugado compreende o polipéptido da presente invenção e um resíduo de polialquilóxido ligado ao terminal N do polipéptido. PEG é um polialquilóxido adequado. Como ilustração, o polipéptido pode ser modificado com PEG, um processo conhecido como "PEGuilação do polipéptido pode ser efectuada por qualquer uma das reacções de PEGuilação conhecidas no estado da técnica (ver, por exemplo, EP0154316, Delgado e tal., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992). Duncun e Spreafico. Clin. Pharmacokinet. 27:290(1994), e Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)). Por exemplo, PEGuilação pode ser efectuada, através de uma reacção de acilação, ou através de uma reacção de alquilação com uma molécula reactiva de polietilenoglicol. Numa estratégia alternativa, os conjugados são formados através da condensação de PEG activado, em que um terminal hidróxi ou grupo amino de PEG foi substituído por um agente de ligação activado (ver, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente de invenção US N° 5,382,657). PEGuilação por acilação necessita tipicamente a reacção de um derivado de um éster activo de PEG com polipéptido. Um exemplo de um éster de PEG activado é PEG esterificado com N-hidróxisuccinimida. Quando aqui utilizado, o termo "acilação" inclui os tipos seguintes de ligação entre o polipéptido e um polímero solúvel em água:amida, carbamato, uretano, e 67 semelhantes. Processos para preparar IL-17RG/IL-17RA PEGuilado vai compreender tipicamente os passos de (a) fazer reagir um polipéptido IL-17RC/IL-17RA com PEG (tal como um éster reactivo de um derivado aldeído de PEG) sob condições em que um ou vários grupos PEG ligados a IL-17RC/IL-17RA, e (b) obtendo o produto da reacção (s) . Geralmente, as condições de reacção óptimas para reacções de acilação vão ser determinadas com base em parâmetros conhecidos e resultados desejados. Por exemplo, quanto maior for a proporção mais elevada de PEG:IL-17RC/IL-17RA, maior é a percentagem de produto IL-17RC/IL-17RA polyPEGuilado. 0 produto de PEGuilação por acilação é tipicamente um produto poliPEGuilado, quando os grupos ε-amina de lisina são PEGuilados, através de um grupo de ligação acilo. Um exemplo de uma ligação de união é uma amida. Tipicamente o IL-17RC/IL-17RA vai ser de pelo menos 95% mono, di, ou tripeguilado, apesar de algumas espécies com graus mais elevados de PEGuilação podem ser formados dependendo das condições de reacção. Espécies PEGuiladas podem ser separadas de polipéptidos IL-17RC/IL-17RA não conjugados utilizando processos padrão de purificação, tais como diálise, ultrafiltração, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, e análogos. A PEGuilação por alquilação envolve geralmente a reacção de um derivado de aldeído terminal de PEG com IL-17RC/1L-17RA na presença de um agente redutor. Grupos PEG podem ser ligados ao polipéptido, através de um grupo -CH2-NH. A derivatização, através de alquilação redutiva para produzir um produto monoPEGuilado aproveita a diferente reactividade de diferentes tipos de grupos amina primários disponíveis para derivatização. Tipicamente, a reacção é efectuada a um pH que permite aproveitar as diferenças de pKa 68 entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e do grupo examino do resíduo terminal da proteína. Através de uma tal derivatização selectiva, a ligação de um polímero solúvel em água que contém um grupo reactivo tal como um aldeído a uma proteína é controlado. A conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal da proteína sem modificação significativa ou outros grupos reactivos, tais como os grupos amino da cadeia lateral de lisina. A presente invenção disponibiliza uma preparação substancialmente homogénea de monopolímeros conjugados de IL-17RC/IL-17RA.

Alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogénea de molécula conjugada de monopolímero IL-17RC/IL-17RA pode compreender os passos de : (reagir uma IL, um polipéptido 17RC/IL-17RA com um PEG reactivo sob condições alcalinas redutivas a um pH adequado para permitir uma modificação selectiva do grupo α-amino no terminal amino de IL-17RC/IL-17RA, e (b) obtendo o(s) produto(s) de reacção. 0 agente redutor utilizado para a alquilação redutiva deveria ser estável numa solução aquosa e capaz de reduzir apenas a base de Schiff formado no processo inicial de alquilação redutiva. Agentes redutores ilustrativos incluem borohidreto de sódio, cianoborohidreto de sódio, dimetilamino borano, trimetilamino borano, e piridina borano.

Para uma população substancialmente homogénea de conjugados de monopolímero IL-17RC/IL-17RA, as condições da reacção de alquilação redutiva, são aquelas que permitem a ligação selectiva do resíduo polimérico solúvel em água do terminal N de IL-17RC/IL-17RA. Tais condições de reacção fornecem geralmente diferenças em pKa entre os grupos amino da lisina e o grupo α-amino no terminal N. 0 pH também afecta a proporção entre polímero e proteína a ser utilizado. Em geral, se o pH é mais baixo, será desejável um maior excesso de 69 polímero em relação a uma proteína, por que o grupo α-amino N-terminal menos reactivo é necessário para se conseguir condições óptimas. Se o pH é mais elevado, o polímero: IL-17RC/IL-17RA não necessita de ser tão grande, porque grupos mais reactivos encontram-se disponíveis. Tipicamente o pH vai diminuir na gama de 3 a 9, ou 3 a 6. Este processo pode ser utilizado para fazer IL-17RC/IL-17RA compreendendo conjugados de receptores solúveis homodiméricos, heterodiméricos ou multiméricos.

Outro factor a considerar é o peso molecular de um polímero solúvel em água. Geralmente, quanto maior for o peso molecular do polímero, menor será o número de moléculas poliméricas que podem ser ligados à proteína. Para reacções de PEGuilação, o peso molecular típico é de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, cerca de 5 KDa a cerca de 50 kDa, ou cerca de 12 kDa a cerca de 25 kDa. A proporção molar do polímero solúvel em água em relação a IL-17RC/IL-17RA vai estar geralmente na gama de 1:1 a 100:1. Tipicamente a razão molar do polímero solúvel em água para IL-17RC/IL-17RA vai ser de 1:1 a 20:1 para poliPEGuilação, e de 1:1 para 5:1 para monoPEGUilação.

Processos gerais para produzir conjugados compreendendo um polipéptido e resíduos poliméricos solúveis em água são bem conhecidos do estado da técnica. Ver, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente de invenção US N° 5,382,657, Greenwald et al., Patente de invenção US N° 5,738,846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). A presente invenção contempla composições compreendendo o polipéptido da presente invenção. Tais composições podem ainda compreender um veículo. O veículo pode ser um veículo convencional orgânico, ou inorgânico. Exemplos de veículos 70 incluem água, solução tampão, álcool, propileno glicol, macrogol, óleo de sésamo, óleo de milho e análogos.

G) Isolamento de polipéptidos de IL-17RC ou IL-17RC/IL-17RA

Os polipéptidos da presente invenção podem ser purificados até pelo menos cerca de 80% de pureza, até pelo menos cerca de 90% de pureza, até pelo menos 95% de pureza, ou superior a 95%, tal como 96%, 97%, 98% ou superior a 99% de pureza em relação a macromoléculas contaminantes, particularmente, outras proteínas e ácidos nucleicos, e isentos de agentes infecciosos e pirogénicos. O polipéptido da presente invenção pode também ser purificado até a um estado farmaceuticamente puro, que é superior a 99,9% de pureza. Em determinadas preparações, o polipéptido purificado encontra-se substancialmente isento de outros polipéptidos particularmente outros polipéptidos de origem animal.

Processos de fraccionamento e/ou purificação convencionais podem ser utilizados para obter preparações de IL-17RC/IL-17RA purificado a partir de células hospedeiras recombinantes. Em geral precipitação com sulfato de amónio e extracção ácida ou caotrópica pode ser utilizada para o fraccionamento de amostras. A título de exemplo, passos de purificação podem incluir hidróxiapatite, exclusão por tamanho, FPLC e cromatografia líquida de elevada performance de fase reversa. Meios cromatográficos adequados incluem dextranos derivatizados, celulose, poliacrilamida, sílicas especiais e análogos. São adequados PEI, DEAE, QAE e Q. A título de exemplo meios cromatográficos incluem aqueles meios derivatizados com grupos fenil, butil, ou octil, tais como Fenil Sefarose FF (Pharmacia), Toyopearl butilo 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , Octyl-Sepfarose (Pharmacia) e análogos; ou resinas poliacrílicas, tais como Amberchrom CG 71 71 (Toso Haas) e análogos. Suportes sólidos adequados incluem esferas de vidro, resinas à base de sílica, resinas celulósicas, esferas de agarose, esferas de agarose reticuladas, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas e análogos que são insolúveis sob as condições em que são utilizadas. Estes suportes podem ser modificados com grupos reactivos que permitem a ligação de proteínas por grupos amina, grupos carbóxilo, grupos sulfidrilo, grupos hidroxilo e/ou resíduos de hidratos de carbono.

Exemplos de químicas de acoplamento incluem activação de brometo de cianogénio, activação de N-hidróxisuccinimida, activação de epóxido, activação de sulfidrilo, activação de hidrazida, e derivados carbóxilo e amino para a química de acoplamento com carbodiimida. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e largamente utilizados no estado da técnica, e encontram-se disponíveis a partir de fornecedores comerciais. A selecção de um processo em particular para o isolamento de polipéptidos e purificação é uma questão de desenho de rotina e é determinada em parte pelas propriedades do suporte escolhido. Ver, por exemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), e Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).

Variantes adicionais no isolamento de IL-17RC/IL-17RA e purificação podem ser concebidas pelos peritos no estado da técnica.

Os polipéptidos da presente invenção podem também ser isolados através da exploração de propriedades particulares. Por exemplo, cromatografia de adsorção de iões metálicos imobilizados (IMAC) pode ser utilizada para purificar proteínas ricas em histidina, incluindo aquelas compreendendo etiquetas de polihistidinas. Brevemente um gel é primeiro 72 carregado com iões metálicos divalentes para formar um quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Proteínas ricas em histidina vão ser adsorvidas a esta matriz com afinidades diferentes dependendo do ião metálico utilizado, e vai ser eluída por eluição competitiva, baixando o pH, ou a utilização de agentes quelantes. Outros processo de purificação incluem a purificação de proteínas glicosiladas por cromatografia de afinidade de lectina e cromatografia de permuta iónica (M. Deutscher,(ed.), Meth Enzymol. 182:529 (1990)). No âmbito das concretizações adicionais um polipéptido de fusão de interesse e uma etiqueta de afinidade (por ex. uma proteína de ligação à maltose, um domínio de imunoglobulina) pode ser construído para facilitar a purificação. Além disso, as propriedades de ligação do ligando do polipétido solúvel IL-17RC/IL-17RA da presente invenção pode ser explorado para purificação, por exemplo, de IL-17RC- compreendendo receptores solúveis; por exemplo, através da utilização de cromatografia de afinidade em que o ligando IL-17F é ligado a uma coluna e o receptor compreendendo IL-17RC está ligado e é subsequentemente eluído utilizando processos cromatográficos padrão.

Polipéptidos IL-17RC/IL-17RA, ou os seus fragmentos podem também ser preparados, através de síntese química, como descrito acima. Estes polipéptidos podem ser monómeros ou multímeros; glicosilados, ou não glicosilados; PEGuilados ou não PEGuilados; e podem incluir, ou não incluir um resíduo de aminoácido inicial de metionina.

I) Utilizações terapêuticas do polipéptido da invenção IL-17RC/IL-17RA O polipéptido da presente invenção pode ser utilizado para modular o sistema imunitários , através da ligação de ligandos IL-17a e IL-17F (isoladamente ou em conjunto), e 73 assim evitar a ligação destes ligandos com o receptor IL-17RC endógeno e/ou IL-17RA. 0 polipéptido da presente invenção pode também ser utilizado para modular o sistema imunitário, através da inibição da ligação de IL-17A e IL-17F com o receptor endógeno IL-17RC e IL-17RA. Neste contexto, a presente invenção inclui a utilização do polipéptido da presente invenção na administração a um sujeito que lhe falta uma quantidade adequada deste polipéptido, ou que produz um excesso de IL-17A e/ou IL-17F. 0 polipéptido da presente invenção (por ex., IL-17RC/IL-17RA) pode ser também utilizado para tratar um sujeito que produz um excesso de IL-17A, IL-17F, IL-17RA ou IL-17RC.

Objectos adequados incluem mamíferos, tais como seres humanos. Por exemplo, tais polipéptidos solúveis são úteis na ligação, bloqueamento, inibição, redução, para antagonizar, ou neutralizar IL-17A e IL-17F (isoladamente ou conjuntamente), no tratamento de inflamação e doenças inflamatórias, tais como a psoríase, artrite reumatóide, IBD, IBS, colite, asma, rejeição alográfica, esclerose múltipla e outras condições inflamatórias aqui reveladas. 0 polipéptido da presente invenção liga-se a , bloqueia, inibe, reduz, antagoniza, ou neutraliza IL-17F e IL-17A (individualmente ou conjuntamente) in vivo.

Análise da distribuição no tecido do ARNm correspondente a IL-17RC ADNc mostrou que o ARNm do gene de IL-17RC é fortemente expresso na tiróide, glândula adrenal, próstata, e tecidos do fígado, e expresso em menor extensão no coração, intestino delgado, estômago, e tecidos da traqueia. Em particular, IL-17RC é expresso de forma consistente em linhas celulares do sangue periférico em células não T, incluindo monócitos, células B, e células da linhagem mieloide. Também o ARNm de IL-17RC é expresso de forma fidedigna em linhas celulares derivadas da pele. Outras 74 linhas celulares que expressam IL-17RC são todas as 5 de linhas celulares do intestino grosso que estiveram presente na matriz. Em contraste a expressão é pequena, ou não existe no cérebro, placenta, pulmão, músculo esquelético, rim, pâncreas, baço, timo, testículo, ovário, cólon, leucócitos do sangue periférico, medula espinal, nódulo linfático, e medula óssea. 0 ligando ao qual IL-17RC se liga (IL-17F e/ou IL-17A) encontra-se implicado na indução da resposta inflamatória e contribuindo para doenças inflamatórias principalmente. Através da sua capacidade de aumentar a produção de mediadores inflamatórios, incluído IL-Ιβ, IL-6 e TNF-α, assim como aqueles mediadores que estão envolvidos na proliferação, maturação e qumiotaxe dos neutrófilos (revisto em Witowski et al., Cell, Mol. Life Sei. 61:567-579 (2004)).

Assim, concretizações particulares da presente invenção são dirigidas em relação ao polipéptido IL-17RC/IL-17RA como antagonistas em doenças inflamatórias e imunitárias, ou condições tais como psoríase, condições de pele inflamatórias, artrite reumatóide, IBD, IBS, doença de Crohn, asma, doença autoimunitária, transplante de orgão , ou da medula óssea; inflamação devida ao trauma, cirurgia, ou infecção; enxerto em relação à doença do hospedeiro; e quando a inibição da inflamação, supressão imunitária, redução da proliferação hematopoiética, células imunitárias, inflamatórias, ou linfoides, macrófagos, células T (incluindo células Thl e Th2) supressão da resposta imunitária a um patogéneo, ou antigéneo, ou outras condições em que é desejável a inibição de IL-17F e/ou IL-17A.

Além disso, o polipéptido IL-17RC/IL-17RA solúvel é útil para: 75 (1) Bloquear, inibir, reduzir, antagonizar, ou neutralizar a sinalização, através de IL-17RA ou IL-17RC no tratamento de inflamação aguda, inflamação como resultado de trauma, ferimento de tecido, cirurgia, infecção, e doenças inflamatórias crónicas, tais como asma, doença inflamatória do intestino (IBD), IBS, colite crónica, artrite reumatóide, asma e outras doenças associadas com a indução de uma resposta de fase aguda. (2) Bloquear, inibir, reduzir, antagonizar, ou neutralizar a sinalização, através de IL-17RA ou IL-17RC no tratamento de doenças autoimunitárias tais como IDDM, esclerose múltipla (MS), artrite reumatóide, IBS e IBD para evitar ou inibir a sinalização em células imunitárias (por ex. linfócitos, monócitos, leucócitos) . Bloquear, inibir, reduzir, ou antagonizar, a sinalização em células imunitárias (por ex. linfócitos, monócitos, leucócitos) . Bloquear, inibir, reduzir, antagonizar a sinalização, através de IL-17RA ou IL-17RC utilizando o tratamento da presente invenção pode também beneficiar doenças do pâncreas, rim, células pituitárias e neuronais. (3) Tornar extremamente lento, amplificar, aumentar, ou iniciar a sinalização, através de IL-17RA ou IL-17RC no tratamento de doenças autoimunitárias, tais como MS, artrite reumatóide, IBS e IBD. 0 polipéptido solúvel da presente invenção pode sinalizar linfócitos ou outras células imunitárias para se diferenciarem, alterar a proliferação, ou alterar a produção de citocinas ou proteínas da superfície celular que melhoram a autoimunidade. Especificamente, a modulação de uma resposta de uma célula auxiliar T num padrão alternado de secreção de citocina pode desviar uma resposta autoimunitária para melhorar a doença (Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). De forma semelhante polipéptidos agonistas solúveis podem ser 76 utilizados para sinalizar, eliminar e desviar células imunitárias envolvidas na asma, alergia, e doença atopoica. A sinalização, através IL-17RC e/ou IL-17RA pode igualmente beneficiar doenças do pâncreas rim, pituitária e células neuronais. 0 polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA aqui descrito pode ser utilizado para se ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar, ou neutralizar a actividade de IL-17F ou IL-17a, isoladamente, ou em conjunto no tratamento da doença autoimunitária e doença atópica descrita acima. A forma solúvel de IL-17RC/IL-17RA pode ser utilizada para promover uma resposta de anticorpo mediada por células Th e/ou para promover a produção de IL-4 ou outras citocinas por linfócitos, ou outras células imunitárias. 0 polipéptido solúvel da presente invenção é útil como antagonista de IL-17RC/IL-17RA . Tais efeitos antagonistas podem ser conseguidos, através de neutralização directa ou ligação de IL-17RC/IL-17RA. Para além de utilizações como antagonistas, o receptor solúvel da presente invenção pode-se ligar a IL-17RC/IL-17RA e actuar como proteínas de veículo para o ligando, de modo a o transportar para diferentes tecidos, órgãos, e células no corpo. Como tal, o receptor solúvel da presente invenção pode ser condensado ou acoplado a moléculas polipéptidos ou resíduos químicos que dirigem o complexo de receptor solúvel ligando a um local específico, tal como tecido, célula imunitária específica, ou tumor. Por exemplo, numa infecção aguda, ou nalguns cancros, o benefício pode resultar da indução da inflamação e proteínas da resposta de fase aguda local através da acção de IL-17F. Assim, os receptores solúveis da presente invenção podem ser utilizados para dirigir especificamente a acção do IL-17A, ou IL-17F. Ver, Cosman, D. Cytokine: 5:95- 77 106, 1993; e Fernandez-Botran, R. Exp. Onion. Invest. Drugs 9:497-513, 2000.

Inflamação é uma resposta protectora, através de um organismo para se defender de um agente invasor. A inflamação é um agente em cascata que envolve muitos mediadores celulares e humorais. Por outro lado, a supressão de respostas inflamatórias pode deixar um hospedeiro comprometido do ponto de vista imunitário; contudo, se deixada por examinar, a inflamação pode conduzir a complicações sérias incluindo doenças inflamatórias crónicas (por ex., psoriase, artrite, artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença inflamatória dos intestinos e semelhantes). De forma importante estas diversas doenças partilham mediadores inflamatórios comuns. As doenças colectivas que são caracterizadas por inflamação possuem um grande impacto na morbidez humana e mortalidade. Por isso, é claro que as proteínas anti-inflamatórias, tais como as do polipéptido solúvel da presente invenção poderiam te um potencial terapêutico crucial para um grande número de doenças animais, de asma a alergia a autoimunidade. 1.Artrite

Artrite, incluindo osteoartrite artrite reumatóide, artrite nas articulações como resultado de ferimento, e semelhantes são as condições inflamatórias comuns que beneficiariam da utilização terapêutica de proteínas anti-inflamatórias, tais como os polipéptidos solúveis da presente invenção. Por exemplo, artrite reumatóide (RA) é uma doença sistemática que afecta o corpo completo e é uma das formas mais comuns da artrite. É caracterizada pela inflamação da membrana que reveste a articulação, que provoca a dor, rigidez, calor, vermelhidão e inchaço. 78 Células inflamatórias libertam enzimas que podem digerir o osso e cartilagem. Consequentemente como resultado da artrite reumatóide o revestimento das articulações, o sinóvio pode invadir e destruir o osso e a cartilagem conduzindo a deterioração e dor grave entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder a sua forma e alinhamento, resultando em dor e perda de movimento. A artrite reumatóide (RA) é uma doença imunomediada caracterizada particularmente pela inflamação e subsequente danificação do tecido conduzindo a uma deficiência grave e mortalidade acrescida. São produzidas uma variedade de citocinas localmente em juntas reumatóides. Numerosos estudos demonstraram que a IL-1 e TNF-alfa duas citocinas prototípicas pró-inflamatórias desempenham um papel importante em mecanismos envolvidos na inflamação sinovial e na destruição progressiva das articulações. De facto, a administração de inibidores de TNF-alfa e IL-1 em doentes com RA conduziu a uma melhoria dramática nos sinais clínicos e biológicos de inflamação e uma redução dos sinais radiológicos da erosão do osso e destruição da cartilagem. Contudo, apesar dos resultados encorajantes, uma significativa percentagem de doentes não respondem a estes agentes, sugerindo que outros mediadores estejam também envolvidos na patofisiologia da artrite (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149.2002). Um daqueles mediadores poderia ser IL-17A ou IL-17F, e como tal uma molécula que se ligue a, ou iniba a actividade de IL-17F ou IL-17A, tal como uma IL-17RC/IL-17RA poderia servir como uma terapêutica valiosa para reduzir a inflamação na artrite reumatóide, e outras doenças artríticas.

Existem vários modelos animais conhecidos no estado da técnica para a artrite reumatóide. Por exemplo, no modelo de artrite induzida pelo colagénio (CIA), os ratinhos 79 desenvolvem artrite inflamatória crónica que se assemelha de perto a artrite reumatoide humana. Uma vez que a CIA partilha características imunológicas e patológicas semelhantes com R. A., isto torna-a um modelo ideal para pesquisar potenciais compostos humanos anti-inflamatórios. 0 modelo de CIA é um modelo bem conhecido em ratinhos que depende de uma resposta imunitária e de uma resposta inflamatória, para ocorrer. A resposta imunitária compreende a interacção de células B e células T CD4 + em resposta ao colagénio, que é dada como um antigénio, e conduz à produção de anticorpos anti-colagénio. A fase inflamatória é o resultado de respostas do tecido de mediadores de inflamação, como uma consequência de alguns destes anticorpos reagirem de forma cruzada com o colagénio nativo do ratinho e activar a cascata complementar. Uma vantagem de utilização do modelo CIA é que os mecanismos básicos de patogénios são conhecidos. Os epitopos relevantes das células T e células B no colagénio do tipo II foram identificados e vários parâmetros imunológicos (por ex. hipersensibilidade do tipo retardado e anticorpo anti-colagénio) e inflamatório (por ex. citocinas, quimocinas, e enzimas que degradam a matriz) foram identificados relacionados com a artrite imuno-mediada, e podem assim ser utilizados para avaliar a eficácia do composto de teste no modelo CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Wiliams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sei. 61:1861-78, 1997; e Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995) .

Um grupo verificou que um anticorpo anti-ratinho IL-17 reduz os sintomas num modelo de ratinho CIA relativo a ratinhos de controlo, mostrando assim conceptualmente que os polipéptidos solúveis da presente invenção seriam benéficos no tratamento da doença humana. A administração de um anti- 80 soro de IL-17 específico de um único ratinho reduziu os sintomas da artrite, quando já presentes no modelo (Lubberts e tal., Artrite Rheum. 50:650-9, 2004). Por isso o IL-17RC/IL-17RA-Fc pode ser utilizada para neutralizar IL-17A, ou IL-17F no tratamento de doenças humanas específicas, tais como artrite, psoríase, doença inflamatória dos intestinos (IBD), IBS, e outras condições inflamatórias aqui reveladas. A administração do polipéptido solúvel da presente invenção a este modelo CIA de ratinho é utilizado para avaliar a sua utilização como um antagonista para IL-17F e IL-17A para melhorar sintomas e alterar o curso da doença. Além disso, resultados que mostram a inibição ou neutralização de IL-17F e/ou IL-17A, através do polipéptido solúvel da presente invenção iria disponibilizar uma prova de conceito de que outros antagonistas de IL-17A ou IL-17F podem também ser utilizados para melhorar os sintomas e alterar o decurso da doença. Além disso, uma vez que a IL-17A e/ou IL-17F induz a produção de IL-16 e TNF-a ambas as quais estão implicadas na patogénese e progressão da artrite reumatóide, a administração sistémica, ou local destes polipéptidos solúveis pode suprimir potencialmente a reposta inflamatória em RA. Através do exemplo e sem limitação, a injecção de 10-200 pg de IL-17RC-Fc por ratinho (uma de sete vezes por semana até, mas não limitada a 4 semanas através da via de administração s. c., i.p., ou i. m) pode reduzir significativamente a pontuação da doença (pontuação da pata, incidente de inflamação, ou doença). Dependendo da iniciação da administração de IL-17RC-Fc (por ex. antes de ou no tempo de imunização por colagénio, ou em qualquer ponto de tempo após a segunda imunização com colagénio, incluindo, aqueles pontos de tempo nos quais a doença já progrediu), IL-17RC pode ser eficaz na prevenção da artrite reumatóide, assim como a prevenção da sua progressão. Outras terapias 81 potenciais incluem os polipéptidos IL-17RC/IL-17RA, e semelhantes. 2. Doença inflamatória dos intestinos

No Estado Unidos aproximadamente 500000 pessoas sofrem de doença inflamatória dos intestinos (IBD) que podem afectar o cólon e o recto (colite ulcerativa) ou ambos, intestino delgado e intestino grosso (doença de Crohn). A patogénese destas doenças não é clara, mas envolvem inflamação crónica dos tecidos afectados. Os polipéptidos solúveis da presente invenção poderiam servir como uma terapêutica valiosa para reduzir a inflamação e efeitos patológicos na IBD, UC e doenças relacionadas. A colite ulcerativa é uma doença inflamatória (UC) do intestino grosso, habitualmente designado cólon, caracterizado por inflamação e ulceração da mucosa mais interior do cólon. A inflamação provoca o cólon a esvaziar-se frequentemente, resultando em diarreia. Sintomas incluem o desprendimento de fezes e cãibras abdominais, febre e perda de peso. Apesar da causa exacta da UC ser desconhecida, investigação recente sugere que as únicas defesas naturais operam contra proteínas que o corpo pensa que são estranhas (uma "reacção auto-imunitária"). Talvez, porque se assemelham a proteínas bacterianas do intestino, estas proteínas podem instigar ou estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. Como o revestimento do cólon é destruído, úlceras dão origem à libertação de muco, pus e sangue. Esta doença inicia-se na área rectal e pode-se eventualmente prolongar, através de todo o intestino grosso. Episódios repetidos de inflamação conduziu ao espessamento da parede do intestino e recto com tecido de cicatrização. Pode ocorrer a morte do tecido do 82 cólon ou sepsia com doença grave. Os sintomas de colite ulcerativa variam em gravidade e o seu inicio pode ser gradual, ou repentino. Os ataques podem ser prolongados por muitos factores, incluindo infecções respiratórias, ou stress.

Apesar de não existir actualmente cura disponível para a UC os tratamentos centram-se na supressão do processo inflamatório anormal no revestimento do cólon. Tratamentos que incluem corticoesteroides imunosupressores (por ex. azatiopirina, marcaptopurina, e metotrexato) e encontram-se disponíveis aminosalicilatos para tratar a doença. Contudo, a utilização de longo termo de imunossupressores, tais como corticosteroides e aziotropina pode resultar em efeitos secundários sérios incluindo emagrecimento dos ossos cataratas, infecção, e efeitos no fígado e na medula óssea. Nos doentes em que as terapias actuais não são bem sucedidas, a cirurgia é uma opção. A cirurgia envolve a remoção do cólon completo e do recto.

Estes são vários modelos animais que podem mimetizar parcialmente a colite ulcerativa. 0 modelo mais largamente utilizado é o da colite induzida pelo ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfónico/etanol (TNBS), que inclui inflamação crónica e ulceração no cólon. Quando o TNBS é introduzido no cólon de ratinhos susceptíveis, através de instilação intra-retal, induz uma resposta mediada pela célula T na mucosa colónica, conduzindo neste caso a uma inflamação massiva da mucosa, caracterizada pela infiltração densa de células T e macrófagos, através da parede completa do intestino grosso. Além disso, este quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clínico de perda de peso progressiva (emagrecimento), diarreia com sangue, prolapso rectal, e espessamento da parede do intestino grosso (Neurath et al. Interm. Rev. Immunol. 19:51-62,2000). 83

Outro modelo de colite utiliza sulfato de dextrano de sódio (DSS), que induz uma colite aguda manifestada por diarreia com sangue, perda de peso. Encurtamento do cólon e ulceração do cólon com infiltração de neutrófilos. Colite induzida por DSS é caracterizada histologicamente por infiltração ou células inflamatórias na lamina própria, com hiperplasia linfoide, dano da cripta, e ulceração epitelial. Pensa-se que as alterações devido ao efeito tóxico do DSS no epitélio e por fagocitose das células da lamina própria e produção de TNF-alfa e TNF-gama. Apesar da sua utilização habitual, várias questões no que diz respeito aos mecanismos da DSS em relação à relevância para a doença humana permanecem por resolver. 0 DSS é considerado como um modelo independente da célula T porque é observado em animais deficientes em células T, tais como ratinhos SCID. A administração do polipéptido solúvel na presente invenção a estes modelos TNBS ou DSS podem ser utilizados para avaliar a sua utilização para melhorar sintomas e alterar o curso de doenças gastrointestinais. Além disso, os resultados que apresentam inibição, ou neutralização do IL-17F e/ou IL-17A por estes polipéptidos solúveis disponibiliza uma prova de conceito de que eles (ou moléculas semelhantes) podem também ser utilizados para melhorar sintomas nos modelos da colite/IBD e alterar o curso da doença. 3. Psoriase

A psoriase é uma condição crónica da pele que afecta mais do que sete milhões de americanos. A psoriase ocorre, quando as novas células da pele crescem anormalmente, resultando em camadas inflamadas, inchadas, e escamosas de pele, onde a pele antiga não se defendeu suficientemente rápido. A 84 psoríase em placa, a forma mais habitual é caracterizada por camada de pele inflamadas ("lesões") encimadas por escamas brancas prateadas. A psoríase pode estar limitada a algumas placas, ou envolver áreas moderadas ou extensas de pele, que aparecem mais habitualmente no couro cabeludo, joelhos, cotovelos e tronco. Apesar de ser latamente visível, a psoríase não é uma doença contagiosa. A patogénese da doença envolve inflamação crónica dos tecidos afectados. Os polipéptidos solúveis da presente invenção servem como uma terapia valiosa para reduzir a inflamação e efeitos patológicos na psoríase, ou outras doenças da pele, alergias da pele e da mucosa, e doenças relacionadas. A psoríase é uma desordem inflamatória da pele mediada pelas células T que podem provocar um desconforto considerável. É uma doença para a qual não existe cura e afecta as pessoas de todas as idades. A psoríase afecta aproximadamente dois por cento da população europeia e da América do Norte. Apesar de indivíduos com uma psoríase suave poderem muitas vezes controlar a sua doença com agentes tópicos, mais do que um Milão de doentes em todo o mundo necessitam de uma terapia imunosupressiva de ultravioleta ou sistemática. Infelizmente, os inconvenientes e riscos da radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapias limitam a sua utilização a longo termo. Além disso, os doentes possuem geralmente psoríase recorrente e em alguns casos recidem nela, pouco tempo após pararem a imunoterapia. 0 polipéptido solúvel da presente invenção pode ser também utilizado em sistemas de diagnóstico para a detecção de níveis de circulação de IL-17F ou IL-17A, e na detecção de IL-17F ou IL-17A associado com uma resposta inflamatória de fase aguda. Numa concretização relacionada, o polipéptido solúvel da presente invenção pode ser utilizado para 85 detectar a circulação de polipéptidos da IL-17F ou IL-17A que actua localmente. Níveis elevados ou deprimidos de ligando ou receptores polipéptidicos pode ser indicativa de condições patológicas, incluindo inflamação, ou cancro. II-17F é conhecida por induzir uma resposta inflamatória de fase aguda. Além disso, a detecção de proteínas de fase aguda, tais como IL-17a ou IL-17F podem ser indicativas de uma condição de inflamação crónica em determinados estados de doença (por ex. asma, psoríase, artrite reumatóide, IBS, IBS) . A detecção de tais condições servem para auxiliar no diagnóstico, assim como para auxiliar um médico a escolher a terapia adequada.

Para além de modelos de outras doenças aqui descritos, a actividade dos polipéptidos solúveis da presente invenção no tecido inflamatório derivado das lesões da psoríase humana podem ser medidas in vivo utilizando um modelo de ratinho combinado imunodeficiente grave (SCID). Vários modelos de ratinho forma desenvolvidos em que as células humanas são implantadas em ratinhos imunodeficientes (referidos colectivamente como modelos xenográficos); ver, por exemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994 e Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Como um modelo xenográfico in vivo para a psoríase, o tecido da pele da psoríase humana é implantado no modelo SCID de ratinho e desafiado com um antagonista adequado. Além disso, outros modelos animais da psoríase do estado da técnica podem ser utilizados para avaliar antagonistas de IL-17A e IL-17F. Além disso, outros modelos animais da psoríase do estado da técnica podem ser utilizados para avaliar antagonista de IL-17A e IL-17F, tais como enxertos de pele de psoríase humana implantados no modelo do ratinho de AGR129, e desafiados com um antagonista apropriado (por ex., ver, Boyman, 0. et al., J. Exp. Med. Online publication #20031482, 2004). O 86 polipéptido solúvel da presente invenção que se liga, bloqueia, inibe, reduz, antagoniza ou neutraliza a actividade de IL-17A e IL-17F pode ser utilizado neste modelo. De forma semelhante, tecidos, ou células derivadas de IBD, IBS, artrite, ou outras lesões inflamatórias podem ser utilizadas no modelo SCID para avaliar as propriedades anti-inflamatórias dos antagonistas de IL-17A e IL-17F aqui descritos.

As terapias desenhadas para abolir retardar ou reduzir a inflamação utilizando o polipéptido solúvel da presente invenção pode ser testado administrando aos ratinhos SCID com tecido inflamatório humano (por ex. lesões de psoriase e semelhantes) , ou outros modelos aqui discutidos. A eficácia do tratamento é medida e avaliada estatisticamente como efeito anti-inflamatório acrescido na população tratada ao longo do tempo utilizando processos bem conhecidos do estado da técnica. Alguns processos da invenção, incluem, mas não estão limitados a medir por exemplo, num modelo de psoriase, a espessura epidérmica, o número de células inflamatórias na derme superior, e os graus de paraqueratose. Tais processos são conhecidos do estado da técnica e aqui descritos. Por exemplo, ver Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, T. M. e tal. J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. et al. Microbiol.Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. et al. J. Dermatol. 144:931, 2001: Boehncke, W. H. et al. Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H. et al. J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H. et al. J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sei. 17:85, 1998; e Villadsen L. S. et al. J. Clin. Invest. 112:1571, 2003. A inflamação pode também ser monitorizada ao longo do tempo utilizando processos bem conhecidos, tais 87 como citometria de fluxo (ou PCR) para quantificar o número de células inflamatórias ou de lesões presentes numa amostra, avaliar para IBD (perda de peso, diarreia, sangramento rectal, comprimento do cólon), pontuação da doença da pata e avaliação da inflamação para o modelo de CIA RA. Por exemplo, estratégias terapêuticas apropriadas para testar num tal modelo incluem o tratamento directo utilizando antagonistas de IL-17RC solúvel, ou IL-17ITRC/IL-17RA, ou outros IL-17A e IL-17F (isoladamente, ou conjuntamente), ou conjugados relacionados, ou antagonistas baseados na interacção destrutiva de IL-17RC e/ou IL-17RA com os seus ligandos correspondentes. A psoriase é uma doença inflamatória crónica que está associada com os queratinócitos da epiderme hiperplástica e células mononucleares infiltrantes, incluindo células de memória T CD4+, neutrófilos e macrófagos (Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). É habitualmente considerado que antigénios ambientais desempenham um papel importante para iniciar e contribuem para a patologia da doença. Contudo, é a perda de tolerância dos auto-antigénios que se pensa mediar a patologia da psoriase. Pensa-se que células dendriticas e células T CD4+ desempenham um papel importante na apresentação de anti-génios e reconhecimento que medeia a resposta imunitária conduzindo à patologia. Desenvolvemos recentemente um modelo de psoriase baseado no modelo de transferência CD4+CD45RB (Davenport et al., International Pharmacol., 2:653-672). O polipéptido solúvel da presente invenção é administrado aos ratinhos. Pontuação da inibição da doença indica (lesões da pele, citocinas inflamatórias) a eficácia daqueles polipéptidos solúveis na psoriase. 4. Asma 88 A IL-17 desempenha um papel importante na activação das células T induzido pelo influxo nas vias respiratórias de alergenos e neutrófilos. 0 receptor para IL-17 é expresso nas vias respiratórias (Yao, et al. Immunity 3:811 (1995)) e IL-17 mediada por recrutamento dos neutrófilos na asma alérgica é largamente induzida pelo quimioatractante IL-8, GRO-β e proteína inflamatória-2 dos macrófagos (MIP-2) produzidas por IL-17 estimulou células bronquiais epiteliais humanas (HBECs) e fibroblastos bronquiais humanos (Yao, et al. J. Immunol 155:5483 (1995)); Molet, et al. J. Allergy

Clin Immunol 108:430 (2001). IL-17 também estimulou HBECs para libertar IL-6, um factor de activação do neutrófilo (Fossiez, et al, J. Exp Med 183:2593 (1996), e Linden, e tal. Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001)) e foi demonstrado possuir sinergia com TNF-α para prolongar a sobrevivência de neutrófilos humanos in vitro (Laan et al., Eur Respir J 21:387 (2003)). Além disso, o IL-17 é capaz de amplificar as respostas inflamatórias na asma, através da sua capacidade de aumentar a secreção de citocinas implicadas na remodelação das vias respiratórias, tais como as citocinas profibróticas, IL-6, e IL-11 e factor estimulante dos mediadores inflamatórios da colónia de granulócitos (G-CSF) e factor de estimulação da colónia de granulócitos macrofagos (GM-CSF) (Molet et al., J. Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)). A evidência clínica demonstra que exacerbações graves de asma aguda, estão associadas com o recrutamento e activação de neutrófilos nas vias respiratórias, assim o IL-17 é provável desempenhar um papel significativo na asma. Doentes com asma suave exibem um aumento detectável na concentração local da proteína IL-17A solúvel livre (Molet et al., J. 89

Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)) enquanto que voluntários humanos saudáveis com inflamação grave das vias respiratórias induzida devido à exposição a um confinamento suino, exibem um crescimento pronunciado na concentração da proteína IL-17A solúvel livre no espaço broncoalveolar (Fossiez et al., J Exp Med 183:2593 (1996), e Linden et al., Int Arch Allergy Imunol 126:179 (2001)). Além disso, os níveis de IL-17 na saliva correlacionaram-se com indivíduos que possuem uma hiper-reactividade acrescida das vias respiratórias (Barczyk et al., Respir Med 97:726 (2003).

Em modelos animais de hiper capacidade de resposta das vias respiratórias, a inalação crónica de ovalbumina por ratinhos sensibilizados resultou na inflamação brônquica eosinofílica e indução da expressão precoce de ARNm de IL-17 e tecido inflamado do pulmão, conjuntamente com neutrófilos brônquicos. (Hellings et al., Am J. Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003). Anticorpos monoclonais anti-IL-17 reduziram fortemente o influxo de neutrófilos bronquiais, mas aumentaram significativamente os níveis de IL-5 no fluido de lavagem bronquialveolar e soro, e agravaram o influxo eosinofílico bronquial induzido por alergenos, sugerindo que IL-17A pode estar envolvido na determinação do equilíbrio entre neutrófilos e acumulação de eosinífilos a seguir a insulto por antigénio (Id.)

Entre os membros da família de IL-17, a IL-17 é a que se encontra mais relacionada com IL-17A. As actividades biológicas mediadas por IL-17F são semelhantes àquelas da IL-17A, em que IL-17F estimula a produção de IL-6, IL-8 e G-CSF. (Hurst et al., J Immunol 169:443 (2002)). A IL-17F também induz a produção de IL-2 o factor de crescimento de transformação (TGF)-p, e a proteína quimioatractora (MCP) em células endoteliais. (Starnes et al., J. Immunol 167:4137 (2001). De forma semelhante o desfio por alergenos pode 90 aumentar IL-17F local em doentes com asma alérgica. (Kawaguchi et al., J Immunol 167:4430 (2001)). A administração genica de IL-17F de murino aumenta os neutrófilos no espaço bronqueoalveolar, enquanto que a transferência da mucosa do gene IL-17F aumenta os níveis de neutrófilos pulmonares induzidos por Ag e a resposta das vias respiratórias à metacolina. (Oda et al., Am J Respir Crit Care Med 171:12 (2005)).

Para além da asma, várias doenças inflamatórias crónicas das vias respiratórias são caracterizadas por recrutamento neutrófilo nas vias respiratórias e a IL-17 foi reportada desempenhar um papel importante na patogénese das condições respiratórias, tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), e fibrose cística (Linden et al., Eur Respir J 15:973 (2000); Ye et al., Am J Respir Cell Mol Biol 25:335 (2001), Rahman, et al. Clin. Immunol 115:268 (2005)). Uma molécula terapêutica anti-IL-17A e/ou anti IL-17F poderia ser demonstrado ser eficaz para a doença inflamatória crónica das vias respiratórias num modelo in vitro de inflamação. A capacidade de antagonistas para a actividade de IL-17F e/ou IL-17A, tais como os receptores solúveis IL-17RC e seus anticorpos incluindo os anticorpos os anticorpos anti-humanos-IL-17RC monoclonais e neutralizantes da presente invenção para inibir IL-17A e/ou a citocina induzida por IL-17F e a produção de quimocinas de HBECs cultivadas, ou de fibroblastos bronquiais pode ser utilizada como uma medida da eficácia de tais antagonistas na prevenção da produção de mediadores inflamatórios resultando directamente da estimulação de IL-17A e/ou F. Se a adição dos antagonistas, tais como o polipéptido solúvel da presente invenção, em relação a IL-F e/ou à actividade de IL-17A reduz marcadamente a produção e expressão de mediadores inflamatórios, Seia de esperar ser eficaz nos 91 aspectos inflamatórios associados com a inflamação crónica das vias aéreas. 5. Síndroma do Intestino Irritado ("IBS") 0 síndroma do intestino irritado representa uma doença caracterizada pela dor abdominal ou desconforto e um hábito intestinal errático. Doentes de IBS podem ser caracterizados em três grupos principais baseados nos hábitos intestinais : aqueles de fezes soltas ou frequentes, aqueles com fezes frequentemente duras ou não frequentes, e aqueles com fezes variáveis ou normais (Rally et al., 2002). Motilidade intestinal alterada, anormalidades na função epitelial, trânsito anormal de fezes e gás, e stress, pode contribuir para os sintomas, enquanto que a hipersensibilidade visceral é uma característica chave na maior parte dos doentes. Factores genéticos que afectam a sinalização da dor e distúrbios no processamento central de sinais aferentes são postulados para predispor indivíduos a IBS a seguir a exposições ambientais específicas. Estudos também demonstraram que as respostas inflamatórias no cólon pode contribuir para o aumento da sensibilidade do músculo liso e nervos entéricos e perturbar por isso funções senso-motoras no intestino (Collins et al., 2001). Existe uma sobreposição clínica entre IBS e IBD, com sintomas semelhantes a IBS reportados frequentemente nos doentes antes do diagnóstico de IBD, e sintomas de IBS, mais elevados do que o esperado em doentes em remissão de IBD estabelecida. Assim, estas condições podem coexistir com uma frequência mais elevada do que o esperado, ou podem existir num contínuo, com IBS e IBD nos diferentes terminais do mesmo espectro. Contudo, deveria ser salientado que na maior parte dos doentes de IBS, especímenes colónicos de biopsia parecem normal. No entanto, 92 IBS afecta significativamente um grande número de indivíduos (prevalência nos EUA em 2000, aproximadamente 16 milhões de indivíduos), resultando num custo total de 1,7 biliões de dólares (ano 2000). Assim, entre as doenças gastrointestinais mais prevalentes e onerosas a IBS está no segundo lugar em relação à doença de refluxo gastro-esofágico (GERD). No entanto, ao contrário do tratamento de GERD, o tratamento para IBS permanece não satisfatório (Talley et al. 2002; Farhadi et al., 21001; Collins et al., 2001) , demonstrando que IBS representa claramente uma necessidade médica não satisfeita.

Modelos de doença convergentes foram propostos que postulam uma capacidade de resposta acrescida, ou neural, circuitos imunes, ou neuroimunes no sistema nervoso central (CNS) ou no intestino para perturbações centrais (psicossociais), ou periféricas (irritação do tecido, inflamação, infecção) da normal homeostase (Talley et al., 2002) . Estes resultados de capacidade de resposta na desregulação da motilidade do intestino, função epitelial (imunidade, permeabilidade), e hipersensibilidade visceral que por sua vez resulta em sintomas de IBS.

Pode haver um papel para várias moléculas na patogénese de IBS incluindo um papel para moléculas que estimulam neurões e aquelas que estão envolvidas na iniciação de um processo inflamatório. Várias das moléculas do nosso portfolio são conhecidas por ligadas a actividade possível em neurões devido à sua expressão directa por neurões, ou expressão dos seus receptores em neurões, incluindo IL-17D, IL-17B e IL-31. Além disso, vários membros da família de IL-17 e moléculas relacionadas foram associadas com a inflamação no intestino, incluindo IL-17A, IL-17F, IL-23 e IL-31. 93 A eficácia de inbidores destas moléculas poderia ser testada in vivo em modelos de animais da doença. Vários modelos animais foram propostos que mimetizam as suas caracteristicas chave de IBS e envolvem estimulos dirigidos centralmente para um alvo (stress), ou estimulos perifericamente dirigidos (infecção, inflamação). Dois exemplos de modelos animais in vivo que podem ser utilizados para determinar a eficácia dos inibidores no tratamento de IBS são (i) modelos que se focam na patogénese primária dirigida ao CNS de IBS (modelos de stress) , e (ii) modelos que se focam em indutores de stress dirigidos ao intestino (i.e inflamação do intestino, infecção ou stress físico). Deverá ser salientado contudo, que acontecimentos no CNS, ou no tracto gastrointestinal (GI) não ocorrem isolados e que sintomas de IBS resultam mais provavelmente de uma interacção completa entre sinais do CNS em GI e vice versa. J) Formulações farmacêuticas

Para utilização farmacêutica, o péptido solúvel da presente invenção é formulado para administração parenteral, particularmente intravenosa, ou subcutânea de acordo com processos convencionais. Uma administração intravenosa pode ser por injecção em bolus, libertação controlada, por ex. utilizando mini-bombas ou outra tecnologia adequada, ou por infusão durante um período típico de uma a várias horas. Em geral, formulações farmacêuticas vão incluir uma proteína hematopoiética em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como soro fisiológico, soro fisiológico tamponizado, 5% de dextrose em água, ou semelhante. As formulações podem ainda incluir um ou mais excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tampão, albumina para evitar perda de proteína nas superfícies dos 94 frascos de vidro, etc. Quando se utiliza uma tal terapia de combinação, as citocinas podem ser combinadas numa formulação única, ou pode ser administrada em formulações separadas. São bem conhecidos do estado da técnica processos de formulação e são revelados, por exemplo em Remington Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990. Doses terapêuticas vão estar geralmente na gama de 0,1 a 100 mg/kg de peso do doente por dia, preferencialmente 0,5-20 mg/kg por dia com a dose exacta determinada pelo clinico de acordo com os padrões aceites entrando em consideração com a natureza e severidade da condição a ser tratada, características de doentes, etc. A determinação da dose encontra-se no âmbito dos conhecimentos de um vulgar perito no estado da técnica. As proteínas são habitualmente administradas ao longo de um período até 28 dias após a quimioterapia, ou transplante de medula óssea, ou até ser conseguida uma contagem de plaquetas até > 20000/mm3, preferencialmente >50000/mm3. Mais habitualmente, as proteínas são administradas ao longo de uma semana, ou menos, muitas vezes ao longo de um período de um a três dias. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipéptido solúvel da presente invenção numa quantidade suficiente para produzir um aumento clínico significativo na proliferação e/ou diferenciação de células progenitoras linfoides ou mieloides que serão manifestadas como um aumento nos níveis de circulação de células maduras (por ex. plaquetas ou neutrófilos). O tratamento de desordens de plaquetas será então continuado até uma contagem de plaquetas de pelo menos 20000/mm3, preferencialmente 50000/mm3 ser atingida. O polipéptido solúvel da presente invenção pode também ser administrado em combinação com outras citocinas, tais como IL-3, -6 e -11; factor de célula embrionária, eritropoietina, G-CSF e GM-CSF. Nos regimes da 95 terapia de combinação as doses diárias de outras citocinas vão ser em geral: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 lg/kg; IL-3, 1-5 lg/kg, e G-CSF, 1-25 1 g/kg. A terapia de combinação com EPO, por exemplo é indicada em doentes anémicos com baixos níveis de EPO.

Geralmente a dosagem do polipéptido solúvel administrado vai variar dependendo de tais factores, tal como a idade do doente, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médica prévia. Tipicamente é desejável disponibilizar o sujeito com uma dosagem de tal polipéptido solúvel que se encontra na gama de cerca de 1 pg/kg a 10 mg/kg a 10 mg/kg (quantidade de agente/peso do doente) apesar de uma dosagem mais pequena, ou mais elevada poder ser administrada ditada pelas circunstâncias. A administração do péptido solúvel da presente invenção a um sujeito pode ser intravenosa, intra-arterial, intraperitonial, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal por perfusão, através de um cateter regional, ou através de injecção intralesional. Quando se administram proteínas terapêuticas por injecção, a administração pode ser efectuada, através de infusão contínua ou através de bolus único, ou bolus múltiplos.

Vias de administração adicionais incluem a via oral, através de mucosas-membranas, via pulmonar e transcutânea. A administração oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinoides, microesferas de policianoacrilatos, e sistemas à base de lípidos (ver, por exemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins, " in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.) páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). A capacidade de administração intranasal é exemplificada, através de um tal modo de administração de insulina (ver, por exemplo, Hinchcliffe e 96

Illum, Adv. Drug Deliv. Ver. 35:199 (1999)). Podem ser preparadas partículas secas, ou líquidas compreendendo o polipéptido solúvel e inaladas com o auxílio de dispersantes de pó seco, geradores de aerossóis líquidos, ou nebulizadores (por ex. Pettit e Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Ver. 35:235 (1999)). Esta abordagem é ilustrada pelo sistema de gestão da diabetes AERX, que é um inalador electrónico manual que administra aerossol de insulina aos pulmões. Os estudos mostraram que proteínas tão grandes como 48000 kDa foram administradas através da pele em concentrações terapêuticas com o auxilio de ultra-sons de baixa frequência que ilustram possibilidade de administração transcutânea (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). A administração transdérmica utilizando electroporaçâo disponibiliza outros meios para administrar o polipéptido solúvel da presente invenção (Potts et al. Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

Uma composição farmacêutica compreendendo o polipéptido solúvel da presente invenção pode ser formulada de acordo com processos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que as proteínas terapêuticas são combinadas numa mistura com veículos farmaceuticamente aceitáveis. Uma composição é dita ser "um veiculo farmaceuticamente aceitável" se a sua administração puder ser tolerada por um doente receptor. Solução salina de tampão fosfato é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veiculos adequados são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995) .

Para fins de terapia, o polipéptido solúvel da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável são administrados a um doente numa quantidade 97 terapeuticamente eficaz. Uma combinação de uma molécula terapêutica da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável é dito ser administrado "numa quantidade terapeuticamente eficaz" da presente invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável é dito ser administrado numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente se a sua presença resultar numa alteração detectável na fisiologia de um doente receptor. Por exemplo, um agente utilizado para tratar inflamação é fisiologicamente significativo se a sua presença aliviar a resposta inflamatória.

Uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido solúvel da presente invenção pode ser fornecida na forma líquida, num aerossol, ou na forma sólida. Formas líquidas são ilustradas, através de soluções injectáveis e suspensões orais. A título de exemplo formas sólidas incluem cápsulas, comprimidos, e formas de libertação controlada. As últimas formas são ilustradas por bombas mini osmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery, " in Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 125-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps, " in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).

Os lipossomas fornecem meios de administrar polipéptidos terapêuticos a um sujeito por via intravenosa, intraperitonial, intratecal, intramuscular, subcutânea, ou via administração oral, inalação, ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas que 98 consistem numa ou várias bicamadas lipidicas que circundam compartimentos aquosos (ver em geral, Bakker-Woudenberg e tal., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1) :S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), e Ranade, "Site-

Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers, "in Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Os lipossomas são semelhantes em composição a membranas celulares e como resultado, os lipossomas podem ser administrados de forma segura e são biodegradáveis. Dependendo do processo de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares, e os lipossomas podem variar de tamanho com diâmetros que vão de 0,02 ym a superior a 10 ym. Uma grande variedade de agentes pode ser encapsulada em lipossomas: partição de agentes hidrofóbicos nas bicamadas e partição de agentes hidrofilicos no(s) espaço(s) interior(es) aquoso(s) (ver, por exemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), e Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Além disso, é possivel controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado variando o tamanho dos lipossomas, o número de bicamadas, composição de lipidos, assim como a carga e as caracteristicas da superfície dos lipossomas.

Os lipossomas podem-se adsorver a qualquer tipo de células e depois libertarem lentamente o agente de encapsulação. Alternativamente, um lipossoma absorvido pode sofrer endocitose pelas células que são fagocíticas. A endocitose é seguida por degradação intra-lipossomal dos lipidos do cromossoma e libertação dos agentes de encapsulação (Scherphof et al., Ann- N. I Acad. Sei. 446:368 (1985)). Após administração intravenosa, pequenos lipossoma (0,1 a 1,0 ym) são tipicamente recebidos pelas células do sistema retículo endotelial, localizado principalmente no 99 fígado e no baço, em que os lipossomas maiores do que 3,0 ym são depositados nos pulmões. A absorção preferencial de lipossomas mais pequenos pelas células do sistema retículo endotelial foi utilizada para fornecer agentes quimioterapêuticos a macrófagos e a tumores do fígado. O sistema retículo endotelial pode ser contornado, através de vários métodos incluindo saturação com grandes doses de partículas de lipossomas, ou inactivação selectiva de macrófagos, através de meios farmacológicos (Claassen et al. Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1994)). Além disso, a incorporação de fosfolípidos derivatizados com glicolípidos ou com polietilenoglicol nas membranas dos lipossomas foi demonstrado resultar numa absorção reduzida significativa pelo sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

Também podem ser preparados lipossomas para tomar como alvo células em particular ou órgãos variando a composição fosfolipídica ou inserindo receptores ou ligandos nos lipossomas. Por exemplo, lipossomas preparados com um teor elevado de um agente tensioactivo não iónico tem sido utilizado para tomar como alvo o fígado (Hayakawa et al., Patente Japonesa 04-244,018; Kato et al., Biol. Pharm. Buli. 16:960 (1993)). Estas formulações foram preparadas misturando fosfatidilcolina, α-tocoferol, e óleo de castor hidrogenado etóxilado (HCO-60) em metanol, concentrando a mistura sob vácuo, e depois reconstituindo a mistura com água. Foi também demonstrado que uma formulação lipossomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) com uma mistura de esterilglicósido derivado da soja (SG) e colesterol (Ch)toma como alvo o fígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Buli. 20:881 (1997)) . 100

Alternativamente vários ligandos alvo podem ser ligados à superfície do lipossoma, tal como anticorpos, fragmentos de anticorpos, hidratos de carbono, vitaminas, e proteínas de transporte. Por exemplo, os lipossomas podem ser modificados com derivados de galactosillípidos do tipo ramificado para tomarem como alvo receptores da asialoglicoproteína (galactose) que são expressos exclusivamente sobre a superfície de células do fígado (Kato e Sugiyama, Crit. Ver. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm Buli. 20:259 (1997)). De forma semelhante Wu et al., Hepatology 27:772 (1998), mostraram que a marcação de lipossomas com asialofetuína conduziu a uma semi-vida mais curta do lipossoma no plasma e aumentou muito a absorção do lipossoma marcado com asialofetuína por hepatócitos. Por outro lado, a acumulação hepática de lipossomas compreedendo derivados de galactosillípidos do tipo ramificado pode ser inibida por pré-injecção de asialofetuína (Murahashi et al., Biol. Pharm. Buli. 20:259 (1997)). Lipossomas poliaconitilados de albumina do soro humano fornecem outra abordagem para dirigir lipossomas para células do fígado (Kamps et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:11681 (1997)). Além disso, Geho et al. Patente de invenção US N° 4,603,044 descrevem um sistema de administração de vesículas de lipossomas dirigido para os hepatócitos, que possui especificidade para receptores hepatobiliários associados com as células metabólicas do fígado especializadas.

Numa abordagem mais geral para tomar como alvo tecido, as células alvo são pré-marcadas com anticorpos biotinilados específicos para um ligando expresso pela célula alvo (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Ver. 32:99 (1998)). Após a eliminação do plasma de anticorpos livres são administrados lipossomas conjugados com estreptavidina. Numa outra abordagem, anticorpos alvo estão directamente ligados a 101 lipossomas (Harasym et al., Adv. Drug. Deliv. Ver. 32:99 (1998)) .

Polipéptidos e anticorpos podem ser encapsulados dentro de lipossomas utilizando técnicas padrão de microencapsulação de proteínas (ver, por exemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Câncer Res. 50: 1853 (1990), e Cohen et al, Biochim.

Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alvin et al. "Preparation and Use of Lipossomes in Immunological Studies, "in Liposome Technology, 2a Edição, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth Enzymol. 149:124 (1987)). Como referido acima, lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivados lipídicos de poli(etileno glicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)) .

Foram concebidas microesferas de polímeros degradáveis para manter elevados níveis sistémicos de proteínas terapêuticas. São preparadas microsferas a partir de polímeros degradáveis, tais como poli(lactide-co-glicólido) (PLG), polianidridos, poli(ortoésteres), polímeros não biodegradáveis de etinilacetato, em que as proteínas ficam presas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery, "in Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery" em "Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds), páginas 45-92 (Plenum Press 1997) ; Bartus e tal., Science 281:1161 (1998); Putney e Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Nanoesferas revestidas de polietileno-glicol (PEG) podem também disponibilizar veículos para 102 administração intravenosa de proteínas terapêuticas (ver, por exemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)).

Outras formas de dosagem podem ser concebidas pelo perito no estado da técnica, como indicado por exemplo por Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5a Edição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995), e por Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) .

Como ilustração as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit compreendendo um recipiente que compreende o polipéptido solúvel da presente invenção. Pode ser fornecido o polipéptido terapêutico na forma de uma solução injectável para doses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injecção. Alternativamente, um tal kit pode incluir um dispersante de pó seco, um gerador de aerossóis líquidos, ou nebulizador para administração de um polipéptido terapêutico. Um tal kit pode compreender ainda informação escrita, ou indicações e utilização da composição farmacêutica. Além disso, tal informação pode incluir uma declaração de que a composição é contra indicada em doentes com hipersensibilidade conhecida a IL-17RC OU IL-17RA. A presente invenção contempla composições do polipéptido solúvel da presente invenção, e processos e utilizações terapêuticas compreendendo o mesmo polipéptido aqui descrito. Tais composições podem ainda compreender um veículo. O veículo pode ser um veículo convencional orgânico, ou inorgânico. Exemplos de veículos incluem água, solução tampão, álcool, propilenoglicol, macrogol, óleo de sésamo, óleo de milho e análogos. K) Produção de Ratinhos Transgénicos 103

Ratinhos transgénicos podem ser sujeitos a engenharia para sobre-expressarem o gene da IL-17F, IL-17A, IL-17RA ou IL-17RC em todos os tecidos ou sob o controlo de elemento regulador especifico do tecido, ou preferido do tecido. Estes sobre-produtores podem ser utilizados para caracterizar o fenótipo que resulta da sobre-expressão, e os animais transgénicos podem servir como modelos da doença humana provocada por excesso de IL-17F, IL-17A, IL-17RA ou IL-17RC. Ratinhos transgénicos que sobre-expressam, qualquer um destes disponibilizam bioreactores modelo para a produção de IL-17RA ou IL-17RC, tais como qualquer um dos polipéptidos solúveis da presente invenção no leite ou no sangue de animais maiores. Processos para produzir ratinhos transgénicos são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", "in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press Ltd. 1994), Monastersky e Rob 1 (eds.), Strategies in Trangenic Animal Science (ASM Press 1995), e Abbud e Nilson, Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice, "in Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez e Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)).

Por exemplo, um processo para produzir um ratinho transgénico que expressa o gene IL-17RC pode iniciar-se com machos férteis adultos (reprodutores) (B6C3fl, 2-8 meses de idade (Taconic Farms, German town, NI)), machos vasectomizados (inoperantes) (B6D2fl, 2-8 meses, (Taconic Farms)), fêmeas férteis pré-pubescência (doadores) (B6C3fl, 4-5 semanas, (Taconic Farms)) e fêmeas adultas férteis (receptoras) (B6D2fl, 2-4 meses, (Taconic Farms)). Os doadores são aclimatizados durante uma semana e depois 104 injectados com aproximadamente (IU/ratinho de gonadotropina de soro de égua grávida (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I. P. e 46-47 horas mais tarde, 8IU/ de ratinho de gonadotropina coriónica humana (hCG (Sigma)) I. P. para induzir super ovulação. As doadoras são acasaladas com animais reprodutores após as injecções de hormonas. A ovulação geralmente ocorre dentro de 13 horas da injecção de hCG. A cópula é confirmada pela presença de um tampão vaginal na manhã após o acasalamento.

Ovos fertilizados são colhidos com um escopo cirúrgico. Os ovidutos são colhidos e os ovos são libertados em lâminas de análise de urina contendo hialuronidase (Sigma). Os ovos são lavados uma vez em hialuronidase, e duas vezes em meio Whitten's W640 (descrito por exemplo, por Menino e 0'Claray, Biol. Reprod. 77:159(1986), e Dienhart e Downs, Zygote 4:129 (1996)) que foi incubado com 5% de C02, 5% de 02, e 90% de N2 a 37°C. Os ovos são então armazenados a 37°C/ num incubador com 5% de C02 até à microinjecção.

Dez a vinte microgramas de ADN de plasmideo contendo uma sequência de IL-17RC que codifica para IL-17RC é linearizada, purificada em gel e novamente suspensa em 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 0,25 mM de EDTA (pH 8,0), com uma concentração final de 5-10 nanogramas por microlitro para microinjecção. Por exemplo, as sequências que codificam para IL-17RC podem codificar para um polipéptido compreendendo resíduos de aminoácidos 21 a 452 da SEQ ID N° 2. O plasmideo de ADN é microinjectado em ovos colhidos contido numa gota de meio W640 coberto por óleo mineral quente equilibrado com 002. O ADN é arrastado para uma agulha de injecção (puxado a partir de um capilar de 0,75 mm num capilar de vidro de borossilicato de 1 mm de diâmetro externo) e injectado em ovos individuais. Cada ovo é 105 penetrado com a agulha de injecção num ou em ambos os pró-núcleos haploides.

Picolitros de ADN são injectados nos pró-núcleos e a agulha de injecção retirada sem ficar em contacto com os núcleos. 0 procedimento é repetido até todos os ovos serem injectados. Os ovos microinjectados viáveis são transferidos para uma placa de cultura de tecido de órgãos com meio W640 pré-gaseado para armazenamento de um dia para o outro num incubador a 37°C/ 5% de CO2.

No dia seguinte, embriões de duas células são transferidos em recipientes de pseudo-gravidez. Os recipientes são identificados pela presença de tampões de copulação, após cópula com animais inoperantes vasectomizados. As receptoras são anestesiadas e rapadas do lado dorsal esquerdo e transferidas para um microscópio cirúrgico. É efectuada uma pequena incisão na pele e através da parede do músculo no meio da área abdominal delimitada pela caixa toráxica, pelo lombo, e pela pata traseira a meio caminho entre o joelho e o baço. Os órgão reprodutores são exteriorizados para um pequeno pano cirúrgico. A camada de gordura é estendida sobre o pano cirúrgico e um grampo para bebé (Roboz, Rockville, MD) é ligado à camada de gordura e deixada pendurada sobre as costas do ratinho evitando que os órgãos escorreguem de novo para dentro.

Com uma pipeta de transferência fina contendo o óleo mineral seguido por W640 e bolhas de ar alternados, 12-17 embriões de duas células saudáveis da injecção do dia anterior são transferidos para o recipiente. A ampola inchada é localizada e mantendo o oviduto entre a ampola e a bursa é efectuado um corte no oviduto com uma agulha de 28 g perto da bursa assegurando que a ampola ou a bursa não sejam rasgadas. 106 A pipeta é transferida para o corte no oviduto e os embriões são soprados para dentro permitindo que a primeira bolha de ar se escape da pipeta. A camada de gordura é empurrada suavemente para o peritoneu, e deixa-se escorregar para dentro os órgãos reprodutores. A parede do peritoneu é fechada com uma sutura e a pele é fechada com um grampo de feridas. O ratinho recuperou sobre uma lâmina quente a 37°C durante um mínimo de quatro horas.

Os recipientes voltam para as gaiolas em pares, e deixados 19-21 dias de gestação. Após o nascimento, 19-21 dias o pós-parto é permitido antes do desmame. Os animais desmamados são sexuados e colocados em gaiolas separadas por sexo, e uma biopsia de 0,5 cm (utilizada para genotipagem) é cortada da cauda com tesouras limpas. O ADN genómico é preparado a partir pedaços de cauda utilizando por exemplo, um kit seguindo as instruções do fabricante. 0 ADN genómico é analisado por PCR utilizando iniciadores desenhados para amplificar um gene de IL-17RC, ou um gene marcador seleccionável que foi introduzido no mesmo plasmídeo. Após os animais terem sido confirmados como transgénicos são retrocruzados numa estirpe consanguínea colocando uma fêmea transgénica com um macho do tipo selvagem, ou um macho transgénico com uma, ou duas fêmeas do tipo selvagem. Como as crias nascem e são desmamados, os sexos são separados e as suas caudas são cortadas para genotipagem.

Para verificar a expressão de um transgénico num animal vivo é efectuada uma hepatectomia parcial. É efectuada uma preparação cirúrgica ao abdómen superior directamente abaixo do processo xifoide. Utilizando uma técnica estéril, uma pequena incisão de 1,5-2 cm é efectuada abaixo do esterno e o lobo lateral esquerdo do fígado é exteriorizado. É efectuado um laço utilizando seda 4-0 à volta do lobo mais 107 baixo segurando-o fora da cavidade corporal. Um grampo atraumático é utilizado para manter o laço, enquanto que um segundo laço de Dexon absorvível (American Cyanamide: Wayne, N. J.) é colocado proximal ao primeiro laço. É efectuado um corte distai a partir do laço de Dexon e aproximadamente 100 mg do tecido de fígado excisado é colocado numa placa de petri estéril. A secção de fígado excisada é transferida para um tubo de fundo redondo de 14 ml de propileno e quebrada congelado em azoto líquido e depois armazenado em gelo seco. O local cirúrgico é fechado com sutura e grampos de feridas e a gaiola do animal é colocada numa placa de aquecimento a 37 °C durante 24 horas após a operação. O animal é verificado 24 horas após a operação. O animal é verificado diariamente após a operação e os grampos das feridas são removidos 7-10 dias após cirurgia. O nível de expressão de ARNm IL-17RC é examinado para cada ratinho transgénico utilizando um ensaio de hibridação com uma solução de ARN, ou reacção em cadeia da polimerase. "Gene

Para além de produzir ratinhos transgénicos que sobre-expressam IL-17F, IL-17A, IL-17RA, ou IL-17RC é útil submeter a engenharia genética ratinhos transgénicos com uma expressão anormal ou sem expressão destes genes. Tais ratinhos transgénicos fornecem modelos úteis para doenças associadas com uma falta de IL-17F, IL-17A, IL-17RA, ou IL-17RC. Como discutido acima, a expressão de genes IL-17RC pode ser inibida utilizando genes anti-sentido, genes de ribozima, ou genes de sequências guia externas. Por exemplo, para produzir ratinhos transgénicos que sub-expressam o gene IL-17RC, tais sequências inibidoras são dirigidas para o ARNm de IL-17RC. Processos para produzir ratinhos transgénicos que possuem uma expressão anormalmente baixa de um gene em particular são conhecidos dos peritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Wu et al., 108

Underexpression in Cultures Cells and Animais by

AntisenseDNA and RNA Strategies," in Methods in Gene Biotecnology, páginas 205-224 (CRC Press 1997)).

Uma abordagem alternativa para produzir ratinhos transgénicos que possuem uma fraca expressão, ou que não possuem expressão do gene IL-17RC é gerar ratinhos que possuem pelo menos um alelo IL-17RC normal substituído por um gene de IL-17RC não funcional. Um processo para desenhar um gene IL-17RC não funcional é inserir outro gene, tal como um gene marcador seleccionável numa molécula de ácido nucleico que codifica para IL-17RC. Processos padrão para produzir estes ratinhos designados como "inactivados" são conhecidos dos peritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice" in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), e Wu et al., "New Strategies for Gene Knockout", in Methods in Gene Biotechnology, páginas 339-365 (CRC Press 1997)) . A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos

Exemplo 1

Expressão do gene IL-17RC

Foram efectuadas transferências de Northern utilizando blots de tecido múltiplo humano (Clontech Laboratories, Inc., Paio Alto, CA). Foram geradas duas sondas a partir de produtos PCR purificados a partir de gel. A primeira sonda foi efectuada utilizando C21798 (5'CGG CGT GGT GGT CTT GCT 109 CTT 3'; SEQ ID N°:8) e ZC21808 (5' TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3'; SEQ ID N° 31) como iniciadores. A sonda foi marcada radioactivamente utilizando um kit de marcação "Multiprime" da Amersham (Arlington Heights, IL) de acordo com o

protocolo do fabricante. A sonda foi purificada utilizando uma coluna de aplicação de diferencial de pressão pneumática Nuc Trap (Stratagene, La Jolla, CA) . Solução ExpressHyb (Clontech) foi utilizada para pré-hibridização e soluções de hibridização para a transferência de Northern. A hibridização foi efectuada de um dia para o outro a 65°C. Após hibridação cada blot foi lavado durante 30 minutos cada um em soluções que continham 0,1% SDS e SSC como se segue: duas vezes em 2xSSC à temperatura ambiente, três vezes em 0,lxSSC a 50°C, uma vez em 0,lxSSC a 55°C, e uma vez em O.IxSSC a 65°C. Os resultados demonstraram que o gene de IL-17R é fortemente expresso na tiróide, glândula adrenal, próstata, e tecidos do fígado e expresso em menor grau no coração, intestino delgado, estômago, e tecidos de traqueia. Em contraste não existe, ou existe pouca expressão no cérebro, placenta, pulmão, músculo esquelético, rim, pâncreas, baço, timo, testículo, ovário, cólon, leucócitos de sangue periférico, cordão umbilical, nódulo linfático e medula óssea.

Exemplo 2

Distribuição de ARNm em painéis de linhas celulares utilizando PCR O ARN total foi purificado a partir de linhas celulares em repouso e estimuladas cultivadas no nosso laboratório e purificadas utilizando um kit Qiagen (Valência, CA) RNeasy de acordo com as instruções, ou um protocolo de purificação de ácido-fenol (Chomczynski e Sacchi, Analytical Biochemistry, 110 162:156-9, 1987). A qualidade do ARN foi avaliada correndo uma aliquota num Agilent Bioanalyzer. Se o ARN foi

significativamente degradado não foi utilizado para a criação subsequente da primeira cadeia de ADNc. A presença de ADN genómico contaminante foi avaliada, através de um ensaio por PCR numa aliquota do ARN com zc41011 (5' CTCTCCATCCTTATCTTTCATCAAC 3'; SEQ ID N° 32) e zc41012 (5'CTCTCTGCTGGCTAAACAAAACAC 3'; SEQ ID N° 33), iniciadores que amplificam um local único de ADN genómico intergénico. As condições de PCR para o ensaio de ADN genómico contaminante foram as seguintes: 2,5 pL lOx tampão e 0,5 pL de mistura de ADN polimerase Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA), 2 pL 2,5 mM dNTP mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 pL 10X Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA), e 0,5 pL de 20 pM zc41011 e zc41012, num volume final de 25 pL. Os parâmetros de ciclização foram 94°C 20'', 40 ciclos de 94°C 20"' 60°C 1'20'' e um ciclo de 72°C 1' . Sujeitou-se 10 pL de cada reacção a electroforese em gel de agarose e os geles foram examinados, quanto à presença de um produto PCR de ADN genómico contaminante. Se foi observado ADN genómico contaminante, o ARN total foi ADNsed utilizando reagentes isentos de ADN (Ambion, Inc. Austin, TX) de acordo com as instruções do fabricante, depois foi novamente testado como descrito acima. Apenas os ARN que pareciam estar isentos de ADN genómico contaminante foram utilizados para a criação subsequente da primeira cadeia de ADNc.

Perfez-se o volume de 20 pL de ARN total de 82 linhas celulares humanas cada uma com H20 até 98 pL, depois separou-se em duas aliquotas de 4 9 pL, contendo cada uma 10 pg de ARN total, e colocados em duas placas PCR de 96 poços. A cada aliquota adicionou-se reagentes para a sintese da primeira cadeia de ADNc (Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System, Carlsbad, CA): 20 pL de 25 mM de MgCl2, 10 pL lOx tampão RT, 10 111 pL de 0,1 M DTT, 2 pL de ARNseOut. Depois adicionou-se a uma aliquota de cada linha celular 2 pL de Superscript II Reverse Transcriptase, e adicionou-se a cada aliquota da linha celular correspondente, 2 pL de H20 para fazer um controlo negativo de transcriptase reversa menos. Todas as amostras foram incubadas como se segue: 25°C 10', 42°C 50', 70°C 15'. As amostras foram dispostas em placas de poços profundos e diluídas com l,7ml de H20. Um robot Multipett (Saigan) foi utilizado para adicionar alíquotas de 16,5 pL em cada poço de uma placa PCR de 96 poços várias vezes gerando numerosos painéis PCR de uma utilização das linhas celulares que foram então selados e armazenados a -20°C. Cada poço nesses painéis representa uma primeira cadeia de ADNc de aproximadamente 100 ng de ARN total. As 82 linhas celulares são espalhadas através de dois painéis, matriz #118A e #118B. A qualidade da primeira cadeia de ADNc nos painéis foi avaliada através de um ensaio PCR multiplex num conjunto de painéis utilizando iniciadores de dois genes largamente expressos, mas apenas moderadamente abundantes, CLTC (clatrina) e TFRC (receptor da transferrina C) . 0,5 pL de cada iniciador de clatrina zc42901 (5' CTCATATTGCTCAACTGTGTGAAAAG 3'; SEQ ID N° 34), zc42902 (5' TAGAAGCCACCTGAACACAAATCTG3'; SEQ ID N°:35), e iniciadores TFRC zc42599 (5' ATGTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT3'; SEQ ID N°:36), zc42600 (5' TTCTCCACGAGGTAAACAAGTCTAC3'; SEQ ID N°:37) foram misturados com 2,5 pL lOxtampão e 0,5 pL de mistura ADNc polimerase Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) , 2 pL de mistura de 2,5 mM dNTP (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 pL 10X Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA), e adicionada a cada poço de um painel de matriz #118A e matriz #118B. Os parâmetros de ciclização foram os seguintes: 94°C 20'', 35 ciclos de 94°C 20'', 67°C 80'', e um ciclo de 72°C 7'.Sujeitou-se 10 pL de cada reacção a electroforese em gel de agarose e os geles foram avaliados, quanto à presença de um 112 produto robusto de PCR para cada gene específico dos poços +RT para cada linha celular.

Expressão de ARNm nos painéis de ADNc de primeira cadeia humana para IL-17RC foi ensaiada por PCR com oligo Zc42756 de sentido (5' ctctccaggcccaagtcgtgctct3'; SEQ ID N°:38) e oligo antisentido ZC42757 (5' ttgtcctgggggcctcgtgtctcc 3'; SEQ ID N°:39) sob estas condições PCR por amostra: 2,5 pL lOx tampão e 0,5 pL de cada mistura 2 ADNc polimerase (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA), 2 pL de mistura, 2,5 mM dNTP (Applies Biosystems), 2,5 pL lOx Rediload (Invitrogen,

Carlsbad, CA), e 0,5 pL de iniciador de sentido e anti-sentido com 20 pM. As condições de ciclização foram 94°C 2', 35 ciclos de 94°C 1', 66°C 30", 72°C 1,5', e um ciclo de 72°C 7' . 10 pL de cada reacção foi sujeita a electroforese de gel de agarose e os geles foram avaliados para expressão positiva ou negativa de IL-17RC. O ARNm de IL-17RC é largamente expresso em muitas linhas celulares representando um largo espectro de tecido e tipos de células. Em particular, IL-17RC é expressa consistentemente em linhas celulares de células não T de sangue periférico, incluindo monócitos, células B e células da linhagem mieloide. Também o ARNm de IL-17RC é expresso de forma fidedigna em linhas celulares derivadas da pele. Outras linhas celulares que expressam IL-17RC são todas 5 das linhas celulares do intestino grosso que estavam presentes na matriz.

Exemplo 3

Distribuição de ARNm em painéis de linhas celulares de ratinho utilizando RT PCR O ARN total foi purificado a partir de 60 linhas celulares em repouso e estimuladas cultivadas nos nossos 113 laboratórios e purificadas utilizando um kit RNeasy da Qiagen (Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante, um protocolo de purificação de ácido-fenol (Chomczynski e Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9, 1987), ou um protocolo de reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) .

Colocou-se 5 yg de ARN total de cada linha celular numa placa de 96 poços de profundidade, 125 μΐ de NaOAc 3 M e 100 μΐ de tinta Pellet Paint (Novagen, Madison, WI) foram adicionados a cada poço, depois o volume final foi ajustado para 1,25 ml com H20. Um robot Multipette (Saigan) foi utilizado para adicionar múltiplas vezes aliquotas de 2 μΐ da mistura de ARN, seguindo-se 75 μΐ de EtOH em cada poço de uma placa PCR de 96 poços, gerando numerosos painéis PCR RT de uma utilização de uma utilização das linhas celulares que foram então selados e armazenados a -20°C. A pesquisa por PCR RT foi efectuada centrifugando primeiro um painel numa centrífuga Qiagen (Valência, CA) de 96 poços durante 10' a 6000 rpm. O sobrenadante foi removido invertendo a placa num papel absorvente. Agregados de ARN foram lavados com 100 μΐ de EtOH a 70%, seguindo-se uma centrifugação durante 5' a 6000 rpm. O sobrenadante foi novamente removido e deixado secar ao ar até o EtOH restante se ter evaporado. Os agregados de ARN foram novamente suspensos em 15 μΐ μΐ de H20. A expressão de ARNm de IL-17RC nos painéis de ARN das linhas celulares de ratinho foi testada por PCR RT com zc38910 (5' acgaagcccaggtaccagaaagag3' ; SEQ ID N° 40) e zc38679 (5' aaaagcgccgcagccaagagtagg3'; SEQ ID N°:41) nestas condições de PCR RT por amostra: "Superscript" de PCR de um passo com o kit Platinum Taq, Invitrogen, Carlsbad, CA. As condições de ciclização foram: 1 ciclo de 48°C durante 30 minutos, 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 15 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 72°C durante 7 minutos. 10 μΐ de cada 114 reacção foi sujeita a uma electroforese em gel de agarose e os geles foram avaliados, quanto à expressão de IL-17RC positiva ou negativa. 0 ARNm de IL-17RC de murino é expresso em várias linhas celulares de ratinho, em particular de linhas celulares derivadas da medula óssea, incluindo osteoblastos, adipócitos, e linhas celulares de pré-adipócitos. Também o ARNm de IL-17RC de ratinho encontra-se representado em várias amostras do sistema endócrino, tais como linhas celulares de células estromais do pâncreas, linhas celulares dos ilhéus do pâncreas, e hipotálamo, glândula salivar, e linhas celulares dos testículos.

Exemplo 4

Dobragem e purificação de pll-17F produzida em E. coli

A) Isolamento do corpo de inclusão e extracção de pIL-17F

Após a indução da expressão da proteína em fermentação em descontínuo, ou cultura em frasco agitado, o caldo de E. coli é centrifugado em garrafas de 1 litro @ 3000 RPM num rotor de balde oscilante Sorvall. A lavagem da pasta celular para remover quaisquer contaminantes do caldo é efectuada com 50 mM de Tris pH 8.0 contendo 200 mM de NaCl e 5 mM de EDTA até o sobrenadante ficar claro.

Os agregados das células são então suspensos em tampão de lise à temperatura do gelo (50 mM Tris pH 8,0; EDTA 5 mM; NaCl, 200 mM, 10% de sacarose (p/v) ; DTT 5 mM; Benzamidina 5 mM;) até 10-20 unidades de densidade óptica a 600 nm. Esta lama foi então sujeita a 3 passagens a 8500-9000 psi num homogeneizador de laboratório arrefecido APV 2000 produzindo um lisado celular destruído. A fracção insolúvel (corpos de 115 inclusão) é recuperada por centrifugação do lisado celular a 20000 xG durante 1 hora a 4°C. O agregado de corpos de inclusão resultante da centrifugação a 20000xg é pesado e novamente suspenso em tampão de lavagem (50 mM Tris pH 8,0 contendo 200 mM de NaCl, EDTA 5 mM; DTT 5 μΜ; Benzamidina 5 mM;) a 10 ml de tampão de lavagem por grama de corpos de inclusão. É conseguida uma dispersão completa homogeneizando com um gerador rotor estator OMNI International. Esta suspensão é centrifugada a 20000 xG durante 30 minutos a 4°C. O ciclo de lavagem é repetido 3-5 vezes até o sobrenadante ficar claro. O agregado lavado final é solubilizado em guanidina 7 M HC1 em tampão Tris 40 mM a pH 8 contendo sulfito de sódio 0,1 M e 0,02 M de tetrationato de sódio. A reacção de extracção e de sulfitólise é deixada continuar com agitação suave a 4°C de um dia para o outro. A solução rosada resultante é centrifugada a 35000 x g durante 1 hora a 4°C e o sobrenadante clarificado contendo o pIL-17F solúvel é filtrado com um filtro de 0,45 ym.

B) Procedimento de dobragem de pIL-17F O pIL-17F solubilizado, sulfitolizado é dobrado por diluição gota a gota em tampão de dobragem à temperatura do gelo contendo MES 55 mM, NaCl 10,56 mM, KC1 0,44 mM, PEG (3400 K) 0,055%, EDTA 1,1 mM, 20% de glicerol, guanidina HC1 0,5 M, 0,7 5 M de arginina e o par redox de glutationa numa proporção de 1:1 (GSH 1 mM: lmM GSSG) . O pH do tampão de dobragem é ajustado para 6,5 com HC1 e pIL-17F é adicionado para uma concentração final de 100 yg/ml. Quando diluida a mistura é deixada a agitar lentamente numa câmara fria durante 72 horas. C) Recuperação de produto & purificação 116 0 pIL-17F dobrado é concentrado 10X em relação a uma membrana com corte de lOkD num sistema TFF à escala laboratorial. A seguir é filtrado utilizando uma membrana de 0,45 micron e o pH é ajustado para 5,1 com a adição de ácido acético. O material de pH ajustado é capturado por cromatografia de permuta iónica catiónica numa coluna Pharmacia SP Fast Flow equilibrada em 50 mM de tampão acetato, pH 5,1. O pIL-17F é carregado em proporções na linha de 1:5 com um tampão de equilíbrio a um caudal de 190 cm/h. Esta diluição diminui a força iónica tornando possível uma ligação eficiente do alvo à matriz. Após a carga da amostra ser completada, a coluna é lavada até a uma absorvância de linha de base com tampão de equilibração. A coluna é lavada com NaCl 0,4 M em tampão acetato 50 mM a pH 5,1 e depois a proteína ligada é eluída com um gradiente 5 CV de 0,4 M a 1,5 M NaCl em tampão acetato 50 mM a pH 5,1. A proteína elui a ~ 1M NaCl e é aproximadamente 85% dimérica por análise SDS PAGE das fracções eluídas. As fracções contendo pIL-17F são reunidas e concentradas contra uma membrana de ultrafiltração de 10 kDa utilizando uma célula agitada Amicon na preparação para a purificação final e permuta de tampão, através de cromatografia de exclusão de tamanho. D) Permuta de tampão por exclusão de tamanho e formulação A solução catiónica concentrada (a um volume de 3-4% de CV) é injectada a um caudal de 30 cm/h numa coluna de exclusão de tamanho Superdex 75 da Pharmacia equilibrada em tampão de fosfato de sódio 50 mM contendo NaCl 109 mM, pH 7,2. O pico eluído simétrico contendo o produto é diluído até uma concentração de 1 mg/ml em 50 mM de tampão de fosfato de sódio contendo 109 mM de NaCl, pH 7,2. Finalmente o pIL-17F é 117 filtrado em condições de esterilidade com um filtro de 0,2 micron, são retiradas aliquotas e é armazenado a -80°C. O rendimento do processo final é de 20%.

Exemplo 5

Montagem de uma construção de expressão de IL-17RC solúvel de mamífero

Uma construção de expressão contendo IL-17RC humano [L21-K451]-mFcl (ratinho BALB/c μ 2a Fc) é montada, através PCR de sobreposição e recombinação homóloga utilizando um fragmento de ADN (SEQ ID N° 42) que codifica para um polipéptido de IL- 17RC (SEQ ID N°: 43), um fragmento de ADN que codifica para mFcl (SEQ ID N° 44), e o vector de expressão pZMP20. Os fragmentos são gerados por amplificação por PCR.

O fragmento de PCR que codifica para IL-17RC [L21-K451] contém uma sobreposição 5' com a sequência do vector pZMP20 na região de codificação da sequência leader do activador de secreção pre-pro optimizado do plasminogénio do tecido, com o domínio de codificação [L21-K451] extracelular de IL-17RC, e uma sobreposição 3' com a região de codificação mFcl. A reacção de amplificação de PCR utiliza o oligonucleótido 5, [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCT TGT-GGGGCCT; SEQ ID N°46], o oligonucleótido 3' [TGTGGGCCCTCTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID N°:47] e um clone de ADN previamente gerado que utiliza IL-17RC como molde. O fragmento de PCR que codifica para mFcl contem uma sobreposição 5' com a sequência IL-17RC, com a região de codificação mFcl, e uma sobreposição 3' com o vector pZMP20 na região do local interno de entrada no ribossoma interno do polivirus. A reacção de amplificação PCR utiliza o 118 oligonucleótido 5 [GACAAATACATCCACAAGGAGCCCAGAGGCCCACA; SEQ ID N°:48], o oligonucleótido 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA; SEQ ID N°:49] e um clone de ADN gerado anteriormente utilizando mFcl como molde.

As condições de amplificação da reacção PCR são as seguintes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido de 55°C, 2 minutos, seguido por 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos. As misturas da reacção PCR são feitas correr num gel de agarose a 1% e os fragmentos de ADN correspondentes às dimensões esperadas são extraídas do gel utilizando um kit QLAquick™ Gel Extraction kit (Qiagen, Cat N° 28704) .

Os dois fragmentos PCR são unidos por PCR de sobreposição. Aproximadamente 1 μΐ de cada um dos dois fragmentos de gel extraídos são combinados numa reacção de amplificação PCR utilizando o oligonucleótido 5, [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCGATGCCGAGTTGAGACGCTTGCGTAGACTGGAGAGGCT TGT-GGGGCCT; SEQ ID N°46] e O oligonucleótido 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA; SEQ ID N°:49]. As condições de PCR utilizadas são as seguintes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido por 55°C, 2 minutos, seguido por 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos. A mistura da reacção PCR é feita correr num gel de agarose a 1% e o fragmento de ADN correspondente à dimensão da inserção é extraída do gel utilizando um kit QLAquick™ Gel Extraction kit (Qiagen, Cat N° 28704) . O plasmídeo pZMP20 é um vector de expressão de mamífero contendo uma cassette de expressão que possui o promotor MPSV, um local de iniciação para linearização antes da recombinação da levedura, uma sequência peptídica de sinal otPA, um elemento de entrada interno no ribossoma do polívirus, um 119 domínio extracelular de CD8 truncado no terminal C do domínio transmembranar; uma origem de replicação de E. coli; uma unidade marcadora de expressão seleccionável de mamífero compreendendo um promotor SV40, amplificador e origem de replicação, um gene DHFR, e o terminador SV40; e URA3 e as sequências CEN-ARS necessárias para a selecção e replicação em S. cerevisiae.

0 plasmídeo pZMP20 é digerido com BglII antes da recombinação na levedura com o fragmento de PCR IL-17RC[L21-K451]-mFcl extraído do gel. 100 μΐ de células competentes de levedura (S. cerevisiae) são combinadas com 10 μΐ da inserção de ADN IL-17RC[L21-K451]-mFcl e 100 ng de vector pZMP20 digerido por BglII, e a mistura é transferida para uma cuvette de electroporação de 0,2 cm. A mistura levedura/ADN é electropulsada utilizando uma fonte de energia (BioRad Laboratories, Hercules, CA) com os parâmetros 0,75 kV (5kV/cm), <x ohms, e 25 pF. Seiscentos μΐ de 1,2 M de Sorbitol são adicionados à cuvette, e a levedura é aplicada em alíquotas de 100 μΐ e 300 μΐ em duas placas URA-D e incubadas a 30°C. Depois de cerca de 72 horas, os transformantes de levedura Ura+ de uma placa única são novamente suspensos em 1 ml de H20 e agitados brevemente em vórtice para formar agregados das células de leveduras. O agregado das células é novamente suspenso em 0,5 ml de tampão de lise (2% de Triton X-100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) .

Os quinhentos μΐ da mistura de lise são adicionados a um tubo Eppendorf contendo 250 μΐ de esferas de vidro lavadas com ácido e 300 μΐ de fenol-clorofórmio é agitado em vórtice durante 3 minutos, e agitado durante 5 minutos numa centrífuga de Eppendorf a uma velocidade máxima: trezentos μΐ da fase aquosa é transferida para um tubo fresco, e o ADN é precipitado com 600 μΐ de etanol, seguido por centrifugação 120 durante 30 minutos à velocidade máxima. O tubo é decantado e o agregado é lavado com 1 ml de etanol a 70%.O tubo é decantado e o agregado de ADN é novamente suspenso em 30 μΐ de Tris 10 mM, pH 8,0, 1 mM de EDTA.

Transformação de células hospedeiras electrocompetentes de E. coli (DH12S) é efectuada utilizando 5 μΐ da preparação de levedura de ADN e 50 μΐ de células de E. coli. As células são electropulsadas a 2,0 KV, 25 pF, e 400 ohms. Após electroporação, 1 ml de SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% de extracto de levedura (Difco), 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgS04, 20 mM de glucose) é adicionado e depois as células são aplicadas em aliquotas de 50 μΐ e 200 μΐ em duas placas LB AMP (LB broth (Lennox), 1.8% Bacto™ Agar (Difco), 100 mg/L Ampicilina).

As inserções de três clones de ADN para a construção é sujeita a análise de sequências e um clone contendo a sequência correcta é seleccionado. ADN de plasmideo em grande escala é isolado utilizando um kit disponível comercialmente (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 6

Montagem de construções de expressão de IL-17RC solúvel de mamífero que expressam IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, e IL-17RC-CFLAG É montada uma construção de expressão contendo IL-17RC [L21-K451] humana com uma etiqueta C-terminal, ou Glu-Glu (CEE), seis His (CHIS), ou FLAG (CFLAG), é construído via PCR e recombinante homólogo utilizando um fragmento de ADN que 121 codifica para IL-17RC [L21-K451] (SEQ ID N°:42) e o vector de expressão pZMP20. O fragmento PCR que codifica para IL-17RCCEE contém uma sobreposição 5' com a sequência do vector pZMP20 na região de codificação da sequência leader do activador de secreção pre-pro do plasminogénio do tecido optimizado, com o domínio de codificação [L21-K451] extracelular de IL-17RC, a sequência da etiqueta Glu-Glu (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu; SEQ ID N°:53), e uma sobreposição 3' com o vector pZMP20 na região do local de entrada interno do ribossoma do polivírus. A reacção de amplificação do PCR utiliza o oligonucleótido 5' [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCT TGT-GGGGCCT; SEQ ID N°46] o oligonucleótido 3' [CAACCCCAGAGCTGTITTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTCCATGGGGATGTATTCTTCCT TGTATTTGTC; SEQ ID N°:50], e um clone de ADN previamente gerado de IL-17RC como molde.

As condições da reacção de amplificação por PCR utilizadas são as seguintes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido por 55°C, 2 minutos, seguido por 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos. A mistura da reacção PCR é feita correr num gel de agarose a 1% e o fragmento de ADN correspondente à dimensão esperada é extraída do gel utilizando um kit QIAquick™ Gel Extraction kit (Qiagen, Cat N° 28704) . O plasmídeo pZMP20 é digerido com BglII antes da recombinação na levedura com o fragmento de PCR IL-17RCCEE-mFcl extraído do gel. 100 μΐ de células competentes de levedura {S. cerevisiae) são combinadas com 10 μΐ da inserção de ADN IL-17RCCEE e 100 ng de vector pZMP20 digerido por BglII, e a mistura é transferida para uma cuvette de electroporação de 0,2 cm. A mistura levedura/ADN é electropulsada utilizando uma fonte de energia (BioRad 122

Laboratories, Hercules, CA) com os parâmetros 0,75 kV (5kV/cm) , oc ohms, e 25 pF. Seiscentos μΐ de 1,2 M de Sorbitol são adicionados à cuvette, e a levedura é aplicada em aliquotas de 100 μΐ e 300 μΐ em duas placas URA-D e incubada a 30°C. Depois de cerca de 72 horas, os transformantes de levedura Ura+ de uma placa única são novamente suspensos em 1 ml de H20 e agitados em vórtice para formar agregados das células de leveduras. O agregado das células é novamente suspenso em 0,5 ml de tampão de lise (2% de Triton X-100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) . Os quinhentos μΐ da mistura de lise são adicionados a um tubo Eppendorf contendo 250 μΐ de esferas de vidro lavadas com ácido e 300 μΐ de fenol-clorofórmio é agitado em vórtice durante 3 minutos, e agitado durante 5 minutos numa centrífuga de Eppendorf a uma velocidade máxima: trezentos μΐ da fase aquosa é transferida para um tubo fresco, e o ADN é precipitado com 600 μΐ de etanol, seguido por centrifugação durante 30 minutos à velocidade máxima. O tubo é decantado e o agregado é lavado com 1 ml de etanol a 70%.O tubo é decantado e o agregado de ADN é novamente suspenso em 30 μΐ de Tris 10 mM, pH 8,0, 1 mM de EDTA.

Transformação de células hospedeiras electrocompetentes de E. coli (DH12S) é efectuada utilizando 5 μΐ da preparação de levedura de ADN e 50 μΐ de células de E. coli. As células são electropulsadas a 2,0 KV, 25 pF, e 400 ohms. Após electroporação, 1 ml de SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% de extracto de levedura (Difco), 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSCp, 20 mM de glucose) é adicionado e depois as células são aplicadas em aliquotas de 50 μΐ e 200 μΐ em duas placas LB AMP (LB broth (Lennox), 1.8% Bacto™ Agar (Difco), 100 mg/L Ampicilina).

As inserções de três clones de ADN para a construção é sujeita a análise de sequências e um clone contendo a 123 sequência correcta é seleccionado. ADN de plasmídeo em grande escala é isolado utilizando um kit disponível comercialmente (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 0 mesmo processo é utilizado para preparar IL-17RC com uma etiqueta his no terminal C, composta por Gly Ser Gly Gly His His His His His His (IL-17RCCHIS: SEQ ID N° 51) ou a etiqueta C-terminal FLAG, composta por GLY SER ASP TYR LYS ASP ASP ASP ASP Lys (IL-17RCCFLAG; SEQ ID N°:52). Para preparar estas construções, em vez do oligonucleótido 3' da SEQ ID N°:50; o oligonucleótido 3' das[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGAT-GGTGATGTCCA CCAGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID N° 54] é utilizada em geral para gerar IL-17RCCHIS ou o oligonucleótido 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTACTTATCATCATCATCCTTATAAT CG-GATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID N° 55 ] é utilizado em geral para gerar IL-17RCCFLAG.

Exemplo 7

Transfecção e Expressão das Construções de Expressão do Receptor IL-17RC solúvel que expressam a proteína de fusão IL-17RC-mFcl, e as proteínas etiquetadas no terminal C IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, e IL-17RC-CFLAG

Três conjuntos cada um com 200 yg das construções de expressão do IL-17RC solúvel de fusão ou etiquetado são digeridos separadamente com 200 unidades de Pvul a 37°C durante três horas, são precipitados com álcool isopropílico, e centrifugados num tubo de 1,5 mL de microcentrífuga. O sobrenadante é decantado e o agregado é lavado com 1 ml de 124 etanol a 70% e deixado a incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente. O tubo é agitado numa microcentrifuga durante 10 minutos a 14000 rpm e o sobrenadante é decantado. O agregado é então novamente suspenso em 750 yl de meio de cultura de tecido de células CHO num ambiente estéril, deixado a incubar a 60°C durante 30 minutos e é deixado arrefecer à temperatura ambiente. Aproximadamente 5xl06 células de CHO são feitas em agregados em cada um dos três tubos e são novamente suspensos utilizando uma solução de meio DNA. As misturas celulares de DNA são colocadas num poço de uma cuvette de 0,4 cm e electroporadas utilizando os parâmetros seguintes; 950 μF, elevada capacitância, a 300 V. Os conteúdos das cuvetes são então removidos, reunidos, e diluídos para 25 ml com meio de cultura de tecido celular de CHO e colocado num frasco de agitação de 125 ml. O frasco é colocado num incubador num agitador a 37°C, 6% de CO2 com agitação a 120 rpm.

As células CHO são sujeitas a selecção de nutrientes por amplificação em passos para 200 nM de metotrexato (MTX), e depois para 1 μΜ de MTX. A expressão da proteína fundida ou etiquetada é confirmada por transferência de Western, e o conjunto de células CHO é aumentado de escala para colheitas para purificação de proteína.

Exemplo 8

Expressão de IL-17RC Solúvel

Um plasmídeo de expressão contendo IL-17RC-TbX-C(Fc9) (SEQ ID N°:64) foi construído, através de recombinação homóloga utilizando um fragmento de ADN de IL-17RC-Tbx e o vector de expressão pZMP40. O fragmento foi gerado por amplificação por PCR utilizando os iniciadores zc44531 e zc44545. 125 0 fragmento de PCR IL-17RC-Tbx contém uma região de codificação para um dominio extracelular parcial de IL-17RC que foi feito utilizando um clone previamente preparado de IL-17RC como molde. 0 fragmento inclui uma sobreposição 5' com a sequência do vector na região de codificação otPA, com o segmento IL-17RC (resíduo de aminoácido 21 a 451 da SEQ ID N°:2), uma sequência de ligação, um local de cisão da trombina, e uma sobreposição 3' com o vector pZMP40 na região de codificação Fc9. As condições de PCR utilizadas foram as seguintes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido por 55°C, 2 minutos, seguido por 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos.

As misturas das reacções PCR são feitas correr num gel de agarose a 1% e uma banda correspondente às dimensões das inserções foi extraída do gel utilizando um kit QIAquick™ Gel Extraction kit (Qiagen, Cat N° 28704). O plasmídeo pZMP40 é um vector de expressão de mamífero contendo uma cassete de expressão que possui o promotor MPSV, locais de inserção múltiplos para inserção de sequências de codificação, uma sequência peptidica de sinalização otPA, e a sequência para Fc9; um elemento de um local de entrada interno do ribossoma (IRES) do polivírus, e o domínio extracelular de CD8 truncado na extremidade do terminal C do domínio transmembranar; uma origem de replicação E. coli; uma unidade de expressão de um marcador seleccionável de mamífero compreendendo um promotor SV40, amplificador e origem de replicação, um gene DHFR, e o terminador SV40; e URA3 e sequências CEN-ARS necessárias para selecção e replicação em S. cerevisiae. Foi construído a partir pZMP21 (publicação da patente de invenção N° US2003/0232414 Ά1; depositada na

American Type Culture Collection e designada como ATCC#PTA-5266). 126 0 plasmídeo ρΖΜΡ40 foi cortado com BglII antes da recombinação na levedura com o fragmento de PCR. 100 μΐ de células competentes de levedura (S. cerevisiae) são combinadas independentemente com 10 μΐ da inserção de ADN (SEQ ID N°:66) e 100 ng de vector pZMP40 cortado e a mistura é transferida para uma cuvete de electroporação de 0,2 cm. A mistura de levedura/ADN foi electropulsada utilizando uma fonte de energia (BioRad Laboratories, Hercules, CA) com os parâmetros 0,75 kV (5kV/cm), <x ohms, e 25 pF. Seiscentos μΐ de 1,2 M de sorbitol são adicionados à cuvete, e a levedura é aplicada em aliquotas de 100 μΐ e 300 μΐ em duas placas URA-D e incubadas a 30°C. Depois de cerca de 72 horas, os transformantes de levedura Ura+ de uma placa única são novamente suspensos em 1 ml de H20 e agitados brevemente em vórtice para formar agregados das células de leveduras. O agregado das células é novamente suspenso em 0,5 ml de tampão de lise (2% de Triton X-100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA). Os quinhentos μΐ da mistura de lise são adicionados a um tubo Eppendorf contendo 250 μΐ de esferas de vidro lavadas com ácido e 300 μΐ de fenol-clorofórmio é agitado em vórtice durante 3 minutos, e agitado durante 5 minutos numa centrífuga de Eppendorf à velocidade máxima: transfere-se trezentos μΐ da fase aquosa para um tubo fresco, e o ADN é precipitado com 600 μΐ de etanol (EtOH), seguido por centrifugação durante 30 minutos à velocidade máxima. O tubo é decantado e o agregado é lavado com 1 ml de etanol a 70%. O tubo é decantado e o agregado de ADN é novamente suspenso em 30 μΐ TE.

Transformação de células hospedeiras electrocompetentes de E. coli (DH12S) é efectuada utilizando 5 μΐ da preparação de levedura de ADN e 50 μΐ de células de E. coli. As células são electropulsadas a 2,0 KV, 25 pF, e 400 ohms. Após electroporação, 1 ml de SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, Mn, 0,5% de extracto de levedura (Difco), 10 mM de 127

NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCÍ2, 10 mM de MgS04, 20 mM de glucose) é adicionado e depois as células são aplicadas em aliquotas de 50 μΐ e 200 μΐ em duas placas LB AMP (LB broth (Lennox) , 1.8% Bacto™ Agar (Difco), 100 mg/L Ampicilina) .

As inserções dos três clones para a construção foi sujeita a análise da sequência e foi seleccionado um clone para cada construção, contendo a sequência correcta. Foi isolado plasmídeo de DN de grande escala utilizando um kit disponível comercialmente (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Três conjuntos com 200 pg da construção IL-17RC [L21-K451]_Tbx_C (Fc9) foram então digeridos com 200 unidades de Pvu I a 37°C durante três horas, e depois foram precipitados com IPA, e centrifugados num tubo de 1,5 mL de microcentrífuga. O sobrenadante foi decantado e o agregado foi lavado com 1 ml de etanol a 70% e deixado a incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente. O tubo foi agitado numa microcentrífuga durante 10 minutos a 14000 rpm e o sobrenadante foi decantado. O agregado foi então novamente suspenso em 750 μΐ meio PF-CHO num ambiente estéril, deixado a incubar a 60°C durante 30 minutos e é deixado arrefecer à temperatura ambiente. 5xl06 células de APFDXB11 foram feitas em agregados em cada um dos três tubos e foram novamente suspensas utilizando uma solução de meio DNA. As misturas ADN/células foram colocadas num poço de uma cuvete de 0,4 cm e electroporadas utilizando os parâmetros seguintes; 950 pF, elevada capacitância, e 300 V. Os conteúdos das cuvetes são então removidos, reunidos, e diluídos para 25 ml com meio PF-CHO e colocados num frasco de agitação de 125 ml. 0 frasco foi colocado num incubador num agitador a 37°C, 6% de CO2 com agitação a 120 rpm. As linhas celulares foram sujeitas a selecção de nutrientes por amplificação em passos para 200 nM de 128 metotrexato (MTX), e depois para 1 μΜ de MTX. A expressão foi confirmada por transferência de Western, e a linha celular foi submetida a um aumento de escala seguindo-se a purificação de proteína.

Exemplo 9

Purificação de IL-17RC solúvel a partir de células CHO

Meios acondicionados de células CHO que expressam IL-17RC-TbX-Fc9 (SEQ ID N°:64) foram concentrados aproximadamente 10 vezes com um sistema de fluxo tangencial Pelicon II contra duas cassetes de membranas Biomax 0,1 m2 30 kD de peso molecular de corte 30 kD (Milipore, Bedford, MA) . O pH dos meios concentrados foi ajustado para 5,5 com ácido acético glacial 0,2M, filtrado em condições estéreis e depois carregado numa resina de fluxo rápido de proteína G (Pharmacia, Piscataway, NJ) , através de cromatografia descontínua de um dia para o outro a 4°C. Antes da carga do meio acondicionado de pH ajustado, a resina de proteína G foi pré-equilibrada com 5 volumes de coluna (aproximadamente 150 ml) de acetato de sódio 25 mM, 150 mM de NaCl, pH 5,5. A proporção entre meio acondicionado filtrado de pH ajustado e a resina foi de 33:1 (v/v). O processo de cromatografia em descontínuo foi efectuado à temperatura ambiente (aproximadamente 21 °C) . O meio acondicionado de pH ajustado filtrado com um filtro de 0,22 pm em lotes foi vertido para uma coluna de vidro vazia de 5,5x20,5 cm (BioRad, Hercules, CA) e empacotado por gravidade. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna (aproximadamente 300 ml) de 25 mM de acetato de sódio, 150 mM de NaCl, pH 5,5. A proteína ligada foi então eluída com pH com 100 mM de glicina, pH 2,7, foram recolhidas fracções de 9,0 ml e foram 129 imediatamente neutralizadas com 1,0 ml de 2,0 M tris pH 8,0. As fracções recolhidas foram analisadas através de SDS-PAGE com coloração com azul de Coomassie. Fracções contendo IL-17RC-Tbx-FC9 foram reunidas e concentradas aproximadamente 6-vezes utilizando um concentrador rotativo de membrana Biomax de peso molecular de corte de 5KD (Millipore, Bedford, MA) de acordo com as instruções do fabricante.

As fracções concentradas reunidas foram então dialisadas a 4°C extensivamente contra lx solução tampão fosfato salina, pH 7,3 (Sigma, St Louis, MO) utilizando uma membrana de peso molecular de corte Slide-A-Kyzer (Pierce, Rockford, IL) . IL-17RG-TbX-Fc9 foi formulada em solução tampão fosfato salina, pH 7,3, foi esterilizada por filtração com um filtro de 0,22 ym antes de se retirarem aliquotas e de armazenagem a -80°C.

Exemplo 10

Ligação de IL-17A e IL-17F ao IL-17RC humano A) Ligação de citocinas biotiniladas a células transfectadas Células de rins de hamster bebés (BHK) que tinham sido transfectadas com vectores de expressão que codificam para os receptores IL-17 (SEQ ID N°:21), IL-17RC (SEQ ID N° 2) humanos, ou a ambos estes receptores são avaliadas, quanto à sua capacidade de se ligarem aos receptores IL-17A e IL-17F biotinilados humanos. As células são colhidas com versene, contadas e diluídas para 107 células por ml em meio corado (SM) que é HBSS mais 1 mg/ml de soro de albumina de bovino (BSA), Hepes 10 mM, e 0,1% de azida de sódio (W/v). IL-17A (SEQ ID N° 14) biotinilado humano e IL-17F (SEQ ID N°:16) biotinilado humano são incubados com as células em gelo durante 30 minutos a várias concentrações. Após 30 minutos, o excesso de citocina 130 é lavada com SM e as células são incubadas com uma diluição 1:100 de estreptavidina conjugada com ficoeritrina (SA-PE) durante 30 minutos em gelo. O excesso de SA-PE é lavado e as células são analisadas por citometria de fluxo. A quantidade de ligação à citocina foi quantificada a partir da intensidade de fluorescência média da coloração da citocina. A partir destas análises verificámos que a IL-17A humana se liga a IL-17R e IL-17RC numa extensão considerável. Também, o IL-17F humano liga-se ao IL-17RC a um nivel semelhante, mas liga-se a IL-17R de forma detectável, mas a um grau muito menor do que o que foi observado com IL-17A. B) Ligação de citocinas biotiniladas às células mononucleares do sangue periférico humano Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram preparadas a partir de sangue completo, através de centrifugação por gradiente de densidade. PBMC com 107 células por ml foi simultaneamente incubado com IL-17A ou IL-17F biotinilados a 1 yg/ml e com anticorpos conjugados com fluorocromo específicos para proteínas da superfície celular que foram concebidos para distinguir as várias linhagens de glóbulos brancos. Os marcadores incluem CD4, CD8, CD19, CDllb, CD56 e CD16. Foi lavado o excesso de anticorpo e de citocina e a ligação específica de citocina é detectada incubando com SA-PE como descrito acima. As amostras foram anlisadas por citometria de fluxo e a partir desta análise verificámos que o IL-17A humano liga-se virtualmente a todas as populações PBMC examinadas, mas que o IL-17F humano não se liga de forma detectável a qualquer população. C) Inibição da ligação específica de IL-17 humano biotinilado e IL-17F com citocina não marcada 131

Estudos de ligação são efectuados como discutido acima, mas um excesso de IL-17A e IL-17F são incluídos na reacção de ligação. Nos estudos com células BHK, a quantidade de citocina não marcada foi variada numa gama de concentrações e verificámos que a adição de IL-17A não marcado competia para a ligação de IL-17A e IL-17F a IL-17RC, mas não competia eficazmente para a ligação para a ligação a IL-17R. Isto indica que ambos os IL-17a e IL-17F se ligam especificamente a IL-17RC e que se ligam a um local que ou é idêntico ou se sobrepõe significativamente, uma vez que existe competição cruzada para a ligação. Também a IL-17A compete para a ligação relativamente fraca de IL-17f para IL-17R, indicando que estas duas citocinas também se ligam a uma região semelhante no IL-17R, mas que o IL-17F liga-se ao IL-17R com uma afinidade muito mais reduzida do que o IL-17RC.

D) Inibição da ligação específica de IL-17A e IL-17F humanos biotinilados com IL-17RC e IL-17R

Os estudos de ligação são efectuados como descrito acima, com excepção de que uma forma solúvel de IL-17RC ou IL-17R é incluída nas reacções de ligação. Estes receptores solúveis são proteínas de fusão derivadas do domínio extracelular de cada receptor fundido com a região constante (Fc) do IgGl humano. Verificamos que o IL-17RC inibe a ligação a IL-17A e IL-17F de células BHK transfectadas. Contudo, IL-17R solúvel inibe a ligação de IL-17A a cada um dos receptores, mas não bloqueia de forma eficaz a ligação de IL-17F a IL-17RC, consistente com a fraca ligação de IL-17F a IL-17R.

Exemplo 11

IL-17A e IL-17F ligam-se a IL-17RC 132 A) Inibição da ligação com ligando arrefecido Células BHK transfectadas com hIL-17RC (SEQ ID N°:2) e IL-17R (SEQ ID N°:21) foram aplicadas 40000 células/poço numa placa de 24 poços (Costar 3527) dois dias antes do ensaio. IL-17A (SEQ ID N°:14) e IL-17F (SEQ ID N:°16) que tinham sido marcadas com radioactividade, através do método de esferas de iodo foram adicionadas independentemente a poços em triplicado a 10 ng/ml com um total de 250 μΐ/poço no tampão de ligação (meio RPMI 1640 (JRH 51502-500M) com 10 mg/ml de soro de albumina de bovino (Gibco 15260-037)). Competidores arrefecidos foram adicionados com um excesso de 100 vezes da massa molar. Foram testados os competidores incluindo IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F e IL-21. Os poços foram incubados em gelo durante 1 hora seguindo-se duas lavagens com PBS (Invitrogen 20012-027) e uma lavagem com uma solução de elevado teor de sal (NaCl, 1,5 M, HEPES 50 mM pH 7,4). Os poços foram extraídos com 500 μΐ de NaOH 0,8 M durante 30 minutos à temperatura ambiente e foram medidas as contagens por minuto num contador gama (Packard Cobra II A5005) .

Os resultados indicaram que IL-17A e IL-17F lOOx molar arrefecidos foram capazes de reduzir a ligação a de 1251 IL-17A a BHK hIL-17RC em aproximadamente 17 vezes enquanto que IL-17B, C, D, E e IL-21 não possuíam efeito na ligação. IL-17A arrefecido lOOx molar reduziu a ligação de 1251 IL-17A a IL-17R de BHK em aproximadamente 4 vezes enquanto que IL-17B, C, D, E, F e IL-21 não possuíam efeito na ligação. IL-17A e IL-17F lOOx molar arrefecidos reduziram a ligação de 1251 IL-17A a IL-17R de BHK em aproximadamente 4 vezes e 5 vezes respectivamente, enquanto que IL-17B, C, D, E e IL-21 não possuíam nenhum efeito na ligação. 133 B) Inibição da ligação com receptor solúvel A ligação a hzytorl4 (SEQ ID N° 2) e IL-17R (SEQ ID N°:21) de células BHK transfectadas foi efectuada como em um, mas foi utilizado na competição hIL-17RCxl/Fc9 solúvel num excesso molar de 100 vezes (Exemplo 8) e IL-17R/Fc solúvel (obtido a partir de R&D; Ref. 177-IR) em vez do ligando arrefecido. As células foram lavadas, extraídas e contadas, tal como na parte um. O hIL-17RC/Fc solúvel inibiu a ligação de 1251 IL-17F a ÚIL-17RC de BHK com um IC50 com uma média de excesso molar de 10X a partir de três experiências. A inibição de hIL-17RC/Fc solúvel a 1 IL-17A na mesma linha celular deu origem a um IC50 médio de 20X o excesso molar e a inibição de hIL-17R/Fc solúvel a 1251 IL-17A deu origem a um IC50 médio de 20X o excesso molar. C) Saturação da Ligação Células BHK transfectadas foram aplicadas em placas de 24 poços como em um. Adicionou-se IL-17A e IL-17F marcados radioactivamente a uma concentração de nM em oito diluições de 1:3 (para uma concentração de 1.83 pM) em triplicado com um total de 250 μΐ/poço em tampão de ligação. Adicionou-se separadamente um excesso molar de 100 vezes em cada ponto de diluição. As células foram lavadas extraídas e contadas como em um. Contagens específicas por minuto foram representadas contra a concentração de ligando marcado radioactivamente subtraindo as contagens do excesso de 100 vezes das contagens sem competição em cada ponto de diluição. Estes dados normalizados foram representados para gerar curvas de ligação de saturação para cada combinação de ligando marcado radioactivamente e células BHK transfectadas. A tabela 7 134 apresenta os valores de afinidade calculados a partir de todas as três experiências

Tabela 7 125I IL-17A+ hIL-17RC de BHK 125I IL-17A+ hIL-17RC de BHK 1. 180 pM 1. 2,5+/- 0,2 nM 2. 200 pM 2. 4,5+/- 0,3 nM 3. 370 pM 3 . 5,9+/- 0,1 nM 12i)I IL-17F+ hIL-17RC de BHK 12i)I IL-17F+ hIL-17R de BHK 1. 50 pM 1.Afinidade muito baixa 2. 60 pM 2.Afinidade muito baixa 3. 80 pM 3.Afinidade muito baixa

Os ajustes de curvas para um local de ligação possuíam uma concordância muito próxima com a ligação de IL-17A e IL-17F a IL-17RC. Os ajustes de curvas para dois locais de ligação obtiveram a melhor concordância com a ligação de IL-17A e IL-17F a hIL-17R. O local de ligação de elevada afinidade é apresentado acima. 0 local de baixa afinidade possuía uma afinidade muito baixa e variava largamente entre as três experiências.

Exemplo 12 Células Nih3t3 de murino respondem a IL-17A e IL-17F humanas A)Aplicação das células em placas e infecção pelo kzl42 adenovirus repórter Células Nih3t3 derivadas de fibroblastos de ratinho (descritas na ATCC) foram aplicadas 5000 células/poço em placas de cultura de células sólidas brancas revestidas de 96 poços, 135 (Cat. #3917. Costar) utilizando DMEM/10% FBS contendo glutamina e corrigida com piruvato e cultivadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO2. Neste segundo dia, o meio da placa foi removido e as partículas do adenovírus Kzl42 numa multiplicidade de infecção de 5000 partículas/célula foram preparadas em DMEM 1% FBS, contendo glutamina e corrigido com piruvato e cultivadas de um dia para o outro a 37°C e 5% CO2. B) Determinação de IL-17A e F utilizando o ensaio da luciferase e activação das células nih3t3 infectadas com o repórter de adenovírus kzl42

Após a incubação de um dia para o outro com o repórter da partícula de adenovírus foram preparados tratamentos com os ligandos IL-17A e IL-17F humanos em meio isento de soro corrigido para 28% de BSA. As partículas de adenovírus e meio foram removidos e as doses adequadas de ligando foram administradas em triplicado. A incubação a 37°C e 5% de C02 foi continuada durante 4 horas, após o que o meio foi removido, as células foram lisadas durante 15 minutos e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi medida utilizando o sistema do ensaio da luciferase e reagentes (Cat#el531 Promega, Madison, WI) e um luminómetro de microplaca. Foi detectada actividade nas concentrações que variam de 1-1000 g/ml de IL-17A e IL-17F humanas, gerando valores de EC50 de cerca de 50 ng/ml para ambos os ligandos. Estes dados sugerem que células nih3t3 transportam receptores para estes ligandos e que o IL-17A e IL-17F activam o factor de transcrição NfKb/Ap-1.

Exemplo 13

Células Nih3t3 de murino expressam IL-17RA e IL-17RC 136

Análise por RTPCR de ARN de nih3t3 demonstrou que estas células são positivas para IL-17RA e IL-17RC, consistente com a sua resposta de nfkb/apl para a mediação de IL-17A e IL-17F humanos que são mediadas por um ou ambos estes receptores.

Detalhes da RTPCR

A)IL-17RC PCR A primeira cadeia de ADNc foi preparada a partir do ARN total isolado a partir de células nih3t3 utilizando processos padrão. A PCR foi aplicada utilizando polimerase hot star e as recomendações do fabricante (Qiagen, Valência, CA) utilizando iniciador de sentido, ZC38910, 5' ACGAAGCCCAGGTACCAGAAAGAG 3' (SEQ ID N° 56) e iniciador anti-sentido, zc 38679, 5' AAAAGCGCCGCAGCCAAGAGTAGG 3' (SEQ ID N°57) e 35 ciclos de amplificação. Electroforese em gel de agarose revelou um único amplicão robusto com o tamanho esperado de 850 pb. B) PCR de IL-17RA de murino A primeira cadeia de ADNc foi preparada a partir do ARN total isolado a partir de células nih3t3 utilizando processos padrão. A PCR foi aplicada utilizando polimerase hot star e as recomendações do fabricante (Qiagen, Valência, CA) utilizando iniciador de sentido, zc38520, 5' CGTAAGCGGTGGCGGTTTTC 3' (SEQ ID N°:58) e iniciador anti-sentido, zc 38521, 5' TGGGCAG- GGCACAGTCACAG 3' (SEQ ID N°59) e 35 ciclos de amplificação. Electroforese em gel de agarose revelou um único amplicão robusto com o tamanho esperado de 498 pb.

Exemplo 14 137

Criação de um ensaio de um clone de Nih3t3 estável que expressa o factor de transcrição apl/nfkb A linha celular de nih3t3 de murino descrita acima foi transfectada de forma estável com a construção de repórter kzl42 apl/nfkb contendo um marcador seleccionável de neomicina. 0 conjunto de transfecção resistente a Neo foi aplicado a uma densidade clonal. Os clones foram isolados utilizando anéis de clonagem e pesquisados, através do ensaio de luciferase, utilizando o ligando IL-17A como indutor. Foram seleccionados clones com a intensidade de fluorescência média mais elevada (MFI) (via apl/NflcB luciferase) e linha de base mais baixa. Uma linha celular de transfectante estável foi seleccionada e designada nih3t3/kzl42.8.

Exemplo 15

Inibição da activação pelos IL-17A e IL-17F humanos em células Nih3t3 de murino utilizando quimeras de IL-17RC e IL-17RA/FC solúveis

Formas solúveis de IL-17RC ou IL-17RA foram utilizadas como antagonistas da activação por IL-17A e IL-17F humanos de elementos apl/nfkb num ensaio da luciferase. Estes receptores solúveis são proteínas de fusão derivadas do domínio extracelular de cada receptor fundido com a região constante (Fc) de IgGl humano. Foi adquirida a proteína de fusão IL-17RC Fc solúvel humana (quimera de IL-17R/FC humana recombinante, número de catálogo 177-IR-100, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Mn.). A quimera IL-17RC FC solúvel humana (IL-17RCsR/FC9) foi construída como acima descrito. Verificámos que um excesso de quimera de IL-17RCsR/FC9 e IL17RsR/Fc humana inibe níveis de 138 EC50 da mediação de IL-17A e IL-17F humanos na activação de apl/nfkb da linha celular de ensaio nih3t3/kzl42.8 de murino. A proteína IL-17RCs/FC9 apresentou a maior potência no antagonismo da activação por IL-17F e a quimera de IL-17RsR/FC mostrou a maior potência no antagonismo da activação de IL-17A.

Exemplo 16 O ARNm de IL-17F é regulado para cima num modelo de murino da asma

Os níveis de ARNm de IL-17F foram medidos num modelo de desafio de sensibilização e de vias respiratórias em ratinhos. Grupos de ratinhos de 8 a 10 semanas de idade foram sensibilizados, através de injecção intraperitoneal de 10 yg de alergeno Dermatophagoides pteronyssinus 1 (DerPl) (Indoor biotechnologies, Cardiff, UK) em 50% Imject Alum (Pierce) nos dias 0 e 7. Sete dias mais tarde, os ratinhos foram desafiados 3 dias consecutivos (dias 14, 15 e 16) com 20 yg de DerPl em 50 yL de PBS. Existiam 4 ratinhos representando este grupo. Controlos negativos incluíam 5 ratinhos a que foi dado uma sensibilização com tampão fosfato salino (PBS), seguido por desafio com PBS. Além disso foi dado a 3 ratinhos uma sensibilização com DerPl, seguida de desafio com PBS. Quarenta e oito horas após o alergeno, ou desafio de controlo foi recolhido o tecido do pulmão e o ARN total foi isolado.

Foi preparada a primeira cadeia de ADNc utilizando quantidades idênticas de ARN total de cada sujeito. Foi aplicada PCR de IL-17F utilizando polimerase Qiagen hotstar (Qiagen, Valência, CA) e as instruções do fabricante. A IL-17 PCR utilizou 35 ciclos de amplificação com iniciador de sentido, zc46098, 5' ACTTGCCATTCTGAGGGAGGTAGC 3' (SEQ ID 139 N°:60) e iniciador antisentido, 46099, 5' CACAGGTGCAGCCAACTTTTAGGA 3' (SEQ ID N°:61). De modo a

assegurar que a qualidade do molde era uniforme entre todos os sujeitos, foi aplicada PCR de beta actina à mesma quantidade de cada molde utilizada na amplificação de IL-17F. PCR da B actina incluiu 25 ciclos de PCR com o iniciador de sentido, ZC44779, 5' GTGGGCCGCTCTAGGCACCA 3' (SEQ ID N°:62) e iniciador anti-sentido, ZCC44776, 5' CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG 3' (SEQ ID N°:63) .

Todos os 4 ratinhos sensibilizados com DerPl, grupo de tratamento desafiado com DerpPl (simulação da asma) apresentaram uma amplificação de IL-17F robusta. Em contraste, foi verificada uma fraca amplificação de IL-17F nos controlos negativos, incluindo 3 de 3 sujeitos representando o tratamento sensibilização com DerPl/desafio com PBS e 5 dos 5 sujeitos do grupo de tratamento sensibilização com PBS/ desafio com PBS. A amplificação com B actina foi pelo menos tão robusta para os controlos negativos, como para os sujeitos com simulação de asma, demonstrando que a amplificação fraca de IL-17F do controlo negativo não era devido a problemas de molde.

Exemplo 17

Transfecção de células COS e armadilha de secreção A) Transfecção de células Cos e ensaios de armadilha de secreção mostram que a IL-17RCsR/Fc9 e IL-17F é um par receptor/ligando

Foi utilizado um ensaio de armadilha de secreção para emparelhar a IL-17RC humana (SEQ ID N°2) com IL-17F humano (SEQ ID N° 16) . A proteína de fusão IL-17RCsR/Fc9 solúvel (Exemplo 8) foi utilizada como um reagente de ligação num 140 ensaio de secreção. SV40 ori contendo os vectores de expressão contendo ADNc de IL-17B, C, D, E, e F humanos foi transfectado de forma transiente em células COS. A ligação de IL-17RCsR/Fc9 a células COS transfectadas foi efectuada utilizando o ensaio de armadilha de secreção descrito abaixo. Foi observada apenas ligação positiva de IL-17RCsR/Fc9 com IL-17F humano. Estes resultados demonstram o novo facto de que IL-17RC e IL-17F constituem um novo par receptor/ligando.

B) Transfecções de células COS A transfecção de células COS transfectadas foi efectuada como se segue: misturar 3 μΐ de ADN reunido e 5 pL de

Lipofectamina™ em 92 pL de soro isento de meio DMEM (55 mg de piruvato de sódio, 14 6 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg e insulina, 1 pg de selénio e 5 mg de fetuina em 500 ml de DMEM), incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos e depois adicionar 400 pl de meio DMEM isento de soro. Adicionar esta mistura de 500 pl l,5xl05 células COS/poço a uma placa de cultura de tecidos de 12 poços e incubada durante 5 horas a 37°C. Adicional 500 pl de meio DMEM 20% FBS (100 ml FBS, 55 mg de piruvato de sódio e 146 mg de L-glutamina em 500 ml de DMEM) e incubada de um dia para o outro. C) Ensaio de armadilha de secreção A armadilha de secreção foi efectuada como se segue: removeram-se as células do meio com PBS e foram fixadas durante 15 minutos com 1,8% de formaldeído em PBS. As células foram então lavadas com TNT (0,1 M Tris-HCl, NaCl 0,15 M, e 0,05% de Tween 20 em h20) , e permeadas com 0,1% de Triton X em PBS durante 15 minutos, e novamente lavadas com TNT. As células foram lavadas durante 1 hora com TNB (Tris-HCl 0,1 M, 141

NaCl 0,15 M e 0,5% de reagente de bloqueamento (NEN Renaissance TSA-Direct Kit) em H20), e novamente lavadas com TNT. As células foram incubadas durante 1 hora com 1 yg/ml com a proteína de fusão do receptor IL-17RCx1sR/FC9 . A células foram então lavadas com TNT. As células foram incubadas durante mais uma hora com Ig-HRP de cabra anti-humano diluído de 1:200 (Fc específico). As células foram novamente lavadas com TNT.

Foi detectada ligação positiva com reagente fluoresceína tiramida diluído de 1:50 em tampão de diluição (kit NEN) e incubado durante 4-6 minutos e lavado com TNT. As células foram preservadas com Vectashied Mountig Media (Vector Labs Burlingame, CA) diluída de 1:5 em TNT. As células foram visualizadas utilizando um filtro FITC num microscópio fluorescente.

Exemplo 18

Criação de anticorpos monoclonais IL-17RC anti-humano de murino A, Imunização para a criação de anticorpos anti-IL17RC 1. IL-17RC-muFc solúvel

Ratinhos inactivados IL-17C intactos de seis a doze semanas são imunizados por injecção intraperitoneal com 25-50 yg de proteína de IL-17RC-muFc solúvel humana (Exemplo 23) misturado 1:1 (v:v) com adjuvante Ribi (Sigma) num período bisemanal.

Sete a 10 dias a seguir à terceira imunização foram retiradas amostras de sangue, através de sangramento retro-orbital o soro foi recolhido e avaliado, quanto à sua capacidade de inibir a ligação de IL-17 ou IL-17F a IL-17RC em ensaios de neutralização (por ex. aqui descrito) e para corar IL-17RC 142 transfectado em relação a células 293 não transfectadas num ensaio de coloração FACS. Ratinhos continuaram a ser imunizados e amostras de sangue foram retiradas e avaliadas como descrito acima até os títulos de neutralização alcançarem um patamar. Nessa altura os ratinhos com os títulos de neutralização mais elevados foram injectados por via intravascular com 25-50 yg de proteína IL-17RC-Fc em PBS. Três dias mais tarde, o baço e os nódulos linfáticos destes ratinhos foram recolhidos e utilizados para a geração de hibridoma, por exemplo utilizando células de mieloma de ratinho (P3-X63-Ag8.653-3.12.11), ou outras linhas celulares adequadas do estado da técnica, utilizando processos padrão conhecidos do estado da técnica (ver por ex. Kearney, J. F. e tal., J. Immunol. 123:1548-50, 1979; e Lane, R.D. J Immnol

Methods 81:223-8, 1985).

2. IL-17RC solúvel, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, IL-17RC-CFLAG

Ratinhos inactivados IL-17RC intactos de seis a doze semanas são imunizados por injecção intraperitoneal com 25-50 yg de IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, ou IL-17RC-CFLAG solúveis misturados 1:1 (v:v) com adjuvante Ribi (Sigma) num período bisemanal. Sete a 10 dias a seguir à terceira imunização foram retiradas amostras de sangue, através de sangramento retro-orbital o soro foi recolhido e avaliado, quanto à sua capacidade de inibir a ligação de IL-17 ou IL-17F a IL-17RC em ensaios de neutralização (por ex. aqui descrito) e para corar IL-17RC transfectado em relação a células 293 não transfectadas num ensaio de coloração FACS. Ratinhos continuaram a ser imunizados e amostras de sangue foram retiradas e avaliadas como descrito acima até os títulos de neutralização alcançarem um patamar. Nessa altura, os ratinhos com os títulos de neutralização mais elevados foram 143 injectados por via intravascular com 25-50 yg de anti-génio de proteína de IL-17RC, IL-17RC-CEE, zcytor-CHIS, ou IL-17RC-CFLAG solúveis em PBS. Três dias mais tarde, o baço e os nódulos linfáticos destes ratinhos foram recolhidos e utilizados para a geração de hibridoma, por exemplo utilizando células de mieloma de ratinho (P3-X63-Ag8.653-3.12.11) , ou outras linhas celulares adequadas do estado da técnica, utilizando processos padrão conhecidos do estado da técnica (ver por ex. Kearney, J. F. et al., J. Immunol. 123:1548-50, 1979; e Lane, R.D. J Immnol Methods 81:223-8, 1985).

3. Transfectantes P815 que expressam IL-17RC

Ratinhos DBA/2 de seis a dez semanas são imunizados por injecção intraperitoneal de lxlO5 células vivas transfectadas, por exemplo células P815/IL-17RC (por ex., 0,5 ml a uma densidade celular de 2xl05 células/ml). Antes da injecção as células são mantidas na fase de crescimento exponencial. Para a injecção as células são colhidas, lavadas três vezes com PBS e novamente suspensas em PBS até a uma densidade de 2xl05 células/ml. Neste modelo os ratinhos desenvolvem um tumor ascítico em 2-3 semanas e progridem até à morte em 4-6 semanas, a não ser que uma resposta imunitária ao antigénio transfectado alvo seja estabelecida. Às três semanas ratinhos sem inchaço abdominal aparente (indicativo de ascites) são reimunizados como acima em intervalos de 2-3 semanas. Sete a dez dias após a segunda imunização, foram retiradas amostras de sangue, através de sangramento retro-orbital o soro foi recolhido e analisado, quanto à sua capacidade para inibir a ligação de IL-17 ou IL-17F a IL-17 ou IL-17RC em ensaios de neutralização (por ex. aqui descritos) e para corar IL-17RC transfectado através de 293 células não transfectadas num ensaio FACS de coloração. Os ratinhos continuam a ser 144 imunizados e as amostras de sangue retiradas e avaliadas como descrito acima, até os títulos de neutralização atingirem um patamar. Nessa altura os ratinhos com os títulos de neutralização mais elevados são injectados por via intraperitonial com lxlO5 células vivas P815 transfectadas. Quatro dias mais tarde, os nódulos de baço e linfa destes ratinhos são recolhidos e uti P8151izados para geração de hibridoma, por exemplo utilizando células de mieloma de ratinho (P3-X63-Ag8.653-3.12.11), ou outras linhas celulares adequadas do estado da técnica, utilizando processos padrão conhecidos do estado da técnica (ver por ex. Kearney, J. F. et al. supra; e Lane, R.D. supra).

Uma abordagem alternativa ao esquema de imunização acima envolve a imunização de células vivas P815 transfectadas por injecção intraperitonial de l-5xl06 células irradiadas transfectadas cada 2-3 semanas. Nesta abordagem, nenhum dos animais desenvolve ou morre de ascites. Em vez disso, os animais são monitorizados para uma resposta imunitária neutralizante a IL-17RC no seu soro como referido acima retirando sangue após a segunda imunização. Quando os títulos de neutralização atingiram um nível máximo aos ratinhos com os títulos mais elevados é administrado um injecção pré-fusão, intraperitonial de 5xl06 células irradiadas e quatro dias mais tarde, os nódulos do baço e nódulos linfáticos destes ratinhos são recolhidos e utilizados para a geração de hibridoma, por exemplo utilizando células de mieloma de ratinho (P3-X63-Ag8.653-3.12.11), ou outras linhas celulares adequadas do estado da técnica, utilizando processos padrão conhecidos do estado da técnica (ver por ex. Kearney, J. F. et al. supra; e Lane, R.D. supra).

B. Pesquisa de fusões de hibridomas de anticorpos que se ligam a IL-17RC e inibem a ligação de IL-17ou IL-17F a IL-17RC 145 São efectuadas três pesquisas primárias diferentes nos hibridomas dos sobrenadantes nos dias 8-10 após fusão. No primeiro ensaio, os anticorpos nos sobrenadantes foram testados, quanto à sua capacidade de se ligarem às proteínas IL-17RC, IL-17RC-muF, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, ou IL-17RC-CFLAG humanas solúveis ligadas a uma placa por ELISA utilizando os reagentes de segundo passo HRP-conjugado de cabra, anti-ratinho kapa e anti-lamda de cadeia leve para identificar anticorpos de ratinhos ligados. Para demonstrar especificidade para a porção de IL-17RC das proteínas de fusão IL-17RC foram avaliados sobrenadantes positivos no ensaio inicial numa proteína irrelevante fundida com a mesma região Fc de murino (mG2a), sequências EE, sequência HIS, ou sequência FLAG. Os anticorpos nesses sobrenadantes que se ligam à proteína de fusão IL-17RC e não ao muFc irrelevante ou a outras proteínas contendo a sequência da proteína de fusão foram consideradas serem específicas para IL-17RC. No segundo ensaio, os anticorpos em todos os hibridomas dos sobrenadantes foram avaliados por ELISA, quanto à sua capacidade de inibir a ligação de IL-17 biotinilado humano ou IL-17F biotinilado humano a proteínas de fusão IL-17RC-muFc ou IL-17RC ligadas a placas.

Todos os sobrenadantes contendo anticorpos que se ligam especificamente a IL-17RC quer inibam ou não a ligação a IL-17 ou IL-17F a IL-17RC no ensaio ELISA foram testados subsequentemente, quanto à sua capacidade de inibir a ligação de IL-17 ou IL-17F a IL-17RC transfectado com células Baf3 ou BHK, ou células epiteliais bronquiais normais humanas. Todos os sobrenadantes que eram de neutralização positiva nos ensaios de inibição de IL-17 ou IL-17F ou ensaios de inibição de ambos IL-17 ou IL-17F foram subsequentemente avaliados, quanto à sua capacidade de corar IL-17RC transfectado ou 146 células Baf3 ou BHK por análise FACS. Esta análise foi concebida para confirmar que a inibição da ligação de IL-17 ou IL-17F a IL-17RC era de facto devida a um anticorpo que se liga especificamente ao receptor IL-17RC. Além disso, uma vez que a análise foi efectuada com um reagente de segundo passo anti-IgG, resultados específicos FACS positivos indicam que o anticorpo de neutralização pertencia provavelmente à classe IgG. Por esta via foi identificado um poço mestre que se liga a IL-17RC na placa de ligação ELISA, inibia a ligação de IL-17 ou IL-17F a IL-17RC no ensaio de inibição baseado em ELISA, bloqueava a interacção de IL-17, e IL-17F com células Baf3 ou BHK transfectadas com IL-17RC, respectivamente, e era fortemente positivo para a coloração de IL-17RC transfectadas com células Bacf3 ou BHK com um reagente de segundo passo de IgG anti-ratinho. 0 terceiro ensaio consiste em células epiteliais bronquiais primárias humanas que expressam IL-17RC e que podem ser induzidas para secretar IL-8 ou IL-6 na resposta ao tratamento com IL-17F. 0 anticorpo monoclonal específico é ensaiado, quanto à sua capacidade de inibir a produção estimulada de IL-8 ou IL-6 pelos IL-17 ou IL-17F por estas células. A produção de IL-8 e IL-6 é testada como resposta à IL-17 ou IL-17F como aqui descrito.

Alternativamente, o anticorpo monoclonal; anti-IL-17RC mediou a inibição de IL-17 ou IL-17F induziu a produção de luciferase em células NIH 3T3 ou outras células contendo IL-17RC pode ser utilizado conjuntamente, ou em vez de um dos ensaios de neutralização da bioactividade referidos acima. 0 ensaio de luciferase mediado por NFkB nas células NIH 3T3 é aqui descrito. C) Clonagem do anticorpo específico anti-IL-17RC produtor de hibridomas 147

Linhas celulares de hibridomas que produzem um anti-IL-17RC mAb especifico que neutralizava de forma cruzada a ligação de IL-17 e IL-17F a células BaF3 ou BHK adequadamente transfectadas são clonadas, através de uma abordagem de diluição de baixa densidade padrão (menos do que 1 célula por poço). Aproximadamente 5-7 dias após aplicação em placa, os clones foram pesquisados por ELISA em por exemplo IL-17RC-muF humanos ligados à placa seguido de um novo teste dos poços positivos por ELISA em muFc irrelevante contendo proteína de fusão como descrito acima. Os clones seleccionados, cujos sobrenadantes se ligam a IL-17RC-muFc e não a muFc irrelevante contendo proteína de fusão são ainda confirmados, quanto a uma actividade específica de anticorpos repetindo ambos os ensaios de neutralização, assim como a análise FACS. Todos os clones positivos de anticorpo IL-17RC seleccionados são clonados num mínimo de duas vezes para ajudar a assegurar a clonalidade e para avaliar a estabilidade da produção de anticorpo. Mais ciclos de clonagem são efectuados e pesquisados como descrito até preferencialmente, pelo menos 95% dos clones resultantes serem positivos, quanto à neutralização da produção de anticorpo anti-IL-17RC. D) Caracterização bioquímica da molécula reconhecida por anti-IL-17RC-mAbs A confirmação bioquímica de que a molécula alvo, IL-17RC reconhecida pelo anti-Il-17RC putativo é de facto IL-17RC é efectuada por imunoprecipitação padrão seguida por análise de SDS-PAGE ou procedimentos de transferência de Western, utilizando ambos preparações de membrana solúvel de linhas celulares não transfectadas que expressam IL-17RC são utilizadas para mostrar que mAbs reconhece a cadeia nativa do 148 receptor, assim como o transfectado. Alternativamente, os mAbs são testados, quanto à sua capacidade de imunoprecipitarem especificamente ou de transferência de western da proteína IL-17RC-muFc.

Exemplo 19

Neutralização de IL-17RC humano de ratinhos injectados com células P815 transfectadas com IL-17RC humano

Utilizando um ensaio de neutralização baseado em células, o soro de ratinhos injectados com células vivas P815 transfectadas com IL-17RC humano (Exemplo 17) é adicionado como uma diluição em série a 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02%, e 0%. As placas de ensaio são incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 4 dias, altura em que azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) é adicionado a 20 μΐ/poço. As placas são novamente incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 16 horas. Os resultados mostraram que o soro de quatro dos animais poderia neutralizar a sinalização tanto de huIL-17 e huIL-17F, através de IL-17RC humano.

Resultados tais como estes fornecem evidência adicional que bloqueando eficazmente IL-17RC por ligação, bloqueamento, inibição, redução, antagonismo, ou neutralização da actividade de IL-17 ou IL-17F (individualmente, ou em conjunto), por exemplo, através de um anticorpo monoclonal de neutralização para IL-17RC da presente invenção, poderia ser vantajoso para reduzir os efeitos de IL-17 e IL-17F (isoladamente ou conjuntamente) in vivo e pode reduzir a inflamação induzida por IL-17 e/ou IL-17F, tal como a verificada, por exemplo na psoríase, IBD, colite, doença pulmonar obstrutiva, crónica, fibrose cística, ou outras doenças inflamatórias induzidas por IL-17, e ou IL-17F incluindo IBD, artrite, asma, artrite 149 psoriática, colite, estados de inflamação da pele, e dermatite atópica.

Exemplo 20

Farmacocinética do anticorpo monoclonal IL-17RC anti-humano

O anticorpo monoclonal de teste, IL-17RC anti-humano é disponibilizado, por exemplo, em aliquotas de 3x3 mL a uma concentração de aproximadamente 1 mg/ml (determinada pela absorvância UV a 280 nM) e foi armazenado a -80°C até ser utilizado. O veiculo é lxPBS (50 mM NaPC^, 109 mM NaCl), pH 7,3. O mAb é descongelado à temperatura ambiente antes de ser utilizado e são utilizadas as aliquotas 1 e 2, tal como

fornecido para os grupos de dosagem de 100 yg IV e SC respectivamente. Metade da aliquota 3 é diluída em tampão 1:2 em lxPBS para o grupo de dosagem de 50 yg SC e a segunda metade da aliquota 3 é diluída d 1:10 em lxPBS para o grupo de dosagem de 10 yg SC. Ratinhos fêmea SCID (n=96) são obtidos a partir dos Labs. Charles River. A saúde dos animais foi verificada à chagada e foram instalados em grupo (3 animais por gaiola). Os ratinhos tinham 12 semanas de idade com um peso corporal médio de aproximadamente 22 g no início do estudo. A) Protocolo de dosagem

Ratinhos fêmea SCID (n=24/grupo de dosagem) foram colocados aleatoriamente em quatro grupos de dosagem (Tabela 8) . Ao grupo 1 foi administrado o IL-17RC mAb anti-humano através de injecção iv de aproximadamente 93 yl numa veia da cauda e aos grupos 2, 3, e 4 foi administrado mAb através de injecção SC de aproximadamente 93 yL na nuca. 150 B) Colheita da amostra

Antes da recolha de sangue os ratinhos foram completamente anestesiados com halotano ou isofluorano. As amostras de sangue foram recolhidas, através de sangramento cardíaco em todos os intervalos de tempo com excepção do tempo de 168 h (recolhido através de sangramento do olho e os mesmos animais foram novamente sangrados no tempo de 504 h, através de sangramento cardíaco) . O sangue foi recolhido em tubos de separação de soro e deixado coagular durante 15 minutos. As amostras foram centrifugadas subsequentemente durante 3 minutos a 14000 rpm. Após centrifugação, alíquotas de 125-150 μΐ foram dispensadas para tubos de eppendorf marcados e imediatamente armazenados a -80°C até serem analisados.

Tabela 8

Grupo # Dose (ROA) Animais Pontos farmacocinéticos 1 100 yg (IV) 3 ratinhos/intervalo de tempo* 0,25, 1,4,8,24,72,168,336 e 504 h 2 10 yg (SC) 3 ratinhos/intervalo de tempo* 0,25, 1,4,8,24,72,168,336 e 504 h 3 50 yg (SC) 3 ratinhos/intervalo de tempo* 0,25, 1,4,8,24,72,168,336 e 504 h 4 10 yg (SC) 3 ratinhos/intervalo de tempo* 0,25, 1,4,8,24,72,168,336 e 504 h *Foram utilizados os mesmos animais nos intervalos de tempo de 168 e 504 h

C) Quantificação das concentrações de IL-17RC-mAb anti-humano no soro por ELISA

Um ensaio de imunoadsorção de enzima ligado (ELISA) é desenvolvido e qualificado para analisar amostras de soro de 151 ratinho de animais doseados com anti-IL-17RC mAb durante estudos farmacocinéticos. Este ensaio é desenhado para aproveitar o anticorpo secundário comercialmente disponível e a detecção colorimétrica utilizando TMB. As diluições utilizadas para a curva padrão foram modificadas para melhorar a definição da porção linear da curva padrão. Uma curva padrão na gama de 100 ng/ml a 0,231 ng/ml com diluições em duplicado permite a quantificação de amostras do soro de ratinho. As amostras QC são diluídas de 1:100, 1:10000 em 10% de soro de ratinho SCID e calculadas de volta a partir da curva padrão. D) Análise farmacocinética A concentração de soro em relação aos dados de tempo foi carregada no software WinNonLin Professional 4.0 (Parsight, Inc.; Cary, NC) para análise farmacocinética. Análise não compartamental é utilizada para determinar os parâmetros farmacocinéticos baseados nos dados médios para cada ponto.

Exemplo 21

Neutralização da actividade de IL-17A e IL-17F por um anticorpo monoclonal IL-17RC anti-humano

Utilizando um ensaio de neutralização baseado em células é adicionado um anticorpo monoclonal IL-17RC anti-humano purificado como uma diluição em série, por exemplo, 10 yg/ml, 5 yg/ml, 2,5 yg/ml, 1,25 pg/ml, 625 ng/ml, 313 ng/ml, 156 ng/ml e 78 ng/ml. As placas de ensaios são incubadas a 37°C, 5% CO2 durante 4 dias, altura em que azul de Alamar é adicionado (Accumed, Chicago, IL) 20 μΐ/poço. As placas são novamente incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 16 horas. Este ensaio é capaz de demonstrar que o anticorpo monoclonal IL- 152 17RC anti-humano é capaz de neutralizar a sinalização de huIL-17 e huIL-17F, através de IL-17RC humano. Para anticorpos altamente eficazes, quando utilizados a uma concentração de aproximadamente 10 yg/ml o anticorpo neutraliza completamente a proliferação induzida por huIL-17 ou huIL-17F, com a inibição da proliferação diminuindo de uma forma dependente da dose a concentrações mais baixas. Espera-se que um ratinho mAb de controlo negativo de isotipo emparelhado testado nas concentrações acima descritas não apresente inibição de proliferação de qualquer citocina. Estes resultados são capazes de demonstrar ainda que os anticorpos monoclonais para IL-17RC podiam de facto antagonizar a actividade dos ligandos pró-inflamatórios, 11-17 e IL-17F a baixas concentrações.

Exemplo 22 IL-17A induz níveis elevados de iFN-gama e de TNF-alfa em células mononucleares humanas do sangue periférico Células mononucleares humanas do sangue periférico (PBMC) são purificadas por centrifugação de gradiente de densidade de ficoll e depois incubadas de um dia para o outro a 37°C apenas em meio, 50 ng/ml de anticorpo CD3 anti-humano, ou a combinação de 50 ng/ml de anticorpo CD3 humano mais 1 yg/ml de anticorpo CD28 anti-humano. Culturas em replicado para cada uma destas condições são efectuadas sem adição de citocina, 25 ng/ml de IL-17A humano, ou 25 ng/ml de IL-17F humano. Após incubações de 24 horas os sobrenadantes de cada cultura são recolhidos e testados para o teor de citocina utilizando a matriz citométrica de esferas da B-D Bioscience Thl/Th2 (CBA). Verificámos que as culturas que tinham sido estimuladas com anti-CD3 ou anti-CD3 mais anti-CD28 tinham sido suplementadas com IL-17A continha níveis significativamente 153 elevados de IFN-gama e TNF-alfa (aumento de 3-5 vezes para cada) em relação a culturas sem adição de citocinas, ou aquelas que receberam IL-17F. Culturas às quais não tinha sido adicionada estimulação anti-CD3 não mostraram alterações significativas nos níveis de citocina. Além disso, a adição de IL-17A não induziu alterações significativas noutras citocinas testadas com CBA incluindo IL-2, IL-4,IL-5, e IL-10.

Estes dados indicam que a IL-17a , mas não a IL-17F podem aumentar a produção de IFN-gama e da TNF-α em culturas de PBMC estimuladas com anti-CD3 ou anti-CD3 mais anti-CD28.

Exemplo 23 IL-17RC-Fc diminui a incidência da doença e a sua progressão no modelo do ratinho de artrite induzida pelo colagénio (CIA) A) Modelo do ratinho de artrite induzida pelo colagénio (CIA)

Ratinhos machos de dez semanas DBA/1J (Jackson Labs) são divididos em 3 grupos de 13 ratinhos/grupo. No dia 21 é dado aos animais uma injecção intradérmica na cauda de 50-100 μΐ de colagénio chick Tipo II formulado em adjuvante de Freund completo (preparado por Chondrex, Redmond, WA), e três semanas mais tarde no dia 0 é dada a mesma injecção com a excepção de que é preparada em adjuvante incompleto de Freund. IL-17RC-Fc é administrado como uma injecção intraperitonial 3 vezes por semana durante 4 semanas a diferentes intervalos de tempo que vão do dia 0 até a um dia em que a maioria dos ratinhos exibe sintomas moderados da doença. Os grupos receberam 10 ou 100 pg/ml de IL-17RC-FC por animal por dose, e os grupos de controlo receberam o veículo como controlo, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Os animais começam a mostrar sintomas de artrite após a segunda injecção de colagénio com a 154 maior parte dos animais a desenvolver inflamação em 1,5-3 semanas. A extensão da doença é avaliada em cada pata utilizando um calibrador para medir a espessura da pata e atribuindo uma pontuação clinica (0-3) a cada pata: 0=normal, 0,5=dedo(s) da pata inflamado(s), 1= inflamação suave da pata, 2= inflamação moderada da pata, e 3= inflamação grave da pata como detalhado abaixo. B) Monitorização da doença

Os animais podem começar a apresentar sinais de inflamação da pata brevemente após a segunda injecção de colagénio, e alguns animais podem mesmo começar a terem sinais de inflamação dos dedos das patas antes da segunda injecção de colagénio. A maior parte dos animais desenvolvem artrite em 1,5-3 semanas da reforçar injecção de reforço, mas alguns podem necessitar de um período mais longo de tempo. A incidência da doença neste modelo é tipicamente de 95-100%, e de 0-2 animais que não respondem (determinado após 6 semanas de observação) é tipicamente observado num estudo que utiliza 40 animais. De salientar, que quando a inflamação se inicia; pode ocorrer uma ocorrência transiente comum de inflamação da pata ou do dedo variável, ou de baixo grau. Devido a esta razão, não é considerado um animal ter uma doença estabelecida até se ter desenvolvido um inchaço marcado persistente na pata.

Todos os animais foram observados diariamente par avaliar o estado da doença nas suas patas, o que é realizado atribuindo uma pontuação qualitativa clínica a cada uma das patas. Em cada dia cada animal possui as suas 4 patas avaliadas de acordo com o seu estado de doença clínica. Para determinar a pontuação clínica pode-se pensar na pata como tendo 3 zonas, os dedos, a própria pata (manus ou pés) e as 155 articulações dos pulsos ou do calcanhar. A extensão e gravidade da inflamação relativa a estas zonas é anotada incluindo: observações de cada calcanhar, quanto ao inchaço; unhas partidas, ou vermelhidão dos dedos; anotação de qualquer evidência de edema ou vermelhidão em qualquer das patas; anotação de qualquer perda de uma demarcação anatómica fina dos tendões ou ossos; avaliação do pulso, ou calcanhar, quanto a qualquer edema, ou vermelhidão; e anotação se a inflamação se estende proximalmente até à perna. Uma pata com uma pontuação de 1, 2 ou 3 encontra-se baseada em primeiro lugar na impressão global de gravidade, e em segundo lugar no número de zonas envolvidas. A escala utilizada para a avaliação clinica é apresentada abaixo. C) Avaliação clínica 0 = normal 0,5 = um ou vários dedos estão envolvidos, mas apenas os dedos encontram-se inflamados l=inflamação suave envolvendo a pata (1 zona) e pode incluir um dedo ou dedos 2= inflamação moderada na pata e pode incluir alguns dos dedos e/ou dos pulsos/calcanhares (2 zonas) 3=inflamação severa na pata, pulso/calcanhar nalgumas, ou em todos os dedos (3 zonas).

Doença estabelecida é definida como uma pontuação qualitativa da inflamação da pata com o valor de 3 ou mais que persiste em dois dias seguidos. Até a doença estabelecida se encontrar presente, a data é registada e designada como o primeiro dia do animal com "doença estabelecida". O sangue é recolhido, através da experiência para monitorizar os níveis de soro de anti-corpos anti-colagénio, assim como a imunoglobulina do soro e níveis de citocina. 156

Anticorpos do soro anti-colagénio correlacionam-se bem com a gravidade da doença. Os animais são eutanizados no dia 21, e o sangue é recolhido para obtenção de soro e CBCs. De cada animal é recolhida uma pata afectada em 10% de NBF para histologia e outra é congelada em azoto líquido e armazenada a -800°C para análise de ARN. Também H de baço, H de timo, H de nódulo linfático mesentérico, um lóbulo de linfa e o rim esquerdo são colhidos em ARNlater para análise de ARN e ^ de baço, ^ de timo, ^ de nódulo linfático mesentérico, o fígado restante e o rim direito são recolhidos em 10% NBF para histologia. O soro é recolhido e congelado a -800°C para ensaios de imunoglobulina e de citocina.

Grupos de ratinhos que recebem IL-17RC-Fc em todos os pontos são caracterizados por um atraso no início e na progressão da inflamação da pata. Estes resultados indicam que IL-17RC pode reduzir a inflamação, assim como a incidência da doença e progressão associada com este modelo. Estes resultados são ainda suportados pele observação de que IL-17RC-Fc resultou em níveis diminuídos dos anticorpos TNF-a, IL-lb, e anti-colagénio no soro.

Exemplo 24

Sobre-expressão estável de IL-17RC na linha celular de ensaio de murino, Nih3t3/kzl42.8 que expressa o factor de transcrição apl/nfkb A linha celular de ensaio de murino, Nih3t3/kzl42.8 foi transfectada com IL-17RCxl humana (SEQ ID N° 2) num vector de expressão com um gene de resistência ao metotrexato (dihidrofolato redutase, DHFR). Esta transfecção foi efectuada utilizando um kit disponível comercialmente e com as recomendações do fabricante(Mirus, Madison, WI. Cat. #MIR218). 157

As células foram colocadas num meio de crescimento corrigido de 1 μΜ para seleccionar o vector de expressão contendo o transgénico de IL-17RCX1 humano. Após a selecção foi gerado um conjunto de transfecção de lL-17RCxl humano, e designado nih3t3/kzl42.8/hcytorl4xl. A) Ensaio de luciferase que utiliza a linha celular de ensaio nih3t3/kzl42.8

Uma vez que nih3t3/kzl42.8 possui um repórter estável kzl42 não há necessidade de adicionar a este repórter a infecção por adenovirus. Assim o protocolo da luciferase foi encurtado e efectuado da forma seguinte: 1. Aplicação em placas Células nih3t3142.8 foram aplicadas 5000 células/poço em placas de cultura de células sólidas brancas revestidas de 96 poços, (Cat. #3917. Costar) utilizando DMEM/10% FBS contendo glutamina e corrigida com piruvato e cultivadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO2. Neste segundo dia, o meio da placa foi removido e substituído por DMEM 1% FBS, contendo a glutamina e corrigida com piruvato e cultivadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO2. 2. Ensaio da Luciferase para medir a activação de IL-17F e F do repórter estável kz!42 A seguir à incubação de um dia para o outro no meio DMEM 1% fbs, foram efectuadas diluições dos ligandos humanos IL-17A e IL-17F em meio isento de soro corrigido com BSA a um nível de 28%. Após adicionar as diluições de ligando as células foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante 4 horas, após o que o meio foi removido, as células lisadas durante 15 minutos e a 158 intensidade de fluorescência média (MFI) foi medida utilizando o sistema e reagentes do ensaio de luciferase (Cat. #el531 Promega, Madison, WI) e um luminómetro de microplaca. A actividade foi detectada para ambos os ligandos a concentrações que variam de 0,l-1000ng/ml. O conjunto de transfecção nih3t3/hcytorl4xl apresentou uma actividade semelhante para o ligando IL-17A de murino, assim como a linha celular parental (exemplo 14) . Contudo, o conjunto de transfectante cytorl4xl apresentou uma resposta elevada para os tratamentos de IL-17A e F, mesmo, quando estas concentrações de ligandos eram tão baixas como 20 femptogramas. O facto da sinalização de MIL-17A ser comparável à da linha celular parental (exemplo 14) sugere que não existe um problema geral, não especifico com as células que expressam IL-17RC e que o IL-17A de murino sinaliza provavelmente, através do receptor IL-17R ou IL-17RC do receptor da célula de murino endógeno nih3t3. Assim , o facto de IL-17A e IL-17F provocam uma elevação de MFI a tais baixas concentrações de ligando pode indicar uma hiper-resposta especifica das células àqueles ligandos, que é mediada, através da sobre expressão do receptor IL-17RC humano.

Este resultado possui ramificações e utilidade clinica e biológica significativa. Por exemplo, as situações fisiológcas poderiam provocar regulação para cima local dos receptores de IL-17RC que poderiam então tornar estas áreas de hiper resposta a IL-17A e IL-17F, resultando em activação biológica a concentrações de ligando muito mais baixas do que as sugeridas sem a sobre expressão de IL-17RC. Deste modo, níveis de receptores bastante mais baixos podem ser suficientes para antagonizar estas concentrações de ligandos hipoteticamente mais baixas do que se pensava anteriormente, ou era reconhecido pelos peritos no estado da técnica. 159

Exemplo 25

Antagonistas da actividade de IL-17F e IL-17A diminuem a incidência da doença e sua progressão numa doença inflamatória dos intestinos modelo (IBD)

Este modelo é desenhado para mostrar que o tecido intestinal cultivado de doentes com IBD produzem niveis mais elevados de mediadores inflamatórios comparados com o tecido de controlo saudáveis. Esta produção acrescida de mediadores inflamatórios (incluindo, mas não estando limitados a IL-lb, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A e F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, membros da família MIP, MCP-1, G e GM-CSF, etc.) contribui para os sintomas e patologias associadas com IBDs, tais como a doença de Crohn (CD) e a colite ulcerativa (UC), através dos seus efeito(s) na activação de vias inflamatórias e células efectoras a jusante. Estas vias e componentes conduziram então a danos/destruição das células observadas in vivo. Por isso, este modelo pode simular este aspecto de mediador inflamatório acrescido de IBD. Além disso, quando o tecido intestinal de controlos saudáveis ou de linhas celulares epiteliais intestinais humanas (IEC) é cultivado na presença destes componentes inflamatórios, pode ser observada sinalização da via inflamatória, assim como evidência de danos no tecido e nas células. A terapia que seria eficaz na IBD humana in vivo iria funcionar nos modelos acima ex vivo ou IEC, através de inibição e/ou neutralização da produção e/ou presença de mediadores de inflamação.

Neste modelo, o tecido intestinal humano é recolhido de doentes com IBD ou de controlos saudáveis que sofrem de biopsia intestinal, resseccionamento, ou de colheita de tecido post-mortem, e processado utilizando uma modificação de 160

Alexakis et al (Gut 53:85-90; 2004). Sob condições assépticas, as amostras são limpas suavemente com quantidades copiosas de PBS seguidas de cultura de sessões de tecido moido, na presença de meio completo de cultura de tecido (mais antibióticos para evitar sobre-crescimento bacteriano). Amostras do mesmo conjunto de tecido são tratadas com um dos seguintes:veiculo (PBS); IL-17A recombinante humano (r h); rhIL-17F; ou rhIL-17A + rhIL-17F. Além disso, estes são tratados com ou sem um antagonista de IL-17A ou IL-17F, isoladamente ou em combinação (tal como IL-17RC) . Este protocolo experimental é seguido de estudos com células IEC humanas, com excepção de que as células são sub-cultivadas de stocks existentes. Após tempos variáveis nas culturas (de 1 a vários dias), os sobrenadantes são recolhidos e analisados, quanto a niveis de mediadores inflamatórios, incluindo aqueles listados acima. Nas amostras de doentes com IBD, ou em amostras tratadas com rhIL-17A e/ou F, niveis de citocinas inflamatórias e quimiocinas são elevados comparados com amostras de tecido de controlo saudável não tratado. A adição de antagonistas à actividade de IL-17F e/ou IL-17A, tal como receptores solúveis de IL-17RC e seus anticorpos incluindo os anticorpos monoclonais anti-humanos IL-17RC e anticorpos de neutralização da presente invenção reduz notavelmente a produção de mediadores inflamatórios, e assim, seria de esperar que fossem eficazes na IBD humana.

Exemplo 26

Antagonistas da actividade de IL-17F e IL-17A diminuem a incidência da doença e a sua progressão num modelo de esclerose múltipla (MS) 161 A esclerose múltipla (MS) é uma doença complexa que se pensa ser mediada por vários factores, incluindo a presença de infiltrados inflamatórios linfocíticos e de células inflamatórias e desmielinização, através do CNS.

Microglias são células do tipo macrófago que povoam o sistema nervoso central (CNS) e tornam-se activados por ferimento ou infecção. Considerou-se que microglias desempenham papeis críticos em várias doenças do CNS incluindo MS e podem ser utilizados para estudar mecanismo(s) de iniciação, progressão, e terapia da doença (Nagai et al. Neurobiol Dis 8:1057-1068; 2001; Olson et al. J. Neurosci Methods 128:33-43; 2003). Linhas celulares microglianas humanas imortalizadas e/ou linhas celulares de astroglia humanas estabelecidas, podem por isso ser utilizadas para estudar alguns dos efeitos de mediadores inflamatórios sobre estes tipos de células e o seu potencial para neutralização. Mediadores inflamatórios (incluindo, mas não limitados a II-lb, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 A e F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, membros da família MIP, RANTES, IP-10, MCP-1, Ge GM-CSF, etc.) podem contribuir para os sintomas e patologia associada com MS, através dos seus efeito (s) na activação de vias inflamatórias e células efectoras a jusante.

Para avaliar as acções pró-inflamtórias de IL-17A e IL-17F, e a capacidade de um antagonista da actividade de IL-17F e/ou IL-17A, tal como os receptores solúveis de IL-17RC e seus anticorpos incluindo os anticorpos monoclonais e neutralizantes anti-humano IL-17RG da presente invenção para neutralizarem ou diminuírem estes efeitos, células gliais cultivadas são tratadas com um dos seguintes: veículo; rhlL-17A;, rhIL-17F; rhIL-17a + IL-17F. Além disso, estes são tratados com ou sem antagonistas de IL-17A ou IL-17F, isoladamente ou em combinação (tal como IL-17RC solúvel). Após tempos variados de cultura (de lha vários dias), são 162 recolhidos sobrenadantes e células e analisados, quanto aos níveis e/ou expressão de mediadores inflamatórios, incluindo aqueles listados acima. Níveis de citocinas inflamatórias e quimocinas são elevadas na presença de rhlL-17A e/ou IL-17F comparados com culturas tratadas com de IL-17F e/ou IL-17A, tal como os receptores IL-17RC solúveis e seus anticorpos incluindo os anticorpos de neutralização e monoclonais de anti-humano IL-17RC da presente invenção reduz notavelmente a produção e expressão de mediadores inflamatórios, e assim, seria de esperar que fosse eficaz em aspectos inflamatórios associados com a MS humana.

Exemplo 27

Antagonistas da actividade de IL-17F e IL-17A diminuem a incidência da doença e a sua progressão num modelo de artrite reumatóide (RA) e osteoartrite (OA)

Este modelo é desenhado para mostrar que culturas sinoviais (incluindo macrófagos sinoviais, fibroblastos sinoviais, e condrócitos articulares) e explantes de doentes com RA e AO produzem níveis mais elevados de mediadores inflamatórios comparados com culturas/explantes de controlos saudáveis. Esta produção acrescida de mediadores inflamatórios (incluindo mas não estando limitados a oncostatina M, IL-lb, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17A, e F, IL-18, IL-13, TNF-a, IFN-g, IP10, RANTS, RANKL, membros da família MIP; MCP-1, G e GM-CSF, óxido nítrico, etc.) contribui para os sintomas e patologia associada com RA e AO, através dos seus efeito(s) na activação de vias inflamatórias e células efectoras a jusante. Estas vias e componentes conduzem então a infiltrados inflamatórios e perda de matriz /destruição da cartilagem, perda de osso, regulação para cima de prostaglandinas e ciclooxigenases. Por 163 isso este modelo pode simular os aspectos inflamatórios destrutivos de RA e AO in vitro e experiências ex vivo. Além disso, quando os explantes e culturas sinoviais de controlos saudáveis são cultivados na presença de vários destes componentes inflamatórios (por ex. oncostatina M, TNF-a, IL-lb, IL-6, IL-17A e F, IL-15, etc.), pode ser observada a via de sinalização inflamatória. Terapias que poderiam ser eficazes na RA humana in vivo iriam funcionar nos modelos in vitro e ex vivo acima inibindo e/ou neutralizando a produção e/ou presença de mediadores inflamatórios.

Neste modelo, explantes sinoviais humanos são recolhidos de doentes com RA, AO, ou de controlos saudáveis que são submetidos a substituição de articulações ou colheita pos-mortem de tecido e são processados utilizando uma modificação de Wooley e Tetlow (Artrite Res 2: 65-70; 2000) e van't Hof et al (Rheumatology 39:1004-1008; 2000). Culturas de fibroblastos sinoviais, macrofagos sinoviais e condrócitos articulares são também estudados. Replicados de amostras são tratados com um dos seguintes: veiculo (PBS); IL-17A humano recombinante (rh); rhIL-17F; ou rhIL-17A+rhIL-17F, e algumas amostras contêm várias combinações de oncostatina M, TNF-a, IL-lb, IL-6, IL-17A, IL-17F, e IL-15. Além disso, estes são tratados com ou sem um antagonista da actividade de IL-17F e/ou IL17A, tal como os receptores solúveis de IL-17RC e seus anticorpos incluindo os anticorpos monoclonais e neutralizantes do anti-humano-IL-17RC desta invenção. Após se ter variado o tempo de cultura (de lha vários dias), os sobrenadantes são colhidos e analisados, quanto aos seus níveis de mediadores inflamatórios, incluindo aqueles listados acima. Nas amostras de doentes com RA ou AO, ou nas amostras tratadas com rhIL-17A e/ou IL-17F isoladamente ou em combinação com outras citocinas inflamatórias), os níveis de citocinas inflamatórias e quimocinas são elevados comparados com explantes de controlo 164 saudáveis não tratados ou em culturas de células não tratadas. A adição de antagonistas da actividade de IL-17F e/ou IL-17A, tal como IL-17RC receptores solúveis e seus anticorpos incluindo os anticorpos monoclonais e de neutralização de anti-humano-IL-17RC da presente invenção reduzem notavelmente a produção de mediadores inflamatórios, e assim seria de esperar que fossem eficazes na RA e AO humana.

Exemplo 28

Respostas funcionais de IL-17A e IL-17F Células NIH-3T3/KZ 142 são transfectadas de forma estável com IL-17RCxl humano (SEQ ID N°:l) e IL-17RCxl (SEQ ID N°:25) de ratinho. Como descrito acima cada linha foi transfectada durante 7 e 15 minutos com uma dose de resposta a IL-17A, IL-17F, murino-IL17F e controlos adequados. Ambos os IL-17A e IL-17F deram uma resposta dependente da dose nos factores de transcrição IkB-α e p38 MAPK, quando IL-17RCxl (SEQ ID N.l) foram transfectados, aproximadamente 30% do que a sinalização inerente da linha de controlo. IL-17A e IL-17F não deram aumento na sinalização quando IL-17RCxl (SEQ ID N°:25) de murino foi transfectado. IL-17F de murino não deu nenhum aumento de sinalização, quer de IL-17RCCxl humano ou de murino.

Exemplo 29

Expressão de IL-17A, IL-17F, IL-17RA e IL-7RC em modelos de doença de murino

Quatro modelos de doença de murino (asma, colite DSS, dermatite atópica e encefalomielite alérgica) foram analisados 165 utilizando técnicas conhecidas para a expressão de IL-17A, IL-17F, IL-17R e IL-17RC.

No modelo da asma, IL-17a e IL-17F foram expressos a niveis detectados muito baixos no pulmão, baço, nódulos linfáticos de drenagem do pulmão e células de infiltração dos pulmões em ratinhos doentes e não doentes. A mensagem de IL-17RC foi encontrada como sendo mais altamente expressa no pulmão, quando comparada com baço e nódulo linfático, mas não foi regulado com a doença. IL-17R foi expresso de forma mais elevada no baço e nos nódulos de drenagem dos pulmões, quando comparado com o pulmão, mas não foi regulado com a doença.

Ao contrário do modelo da asma, IL-17A e IL-17F foram altamente regulados para cima nos ratinhos doentes, mas não nos ratinhos normais no modelo da DSS no cólon proximal e distai. Nenhuma das citocinas foi significativamente regulada para cima no nódulo linfático mesentérico. Verificou-se além disso uma regulação para cima de ambas as citocinas no contexto da colite aguda induzida por DSS, mas não na colite crónica induzida por DSS. Constatou-se que IL-17R era expresso de forma proeminente nos nódulos mesentéricos linfáticos, quando comparados com o cólon proximal e distai, mas não era regulado com a doença. Em contraste, IL-17RC era mais altamente expresso no tecido do cólon proximal e distai quando comparado com os nódulos mesentéricos linfáticos. A expressão de IL-17RC também não era regulada com a doença.

Na dermatite atópica ARNm de IL-17A não era detectável. Verificou-se que IL-17F era expresso na pele e nos nódulos de drenagem linfáticos da pele, mas não parecia ser suficientemente regulado na doença. IL-17RC era mais altamente expresso na pele, quando comparado com os nódulos linfáticos da pele, mas também não era regulado na doença.

Na encefalomielite alérgica experimental IL-17A e IL-17F pareciam ser regulados para cima na medula espinal doente, mas 166 não nos ratinhos saudáveis. IL-17 pode ter sido mais altamente expresso em nódulos linfáticos, quando comparado com a medula espinal, mas a expressão nos nódulos linfáticos não era regulada com a doença. Contudo, os níveis globais de expressão nestes tecidos eram bastante baixos. IL-17R é mais altamente expresso em tecido do nódulo linfático, do que no cérebro e medula espinal. IL-17RC não foi testado.

Resumidamente, a expressão de IL-17A e IL-17F parece ser regulada com a doença no contexto da colite induzida por DSS e modelos da encefalomielite alérgica experimental, mas aparentemente não para a asma ou para a dermatite atópica. A expressão de IL-17R e IL-17RC não aprece ser regulada com a doença, mas a expressão de IL-17R parece ser enriquecida em tecido linfoides, enquanto que a expressão de IL-17RC parece estar enriquecida em tecidos não linfoides.

Exemplo 30

IL-17RC é um mediador de activação de IL-17A e IL-17F A linha celular de ensaio nih3t3/kzl42.8 foi transfectada com IL-17RCX humano (SEQ ID N°:2) num vector de expressão com um gene de resistência ao metotrexato (dihidrofolato redutase, DHFR) IL-17RA humano (SEQ ID N°:21) foi transfectado de forma semelhante para esta linha celular. As transfecções foram efectuadas utilizando um kit disponível comercialmente e as recomendações do fabricante. Células (Mirus, Madison, WI. Cat. #MIR218) foram colocadas em meio de crescimento 1 μΜ mtx para seleccionar o vector de expressão contendo as construções de expressão. Após selecção foram gerados os conjuntos de transfecção e designados e designados nih3t3/kzl42.814X1 e nif3t3/kzl42.8/IL-17R. 167 A) Ensaio da luciferase utilizando as linhas celulares à base de nih3t3/kz!42.8

Uma vez que as linhas celulares à base de nih3t3/kzl42.8 possuem repórteres apl/nfkb estáveis (kzl42) não existe necessidade de infecção com adenovirus para adicionar este repórter. Assim, o protocolo do ensaio da luciferase foi encurtado e efectuado da seguinte maneira: 1. Aplicação das células em placas Células foram aplicadas 5000 células/poço em placas de cultura de células sólidas brancas revestidas de 96 poços, (Cat. #3917. Costar) utilizando DMEM/10% FBS contendo glutamina e corrigida com piruvato e cultivadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO2. Neste segundo dia, o meio da placa foi removido e trocado por DMEM 1% FBS, contendo glutamina e corrigida com piruvato e cultivada de um dia para o outro a 37°C e 5% C02. 2. Ensaio da luciferase para medir a activação de IL-17a e F do repórter kzl42 estável

Após a incubação de um dia para o outro no meio DMEM 1% fbs, as diluições dos ligandos IL-17A e IL-17F humanos foram efectuadas em meio isento de soro corrigido com BSA para um nivel de 0,28%. Após adição das diluições do ligando as células foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante 4 horas, após o que o meio foi removido, as células foram lisadas durante 15 minutos e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi medida utilizando 0 sistema do ensaio da luciferase e reagentes (Cat#el531 Promega, Madison, WI) e um luminómetro de microplaca. Foi detectada actividade para ambos os ligandos 168 a concentrações que variam de 1-1000 ng/ml. Os valores de EC50 discutidos abaixo são médias de pelo menos 4 experiências. O conjunto de transfecção nih3t3/kzl42.8/hcytorl4xl apresentou um actividade semelhante para o ligando IL-17A de murino, assim como a linha celular parental com um EC50 de cerca de 40ng/ml (exemplo 14) . O facto de a sinalização de MIL-17A na linha recombinante de hcytorl4xl ser comparável à da linha celular parental sugere que o IL-17A de murino está provavelmente a sinalizar através dos receptores 17RA ou IL-17RC da linha celular endógena de nih3t3 de murino e não activa as células, através do hcytorl4xl. Contudo, o conjunto de transfectantes hIL-17RCXl apresentou uma resposta elevada a ao tratamento por IL-17A humano com um EC50 de 41 ng/ml Vs 2,8 ng/ml (médias de 4 experiências) na linha parental (uma EC50 6,8 vezes mais potente na linha recombinante). Além disso, a linha recombinante hIL-17RCXl possuía uma resposta acrescida a hIL-17F com uma EC50 de 0,61 ng/ml na linha recombinante em relação a 10 ng/ml na linha parental (uma EC50 17 vezes mais potente do que na linha parental) . A potência acrescida de hIL-17A e F na linha hIL-17RCXl é consistente com IL-17RCX1 sendo um receptor de elevada afinidade para IL-17A e IL-17F. Em contraste, a linha recombinante possuía uma sensibilidade yg/ml para a linha parental. Não houve um aumento da EC50 da hIL-17F na linha recombinante hIL-17RA, com uma EC50 de IL-17F de 12,4 ng/ml e 8,9 ng/ml para a linha parental.

Este resultado é significativo porque implica especificamente hIL-17RCXl como um mediador da activação de hIL-17A e hIL-17F e sugere que hIL-17RA medeia a sinalização apenas para activação de hIL-17A e não para hIL-17F.

Exemplo 31

Administração intravenosa de IL-17A e IL-17F 169

Para determinar o efeito da administração i.v. no murino ou nos seres humanos de IL-17A ou IL-17F nas contagens de sangue completa e nas citocinas/quimocinas do soro em ratinhos BALB/c em vários intervalos de tempo. A administração i.v. de lyg/ml-17A resultou num aumento de duas vezes nos neutrófilos circulantes (por CBC) e um aumento de aproximadamente 10 vezes no soro KC e MCP-1 (por Luminex) 1-2 h a seguir à administração; foram observados resultados semelhantes nestas quimocinas com 5 yg de hIL-17A. Os niveis de monócitos no sangue foram também significativamente aumentados em ratinhos tratados com 1 yg de mIL-17A (apresentaram o maior aumento), 5 yg de hIL-17A ou 5 yg de hIL-17F no intervalo de 2 h. Administração I.V. de m e hIL-17F resultou em aumentos marcados no soro IL-15 (por Luminex) nos intervalos de 1 e 2 horas, e pequenos aumentos no soro KC e MCP-1 nos mesmos pontos de tempo.

Exemplo 32

Neutralização da administração intravenosa de IL-17A e IL-17F

Para neutralizar os aumentos mediados por IL-17A e IL-17F i.v. nas citocinas e quimiocinas com receptores solúveis i.p. (MIL-17RA:Fc para ligandos de murino; IL-17RC humano solúvel para ligandos humanos). Foi administrado a ratinhos fêmea BALB/c por injecção i.p. PBS, 100 yg MIL-17RA.FC, ou 100 yg de IL-17RC solúvel humano três horas antes de receber a injecção i.v. pela cauda: PBS; 2 yg de MIL-17F, ou 2 yg de MIL-17A e F (ratinhos que receberam MIL-17RA: Fc) ; ou 2 yg de hIL-17A, hIL-17F, ou 2 yg de hIL-17A e F (para ratinhos que receberam IL-17RC solúvel humano) . O soro foi colhido lha seguir à 170 administração de ligandos e um pequeno número de citocinas do soro foram analisadas.

Ratinhos tratados com receptor solúvel i.p. tiveram reduções marcadas em aumentos mediados por nas concentrações de soro de IL-17A e KC comparados com os ratinhos tratados com PBS+IL-17A.

Exemplo 33

Ensaios de proteínas baseados na ligação a placas dos polipéptidos IL-17RC solúvel e IL-17RC/IL-17RA 0 formato do EIA de captura é o seguinte: revestimento da placa de ELISA com IgG anti-humano de cabra a 1 yg/ml e incubado de um dia para o outro a 4 °C. Lavar e bloquear a placa com 200 μΐ por poço de 1% BSA durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavagem, adicionar as séries de diluição (de 100 yg/ml a 0,10 yg/ml) das variantes do receptor (A1586F, A1587F), ou ILl7RCxl (A1034F) à placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar, adicionar ligando marcado com biotina @ 10:1 (IL17A) ou 6:1 (IL17F) e incubar 1 h à temperatura ambiente. Lavar, adicionar estrepavidina-peroxidase de rábano silvestre 0 0,5 yg/ml e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar e adicionar substrato TMB durante 4 minutos. Parar a reacção adicionando solução de paragem. (Nota: todos os volumes de reagentes eram de 50 μΐ por poço anão ser que referido de outro modo) . Um resultado positivo seria valores elevados de OD, geralmente acima de 0,5. Os resultados indicaram que a construção 1342 (SEQ ID N°74) não se liga a IL-17A liga-se de uma forma fraca a IL-17F neste ensaio. A construção 1341 (SEQ ID N°:72) liga-se a IL-17A e IL-17F muito fortemente. IL-17RCxl liga-se a IL-17A e IL-17F. 171 0 formato da neutralização de EIA é o seguinte: revestir a placa ELISA com um receptor solúvel (A1034F) a 1 yg/ml e incubar de um dia para o outro a 4°C. Lavar e bloquear a placa com 200 μΐ por poço de 1% BSA durante 1 hora à temperatura ambiente. Enquanto se bloqueia incubar numa placa separada as séries de diluição 50 yg/ml a 0,05 yg/ml) das variantes do receptor solúvel (A1586F, A1586F) com ligando marcado com biotina 0 10:1 (IL17A) ou 6:1 (IL17F) em iguais volumes de 1 hora à temperatura ambiente. Lavar e bloquear a placa, adicionar o complexo receptor-ligando à placa bloqueada e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar, adicionar estrepavidina-peroxidase de rábano silvestre 0 0,5 yg/ml e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar e adicionar substrato TMB durante 7 minutos. Parar a reacção adicionando solução de paragem. (Nota: todos os volumes de reagentes eram de 50 μΐ por poço a não ser que referido de outro modo). Um resultado positivo seria valores baixos de OD, geralmente abaixo de 0,5. Os resultados indicaram que a construção 1342 (SEQ ID N°74) neutraliza de uma forma fraca a ligação de IL-17A a IL17RCxl e neutraliza fortemente a ligação de IL17F a IL17RCxl. A construção 1341 (SEQ ID N°:72) neutraliza de forma fraca a ligação de IL-17A e IL-17RCxl e neutraliza fracamente a ligação de IL17F a IL-17RCxl. A neutralização indica que a proteína variante se está a ligar ao ligando biotinilado.

Exemplo 34

Protocolo do ensaio de ligação FACS

Para avaliar a capacidade dos polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solúveis da presente invenção para se ligarem aos ligandos IL-17A e IL-17F foi utilizado um ensaio de ligação 172

competitiva baseado na citometria de fluxo. A incubação de uma linha celular BHK transfectada de forma estável com IL17RCx4 de comprimento completo na presença dos ligandos IL-17A ou IL-17F, e o receptor solúvel dirigido para se ligar aos ligandos permite a detecção e quantificação relativa do ligando ligado à superfície da célula (e por isso não ligado ao receptor solúvel). A biotinilação do ligando permite a detecção FACS utilizando um fluoroforo conjugado de estreptavidina secundária. A redução do ligando ligado à célula numa titulação do receptor solúvel é registado como uma redução na fluorescência média das células. Os ligandos biotinilados são pré-misturados individualmente a 1 pg/ml com quantidades de titulação do receptor solúvel em meios de coloração (HBSS+ 1%BSA+0,1% NaAzida+lOmM HEPES) em volumes de 100 μΐ e

incubados à ta durante 15 minutos. Uma linha celular BHK transfectada de forma estável com IL17RCx4 de comprimento completo é preparado para a coloração de ligando por nova suspensão com Versene (Invitrogen cat. 15040-066), equilibrando para 2xl05 células/100 μΐ, preparação de agregados e nova suspensão na pré-mistura de ligando/receptor solúvel. As células coradas são incubadas a 4°C durante 30 minutos, lavadas em lx meio de coloração, e coradas com estreptavidina-PE (BD Pharmingen cat. 554061) numa proporção 1:100. As células são incubadas a 4°C no escuro durante 30 minutos, lavadas 2x em meio de coloração, e novamente suspensas numa proporção 1:1 de meio de coloração e Cytofix (BD Biosciences 554655). O citómetro de fluxo BD LSRII ou instrumento

semelhante foi utilizado para recolher dados e análise. A Figura 5 representa um gráfico padrão. O gráfico foi gerado utilizando o programa de software Prizm. Os valores de Y representam a MFI normalizada até a um máximo e a um minimo (100% e 0%) baseados em poços apenas com ligando e em poços de controlo sem ligando/sem receptores solúveis, e assim a 173 percentagem de ligação dos ligandos às células. 0 software calcula o IC50 para cada curva.

Exemplo 35

Inibição da ligação especifica de IL-17A e IL-17F humano biotinilado com um polipéptido IL-17RC/IL-17RA solúvel 0 ensaio de ligação utilizado para determinar a capacidade dos polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA de se ligarem a IL-17A e IL-17F é aqui descrito. São efectuados estudos de ligação como discutido acima com excepção de que polipéptidos solúveis adicionais, tais como SEQ ID N° 157 e 158 foram incluídos na reacção de ligação. Este polipéptido solúvel inibiu a ligação de IL-17A e IL-17F a IL-17RC transfectado com células BHK na mesma extensão que a proteína de fusão IL-17RCxl Fc humana (SEQ ID N°:64). Os restantes polipéptidos solúveis incluindo o polipéptido solúvel da SEQ ID N° 157 e 158 são incluídos na tabela 9 abaixo.

Tabela 9*

Polipéptido Solúvel Variante IC50- IL17A Polipéptido Solúvel Variante IC50- IL17F IL17RA/RC 1407 7 IL17RC 1390 9 IL17RA/RC 1407 9 IL17RA/RC 1454 18 IL17RA/RC 1454 4 IL17RA/RC 1454 31 IL17RA/RC 1454 17 IL17RA/RC 1454 95 IL17RA/RC 1454 20 IL17RA/RC 1407 33 IL17RC 1390 12 IL17RA/RC 1407 42 IL17RA/RC 1341 30 IL17RC 1210 31 IL17RC 1210 35 IL17RC 1210 61 IL17RC 1210 47 IL17RC 1210 67 174 (continuação)

Polipéptido Solúvel Variante IC50- IL17A Polipéptido Solúvel Variante IC50- IL17F IL17RC 1210 74 IL17RA/RC 1341 47 IL17RC 1459 126 IL17RC 1459 103 IL17RC 1342 217 IL17RC 1342 313 *IC50 da inibição de competição baseada em células (ng/μΐ); ordenação das construções dos ligantes mais fortes até aos mais fracos baseado na IC50 para cada ligando

Exemplo 36

Afinidade de ligação dos polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA a IL-17A e IL-17F

Foram testados os polipéptidos IL-17RCxI, IL-17RA e o polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RAC (SEQ ID N°: 157 e 158), quanto à sua afinidade de ligação para IL-17A e IL-17F como se segue: anticorpo especifico igG-Fc cabra-anti-Hu (Jackson #109-005-008) foi diluído para 50 yg/ml em pH 5,0 acetato de Na e imobilizado num chip CM5 Biacore. O protocolo foi optimizado para capturar o receptor a um máximo teórico de ligação antes de injectar uma série de concentração de cada ligando para observar a associação e a dissociação. Foram testados os receptores solúveis e o polipéptido IL-17RC/IL-17RA, quanto à ligação a uma série de concentrações de cada ligando. A superfície foi regenerada com injecções de 2x30 s de glicina a pH 1,75 entre ciclos. Os dados foram avaliados utilizando o software Biacore Evaluation para definir valores cinéticos e são apresentados na Tabela 10 abaixo. 175

Tabela 10*

Afinidade de ILl7RCxl humano para IL-17A humano 05-2005 ka (1/Ms) kd (1/s) kD (M) Rmax (RU) Chi2 (RU2) 1, 05E+06 4,90E-04 4 . 69E-10 9.02 0.424 1,24E+06 4,38E-04 3.52E-10 8.56 0.324 Afinidade de IL17RCx: para IL-17F hunu humano ino 05-2005 ka (1/Ms) kd (1/s) kD (M) Rmax (RU) Chi2 (RU2) 9,91E+05 4,31E-04 4,35E-10 7,22 0,378 1,11E+06 3,84E-04 3,46E-10 7,57 0,549 Polipéptido IL17RC/IL-17RA solúvel para IL-17A humano 04-2006 ka (1/Ms) kd (1/s) kD (M) Rmax (RU) Chi2 (RU2) 1,42E+06 6,22E-05 4,39E-11 20,5 0,460 2, 61E+06 9,95E-05 3,82E-11 18,3 0,888 Polipéptido IL17RC/IL-17RA solúvel para IL-17F humano 04-2006 ka (1/Ms) kd (1/s) kD (M) Rmax (RU) Chi2 (RU2) 1,82E+06 2,61E-04 1,43E-10 10,2 0,495 2,49E+06 3,15E-04 1,26E-10 11,2 0,544 Afinidade de IL-17RA humano para IL-17A humano 06-2006 ka (1/Ms) kd (1/s) kD (M) Rmax (RU) Chi2 (RU2) 3,7 0E+05 8,65E-05 2,34E-10 29,5 0,249 2,89E+05 8,75E-05 2,96E-10 35,1 0,197 Afinidade de IL-17RA humano para IL-17F humano 07-2006 ka (1/Ms) kd (1/s) kD (M) Rmax (RU) Chi2 (RU ) 2,09E+04 5,56E-04 2,66E-08 20,3 0,071 2,55E+04 4,40E-04 1,72E-08 9,9 0,076 *São apresentadas as constantes de equilíbrio e c e os valores caem dentro dos limites da máquina. e velocidade

Chi2 diz respeito à soma dos quadrados dos resíduos entre as curvas de ligação e a avaliação das curvas de ajuste. Quanto 176 mais perto de 0, maior a confiança que temos nos dados. Estes dados são apresentados com um grau de confiança elevado.

Estes dados demonstram a ligação de IL-17A humano e IL-17F humano a IL-17RA e IL-17RC. Especificamente IL-17RC humano demonstra uma afinidade de ligação semelhante para IL-17A humano e IL-17F humano com constantes de dissociação de equilíbrio (KD) na gama dos 400 picomolar (pM) . O IL-17RC/IL-17RA produziu a maior discrepância da afinidade do ligando com uma diferença de 100 vezes entre o IL-17A humano, KD-300pM, e a ligação de IL-17F humano, KD-30 nanomolar (nM).

Exemplo 37

Criação das linhas celulares de ensaio repórter IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 e IL-17RCx4/NIH3T3/KZl42.8 recombinantes humanas A linha celular repórter de murino NIH3T3/KZ142.8 aqui descrita foi criada para utilizar novas linhas celulares de ensaio, recombinantes para IL-17RA (SEQ ID N°21) ou IL-17RCx4 (SEQ ID N°:166). Isto foi conseguido por transfecção destas linhas celulares com construções de expressão contendo cada um destes ADNcs. O vector de expressão utilizado, pzmpll, contém o gene da dihidrofolato redutase. Assim, foram seleccionados transfectantes utilizando meio corrigido com 1 μΜ de metotrexato para criar conjuntos estáveis. Estas linhas celulares de ensaio foram designadas hIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 e hIL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8 .

Exemplo 38 177

Um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA antagoniza a activação de IL-17A humano de células humanas recombinantes hlL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 A eficácia da competição do polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA solúvel (SEQ ID N°s: 157 e 158) para activação de IL-17A humano de células hIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 recombinantes humanas foi medida como se segue: aplicação de células em placas para um ensaio de luciferase foi a mesma que a aqui descrita. No dia do ensaio foi primeiro dado a estas células uma dosagem em triplicado do dobro de uma série de um volume de receptores solúveis com duas vezes a concentração final, incluindo o polipéptido solúvel acima, IL-17RA e IL-17RC começando com 2 yg/ml, (que resulta numa concentração final de 1 yg/ml combinada uma vez com o ligando). A seguir foi aplicado um volume de IL-17A a 1 ng/ml, que é 2 vezes a concentração final de 0,5 ng/ml que resulta na mistura dos receptores-ligandos. A activação máxima foi determinada utilizando um conjunto em triplicado que recebeu 0,5 ng/ml de IL-17A sem receptor. A activação basal foi determinada utilizando um conjunto em triplicado que recebeu apenas meio de ensaio que não continha ligando nem receptor solúvel. Uma análise de dados revelou que a IC50 para uma activação de IL-17A da linha celular acima pelo polipéptido solúvel era de 7 ng/ml. Não havia potência suficiente para o IL-17RA solúvel ou IL-17RC antagonizarem convicentemente a activação de 0,5 ng/ml de hIL-17A desta linha celular mesmo com a dose mais elevada de 1 pg/ml de receptor solúvel.

Exemplo 39 178

Um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA antagoniza a activação de IL-17F humano de células humanas recombinantes hlL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 A eficácia da competição do polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°s: 157 e 158) para activação de IL-17F humano de células hIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 recombinantes humanas (descritas acima) foi medida como se segue: aplicação de células em placas para um ensaio de luciferase foi a mesma que a aqui descrita. No dia do ensaio foi primeiro dado a estas células uma dosagem em triplicado do dobro de uma série de um volume de polipéptido solúvel com duas vezes a concentração final, incluindo o polipéptido solúvel acima, IL-17RA e IL-17RC começando com 4 yg/ml, (que resulta numa concentração final de 2 yg/ml combinada uma vez com o ligando) . A seguir foi aplicado um volume de IL-17F a 40 ng/ml, que é 2 vezes a concentração final de 20 ng/ml que resulta na mistura dos receptores-ligandos. A activação máxima foi determinada utilizando um conjunto em triplicado que recebeu 20 ng/ml de IL-17F sem receptor. A activação basal foi determinada utilizando um conjunto em triplicado que recebeu apenas meio de ensaio que não continha ligando nem receptor solúvel. Uma análise de dados revelou que a IC50 para uma activação de IL-17A da linha celular acima pelo polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA era de 0,48 pg/ml. Não havia potência suficiente para o IL-17RA solúvel ou IL-17RC antagonizarem convicentemente a activação de 20 ng/ml de hIL-17A desta linha celular mesmo com a dose mais elevada de 2 yg/ml de receptor solúvel.

Exemplo 40 179

Um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA antagoniza a activação de IL-17F humano de células humanas recombinantes hlL-17RCX4/NIH3T3/KZ142.8 A eficácia da competição do polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°s: 157 e 158) para activação de IL-17F de células hIL-17RCX4/NIH3T3/KZ142.8 recombinantes (descritas acima) foi medida como se segue: aplicação de células em placas para um ensaio de luciferase foi a mesma que a aqui descrita. No dia do ensaio foi primeiro dado a estas células uma dosagem em triplicado do quíntuplo de uma série de um volume de receptores solúveis com duas vezes a concentração final, incluindo o polipéptido solúvel acima, IL-17RA e IL-17RC começando com 4 pg/ml. A seguir foi aplicado um volume de IL-17F lote A1275F a 2 ng/ml que é a duas vezes a concentração final de 1 ng/ml que resulta na mistura dos receptores- ligandos. A activação máxima foi determinada utilizando um conjunto em triplicado que recebeu 1 ng/ml de IL-17F sem receptor. A activação basal foi determinada utilizando um conjunto em triplicado que recebeu apenas meio de ensaio que não continha ligando nem receptor solúvel. Uma análise de dados revelou que a IC50 para uma activação de IL-17F do polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA era de 0,8 yg/ml, era de 6 pg/ml para IL-17RC, e não possuía antagonismo para IL-17RA em qualquer dose.

Exemplo 41

Polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA neutraliza a actividade de indução de IL-17A e IL-17F para G-CSF, IL-6 e IL-8

Pequenas células epiteliais humanas das vias respiratórias (SAEC) foram tratadas com IL-17A humano ou com IL-17F humano e 180 foram recolhidos os sobrenadantes de 48 h. Estes sobrenadantes foram testados e apresentaram uma indução dependente da dosagem de G-CSF, IL-6, e IL-8 como indicado na tabela 11 abaixo:

Tabela 11 Múltiplos de indução em sobrenadantes de 48 h G-CSF IL-6 IL-8 SAEC tratadas com: huIL-14 50 ng/ml 26 13 8 10 ng/ml 24 14 6 2 ng/ml 14 8 3 0,4 ng/ml 13 8 3 huIL-17F 250 ng/ml 15 11 4 50 ng/ml 10 8 3 10 ng/ml 8 8 2 2 ng/ml 4 5 2 SAEC foram também tratadas com doses de 0,01-10 yg/ml de polipéptido IL-17RC/IL-17RA solúvel (SEQ ID N°s: 157 e 158) em combinação com 10 ng/ml de IL-17A humano ou 50 ng/ml de IL-17F (ambos os ligandos e os polipéptidos solúveis foram incubados conjuntamente durante 30 minutos a 37°C antes de serem adicionados às células), e os sobrenadantes de 48 h foram recolhidos. Como apresentado na tabela 12 abaixo, estes sobrenadantes apresentaram uma diminuição em G-CSF, IL-6, e IL-8 demonstrando que o polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA era capaz de neutralizar eficazmente a actividade de indução pelo IL-17A humano e IL-17F humano destas citocinas. 181

Verificou-se que não era possível determinar valores de IC50 para a neutralização de IL-6, porque para a dose mais baixa (0,01 yg/ml) do polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA testado, a neutralização tinha apenas voltado para aproximadamente 50% do Max.) .

Tabela 12 0 receptor solúvel de IL-17RA/RC neutraliza a actividade de hulL-17A/F IC50 de IL-17RA/RC (pg/ml) Indução por huIL-17A (10 ng/ml) de G-CSF 0,14 Indução por huIL-17F (50 ng/ml) de G-CSF 1,20 Indução por huIL-17A (10 ng/ml) de IL-8 0,03 Indução por huIL-17F (50 ng/ml) de IL-8 0,57 Indução por huIL-17A (10 ng/ml) de IL-6 94% neutralizado a 10 yg/ml 49% neutralizado a 10 yg/ml Indução por huIL-17F (50 ng/ml) de IL-6 72% neutralizado a 10 yg/ml 57% neutralizado a 10 yg/ml

Exemplo 42

Eficácia dos polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA em amostras humanas de esclerose múltipla A esclerose múltipla (MS) é uma doença complexa que é pensada para ser mediada, através de vários factores, incluindo a presença de infiltrados de células linfocíticas e mononucleares inflamatórias e desmielinização em todo o CNS. Micróglias são células do tipo macrófago que povoam o sistema nervoso central (CNS) e são activadas por ferimentos ou infecção. Micróglias e células neuronais foram ambas consideradas como desempenhando papeis críticos em várias 182 doenças do CNS incluindo MS, e podem ser utilizadas para estudar mecanismo(s) de iniciação, progressão, e terapia da doença (Nagai et ai. Neurobiol. Dis 8:1057-1068; 2001; Olson et al J. Neurosci Methods 128:33-43; 2003; Giuliani et al. J. Neuroimmunol 165: 83-91; 2005). Culturas celulares neuronais primárias, linhas celulares microgliais humanas imortalizadas e/ou linhas celulares astrogliais humanas estabelecidas podem por isso ser utilizadas para estudar alguns dos efeitos dos mediadores inflamatórios nestes tipos de linhas celulares e o seu potencial de neutralização. Mediadores inflamatórios (incluindo mas não limitados a IL-lb, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A e F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, membros da família MIP, RANTES, IP-10, MCP-1, G e GM-CSF, etc.) podem contribuir para os sintomas e patologia associada com MS, através dos seus efeito (s) na activação de vias inflamatórias e células efectoras a jusante.

Para avaliar as acções pró-inflamatórias de IL-17A e IL-17F nestes tipos de células, e a capacidade dos polipéptidos solúveis da presente invenção, tais como o polipéptido IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158) para neutralizar ou diminuir estes efeitos, células neuronais ou gliais são tratadas com um dos compostos seguintes; veículo, rhIL-17A; rhIL-17F; rhlL-17A+IL-17F. Além disso, estas são tratadas com ou sem um polipéptido solúvel da presente invenção, tais como o polipéptido IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158). Num conjunto separado de culturas células T em circulação isoladas a partir de sujeitos humanos e activados com anti-CD3 são adicionadas às células de cultura neuronais e gliais na ausência de IL-17A ou IL-17F exógeno, disponibilizando deste modo um processo de co-cultura de investigar os efeitos destrutivos de células T activadas nestes tipos de células. As células T são tratadas com ou sem um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como o polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158). 183

Após tempos de cultura variados (de lha vários dias) os sobrenadantes e células são recolhidos e analisados, quanto aos níveis e à expressão de mediadores inflamatórios, incluindo aqueles listados acima, e são também analisados quanto à sobrevivência das células. Níveis de citocinas inflamatórias e quimiocinas, e morte de células neuronais, são elevados na presença de rhIL-17A e/ou IL-17F em comparação com culturas tratadas apenas com veiculo. A adição de um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como o polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158) reduz marcadamente a produção e expressão de mediadores inflamatórios nestas culturas, e aumenta a sobrevivência das células nas células neuronais.

Por isso, uma vez que estas experiências ex vivo demonstram que um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158) pode reduzir as acções destrutivas e inflamatórias que estão associadas com a patologia do tratamento da MS humana, o tratamento com tais polipéptidos solúveis seria de esperar que fosse eficaz na redução de aspectos inflamatórios, morte neuronal, e/ou desmielinização associada com MS humana.

Exemplo 43

Eficácia dos polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA em amostras humanas de artrite reumatóide ("RA") e osteoartrite ("OA")

Estes modelos foram desenhados para mostrar que culturas sinoviais humanas (incluindo macrofagos sinoviais, fibroblastos sinoviais, e condrócitos articulares) e explantes de doentes com RA ou AO produzem níveis mais elevados de mediadores inflamatórios quando comparados com 184 culturas/explantes de controlos saudáveis que por sua vez podem contribuir para a degradação de componentes da matriz celular (por ex. osso, cartilagem, etc. que é uma marca distintiva destas doenças. Além disso, os modelos de co-cultura descritos abaixo são desenhados para mostrar que os mediadores inflamatórios presentes no fluido sinovial de RA/AO e/ou células activadas T podem também resultar numa maior inflamação e degradação da matriz. A produção acrescida de mediadores inflamatórios (incluindo, mas não limitados a oncostatina M, IL-lb, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17A e F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, IP-10, RANTES, RANKL, membros da família MIP, MCP-1, MMP-9, G e GM-CSF, óxido nítrico, etc.) contribui para os sintomas e patologias associadas com RA e AO, através dos seus efeito (s) na activação de vias inflamatórias e células efectoras a jusante. Estas vias e componentes conduziram então a infiltrados inflamatórios, cartilagem e perda/destruição de matriz, perda de osso, e regulação para cima de metaloproteases de matriz prostanglandinas e ciclooxigenases. Por isso, estes modelos podem simular os aspectos inflamatórios destrutivos de RA e AO em experiências in vitro e ex vivo. Além disso, quando os explantes e culturas sinoviais de controlos saudáveis são cultivados na presença de componentes inflamatórios adicionados de forma exógena (por ex. oncostatina M, TNF-a, IL-lb, IL-6, IL-17A e F, IL-15 etc.), ou alternativamente na presença de fluido sinovial de doentes com RA (que poderiam conter componentes inflamatórios de forma endógena) , pode ser observada uma sinalização de via inflamatória e degradativa. Terapias que poderiam ser eficazes na RA humana in vivo iriam funcionar nos modelos in vitro e ex vivo acima inibindo e/ou neutralizando a produção e/ou presença de mediadores inflamatórios. 185

Nestes modelos, explantes sinoviais humanos são recolhidos de doentes com RA, AO, ou de voluntários saudáveis de controlo submetidos a substituição de articulações e de recolha de tecido pos-mortem, e processados utilizando uma modificação de Wooley e Tetlow (Arthritis Res 2: 65-75; 2000) e van't Hof et al (Reumatology 39:1004-1008; 2000). São também estudadas culturas de fibroblastos sinoviais, macrófagos sinoviais e condrócitos articulares. Amostras replicadas são tratadas com um dos seguintes: veiculo (PBS); IL-17A recombinante humano (rh); rhIL-17F; ou rhIL-17A+rhIL-17F, e algumas amostras contêm várias combinações de oncostatina M, TNF-a, IL-lb, IL-6, IL-17A, IL-17F, e IL-15. Um conjunto separado de amostras são tratadas com células T activadas humanas, ou fluido sinovial de controlos saudáveis ou de doentes com RA ou AO. Além disso, todas estas amostras são tratadas com ou sem um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como um polipéptido IL-17RC solúvel, ou um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158). Após um tempo de cultura variável de 1 h a vários dias) , os sobrenadantes e células são recolhidos e analisados quanto aos niveis de mediadores inflamatórios e biomarcadores de cartilagem/osso/matriz, incluindo aqueles listados acima. Nas amostras de doentes com RA ou AO, ou em amostras tratadas com fluido sinovial RA/AO, células T activadas, rhIL-17A e/ou rhIL-17F (isoladamente ou em combinação com outras citocinas inflamatórias e quimocinas e marcadores de cartilagem/osso/matriz são elevados comparados com explantes de controlo saudáveis não tratados, ou em culturas celulares não tratadas. A adição de um polipéptido solúvel da presente invenção reduz marcadamente a produção de mediadores inflamatórios e de degradação de cartilagem/osso/matriz, e assim seria de esperar que fosse eficaz na RA e AO humana. 186

Exemplo 44

Eficácia dos polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA na doença inflamatória dos intestinos humana ("IBD"), através de culturas de biopsia de mucosas

Este modelo foi desenhado para mostrar que tecido intestinal de doentes cultivados de doentes com IBD produzem níveis mais elevados de mediadores inflamatórios comparados com o tecido de controlos saudáveis. Esta produção acrescida de mediadores inflamatórios(incluindo mas não estando limitados a IL-lb, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A e F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, membros da família MIP, MCP-1, G e GM-CSF, etc.) contribuem para os sintomas e patologias associadas com IBD, tais como a doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC), através dos seus efeito (s) na activação de vias inflamatórias e células efectoras a jusante. Estas vias e componentes podem então conduzir a danos/destruição do tecido e células observada in vivo. Por isso, este modelo pode simular este aspecto mediador inflamatório acrescido de IBD. Além disso, quando o tecido intestinal de controlos saudáveis ou de células epiteliais intestinais humanas (IEC) é cultivado na presença destes componentes inflamatórios, pode ser observada a sinalização da via inflamatória, assim como evidência de danos nos tecidos e nas células.

Terapias que seriam eficazes na IBD humana in vivo iriam funcionar nos modelos acima ex vivo ou de IEC inibindo e/ou neutralizando a produção e/ou a presença de mediadores inflamatórios.

Neste modelo, tecido intestinal humano é recolhido de doentes com IBD de controlos saudáveis submetidos a biopsia intestinal, re-seccionamento ou de recolha de tecido pos- 187 mortem, e processado utilizando uma modificação de Alexakis e tal (Gut 53:85-90/2004). Em condições assépticas, as amostras são suavemente limpas com quantidades copiosas de PBS, seguidas da cultura de secções moídas dos tecidos, na presença de meio completo de cultura de tecido (mais antibióticos para evitar o sobre-crescimento bacteriano). Amostras do mesmo conjunto de tecido moído são tratados com um dos seguintes: veículo (PBS); IL-17A recombinante humano (rh) IL-17A; rhlL-17F; ou rhIL-17A+rhIL-17F. Além disso, estes são tratados com ou sem um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como um polipéptido IL-17RC solúvel, ou um polipéptido IL-17RC/IL-17RA solúvel (SEQ ID N°:158). Este protocolo experimental é seguido por estudos com linhas IEC humanas, com a excepção de que células são passadas de stocks existentes. Após tempos variáveis de cultura (de lha vários dias), os sobrenadantes são recolhidos e analisados, quanto a níveis de mediadores inflamatórios, incluindo aqueles listados acima. Nas amostras de doentes com IBD, ou em amostras tratadas com rhIL-17A e/ou F, os níveis de citocinas e quimiocinas inflamatórias são elevados, quando comparados com amostras de tecido de controlo saudáveis não tratadas. A adição de um polipéptido solúvel da presente invenção reduz marcadamente a produção de mediadores inflamatórios, e assim seria de esperar ser eficaz na IBD humana.

Uma arma adicional deste estudo pode incluir comparações da produção de mediadores inflamatórios a partir de biopsias aqueles que não estavam a ser medicados ou considerados como não respondendo ao tratamento.

Exemplo 45 188

Eficácia dos polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA em amostras de IBD humana, através da função da barreira epitelial A manutenção da integridade da barreira epitelial é um factor critico na conservação de um tracto gastrointestinal saudável. A evidência experimental sugere que o estado de não estanquicidade no intestino pode contribuir par o desenvolvimento de IBD. Células imunitárias localizadas na lamina própria intestinal interagem geralmente com as células epiteliais intestinais via contacto célula a célula ou produção de factores solúveis para manter a vigilância imunitária e contribuir para a integridade da barreira epitelial.

Contudo, a inflamação imuno-mediada prolongada ou desregulada pode contribuir para defeitos na células da barreira epitelial, integridade e função. 0 estudo seguinte é designado para medir o(s) efeito (s) directos de IL-17a derivados de células T e/ou IL-17F na integridade da barreira epitelial.

Neste exemplo, linhas celulares epiteliais intestinais, como células Caco-2 são diferenciadas nas membranas semi-permeáveis e co-cultivadas no lado baso-lateral com células T ou monócitos derivados de biopsias de doentes de IBD ou de indivíduos normais. Integridade da monocamada epitelial é monotorizada ao longo do tempo utilizando a avaliação da resistência transepitelial eléctrica ou resistência da monocamada para a difusão do corante. Diminuições na resistência transepitelial de monocamadas em co-culturas poderiam sugerir uma destruição da monocamada induzida pela actividade das células T ou monócitos na co-cultura. Inibidores de IL-17A e IL-17F, tais como os péptidos 189 polipéptidos solúveis da presente invenção, tal como um polipéptido IL-17RC solúvel, ou um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158) poderia ser utilizada para determinar a contribuição relativa de IL-17A e IL-17F para a destruição da camada epitelial e testar se os inibidores de IL-17A e IL-17F seriam eficazes para manter a integridade da barreira epitelial. A prevenção da destruição da monocamada epitelial induzida por células T activadas por tais moléculas iria sugerir que os polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA da presente invenção podem ser eficazes para o tratamento terapêutico da IBD nos seres humanos.

Sistemas de co-cultura poderiam igualmente ser gerados utilizando monocamadas formadas pelo epitélio primário de doentes de IBD para determinar se estas células são mais sensíveis a IL-17A e IL-17F do que células epiteliais derivadas de indivíduos saudáveis. Se for este caso o caso, estes dados iriam sugerir que a inibição de IL-17A e IL-17F poderia ser uma estratégia adequada para o tratamento terapêutico de IBD.

Exemplo 46

Efeitos de IL-17A e IL-17F em células T da lamina própria e em monócltos/macrofagos em amostras normais e de IBD humana

Inflamação imuno-mediada desregulada ou sustida pode contribuir para os sintomas e patologias associadas com IBD, através de danos no tecido ou permanente desvio para respostas imunitárias inapropriadas ou prolongadas. Este modelo pode determinar o potencial a jusante e consequências da exposição a células T associadas a doença e monócitos a IL-17a e IL-17F que podem encontrar-se presentes no meio ambiente imediato das citocinas do tecido intestinal. 190

Terapias que seriam eficazes na IBD humana in vivo iriam funcionar nos modelos acima ex vivo inibindo e/ou neutralizando a produção e/ou presença de mediadores inflamatórios (incluindo, mas não estando limitados a IL-Ib, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A e F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, membros da família MIP, MCP-1, G- e GM-CSF, etc,).

Neste modelo, células T e monócitos/macrófagos são isolados a partir de amostras de biopsia, através de trituração cuidadosa com tesouras em HBSS, tratando com colagenase e Dispase II e incubando durante lha 37°C num agitador. A suspensão celular é filtrada, através de uma rede de nylon para remover os resíduos e aglomerados de células e lavada numerosas vezes com HBSS. Células T e macrofagos/monócitos podem ser isolados utilizando selecção directa de células ou protocolos de depleção /enriquecimento de esferas. As células isoladas são incubadas na presença de IL-17A e IL-17F. Isto induz a produção de mediadores inflamatórios por células T e monócitos/macrófagos ou resultados no desvio de respostas subsequentes das células T a respostas altamente pró-inflamatórias. Podem ser efectuadas comparações entre os tipos de mediadores inflamatórios produzidos por células de doentes de IBD e aqueles de células de indivíduos normais e poderia sugerir que células T e monócitos/macrófagos de doentes de IBD produzem um perfil mais pró-inflamtório na presença de IL-17A, tal como IL-17RC solúvel e IL-17F. A adição de um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como um polipéptido IL-17RC solúvel ou um polipéptido IL-17RG/IL-17RA solúvel (SEQ ID N°:158) para neutralizar a produção de mediadores inflamatórios a jusante induzidos por IL-17A e IL-17F sugere que tais polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA pode ser eficaz no tratamento terapêutico de doentes com IBD. 191

Exemplo 47

Eficácia de polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA no síndroma do intestino irritável ("IBS"): Patogénese dirigida pelo CNS

Um modelo que se foca na patogénese de IBS primária dirigida pelo CNS que utiliza estímulos de stress para induzir sintomas característicos de IBS. 0 modelo de stress psicossocial neonatal mimetiza algumas características clínicas associadas com doentes de IBS incluindo hiperalgia visceral, diarreia e sensibilidade ao stress. A separação diária da ninhada das suas mães durante 180 minutos cada dia durante os dias pós-natais 4-18 vai resultar numa alteração do comportamento maternal e reduzir significativamente o comportamento de lamber/limpeza. O stress nos recém-nascidos resulta em alterações permanentes no CNS resultando numa sensibilidade à dor somática e visceral induzida pelo stress. A função motora colónica em resposta ao stress é reforçada nestes animais e os dados preliminares mostram evidência de permeabilidade intestinal acrescida (Meyer et al., 2002). O tratamento com um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como o polipéptido IL-17RC solúvel ou um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°:158) e análise subsequente da função colónica motora, permeabilidade epitelial e estímulos de resposta ao stress poderia determinar a eficácia neste modelo animal de IBS. Diminuições na incidência dos sintomas após o tratamento com estes inibidores iria sugerir a eficácia potencial no tratamento de IBS.

Exemplo 48 192

Eficácia dos polipéptidos solúveis IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA no síndroma do intestino irritado ("IBS"): indutores de stress primários dirigidos para o intestino

Este é um modelo que se foca nos indutores de stress primários dirigidos para o intestino (i.e inflamação do intestino, infecção, ou stress físico). Estudos animais indicaram que a inflamação de baixo grau ou activação imunitária pode ser uma base para motilidade alterada e/ou função aferente e epitelial do intestino (Mayer et al., 2002). Neste modelo, irritação diária do cólon é produzida em animais neonatais (dias 8-21) na forma de injecção intracolónica diária de óleo de mustarda. O óleo de mustarda é um estimulante neuronal e verificou-se que induzia hiperalgia visceral a seguir à administração intra-colónica. Este modelo mimetiza funções chave na IBS incluindo hipersensibilidade visceral e alteração nos hábitos do intestino. Encontravam-se também presentes animais com diarreia ou prisão de ventre, uma característica chave dos doentes de EBS (Mayer et al., 2005). Um polipéptido solúvel da presente invenção, tal como um polipéptido solúvel IL-17RC ou um polipéptido solúvel IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID N°: 158) poderia ser determinado para determinar alterações no desenvolvimento de sintomas associados com este modelo. Diminuições na incidência ou na ordem de grandeza da hipersensibilidade visceral e mobilidade do intestino alterada após tratamento terapêutico com os nossos inibidores iria sugerir um potencial destas moléculas para serem eficazes no tratamento da IBS.

Exemplo 49 193

Concepção de um processo de produção de uma proteína passível de aumento de escala para um antagonista de IL-17A e IL-17F solúvel

Na concepção de estratégias focalizadas no desenvolvimento de um processo de produção de uma proteína passível de aumento de escala para uma forma solúvel de IL-17RC, foram encontradas muitas dificuldades na identificação de um sistema de expressão que permitiu um elevado nível de concentrações de proteína no meio condicionado. Análise de transferência de Western demonstrou baixos níveis de secreção de proteína com acumulação de proteína na célula. No desenvolvimento de polipéptidos solúveis da presente invenção foram concebidos mais do que setenta diferentes construções de expressão, geradas e testadas, quanto à expressão em células BHK, CHO, ou HEK 293. Foram testadas várias em mais do que uma linha celular hospedeira. Variações das cassetes de expressão testadas de IL-17RC incluíram: 1) Sequências de sinal alternativas tais como: a) nativas; b)otPA; c) região variável da cadeia pesada a imunoglobulina de ratinho; d) hormona de crescimento humano; e) IL17RA de ratinho 2) Duas variantes de união de ocorrência natural (IL-17RCxl, SEQ ID N0:2; e IL-17RCx4, SEQ ID N°:166). 3) Adição de sequências de ligação entre o domínio extracelular de IL-17RC (ECD) e a porção Fc, tal como: a) sem sequência de ligação; b) uma sequência de ligação de 9 aminoácidos baseada em GlyGlyGlySer; e c) uma sequência de aminoácidos ligada baseada em GlyGlyGlySer. 194 4) as suas formas monoméricas marcadas 5) proteínas de fusão Fc ambas de terminal amino e carbóxilo

6) Remoção dos locais de hidratos de carbono ligados a N 7) Gin para substituições do aminoácido Gin

8) Proteínas híbridas de fusão entre IL17RA e IL17RC

Todas as construções de expressão variantes de IL-17RC solúvel foram testadas, quanto à expressão de proteínas, através de expressão transiente em células HEK 293. Foi utilizada a análise por transferência de Western para detectar proteínas secretadas no meio condicionado comparadas com a proteína retida na célula, através da amostragem de lisados celulares. A maior parte das proteínas expressas pelas construções secretadas no meio de condicionamento que quase não eram detectadas pela transferência de Western. Adicionalmente, o sinal era maior a partir da amostra de lisado celular em comparação com a amostra do meio condicionado indicando uma incapacidade para a proteína ser eficazmente secretada. Estas construções de expressão que resultaram nos sinais mais elevados no meio de acondicionamento foram utilizadas para transfectar conjuntos de células CHO transfectadas estáveis. Foram medidos títulos de proteínas a partir dos conjuntos de CHO estáveis e quando possível a proteína purificada foi analisada quanto à ligação de IL-17A e IL-17F num ensaio de competição baseado em células. A tabela seguinte apresenta resultados das construções de expressão mais elevada em conjuntos de células CHO estáveis. Em que as medições da concentração absoluta de 195 proteína estavam abaixo do nível de detecção, o título da proteína é indicado como <0,5 mg/ml. A designação do número da construção das proteínas de expressão de IL-17RC e IL-17RC/RA, breve descrição dos exões incluídos, título das proteínas de conjuntos de células transformadas de forma estável, e capacidade de ligação de IL-17A e IL-17F. Nem todas as sequências das variantes incluídas na tabela 13 foram aí incluídas.

Descrição Título da proteína (mg/L) Ligação Variante de união xl Exões de IL17RC Exões 1-6, exões B-16 (variante 1210) 3,0 Capacidade de bloquear IL17A e IL17F e IL17F Variante de união x4 Exões IL17RC 1-6 <0,5 Não foi possível obter amostra suficiente Exões de IL17RC 1-6 <0,5 Inactivo Exões de IL17RC 8-13 1,6 Inactivo Exões de IL17RC 7-16 <0,5 Capacidade de bloquear IL17A e IL17F e IL17F Exões de IL17RA 1-10 Exões de IL17RC 8-16 (variante 1407) 32,5 Capacidade de bloquear IL17A e IL17F Exões de IL17RA 1-6 Exões de IL17RC 8-16 Exões de IL17RC 7-10 <0,5 Inactivo 196 (continuação)

Descrição Título da proteína (mg/L) Ligação Exões de IL17RA 1-3 Exões de IL17RC 4-16 <0,5 Não foi possível obter amostra suficiente Exões de IL17RA 1 Exões de IL17RA 2-16 <0,5 Não foi possível obter amostra suficiente Exões de IL17RA 1-6 Exões de IL17RC 8-16 (variante 1454) 19 Capacidade de bloquear IL17A e IL17F 197

Listagem das Sequências <1 IO5" LOIdO, StOVOO D, RIX\í5, MsrkW. víSO. Ζί:'Γί>Γ; K&tnms® e. BRSDoroúvJ?·;. Jar:n$ T&f, Oavid W. «120» ÈL-17 and 1-1 ?F mú àMhoda ot Using Sarna <130> 06-30 «140» Hot Ysi Assipsd <141 > 2556415-25 <:55>65í721/162 <151> 2555419-2¾ <15S> §®?53794 <151 < 2555-12-22 <15S> §<57721122 <151 >2556412-15 -154» €455224' <151 >2555413-14 <1S5» 151 <175» FssíSEQ fe? SfiSfstes Vs?$im 4.5 <215» 1 «211» 2255 <212» OMÃ. <213» :ssç1í®s <225» <221»C:QS <222» 14541.....¢2229¾ <22S» <223> Ofâfftoâ tissi.® Pissrasrsspn Mivister íísRA) $í8-prc> signs sss$sre« arsá «skííís 7-iíí sí tesas il-1 IRC. iíífá F«5 <455» 1 àaçtasscag: cse-sgccceç fca-cgçççcet efeggaggcfcg sagagggafcfc ccagceectg SO ecac-ceacÃS ae«egggct§ aetggggfcgt etfeeeeee* tggggggggg eageaeaggg IS» cctcsggccl gggtgecaes t^gcacctag aag atg cct gt-g ccc t-gg fct© ttg 174

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Lisboa, 26 de Novembro de 2010.

Claims (23)

1 Reivindicações 1. Polipéptido solúvel isolado compreendendo os exões 8-16 de IL-17RC (resíduos de aminoácidos 193-447 da SEQ ID N°: 2) e exões 1-6 de IL-17RA, em que o dito polipéptido solúvel se liga especificamente a IL-17A e IL-17F.

2. Polipéptido solúvel isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido compreende os resíduos de aminoácidos 1-458 da SEQ ID N°:158.

3. Polipéptido solúvel isolado de acordo com a reivindicação 2, em que o polipéptido compreende a SEQ ID N°: 158.

4. Polipéptido solúvel isolado de acordo com a reivindicação 2, em que o polipéptido é constituído por resíduos de aminoácidos 1-458 da SEQ ID N°:158.

5. Polipéptido solúvel isolado de acordo com a reivindicação 3, em que o polipéptido consiste na SEQ ID N° 158.

6. Polipéptido solúvel isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo constituído pela SEQ ID N°:72 e SEQ ID N°:140.

7. Molécula de ácido nucleico isolado que codifica para um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6. 2

8. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7, em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência nucleótidica apresentada na SEQ ID N°157.

9. Vector de expressão compreendendo os seguintes elemento ligados de forma funcional: a) Um promotor de transcrição b) um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6; e c) um terminador de transcrição

10. Célula isolada na qual foi introduzida um vector de expressão de acordo com a reivindicação 9, em que a célula expressa o polipéptido codificado pelo segmento de ADN.

11. Processo para produzir um polipéptido compreendendo: a) a cultura de uma célula na qual foi introduzida um vector de expressão de acordo com a reivindicação 9, em que a célula expressa o polipéptido codificado pelo segmento de ADN; e b) a recuperação do polipéptido expresso

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, em que a célula é uma célula eucariótica, e em que o polipéptido expresso é secretado pela célula.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o polipéptido codificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:158 ou resíduos 1-458 da SEQ ID N°:158. 3

14. Polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, em que o polipéptido compreende ainda uma reacção de PEGuilação.

15. Polipéptido solúvel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 para reduzir ou inibir a inflamação induzida por IL-17A ou IL-17F num mamifero.

16. Polipéptido solúvel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 para reduzir a inflamação induzida por IL-17A ou IL-17F num mamifero.

17. Uso de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 no fabrico de um medicamento para tratar um mamifero que sofre de uma doença inflamatória em que IL-17A e/ou IL-17F desempenhem um papel.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, em que a doença é seleccionada a partir do grupo constituído por uma doença inflamatória crónica, uma doença inflamatória aguda, uma doença autoimunitária, e uma doença inflamatória crónica das vias respiratórias.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, em que a doença é uma doença inflamatória crónica seleccionada a partir do grupo constituído por doença inflamatória dos intestinos, colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite e psoríase.

20. Uso de acordo com a reivindicação 18, em que a doença é uma doença auto-imunitária seleccionada a partir do grupo constituído pela esclerose múltipla, artrite reumatóide, e doença inflamatória dos intestinos (IBD). 4

21. Uso de acordo com a reivindicação 18, em que a doença é uma doença inflamatória das vias respiratórias seleccionada a partir do grupo constituído por asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), e fibrose cistica.

22. Uso de acordo com a reivindicação 17, em que a doença é seleccionada a partir do grupo constituído por psoríase; artrite reumatóide; osteoartrite; colite ulcerativa; doença de Chron; síndroma do intestino irritável (IBS); dermatite de contacto; esclerose múltipla (MS); rejeição de transplante; asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD); fibrose cística; e asma alérgica.

23. Uso de qualquer uma das reivindicações 18 a 22, em que o polipéptido solúvel é um polipéptido produzido, através do processo de acordo com a reivindicação 13. Lisboa, 26 de Novembro de 2010.