PT1945657E - Muteínas dos locais de glicosilação de tlr3 e métodos de utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MUTEÍNAS DOS LOCAIS DE GLICOSILAÇÃO DE TLR3 E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO"

Campo da invenção A presente invenção diz respeito a muteínas dos locais de glicosilação de TLR3, a ácidos nucleicos que codificam as muteínas e a métodos para a modulação da actividade de TLR3 numa célula.

Antecedentes da invenção

As patologias associadas a estados inflamatórios constituem um desafio significativo nos cuidados de saúde e podem ser dolorosos, debilitantes e letais. Por exemplo, a sépsis e as patologias associadas à sépsis afectam mais de 750000 pessoas anualmente nos E.U.A., com taxas de mortalidade entre 28% e 50%, provocando 215000 mortes anuais (Natanson et ai., Crit. Care Med. 26: 1927-1931 (1998); Angus et al., Crit. Care Med. 29: 1303-1310 (2001)). Há outras patologias inflamatórias, tais como as doenças inflamatórias do intestino (IBD), doença de Crohn e colite ulcerativa, que afectam mais de 1 milhão de pessoas por ano nos E.U.A. (Hanauer et al., Rev. Gastroenterol. Disord. 3: 81-92 (2003)).

As patologias inflamatórias pulmonares que afectam a função do pulmão, tal como doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), asma e infecções do pulmão, também afectam números significativos de pessoas nos E.U.A.. A COPD, por exemplo, afecta um número estimado de 10 milhões de americanos adultos e a sua prevalência está a aumentar 2 (Mapel et al., Manag. Care Interface 17: 61-66 (2004)). As patologias associadas a estes estados patológicos inflamatórios e exacerbações destes estados patológicos possuem um impacto significativo em termos de saúde e da economia. A exacerbação em doenças pulmonares, tais como asma e COPD, é caracterizada pelo agravamento dos sintomas e um declínio na função do pulmão. As infecções virais estão associadas às exacerbações de muitas doenças pulmonares (Johnston, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: S46-52 (1995); Bandi et al, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 37: 69-75 (2003)) e crê-se que constituem a causa principal de exacerbações. A secreção de citoquinas pro-inflamatórias nos pulmões após uma infecção virai constitui um passo crucial na promoção da resposta inflamatória em diversas doenças pulmonares (Gern et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 28: 731-737 (2003); Panina-Bordignon et al. , Curr. Opin. Pulm. Med. 9: 104-110 (2003)). O reconhecimento de antigénios microbianos pelo sistema imune hospedeiro é mediado pelos receptores imunes inatos, cuja activação constitui um passo importante no início de uma resposta inflamatória. Os receptores de tipo portagem (TLR) constituem uma família de receptores imunes inatos que desempenham um papel crucial na mediação de uma resposta imune a antigénios exógenos. O TLR3, por exemplo, é um receptor de reconhecimento de padrão de mamíferos que reconhece ARN de cadeia dupla (ds), bem como o análogo de ARN ds sintético, ácido poli-riboinossinicribocitidílico (poli I:C), (Alexopoulou et al., Nature 413: 732-238 (2001)). Além do mais, o TLR3 tem demonstrado reconhecer ligando endógenos, tais como ARNm libertado a partir de 3 células necróticas (Kariko et al., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004)), o que indica que a morte de células necróticas em locais de inflamação pode contribuir para a activação de TLR3. Uma sequência de aminoácidos de TLR3 humana de comprimento completo e uma sequência de polinucleótidos de codificação são apresentadas nas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. A activação de TLR3 pelo análogo de ARN virai ds poli(I:C) ou pelos ligandos de ARNm endógenos induz a secreção de citoquinas e quimioquinas pro-inflamatórias, que é uma conclusão que indica que a activação de TLR3 modula o resultado da doença durante a inflamação associada à infecção. Assim, crê-se que a ligação de TLR3 in vivo ocorre no contexto de infecção virai (Tabeta et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101: 3516-3521 (2004)) ou necrose associada à inflamação (Kariko et al., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004)). No geral, estes dados demonstram que a ligação de TLR3 dá início a cascatas de fosforilações e de eventos de activação de transcrição que resultam na produção de diversas citoquinas inflamatórias, sobre as quais se crê que contribuem para a imunidade inata (descrição por Takeda e Akira, J. Derm. Sei. 34: 73-82 (2004)). Além do mais, estes dados sugerem que a activação prolongada de TLR3 pode ser um componente crítico na modulação de doenças inflamatórias associadas a infecção. Dados publicados suportam esta hipótese, conforme ilustrado pelas conclusões que associam a sobreprodução de citoquinas pro-inflamatórias com a síndrome de resposta inflamatória sistémica, com tempestades de citoquinas agudas associadas a infecção (descrito por Van Amersfoort et al., Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414 (2003)) e patologias crónicas 4 imuno-mediadas, tais como artrite reumatóide (descrito por Miossec et al ., Curr. Opin. Rheumatol. 16: 218-222 (2004)) e doenças inflamatórias do intestino (descrito por Ogata e Hibi, Curr. Pharm. Des. 9: 1107-1113 (2003)).

Mais importante, está-se a tornar claro que a actividade de TLR3 também desempenha um papel significativo em patologias, tais como sintomas da doença inflamatória do intestino, sépsis, citoquina, quimioquina e patologias do pulmão mediadas por factor de crescimento e patologias inflamatórias pulmonares provenientes de um aumento da infiltração de células inflamatórias em tecidos do pulmão. No entanto, ainda não é claro o efeito da glicosilação, se houver, sobre a actividade de TLR3 e em patologias mediadas pela actividade de TLR3.

Assim, existem a necessidade de compreender o efeito da glicosilação de TLR3 sobre a actividade de TLR3 e explorar esta informação para o desenvolvimento de composições e de métodos que modulem de um modo eficaz a actividade de TLR3.

Descrição abreviada dos desenhos

Fig. l-o painel (A) mostra um espectro de massa MALDI-TOF do domínio extracelular hTLR3 (ECD) e o painel (B) mostra um espectro de massa MALDI-TOF de ECD hTLR3 tratado com desglicosidades. A fig. 2 mostra o efeito de N-glicosilação com tunicamicina sobre a activação induzida de poli(I:C) da sinalização de hTLR3 em células HEK293. A fig. 3 mostra o efeito de N-glicosilação de ECD por mutagénese de N247, N252 ou N413 em hTLR3 (SEQ ID NO: 2) sobre a activação da sinalização de hTLR3 em células. 0 5 painel (A) representa um alinhamento de locais de N-glicosilação possíveis a partir de homólogos de hTLR3 seleccionados; os painéis (B) e (C) mostram ensaios de activação de hTLR3 realizados com os mutantes de hTLR3 indicados a 10 pg/mL (B) ou 2,5 pg/mL (C) do ligando de hTLR3, poli(I:C). A fig. 4 mostra o efeito da N-glicosilação de hTLR3 ECD por mutagénese de N247, N252 ou N662 de hTLR (SEQ ID NO: 2) sobre a activação induzida de poli(I:C) da sinalização de hTLR3 em células.

Descrição abreviada da invenção

De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a uma cadeia peptidica que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma mutação nos três resíduos aminoácidos de um alinhamento de posição para N636 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

De acordo com outro aspecto, a invenção diz respeito a uma cadeia peptidica que compreende pelo menos uma mutação nos 3 resíduos aminoácidos da posição N636 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

De acordo com outro aspecto, a invenção diz respeito a uma cadeia peptidica que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20.

De acordo com outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para a modulação da actividade de TLR3 numa célula, o qual compreende a diminuição da glicosilação de TLR3 na célula, em que a modulação é uma atenuação. 6

Descrição minuciosa da invenção 0 termo "homólogo" designa sequências proteicas que possuem uma identidade de sequência compreendida entre 40% e 100% em relação a uma sequência de referência. Os homólogos de hTLR3 compreendem cadeias peptídicas de outras espécies que possuem uma identidade de sequência entre 40% e 100% com uma sequência de hTLR3 conhecida. As expressões "homólogo de TLR3" e "TLR3" são utilizadas interpermutavelmente ao longo da memória descritiva e das reivindicações. A expressão "cadeia peptídica", tal com aqui utilizada, designa uma molécula que compreende pelo menos dois resíduos aminoácidos que ocorrem naturalmente ou não naturalmente ligados por ligações peptídicas. A expressão "actividade de TLR3", tal como aqui utilizada, designa a quaisquer actividades que ocorrem como resultado da ligação do ligando à superfície celular de um homólogo de TLR3 ou que são mediadas, na sua totalidade ou em parte, pelo menos por uma cadeia peptídica de um homólogo de TLR3.

As composições e os métodos da invenção são úteis na modulação da actividade de homólogos de TLR3 em células in vitro e in vivo. Em particular, as composições e os métodos da invenção podem ser utilizados para atenuar a sinalização dependente de TLR3 in vivo e processos biológicos associados à actividade de TLR3 em patologias, tais como sintomas da doença inflamatória do intestino, sépsis, citoquina, quimioquina e patologias do pulmão mediadas por factores de crescimento e patologias inflamatórias pulmonares provocadas por um aumento da infiltração de células inflamatórias nos tecidos dos pulmões. 7 É aqui descrita uma cadeia peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos com uma identidade de 75% com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma mutação nos 3 resíduos aminoácidos de um alinhamento de posição para N221, N226, N387 ou N636 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6. A identidade percentual entre duas cadeias peptídicas pode ser determinada por alinhamento utilizando as definições por defeito do algoritmo BLASTP 2.2.12 [Aug-07-2005] com o filtro de baixo complexidade desligado e utilizando a SEQ ID NO: 6 como sequência de inquérito BLASTP. As sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20 constituem exemplos de tais cadeias peptídicas. Tais cadeias peptídicas podem compreender sequências suplementares para além da forma madura mutagenisada do homólogo de ECD TLR3. Tais sequências suplementares podem ser, por exemplo, péptidos de sinal, tais como um péptido de sinal nativo ou os domínios intracelulares e transmembranares nativos do homólogo. Serão evidentes para os especialistas na matéria outras sequências suplementares, tais como sequências de marcadores de afinidade ou outras sequências que facilitem a actividade, função ou purificação de TLR.

Tais cadeias peptídicas podem ser facilmente preparadas por determinação da percentagem de identidade entre um homólogo de TLR3 e a SEQ ID NO: 6, conforme descrito antes, seleccionado um homologo pelo menos com 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 6, identificando um alinhamento de posição para N221, N226, N387 ou N636 da SEQ ID NO: 6, e introduzindo pelo menos uma mutação nos 3 8 resíduos da posição identificada. Mais importante, o motivo do local de glicosilação de consenso nuclear é o motivo de 3 resíduos aminoácidos Asn-X-Ser/Thr. Tais mutações podem ser substituições, supressões ou inserções e podem ser geradas utilizando técnicas de mutagénese in vitro e in vivo, bem conhecidas na especialidade. Tais cadeias peptidicas também podem compreender mutações suplementares incorporadas no homólogo de TLR3 que não ocorram nos 3 resíduos de aminoácidos de um alinhamento de posição para N221, N226, N387 ou N636 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. E aqui descrita uma cadeia peptídica que compreende pelo menos uma mutação nos 3 resíduos aminoácidos da posição N221, N226, N387 ou N636 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. As sequências de aminoácidos das SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20 constituem exemplos de tais cadeias peptidicas. Tais mutações podem ser substituições, supressões ou inserções e podem ser geradas por meio de técnicas de mutagénese in vitro e in vivo, bem conhecidas na especialidade. Tais cadeias peptidicas também podem compreender sequências suplementares conforme descrito antes. E aqui descrita uma cadeia peptídica que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20. Tais cadeias peptidicas também podem compreender sequências suplementares, conforme descrito antes. 9

De acordo com uma variante, a invenção proporciona um ácido nucleico que codifica uma cadeia peptídica da invenção. E aqui descrito um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados por meio da utilização de técnicas in vivo ou in vitro conhecidas pelos especialistas na matéria. Tais ácidos nucleicos podem compreender ADN ou ARN. Além disso, tais ácidos nucleicos podem compreender sequências de ácido nucleico suplementares ou podem ser conjugados para outra classe de moléculas. Por exemplo, tais ácidos nucleicos podem ser inseridos em ácidos nucleicos vectores ou fornecidos a um célula ou um sistema para produzir a expressão de uma cadeia peptídica codificada pelo ácido nucleico. Tais células ou sistemas podem ser células eucarióticas, células procarióticas, células ancestrais ou sistemas in vitro isentos se células, tais como sistemas de transcrição e de tradução acoplados in vitro. As técnicas para a expressão de cadeias peptídicas, para a introdução de ácidos nucleicos em vectores e para fornecer os ácidos nucleicos às células, bem como as células ou sistemas adequados para a expressão de cadeias peptídicas codificadas por um ácido nucleico são bem conhecidas pelos especialistas na matéria. E aqui descrito um método para modular a actividade de TLR3 numa célula, o qual compreende a diminuição da glicosilação de TLR3 na célula utilizando técnicas tais como inactivação de genes ou dirigir a transcrição (v.g., 10 ARNsi) . A glicosilação de TLR3 pode ser diminuída, por exemplo, fornecendo à célula pequenas moléculas que inibem a glicosilação de TLR3, tal como tunicamicina, proporcionando homólogos de TLR3 em que o local de glicosilação foi modificado de modo que não possa ser glicosilado, sobreexpressando enzimas glicolíticas na célula e diminuindo ou inactivando a expressão de glicoliases na célula. Também é possível utilizar moléculas de anticorpo ou fragmentos de anticorpo para diminuir a glicosilação e a actividade de TLR3. Tais moléculas ou fragmentos de anticorpo podem bloquear o ligando ou a multimerização do receptor por ligação à região da superfície celular de TLR3 que contém o resíduo N221, N226, N387 ou N636 da SEQ ID NO: 6. Nos métodos de acordo com a memória descritiva a N-glicosilação e a O-glicosilação de homólogos de TLR3 pode ser dirigida para diminuir a glicosilação de TLR3. É aqui descrito um método para modular a actividade de TLR3 numa célula, o qual compreende proporcionar tunicamicina a célula. A tunicamicina pode ser fornecida a uma célula in vitro por meio de meio de cultura (numa concentração de cerca de 0,2 a 0,5 pg/mL) ou por meio de injecção intravenosa in vivo, por exemplo. Será evidente para os especialistas na matéria muitos outros métodos e vias pelos quais é possível fornecer tunicamicina a uma célula in vitro ou in vivo.

De acordo com outra variante, a invenção proporciona um método para modular a actividade de TLR3 numa célula, o qual compreende fornecer uma cadeia peptídica da invenção à célula. As cadeias peptídicas podem ser proporcionadas a uma célula, por exemplo, fornecendo a cadeia peptídica ao 11 fluido ou tecido que envolve a célula, introduzindo um ácido nucleico exógeno que expresse a cadeia peptídica para dentro da célula, por micro-injecção da cadeia peptidica à célula ou fundindo, uma célula com uma segunda célula ou vesícula que contém a cadeia peptídica. Serão evidentes para os especialistas na matéria outros meios pelos quais é possível proporcionar uma cadeia peptídica a uma célula.

De acordo com outra variante, a invenção proporciona um ácido nucleico da invenção para utilização num método para modular a actividade de TLR3 numa célula. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser fornecidos a uma célula através da utilização de vectores virais, plasmíticos, celulares ou vesiculares, microinjecção, absorção ou competência de ácido nucleico que ocorre naturalmente, conjugação para uma molécula capaz de penetrar na célula ou por outra técnica qualquer conhecida pelos especialistas na matéria, através da qual os ácidos nucleicos podem ser introduzidos numa célula.

De acordo com outra variante da invenção, o ácido nucleico é introduzido na célula por transfecção. A transfecção de ácidos nucleicos numa célula pode ser efectuada por diversas técnicas, tais como electroporação, choque químico, lipofecção, fusão com vesícula e outras técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria. A presente invenção irá agora ser descrita por referência aos seguintes exemplos de comparação, específicos e não limitativos. 12

Exemplo 1

Glicosilação do domínio extracelular de hTLR3 A análise de espectroscopia de massa efectuada sobre ECD solúvel e purificado de hTLR3, expresso de um modo recombinante em células HEK293 provenientes de Homo sapiens (n° ATCC®: CRL-1573™) revelaram um grau elevado de carga de heterogeneidade entre as espécies de fragmentos de ECD de hTLR3 (fig. IA) e uma massa iónica média de fragmentos de 110 kD. O tratamento de ECD de hTLR3 expresso recombinantemente com uma mistura de desglicosidases especificas para glicosilação O-ligada e N-ligada e subsequente análise por espectroscopia de massa revelou que o tratamento com desglicosidase diminuiu a massa iónica média do fragmento até 94 kD (fig. 1B) . Além do mais, a incubação de ECD de hTLR3 com ácido N-acetilneuraminico (NANAse), O-glicosidase DS, péptido N-glicosidase F (PNGase F) ou com um cocktail que contém todas essas enzimas fez diminuir as manchas específicas de glicoproteínas de ECD de hTLR3 resolvido com SDS-PAGE. Em conjunto, estes resultados indicam que o EDC de hTLR3 é N-glicosilado e O-glicosilado. O EDC de hTLR3 para as análises de espectroscopia de massa e de SDS-PAGE específica de glicoproteína foi preparado do modo seguinte. Em primeiro lugar, o ADNc (SEQ ID NO: 1) que codifica a proteína TLR3 de Homo sapiens de comprimento completo (SEQ ID NO: 2), idêntica ao número de adesão U88879, foi clonado em pcDNA3.1. Depois, um fragmento de ADNc que codifica o EDC de hTLR3 (SEQ ID NO: 3), constituído pelos aminoácidos 1 a 703 de hTLR3 de comprimento completo (SEQ ID NO: 4), foi clonado em pcDNA3.1. Este fragmento de ADNc foi clonado em pcDNA3.1 em moldura e no lado 5' de um ADNc que codifica um marcador de 13 afinidade de hexa-histidina. 0 plasmídeo resultante codifica um EDC de hTLR recombinante que compreende um marcador de hexa-histidina no terminal C. 0 EDC de hTLR3 codificado por este plasmídeo foi expresso, processado e segregado por células HEK293 transfectadas de um modo transiente. As células foram transfectadas e mantidas em cultura utilizando métodos convencionais. 0 EDC de hTLR3 recombinante com o marcador de afinidade de hexa-histidina no terminal carboxi foi purificado a partir do sobrenadante da cultura de células utilizando uma resina Ni-NTA e foi purificado outra vez por cromatografia de permuta iónica utilizando métodos convencionais. Prevê-se que à maior parte da proteína de EDC de hTLR3 produzida por este processo lhe falte os primeiros 26 resíduos de péptidos de sinal no termina amino devido ao processamento proteolítico pós-tradução e à secreção. A proteína de EDC de hTLR3 purificada compreende os resíduos aminoácidos 27 a 703 (SEQ ID NO: 6) do hTLR3 de comprimento completo (SEQ ID NO: 2).

As análises por espectroscopia de massa de EDC de hTLR3 recombinante purificado foram realizadas do modo seguinte. Em primeiro lugar, as amostras foram concentradas com um concentrador de centrifugação Nanosep™ (Pall Corp., East Hills, NY), dessalinizados utilizando yZip Tips C-18' (Millipore Corp., Billerica, MA), efectuando a eluição com 50% de acetonitrilo/0,1% de ácido trifluoroacético. Deixou-se co-cristalizar 1 pL de cada amostra com a matriz em ácido 2,5-di-hidroxibenzóico em acetonitrilo/água (a 50:50), que continha 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). As experiências de MALDI-TOF foram então efectuadas utilizando métodos convencionais e registadas num 14 espectrómetro de massa 'ABI Voyager-DE™ STR'. Para se examinar a glicosilação, manteve-se a incubar 1 pg da proteina de EDC de hTLR3 purificada com uma mistura de N-glicanase, O-glicanase e sialidase a 37°C durante 24 horas. Os produtos desta incubação foram então analisados por espectroscopia MALDI-TOF conforme descrito antes. A preparação de ECD de hTLR3 purificado para resolução por SDS-PAGE e visualização especifica de glicoproteinas foi efectuada do modo seguinte. Em primeiro lugar, preparou-se amostras que contêm ECD de hTLR3 expresso recombinantemente por si só, ECD de hTLR3 ECD incubado com ácido N-acetilneuraminico (NANAse), ECD de hTLR3 incubado com O-glicosidase DS, péptido N-glicosidase F (PNGase F) ou um cocktail que contém todas estas enzimas e ECD de hTLR3. As amostras que contêm quantidades iguais de ECD de hTLR3 são então resolvidas por SDS-PAGE num gradiente de 4% a 15% em gel utilizando métodos convencionais e as glicoproteinas são observadas com as manchas de gel de proteínas 'SYPRO Ruby' específicas para as glicoproteinas (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA).

Exemplo 2

Efeito de N-glicosilação sobre a activação induzida com poli(I:C) na sinalização de hTLR3 em células

Nestas experiências, testou-se a sinalização de hTLR3 utilizando a construção do gene repórter pNF-KB-Luciferase (Stratagene, Inc., Carlsbad, CA) transfectado transientemente por métodos convencionais em células HEK293. Esta construção repórter compreende um elemento de ADN que responde a NF-κΒ ligado a um gene repórter de luciferase. A activação de TLR3 pelo ligando poli(I:C) 15 aumenta a actividade de NF-κΒ e provoca a activação de genes que respondem a NF-κΒ, tais como o gene repórter de luciferase. As células HEK293 transfectadas com pNF-FCB-Luciferase foram co-transfectadas transientemente com o vector de controlo pHRL-TK que produz constitutivamente uma proteína luciferase proveniente de Renilla. Um ADNc que codifica o hILR3 de comprimento completo também foi co-transfectado transientemente, utilizando métodos convencionais, em células HEK-293 transfectadas com o gene repórter de luciferase.

Após a transfecção, tratou-se as células com doses não tóxicas de tunicamicina, conforme apresentado na fig. 2. A tunicamicina inibe a glicosilação N-ligada por meio da inibição da ligação de N-acetilglucoasamina, que é o primeiro resíduo açúcar ligado a uma cadeia peptídica durante a glicosilação. Mantém-se então a incubar células HEK293 tratadas ou de controlo com 10 pg/mL do ligando poli(I:C) (PIC) de hTLR, conforme indicado na fig. 2.

Após o tratamento, testou-se a luciferase expressa a partir de pNF-KB-luciferase e pHRL-TK utilizando métodos convencionais. Os dados foram expressos como "proporção de luciferase" igual à actividade de pNF-KB-luciferase normalizada para a actividade de pHRL-TK luciferase. Os resultados são apresentados como representações gráficas dispersas dos dados recolhidos a partir de 9 amostras individuais e são representativos das três experiências idênticas e conduzidas de um modo independente. 16

Exemplo 3

Efeito da inibição de N-glicosilação de EDC de hTLR3 sobre a activação induzida por poli(I:C) da sinalização de hTLR3 em células

De um modo surpreendente, concluiu-se que dois locais de N-glicosilação, N247 e N413, dos muitos locais possíveis na sequência de hTLR3 da SEQ ID NO: 2 desempenham um papel crítico na sinalização de hTLR3 (fig. 3C) . Além disso, concluiu-se também que dois outros locais potenciais de N-glicosilação na SEQ ID NO: 2, N252 e N662, desempenham um papel importante na sinalização de hTLR (fig. 3B e fig. 4). As posições N247, N252, N413 e N662 na SEQ ID NO: 2 são equivalentes, respectivamente, a N221, N226, N387 e N636 da SEQ ID NO: 6. 0 ECD de hTLR3 possui diversos locais potenciais de glicosilação N-ligada, com base na presença do motivo de N-glicosilação Asn-X-Ser/Thr (fig. 3A) em diversos homólogos de TLR3. Apenas cinco desses locais potenciais de glicosilação N-ligada foram conservados entre os homólogos de TLR3 de Homo sapiens, Pan troglodytes, Canis familiaris, Bos taurus, Rattus norvegicus e Mus musculus (fig. 3A) , conforme observado por alinhamento CLUSTALW convencional. Os cinco locais conservados na SEQ ID NO: 2 foram N57, N196, N247, N275 e N413. Há quatro outros locais potenciais de N-glicosilação na SEQ ID NO: 2 que variaram entre os diversos homólogos de TLR3 examinados (fig. 3A). Estes quatro outros locais potenciais de N-glicosilação, embora não conservados, foram N252, N265, N291, N507, N636 e N662 da SEQ ID NO: 2.

Os resíduos asparaginas nestes locais potenciais de glicosilação N-ligada no EDC de hTLR3 foram individualmente 17 mutados utilizando métodos convencionais para resíduos alanina (fig. 3 e fig. 4). Quatro resíduos asparagina suplementares presentes no ECD de hTLR3 ECD que não contêm uma correspondência com o motivo de N-glicosilação Asn-X-Ser/Thr em qualquer homólogo de TLR3 também foram mutados como controlo. Estes resíduos foram N70, N124 e N388 de hTLR3 de comprimento completo (SEQ ID NO: 2) . Todas as mutagéneses foram realizadas em ADNc que codificam o hTLR3 de comprimento completo para assim se produzir hTLR3 de comprimento completo processado e segregado com um ECD mutagenizado. As posições mutadas na SEQ ID NO: 2 estão indicadas nas figuras através da identificação da posição da substituição com alanina (v.g. , N70 significa que a N70 foi substituída com um resíduo alanina).

Os plasmídeos que codificam e expressam as construções de ADNc de hTLR3 mutante descritas antes foram transfectadas individualmente em células HEK293T. As células transfectadas com plasmídeos que codificam moléculas de hTLR3 mutante individuais também foram simultaneamente transfectadas com o repórter pNF-κΒ-luciferase e o vector de controlo pHRL-TK. As transfecções e as culturas de células foram efectuadas utilizando métodos convencionais.

As células HEK293 transfectadas e de controlo foram então mantidas a incubar com 10 pg/mL (fig. 3B e fig. 4) ou com 2,5 pg/mL (fig. 3C) de ligando poli(I:C) (PIC) de hTLR3 conforme indicado para avaliar o efeito das diversas mutações de hTLR3 sobre a sinalização de hTLR3. Após o tratamento, testou-se a luciferase expressa a partir de pNF-KB-Luciferase e de pHRL-TK utilizando métodos convencionais. Os dados são expressos sob a forma de 18 "proporção de luciferase", conforme descrito antes. Os resultados são apresentados como representações gráficas dispersas dos dados recolhidos a partir de 6 amostras individuais .

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> CENTOCOR, INC.

<120> MUTEÍNAS DOS LOCAIS DE GLICOSILAÇÃO DE TLR3 E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO

<130> CEN5120PCT <140> A SER ATRIBUÍDO <141> 2006-10-30 <140> 60/731,105 <141> 2005-10-28 <160> 20 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 2710 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 19 atgagaeaga etttgcettg tarcfcaefcfc-t tgggggggcc ttttgcçctt tgggatçctg So tgtgeatcgt gcaecaccaã gtgcaetçfct ãgecatgaag tfcgetgaetg cagccsocfcg 120 aàgtfcgscte aggtaeccgs tçatctaccc acaaacatsa csgfcgttgaa cctfcacccat 180 aatasactca gasgat-taec: sgecgccsae tteacaaggt aiageeaget aaetagcfctg· 200 gatgtâggat ttââcaccât ctcaâ&aefcg g&gccagaat. tgfcgccagsa actfecccatg 300 ttaàaagftfct fcgaacetcea geacaafcgag etatcteaae òttctgataa aaeetttgee 360 ttctgeacga sttt.gaetga. aetccatctc afcgtecaact caatccagaa aattaasaat 420 aatcocfcfctg tcaageagaa gaatttsat-c aeattagatc tgfcctcafca* fcggctfcgtca 480 tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gasaatotcc aagagcttst attatcaaac 549 aataaaattc «agcgctaaa aegfcgaaga* etgsf&tatcfc ttgccaattc afectttaaaa 800 aaattagagt tgteategraa teaaatfceaa g&gtttfccte csgggtgttt teaftqrcaatfc 660 ggssgattat ttggcetctt tctgaacaat gtccagctgg gtcccagcct tacagagaag 720 ctatgtttgg aattagcaaa eacaagcatt eggaatctgt etetgagtaa cagceagatg 780 tccaccacc» gcaatscaac tttcttggga ctaaagfcgga easatctcae tatgctcgat, 840 ctttcstaca aca&ettsaa tgtggttggt aaegattccfc tfcgcttggct. tccacaacta 900 gaatattfcct tcctagsgta taatasfcata cagcafcfctgt ttictcaefcc tfetgcacggg 969 efctitcaafcg tgaggtacct gaatttg&aa cggtctttta etaaagsaag fcatttccefct 1020 gccteaciee ccaagatfcga tgattfettct tttcegtggc tsasatgfcit ggagcecctt 1080 aacatggaag ataafcgatat tccaggcata aaaagcaata tçttcacagg aitgafcaaac 1140 ctgaaàfcacfc taaçtctatc caactccttt acaagfcttgc gaaetttgac aaatgaaaca 1200 tttgtatcae ttgctcatte tacctitacaç ataotcaecc fcaaecaagaa kaaaatetca 1260 aas&tsg&gs. gtgafcgcttt ctcfctggtfcg ggccaectag aagfcaettga octgggcctt 1320 aatgaaattíg ggeasgaact eacaggeçag gaatggagag gtçtagasaa t&ttiteg&â 13SC atctãtcttt cctscaacaa gtaccfcgcag ctgsctagga actectttgc cttggtccca 1440 agcettcaac gactgatgct ccgaagggtg gcccttasaa algtgçstag ctctccttca 1500 ccattccagc efccifccgtaa cttg&ccstfc ctggatctaa gcaôcaaoaa catagccaac 2569 ataaatgatg aeatgttggs gggfccfcfcgag aaactagaaa fctetcgattt gcagcataac 1620 sacttagcse ggctctggaa gtcacgca&ac cctggtggtc ccatttattt cctsaagggt 1680 etgtctea.ee fcccacatcct fc»actfc.ggag tecaaeggct ttgatgagat ecea.gttgag 2749 gtct.tçaggg atttatttga actasseg®tc stcgatttag gattgsataa ttta-íacaca 1000 cttccagcat cigfcetttsa, fcaatcaggtg tctctaaagt cattgaacct teag.siisga.at 1860 cfceatassafc cegttgagaa gasggttttc gggccagctt tc&ggaaect gacfcgagtta 1920 gat&tgcgct itaafcccefct tgattgcscg tgtga&agts tfegcctggtt tgttaattgg 1980 stxaacgàga cccataccaa catocctgag ciatc&agcc actacctttg csacactcca 2040 ccsteactate atgggttecc agtgagactt tvtgátscat cstcttgcaa sgacagfcgc«; 2X00 cectttgaac tetttttcãt gatesatacc agtstccfcgt tgatt:tttát ctttattgta 2160 cttafecetcc acfcttgaggg stggsggata tctttttatt gçastgttt.c agt&catcga 2220 gtfcctfcggtt tcaaagaaafe agacagacag acag&aeagt ttgaatatgc agcatatata 2289 attcstgcct ataaagaiaa ggattgggtc tgggaaoatt tctcttcast ggaaaaggaa 2340 gascsaat.ctt; tsaaattttg tctggaagas agggaotttg aggcgggtgt ttttgaacta 24Ô0 gaagsaattg í:t8attagea£ caaaagaagc agasaaatta t.t-ttt.gtfcBt aacãcaccst 2460 ctattaaaag «cccattatg caa&agafctc aaggtacatc atgcagttca aca&gctatt: 2520 gaacaaaatc tggattccat katattggfet fctccttgagg agattccaga fctafcs&actg 2580 «aocatgcec tctglitfcgeg aaçaggaatg tttaaafccfcc actgcatstt gaactggcca 2640 gtt«agaaag aacggatagg tgcctttcgt cataasttgc aagtsgeact tggafcccããa 2700 aactotgtac 2710

<210> 2 <211> 904 <212> PRT <213> Homo sapiens 20 <400> 2

Het 1 Arg Gin fhr teu 5 Pr o Cys lie í?he siy He t Leu 20 cy« Ala Ser Ser (31 u Val Ala 35 Asp Cys Ser His teu 40 teu Pro 50 fhr Asn n« Tbr Vai 55 teu Arg 65 Leu Pro Ala Ms Asn 70 Fh« Thr Asp Vai ©iy Phu Asa 85 Thr 11.» Ser Leu Fr o Het 100 Leu Lys Vai teu Gin teu Ser 1X5 Asp Lys ttr l?:hs Ala 120 His teu 130 Met Ser teu Ser lie 135 Gin Lys 145 Gin Lys Asr teu Ile ISO fhx teu ser Th£ Lys teu GlV 165 Thr 5.1b vai teu Leu Asn 190 Asa Lys Ile Gl» Ile Phe Ais. 155· Asm Ser Ser teu tes 200 Ile lys 210 Glu Ph-s Ser Fro Gly 215 Cys Gly 225 teu Ph© teu Asu Asm 230 Vai Gin Leu cys teu Glu Leu 245 Ale Asn fhr &srt Ser 41 u teu 200 Ser fhr Ihr Ser 'Tyr Phe Trp Gly Gly Leu Leu Pro 10 15 Thr fhr lyg 0^;ξ§ fhr Vai Ser Hl 8 25 30' Lys Leu Khr Gin Vai Prs Asp Asp 45 &®n Leu Thr Hl a Ase Glu Leu Ar§ 60 Arg «yr Sét Gin Léu fhr Sèr Leu 75 ao Lya Leu Glu Pr o Glu Leu Cys Sis 90 9:5 Asn Leu Gin Hl a Asn Glu teu Ser 105 1X0 Fhe Cys fhr Asrt teu fhr Glu Leu 125 Lys lie Lys Asn Asm Fro Phê Vai 140 Ssp teu. Ser Hia Asm Gly teu Ser 155 160 Glu teu Glu Asn teu Gin Glu Leu. 130 175 Ala teu Lys Ser Glu Glu :teu Asp 165 ISO Lys Leu Glu :tee Ssr Ser Asm Glu 2:05 Phe Eis Ala lia Gly Arç Leu Phe 220 Leu Gly ?ro Ser teu Thr· Glu Lys 235 21D Ser Ile Arg Aer Leu Ser teu Ser 350 2S5 Asm Thr fhr Phe teu Gly teu Lys 2€5 a? o 21

Trp Thr Asn leu Thr Wefc Leu Asp Leu Ser Tyr Asn. Asn Leu Asn Vai 275 280 ’ 285

Vsi Gly Asn Asp Ser Ph© Ala Trp Leu Pro Gin Leu Slu Tyr Pfc© Phe zm 295 300 Leu Glu Tyr Asn Asn. Ile Gin His Leu mie Ser His Ser Leu ais Giv 305 310 315 320 Leu Phe Asn Uai Arg Tyr Leu Asn Leu Lys Arç Ser Pb© Thr Lys sln 32 5 330 335 Ss,r 11© Smt Leu Alá Ser Leu ?ro Lys lie Asp &sp íSie Ser pise Gin 340 345 35S frp Leu lys Cys Leu Glu His Leu Asn Met GiU I 1 Asp lie Oro 3.55 360 365

Gly I1« Lys Ser Asn Mst Phe Thr Gly Leu Ile Asn Leu. Lys Tyr leu 370 375 350 Ser Leu Ser Asn Ser 9ha Thr Ser Lso Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr 365 390 395 400 Phe Vai .Ser Leu Ala His Ser Pro Leu His Ile Leu Asn. Leu Thr Lys 405 410 415 Mn Lyss 11© Ser Lys lie Glu Ser Asp Ala Phe Sor Trp Leu Gly Mis 420 425 430 Leu Glu Vai. Lati Asp Len Gly Leu Asn Glu lie Glv 61 s Gla Leu Thr 435 440 443 01 y Gin Glu Trp Arg Gly Lou Glu Aon. Ile Phe Slu lio Tyr Leu Sor 450 455 460 Ty.r Asn Lys Tyr Leu Gin Leu Thr Ar<j Asn Ser Phe Ala Leu Vai Pro 465 470 475 48S Ser Leu Gin Arg Leu Met Leu Arg Arg Vai Ma Leu Lys Asn Vai Asp 485 490 495 Ser Ser Pro Ser Pro Pha Gin Pro Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp SOO 505 510 Leu Ser •Ask Asn Asn Ile Ala Asa lie Asn Asp Asp Met Leu Glu Gly 515 S20 S25 Leu Gin Lys Leu Glu Ile Leu Asp Leu Gin His Asn Asn Leu Ala Arg 530 S35 540 Leu Trp lys His Ala Asn Pro gly Gly firo Lie Tyr fhe Leu Lys Giy 545 550 SS5 560 Leu Ser M« Leu His Ile. leu ASn Leu. Glu Ser Asn Gly Phe Asp Glu 565 570 57 S TI a firo vai Glu Vai Phe Lya Asp leu Phe Glu Leu lys Ile 11©· Asp 580 5 85 590 L®n Gly leu Asn Asn L©u Asm Thr Leu Iro Ala Ser vai Phe Asm .Asn 595 SOO 605 Glis Vai Ser Leu Ly® Ser Leu Asn Leu Gin Lya Asn Leu ile Thr Sêr 510 615 620 Vai GlU lys Lya vai Phe Gly Pro Ala Phe .Arg Asn Leu Thr 01 u Leu 625 630 S35 690 Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cyu; Thr Cys Glu Ser II© Ala frp 645 650 6S5 Phe Vai Aan Trp He Asn GiU Thr His Thr .Asn lie Pro GlU Leu Ser 660 66S 670 Ser His Tyr Leu Cys Asn. Thr Pro· Pro Mis Tyr His Gly Phe Pro vai 675 680 685 h:m Leu Phe. Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ma Pro Phe GlU Leu mo 695 700 fha Phe mt Ile Asn Thr Ser lie Leu Leu 11© Phe lie Phe: Ile Vai 7 05 710· 715 720 22 Leu Lsu Xlé Sis PhS: Glu Gly f.rp Arg Xle Ser FAé Tyr Trp Asn vai 725 730 735 S«:t vai Hls Arg val Leu Gly Piia Lys Glu 11» Asp Arg Gin Tár Glu 740 745 750 Gin. Pbe Glu yyr Ma Ai® Tyr lis Ils Lia Ala Tyr Lys Asp Lys &Sp ?ss 760 765 Trp Vai f rp Gl» BÍS Pha Ser Ser Eet Glu Lys Glu Asp Gin Ser Leu 770 775 7BÓ Lys t?h© Cy«. Leu Çlu Glu A.rf Asp Pàe Glu Ala Gly Vai Fh» Glu Leu 785 798 795 806 Glu Ais lie Vai Asn Ser Xle Lys Arg Ser Arg Lys lia Ϊ1» Ph« Vai SOS 810 SIS n« Tfer Eis Riu Leu Laa Lys Asp Fr o Mas Cys &ys Arg Fhe X»ys Vai 820 825 838 Eis Mâb Ala Vai Gin Gla Ala Jle Glu Glu Asn Leu Asp Sar lia 11» 835 848 845 Leu Vai Pfee Leu Glu Glu 11» 8¾¾ Asp Tyr Lya Leu Asa Eis Ala Leu aso 855 860 Cys Leu Arg Arg Gly Met FHe Lys Ser tti$ Cy a 11 e Leu As.n Trp Fro 665 870 675 880 V®1 Gin Lys Glu Arg 11» Sly Ala Fhe Arg ais Ly» Leu Gin VAI Ala 885 890 095 Leu ®ly Sar Xya Aím Ser vai Eis 800 <210> 3 <211> 2109 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 23 afcgagacafa «tfctgccfctg tatetaettt tg^^ggcc tttfcgccetfc fcgggatgcfcg 60 tgtgeatcct oc&ceaeea* gtgcaetgfct ageaatgãag fcfcgctçàctg eagecacctg 120 aâgttgacfce aggt&ccega tgatctaccc acssaeat&a cagtgttgãa çcttacocát .130 a&icaacfco* gaagattasc: agccgecaac ttcaeaaggt atagccagct sacfcagctt;g 2#0 gètgtsggsfe ttaasaseat etsaaaactg gagccsgsst tgtgccagaa acttcccatg 300 ttaaaagttt tgaacctees gcaeaatgag ctat-etcaas tttetgôfcaa aacefcttgcc 360 ifcc*g*&*8* átttgáetgà agtccatctô atgSccaact caatccagás aâttâsas&fc 420 «stccctttg tcaagcagaa gaatfctaatc «cattagst.e tgtctoetaa tggcttgtna 480 tctacaaaat taggaaetca ggticagctg gaaaatetce asgagcifcct attatcaaac 540 aataaaattc aagcgctaaa aagtçaagaa cfcggatatct ttgccaattc atcfcfcfcasaa 600 saattegagt tgicatecgsa fceaaattaa® gsgttttctc ssgggfcgttt fccaegcaatt 660 ggaag&ttat ttggcctctt tetga&c&at gtccagctgg gtcecagcct tacagagaag 720 ct&tgttt-gg aatfcagsaaa oacaagcafcfc cggaatctgt ©tctgagtaa cagceagctg 700 tccaecacca. gcaatacaac fcttetfcggg® etaaagtgga caaatcteac tatgctcgat 840 ctttcctaea ac&acttaa® tgttgçttggt aacgattcct ttgeitggct tecacaacta 000 gmststtcet toctagagta taat&atara cagcatUgt fcfctctcscfcc tttgcacggg 960 Ctttteaatg tgaggtacCt gâatttgaaã çggtotttt® ctaâáçaa&g taittccctt 1020 gestcaestcc cc&agattga tgatttttct tttcagtgge taaaatgttt ggagesectt 1080 ascatggaag ataa.tgatst tccaggcats aaaagcsats tgttsaeagg· attgafcaaac 1140 sitga&ãtaçt tsagfcstste gaactocttt acaagfcfetgc gaactttgae aaatg«aa«a 1200 tttgtatcac ttgetcattc fcecct.t.acaer atactcaacc t&acc&ag&a. t-aasatetc® 1260 aaaatagaga gtgatgcttt ctct&ggtt? ggocacctag aagtscttga ectgggcctt 1320 aatgaaattg ggcaagaact oacaggccag gaatggagag gtcfcagaaaa tatfcttcga* 1380 atctatcttt ccfcaeaacaa gtacctgcag etgactagga actcctttgc cttggtceca 1440 agcctteaac gactgatgct ccgssgggtg gcccfctaaaa atgtggatag ctctccttca 1500

Gc&ttccagc ctcttcgtaa cttgaccatt ctggatctaa gc&ac&acaa catagceaae 15S0 ataaatgatg acafcgtfcgga gggt.attgag aaacfcagaaa tfcctcgattt geagcataac 2620 aactfcagcac ggctctggaa ècacgcaaac cctggtggtc ccatttattt cctaaagggt 1680 etgtstcscc tccacafccet taacfcfcggag fcceaaoggct fctgaegagat cccsgttgag 2740 gtcttcsãgg atttatttgs actaaag&tc atcgatttag gattgaataa fcttaaac««a 1800 cttce&gcãt stgtertttaa fca&tcaggtg tctctaa&gt eafctgaacct tcagaagaafc 1860 ctcafcaacst· ccgttgagaa gaaggttttc gggccagcfet tcagg&açet gactgagtta 1920 gatafegcgcfc ttaatcçcfei tgat&gcaog tgbgaaagta ttgcctggfct tgtitasttgg 1980 attaacgsg® ©ceafcaccaa cstccetgag etgtc&sgoe aefcacetttg oaacactcca 2040 aatfiaet.at.c atgggtteaa: agt.g&gactt t.t.tg®tacat catcttg«aa agacagtgcc 2200 cectttgaa 2109 <210> 4 <211> 703 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 24

Met Arg Glu fbr Leu Pr a Cys 21 e Ty.r Ph® frp 61 y siy Leu Leu Pm 1 5 10 15 Fne 61 y MSt Leu; Cy« Ala Ser Ser Thr Thr Lys Cys Thr Vai Ser His 20 25 30 .. Glu Vai Ala Asp cya Ser His Leu Lys Lsu Thr Gin vai Pro Aap Asp 35 40 45 Leu Pro Thr Asn lie Thr Vai Leu Asm Leu Thr Mis A© si. Gin Leu Arg 50 55 60 Arg Leu frs Ala Ai a Asr. Pbe Mir Arg Tyr Ser Gin Lua Thr Ser Leu 65 70 75 80 Asp vai 61 y Fhe Asm Thr lie Sai: Lys Leu GlU Pro Glu Leu cys Gin 85 90 95 Lys leu Pr o Mel Leu Lys Vai Leu Asm Leu Gin HlS Asm Glu Leu Spr 100 10S 110 61n leu Sar Asp Lys Thr Phe Ala The Cys Thr· As S i. Leu Thr Gin Leu 115 120 125 Mis leu Met se.s Ãsn Ser Ile GJjj LyS li® Lys Ã$n Asm. Pro phe vai 130 13,5 140 Lys Gin Lys íuir. Leu 11® Thr Leu Asp Leu Ser fiis Asm Gly Lau Ser 14 5 150 155 IBS S0:£ Thr Lys Leu 61 y Thr Gin Vai Gin Leu 6 JAA Asn Leu Gin G1 u Leu l&s 170 175 Leu Ser Asm Asn Lys 11® Gin Ala leu Lya Ser Glu Glu Leu Asp ISO 185 190 lie Fhe Ala Asm S«r Ser Leu hys Lys Leu g:i u Imu 5® r Ser Asn Gin 195 200 205 11© Lys Glu Mie Ser Pr» 61 y Cys Fbe His Ala lie 6.1 y Arg Leu Phe 210 215 22 0 Gly leu Fhe Leu Aso Asn vai 61 n. Leu Giy Fro Ser Leu Thr Glu Lys 22S 230 235 24 0 Leu Cy» Leu Glu Leu Ala As π Thr Ser Ile Ãrg .Ases Leu Ser Lesa Ser 245 250 255 Asa Ser Gin Leu Sem TAr Thr Ser Asn. Thr Thr Pb® Xieu Sly Lgsa Lys 260 265 270 Trp Thr &3R Leu Thr Met Leu Aap Leu Sar Tyr Asrs. Asn Leu Asn Vai 215 280 285 Yei 61 y Asn ASp Ser Fhe Al a Trp Leu Tm 61h Lau Glu Tyr Fhe Fhe 290 295 3Ω0 25

Leu Giu Tyr A»n A-sn Ilè Gin Eis Lsu £h» Ssr Bis Ser Leu Bis Gly 305 31Q 315 320 í*tt Phe Asrt Vai Arg Tyr Leu Asa Leu Lys Arg Ser Pbe Thr Lya Gin 325 330 335 Ser lie. Ser Leu Ala Ser L§« Pr© Lys Tle Asp ASjp Phe Ser Fhe Gin 340 34,5 350 Trp Leu Ly$ Cys Leu Glu His Leu A,m Mefc Glu ,A.up Α.&:Γί: A.Í2jp IX® ?r© 35 S 360 365 Gly 11® Lys Ser ASn M£i Fhe Thr Gly Leu 11 a Asn XtfíSU. Lys Tyr Leu 370: 375 330 Ser Leu 8®r hsr< Ser ?he Thr Ser Leu .Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr 385 300 305 400 Phe Vai Ser Leu Ala Sis Ser Fm Leu Mis 11® Leu Asa LsSU Thr Lys 4 05 410 413 As© Lys 11© Ser Lya 11® Glu, Ser Asa Ala f%» ser Trp Leu, Gly Mis «20 425 430 Leu Glu Vai Leu Asp Leu Gly Leu Asa Glu II e Gly Gin Glu Leu Thr 435 440 445 Gly 6ia Glu Trp Arg ®ly Leu Glu Asa 11 © Phs Glu 11® Tyr Leu Ser 450 45S 4 60 Tyr Asa Lya Tvr Leu Glu Leu Thr Arg Asn Ssr Pbe Ala leu Va.l Pro 465 470 475 480 Leu Gin Arq Leu Mat L$u Arg Arg Vai Ala LSU Lys V@1 Asp 483 430 435 Ssr Ser Pro Sei: Pm Fhe Glu Pr© Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp 500 505 510 Leu Ser &en Asa Asn lisa Ala As© Jls Asa Asp Asp Hat Leu Glu Gly 515 520 525 I«2 Glu Lys Leu Glu. 11® Leu Asp Leu Gin His Aun Asn Leu Ais Arg S30 53 S 540 Leu, Trp Lys Sis Ala Asn Pr© Gly Gly Pro Ilo Tyr Phe Leu Ly® Gly 545 550 555 560 Leu Ser Eis Leu Sis lie Leu Asa Leu Glu Ser Asa Gly Fh© Asa Glu 565 570 575 lie rta Vai GlU vai Phe Lys Asp Luu Phe Glu Leu Ay >3 lie ile A«p 560 335 590 Leu Gly Leu Asm Asa Lua Asa Thr Leu Pro Ala Ser ¥a! PLe Asn Asn. SS5 600 605 Si n Vai Ser Leu Lys Bar Leu ,A.sn Leu Gin Lys Asa Leu 11® Thr Ser 610 615 620 v»X GlU Lya Lys Vai Pus Gly Pro Ala Phe Arg Asa Leu Thr Glu Leu 625 63 O 635 54.0 1 1 Arq Pb a Asa Pro Phe Asp cys Thr Cya Glu Ser 11® Ala Trp 64 S 650 655 Ph.<s VísI Asn Trp Uô Asa Glu Thr Eis Thr Assa lie Pro Glu Leu Ser 660 665 67 0 Ser Eis Tyr Leu Cys Asa Thr Pro Pro Ela Tyr Kls Gly Pbe Pro v&i 675 €30 685 Arg Leu Ph.e Aap Thr ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pr© Ph» Glu 690 695 700 <210> 5 26

<211> 2031 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 aagfegceetg fct&gecstga agttgctgac tgcagceaee tgaagttgsc teagcjiaeee 60 gatgafcctac ccacaascat sacagtgfctg aaççfcfcacçç at-a&te&aefc çagaagatta 1£Ç ccagccgcça aetteseasg gtatagccag ctaacfcagct tggatgt&gg atttaaeacc 180 at«fc.«aaaac tggagocsga attgfcgcoag' saacfctcossa tgtfcaaaagfc tfctçaaccfce 240 eagcaeaatg agotatctça astttctgat aaaacctttgr ccfctetgeac gastfctgaçt 300 gaaetccatc teafegfcccaa ctcaatccag saafjtt.aaaa ataatcccfct tgtcaage&g 3S0 asgaatttas fccseafcfcag» tstgtetcat, a&tggettgt eatctacaaa attaggaact 420 caggttcage tggaaaatct ccsagagctt ctafciatcaa acaataaaat toaagcgcta 480 aaaagfcgaag sactggatat ctttgccaat tcatctttsa asaaattaqs gtfcgfccatcç 340 aatcaaatta· aagagttttc tscagggtgt tttcacgcaa ttggaagatt attfcggcctg 600 fcttctgaaca atgtecagct gggtcccagc cttaeagaga agctatgttt ggaattagca S6Q aacacaagca fctcçgaatet gtctctgagt aaeagceagc tgtccsocac eagcaataca 320 actttcfctgg gaetaaagtg gaaaaatcte sctatgctcg afce-tfefeccta eaacaaefefea 780 aafegtggttg gtaacgattc ctttgcttgg cttccacaac tagaatattt cfcfccetaga.g 340 fcataataata fc&cageattt gttttctcac totttgc&cg ggcttttcaa tgtgaggtac 808 etgsstttga aacggtcttt tactasacaa sgtatttocc ttgcctcsct. ecocaagatt ÓS0 gatgattttt cttttoagtg go-taaaatgt ttggagcacc ttaacatggs ôçstaatgat 1020 attccaggca taaaaageaa tatgttcaca gg&ttgat«a acctgaaata ettaagfecta 10B0 tecaa<st<s«t ttaeaagfctfc gggaactttç ecaaatgaaa eattigtatc acttgctcat 1140 tcfccccttac acafeacCcaa rastaaccaag a&taaaatct c&aaaataga gagtgatgct X200 ttetettggt tgggccaecit agaagfcaeti gaeetgggee: ttsatgaaat tgaç.aa&gaa 12SÔ ctcacaggos aggaetggag sggtEjtagaa aatsttStog aaatofcatct fcfccefcecaac 1320 sagtáçctge agetgaetag gããetac:tt.t gçcK.l-ggtae cságcçfctea aagaatgãtg 1300 ctccgaaggg tggcccttaa ssatgtggat agetetectt. «aeeattcc» gcctcttcgt 1440 «acttgaoea ttctggafcct aagca&caac aacatagcc* acafcaaatga tgacatgttg 1500 gsgggtcttg sg&aacfc&ga aattcfcegai ttgcagcata aoaacfctagc eeggctetgg 1560 aaacacgcaa aecctggtgg tcceatttat tteetaaagg glcfcgtctca cetccacate 1620 cfctaacttgg agtccaacgg çtttgaegag atcceagttg aggtcttcaa ggsttt&fct-fe ISSO gsactaaagã tcãtcgãttt sggãttgsst astttáãáca cacttcOágc «tctgtçtfcfc 1740 aatastcagg tgtetctaaa gtcattgaac ctteagaaga atcteataac atccgttgag 1800 Sagsèggttt fccgggecsge tttcaggaac ctgactgagfc tegatat^cg Ctttastcc-c 1360 tttgsttgca cgtgtgâaag tafctgscfcgg tfctgfciaatfc ggatfcaacga gacccatacc 1020 aacatccctg sgctgtcaag ccactacstt tçscaacactc eacctcacta tcatgggtt» 1080 ccsgtgagsc tt.tfctgatac atcatettgc eeagacegtg eceectttgâ ô 2031 <210> 6 <211> 677 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 27

Lys CyíJ Thr Vai Ser ais Gin Vai Ala Asp Cys Ser Mis Leu Lys Leu 1 $ 10 15 Th.r Gin Vai Fro Asp Asp Leu Fr© Th r Asri XI e ihr Vai Leu .Asa. Leu 20 25 30 Thr Mis Asa Gin Leu Arç? Arg Leu. Pr o Lia Ala Asa Ohe Thr A.rg Tyr 35 4Q 45 Set Gin Leu fts.r Ser Leu «asp Vai siy Phs Asn Thr Ile Ser Lys Léu 50 55 60 Qlu PtO Glu Leu Cys Gin Lys Leu P cro Mãt Leu Lyu y.31 Leu Asn Leu 65 70 7S SÓ G.ln Híí' ks-n GXu Leu Ser Gin Leu Ser Asp Lys Thr Fhe Ala F&© Cys 85 90 05 Thr Asn Leu TAx Glu Leu fíis Leu Mefc Ser Asn Ser Ile Gin Lys ll>a 100 105 110 28 28 Tyr Asa Asa Leu Asa Vai Vai 61 y As» Asp Sei: 260 265 Gin Leu SI» Tyr Phe Ph© Leu 61» fyr Asn Asa 275 2S9

Lys Asn Asa Prc· Phe vai Lys Gin 11.5 1.20 ãrer Mi s htm Qly L«a Sair Ser Thr 130 .135 61» Asa Leu Gin 61a Lmi L©u leu 145 150

Lys Ser 61a Gl» L«u A&ç> Ils Fh© 1«5 61» L®u Ser Ser Asa 61« Sis Lys

ISO

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<210> 7 <211> 2031 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de ADNc obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, a qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N221. <400> 7 30 a&âfcgcacsg igagccatga. agtggcggat tgcsgosate tgaasçfcgao oeaçgtgccg 60 gstgatetgc cgsccaseat tsccgfcgctg asectcpeos atãaeeagct gcgccgcctg 120 «sggcggcga aetttaccog ctatagoeag etfsceagcc tggatgtggg cttta&cace .IBQ attagceaac tggaaccgga setgigccag aaactgccga tgcfcg&aagt gctgaacctg 240 cagcataacg aaçtgagcne. gctgagegat aaaaccttt-g cgttttgçac caacctgacc? 300 ga&ctgeatc tgatgagcaa cagcat.fccag aaaatfcaasa acaacccgtt tgtgaaacag 360 aa&aacctga tfcseecfcgga tctgagceat a&cggcctga gcagcaceaa sctgggcacc 420 caggtgcagc tgg&aaaccfc gcaggaactg ctgctgagca acaacaaast tcaggcgcfcg 480 aaaagcgaag eactggatat ttttgcgaac agcagcctga aaaaagfcgga actgsgcagc 340 aaccagatta aag&attt-ag ccegggctgc tttcatgcga ttggccgcct gttfcggcctg 600 tttctgaaca aggtgcagct gggccçgage çfcgsccg&aa a&etgfcgcct ggaactggcg 660 gcgaccagca ttcgcaacct gagccfcgaçe aaeageeagc tgagcaccac csgcaaeaee 720 acctttctgg gcetgaa&tg gaccaacctg accstgctgg stctgsgefca t&acaacefcg 7S0 ' aacgtggtgg gcaacgatag ctttgcgtgg ctgccgeagc tggaatattt ttttctggaa 840 tafcaacaaca fctç&gç&tct. gtfctagccat agcrstgc&tg gcctgtfctaa cgtgcgctafc. SCO etgaacctga aacgcagctt taceaaacag agcattagce tggcgagcet gccgaaaatt 960 gafegatttta gcfcfetcsgfcg gsfcgssa&igs «tggaacat« tgasgstgga sgafcaacgafc 2020 attccgggca ttaaaagcaa eafcgtttacc ggcuytgaita acetgaaafca fcctgagcctg 1080 agcaaeagat ttaecagcct gcgcacccrx? acca&cgaaa cctttgtgag «ctggcgcat 2140 agcccgctgc afcafctetçaa cctgaccaaa aacaaeatta gcaaaattga sagcgatgcg 2200 fcttagctggç tgggccatct ggaagtgcfcg gatctgggcc tgaacgaa&t iggccagga* 1260 ctgaecggcc aggaatggsg eggeetggaa aaoatttttg aaatt.tat.et gagatataac 1320 «aatafcçtgc agefcgacecg eaacagettt gsgctggigc cg&gcctgca gcgecfcg«tg 1380 etgogccgeg tggçgctgaa aaacgtggat agcagcccga çeeegttfcea çecgctgeçc 1440 sscetgacea ttctgg&tat gagcaac&ac aacattgcga acattaacga tgatatgctg 1SQD gaaggcctgg aaaaactgga aafctcfcggat ctgcagcata ae&acetggc gcgcctgtgg 1560 aaacafcgcga. açccgggcgg eccgatfcfcat fcttctgaaag gcctgagoca tefcgcatatt 1620 «?tgaac«ftgg eaagcaacgg ctttgafcgaa attccggtgg aagtgtttaa agatctgttt. 1630 gaacfcgaaaa tfcafcfcgatcfc gggcçtgaae aaeetgaaca ccctgçcggc çagcg*gt.ifc 2740 aacaaccagg tgagcctgaa aageetgaac ctgcagaaaa acctgattac eagcgtggaa 1S00 aaeaaagtgt ttggcccgge gtttegçsac ©tgacegaac tggaistgeg «tfctaacccg 1860 fcttgafctgea cctgcgas&g eafctgcgigg tttgtgaaet ggaitaacga aacceafcace 1520 aacafctcegg aactgagcsg sçattatetg tgeaa.ase:s:;c cgccgc^tta tcstggcttfc 1980 ccggtgcgcc tgtttgatae cagcagctgc aaagatagcg «gocgtttga a 2031

<210> 8 <211> 677 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N221. 31 <400> 8

Cys Thr Vai Ser Eis Glu V«I Ala Asp Cys Ser Eis Lsu Lys Leu i 5 10 15 Thr Gin Vai Pro &sp A.sp Leu Pro Thr Asn Ile Thr Vai Leu Asn Lsu 20 25 30 Thr Bis Asn. Gin Leu Axg Arg Leu Pro Ala Alâ Asn Phe Thr Arg Tyr 35 40 45 Ser G In Leu Thr Ser Leu Asp Vai Gly Phes A&n Thr Πβ Ser Lys Leu SQ 55 60 Glu. F:ro eiu Leu Cys Gla Lye Leu Pro Met Leu Lys Vai Leu A,sn Leu 65 70 75 8!) Gin EI s Asn Glu Leu Ser Gin Leu Ser Asp Lys» Thr Fhs Ala Phe Cys 65 9 θ' 05 Thr Asn Léu Thr Glu Leu Mie Leu Mfct Ser Asn. Ser lie Gin Lys 11 s 100 105 110 1 1 As íi Pr o Pha Vai Lye Gin Lys Asn Leu lie Thr L-su Asp Leu 115 120 125 Sex Hiss Asn Gly Leu Ser Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gin Vai Gin Leu. 130 135 140 Glp Asa leo. g i &. Glu LéU Lêtt Leu Ser Asn Asn Lys Ue Gin Ala Leu 145 150 155 160 Se.tr eia Glu Leu Mp Ilê Phe Ale Aêh Sêr Ser Leu Lys Lys Léu 165 170 1?5 Glu Leu Ser Ser Asn Gin Ie Lys Glu Phe Ser Pro Gly Cys Phe Mia 130 185 100 3iv_Í. ct Ue Giv Àrg Leu Phe Gly Leu Phe Leu Asa Asn Vai Gin Leu Gly 195 a 00 205 Ρϊο Ser Lcm Thr Gl« Lys Leu Cys Leu Gin Leu Ala Ala Thr Ser lie 210 215 220 Arg Asn MíU Ser Leu Ssr Asn Ser Gin Leu Se.r Thr Thr Ser Asn Thr 225 230 235 240 Thr Phe Leu eiy Leu Lys Trp Thr Asn Leu Thr Mat Léu Asp Leu Ser 245 250 255 Tyr Asn Asn Leu Mn Vai Vai Gly Aen Asp Ser Fh.e Ala Trp Lsu Pro 260 265 270 Gin Leu G l.u Tyr Pfee Phe Leu Gin Tyr Asn Asn Ue Gin Bis Lau Fhe 2?S 2 ao 285 32

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<211> 2031 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapíens, à qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N387. <400> 9 ssãtgeáccg tefagccafcga fstgâtctgc egacc&aeat ccggcggcgá actttacocg a 11 agcaa a e tgg& aecgga cagcataaçg aactgagccá gaacfcgcatc fcgafcgageaa aaaaacefcga ttaccctgga caggtgcâgcr tggaaaacct aaaagcgaag aaetggatat aaceagatta a a.ga attfcag tttetgaaea aegtgc&gcfc aapaceagsa ttcgeaacet accfcfctctgg gecfcgaaafcg aaegtggfcgg geaaogafcag tãtsãeãácá fcfccagcsfcôt etg sa eetga aaegcagefct gatgatttfc» gotfctcsgfcg a 11 ccgggca ttaaaagcaa agcaacagefc ttãçeageet agcccgctgc afesttctggc 11 tagotggc tgggocatet ctgaeeggcc agga&tggcg «aafcatctgc agctgeccog ctgssgecgeg tggegetgaa ascctgacc» tfeçtggatct gaaggcctgg «aaaacfcgrça aaaeatgsga accegggegg ctgáêoctgg aasgcaacgg gaactgaaaa ttattgatct aaoaaccagg tgagcctgaa aaaaaagtgt ttggcccggc ttfcgafctgea eefcgcgaaag a&cafctcegg aactgagçag ccggtgcgcc tgtt.fcgat.ac ccaggtgoeg 60 ge^csgectg 120 ctttaacacc ISO gctgaaecrtg 240 caecstgacc 300 tgfcgaaáoag S6Ô actgggcacc 420 tcaggcggtg 480 atfcgageage 540 gfcfcfcggccfcg 600 ggaactggeg 650 cagcaacacc 720 tsacssQctg 780 ttttctgga* 040 cgfcgegctat· SOO gecgsasâti. 060 agataacgafc 1020 tctgagcctg 1089 cctçgogcat 1140 aagcgafcgcg 1200 tggecaggaa 12 69 gagctatãac 1320 gcgccfcgafeg 1380 gccgcigcgc 1440 fcgatatgqtg 1S0O gcgcctgtgg 1360 tcfcgeatatt 1620 «gafcctgttfc 16S0 gagcgtgttt 1740 cagc.gt.ggaa 1000 ctttascccg 18S0 ssecçatacc .1920 t.eatggcttt 1080 »' 2031 agtggeggist tgcagcestc tgaaactgac fcaccgfcgcfcg aacctgaccc ataaceafcfc çtãtágccag etgatcagtç tggafcgtggg actgtgewag «aactgccg» tgctgaa&gt gçtgagogãfc saascctt-tg egtfctfcgçac cagcattcag aaaattaaaa acaacccgtt tcfcgagccafc aacggcctga gcaçcaccaa gc&ggaaetg ctgctgssca acaaoaaaat fcfcfctgegaac ageagccfcga aaaaactgga cccgggefcgc tfctcatgcga fctggccgcet gggcccgagc cfcçscegasa aactgtgcct gagcetgagc aacagccagc fcg&gcaccac gaccaacctg accatgçfcgg atctgagcfcs ctttgcgfcgg «tgccgcagc tggaatattt gttfcagccat agcctgtatg gcetgttfcaa taceaaaeag agcattagec fcggcgagcct gctgaaatge cfcggaacatc fcgaacafcgga catgtttacc ggcctgatta accfcgaaafca gcgcaccctg accaacgaaa cefcfcfcgtgag gctgsccaaa aacaaaatta gcasaattga ggaagtgctç gatcfcgggcc tgaacgaaát eggcetggsa aacatttttg aaatttatct çsãçagcttt. gcgctggfcgc cgagccfcgta aaacgtggat agciageccgã gcccgtttca gagcásçáãc aacattgcga a.catfcaacga aafcfccfcggat ctgcagcsta scaacctggc cccgatttat tttctgaaag geefcgageea cttfcgatgaa afctccggtgg aagtgtttaa gggectgaac aacctgaaca ccctgccggc aagccfcgaac cfcgcagaaaa acctgattac gttfcogcaac ctgaccgaac feggatafcgcg cattgegtgg- fcttgfeg&act ggattaacga oeattafccfcg fcgcaagsççç àfçcgçatfcá cagcagctgc «aagafcageg cgcegtttga 34

<210> 10 <211> 677 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N3 8 7. <40 0> 10 rV e Cy-ij T rs r y&i Se r r i s Sliu V a j. A1 a Asp C y s Se x H .1 s L··3 ύ f y o fuu 1 5 :io' ' is 35

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<210> 11 <211> 2031 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de ADNc obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, a qual falta um péptido de sinal e contém mutações de substituição de alanina (A) em N221 e em N3 8 7. <40 0> 11 37 aaafcgcaccg tgagcscafcga agtggcggat tgcagccafcc tgaaactgac ccaggfcgceg €0 gatgatstgc cgaseaaeat taccgtgctg aacefcgaccc ataaccagcfc gcgsegeeig X20 ccggcggcga actttacccg ctatagccag ctgaccagcc tggatgtggg etttaaeaec ISO attafcaaae tggssecgga actgtgccaç asactçccga tgcfcgsssgt gctgaacctf 240 cagcataecg aaetgagcca getgagcgat aaaaccfcttg ogttfctgcftc caacçtgacc 300 gaactgcatc tgatgagcaa oagcattcag aaaattaaa» acaacccgtt tgtgaaacag 360 aaaa&cctg* tfc&eccfcgga tcfcgagecat aacggcctga gcageacctsa actgggca«« 420 c&ggtgcagc tggaaaacct gcaggaactg ctgctgagca acaacaaaat tcaggcgctg 480 aaaagcgaag aactggatat ttttgcgaac agcagcctga aaaaactgga actgagcagc S40 aaocagatta asgaatttag cccgggctgc tttcafcgcga tfcggeegcct gtttggçetg €00 tttofcgsacâ acgtgcagct çggoccgagc ctgaccg&aa aacfcgtçcct ggaactggcg 660 gcgacseagca tfccgcaacct gagcofcgage aacagccegc tgagcaccac cagcaacacc 720 acctttctgg gcctgaaafcç gaccsaccig accatgctgg atctgagçta teacaacctg 780 aacgtggfcgg gcaacgatag cfcttgcgfcgg ctgccgcagc tggaat.stt.fc tttfcetggaà 840 tafcaacaaca ttcagcatct gttfcagecafc agceigcatg gcctgttfcaa cgtgegctat 900 ctgaacctga aacgcagctt taccaaacag ageafcfcagcc tggcgagcct gccgaasatt 960 gatgatttt® gctttcagtg gcfcgaaatgc ctggaacatc tgaacatgga agataacgat 1020 afcfcccgggca ttaaaagcaa cstgfcttscc ggcctgatta accfcgaaafca tctgagcctg 1080 agcaacagct ttaccâgcct gcgcaccctg accaaegaaiâ cctttgfcgag cctggcgcat 1140 agcccgctgc atattctggc gefegaeeaaa aacaaaatts gcaaaattgà aagegatgcg 1200 tttagctgge tgçgocatct ggaagfcgcfeg gatctgggcc tgaacgaaafc tggcaaggaa 1260 ctgaccggcc aggaafcggcg cggecfcggaa aacatttttg aaafcttatcfc gagctafcaac 1320 aaateafccfcge agctgacccg eaasagcfctfc gegctggtgc cgagcetçca gcgcctgatg 1380 «tgcgccgcg tggcgctgaa aaacgtggat agcagcccga gcccgtttca gccgctgcgc 1440 aaccfcgaoss tfcctggatct gagcaacaac aacattgcg* aeattaacga tgatatgctg 1500 gsaggoctgg aaasscfcgga aattetggat ctgcagcata acaacctggc gogcctgtgg 1560 aaacatgcga acccgggcOg ccegatttat tttctgaaag geetgageca fcefcgcstafct 1620 ctgaacctgg· aaagcaaegg ctttgatgaa attccggtgg aagfcgfcfcfcaa agatetgttt 1680 gaactgaaaa ttattgafccfc gggectg&ac aacetgaaca ccctgccggc gàgcgtgfctt 1740 aacaaccagg tgagcctgaa aagcctgaac ctgcagaaaa acctgafcfcac cagcgtggaa 1800 aaaaaagtgt ttggcccggc çtttcgcaac cfcgaccgaae fcggafcafcgeg ctttaacccg 1860 ttfcgattgca cctgcgaaag «attgcgfcgg ttfcgtgaact ggattagcga aacccafcacc 1920 aacattecgg aactgsgçag ccattatctg fcgcaacacec ogccgcatta tcatggcttt 1030 ccggtgcgcc tgtttgatac cagcagctgc aaagatagcg cgccgtttga a 2031

<210> 12 <211> 677 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de ADNc obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém mutações de substituição de alanina (A) em N221 e em N387. 38 <400> 12

Lys 1 Cys íhr '?&! Ser 5 His Glu V£i! Th>: Gla Vai Pt D 20 Asp Asp Leu PtO IHr Ms As.n 35 Gla lieu Arg Arg Leu 40 Ser Gin SO Leu Th r Ser leu Asp 55 Vai fils 65 ?ro Glu Leu Cys Gin 70 Lys Leu: Gin Eis Asn Oiu Leu 85 Ser Gin Leu íhr Leu nfcr 100 Glu Leu Mis Leu Lys Aím Agíi H5 Pr» Pha Vai Lys Gia 120 Ser His 130 Asn Gly Leu S©r Ser 135 Thr GIu 14S As.n Leu Gin L-i ti Leu 1.50 Leu Leu Lys Ser Glu Glu Leu 165 Asp 11 s Phe Glu Leu Ser Ser 180 Asn Gin lis Lys

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<210> 13 <211> 2031 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de ADNc obtida a partir de EDC de TLR3 de Mus musculus, à qual falta um péptido de sinal e contém mutações de substituição de alanina (A) em N221, N226, N387, e em N636. <400> 13 41 cagtgeaccg tgcgçtstaa cgtggegfat tge&gceatc tgaaaçfcgac «catattceg 60 gafcgatcfcgç cgagfiascat fcaô&gtgetg aéâôtgâássc ãfcaaccagct gcgôògcctg 120 ccgccgacca actttacecg gtatagccag ctggegattc tggatgeggg stttaacegò 180 atfcagcsaae tggascoggé acfcgtgcoag attotgçggg fcgctgisaagt gcrtgaacstg 240 c&gcstaacg aactgagcoa gattagcgat cagacctttg tgfctttgcac caacctçacc 300 gaactggísfcc tgatgagcaa cagcBfctcat aaaattsaaa gcaacccgfct taasaaesãg 360 aaaaaíscfcga fctaâactgga tctgagccsfc aacggcatga çrcagcscôaa aet.g@gcacc 420 ggcgtgeagc tgg&aascet gcaggaaetg ctgctggcga «aaacaaaat tetggegetg 480 çgçagçgaag ããctggaátt tctgggaaac ageagcctgc goaaaetgga fectgág«agc 340 aaeccgctga aagaatttag cccígggctgc tttcagacca ttggoaaact gttfegegetg 000 ctgctgaaca àogcgcagct gaacçggcat ctgaeçgaaa aacfcgtgcts ggaactgago 360 · gcgmceagca ttcaggcgçt gagcctggçg aaosacçsgc tgctggogac cãgcgaãagc 720 accfctfcagcg gcefcgaaatg gacea«cetg acccagctgg «tetgagct* taacaacctg 780 catgatgtgg gcaacggcag ctttagctat ctgccgsgoc tgcgctatct gagcetggaa 340 tataacaaca tteagcgcct gagscegcge agctttfcafcg gcetgagcaa êetçfcgètat 000 ctgsgcctga aaegcgegtt taeeaaacag «gegtgageo tggçgagecs tcagaacatt 960 gatgafcfcfcfca gctttcagtg gçtgáaatat ctggaatatc tgaacatgga tgafcaacaac 2020 afctxegagca cca&aagca» çaCGtfcfcaee ggcíJtggtg*. goctgaaat» t«tgagcctg 1030 ageaaaaect fctaecagcct gcagacecfcg a«eaa«gaaa ««tttgtgag cctggegea.t 1240 ageecgetgc tgsccctggc gefcgaceaaa aace&fcafeta gcaaaattga gascà^caos 2200 tttagctgg© tgggccagct gcgosttctg gafccfcgggcc tgaacgaaat tgaasagaaa 2260 ctg&gcggec aggaatggcg ©ggcctgcge aaeatttttg _ aaatttatct gagctataac 1320 aaatafcctgc agctgagc&c cagcagefcfct gegetggfcge egsgcctges gggcefcgstg 13S0 «tgcgccgog tggegctgsa aaacgtggat attsgcccgs gaacgtttag cccsgcfcgcsgcs 2440 aacctg&cca fcfcetggafcct gagca&caac aacatfcgcga acafcfcaacga sgatctgctg 1500 gaaggcetgg saftacsfcgga aattctggat fctfceaçcats acascefcgge gcgcct-gtgg 1560 aaacg«gcga acccgggogg ©ccggtgaa© tttctgaaag gcctgsgcca tctgcaiatt 1620 ctgaacctgg aaageaaegg cx&ggatgaa afctceggtgg gcgtgttt&s aaacctgttt 1630 gaaetgaaaa gcattaacet gggaetga&c a&ccfeg&aca aactggaacc gtfctatfcfctfc 1740 gatgsteaga ccagoetgeg cagcetgsac etgcagaaaa aeetg&ttac c&gegtggss 2800 aaagatgtgt ttçgeccgcc gttteagaac cfcgaacagce tggatatgeg etftaacccg I8SQ tttgsttgca cctgcgaaag cattagctgg tttgtgaact ggafctgcgca gaoscstac© 2320 aacattagcg aaefcçageac ©caifcatcfcg tgcaacascc cgcatcatt* ttatggcttt 1980 ecgctgaaac fegtttgatac esgcagotgc aaagatagcg cgccgtttga a 2031

<210> 14 <211> 677 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de TLR3 de Mus musculus, à qual falta um péptido de sinal e contém mutações de substituição de alanina (A) em N221, N226, N387, e em N636. 42 <400> 14

Gin cys Thr Vai Arg Tyr Asrs Vai Ale Asp Cys Ser Mie Leu Lys Leu 1 5 10 15 ffcr Eis lis Fro Asp Asp Leu Fr o Ser Asa Ue Thr Vai Leu Asm Leu 20 25 :to Thr Mis Asm Gin Leu Arg AXg Léu Era Pro Thr As.n Fhé Thr Ax<g Tyr 35 40· 45 Ser Gin Leu Ala n« Leu Asp .AÍ a Gly Fh* As π Ser 11a Ser Lys Leu 50 55· 60 Çlu Pr© Glu Leií Cys Gin llxi Leu Fr© Leu Leu lys vai Leu. Asi R Leu 65 70 75 SS Gin Hls Asn Giu Leu Ser Gin xie Ser Asp Glu Thr Phe Vai Fhe Cys 85 90 95 Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Met Ser Asa Ser lie ais Lys lie 100 105 110 lys Ser Asn Fro Fhe Lys Mn Glu Lys Asa Leu Ile X.ys Leu Asp Leu 115 120 125 S*i: Ela Asm. Gly Leu Ser Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gly Vai Gin Lsse 130 13.5 140 Glu Mn Leu Glrs Glu Leu Leu Leu Ala Lys Mn LyS lis Leu Ala Lsu 145 150 1.55 160 Arg Ser Glu Glu Leu Glu t>m. Leu Gly â3u Ser Ser Leu Arg Lys Leu 165 170 175 Asp Leu Ser Ser Má Pr© Leu Ly© Glu Ffee Ser Pro Gly Cys Phe Gin IBS 185 190 Thr I le Gly Lys Leu Phe Ala Leu Leu Leu fisn Asa Ala Glu. Leui Asa 195 200 aos Pro His Leu Thr Glu Lys Leu Cys Trp Glu Leu Ser Ais Thr Ser llss 2.10 215 220 Gir. Ali: Leu Ser Leu Ala Asn Asn Glu Leu. Leu Ais Thr Ser Glu Ser .225 230 235 240· Thr P.he Ser Gly Leu Lys Trp Thr Asa Leu. fhr Sln Leu Asp Leu Ser 245 2BÕ 235 Tyr Asn Asa Leu Eis Asp VSl Gly Asa Gly Ser Fhe Ser Tyr Leu Pro 260 2 65 270 Ser Leu Arg Tyr Leu Ser Leu Glu Tyr Asa Asm 21© Gin Arg Leu. Ser 275 280 285 Fro Arg Sex Fhe Tyr Gly Leu Ser Asa Leu. Arg Tyr Leu Ser Leu Lys 250 295 300 Arg Ais P.he Thr Lys Gin Ser Vai Ser Leu Ala Ser .His Fr© Asm Ile 305 310 315 320 Asp Asp Mie Ser Fhe 6ln Trp &su Lys Tyr Leu GlU Tyr Leu Asm MM 325 339 335 Mp Asp As.u Asa Ili Fr o Ser Thr Lys Ser Asa Thr Phe Thr Gly Leu 340 343 350 Vai Ser Leu Lys Tyr Lsu Ser Leu Ser Lys Thr Phe Thr Ser Leu Gin 35S 360 3S5 43

Thr leu Thr Asn Glu Thr Fhe Val Ser Leu. Ala Hie Ser Pro Leu 370 375 380 •Thr Leu Ala Leu Thr Lys Asn BÍS Ue Ser Lys lie Ala Asn Gly Thr 38 S 390 395 4 00 Fhe Ser Trp Leu Gly Gin Leu Arg Ils Leu Asp Leu Gly Leu Asn Gla 4 D5 410 4 IS lie Slu Gin Lys Ser Gly Gin Giu Trp Arg Gly Leu A.tg Asn Ile 420 425 430 Phe Glu lie Leu Ser Tyr Aso Lys Tyr Leu Gin Leu Ser Thr Ser 435 440 445 Ser Fhe Ala Leu Vai Pro ser Leu Gin. Arg Leu €iet Leu Arg Arg Val 450 455 460 Ala t*o I&® Asn Vai Asp 1!« Ser Prs Ser Pro Fhe Arg Pro X^u Arg 4 $5 470 415 4Θ0 n. Léu Thr Ile Leu Asp Leu Ser Asn Asn Asn 11 e Ala Asn Ile Abo 485 490 495 Lee Leu Glu Gly Leu Gin Asn LêU Giu lie Leu Asp Fhe G1 ti 500 505 510 Hl a Asm Asn Leu Ale Arg Lau Trp Lys Arg Ala Aefa Pro Gly Gly Fro 515 520 525 Vai As.n Fhe Leu Lys Gly Leu. Ser His Leu Sis Ile Leu Asn Leu Giu 530 S3S 540 Ser Âsn Sly Leu Asp· Glu Ile Pro Val Gly Vai Fhe Lys Asn Leu Fhe 54 S 550 555 560 Gil Ul Leu Lys Ser lie Asn Leu Gly LíèU Asn Asn Leu Asn Lys Leu Glu 565 570 575 Fjto Fhe lie Fhe Asp Asp Gin Thr Ser Leu Arg Ser Leu Asn Leu Gih 580 385 590 Lys Asn Leu lie Thr Ser Val Giu Lys Asp Val Fhê Gly Frçf Pro Phe 505 600 605 Gin ÃSB Leu Asn Ser leu. lurp Met Arg Fhs Asn. Fro ?hs A®p Cys Thr 610 615 620 Cys fâla Ser Ile Ser Trp Phe Val Asn Trp Ile Ala Gin Thr Ais Thr 625 630 635 640 Asn Ilê Ser Gin Leu Ser Tsr His Tyr Leu Cys Asn. Thr Prp Mis His 645 650 655 Tyr lyr Giy Fhe ire .Leu Lys Leu Fhe âsp Thr Ser Ser CVS Lys Asp 66 S 66 S 610 Gsr .Ma Pr« Phe Gin €15

<210> 15 <211> 2031 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 44 <223> Sequência artificial de ADNc obtida a partir de EDC de TLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém mutações de substituição de alanina (A) em N226. <400> 15

saaigc&ccg tgagccatga agtggsggai tgcagccatc fcfaaactgsc ccaggfcgccg 60 gatgatctgc cgaocaãcat. taccgfcgctg aacctgaccc atascsaget gcgccgcctg 12 D cc:ggcggc.g« aetttacccg ctatagccag tggafcgtggg ctttaasscc ISO afetagcaaac tggaaccgga actqtgceag aaactgcegâ tgctgaaagt gctgs&ectç 240 cagfestaacg ssctgagcca gctgagcgat aaaacetttg cgttttgeac caacotgacc 300 çaectçcste tgatgagcaa cagcattcag aaaattaaaa aeaacccgtt tgtg&aecag 360 •esaaaacctga ttaccctgga tctgagccat aacggectga gcaçcjaecaa actgggcacc 420 caggtgcagc tggaaaacci goaggaactg ctgctgsgca acaacaaaat fccaggcgctg 400 saaagogsag aactggatst tfcfctgcgaac agcagcetga aaaaactgga aefcgagçagc S40 «acoagatta ssgBattfcag cccgggctgç tttcafcgcga ttggòagçjct gtttggcsig 600 tfcfcetgaaca acgtgesgct gggcccgages etgaocgaaa aactgfegcsasfc ggaacfcggcg 660 aaeaecsgca ttcgcgcgct gageefcg&gc a&cagccagc tg&gcsaceac oagc&acacc 120 seefcfctctgg gectgaaatg g&eeaaectg accatGctgg afcctgageta ta&es&cetg 7S0 aaegtggfcgg gea&sgsfcag ctfctgcgfcgg ctgccgoagc tggaatattfe fetttctggss 840 t&taacaaca ttcagcatct gtttagecat agecigcatg gcetgtttaa cgtgegetai 500 çtgaacctga aacgcagett tacc&aacag agcattagee fcggcgagcct gccgaaaat* §60 gatgatttta gctttcagtg gctgaaatgc ctggaacatc fcgaacafcgga agataacgafc 1020 afcfcccgggca ttaaaagcaa catgtttacc ggecfcgatta acctgaaata tcfcgagcçtg 1080 agçaacagçrt ftaccagcct gcgcaccctg açcascgaa» cctit.gfcgag cctggogcat 1140 agaccgctgc efcafct-ctgas ccfcgaccaaa aacaaaatta gcaaaattga aagcgatgcg 1200 tttagcfcggc tgggcoatct ggaagtgctg gatctgggcc tgaacgaaat fcggccsggaa 1260 efcg&cqggec sggã&tggcg cggggtggaa aaeatifcfctg aaattfcatfit gagetata&c 1320 aaatatefcgc agstgacccg caasagctfct gcgçtggtgc cgagccfcge* gçgectgatg 2380 efcgcgccgcg tggcgctgaa asacgtggst agcagcccga goccsgtfcfcca gccgctgcgc 1440 aaectg&cíca fctcfcggatçfc gageaaeaae aacafcfcgcga ac&tt.a&cga fcgatafcgctg 1500 ga.®ggccfcgg aasasat-oça aattetggat ctgcagoata acaacctggc gegoc&gtgg 15S0 aaatsatgcga aeeegggcgg ccegatfctafc fcttctgaaag gcctgsfçea tcfcgoafc&tt 1620 ctgsâççtgg ãaagçsaegg ctttgãtgaa attcgggtgg aagtgtttãã ãgat.ctgtfct 1680 gsacfcg&as» fctatfcgatcfc gggcetgaaí; aaeefcgaaea ©cctgceggc gagcgtgttfc 1040 iaàCáaceagg tgagect-gaa aagcctga&c ctgcagassa acetgattac cagcgtggaa 1800 asaasagtgt ttggcecggc gtttcgesaè ctgacegaae fcggafcsfcgKg tstet-fcaacccg 1860 tfctgsttge» ce&gegaaag cafcfcgcgfcgg tttgtgasct gg&tt&âcga saeccatacc 1020 aaeattccgg aactgageag ccattatefg tgcaacaccc cgocgeatta ‘toatggcttt 1080 eeggtgcgee tgtttgatsc cagesgetgc aaagatageg ogccgtttga a 2031

<210> 16 <211> 677 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 45 <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N226. <40 0> 16

Lys Cys Thr Vai ser His Q:l« v»l Ala Asp €ys Ser His LéO Lys le» 1 5 10 · 13

Thr 61» Vai Firo Asp Asp Lais Pre Thr Ãsrt Ile Thr Vai Leu Asn La» 20 ' 25 30

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Arq Ma Leu Ser Leu Ser Asa Ser Glr* Leu Ser Thr Thr Ser Asn Thr 225 230 235 240

Th.r J?be Leu €>ly Leu Lys Trp Thr Ag» Leu Thr Met Lee Asp Leu Ser 245 250 255

Tyr Asn A«n Leu &»» Vai Vai Qly A»h Aap Ser Phe Ala. Trp lj«u Pro 260 ” 265 270 ©2« Le» Glu Tyr Pfeô Fhe Leu Glu Tyr Asa Asn lie 61» Bis Leu. phs 275 ' 280 ' 285

Ser Ais Sar Leu Bis Sly Leu Phe Aan Vai Arq Tyr Leu Asn Leu Lys 290 295 300

Arg Ser Ph« Thr Lys <3 la Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pr o Lys lie 305 310 315 320 Ãsp Asp Fhe Ser Fhe Gin Trp Leu Lys Cy» Leu Glu Bis Leu Asn Eet 22S ‘ 330 335

Glu Asp As» Asp Ile Fro Sly II© Lys Ser Asn Mafc Phe Thr Sly Leu 340 345 350 12« As» Leu Lys Tyr Tjen ser Leu Ser Asn Ser pfc® Thr Ser Leu Arc? 355 360 365

Thr Leu Thr Asn Glu Thr Phe Vsi Ser X«ex? Ale «is Ser Fro Lee Eis 370 375 380 12« Leu As» Ls» Thr lyo Asn Lys Ile ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala 385 390 395 ' 400

Phs Ser Trp Leu ©ly Bi» Leu Glu V&l Leu Mp Léu Sly Leu As» Glu 405 410 415

Ile Gly 61» Glu Leu Thr Sly ©2» Glu frp Mg Cily Leu Glu Asn lie 420 425 430

Fhe 62« Ile Tyr Leu Ser Tyr Mn Lys Tyr Leu Gin Leu Thr Arg Asa 435 ’ 440 445

Ser Fhe Ale Leu Vai Fro Sor Lee Gin Arg Leu H«t Léu Mg Mg Vai 450 455 460

Alá Lee Lys Asn Vai Asp Sér Ser Fro Ser Fro Phs Gin Fro Leu Mg 46S 476 475 480

Ase Leu Thr 11« Leu As» Leu Ser Asn Asn Asn lie Ala Asn Ile Asn 485 49Ú 495

Mp Asp Met Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Glu 21« !«u Mp Lee Glu 500 SOS 51.0 H1..& A»n Asn hm Ala Arg Leu Trp Lys Hi» Ala Asn Fro Gly Gly Fro 515 520 5.25

Ile tyr Fhe Leu Lys (Sly Leu Ser Bi» Leu Eis Ile Lau Mn hm <»1« 530 535 S«0 47

Ser Giy ffte Asp 61« lie Fxo V*1 Giu Vai Pfce Lys Asp Leu Phe 545 550 555 560 Giu .teu. Lys Ile Ile Asp Lta Gly La» As,o Asa Leu Asa Thr Leu Pro 565 S70 575 lias Ser V©1 Pb© Asn Asa 61 íi Vai Ser Leu Ly© Ser Leu Asn Lsu Qln 589 585 590 Ase Leu lie Thr Ser Vai Siu Lys Lyg Vai Phe Giy Pr o Ala Pb© 59 S «00 605 Arç Asm Lsu Thr Glu Leu Asp H&t Arg Phe Asn Pr o Phe Asp Cya Thr €19 Si 5 620 Cys <3lu Ser Ile Ala Trp Pb© Vai Asa Trp Lie Asn <3 la Thr His Thr €25 630 635 640 Asn n* Pro 61a Leu Ser Ser BlS Tyr Leu Cya Asa Thr Pro Pro Bis 645 650 655 Ίγχ Sis <tl y Fhe Pro Vai Arg Leu Ph® Asp Thr Ser Ser Cys Ays Asp eso 665 S70 S>sr Ala Pro ul u 675

<210> 17 <211> 2031 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N636. <400> 17 48 aaisfcgcaccg tgageeaiga agtggcggat tgcagccstc tgaaactgae ccsggtgccg 60 gatg&tctgc cgaccaacst taccgtgctg aacctgaccc ataacc&gct gcgccgcctg 120 ccggcggcga acttt.aaccg ctstsgscag cfcgssssgc-c tggstgtggg cttfcaacace 180 safcaga-aaaç tggaaccgga «etgtgccag asaçt:ga«ga tgçtgaaagt; gctgaaactg 240 cagcafcaacg a&ctgagcca gctgãgsgafc aaascctttg cgttttgce« caacctgacc 306 gaaefcgeate tgatgagcsa cagcattcag asaafctaaaa acaacccgtt tgtgaaaeag 360 aaaaaccfcga tfcaccctgga tcfcgagccst aaeggcctga gcagcaeesa acfegggcace 429 caggtgcagc tggaaaacet gcaggaaefcg ctgctgagca acaacaaaat tcaggogctg 480 aaaagcgasg aactggatat ttttgcgaac agcsgcctgs aaa&sctgga actgsgcsgc 540 ssaccagatta aagaatttag cccgggcigc tttcatgcga ttggccgcct gtttggcetg 600 tttctgaaç» aegtgcegct gggcccgagc etgacegaaa aactgtgcct ggaactgçeg 660 aaeaccagsa ttggc&acct gsgegtgagc aacagccagc tgageascac «sgcaãçsçg 72.0 acctttctgg gcctgaaatg gaccaacctg accatgctgg atotgagcta fcsacascstg 760 aaegtggtgg geaácgãtag· ©tttgegfcgg ctgcegeage tgg&atafctt. ttttetgga» 640 tataac&aca fctcagcatct. gfcfctagecat agcctgcatg geetgfcfetaa egtgcgcfcafc 000 ctgaacctga aacgcsgctfc taccaaacag agc&ttagcc tggegagcct gccgaaaat-t ?S0 gatgatttta gctfctcagtg gctgaaatigc ctggascaf-c tgaacatgga sgataaogat 1020 «tfcccgggca ttaaaagcaa catgtit-acc ggoctgatfca acctg&aata tcfcgagcefcg 1080 agcaacsgct tfcaecagect gegsaccctg aecaaegaaa eeittgtgsg cctggcgeat 1140 agcccgctge at&itctgaa cctgsccaaa aacasaatta çcaaaattfa sagcgatgcg 1200 tttagcfcgg© iggg<jestcfc ggaagtgctg· gatctgggcc tgascgaaat tggccsggas 1260 ctgaocggcc aggaatggcg cçgcctggaa sacãtfctttg aaatttatct. aagctatsac 1320 aaatatetgc agctgacccg caacagottt; gogctggtgc egsgcetgca gcçccfcgafcg 1360 ctgcgc-cgcg tggcgçtgaa aaacgtggmt agcsgcccga gcccgtttca gccgctgcgc 1440 aaec&gacea fctefcggatct gsgçaacaãc aacattgega acsfctaaçgâ tgafcafcgefcg 1SÕ0 gaaggcctgg aaaaactgga aattetggat ctgcagcata acaacctggc gcgcctgtgg 1560 aaae&tgega acccgggcgg cccgatttat tttctgaaag gcctgagcsa tctgeafcatt 1620 ctgascctgg aaagcaacgg ettfcgafcg&a attccggtgg asgtgttfcaa agatctgttt 1680 gaaetgaaaa ttattgatct gggectgaac aacctgaaca ccctgccggc gagcgtgfctt 1740 aacaaccsgg tgagcctgaa aagcetgaac ctgcagaaaa acctgattaç cagcgtggaa 1800 aaaaamgtgt fcfcggoceggc gtttcgcaac cfcgaccgaac tggstafegcg ctttaacccg 1860 tttgattgea ccfcgegsaag catigcgtgg tttgtga&ct ggattgcgga àâeccafcaoe 1020 aacat-tccgg aacfcgagcag ccattátetg tgcaaeaccc cgccgcattss fccatggçttt 1980 cçggtgcgcc tgtttgatac cagcsgctgc saagatsgcg cgcogfcttga a 2:031 <210> 18 <211> 677 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, sinal e contém uma mutação de em N636. aminoácido obtida a partir de à qual falta um péptido de substituição de alanina (A) 49 <400> 18

Lys cys ths Vai Ser Hls Slu Vai. Ala Asp Çys Ser Mis Leu Lys Leu 1 5 10 15 7 br Gin vai Pro As? Asp Leu Pro Thr Αδη n® Thr vai Leú Asm Leu 20 25 30 Thr Si§ Asa Gin Leu Arg Arg Leu Ar® Ala Al ^ Asm Phe Thr Arg fyr 35 40 45 Ser SlA Leu Thr Ser LiSU Asp Vai Gly Fhe Asn Thr lie Ser Gys Leu 50 35 S8 Glu Pro Glu Léh Cys Gin Lys Leu Pro Met Leu Lys Vai Leu Asm Leu 65 7 D 75 B0 Gin His A§n. Glu Léu Ser Gin Leu Ser Ãsp Lys'5 Thr Phe Ala Ph.e Cys 85 90 95 •Thr Asa Leu Thr 61a LèU Hi-s Leu Met Ser fisn Ser 11» Gin Lys Oe 100 105 110 Lys Asn Asa P»:o Phe vai Lys Gin IfS Asn Le u lie Thr Leu Ãsp Leu ns 120 125 Sér Hl® As π 61 y Leu Ser Sur Thr Lys Leu Gly Thr Gin Vai Gin Leu 130 135 14 0 Glu Asa Leu Gl.ift Glu Leu Leu Leu Ber Agn Asa Lys lie Gin Ala Leu 145 150 15:5 160 Lys Ser Glu 51¾ Leu Asp n» Plie Ala Asm Ser S®r Léu hys Lys Leu 165 170 175 Glu Leu Ser Ser Asn Gin He Lys Glu Phe Ser Pr o Giy Cys Phe eis 180 185 190 Ala ile Gly ,&rg Leu Phe Gly Leu. 9he Leu Asm .Asa Vai Gin. Leu Gly 195 200 205 f-ro Ser Leu Thr G1 u Lys Leu Cys Leu Glu Leu Ale Amn Thr Ser I Is 21D 215 220 Arg Asa Leu Ser Leu Ser JMm Ser Gin Leu Set: Th r Thr Ser Asn Thr 225 230 235 240 Thr Phe Leu Gly Leu Lys Trp Thr A$n Leu Thr Het Leu Asp Leu Ser 245 250 255 Tyr A.srt Asn Léu As π Vai Vai Gly Asa Asp Ser Ph® Ara. Trp Leu Pr o 2S0 265 270 50

Gla Leu Glu Tyr Phe Phe Leu Glu Tyr Aars Asn 1M Gin Bis Leu Phe 275 280 285 Ser Bis Ser Leu Bis Gly Leu Pha Asn Val Arg Tyr Leu Asa Leu Lys 290 2 85 300 Arg Ser Phs ar Lys Glu Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pro Lys lie 305 310 315 320 &S{> Asp Phe Ser Phe Glu Trp Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Asri Met 325 330 335 Glu âsp &sn Asp Ile Pro Gly Ile lys Ser Aon Met Phe Thr Gly Leu 390 315 350 Ils Asa Leu Lye Tyr Leu Ser Leu Ser Asn Ser Phe Thr Ser Leu Arg 35S 360 365 Th* Leu Thr &®a Glu Thr Phe Val Sai Leu Ala His Ser Pro Leu Ris 3?Q: 375 380 Ile Leu ASU Leu 3?hr Lys Asn Lys lie Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ais 385 390 395 400 Phe Ser T.rp Leu Gly Bis Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Leu Asn Glu 405 910 415 lie Gly Gin GlU Leu Thr siy Gin Glu Trp Arg Gly Leu Glu Asa lia 420 425 430 Pfee Glu ile Tyr Leu. Ser Tyr Asn Lys Tyr XíêU Gin Leu Thr Arg Asa 435 440 445 Ser Phe Ala Leu Vai Pro Ser Leu Sln Arg Leu Met Leu Arg Arg Val 450 455 460 Ma Leu Lys Asn val Asp Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gin Pro Leu Arg 465 970 475 980 ASU Leu shr Ils Le« Asp Leu Ser Asa Asn Asn ile Ale Asa ile Asn 46S 490 995 Asp Asψ Met Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Glu ile Leu Asp Les Gin 500 505 510 Bis Aí;n Asn Leu Ala Árg Leu Ttp Lys Bie Ala Aso Pro Gly Gly Pro 515 520 525 Ile Tyr Phe Leu Lys Gly Leu Ser Mia Leu Hl® lie Leu Aso Leu. Glu 530 535 540 Ser &SU Gly Phe Asp Glu Ile Pro Val Glu val Phe Lys Asp Leu Phe 595 550 555 560 Glu Leu Lys 11 e lie Asp Leu Gly Leu Asn A.a r Leu Asa Thr Leu Pro 565 570 575 Mà Ser V»1 Phe Asn Asn Gin Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gin 5BQ 58-5 520 Lys Asn Leu Ile Thx Ser Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala pha 505 600 SÓS Arg ASO. Leu Thr Glu Leu Asp Met Argr Phs Asn Pro Phe Asp Cys Thr 610 615 620 CyíS Glu. Ser Ile Ala Trp Pha Val Asn Trp Ile Ala Glu Thr Bi® Thr €25 630 635 640 &SU Ilt Pro Glu Leu Ssr Ser Bis Tyr Leu Cya Âsn Thr Pro Pro His 645 650 655 Tyr His siy Fhe Pro Val Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp 660 665 670 Ser Ak Fto Phe Glu €75 51

<210> 19 <211> 2031 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N221, N226, N387, e em N636. <400> 19 52 «astgeaccg tgsgceafga agtggçggst tgcagceatc tgaaactgec ceaggtgecg 60 gatgaictgc cgaccaacai iaccgfcgctg aaectgaccc sfcaaccagct gcgccgcctg Í2ts ccggcggcga actfctaeeog cfeafcagoeag ctgaccagcc tggatgtggg ctttaacacc 180 afctágcàaac tggaaccgga «çtgtgccag aa&ctgccga tgstf&asgfc gctgaacçtg 2<1Q cagcataacg asctgagcca gcfgagcgat aaaaectfctg cgtttfcgcac caacctgacc 300 gaaotgcatc tgatgagcaa c&gcafcteag aaaafcfcaaaa acaacccgtt fegtgaaacag 360 aaaaacctg* ttaeecfegga tctgagccst aaeggcotga gcageascaa actgggeace 420 caggtgcagc tggaaaacct gcaggaactg ctgctgagea atsaaeaaaat tcaggcgctg 480 aaaagcgaag aactggatat ttttgcgaac agcagcetçja aaaaactggs aetgagcacsc S4D aaccagatta aagaatttag ceegggctgc tttcatgcga ttggccgcct gtttggcctg 600 tttctgaaca aggtçcagci gggeeegage ctgacegaaa aactgtgcct ggaactgçcg 660 gcgaccagca ttcgcgcçct gagcctgagc aacagccagc tgagcaccac cagcaacacc 720 scefcttetgg gecfcgaaatg g»ccaa«ctg accat.g«6.gg atctgagcta taat^aeetg ?®0 aassgtggtgg gcaacgatag cttfcgegtgg ctgcogcagc tggaatattfc ttttçtggaa 840 tataacaaca tteageatet. gtfctãgcçat ágcçfcgcatg gectgttfcaã ogtgegcfcát 900 crtgaacctga aacgeagefcfc ta«c»»acag agcatfcagcc tggegagccfc geegaaaatfc 960 gatgstttts gettfccagfcg gctg®ss.afcga ctggaácatc tg»*©#fcgga agaiaasgat 1020 afcteogggca tt&à&agcss catgittaec ggcc.tg3.tts accfcgaaata letgagcstg 1080 agcaaeaget ttaeeageet gcgcaecctg aecaaegasa cctfctgtgag cetggcgeat 1140 sgcccgctgc afcattctggg gctg*«c«sa sacsaaatfca gcamaatfcga aagcgatgcg 1200 ttfcagotggc tgggccatct ggaagfcgctg gatefcgggec tgaaogaaat tggsesggsa 1260 ctgaccggec «ggaatggcg sgggctggaa aac&tttttg aa&tttatct gagctataac 1320 &aatatct.gc agctgacccg caacagcttfc gcgctggtgc cgagcctgca gcgcctgatg 1380 ctgcgçegcg fcggragcfcg&a «aaegfcggat agesgcccga ge«egtttC* gcegctgcgc 1440 aacctgaaca ttct.ggafcct gagoaacaac aacattgçga acettaacga tgatatgcfeg 1500 gaaggcotgg aaaaactgga a&ttctggst ctgeagcsbs acaaectgges gcgcotgtgg ISSO aeaeatgcga aeccgggcgg cccg&tttat tttctgaaag gccigagcca tctgcatatt. 1620 ctgaacctgg aaagcaacgg cttfegatgaa atfeccggtgg aagtgtttaa agatctgttt 1680 gascítgaaaa ttattgatot ggg«ctg&s.c saccfegasca ooctgccggc çagogtgttt 1740 aacaaccagg fegagcctgas aagcstgaec crtgcagaaaa aectgatfse cagcgtggaa 1800 saassagtgt ttggcccggc gtttogrcaac ctgeccgaac tggatatgeg ctttaacccg 1860 fcttgstfcgca actgcgsaag cattgcçtgg tttgtgaaçt ggafcfcgcggs aacccata.cc 1920 aac&ttcegg aactgagcag ecsfctafcetg t.g&aacaccc cgccgcatta tcatggettfc 1980 cssggtgcgcc tgtttgatac cagcagctge aaagatageg cgccgt.ttga a 2033 <210> 20 <211> 677 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Sequência artificial de aminoácido obtida a partir de EDC de hTLR3 de Homo sapiens, à qual falta um péptido de sinal e contém uma mutação de substituição de alanina (A) em N221, N226, N387, e em N636. 53 <4Ο0> 20

Lys cys ταχ vsi ser hís Gin vai I 5 Thr Mn Vai Fro Asp &8p Leu Pxô 20 Thr Sis Asa Sla I»«sj Axg Arg Leu 35 ao Ser Gin Leu Thr $»x Leu Asp Vai 50 55 Glu Pr© Glu Lm CVS Gin ty& hm δ 5 70

Ala &sp cys Ser Eis Leu Lys Leu 10 15 fhr Asn lie fhr V&l Leu Asa Leu 25 30

Prs Ma Ala A.s:e Phe Shr Arg Tyr 45

Sly Phe Asn Thr 11« Ser Lys Leu 60

Prg Met Le» Ly» Vai Leu Aea Leu 75 80

Gin ais Asa Glu Leu ser Gin Leu ser Asp Lys Thr Phe Ale a® cya 85 50 95

Thr Asa leu Thr Gin Leu Sis Leu Est Ser As» Ser Xis Sln Lys 21« 100 105 HO

Lys Asn Asa Pro Ph« Vai Lys ala Lys Asa Leu 11«. Thr Leu Âsp Leu 115 120 125

Ser Bis Asn Gly Leu Ser Ser· Thr Lvs L®a Giy Thr Gin Vai Gin Len 138 135 ' " 140

Glu Jtóft Leu Gin Glu Leu Leu Leu ser Asn As» l-ys Ila Gin Ala Leu 145 150 155 ' 150

Ly» Ser Giu eia Leu Aap lie lhe Ala Asa Ser Ser Leu Lys Lys Leu 165 170 - 115

Glu Leu s«r Ser ãsb Gin lie Lys Giu Fhe ser Pro Giy Cys Phe His ISO 185 190

Ala 11« 0.1 y Arg Leu Phe Sly Leu Ph« Leu Asn. Asn Vai Gin Leu Gly 195 200 205

Pro Ser Leu Thr Giu Lys Leu Cys L-ss. Glu Leu Ala Ala Thr Ser Ile 210 215 220

Arg Ale Leu Ser Leu Ser Asn Ser Gin Leu Ser Thr Thr Ser Asn Thr 225 230 235 240

Thr Fhe Leu <3Xy Leu Lya Trp Thr Mn Leu. Thr Hefc Leu Asp Leu Ser 245 250 255

Tyr Asa A$.r Leu As» Vai Vai. Giy a.sr Asp Ser Phe. Ala irp Leu Pro 280 285 270

Gin Leu Glu Tyr Phe Ph.« Leu Glu Tyr Asa As» SI© 61» Jiis Lm Pfc® 2?5 280 285

Ser Sis Ser Leu Eis 6ly Leu Pfea Asa Vai Arg Tvr Leu Asa Leu Lys £90 295 ' 300

Arq Ser Phe Thr Lys Gin Sèr 11« Ser Leu Ais Ser Leu Pro Lys Ile 305 310 315 320

Asp Aap Phe Ser Ph« Gin Trp Leu Lys Cys leu Glu Bis Lea Mh mt SIS 3J0 335

Giu Aap Aan Aap 11« Pro Gly XI® Lys Ser Aan Met Fhe Thr Gly Leu 340 343 3&Θ

Ile Asa Leu Lys Tyr Leu Ser Leu. ser Asa Ssr Fhs Thr Ser Lau Arg 5SS 3SQ 3S5

Thr Leu Thr Asn Gin Thr Ph« Vai Ser Leu Ala Sis ser Pro Leu His 378 ^ 375 380

Ilí3 Leu Ala Leu Thr Lys Asa Lys lis Ser Lye Ile Glu Ser Asp Ala 385 390 395 400

Pne Ser Trp Leu 61 y Mis Leu Glu Vai Lsu Asp Leu Gly Leu. Asa <3.Xu 403 410 413 lie Gly Gin Glu Leu Thr Gly Gin Glu Srp Arg Gly leu Glu Asa TX« 425 ‘ 430

Fhe Glu Ire Tyr Leu Ser Tyr Asn Lys Tyr Leu Gin Leu Thr Arg Asa *3$ 440 “ 445 54

ser Fhe Ala Lau Vai Pr o Ser Leu 45 0 435 Ala Leni Lys Mft V*1 Aap Ser Ser 465 470 Aaa leu Thr n® leu Asp Leu Ser 463 Asp Aap Met Leu eie Gly Leu eiu soo H.iS Asa Asri Leu Ala Arg Leu ϊ-!:ρ 313 520 11$ Xyr Phe leu Lys Gly leis Ser 330 535 B&z Asa Gly Ph® Asp GI.u 11® Pr» 545 SSQ Gla Leu Lys Ϊ1© 11ε Asp Leu siy 565 Ala Ser Vai as .A»n A&n Gin vai 5SS l,f;s Asn is a 11$ Thr Ser Vai G.1.13 S95 600 &W0 ASA L$a Thr Slu Leu Asp Met 610 SIS cy» Giu Set lie Ais Xrp Fhs Vai 623 630 As ti riè Pr» Gin leu Ser Ser Ria 645 7yz KÍ8 Gly Phe Pr© Vai Arg Leu 660 Ser Ais Pro Phe 6lu 67 S

Gin &rg Leu Met 460 Leu &rg Arg Vai Pr© ser Pró 475 Phe Gin Pr© l*eu Arg 480 Asa ASft 190 ÍíSU n® Ala As» 11$ Aan 475 ly-s 505 Leu eiu Ile Lee Asp 510 Leu Gin Lya El$: Ala Ãati Pr© 525 Giy Gly PrO Hl 3 Leu Eiá Ile 540 .Leu A«r Leu Gla Vai Glu Vai 555 ?h© lys Asp Leu |%© 560 Leu As® 570 Asa isêU Asn Thr Leu Pro 575 Ser 585 Leu Lys Ser .Leu Asa SOO Leu Sla Lys Lys Vai Phe Gly 605 Fr» Ale Phe Arg Phe Asn Pr o 620 A»P Cys Thr A3n Trp Ile 635 Ala Slu Thr Ais Thr 640 Tyr lt«U 650 C;ys As-«. Thr Pr© Pr» Ria 653 Pb® 66$ Asp Thr Ser Ser Cye 070 !«YS Asp 55

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Natanson et al. Crit. Care Med., 1998, vol. 26, 1927-1931 [0002] • Angus et al. Crit. Care Med., 2001, vol. 29, 1303-1310 [0002] • Hanauer et al. Rev. Gastroenterol. Disord., 2003, vol. 3, 81-92 [0002] • Mapel et al. Manag. Care Interface, 2004, vol. 17, 61-66 [0003] • Johnston. Am. J. Respír. Crit. Care Med., 1995, vol. 152, 46-52 [0004] • Bandi et al. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2003, vol. 37, 69-75 [0004] • Gern et al. Am. J. Respír. Cell. Mol. Biol., 2003, vol. 28, 731-737 [0004] • Panina-Bordignon et al. Curr. Opin. Pulm. Med., 2003, vol. 9, 104-110 [0004] • Alexopoulou et al. Nature, 2001, vol. 413, 732-238 [0005] • Kariko et al. J. Biol. Chem., 2004, vol. 26, 12542-12550 [0005] [0006] 56 • Tabeta et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2004, vol. 101, 3516-3521 [0006] • Takeda; Akira. J. Derm. Sei ., 2004, vol. 34, 73-82 [0006] • Van Amersfoort et ai. Clin . Microbiol. Rev., 2003 , vol. 16, 379-414 [0006] • Miossec et ai. Curr. Opin . Rheumatol. , 2004, vol. 16, 218-222 [0006] • Ogata; Hibi. Curr. Pharm. Des., 2003, vol. 9, 1107-1113 [0006]

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Cadeia peptídica que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 e pelo menos uma mutação com 3 resíduos de aminoácidos de um alinhamento de posição para N636 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

2. Cadeia peptídica que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20.

3. Ácido nucleico que codifica a cadeia peptídica de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

4. Acido nucleico de acordo com a reivindicação 3 que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19.

5. Cadeia peptídica de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para utilização num método para modular a actividade de TLR3 numa célula, em que a modulação é uma atenuação.

6. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 para utilização num método para modular a actividade de TLR3 numa célula, em que a modulação é uma atenuação.