PT1982184E

PT1982184E - Composição de sol para biochip de sol-gel para imobilizar uma sonda sobre um substrato sem tratamento de superfície e método para o seu rastreio

Info

Publication number: PT1982184E
Application number: PT77085710T
Authority: PT
Inventors: So Youn Kim
Original assignee: So Youn Kim
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2014-07-08
Also published as: EP1982184A1; WO2007086671A1; DK1982184T3; US9476876B2; KR20070078556A; KR100784437B1; EP1982184B1; US20160334400A1; EP1982184A4; JP5538726B2; US10191045B2; ES2462549T3; JP2009524819A; US20090227466A1

Description

ΕΡ 1 982 184/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Composição de sol para biochip de sol-gel para imobilizar uma sonda sobre um substrato sem tratamento de superfície e método para o seu rastreio"

CAMPO TÉCNICO 0 presente invento refere-se a um método para rastrear uma composição de sol para biochips de sol-gel, que é utilizado para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, à utilização uma composição de sol rastreada pelo referido método, e a um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre o mesmo.

ESPECIALIDADE ANTERIOR 0 biochip é um exemplo representativo de nova tecnologia combinando tecnologia de materiais tais como nanotecnologia (NT) e biotecnologia (BT) que aplica conteúdos dos campos da tecnologia de materiais e tecnologia de informação (IT) para analisar uma grande quantidade de resultados. 0 biochip é formado por microarranjo de alta densidade de vários tipos de biomateriais sobre uma unidade de área de uma superfície de um suporte sólido. As tecnologias de biochip incluem uma tecnologia para imobilizar biomateriais, uma tecnologia para tornar a superfície do chip biocompatível, tecnologia de microarranjo de biomateriais, uma tecnologia de ensaio para realizar várias reacções biológicas sobre um chip produzido, uma tecnologia para detectar resultados de reacção, uma engenharia de proteínas para produzir biomateriais para serem imobilizados e tecnologia de recombinação genética.

Um chip de proteínas representativo dos biochips é formado por microarranjo intensivo de várias proteínas sobre uma unidade de área da superfície de um suporte sólido. Utilizando o chip de proteínas, é possível conduzir uma experiência para múltiplos propósitos, tais como diagnóstico de doenças, ensaios de elevado rendimento (HTS, high 2 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ throughput screening), testes de actividade enzimática e outros, com uma pequena quantidade de amostras. Têm existido alqumas tentativas para produzir o chip de proteínas utilizando os mesmos princípios e factores técnicos como na produção de chips de ADN, que já foram desenvolvidos e são habitualmente utilizados. Em geral, a maioria dos chips de ADN habitualmente utilizados são produzidos por imobilização de ADN sobre um substrato de vidro, cuja superfície foi pré-tratada com um material de revestimento. Quando o chip de proteínas é fabricado de acordo com um método similar ao utilizado na produção de chips de ADN, isto é, quando o chip de proteínas é fabricado por imobilização de proteínas sobre um substrato de vidro cuja superfície foi pré-tratada com um material de revestimento, ocorrerão provavelmente vários problemas devido à diferença em propriedades físicas e químicas entre as proteínas alvo a serem imobilizadas.

Um chip de proteínas anterior foi produzido por imobilização de proteínas sobre um substrato de vidro de superfície tratada e utilizado para realizar um ensaio de ligação simples. 0 desempenho do chip de proteínas era determinado pela actividade da proteína imobilizada e foi difícil que funcionasse com sucesso (MacBeath e Schreiber, Science 289:1760, 2000). Estes problemas são causados pela desnaturação, inactivação e degradação de proteínas resultantes da diferença nas propriedades físicas e químicas inerentes das proteínas.

De modo a solucionar estes problemas, investigações e estudos têm sido conduzidos sobre tecnologias de tratamento de superfície para imobilização de proteínas, adequadas para as características de proteínas, que se distinguem das do ADN, e materiais para imobilização de proteínas. Esta investigação e estudos estão focados num método para realizar a imobilização sobre a superfície de um chip de proteína ao mesmo tempo mantendo a actividade da proteína. Exemplos destes incluem uma lâmina revestida a hidrogel (PerkinElmner), o chip Versalinx (Prolinx), o chip PDC que é um biochip disponível comercialmente na Zyomyx, etc. 3 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ

Em particular, a lâmina revestida a hidrogel é uma tecnologia gue utiliza um gel de poliacrilamida tridimensional, na qual um vidro suiço de nivel óptico com uma superfície tratada com silano é utilizado como material de base e um polímero de acrilamida de superfície modificada é aplicado sobre o mesmo para melhorar a força de ligação e a estabilidade estrutural de uma proteína. Aqui, a proteína é imobilizada por uma ligação covalente com um grupo funcional do gel de poliacrilamida. Também, o chip Versalinx da Prolinx compreende uma monocamada de automontagem de poli(L-lisina)-g-poli(etilenoglicol) conjugado com biotina formada sobre TÍO3, no qual uma proteína está imobilizada sobre a superfície da monocamada de automontagem, pela qual a actividade da proteína pode ser melhorada. Estes métodos formam uma microestrutura tridimensional e imobilizam covalentemente proteínas sobre uma superfície modificada de modo a manter as actividades das proteínas dentro de pontos (spots). Para além destes métodos, é também possível produzir chips do tipo micropoços através de microprocessamento de modo a produzir chips no estado de solução. Em Loh, Med. Device Technol. 10(1): 24-30, 1999, são revistas as potencialidades e aplicações da modificação de superfícies por plasma em aplicações biomédicas. Entretanto, um processo de sol-gel é uma tecnologia que tem sido utilizada para produzir uma microestrutura por microprocessamento e, em particular, é uma tecnologia que compreende a formação de uma rede de ligação por um processo moderado e a imobilização de biomoléculas dentro da rede de ligação por outros métodos que não uma ligação covalente, em vez de se ligarem quimicamente biomoléculas a um material inorgânico (Gill, I. e Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000). Biomoléculas incluindo enzimas são imobilizadas sobre uma matriz de massa de sol-gel para utilização na produção de chips de biocatalisadores ou biossensores (Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997). Especialmente, a matriz de sol-gel é também utilizada na detecção do desenvolvimento de cor óptica devido à sua transparência e propriedades ópticas (Edminston et al., J. Coll. Interf. Sei., 163:395, 1994). Também, as biomoléculas são conhecidas por serem estabilizadas não apenas quimicamente mas também termicamente quando são imobilizadas 4 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ sobre uma matriz de sol-gel (Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994) . A WO 2004/099776 revela um suporte de biochip, consistindo de um substrato suportando pelo menos uma camada de material poroso sobre uma primeira face, em que a camada pretende assegurar a fixação de moléculas biológicas sobre e no interior da referida camada, e onde a camada é uma camada fina de material óptico preparado por um processo de sol-gel, e um método para enxertar moléculas biológicas à superfície e no interior da camada fina de material preparado pelo processo de sol-gel sobre a primeira face do suporte de biochip. A WO 2004/092250 revela um material biocompatível compreendendo uma composição obtida por hidrólise de um composto de silício monomérico possuindo pelo menos um grupo hidrolisável ou condensável ligado ao átomo de silício do composto com outro composto monomérico possuindo pelo menos um grupo reactivo quimicamente ligado ao átomo de metal ou de metalóide do composto para formar um material compósito de siloxano híbrido; e a utilização do material biocompatível num dispositivo sensor, tal como um biossensor ou biochip.

No caso do biossensor, a reacção sol-gel é utilizada como um método para formar padrões por formação de uma microestrutura sobre um suporte sólido bem como para imobilização simples.

Aqui, o método de formação de padrões inclui modelação de um sol no estado líquido utilizando um molde por dinâmica de fluido, gelatinização do material modelado e separação do molde para formar um padrão. Por exemplo, uma tecnologia designada por tecnologia de micromodulação em capilares (MIMIC, micro-moduling in-capillaries) é utilizada para formação de padrões em sílica mesoscópica (Kim et al., J.

Ferment. Bioeng. 82:239, 1995; Marzolin et al., Adv. Mater. 10:571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics 38:5799, 1999).

Esta tecnologia pode ser utilizada na formação de padrões básicos de engenharia de microfluidos.

No entanto, uma vez que a actividade de proteínas pode ser afectada por vários factores tais como o pH, é 5 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ importante estabelecer as condições para a manutenção da actividade adicionando a proteina a partir do seu estado de sol no processo de sol-gel. Para este propósito, são propostas tecnologias para formação de padrões de uma proteina misturando previamente a proteina com um sol, utilizando várias condições moderadas tais como pH neutro (Kim et al., Biotechnol. Bioeng. 73:331 a 337, 2001), mas existem problemas pelo facto de o processo de sol-gel progredir rapidamente a pH neutro para formar um gel e poderem ocorrer fissuras ou o gel tornar-se opaco, de acordo com a escolha de aditivos.

Para ultrapassar os problemas acima descritos, os presentes inventores desenvolveram anteriormente um biochip utilizando uma reacção sol-gel (Publicação de Patente Coreana em Aberto N.° 10-2004-0024510). Especificamente, porque não existia na especialidade anterior qualquer tecnologia pela qual uma matriz de sol-gel contendo biomateriais, incluindo proteínas, pudesse ser imobilizada sobre um substrato de chip na forma de pontos, não existia qualquer biochip no qual uma matriz de sol-gel possuindo biomateriais imobilizados na mesma fosse integrada na forma de pontos. Na patente anterior, foi desenvolvida uma tecnologia de tratamento da superfície de um substrato de chip com um material de revestimento especial, e assim pôde ser preparado pela primeira vez um biochip utilizando uma reacção sol-gel sobre o substrato de chip. Pela tecnologia de tratamento de superfície do substrato de chip de acordo com a patente anterior, uma mistura de sol contendo biomateriais pode ser integrada sobre o substrato de chip na forma de pontos, uma reacção sol-gel para gelificação da mistura de sol pode ocorrer sobre o substrato de chip, e matrizes de sol-gel podem ser imobilizadas sobre o substrato de chip. Em particular, na patente anterior, ao contrário dos biochips anteriores possuindo biomateriais imobilizados sobre a superfície de substrato de chip por ligações covalentes, foi desenvolvido um biochip compreendendo biomateriais aprisionados e encapsulados nos poros de pontos do tipo gel, que estão integrados e imobilizados sobre um substrato de chip. 6 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ

No entanto, no caso deste biochip, de modo a imobilizar os pontos de gel contendo biomaterial sobre o substrato, a superfície do substrato deverá ser tratada com um agente de revestimento tal como poli(acetato de vinilo), e a mistura de sol deverá ser aplicada por pontos sobre o substrato de superfície tratada. Assim, este biochip é desvantajoso em termos de custo ou de produção em massa e tem uma limitação pelo facto de não poder ser aplicado a biochips possuindo uma superfície ou forma que não pode ser revestida.

Por conseguinte, os presentes inventores desenvolveram muitos esforços para encontrar uma composição de material para utilização em encapsulação de sol-gel, que se pode ligar fortemente a um substrato que não foi submetido a tratamento de superfície essencial para a utilização comercial de biochips. Como resultado, os presentes inventores conceberam um método eficiente para rastrear uma composição de sol e encontrar uma composição de sol, que se pode ligar fortemente a uma superfície de substrato e assim pode suportar uma lavagem intensa durante o processo de análise de biochips e, ao mesmo tempo, pode proporcionar bons resultados de ensaio, completando deste modo o presente invento.

SUMÁRIO DO INVENTO

Por conseguinte, é um objectivo do presente invento proporcionar um método para rastrear uma composição de sol para biochips de sol-gel, que é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico.

Outro objectivo do presente invento é proporcionar a utilização de uma composição de sol para substratos de PMMA ou substratos de ouro ou substratos de bolacha de silício, rastreada pelo referido método, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre o mesmo.

Para conseguir o objectivo anterior, o presente invento proporciona um método para rastrear uma composição de sol 7 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ para biochips de sol-gel, que é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, o método compreendendo os passos de: (a) obter uma primeira biblioteca de composições de sol onde pelo menos um monómero de silicato seleccionado entre o grupo consistindo de tetrametilortossilicato (TMOS), metiltrimetoxissilano (MTMOS), tetraetilortossilicato (TEOS), etiltrimetoxissilano (ETrEOS), trimetoxissilano (TMS), metiltrimetoxissilicato (MTMS) e 3-aminopropiltrimetoxissilicato (3-ATMS), e pelo menos um aditivo seleccionado entre o grupo consistindo de poliglicerilsilicato (PGS), diglicerilsilano (DGS), 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GPTMOS), (N-trietoxissililpropil)-O-poli(óxido de etileno)-uretano (PEOU), glicerol e polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular de 100-10000, são misturados um com o outro em tampão em várias proporções; (b) formar pontos da primeira biblioteca de composições de sol sobre um substrato alvo que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; (c) medir a adesão, aspecto, transmitância e tempo de gelificação dos pontos formados no passo (b) e, com base nos resultados das medições, seleccionar composições que não mostram o desprendimento dos pontos mesmo quando são raspados com uma ponta após lavagem, possuem um diâmetro de ponto de 100-800 pm mantendo ao mesmo tempo uma forma circular, mostram uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo, e têm um tempo de gelificação de 4-48 horas num tubo e um tempo de gelificação de 1-4 horas nos pontos do substrato, obtendo-se desse modo uma segunda biblioteca de composições de sol; (d) adicionar uma sonda à segunda biblioteca de composições de sol e formar pontos da segunda biblioteca contendo sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; e (e) medir a taxa de imobilização dos pontos para a sonda, e a especificidade entre a sonda e uma substância alvo e, com base nos resultados da medição, seleccionar uma composição de sol onde a taxa de imobilização da sonda é pelo menos 70% e a razão de sinais específicos/sinais não específicos da sonda e da substância alvo é pelo menos 3. 8 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ Ο presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende: 17,5-25 partes em peso de TMOS; 5-15 partes em peso de MTMS; 2,5-15 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico. O presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico e compreende: 22,5-25 partes em peso de TMOS; 7,5-10 partes em peso de MTMS; 2,5-5 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico. O presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, compreende: 16,2-18,7 partes em peso de TMOS; 3,7-6,2 partes em peso de MTMS; 13,7-16,2 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12,5 9 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ partes em peso de HC1 10 mM; 23, 7-24,5 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico. O presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de silício (bolacha) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, compreende: 5-30 partes em peso de TMOS; 2-35 partes em peso de MTMS; 1-15 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 23, 7-24, 5 partes em peso de água destilada; 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 12,5 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de silício (bolacha) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico.

Os objectos, características e concretizações anteriores e outros do presente invento serão mais claramente compreendidos a partir da descrição detalhada seguinte e das reivindicações apensas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 mostra um método de análise que utiliza um biochip do tipo placa de 96 poços de acordo com o presente invento. A FIG. 2 é um fluxograma mostrando um método para rastrear uma composição de sol que forma pontos sobre um substrato de superfície não tratada. 10 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ A FIG. 3 mostra propriedades físicas de uma formulação de chip de proteínas seleccionada a partir do método de rastreio de acordo com o presente invento. A FIG. 4 mostra resultados de diagnóstico de HIV obtidos misturando proteína de antigénio de HIV p24 com a composição de sol obtida através do processo de rastreio do invento, por imobilização da proteína de antigénio sobre uma placa de 96 poços sem tratamento de superfície e realização do diagnóstico de um paciente de HIV utilizando o antigénio imobilizado. A FIG. 5 mostra resultados de diagnóstico de HCV obtidos por mistura de um marcador de HCV com a composição de sol obtida através do processo de rastreio do invento, imobilização do marcador sobre uma placa de 96 poços sem tratamento de superfície e realização do diagnóstico de hepatite C utilizando o marcador imobilizado. A FIG. 6 mostra o limite de detecção (sensibilidade) para um chip de proteínas de sol-gel de acordo com o presente invento. À esquerda estão os resultados do diagnóstico de hepatite C realizado utilizando um biochip possuindo uma composição de sol utilizada de acordo com o presente invento imobilizada sobre o mesmo e à direita um gráfico mostrando os resultados obtidos analisando quantitativamente os resultados de diagnóstico utilizando um programa de software de quantificação. A FIG. 7 mostra um chip de ouro fabricado por formação de pontos de uma composição de sol rastreada de acordo com o método do invento sobre um substrato de ouro (Au). A FIG. 8 é um chip de semiconductor fabricado por formação de pontos de uma composição de sol rastreada de acordo com o método do invento sobre um substrato semicondutor.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO E CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Num aspecto, o presente invento refere-se a um método para rastrear uma composição de sol para biochips de sol- 11 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ gel, que é utilizado para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, o método compreendendo os passos de (a) obter uma primeira biblioteca de composições de sol onde pelo menos um monómero de silicato seleccionado entre o grupo consistindo de tetrametilortossilicato (TMOS), metiltrimetoxissilano (MTMOS), tetraetilortossilicato (TEOS), etiltrimetoxissilano (ETrEOS), trimetoxissilano (TMS), metiltrimetoxissilicato (MTMS) e 3-aminopropiltrimetoxissilicato (3-ATMS), e pelo menos um aditivo seleccionado entre o grupo consistindo de poliglicerilsilicato (PGS), diglicerilsilano (DGS), 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GPTMOS), (N-trietoxissililpropil)-O-poli(óxido de etileno)-uretano (PEOU), glicerol e polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular de 100-10000, são misturados um com o outro em tampão em várias proporções; (b) formar pontos da primeira biblioteca de composições de sol sobre um substrato alvo que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; (c) medir a adesão, aspecto, transmitância e tempo de gelificação dos pontos formados no passo (b) e, com base nos resultados das medições, seleccionar composições que não mostram o desprendimento dos pontos mesmo quando são raspados com uma ponta após lavagem, possuem um diâmetro de ponto de 100-800 pm mantendo ao mesmo tempo uma forma circular, mostram uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo, e têm um tempo de gelificação de 4-48 horas num tubo e um tempo de gelificação de 1-4 horas nos pontos do substrato, obtendo-se desse modo uma segunda biblioteca de composições de sol; (d) adicionar uma sonda à segunda biblioteca de composições de sol e formar pontos da segunda biblioteca contendo sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; e (e) medir a taxa de imobilização dos pontos para a sonda, e a especificidade entre a sonda e uma substância alvo e, com base nos resultados da medição, seleccionar uma composição de sol onde a taxa de imobilização da sonda é pelo menos 70% e a razão de sinais especificos/sinais não específicos da sonda e da substância alvo é pelo menos 3. 12 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ

No presente invento, a sonda é preferivelmente qualquer uma seleccionada entre o grupo consistindo de proteínas, oligopéptidos, ácidos nucleicos, substâncias de peso molecular baixo, microorganismos, fungos e materiais de ervas medicinais, e o substrato é preferivelmente qualquer um seleccionado entre o grupo consistindo de placas de polímero, metais, bolachas de silício, vidro e LCD.

Noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 17.5- 25 partes em peso de TMOS; 5-15 partes em peso de MTMS; 2.5- 15 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada;

11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda.

Ainda noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico e compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 22.5- 25 partes em peso de TMOS; 7.5- 10 parte em peso de MTMS; 13 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ 2,5-5 partes em peso de GPTMOS; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada;

11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10- 15 partes em peso de uma solução de sonda.

Na utilização da composição de sol, a referida sonda é preferivelmente proteina, mais preferivelmente antigénio de HCV, e no biochip de sol-gel o referido substrato é preferivelmente uma placa de 96 poços.

Ainda num outro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 16,2-18,7 partes em peso de TMOS; 3.7- 6,2 partes em peso de MTMS; 13.7- 16,2 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 23.7- 24,5 partes em peso de água destilada;

11- 13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda.

Na utilização da composição de sol, o referido adesivo é preferivelmente 1010 e/ou 1020, e a referida sonda é preferivelmente proteina.

Ainda noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de silício que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso 14 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de silício que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 5-30 partes em peso de TMOS; 2-35 partes em peso de MTMS; 1-15 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 23,7-24,5 partes em peso de água destilada;

12.5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 12.5 partes em peso de uma solução de sonda.

Como aqui utilizado, o termo "tratamento de superfície" é o termo revelado na patente anterior (Publicação de Patente Coreana em Aberto N.° 10-2004-0024510) dos presentes inventores e refere-se ao revestimento da superfície de um substrato para utilização em biochips de sol-gel com uma solução de um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado, tal como poli(acetato de vinilo), dissolvido num solvente orgânico tal como diclorometano ou tetra-hidrofurano.

Como biomateriais que podem ser imobilizados sobre o biochip de acordo com o presente invento, é possível utilizar todos os biomateriais que se podem ligar especificamente a uma substância alvo para permitir a análise da ligação entre eles. Preferivelmente, os biomateriais incluem ácidos nucleicos incluindo ADN, ARN ou PNA, proteínas e oligopéptidos. Adicionalmente, é também possível imobilizar vários compostos, incluindo substâncias de baixo peso molecular e substâncias naturais.

Entre os biomateriais, exemplos não limitantes de proteínas que podem ser integradas sobre a superfície de substrato de chip com uma densidade elevada de acordo com o presente invento incluem p24 de HIV, Combo, RgpIII, HCV core, NS5, NS3, E1/E2, antigénios de superfície e anticorpos de HBV, IgG-Cy3, antigénios ou anticorpos para diagnóstico 15 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ de doenças infecciosas, antigénios ou anticorpos para diagnóstico do cancro, incluindo AFP (alfa-fetoproteina), PSA, CA1-1 e glipecano, e enzimas que são utilizadas em medição de actividade. Também, para além de proteínas, antigénios e anticorpos, utilizando a composição de sol é possível imobilizar substâncias de baixo peso molecular para utilização no desenvolvimento de novos fármacos, e substâncias naturais, incluindo plantas nativas, microorganismos, fungos e materiais de ervas medicinais.

De acordo com o presente invento, uma mistura de sol possuindo uma composição seleccionada por rastreio pode ser usada para formar pontos sobre um substrato do tipo placa de 96 poços sem tratamento de superfície, e um biochip possuindo uma sonda imobilizada sobre o mesmo utilizando a mistura de sol pode ser usada para diagnóstico e análise utilizando dispositivos automatizados existentes para testes imunológicos sem introdução de novos dispositivos. 0 processo de análise é apresentado na FIG. 1. Como a placa de 96 poços, qualquer placa de polímero disponível comercialmente de qualquer fabricante pode ser utilizada sem qualquer limitação particular mas, no presente invento, utilizou-se uma placa de 96 poços (NUNC, SPL) para imobilizar pontos e fabricar um chip. Também, como se mostra na FIG. 1, os dispositivos automatizados podem ser utilizados, por exemplo, com um dispositivo Axym (Abott) e um dispositivo da Roche.

No caso de um chip de proteína, o diâmetro dos pontos é preferivelmente cerca de 100-500 pm, e são integrados preferivelmente 1-1000 pontos por poço. Nos Exemplos abaixo, foi fabricado um chip possuindo 100 pontos/cm2, mas é possível integrar pontos com uma densidade elevada de até 1000 pontos/cm2.

No caso de um biochip fabricado utilizando uma reacção sol-gel no presente invento, resultados de reacção podem ser obtidos em 30 minutos a 2 horas, ao contrário de um método de diagnóstico requerendo um tempo de reacção longo, ou um método de diagnóstico de biochip existente. 16 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ Ο chip de proteínas fabricado de acordo com o presente invento pode ser utilizado em diagnóstico, marcando um antigénio com um pigmento fluorescente do mesmo modo como num ensaio de sanduíche, como um método de diagnóstico imunológico. Neste caso, num passo de medição de resultados, os resultados de diagnóstico podem ser analisados e quantificados utilizando um analisador de fluorescência através de um programa de software. 0 chip de proteínas fabricado de acordo com o presente invento pode substituir um método de diagnóstico imunológico enzimático de HIV, HCV, HBV e outros.

Na composição de sol utilizada de acordo com o presente invento, porque os biomateriais podem ser adicionados num estado de solução, proteínas ou substâncias de baixo peso molecular podem ser integradas numa densidade elevada. Assim, é possível realizar ensaios de elevado rendimento (HTS, high throughput screening) utilizando o biochip fabricado. Também, porque as enzimas para utilização na medição da actividade de proteínas podem ser integradas na mistura de sol, o biochip fabricado pode ser utilizado na medição de actividade enzimática. As enzimas para medição da actividade incluem enzimas que são utilizadas em análise de toxicidade, análise ambiental e análise de bactérias nos alimentos. Assim, o biochip do tipo placa de 96 poços de acordo com o presente invento pode ser aplicado para diagnóstico de doenças e pode ser utilizado não apenas em tecnologias fundamentais para o desenvolvimento de novos fármacos, mas também em análise ambiental e análise de toxicidade. A FIG. 1 mostra um método de análise utilizando o biochip do tipo placa de 96 poços de acordo com o presente invento. No presente invento, uma composição de sol pode ser imobilizada de modo estável sobre uma placa de 96 poços sem tratamento de superfície, e pode ser analisada do mesmo modo utilizando um dispositivo de diagnóstico imunológico existente.

Também, a composição de sol utilizada de acordo com o presente invento pode ser aplicada a um biossensor desenvolvido anterior para aumentar a sua sensibilidade. A 17 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ composição de sol pode ser imobilizada sobre polímeros, superfícies de metal incluindo ouro, superfícies de semicondutor incluindo silicio, superfícies de polímero transparentes, superfícies de vidro incluindo espelho, para aumentar a sua sensibilidade. Para facilitar a detecção, uma substância alvo é preferivelmente marcada com um indutor de sinal tal como um pigmento fluorescente. A detecção da ligação entre o biomaterial e a substância alvo pode ser realizada utilizando vários métodos, incluindo um método de detecção de fluorescência, um método de detecção electroquímico, um método de detecção que utiliza uma alteração de massa, um método de detecção que utiliza uma alteração de carga eléctrica, e um método de detecção que utiliza uma diferença em propriedades ópticas, de acordo com as propriedades de um substrato ao qual uma substância alvo marcada com um indutor de sinal está ligada.

Quando a composição de gel é utilizada de acordo com o presente invento, podem ser integradas proteínas, antigénios, anticorpos, substâncias de baixo peso molecular e bactérias num máximo de 1000 pontos por poço. A composição utilizada de acordo com o presente invento pode ser tipicamente utilizada em rastreio de bancos de sangue para procedimentos de compatibilidade em transfusão de sangue (marcadores de doenças infecciosas, por exemplo, HIV I, II, HCV, HBV, malaria, H. pylori, sífilis, etc.) num processo de colheita de sangue, e um marcador para o diagnóstico de cancro em geral e um marcador para o diagnóstico de um cancro específico podem ser integrados sobre um substrato ao mesmo tempo e podem ser utilizados em diagnóstico. Além disso, de acordo com o presente invento, pode ser desenvolvido um grupo de produtos, incluindo POCT, que podem detectar doenças e bactérias sem um marcador fluorescente, utilizando vários substratos de metal e semiconductor. Também, marcadores sensíveis a poluição ambiental, particularmente poluição da água, podem ser integrados ao mesmo tempo, pelo que a poluição da água pode ser detectada prontamente.

Exemplos O presente invento será aqui a seguir descrito em maior detalhe através de exemplos. No entanto, deve ser entendido 18 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ que estes exemplos podem ser modificados em várias outras formas, e o âmbito do presente invento não pretende estar limitado a tais exemplos. Estes exemplos são apresentados para descrever mais detalhadamente o presente invento para uma pessoa perita na especialidade.

Exemplo 1: Rastreio de composições de sol que são específicas para um substrato e biomateriais e, ao mesmo tempo, podem ser imobilizadas directamente sobre o substrato

Uma composição de sol-gel, que pode suportar uma forte lavagem mesmo quando é imobilizada directamente sobre um substrato de superfície não tratada e, ao mesmo tempo, tem excelentes propriedades físicas quando é fabricada num biochip, foi rapidamente rastreada pelo método de rastreio do invento (FIG. 2) . A FIG. 2 é um fluxograma que mostra um método para rastrear uma composição de sol que forma pontos sobre um substrato de superfície não tratada, e a FIG. 3 mostra exemplos de composições seleccionadas e excluídas no método de rastreio da FIG. 2. Pode-se observar que as composições excluídas não podiam imobilizar biomateriais tais como proteínas sem tratamento de superfície e foram completamente desprendidas durante um processo de lavagem.

Primeiro, cerca de 100000 composições de sol baseadas em monómeros de silicato foram utilizadas para formar pontos sobre um substrato e medidas no que se refere à forte adesão capaz de suportar lavagem num processo de análise, propriedades físicas capazes de manterem a forma dos pontos constante, tempo de gelificação, transmitância óptica, e autofluorescência baixa. Das composições utilizadas para formar os pontos, foi primeiramente rastreado um total de 700 composições, que não se desprenderam mesmo quando foram raspados com uma ponta após lavagem, tinham um diâmetro de ponto de 100-800 pm mantendo ao mesmo tempo uma forma circular, tinham uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo, e tinham um tempo de gelificação de 4-48 horas num tubo e um tempo de gelificação de 1-4 horas nos pontos do substrato.

Entre as 700 composições de sol, em face do rendimento de imobilização de biomateriais e da sensibilidade numa 19 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ análise imunológica, foram seleccionadas as composições onde a taxa de imobilização de uma sonda foi mais de 70% e a razão de sinais específicos/sinais não específicos da sonda e da substância alvo foi pelo menos 3.

Finalmente, quando os biomateriais eram substâncias de baixo peso molecular, proteínas e anticorpos, obtiveram-se respectivamente, 2 composições, 7 composições e 8 composições.

Será aqui a seguir descrito em mais detalhe, o método para rastrear composições de sol de acordo com o presente invento.

Rastreio primário de composições de sol

Monómeros de silicato (TMOS, MTMOS, TEOS, TrEOS, TMS, MTMS e 3-ATMS), intermediários (PGS e DGS) e aditivos (GPTMOS, PEOU, glicerol, PEG200, PEG400 e PEG8000) foram adicionados a uma solução HC1 10 mM para se obterem várias composições. Finalmente, a cada uma das composições foram adicionados tampões possuindo diferentes pH (4-9), concentrações (0-500 mM) e sais (potássio e amónio). Como resultado, obtiveram-se mais do que 100000 composições, e estas composições foram integradas sobre uma placa de PMMA disponível comercialmente (poli(metacrilato de metilo)), e testadas quanto à adesão, aspecto dos pontos, tempo de gelificação, transmitância e fluorescência de fundo. A adesão foi testada por raspagem intensa dos pontos após lavagem, na qual o substrato foi lavado intensivamente três vezes com 1 χ PBS (contendo 10% de Tween®) a 1200 rpm durante 5 minutos, e depois seleccionaram-se as composições de pontos que não se desprenderam mesmo quando foram raspadas directamente com uma ponta. O aspecto dos pontos foi observado directamente com um microscópio óptico para seleccionar os pontos que mantiveram uma forma circular e tinham um diâmetro de ponto de 100-800 pm. O tempo de gelificação foi medido tanto num tubo como nos pontos, e seleccionaram-se as composições que mostraram um tempo de gelificação de mais de 4 horas no tubo e um tempo de gelificação de mais de 1 hora nos pontos. No que se refere à transmitância óptica, seleccionaram-se as composições que se 20 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ determinou terem uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo utilizando um leitor de laser (GenePix 4100, Axon Instrument).

Selecção de composições óptimas

Mediu-se a velocidade de imobilização dos pontos de cada uma das composições rastreadas primeiramente por comparação dos sinais de um péptido, uma proteina BSA e um anticorpo imobilizados marcados com Cy-3, antes e após um processo de lavagem. Para análise de actividade, uma proteina BSA (500 ng/μ ) foi adicionada a cada uma das composições rastreadas primeiramente, e as misturas resultantes foram integradas sobre uma placa do tipo lâmina de PMMA em conjunto com a proteina. Deixou-se a lâmina reagir com um anticorpo de BSA marcado com Cy-3 (Sigma) durante 30 minutos, e depois lavou-se intensamente com uma solução de lavagem (1 χ PBS, 0,1% de Tween® (Sigma)), seguindo-se secagem. Para analisar a sensibilidade dos sinais, efectuou-se a leitura dos pontos da lâmina, e o valor do sinal em relação ao valor de fundo foi quantificado utilizando o software GenePix Pro 4.0 (Axon Instrument) de modo a analisar a sensibilidade do sinal.

Como resultado, como se mostra na Tabela 1 abaixo, duas composições entre as composições rastreadas primeiramente mostraram uma taxa de imobilização de mais de 70% para a substância de peso molecular baixo ai contida, 7 composições mostraram uma taxa de imobilização de mais de 80% para a proteina ai contida, e 8 composições mostraram uma taxa de imobilização de cerca de 90% para o anticorpo.

Tabela 1: Taxa de imobilização de composiçoes de sol para substâncias alvo a serem imobilizadas

Taxa de imobilização (%) Molécula pequena Proteína Anticorpo Composições de sol para molécula pequena (2) 75,5 50,5 43,2 Composições de sol para proteína (7) 21,1 82,7 74, 5 Composições de sol para anticorpo (8) 1,2 10,3 88,9 21 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ

Análise de superfície A superfície dos pontos foi observada utilizando SEM (S-4800 SEM, Hitachi Co. ) . O revestimento condutor para observação de SEM foi realizado utilizando um equipamento de revestimento por pulverização (sputter coater) de feixe de iões com um alvo de irídio (cerca de 20 nm de espessura) , e depois os pontos foram completamente gelifiçados. O tamanho dos poros foi medido utilizando um programa de software de análise de imagem (Image-Pro Plus, MediaCybernetics). Mediu-se o número de poros em 9 áreas diferentes (576 nm χ 430 nm) , e calculou-se a densidade média de poros como [Σ área de poros]/[área total (576 nm χ 430 nm)].

Análise interna de pontos em solução

As imagens internas de pontos foram medidas em ar utilizando TappingModeTM AFM (MultiMode SPM, Nanoscope Illa, Vecco Instrument). Os pontos foram seccionados utilizando um micrótomo vertical.

Análise do perfil de varrimento de ponto

As imagens de ponto foram medidas através de uma forma de reflexão padrão utilizando um microscópio de varrimento de laser confocal (LSM 5 pascal, Cari Zeiss Inc.) . O perfil de varrimento para o centro dos pontos foi medido para ter uma espessura inferior a 63 pm e um diâmetro inferior a 380 pm.

Para medir a distribuição da proteína e do anticorpo nos pontos após análise imunológica, a imagem de tomografia vertical dos pontos internos foi fotografada com CLSM (LSM 5 pascal, Cari Zeiss Inc.) . A resolução mais elevada do eixo dos z utilizando um motor passo a passo foi 50 nm, e as resoluções mais elevadas do eixo dos x e do eixo dos y utilizando um módulo de varrimento foram xl00 e x40, respectivamente. Para fotografar imagens de CLSM, micropontos contendo uma proteína p24 foram primeiro integrados sobre uma lâmina de vidro, deixou-se a lâmina possuindo os pontos contendo proteína p24 aí integrados 22 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ reagir com ο anticorpo de p24 durante 1 hora, e depois lavou-se intensamente. Depois, deixou-se a lâmina reagir com um anticorpo secundário marcado com Cy3 durante 20 minutos, lavou-se e secou-se e fotografaram-se as suas imagens de CLSM.

Medição da especificidade entre marcador e substância alvo e sua actividade

Para medir a especificidade e actividade da interacção proteína-proteína sobre um substrato sol-gel, uma proteína p24 como proteína de antigénio de HIV foi misturada com a composição de sol IV da Tabela 2 abaixo e imobilizada. Realizou-se a análise imunológica com diluições em série de soro contendo um anticorpo de HIV correspondendo à proteína p24. Ao mesmo tempo, para confirmar a adsorção não específica do anticorpo de HIV, uma proteína BSA foi imobilizada sobre o mesmo chip no substrato de sol-gel. A interacção não específica, que ocorre após a reacção de uma proteína (4-1BB) não possuindo qualquer relação com os pontos, de uma composição de sol não contendo qualquer proteína era muito baixa. No entanto, com os anticorpos de BSA ou 4-1BB contra BSA ou antigénio 4-1BB, a interacção específica foi evidente nos pontos exactos. A Tabela 2 mostra as propriedades de 7 composições de sol para imobilização de proteínas, rastreadas pelo presente invento. Na Tabela 2, a composição 0 é uma composição comparativa consistindo apenas de TMOS e MTMS.

Entre as referidas 7 composições para imobilização de proteínas, as composições IV mostraram os melhores resultados no que se refere aos sinais e à relação sinal/fundo. A composição IV tinha uma proporção de TMOS baixa em comparação com as outras composições, continha PEG de peso molecular elevado, e evidenciava uma densidade de poros elevada e um baixo teor de anticorpos não específicos. 23 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ

Tabela 2: Análise de propriedades de composiçoes para imobilização de proteínas

Composições de sol Composição Actividade Propriedades de poro do ponto Capacidade de adsorção dimensão (nm) densidade 0 25,5% TMOS, 12,5% MTMS 1,1475 12,4 0,07 1993,33 I 17,5% TMOS, 12,5% MTMS, 4% PGS 3,45084 21,9 0,188 578,29 II 20,5% TMOS, 10,5% MTMS, 5% PEOU 6,35116 21,3 0, 102 304,06 III 25,5% TMOS, 12,5% MTMS, 3% PEG400 18,8969 27, 8 0,349 265,66 IV 25,5% TMOS, 12,5% MTMS, 5% PEG8000 37,43029 21,5 0,259 14, 69 V 25,5% TMOS, 12,5% MTMS, 2,5% glicerol 16,58053 21,9 0,139 77, 24 VI 25,0% TMOS, 7,5% MTMS, 5% GPTMOS 3,45084 17, 6 0,053 517,62 VII 10% MTMS 5,3421 20,4 0,119 99,64

Exemplo 2: Diagnóstico imunológico enzimático de doenças através da imobilização de pontos de proteínas no chip de sol-gel imobilizados sobre placa de 96 poços

Neste Exemplo, as composições de sol seleccionadas no

Exemplo 1 foram medidas utilizando um processo de diagnóstico de ELISA automatizado que é correntemente utilizado para diagnóstico da hepatite. 0 processo de diagnóstico automatizado compreendeu um processo de lavagem intensa e assim, entre as composições rastreadas, foi utilizada uma composição na qual os pontos mostravam uma forte adesão e podiam manter a sua forma circular característica mesmo após lavagem. A composição de sol utilizada neste Exemplo estava optimizada tal que os pontos 24 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ formados se mantinham mesmo após raspagem utilizando um dispositivo Abbott Axsym e um dispositivo Roche Elecsys.

Neste Exemplo, quando o material de uma placa de 96 poços para a composição seleccionada através deste processo era PMMA tratado por plasma, uma mistura da composição de sol para imobilização e uma solução de proteína consistiram de 17,5-25 partes em peso de TMOS, 5-15 partes em peso de MTMS, 2,5-15 partes em peso de GPTMOS, 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 25 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8) e 12,5 partes em peso de uma solução de proteína.

No caso de composições contendo TMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 17,5-25 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo TMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo MTMS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 5-15 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno, e no caso de composições contendo MTMS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 2,5-15 partes em peso, ocorreram muitas reacções não específicas devido à elevada capacidade de adsorção dos pontos e, no caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi facilmente imobilizada devido um tamanho de poro grande.

Utilizando o antigénio de HIV, proteína p24, como solução de proteína, os pontos de sol-gel foram integrados sobre uma placa de 96 poços. Como resultado, como se mostra na FIG. 4, quatro amostras mostraram uma reacção específica 25 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ pela proteína ρ24 de HIV, indicando que as amostras eram todas HIV positivas. A proteína pôde ser fortemente imobilizada tridimensionalmente sobre a placa de 96 poços fabricada de PMMA tratado por plasma utilizando a mistura de sol-gel, e os resultados de reacções antigénio-anticorpo puderam ser confirmados utilizando o biochip através do dispositivo de diagnóstico automatizado e de um método de ensaio existentes.

Também, uma mistura de uma composição de sol e uma solução de proteína, para imobilização sobre uma placa de 96 poços fabricada de PMMA comercial não tratado por plasma, era composta de 22,5-25 partes em peso de TMOS, 7,5-10 partes em peso de MTMS, 2,5-5 partes em peso de GPTMOS, 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 25 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8), e 12,5 partes em peso de uma solução de proteína.

No caso de composições contendo TMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 22,5-25 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo TMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo MTMS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 7,5-10 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo MTMS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 2,5-5 partes em peso, ocorreram muitas reacções não específicas devido à elevada capacidade de adsorção dos pontos e, no caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi facilmente imobilizada devido um tamanho de poro grande. 26 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ A composição optimizada foi misturada com um antigénio de HCV e integrada sobre uma placa de 96 poços fabricada de PMMA não tratado por plasma, preparando-se assim um biochip. Utilizando o biochip, foi realizado um teste em 79 pacientes (negativos: 25 pessoas, e positivos: 54 pessoas) com o kit EIA de HCV da Roche. A FIG. 5 mostra resultados de análise de sangue para 12 pacientes. Como se pode observar na FIG. 5, os resultados de teste obtidos utilizando o biochip foram completamente consistentes com os resultados de teste obtidos utilizando o método ELISA existente, sugerindo que o biochip do invento tinha uma elevada reprodutibilidade de resultados. 0 biochip de acordo com o presente invento teve um elevado desempenho, elevada sensibilidade, elevado rendimento e elevada exactidão, e pôde realizar medições a um custo baixo, sugerindo que poderia ser utilizado em substituição de métodos de diagnóstico de ELISA existentes. Também, o biochip do invento podia imobilizar a proteína numa quantidade maior do que no método de diagnóstico imunológico existente, pelo que os seus falsos positivos podiam ser reduzidos em comparação com o método de diagnóstico existente, e assim pôde ser realizado um método de diagnóstico da hepatite mais exacto.

Também, de modo a examinar se a análise quantitativa podia ser realizada utilizando o biochip do invento, foram realizados testes sobre limites de detecção e intervalos de quantificação através de diluições em série de amostras de paciente (FIG. 6). Como resultado, foi apresentada uma distribuição quantitativa. A partir dos resultados de teste, pôde-se observar que, quando se utilizou o biochip de acordo com o presente invento, pôde também ser realizada a análise quantitativa, que não podia ser realizada em métodos existentes de diagnóstico imunológico.

Exemplo 3: Fabricação e análise de um biochip utilizando substrato de chip de ouro

Neste Exemplo, uma composição de sol para imobilização sobre um substrato de chip de ouro foi seleccionada de acordo com o mesmo método como no Exemplo 1 utilizando um chip de ouro (Au) utilizado num sistema SPRi. No caso do 27 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ chip de ouro, adicionaram-se adesivos (1010 e 1020; LG Chemical Co., Ltd., Coreia) como aditivos à composição de sol para imobilização. Após formação de pontos a mistura de sol foi modificada numa substância, que era transparente como o vidro e tinha poros, mas a mistura de sol não foi imobilizada sobre o chip de ouro, cuja superfície estava revestida com Au. Neste Exemplo, de modo a imobilizar pontos de sol sobre a superfície de chip de ouro, foram utilizados aditivos, e a composição da mistura de sol utilizada era composta de 16,2-18,7 partes em peso de TMOS, 3,7-6,2 partes em peso de MTMS, 13,7-16,2 partes em peso de GPTMOS, 0,01-20 partes em peso de adesivos (1010, 1020, etc.), 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 23,7-24,5 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8), e 12,5 partes em peso de uma solução de proteína.

No caso de composições contendo TMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 16,2-18,7 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo TMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo MTMS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 3,7-6,2 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo MTMS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 13,7-16,2 partes em peso, ocorreram muitas reacções não especificas devido à elevada capacidade de adsorção dos pontos e, no caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi facilmente imobilizada devido um tamanho de poro grande. 28 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ A mistura foi aplicada por pontos sobre o chip de ouro do mesmo modo como nos Exemplos 2 e 3, e depois ensaiada para uma proteina p24. A diferença do ensaio do chip de ouro em relação ao ensaio do biochip imobilizado sobre a placa de 96 poços era que foi realizada uma reacção de anticorpo primário e os resultados podiam ser detectados sem uma reacção secundária com marcação por fluorescência. Os resultados do chip de ouro submetido à reacção primária podiam ser lidos por medição e visualização de uma alteração de ressonância que ocorre durante a reacção, utilizando o sistema SPR (FIG. 7) . 0 chip de ouro podia imobilizar uma qrande quantidade de proteina e detectar directamente a ligação proteína-proteína sem marcação química, e assim tinha uma sensibilidade elevada.

Exemplo 4: Imobilização e detecção electroquímica de pontos sobre um chip de semiconductor

Este Exemplo refere-se a um sistema no qual uma mistura condutora de sol foi imobilizada sobre o eléctrodo positivo de um chip de semicondutor para utilização em medições electroquímicas, e a diferença em resistência eléctrica antes e após uma reacção ocorrendo entre os mesmos foi medida para monitorizar a reacção. Uma superfície de metal utilizada neste Exemplo era uma bolacha de silicio muito frequentemente utilizada em eléctrodos, mas era difícil na especialidade anterior fixar uma substância polimérica à bolacha de silício sem tratamento de superfície, porque a sua superfície era muito uniforme e lisa. Contudo, neste Exemplo, uma composição de sol para imobilização sobre eléctrodos foi rastreada de acordo com o método do Exemplo 1 e misturada com proteina p24, e a mistura foi imobilizada sobre uma bolacha de semiconductor. A composição de sol para chips de semicondutor, utilizada neste Exemplo, era composta de 5-30 partes em peso de TMOS, 2-35 partes em peso de MTMS, 1-15 partes em peso de GPTMOS, 0,01-20 partes em peso de adesivos, 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 23,7-24,5 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8), e 12,5 partes em peso de uma solução de sonda. 29 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ

Utilizando ο chip de semicondutor sobre o qual a composição de sol e a proteina p24 foram imobilizados, mediu-se a diferença em resistência eléctrica antes e depois de uma reacção, de acordo com um método de medição electroquimico, e os resultados da medição são apresentados na FIG. 8. Como se mostra na FIG. 8, a sensibilidade foi significativamente aumentada, e a razão de ruído de fundo pôde ser reduzida. Assim, o chip de semicondutor chip de acordo com este Exemplo é barato e, ao mesmo tempo, é útil para a fabricação de sistemas de análise de biochip de pequena dimensão.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Como descrito acima em detalhe, o presente invento proporciona um método para rastreio de uma composição de sol para biochips de sol-gel, que é utilizado para imobilizar uma sonda sobre um substrato de superfície não tratada. Também, o presente invento proporciona a utilização de uma composição de sol para substratos de PMMA, substratos de chip de ouro e substratos de bolacha de silício, rastreada pelo referido método, e um biochip de sol-gel preparado utilizando a referida composição de sol. 0 biochip de acordo com o presente invento é conveniente e económico, porque pode utilizar sistemas de reacção e sistemas de análise existentes por imobilização de pontos do tipo gel contendo biomateriais directamente sobre placas de 96 poços, que são amplamente utilizadas em bioensaios. Também o biochip pode proporcionar bons resultados de análise, porque ocorre menos modificação dos biomateriais imobilizados sobre o biochip. Em particular, quando o biochip é utilizado num método de análise sem uma sonda, para além da análise de fluorescência, o problema de sensibilidade que ocorre no método de análise anterior pode ser solucionado ligando fortemente pontos de sol-gel tridimensionais, e assim é de esperar que o biochip seja útil para o desenvolvimento de produtos, incluindo POCT.

Lisboa, 2014-06-23

Claims

ΕΡ 1 982 184/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método para rastrear uma composição de sol para biochips de sol-gel, que é utilizado para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, o método compreendendo os passos de: (a) obter uma primeira biblioteca de composições de sol onde pelo menos um monómero de silicato seleccionado entre o grupo consistindo de tetrametilortossilicato (TMOS), metiltrimetoxissilano (MTMOS), tetraetilortossilicato (TEOS), etiltrimetoxissilano (ETrEOS), trimetoxissilano (TMS), metiltrimetoxissilicato (MTMS) e 3-aminopropiltrimetoxissilicato (3-ATMS), e pelo menos um aditivo seleccionado entre o grupo consistindo de poliglicerilsilicato (PGS), diglicerilsilano (DGS), 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GPTMOS), (N-trietoxisililpropil)-O-poli(óxido de etileno)-uretano (PEOU), glicerol e polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular de 100-10000, são misturados um com o outro em tampão em várias proporções; (b) formar pontos da primeira biblioteca de composições de sol sobre um substrato alvo que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; (c) medir a adesão, aspecto, transmitância e tempo de gelificação dos pontos formados no passo (b) e, com base nos resultados das medições, seleccionar as composições que não mostram o desprendimento de pontos mesmo quando são raspados com uma ponta após lavagem, possuem um diâmetro de ponto de 100-800 pm mantendo ao mesmo tempo uma forma circular, mostram uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo, e têm um tempo de gelificação de 4-48 horas num tubo e um tempo de gelificação de 1-4 horas nos pontos do substrato, obtendo-se desse modo uma segunda biblioteca de composições de sol; ΕΡ 1 982 184/ΡΤ 2/5 (d) adicionar uma sonda à segunda biblioteca de composições de sol e formar pontos da segunda biblioteca contendo sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; e (e) medir a taxa de imobilização dos pontos para a sonda, e a especificidade entre a sonda e uma substância alvo e, com base nos resultados da medição, seleccionar uma composição de sol onde a taxa de imobilização da sonda é pelo menos 70% e a razão de sinais específicos/sinais não específicos da sonda e da substância alvo é pelo menos 3.
2. Método para rastreio de uma composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com a reivindicação 1, onde a sonda é qualquer uma seleccionada entre o grupo consistindo de proteínas, oligopéptidos, ácidos nucleicos, substâncias de baixo peso molecular, microorganismos, fungos e materiais de ervas medicinais.
3. Método para rastreio de uma composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com reivindicação 1, onde o substrato é qualquer um seleccionado entre o grupo consistindo de placas de polímero, metais, bolachas de silício, vidro e LCD.
4. Utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende: 17.5- 25 partes em peso de TMOS; 5-15 partes em peso de MTMS; 2.5- 15 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda. ΕΡ 1 982 184/ΡΤ 3/5
5. Utilização da composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com reivindicação 4, onde a referida sonda é uma proteína.
6. Biochip de sol-gel no qual a composição de sol utilizada em uma das reivindicações 4 ou 5 está imobilizada sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico.
7. Utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico e compreende: 22.5- 25 partes em peso de TMOS; 7.5- 10 partes em peso de MTMS; 2.5- 5 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda.
8. Utilização da composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com reivindicação 7, onde a referida sonda é uma proteína.
9. Utilização da composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com reivindicação 8, onde a referida proteína é antigénio de HCV.
10. Biochip de sol-gel no qual a composição de sol utilizada em uma das reivindicações 7 ou 8 está imobilizada sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico.
11. Biochip de sol-gel de acordo com reivindicação 10, onde o referido substrato é uma placa de 96 poços. ΕΡ 1 982 184/ΡΤ 4/5
12. Utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, compreende: 16,2-18,7 partes em peso de TMOS; 3.7- 6,2 partes em peso de MTMS; 13.7- 16,2 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 23.7- 24,5 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda.
13. Utilização da composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com reivindicação 12, onde o referido adesivo é 1010 e/ou 1020.
14. A utilização da composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com reivindicação 12, onde a referida sonda é uma proteína.
15. Biochip de sol-gel no qual a composição de sol utilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-14 está imobilizada sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico.
16. Utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de silício que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende: 5-30 partes em peso de TMOS; 2-35 partes em peso de MTMS; 1-15 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 23.7- 24,5 partes em peso de água destilada; ΕΡ 1 982 184/ΡΤ 5/5 12.5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 12.5 partes em peso de uma solução de sonda.
17. Utilização da composição de sol para biochips de sol-gel de acordo com reivindicação 16, onde a referida sonda é uma proteína.
18. Biochip de sol-gel no qual a composição de sol utilizada em uma das reivindicações 16 ou 17 está imobilizada sobre um substrato de silício que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico. Lisboa, 2014-06-23