PT1987353E

PT1987353E - Mecanismo de transferência de fluido

Info

Publication number: PT1987353E
Application number: PT07705600T
Authority: PT
Inventors: Alastair Mcindoe Hodges; Ronald Christopher Chatelier; Garry Chambers
Original assignee: Universal Biosensors Pty Ltd
Priority date: 2006-02-21
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2012-09-06
Also published as: CN101384900A; CN101384900B; MX2008010719A; EP1987353A1; KR101345428B1; EP1987353B1; TW200813215A; WO2007096730A1; NZ571322A; US20090305431A1; HK1124665A1; DK1987353T3; PL1987353T3; IL193352A; BRPI0708131A2; CA2643370C; IL193352A0; JP2009527676A; EP1987353A4; US8182765B2

Description

DESCRIÇÃO "MECANISMO DE TRANSFERENCIA DE FLUIDO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se, de um modo geral, a mecanismos de transferência de fluido. Exemplos de formas de realização particulares da invenção referem-se a mecanismos de teste de fluidos médicos. Técnica Relacionada A concepção de algumas fitas de sensor requer duas ou mais câmaras, em que o fluido pode ser introduzido numa câmara e, em seguida, transferido para uma segunda câmara, ou câmaras adicionais, após um tempo predeterminado. Em particular, as fitas de análises imunológicas, como divulgado nos Pedidos de Patente US N° 10/830841 e 11/284097 tinham pelo menos duas câmaras, uma primeira câmara de reacção e uma segunda câmara de detecção. Em utilização, o líquido era introduzido primeiro na câmara de reacção e mantido aí durante um tempo predeterminado, enquanto as reacções de ligação imunológica prosseguiam e, em seguida era transferido para a câmara de detecção. Este tempo de transferência obtinha-se ao ter a câmara de detecção aberta para a câmara de reacção mas, inicialmente, não ventilada, de modo a que, quando a câmara de reacção enchia, a abertura para a câmara 1 de detecção era fechada pelo líquido. Este ar aprisionado na câmara de detecção impedia-a de encher com líquido. Quando se desejava encher a câmara de detecção, abria-se um respiradouro na extremidade da câmara de detecção distante da câmara de reacção, habitualmente, através da perfuração de uma camada, de acordo com o que, o líquido era transferido da câmara de reacção para a câmara de detecção, esvaziando parcialmente a câmara de reacção ou extraindo uma amostra a partir de um reservatório de enchimento. 0 método apresentado anteriormente possui várias desvantagens potenciais. Pode ser difícil fechar a entrada para a câmara de detecção de um modo fiável, através do intervalo de viscosidades das amostras encontradas, quando se testa sangue inteiro. Isto significa que podem entrar quantidades diferentes de líquido na câmara de detecção, durante o enchimento da câmara de reacção, que se podem adicionar à variabilidade da resposta. Igualmente, pode ser difícil garantir a fiabilidade de um método de perfuração ao longo da vida de um medidor, devido ao potencial de uma agulha ou lâmina se tornar romba com uma utilização repetida. Seria assim desejável desenvolver um método para afectar uma transferência de líquido temporizada, que solucione estas dificuldades. 0 documento EP0057110 descreve um vaso de reacção com uma primeira e uma segunda zona ligadas por um caminho de passagem, e um método para efectuar a interacção de líquidos e reagentes. 2

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um exemplo de uma forma de realização da invenção procura proporcionar um método fiável e robusto para transferir pequenos volumes de liquido entre câmaras, utilizando forças de transferência passivas. 0 método envolve proporcionar uma parede porosa entre as câmaras, entre as quais se deve transferir o líquido. A parede porosa possui poros que são suficientemente grandes para serem substancialmente cheios com o líquido a ser transferido, mas suficientemente pequenos, de modo a que, a tensão superficial da interface do líquido com a segunda câmara impeça o líquido de derramar para fora dos poros para a segunda câmara antes de se realizar um passo de iniciação. 0 liquido é introduzido numa primeira câmara, de modo a que molhe a parede porosa e encha, pelo menos parcialmente, os poros. 0 liquido não entra, contudo, na segunda câmara neste momento, uma vez que a tensão superficial o impede de sair pela face oposta da parede porosa para a segunda câmara. Quando se deseja transferir líquido para a segunda câmara, realiza-se um passo de iniciação que ultrapassa ou quebra a tensão superficial e permite que o líquido flua para fora dos poros e para o interior da segunda câmara. 0 passo de iniciação é de modo a que se ultrapasse a tensão superficial que mantém o liquido nos poros na parede e permita que o liquido entre na segunda câmara. Este passo de iniciação pode ser proporcionado através do fornecimento de um impulso de pressão para o liquido na primeira câmara, criando um vácuo na segunda câmara, vibrando a fita, tocando uma superfície na superfície da parede porosa que está voltada para a segunda 3 câmara ou qualquer outro método que quebre ou ultrapasse a tensão superficial.

Podem encher-se múltiplas segundas câmaras a partir de uma única primeira câmara, ao mesmo tempo ou em tempos diferentes, através da indução do mecanismo de iniciação na(s) segunda(s) câmara(s) desejada(s) no(s) tempo(s) desejado(s). Além disso, uma terceira câmara pode ser cheia a partir da segunda câmara que possui, pelo menos, uma parte de uma parede da segunda câmara porosa e em comum com a terceira câmara, sendo o passo de iniciação realizado na terceira câmara, quando é requerida a transferência. Isto pode repetir-se, evidentemente, para uma fiada subsequente de câmaras em paralelo ou em série.

As formas de realização particulares da invenção proporcionam um dispositivo de transferência de fluido para transferir liquido de uma primeira câmara para uma segunda câmara. 0 dispositivo possui uma primeira câmara, uma segunda câmara e uma barreira entre a primeira câmara e a segunda câmara, possuindo a barreira, pelo menos, uma abertura que liga de modo fluido a primeira câmara à segunda câmara, sendo a, pelo menos uma, abertura dimensionada de modo a que uma força de retenção mantenha o líquido na primeira câmara. 0 fluido é transferido da primeira câmara para a segunda câmara, quando se introduz uma entrada de iniciação no líquido, que é suficiente para ultrapassar a força de retenção.

Outras formas de realização da invenção proporcionam métodos de transferência de líquido de uma primeira câmara para uma segunda câmara. Os métodos incluem proporcionar uma primeira câmara, proporcionar uma segunda câmara, proporcionar uma barreira entre a primeira câmara e a segunda câmara, possuindo a 4 barreira, pelo menos, uma abertura que liga de modo fluida a primeira câmara à segunda câmara, sendo a, pelo menos uma, abertura, dimensionada de modo a que uma força de retenção mantenha o liquido na primeira câmara, e transferência do liquido a partir da primeira câmara para a segunda câmara. A transferência realiza-se quando se introduz uma entrada de iniciação no liquido, que é suficiente para ultrapassar a força de retenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 0 exposto anteriormente e outras caracteristicas e vantagens da invenção, serão evidentes a partir da descrição mais particular que se segue, de formas de realização particulares da invenção, como ilustrado nos desenhos anexos, em que números de referência semelhantes indicam, de um modo geral, elementos idênticos, funcionalmente semelhantes, e/ou estruturalmente semelhantes. A Figura 1 mostra um exemplo de uma primeira forma de realização da invenção; A Figura 2 é uma vista em corte ao longo da linha de corte A-A' da forma de realização mostrada na Figura 1; A Figura 3 é uma vista em corte ao longo da linha de corte B-B' da forma de realização mostrada na Figura 1; A Figura 4 mostra um exemplo de uma segunda forma de realização da invenção; 5 A Figura 5 é uma vista em corte ao longo da linha de corte A-A' da forma de realização mostrada na Figura 4; A Figura 6 é uma vista em corte ao longo da linha de corte B-B' da forma de realização mostrada na Figura 4; A Figura 7 mostra uma forma de realização alternativa da invenção; A Figura 8 mostra um exemplo de uma terceira forma de realização da invenção; A Figura 9 é uma vista explodida da forma de realização mostrada na Figura 8; A Figura 10 é um gráfico que mostra a corrente em função do tempo, de um primeiro exemplo da invenção; e A Figura 11 é um gráfico que mostra a corrente em função do tempo, de um segundo exemplo da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção será agora descrita com referência a uma forma de realização especifica de duas câmaras, com um passo de iniciação específico. Esta forma de realização refere-se a uma fita de análises imunológica descartável que utiliza uma detecção electroquímica dos resultados de uma reacção de ligação imunológica. Salienta-se que os termos superior e inferior utilizam-se apenas por conveniência na descrição seguinte, não implicando nada relativamente à orientação preferida do 6 dispositivo durante a utilização, que pode ser utilizado, de facto, em qualquer orientação. A fita compreende três câmaras, uma câmara de enchimento, uma câmara de reacção e uma câmara de detecção. A câmara de enchimento serve para receber a amostra e actua como um reservatório da amostra, a câmara de reacção contém reagentes, de acordo com o que, uma sonda está imobilizada selectivamente na câmara de reacção em extensões diferentes, dependendo da presença ou concentração de um analito na amostra. A câmara de detecção contém eléctrodos e reagentes, de modo a poder detectar a quantidade de sonda transferida com o líquido a partir da câmara de reacção e detecta ou quantifica, assim, a quantidade de analito na amostra original. Mostra-se nas Figuras 1-3, um exemplo de uma tal fita. A fita 100 possui um número de camadas que são laminadas em conjunto utilizando adesivos. A fita possui três câmaras, uma câmara 1 de enchimento, uma câmara 2 de reacção e uma câmara 3 de detecção. As camadas 10 e 70 são camadas de vedação, que servem para fechar as faces da câmara 1, para auxiliar a formar um espaço capilar. A camada 20 é uma camada que transporta uma superfície superior, electricamente condutora, que serve como um eléctrodo na câmara 3 de detecção. As camadas 30 e 50 são camadas de espaçamento que possuem faces, superior e inferior, adesivas. As camadas 30 e 50 servem para manter o laminado em conjunto e para definir a altura das câmaras de detecção e de reacção, respectivamente. Uma região recortada da camada 30, mostrada nas Figuras 2 e 3, define a área da câmara 3 de detecção e a área dos eléctrodos da câmara de detecção. Uma região recortada da camada 50, mostrada nas Figuras 2 e 3, define a área da câmara 2 de reacção. A camada 40 é uma camada que contém poros que servem como poros que ligam a câmara 2 de reacção à câmara 3 de detecção. A camada 40 possui 7 um revestimento electricamente condutor sobre a sua superfície inferior, que serve como o segundo eléctrodo na câmara 3 de detecção. A camada 60 serve para fechar a câmara 2 de reacção e a câmara 1 de enchimento. Opcionalmente, a camada 60 pode transportar um revestimento electricamente condutor sobre a sua superfície inferior para servir como um eléctrodo, para detectar quando o líquido enche a câmara 2 de reacção. Com esta opção, o líquido enche a câmara 2 de reacção e os poros em 40, estabelecendo assim uma ligação entre o eléctrodo na face inferior de 40 e aquele na face inferior de 60. Esta ligação pode ser detectada, de modo a dizer ao medidor para iniciar a sequência de teste. As camadas 10 e 70 podem ser fixas às camadas 20 e 60, respectivamente, através de qualquer método adequado. Um método preferido é utilizar adesivo. Numa forma de realização, o adesivo pode ser aplicado na superfície inferior da camada 20 e na superfície superior da camada 60, as camadas 10 e 70 podem ser, em seguida, laminadas a estas camadas adesivas. Alternativamente, o adesivo pode ser revestido sobre as camadas 10 e 70 e, em seguida, essas camadas laminadas a 20 e 60.

As Figuras 4-6 mostram uma forma de realização alternativa, onde o recorte na camada 50 para formar a câmara 2 de reacção, é de modo a que as paredes do recorte rodeiem totalmente o recorte, de modo a formar uma área fechada. Esta forma de realização tem a vantagem de impedir que o líquido proveniente da câmara 2 de reacção molhe em torno da margem aberta da câmara 2 de reacção, de modo a encher a câmara 3 de detecção a partir da sua margem aberta, em vez de através da parede porosa que liga as duas câmaras. Nesta forma de realização, o ar que é deslocado à medida que o líquido enche a câmara 2 de reacção pode ventilar através dos orifícios na parede porosa, permitindo que a câmara encha até que todos os poros na parede estejam cheios com líquido ou a câmara 2 de reacção fique totalmente cheia. Salienta-se que não é necessário, que a câmara 2 de reacção fique completamente cheia para uma operação correcta, uma vez que existe um volume suficiente de líquido em contacto com os reagentes na câmara 2 de reacção para encher a câmara 3 de detecção.

Mostra-se, igualmente, nas Figuras 4-6 uma forma de realização onde as camadas 10 e 70 não são necessárias, e, em alternativa, as camadas 20 e 60 estem-se de modo a formar as paredes de extremidade da câmara 1 de enchimento. Opcionalmente, nesta forma de realização, a camada condutora na superfície superior de 2 0 pode estender-se para a câmara 1 de enchimento. Se isto for efectuado, quando o líquido enche a câmara 2 de reacção e os poros da camada 40, efectua-se uma ligação eléctrica através do líquido entre a camada condutora em 20 na câmara 1 de enchimento e a camada condutora sobre a superfície inferior da camada 40. Isto pode ser detectado electricamente como uma queda na resistência ou uma modificação na tensão, ou da corrente que flui ou da capacitância entre as camadas condutoras em 20 e 40. Isto pode servir como um sinal para o medidor, que o líquido encheu a câmara 3 de detecção e inicia, assim, automaticamente uma sequência de teste predeterminada. Salienta-se que uma vantagem deste método, é que o sinal não será detectado até que o líquido na câmara 1 de enchimento tenha um volume suficiente de modo a tocar a abertura da câmara 2 de reacção e comece a encher os poros da camada 40. Semelhante ao método divulgado no documento US 6571651, a dimensão capilar da câmara 1 de enchimento é maior do que a da câmara 2 de reacção, e, assim, a câmara 1 de enchimento pode esvaziar-se de modo a encher a câmara 2 de reacção. Deste modo, se a câmara 1 de 9 enchimento for dimensionada de modo a possuir um volume, pelo menos, igual e, de um modo preferido, ligeiramente maior do que a câmara 2 de reacção, então, o sinal que indica que o liquido foi introduzido no dispositivo não será detectado até que exista líquido suficiente introduzido no dispositivo para funcionar como pretendido. Uma vantagem adicional disto, é que, se no início não se introduzir líquido suficiente na câmara 1 de enchimento, pode adicionar-se mais até estar suficientemente presente, sem afectar a operação pretendida do dispositivo. Quando se inicia a transferência de fluido entre a câmara 2 de reacção e a câmara 3 de detecção, ocorrerá uma segunda variação nas condições eléctricas entre as superfícies condutoras em 20 e 40, devido à molhagem da camada condutora em 20 na área da câmara 3 de detecção. Esta variação pode ser utilizada para confirmar ao medidor, que a transferência de fluido se realizou com sucesso. Salienta-se que, em geral, o sinal de corrente que resulta da área da camada condutora em 20 exposta na câmara 1 de enchimento será pequeno comparado com o gerado pela área da camada condutora exposta na câmara 3 de detecção, de modo que, não interferirá significativamente com o sinal da câmara 3 de detecção. Isto é assim, devido, em geral, a existirem baixas concentrações ou não existir uma quantidade significativa, de espécies electroactivas na amostra nativa que podem gerar corrente com as tensões aplicadas, normalmente entre os eléctrodos na câmara 3 de detecção. Igualmente, o trajecto de liquido relativamente longo entre a camada condutora exposta na câmara 1 de enchimento e a camada condutora em 40, confere uma resistência eléctrica relativamente alta, que tende a reduzir o sinal de corrente produzido.

Uma vantagem desta forma de realização é que apenas são necessárias duas ligações eléctricas para detectar todos os 10 sinais eléctricos provenientes da fita para completar o teste, uma ligação à camada condutora em 20 e a segunda à camada condutora em 40. Os elementos de ligação adequados, para tal, divulgam-se nas Patentes US N° 6379513 e 6946067 e no Pedido de Patente US N° 11/284136.

Mostra-se na Figura 7, um método de ligação eléctrica alternativo para este dispositivo. O dispositivo 200 de ligação ilustra-se com referência à presente invenção, contudo, deve entender-se que este aspecto da invenção aplica-se a qualquer dispositivo, quando se deseja que a ligação seja feita nas superfícies que estão muito próximas e voltadas, umas para as outras. Os elementos numerados na Figura 7, com números comuns a outras figuras, indicam o mesmo elemento na presente ilustração. Nesta forma de realização deste aspecto da invenção, a Figura 7 mostra a extremidade da fita oposta à extremidade sobre a qual se abre a câmara 1 de enchimento. De acordo com esta forma de realização, a camada 20 estende-se para lá da camada 30 de espaçamento e da camada 40. A camada 20 transporta uma camada 70 electricamente condutora sobre a sua superfície superior e a camada 40 transporta uma camada 90 electricamente condutora sobre a sua superfície inferior. Deseja-se efectuar uma ligação eléctrica separada com as camadas 7 0 e 90. A camada 40 estende-se para lá da camada 30 de espaçamento. Introduz-se uma camada 110 adicional no espaço entre as camadas 20 e 40 que se estende para lá de 30. De um modo preferido, a espessura da camada 110 ma is a camada 80 condutora e quaisquer camadas adesivas que podem estar presentes, é igual, ou ligeiramente maior, do que a espessura da camada 30. A camada 110 é electricamente condutora, pelo menos, na sua superf icie 80 superior, contudo, não é electricamente condutora através de toda a sua espessura, de modo a que a ligaçao eléctrica possa 11 efectuar-se entre 80 e 90, mas não entre 90 e 70 através de 110. A camada 110 e a camada 80 condutora transportada sobre a mesma, estendem-se para lá da margem de40, assim, ao estabelecer uma ligação de 80 e 90 em ligação eléctrica, pode efectuar-se uma ligação eléctrica a 90 através de 80, na área de 80 que se estende para lá de 40. De um modo preferido, está presente uma camada adesiva entre a superfície inferior de 110 e 70, para fixar a camada 110 em posição. Pode colocar-se, opcionalmente, um adesivo condutor entre as camadas 90 e 80, pelo menos, numa parte onde elas se sobreponham, para auxiliar a garantir uma boa ligação eléctrica. Alternativamente, a porta que contém os pinos ou dispositivos semelhantes para ligar a fita a um circuito eléctrico exterior, pode ser configurada, de modo a que, quando a fita é inserida na porta, uma face, ou faces da porta, empurrem contra a superfície superior de 40 para empurrar 90 em ligação com 80.

Mostra-se nas Figuras 8 e 9, uma forma de realização da invenção que utiliza um dispositivo com três câmaras activas. A Figura 8 mostra uma vista superior de um dispositivo com três câmaras activas e uma câmara de enchimento. A Figura 9 mostra uma vista explodida desta forma de realização, que mostra as várias camadas. A fita 700 compreende uma câmara 800 de enchimento, uma primeira câmara 510 de reacção, uma câmara 310 de transferência e reacção e uma segunda câmara 520 de reacção. As perfurações 410 na camada 400 servem para ligar a primeira câmara 510 de reacção com a câmara 310 de transferência e reacção . As perfurações 420 na camada 400 servem para ligar a câmara 310 de transferência e reacção à segunda câmara 520 de reacção . Em utilização, a amostra adiciona-se na câmara 800 de enchimento que enche até à abertura 510 na extremidade da câmara 800 de enchimento, de acordo com o que, a amostra enche a 12 primeira câmara 510 de reacção. O ar, que é deslocado necessariamente durante este processo de enchimento, ventilará através das extremidades abertas da segunda câmara 520 de reacção, através das perfurações 410 e 420. Um, ou mais reagentes e camadas reagentes, podem ser secos na primeira câmara 510 de reacção para efectuar um passo de pré-tratamento da amostra, por exemplo. Depois de um tempo desejado na primeira câmara 510 de reacção, a transferência de fluido para a câmara 310 de transferência e reacção pode iniciar-se através dos meios divulgados, tais como, empurrando a camada 200 a partir de baixo até que ela contacte com a superfície inferior da camada 400 na área 410 perfurada. Quando isto se inicia, a amostra tratada fluirá desde a primeira câmara 510 de reacção até encher a câmara 310 de transferência e reacção até que as perfurações 420 sejam bloqueadas com a amostra de líquido, de modo a que, o ar já não possa ventilar através das perfurações 420. Opcionalmente, um segundo conjunto de reagentes pode ser seco na câmara 310 de transferência e reacção se desejado, de modo a realizar uma segunda reacção da amostra, tal como, uma reacção de ligação, como discutido abaixo. Salienta-se que é vantajoso, mas não necessário, que as reacções se realizem em todas as câmaras. Por exemplo, a primeira câmara 510 de reacção pode corresponder à câmara de reacção da forma de realização mostrada nas Figuras 1-7 e a segunda câmara 520 de reacção pode funcionar como a câmara de detecção. Neste caso, a câmara 310 de transferência e reacção actua meramente como uma câmara de transferência que separa a primeira câmara 510 de reacção e a segunda câmara 520 de reacção lateralmente, bem como, a área 420 perfurada. Isto pode ser vantajoso em algumas aplicações, na minimização da difusão do vapor proveniente do fluido na primeira câmara 510 de reacção, quando cheia, para a segunda câmara 520 de reacção e molhagem dos reagentes prematuramente. 13

Depois da amostra de fluido estar presente na câmara 310 de transferência e reacção durante o tempo desejado, pode ocorrer uma outra transferência da amostra da câmara 310 de transferência e reacção para a segunda câmara 520 de reacção, através das perfurações 420. Esta transferência pode iniciar-se, por exemplo, ao empurrar sobre a superfície superior da camada 600 por cima das perfurações 420, de modo a que, a superfície inferior da camada 600 entre em contacto com pelo menos algumas das perfurações 420. Podem secar-se outros reagentes na segunda câmara 520 de reacção, para tratarem ou reagirem posteriormente com componentes da amostra. Por exemplo, os resultados de quaisquer reacções realizadas na câmara 310 de transferência e reacção e na primeira câmara 510 de reacção, podem ser detectados na segunda câmara 520 de reacção e convertidos num sinal utilizável, quer óptico, electroquímico ou para algum outro método adequado. A Figura 9 mostra com maior pormenor o modo como são formadas as várias câmaras nesta forma de realização. As camadas 200 e 600 são as camadas de fecho inferior e superior, respectivamente, cujas funções são fechar as faces dos espaços capilares na fita, proporcionar camadas para contactar a camada perfurada, de modo a iniciar a transferência de fluido, se a iniciação for realizada deste maneira, e para servir como suportes sobre os quais, podem colocar-se uma ou mais outras camadas. Exemplos de outras camadas, são camadas de material condutor para formar eléctrodos e pistas de ligação eléctrica, e camadas de reagentes secos, que podem ser requeridos para processar a amostra nas várias câmaras. 14 A camada 500 está na camada de espaçamento superior. As partes da camada 500 são recortadas ou formadas de um outro modo, para definir a área da primeira e da segunda câmara 510, 520 de reacção. A camada 500 pode ser formada a partir de um substrato com adesivo revestido nos dois lados ou pode ser apenas uma camada de adesivo, que foi formada ou colocada nas áreas que corresponderão à primeira e à segunda câmara 510, 520 de reacção, deixadas libres de adesivo. Se se utilizar um substrato revestido por adesivo, as áreas correspondentes à primeira e à segunda câmara 510, 520 de reacção podem ser formadas através de perfuração ou de um outro modo, que remova essas áreas. A camada 400 é uma camada que actua como uma barreira, e compreende as perfurações necessárias para completar as transferências de fluido entre, a primeira câmara 510 de reacção e a câmara 310 de transferência e reacção e a câmara 310 de transferência e reacção e a segunda câmara 520 de reacção, quando requerido. As perfurações podem ser formadas como descrito numa outra parte desta divulgação. A camada 300 é uma segunda camada de espaçamento com uma área aberta que serve para definir a câmara 310 de transferência e reacção. Esta pode ser construída através dos métodos dados anteriormente para a camada 500. A câmara 800 de enchimento pode ser formada laminando primeiro ou unindo de um outro modo as camadas 300, 400 e 500 com as áreas 310, 510 e 520 e as perfurações 410 e 420 pré-formadas nas respectivas camadas e, em seguida, perfurando através do elemento trilaminado de modo a formar o recorte para a câmara 800 de enchimento. Alternativamente, as regiões 300, 400 e 500 que correspondem à câmara 800 de enchimento podem ser formadas separadamente nas camadas e, em seguida, as camadas laminadas, de modo a que, as 15 regiões recortadas se alinhem de modo a formar as paredes laterais da câmara 800 de enchimento. As faces de extremidade da câmara 800 de enchimento são fechadas, quando 200 e 600 são laminadas nas superfícies superior e inferior do elemento trilaminado que compreende 300, 400 e 500.

Com referência à forma de realização ilustrada nas Figuras 1-6, para funcionar como uma fita de análise imunológica seca, os reagentes podem ser secos na câmara 2 de reacção e na câmara 3 de detecção durante a fabricação. Os reagentes na câmara 2 de reacção compreendem uma sonda ligada a um agente de ligação (daqui em diante designado por conjugado) e um alvo de ligação em relação ao qual o agente de ligação se pode ligar, onde as espécies que transportam o alvo de ligação ou o próprio alvo de ligação, podem ser impedidas de entrar na câmara 3 de detecção. Por exemplo, o conjugado pode consistir numa enzima, tal como a glucose desidrogenase dependente de PQQ (GDHpqq) ligada a um anticorpo de um analito de interesse. O local de ligação alvo pode ser, então, o analito de interesse preso a esferas magnéticas. As esferas magnéticas podem ser impedidas de entrar na câmara de detecção por meio de um íman que as confina na câmara 3 de reacção. Alternativamente, as esferas não necessitam de ser magnéticas, mas devem ser suficientemente grandes, de modo a que, elas não possam ajustar-se através dos poros na camada 40, de modo a que, isto as impeça de entrar na câmara 3 de detecção. Quando existe analito na amostra, o analito livre pode ligar-se ao local de ligação no conjugado e bloquear, assim, o conjugado de se ligar aos locais alvo, imobilizados. 0 conjugado permanece, assim, livre em solução e capaz, assim, de se transferir para a câmara 3 de detecção. Nesta forma de realização, é desejável que o conjugado e o local de ligação alvo não sejam misturados antes da amostra contactar 16 os reagentes. Para obter isto, o conjugado pode ser seco sobre a face inferior de 60 e a espécie que transporta os locais de ligação alvo sobre a face superior de 40. Se os locais de ligação alvo estiverem localizados sobre esferas magnéticas, um iman permanente ou um electroiman colocado próximo da face superior de 60 pode arrastar as esferas para cima para misturar com o conjugado, depois da amostra ter enchido a câmara 2 de reacção e libertado as esferas magnéticas da camada inicialmente seca. Em adição, o iman serve para impedir as esferas de entrarem na câmara 3 de detecção. A câmara 3 de detecção contém, igualmente, reagentes secos durante a fabricação da fita. Estes reagentes são aqueles necessários para transladar a presença da sonda para uma corrente que possa fluir entre os eléctrodos na câmara 3 de detecção. Nesta forma de realização da invenção, onde a sonda é uma enzima, pode incorporar-se um substrato e um mediador electroquimicamente activo para a enzima. Alternativamente, o substrato para a enzima pode ser incorporado na câmara 2 de reacção. Isto tem vantagens, quando o substrato pode demorar algum tempo a tornar-se activo. Quando a sonda é GDH, a glucose é um substrato adequado, contudo, a GDHpqq é apenas activa com β-D-glucose. A D-glucose, no estado seco, está predominantemente na forma de α-D-glucose, que prossegue para mutarrotação para β-D-glucose, logo que se dissolva. Assim é vantajoso dissolver a glucose na amostra na câmara 2 de reacção, de modo a que, ela possa mutarodar, enquanto se realizam as reacções de ligação.

Qualquer fluido contendo uma sonda que entra na câmara de detecção, dissolverá os químicos secos e os químicos e a sonda começam a reagir. No caso de GDHpqq como sonda, a glucose é um substrato adequado e o ferricianeto é um mediador adequado. 17

Quando a GDHpqq, a qlucose e o ferricianeto são misturados, a GDHpqq oxidará a glucose e será reduzida no processo, a GDHpqq será em seguida reoxidada pelo ferricianeto, que forma ferrocianeto no processo. 0 ferrocianeto pode ser, em seguida, oxidado no ânodo na câmara de detecção para produzir uma corrente mesurável. Esta corrente pode ser relacionada com a taxa de produção de ferrocianeto, que, por sua vez, pode ser relacionado com a concentração de GDHpqq na câmara de detecção, que por sua vez pode ser relacionada com a concentração de analito originalmente na amostra.

De um modo óptimo, os produtos quimicos secos na câmara de detecção devem ser secos sobre a superfície superior de 20. Isto impede o liquido de encher os poros de 40 que entram em contacto com os reagentes secos prematuramente. Adicionalmente, a dissolução dos produtos químicos em 20 no líquido da amostra reagido, quando os produtos químicos contactam os poros cheios de líquido de 40 (como estabelecido abaixo) ajuda a encorajar a transferência de líquido para a câmara de detecção.

Para que a GDHpqq seja detectada na câmara de detecção, o líquido da câmara de reacção deve ser transferido para a câmara de detecção, depois de um tempo predeterminado, quando as reacções de ligação na câmara de reacção tiverem prosseguido até ao ponto desejado. Quando o líquido enche a câmara de reacção, a hidrofilia dos poros em 40 é tal, que eles enchem igualmente com líquido, neste ponto. Contudo, para que o líquido saia dos poros na face de 40 voltada para a câmara de detecção, teria que se aumentar a área da interface ar/líquido, a que a tensão superficial do líquido se opõe. Assim, o líquido tende a encher a base dos poros, e parar. Nesta forma de realização, de forma a quebrar a tensão superficial, a camada 20 é empurrada a partir 18 de baixo na região da câmara de detecção. Esta distorce 20, de modo a que, a sua superfície superior entre em contacto com a superfície inferior de 40. No(s) ponto(s) de contacto, o líquido pode sair agora dos poros em 40 sem aumentar a área da interface ar/líquido, através directamente da molhagem da face superior de 20. Contudo, uma vez que o mecanismo de empurrar seja retirado e a face superior de 20 se afaste da face inferior de 40, a solução que molha 20 afasta-se com ela e extrai mais líquido através dos poros de 40, de forma a minimizar a taxa da interface ar/líquido em relação ao volume de líquido, quando as superfícies se afastam. Este processo extrai líquido através dos poros até eventualmente a câmara de detecção estar completamente cheia. Salienta-se que a câmara de reacção e a câmara de detecção devem ser abertas para a atmosfera, quando elas estão a ser cheias para uma função correcta, de modo a que, o ar possa ser deslocado e ventilado durante os processos de enchimento. Na forma de realização mostrada nas Figuras 1-3, proporciona-se uma função de ventilação devido às câmaras de reacção e detecção se abrirem para os lados da fita 100. Na forma de realização mostrada nas Figuras 4-6, a câmara de detecção é ventilada através das suas aberturas para os lados da fita e a câmara de reacção é ventilada através dos lados abertos da câmara de detecção através dos poros em 40.

Igualmente, para que esta forma de realização funcione optimamente, é desejável que o enchimento da câmara de detecção não resulte no esvaziamento de uma câmara com dimensões capilares semelhantes, uma vez que as duas forças se podem opor, uma à outra, e criar um enchimento lento ou incompleto. Na fita 100 mostrada, a câmara de enchimento possui uma dimensão capilar maior do que qualquer das câmaras de reacção e detecção.

Assim, quando a câmara de detecção enche, a câmara de enchimento 19 esvaziará se não existir um excesso de líquido fixo à câmara de enchimento. Dado que a câmara de enchimento possui uma dimensão capilar maior do que a câmara de detecção, o enchimento da câmara de detecção será menos impedido. Alternativamente, se a câmara de enchimento possuir as mesmas dimensões capilares que a câmara de detecção, então, a câmara de detecção deve ser mais hidrofílica do que a câmara de enchimento, de modo a afectar a transferência de líquido. Em geral, deve considerar-se o valor de (Yd,sL-Yd,sA) AAd + (Yf,sa_Yf,sl) AAf, onde γ é a tensão superficial, ΔΑ é a variação na área molhada de uma câmara, os subscritos d e f referem-se às câmaras de detecção e de enchimento, respectivamente, SL refere-se à interface sólido-líquido e SA refere-se à interface sólido-ar. A invenção possui várias vantagens sobre a técnica relacionada. Pode utilizar-se um mecanismo com dispositivo para empurrar em vez de um mecanismo de perfuração, para iniciar a transferência de fluido, que deve conferir robustez ao sistema. Igualmente, as câmaras podem ser empilhadas, umas sobre as outras, conduzindo à miniaturização e a vantagens de fabricação. Igualmente, múltiplas câmaras podem ser empilhadas e descentradas, com múltiplos mecanismos com dispositivo para empurrar, como exemplificado nas Figuras 8 e 9, permitindo, assim, múltiplas câmaras em paralelo ou em série a serem cheias em tempos desejados, aumentando a flexibilidade. Igualmente, as áreas de eléctrodo na célula de detecção podem ser definidas de um modo mais conveniente, dado uma região recortada em 30 poder definir completamente as áreas de eléctrodo.

Os exemplos 1 e 2, abaixo, são dados como exemplos de formas de realização da invenção e não devem ser considerados como limitadores de qualquer modo. 20

Exemplo 1

Uma Melinex 329 de 0,007 polegadas de espessura foi revestida por metalização em vácuo de uma camada fina de paládio para conferir uma resistência eléctrica de 10 Ohm/sq para formar a camada 20. Uma Melinex 329 de 0,002 polegadas de espessura foi revestida com cerca de 22 micrones de adesivo activado por calor ARCare-90503 (Adesives Research Inc) em ambos os lados para servir como camadas 30 e 50. A fita adesiva foi fornecida com revestimentos de libertação de PET siliconizado em ambas as faces.

Uma membrana de 0,004 polegadas de espessura de PET foi perfurada através de corte por laser através de orifícios em linhas na direcção descendente na membrana. Os orifícios eram de forma cónica, sendo a extremidade maior de um diâmetro de 150 micrones e sendo a extremidade menor de 45 micrones de diâmetro. A densidade de orifícios média era de 8,2 orifícios/mm2. Depois de perfuração, um lado da membrana foi revestido por metalização em vácuo com ouro para conferir uma resistência eléctrica de 10 Ohm/sq. A fita adesiva de dupla face foi laminada em ambos os lados do PET perfurado deixando os intervalos, como se mostra na Figura 1, que formariam a câmara de reacção 2 e a câmara 3 de detecção. A Melinex revestida por paládio foi, então, laminada na face inferior da camada 30 para formar a camada 20. Uma película de PET transparente foi laminada na face superior da camada 50 para formar a camada 60. A câmara 1 de enchimento foi então formada através de perfuração através das camadas 20 a 60, 21 e de laminação das camadas 10 e 70 de película de PET revestida por adesivo para fechar as faces da câmara 1 de enchimento. O conjugado e as esferas magnéticas derivadas foram preparados como pelo Pedido de Patente US Publicação N° US-2006-0134713-A1, incorporada aqui como referência. O conjugado compreendeu um anticorpo a CRP (Proteína C Reactiva) unido a, pelo menos, uma GDHpqq. A superfície das esferas magnéticas foi modificada para compreender a CRP. Esta CRP serviu como o local de ligação imobilizado para o conjugado. As esferas magnéticas foram impedidas de entrar na câmara de detecção através de um iman permanente colocado próximo da câmara de reacção. O conjugado foi seco sobre a superfície inferior da camada 60. Em algumas fitas, as esferas foram secas sobre a face superior da camada 40. Uma mistura de ferricianeto de potássio, glucose e tampão foi seca sobre a superfície superior da camada 20. Durante o teste colocou-se um íman permanente adjacente da face superior da camada 60. Isto serviu o duplo propósito de impedir as esferas (se presentes) de entrarem na câmara de detecção e atrair as esferas em direcção da camada de conjugado para promover a mistura das duas, logo que a amostra foi introduzida na câmara de reacção.

Em utilização, a amostra foi introduzida na câmara 1 de enchimento até encher através da mesma, até tocar a entrada da câmara 2 de reacção, de acordo com o que, a câmara 2 de reacção encheu, igualmente, com a amostra. Deixaram-se passar, então, sessenta segundos. Depois de sessenta segundos, uma vara de metal foi pressionada contra a superfície inferior de 20, de modo a que 20 fosse deflectida para cima até à superfície 22 superior de 20 entrar em contacto com o líquido que enche os orifícios na camada 40, de acordo com o que, o líquido fluiu através dos orifícios em 40 para encher completamente a câmara 3 de detecção. Quando o líquido estabeleceu uma ligação do espaço entre o eléctrodo sobre a face superior de 20 e aquele da face inferior de 40 do medidor, iniciou-se uma sequência de teste electroquímico, que tornou o eléctrodo inferior com +300 mV relativamente ao eléctrodo superior durante 16 segundos. A Figura 10 mostra gráficos da resposta da corrente típica para fitas cheias com tampão HEPES 0,1 M em água, com e sem a presença de esferas designadas de CRP na solução de teste. Quando não estão presentes esferas, deve transferir-se o conjugado máximo para a câmara 3 de detecção. Quando está presente um excesso de esferas designadas de CRP acima do conjugado na solução, o conjugado é substancialmente imobilizado sobre as esferas conduzindo a uma transferência mínima de conjugado para a câmara 3 de detecção. Neste caso, o eléctrodo inferior estava com +300 mV relativamente ao eléctrodo superior durante os dezasseis segundos em que o potencial foi aplicado. A Figura 11 mostra respostas de corrente típicas para fitas com conjugado e esferas secas nas mesmas, quando testadas com soro do sangue contendo zero ou 250 microgramas/mililitro de CRP. Neste caso, o eléctrodo superior estava com +300 mV relativamente ao eléctrodo inferior.

Exemplo 2 A invenção refere-se, igualmente, a um sensor com um único orifício perfurado grande na camada 40 em vez de uma série de 23 orifícios formados por laser, pequenos. Por exemplo, utilizou-se uma perfuração macho/fêmea de diâmetro de 1,5 mm para criar um orifício na camada 40. Quando o líquido encheu a câmara 2, ele parou mesmo para lá da margem do orifício. Quando a camada 20 foi empurrada contra o orifício, o líquido entrou na câmara 3. A invenção não está restringida ao número de orifícios por sensor ou ao intervalo de diâmetros de orifício descritos nos Exemplos 1 e 2.

Lisboa, 30 de Agosto de 2012 2 4

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo (100, 700) de transferência de fluido para transferir um liquido de uma primeira câmara (2, 510) para uma segunda câmara (3, 310), compreendendo o dispositivo: uma primeira câmara (2, 510); uma segunda câmara (3, 310); e uma camada (40, 400) barreira entre a primeira câmara (2, 510) e a segunda câmara (3, 310), possuindo a camada (40, 400) barreira, pelo menos, uma abertura que liga de modo fluido a primeira câmara (2, 510) à segunda câmara (3, 310), definindo a, pelo menos uma, abertura (410) um caminho de fluido da primeira câmara (2, 510) para a segunda câmara (3, 310), sendo a, pelo menos uma, abertura (410) dimensionada de modo a que uma força de retenção mantenha o liquido na primeira câmara (2, 510) e na, pelo menos uma, abertura (410), em que, pelo menos, uma parte (20, 200) da segunda câmara (3, 310) é móvel relativamente à camada (40, 400) barreira e em que o liquido pode ser transferido da primeira câmara para a segunda câmara através de um caminho de fluido, quando se introduz uma entrada de iniciação para que a parte da segunda câmara (3, 310) contacte o liquido na, pelo menos uma, abertura (410) . 1
2. Dispositivo da reivindicação 1, em que a força de retenção compreende uma tensão superficial do liquido na, pelo menos uma, abertura (410).
3. Dispositivo da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a segunda câmara (3, 310) possui uma superfície interior e uma superfície exterior, em que, pelo menos, uma parte da superfície interior da segunda câmara é móvel relativamente à camada (40, 400) barreira, e em utilização, a entrada de iniciação compreende uma pressão aplicada na superfície exterior da segunda câmara (3, 310), de modo a que a parte da superfície interior da segunda câmara (3, 310) contacte o líquido na, pelo menos uma, abertura (410) e faça com que o líquido flua através do caminho de fluido para a segunda câmara (3, 310).
4. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dispositivo é uma fita de sensor, a primeira câmara é uma câmara (2, 510) de reacção da fita de sensor, e a segunda câmara é uma câmara (3) de detecção da fita de sensor.
5. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda uma terceira câmara (520); e uma segunda camada (400) barreira entre a segunda câmara (310) e a terceira câmara (520), possuindo a segunda camada (400) barreira, pelo menos, uma abertura (420) que liga de modo fluido a segunda câmara (310) à 2 terceira câmara (520), definindo a, pelo menos uma, abertura (420) um segundo caminho de fluido da segunda câmara (3, 310) para a terceira câmara (520), sendo a, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira dimensionada de modo a que uma segunda força de retenção mantenha o liquido na segunda câmara e na, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira, em que, pelo menos, uma parte (600) da terceira câmara (520) é móvel relativamente à segunda camada (400) barreira, e em que o liquido pode ser transferido entre a segunda câmara (310) e a terceira câmara (520) através do segundo caminho de fluido quando a parte da terceira câmara (520) contacta o líquido na, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira.
6. Dispositivo da reivindicação 5, em que a segunda força de retenção compreende uma tensão superficial do líquido na, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira.
7. Dispositivo da reivindicação 6, em que a terceira câmara (520) possui uma superfície interior e uma superfície exterior, em que, pelo menos, uma parte da superfície interior da terceira câmara (520) é móvel relativamente à segunda camada (400) barreira e a segunda entrada de iniciação compreende uma pressão aplicada na superfície exterior da terceira câmara (520), de modo a que a parte da superfície interior da terceira câmara (520) contacte o líquido na, pelo menos uma, abertura (420) 3 na segunda camada (400) barreira e faça com que o líquido flua através do segundo caminho de fluido na segunda camada (400) barreira para a terceira câmara (520).
8. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 5-7, em que o dispositivo é uma fita de sensor, a primeira câmara (510) é uma câmara de reacção da fita de sensor, a segunda câmara (310) é uma câmara de transferência e reacção da fita de sensor e a terceira câmara (520) é uma câmara de reacção da fita de sensor.
9. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a camada (40) barreira compreende um eléctrodo.
10. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a parte móvel (20) da segunda câmara (3) compreende um eléctrodo.
11. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a primeira câmara (2, 510) e a segunda câmara (3, 310) estão empilhadas.
12. Dispositivo da reivindicação 11, em que a primeira câmara (2, 510) e a segunda câmara (3, 310) estão descentradas.
13. Dispositivo da reivindicação 11, em que a primeira câmara e a segunda câmara estão, pelo menos parcialmente, sobrepostas.
14. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dispositivo é uma fita de análise imunológica descartável. 4
15. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda uma câmara (1, 800) de enchimento, em que o liquido pode ser transferido da câmara (1, 800) de enchimento para a primeira câmara (2, 510) por acção de capilaridade.
16. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a câmara (1, 800) de enchimento possui um volume maior do que a primeira câmara (2, 510).
17. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a fita é formada a partir de uma pluralidade de camadas e sendo a primeira e a segunda câmaras formadas em camadas separadas.
18. Método de transferência de um líquido a partir de uma primeira câmara para uma segunda câmara, compreendendo: proporcionar uma primeira câmara (2, 510); proporcionar uma segunda câmara (3, 310); proporcionar uma camada (40, 400) barreira entre a primeira câmara (2, 510) e a segunda câmara (3, 310), possuindo a camada (40, 400) barreira, pelo menos uma, abertura (410) que liga de modo fluido a primeira câmara (2, 510) à segunda câmara (3, 310), definindo a, pelo menos uma, abertura um caminho de fluido da primeira câmara (2, 510) para a segunda câmara (3, 310), sendo a, pelo menos uma, abertura (410) dimensionada de modo a que uma força de retenção mantenha o líquido na primeira câmara (2, 510) e na, pelo menos uma, abertura (410) na camada (40, 400) barreira; 5 introduzir o liquido na primeira câmara (2, 510) para molhar, pelo menos parcialmente, a camada (40, 400) barreira na, pelo menos uma, abertura (410); e transferir o liquido da primeira câmara (2, 510) para a segunda câmara (3, 310) através do caminho de fluido, em que a transferência se realiza quando se introduz a entrada de iniciação, de modo a que uma parte da segunda câmara (3, 310) contacte o liquido na, pelo menos uma, abertura (410) na camada (40, 400) barreira, e em que a parte da segunda câmara (3, 310) é móvel relativamente à camada (40, 400) barreira.
19. Método da reivindicação 18, em que a força de retenção compreende uma tensão superficial do liquido na, pelo menos uma, abertura (410).
20. Método da reivindicação 19, em que a entrada de iniciação compreende uma pressão aplicada numa superfície exterior da segunda câmara (3, 310), de modo a que uma superfície interior da segunda câmara (3, 310) contacte o líquido em, pelo menos, uma abertura (410) e faça com que o líquido flua através do caminho de fluido para a segunda câmara (3, 310).
21. Método de qualquer uma das reivindicações 18-20, em que a primeira câmara (2, 510) é uma câmara de reacção de uma fita de sensor, 6 e a segunda câmara (3) é uma câmara de detecçao da fita de sensor.
22. Método de qualquer uma das reivindicações 18-21, compreendendo ainda: proporcionar uma terceira câmara (520); proporcionar uma segunda camada (400) barreira entre a segunda câmara (310) e a terceira câmara (520), possuindo a segunda camada (400) barreira, pelo menos uma, abertura (420) que liga de modo fluida a segunda câmara (310) à terceira câmara (520), definindo a, pelo menos uma, abertura um segundo caminho de fluido a partir da segunda câmara (310) para a terceira câmara (520), sendo a, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira dimensionada de modo a que uma segunda força de retenção mantenha o líquido na segunda câmara (310) e na, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira; e transferir o líquido da segunda câmara (310) para a terceira câmara (520) através do segundo caminho de fluido, em que a transferência entre a segunda câmara (310) e a terceira câmara (520) se realiza quando se introduz uma segunda entrada de iniciação, de modo a que uma parte da terceira câmara (520) contacte o líquido na, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira, e em que a parte da terceira câmara (520) é móvel relativamente à segunda camada (400) barreira. 7
23. Método da reivindicação 22, em que a segunda força de retenção compreende uma tensão superficial do liquido na, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira.
24. Método da reivindicação 23, em que a segunda entrada de iniciação compreende uma pressão aplicada numa superfície exterior da terceira câmara (520), de modo a que uma superfície interior da terceira câmara (520) contacte o líquido na, pelo menos uma, abertura (420) na segunda camada (400) barreira e faça com que o líquido flua através do segundo caminho de fluido na segunda camada (400) barreira para a terceira câmara (520).
25. Método de qualquer uma das reivindicações 22-24, em que a primeira câmara (510) é uma câmara de reacção de um fita de sensor, a segunda câmara (310) é uma câmara de transferência e reacção da fita de sensor; e a terceira câmara (520) é uma câmara de reacção da fita de sensor.
26. Método de qualquer uma das reivindicações 18-25, compreendendo: proporcionar uma primeira e uma segunda camada de eléctrodo em cada lado da segunda câmara, e ligar de modo eléctrico a primeira e a segunda camada de eléctrodo a um medidor. 8
27. Método de qualquer uma das reivindicações 18-26, em que a transferência do liquido da primeira câmara para a segunda câmara através do caminho de fluido compreende a deflexão da parte móvel da segunda câmara de modo a contactar o líquido na, pelo menos uma, abertura, extraindo, desse modo, o líquido para a segunda câmara.
28. Método da reivindicação 26 compreendendo ainda a medição de uma propriedade eléctrica da segunda câmara utilizando a primeira e a segunda camada de eléctrodo, de modo a determinar um estado de enchimento da segunda câmara. Lisboa, 30 de Agosto de 2012 9