PT2005182E

PT2005182E - Correlativo clínico

Info

Publication number: PT2005182E
Application number: PT77129237T
Authority: PT
Inventors: Ajit Lalvani; Kerry Millington
Original assignee: Ajit Lalvani
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2013-08-02
Also published as: US20090170120A1; WO2007107714A3; WO2007107714A2; WO2007107714A8; JP5258584B2; JP2009529865A; US8765366B2; AU2007228598A1; DK2005182T3; GB0605474D0; ES2423479T3; EP2005182B1; PL2005182T3; EP2005182A2

Description

1

DESCRIÇÃO "CORRELATIVO CLÍNICO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para a monitorização de infeções por micobactérias, tais como a infeção por Mycobacterium tuberculosis e utiliza kits com tais métodos.

Antecedentes da Invenção Há uma necessidade de marcadores do estado de infeção de um indivíduo. A utilização de tais marcadores permite o tratamento, a prevenção e o controlo da doença em causa. Por exemplo, monitorar o estado de um indivíduo infetado com tuberculose (TB) é essencial para o tratamento, prevenção e controlo da doença ressurgente. A carga de micobactérias não pode ser medida diretamente e não há atualmente qualquer biomarcador que reflita a carga micobacteriana. Além disso, a Mycobacterium tuberculosis é muitas vezes difícil para a cultura a partir de pacientes com TB ativa, e impossível de cultura a partir de pessoas saudáveis com infeção latente. Portanto, um teste de diagnóstico de base imune indicando o estado da infeção por Mycobacterium tuberculosis seria muito útil em vários cenários clínicos que orientam o tratamento, prevenção e controle de infeção. Por exemplo, fazer a diferenciação entre infeção ativa e latente, monitorizar a eficácia da terapia antituberculose de TB ativa e latente, monitorizar a eficácia de vacinas terapêuticas e novos fármacos e detetar uma progressão precoce para a doença ativa. 2

Os antigénios micobacterianos são conhecidos na técnica. Por exemplo, o antigénico precoce alvo-6 (ESAT-6) e proteína 10 de filtrado de cultura (CFP10) são dois antigénios de Mycobacterium tuberculosis, que têm sido intensivamente investigados em modelos animais e em humanos ao longo dos últimos anos. 0 ESAT-6 e o CPF10 são fortes alvos da resposta imunitária celular em modelos animais, pacientes e contactos de tuberculose e assim podem ser utilizados em testes de sangue baseados em células T específicas. Métodos para monitorizar as infeções por micobactérias são conhecidos a partir de Tsukaguchi et al. 1915.

Sumário da Invenção

Os presentes inventores demonstraram que o perfil de segregação IFN-γ e IL-2 derivados das células T se correlaciona com diferentes resultados clínicos de infeção por patogénio intracelular. A divulgação fornece assim um biomarcador imunológico indireto da carga de patogénio intracelular e do estado in vivo que pode ser utilizado para prever, determinar e monitorizar o resultado clínico, bem como monitorizar o efeito de intervenções terapêuticas ou de vacinas sobre a infeção.

Mais particularmente, os inventores demonstraram que o perfil de citoquinas IFN-y/IL-2 de células T CD4 específicas para o antigénio patogénico altera em relação à carga de antigénio. Durante estados de elevada carga de antigénios as células T CD4 específicas do antigénio segregam IFN-γ apenas e IFN-y/IL-2. Durante estados de baixa carga de antigénio, as células T específicas do 3 antigénio, para segregar IFN-γ apenas, segregam predominantemente IFN-y/IL-2 e novamente segregam IL-2 apenas. Essa mudança do perfil de citoquinas foi observado durante a passagem de alta (doença ativa) a baixa (após terapia bem-sucedida) carga de antigénio.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona: - um método para avaliar e/ou monitorizar uma infeção por micobactérias, o referido método compreendendo: (i) o contacto de uma amostra contendo células T a partir do referido indivíduo, com um antigénio micobacteriano; (ii) a deteção de quaisquer células que segreguem IFN-γ e/ou IL-2; (iii) a determinação se a amostra compreende: (a) células que segregam IFN-γ apenas; (b) células que segregam IL-2 apenas; e/ou (c) células que segregam tanto IFN-γ como IL-2, em que o perfil de (a) , (b) e (c) indica o estado da infeção; - a utilização de um kit de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo meios para a deteção de células que segregam IFN-γ, IL-2, ou tanto IFN-Y como IL-2 e um antigénio micobacteriano.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra o perfil de citoquinas de IFN-γ e IL-2, de células T CD4+ em tuberculose ativa e durante e depois da terapia antituberculose. As percentagens apresentadas indicam as proporções relativas das células CD4+ produtoras de IFN-γ 4 e IL-2 na fração enriquecida com níveis de produção de citoquina não específica de fundo subtraídos. As células T CD4+ que segregam IFN-γ e IFN-y/IL-2 específicas de ESAT-6 e CFP-10 codominam na tuberculose ativa, em que a carga bacteriana é alta (A, B) enquanto que as células T que segregam IFN-y/IL-2 apenas predominam durante e após o tratamento que erradicou bacilos viáveis in vivo com a perda de células T CD4+ secretoras apenas de IFN-γ, e o aparecimento de células T CD4+ que segregam IL-2 (C, D). Estes dados foram observados repetidamente em 4 casos de tuberculose ativa e em 9 amostras de acompanhamento de 5 pacientes, 3 meses no tratamento e depois do mesmo. A Figura 2 mostra a proporção e frequência de respostas de células T CD4+ específicas de ESAT-β e CFP-10 a IFN—γ (barras brancas/símbolos), IFN-y/IL-2 (barras cinzentas/símbolos) e IL-2 (barras pretas/símbolos) em TB ativa em comparação com os pontos de tempo de acompanhamento (durante e após o tratamento) . É mostrada a proporção de células T CD4+ específicas de ESAT-6 e CFP-10 secretoras de IFN-γ e/ou IL-2 na fração enriquecida (A) e frequências destas células como determinado após o enriquecimento magnético de células secretoras de IFN-γ e IL-2 (B) . As linhas horizontais indicam a resposta positiva mediana. Os valores de P indicam se há diferença estatística entre TB ativa e acompanhamento. A Figura 3 mostra o perfil de citoquinas de IFN-γ e IL-2 de células T CD4+ na tuberculose autocurada. As 5 PBMCs foram estimuladas com ESAT-6 e CFP-10 e enriquecidas para células secretoras de IFN-γ e IL-2, como para a Figura 1. Células T CD4 + secretoras de IFN-γ, IFN-y/IL-2 e IL-2 foram observadas em participantes autocurados nos quais os bacilos viáveis persistem. A Figura 4 resume os perfis de citoquinas observados em diferentes resultados de infeção por tuberculose. A Figura 5 mostra aplicações potenciais da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos do antigénio de Mycobacterium tuberculosis ESAT-6. A SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos do antigénio de Mycobacterium tuberculosis CPF-10.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção fornece um método de avaliação de uma infeção micobacteriana e/ou monitorização de uma infeção micobacteriana num indivíduo compreendendo a determinação se o indivíduo tem (a) células T que segregam IFN-γ apenas, (b) células T que segregam IL-2 apenas, ou (c), células T que segregam tanto IFN-γ como IL-2, em resposta a um antigénio patogénico intracelular e, opcionalmente, a determinação de qualquer mudança neste perfil de citoquinas. 6 0 agente patogénico intracelular é mycrobacterium. A infeção é uma infeção por micobactérias, tais como Mycobacterium tuberculosis. 0 método pode ser usado para determinar a carga de patogénios, prever o desenvolvimento e/ou a reativação da doença, monitorizar a terapia antipatogénio, avaliar a eficácia de fármacos ou de vacinas antipatogénio ou para determinar se a terapia antipatogénio resulta numa esterilizante. Por exemplo, o método pode ser usado para determinar e/ou monitorizar se um paciente tem uma infeção ativa, infeção latente, infeção ou doença que foi eliminada espontaneamente ou está a ser eliminada, infeção ou doença, que foi eliminada ou está a ser eliminada sem intervenção médica, ou infeção ou doença que foi ou está a ser curada.

Um método da invenção tipicamente compreende: (i) o contacto de uma amostra contendo células T a partir do referido indivíduo, com um antigénio de patogénio intracelular; (ii) a deteção de quaisquer células que segreguem IFN-γ e/ou IL-2; (iii) a determinação se a amostra compreende: (a) células que segregam IFN-γ apenas; (b) células que segregam IL-2 apenas; e (c) células que segregam tanto IFN-γ como IL-2. 0 perfil de (a), (b) e (c) indica o estado da infeção.

Num exemplo, a divulgação providencia um método para determinar a carga de patogénios num indivíduo, em que a presença e/ou a proporção de (a) está positivamente correlacionada com a carga de patogénios e a presença e/ou 7 a proporção de (b) está negativamente correlacionada com a carga de patogénios. 0 indivíduo é tipicamente um mamífero, preferencialmente um ser humano. 0 ser humano pode ter uma infeção por micobactérias ativa ou latente, ou pode ter tido tal infeção recentemente. 0 ser humano pode ter resultados positivos ou negativos num teste de Mantoux. 0 ser humano pode estar em risco de infeção (tal como infeção por micobactérias), tipicamente por razões socioeconómicas ou pode ter uma predisposição genética ou adquirida à infeção. A infeção micobacteriana pode ser causada por qualquer micobactéria. De preferência, a infeção por micobactérias é causada por Mycobacterium tuberculosis. 0 ser humano pode ser um contacto conhecido ou suspeito, que esteve exposto, ou possa ter sido exposto à Mycobacterium tuberculosis . Tipicamente, a exposição é à tuberculose pulmonar, tal como à tuberculose pulmonar "aberta" que é positiva a esfregaço de expetoração AFB (Bacilo Ácido-Resistente) . 0 contacto pode ser alguém cuja exposição é uma casa, local de trabalho (por exemplo, um trabalhador na área da saúde) ou exposição em prisão (tal como um presidiário). A exposição pode ter resultado da residência num país com alta prevalência de TB, e testes de diagnóstico após a emigração para um país com baixa prevalência de TB. Assim, o contacto pode ser um imigrante. 0 ser humano (por exemplo, que tenha uma exposição recente ou remota conhecida ou suspeita) pode ser saudável, pode ter uma coinfeção ou doença crónica ou pode estar a tomar agentes terapêuticos que o coloquem em maior risco de desenvolver TB ativa e/ou que possam tornar a infeção TB mais difícil de diagnosticar. Exemplos incluem os indivíduos infetados pelo HIV, os indivíduos que tomam imunossupressores (por exemplo, corticosteroides, azatioprina e agentes anti-TNF-a, tais como infliximab e terapia do cancro), pacientes de hemodiálise, recetores de transplantes de órgãos, diabéticos e crianças muito jovens (com menos de 5 anos de idade, em particular com menos de 2 anos).

As células T que reconhecem o antigénio no método são geralmente células T que foram pré-sensibilizadas in vivo ao antigénio do agente patogénico. Estas células T experientes em antigénio estão geralmente presentes no sangue periférico de um hospedeiro, que tenha sido exposto ao agente patogénico a uma frequência de 1 em 106 a 1 em 103 células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As células T podem ser células T CD4 e/ou CD8.

No método, as células T podem ser contactadas pelo antigénio in vitro numa amostra do indivíduo.

Em geral, as células T que estão em contacto no método são recolhidas a partir do hospedeiro numa amostra sanguínea, embora outros tipos de amostras que contêm células T possam ser usados. A amostra pode ser adicionada diretamente ao ensaio ou pode ser processada em primeiro lugar. Tipicamente, o processamento pode compreender a diluição da amostra, por exemplo, com água, tampão ou meio. Tipicamente, a amostra é diluída 1,5 a 100 vezes, por exemplo de 2 a 50 ou de 5 a 10 vezes. 9 0 processamento pode compreender a separação de componentes da amostra. Tipicamente, as células mononucleares (MCs) são separadas das amostras. As MCs compreenderão as células T e células apresentadoras de antigénios (APCs). Assim, no método, as APCs presentes nas MCs separadas podem apresentar o péptido às células T. Numa outra forma de realização, somente as células T, tal como apenas células T CD4, podem ser purificadas a partir da amostra. As PBMCs, MCs e células T podem ser separadas da amostra utilizando técnicas conhecidas na arte, tais como as descritas em Lalvani et al (1997) J.Exp. Med. 186, pág. 859-865.

De preferência, as células T utilizadas no ensaio estão na forma de amostras não processadas ou diluídas, foram recentemente isoladas de células T (tal como na forma de MCs ou PBMCs recém-isoladas) que são utilizadas diretamente ex vivo, isto é, não são cultivadas antes de serem utilizadas no método células ou são células descongeladas. No entanto, as células T podem ser cultivadas antes da utilização, por exemplo, na presença do antigénio, e em geral também de citoquinas promotoras de crescimento exógeno. Durante a cultura, o antigénio está tipicamente presente na superfície de APCs, tais como a APC utilizada no método. A pré-cultura das células T pode conduzir a um aumento da sensibilidade do método. Assim, as células T podem ser convertidas em linhas celulares, tais como linhas celulares de curta duração (por exemplo, como descrito em Ota et al (1990) Nature 346, pág. 183-187). A APC, que está normalmente presente no método pode ser proveniente do mesmo hospedeiro que das células T, ou de um hospedeiro diferente. A APC pode ser uma APC de ocorrência natural ou uma APC artificial. A APC é uma célula que é 10 capaz de apresentar o antigénio a uma célula T. É tipicamente uma célula B, célula dendrítica ou macrófago. É tipicamente separada da mesma amostra da célula T e é tipicamente copurifiçada com a célula T. Assim, a APC pode estar presente em MCs ou PBMCs. A APC é tipicamente uma célula recém-isolada ex vivo ou uma célula cultivada. Ela pode estar na forma de uma linha celular, tal como uma linha celular de curta duração ou linha celular imortalizada. A APC pode expressar moléculas vazias de MHC de classe II na sua superfície.

Num exemplo, o antigénio é adicionado a um ensaio compreendendo células T e APCs. Por exemplo, o antigénio pode ser revestido num aspeto interno do recipiente, por exemplo um tubo no qual o sangue é retirado do paciente; em alternativa, o antigénio pode ser adicionado a um recipiente que já contém as células T e as APCs. Como discutido acima , as células T e as APCs em tal ensaio poderiam estar na forma de MCs. Quando um antigénio é utilizado, que possa ser reconhecido pela célula T sem a necessidade de apresentação por APCs, então as APCs não são necessárias. Análogos que imitam o antigénio original ligados a uma molécula de MHC são um exemplo de tal antigénio.

Num exemplo, o antigénio é fornecido à APC na ausência da célula T. A APC é depois fornecida à célula T, tipicamente depois de ter sido permitido apresentar o antigénio na sua superfície. O antigénio pode ter sido recolhido no interior da APC e apresentado, ou simplesmente ter sido tomado sobre a superfície, sem entrar no interior da APC. 11

Tipicamente, IO5 a IO7, de preferência 2,5xl05 a 106 PBMCs são adicionadas a cada ensaio. No caso de o péptido ser adicionado diretamente ao ensaio a sua concentração é de 1CT1 a 10J pg/mL, de preferência de 0,5 a 50 pg/mL ou de 1 a 10 pg/mL.

Tipicamente, o período de tempo durante o qual as células T são incubadas com o antigénio é de 4 a 24 horas (de preferência 5 a 18 horas) para células T efetoras, ou durante mais de 24 horas para as células de memória central. Ao utilizar PBMCs ex vivo verificou-se que 5,OxlO6 PBMCs podem ser incubadas em 10 pg/mL de péptidos durante 5 horas a 37 °C.

Qualquer antigénio adequado pode ser utilizado num método da invenção. Tipicamente, o antigénio é um antigénio de M. tuberculosis ou de micobactérias. 0 antigénio pode estar na forma de uma proteína de ocorrência natural, que é reconhecida por uma célula T. Antigénios de M. tuberculosis adequados incluem o ESAT-6 e CFP-10. As sequências de aminoácidos destes antigénios são mostradas nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respetivamente. O antigénio pode ser um fragmento (tal como um peptídeo) e/ou homólogo de uma proteína de ocorrência natural, que é reconhecida por uma célula T que reconhece a sequência do epítopo de célula T natural. O antigénio pode também ser um análogo que imita o epítopo da proteína de ocorrência natural, ligada a uma molécula de MHC. O IL-2 ou IFN-γ podem ser tipicamente detetados permitindo-lhes ligar-se a um agente de captura específico, que pode ser imobilizado sobre um suporte, como uma placa, grânulo 12 ou a própria célula que segrega a citoquina , e depois medindo a presença do complexo de agente de ligação especifica/IL-2 e/ou o complexo do agente de ligação especifica/IFN-γ tipicamente com um segundo agente de deteção de ligação. Um passo de lavagem pode ser incorporado para remover material que não está especificamente ligado ao agente de captura.

Tipicamente, o segundo agente liga-se ao IFN-γ ou IL-2 num local que é diferente do local onde se liga o primeiro agente. 0 segundo agente pode ser diretamente conjugado com uma enzima tal como fosfatase alcalina, ou um marcador fluorescente, ou pode compreender uma quantidade de biotina a ser detetada por um terceiro agente que compreende estreptavidina, que é diretamente conjugado com um marcador enzimático ou fluorescente. A enzima conjugada depois muda a cor de um reagente. 0 agente é preferivelmente um anticorpo mono- ou policlonal. Os anticorpos para IL-2 e IFN-γ estão disponíveis comercialmente, ou podem ser produzidos utilizando técnicas normalizadas. 0 método preferido utilizado para a deteção de IFN-γ e/ou IL-2 será baseado em imunoensaios tipo sanduíche que detetam a frequência de células secretoras de citoquinas, tais como ELISpot de coloração ou fluorescente, ensaios de diluição limitada, a coloração de citoquinas intracelulares e ensaios de secreção de citoquinas com ou sem enriquecimento de células secretoras de citoquinas tal como foi iniciado pela Miltenyi Biotec. Em alternativa, a quantidade de citoquina segregada pode ser medida por exemplo por um sistema baseado em ELISA tal como o sistema de sangue total Quantiferon® com o anticorpo de captura imobilizado sobre uma placa, e as suas modificações (por 13 exemplo, tal como disponível pela Cellestis) ou tecnologia de matriz de suspensão Luminex® usando kits Beadlyte® com o anticorpo de captura imobilizado num grânulo. A expressão do ARNm de citoquinas pode também ser medida com ensaios tais como RT-PCR.

Num exemplo, o sistema de deteção que é utilizado é o ensaio ex-vivo ELISpot descrito no documento WO 98/23960. Neste ensaio o IFN-γ segregado a partir da célula T está ligado por um primeiro anticorpo específico para IFN-γ que está imobilizado num suporte sólido. O IFN-γ ligado é então detetado utilizando um segundo anticorpo específico para IFN-γ que está marcado com um marcador detetável. Tal anticorpo marcado pode ser obtido a partir de MABTECH (Estocolmo, Suécia). Outros marcadores detetáveis que podem ser utilizados são discutidos abaixo.

Os métodos da invenção permitem a determinação se as células T sensíveis ao antigénio patogénico, que produzem IFN-γ, IL—2, ou tanto IFN-γ como IL-2, estão, cada uma, presentes num indivíduo. As quantidades relativas de cada tipo de célula T sensível ao antigénio podem também ser determinadas. A presença ou ausência de cada tipo de célula T permite que o estado da infeção no indivíduo e/ou a carga micobacteriana sejam determinados. A presença de células que segregam apenas IFN-γ e células que segregam tanto IFN-γ como IL-2, ocorre durante estados de carga elevada de antigénio. Durante estados de baixa carga de antigénios, as células T específicas para o antigénio deixam de segregar IFN-γ apenas, predominantemente segregando tanto IFN-γ como IL-2 e recentemente segregando IL-2 apenas. Assim, as células que 14 segregam IFN-γ apenas estão correlacionadas positivamente com a carga de antigénio e as células secretoras de IFN-Y/IL-2 estão correlacionadas negativamente com a carga de antigénio. 0 perfil dos três tipos de células T sensíveis a antigénios podem ser utilizados para determinar a carga do patogénio no indivíduo.

Sempre que o indivíduo tenha uma infeção latente por micobactérias, mas não demonstre sintomas de doença que avaliem e/ou monitorizem o perfil de células secretoras de IFN-γ, IL-2 e IL-2/IFN-y, permitirá prever o risco de reativação. A presença de células secretoras de IFN-γ apenas ou de IFN-y/IL-2, geralmente indica que o indivíduo tem uma infeção latente, associada com um risco de progressão para a tuberculose ativa. 0 número ou proporção de células secretoras de IFN-γ apenas pode correlacionar-se positivamente com o risco de progressão ou de reativação, que também é fortemente influenciado por vários fatores do hospedeiro, incluindo, por exemplo, mas não limitados a, idade, doença concomitante, coinfeção de HIV, imunossupressão iatrogénica e do quão recente é a infeção. Por outro lado, o número ou a proporção de células secretoras de apenas IL-2, com ou sem a presença de células secretoras de IFN-γ e IL-2, pode correlacionam-se inversamente com o risco de progressão ou de reativação e um número relativamente elevado de células secretoras de IL-2 pode indicar um risco muito baixo de reativação. 0 método pode ser utilizado para monitorizar o progresso de terapia antipatogénio (preferencialmente mycobacterium) na infeção latente ou ativa num indivíduo. Uma diminuição no número de (ou quantidade relativa de) células secretoras de IFN-γ apenas e/ou um aumento no número de (ou quantidade 15 relativa de) células secretoras de IL-2 indica que a terapia é eficaz. Do mesmo modo, um aumento na predominância de células que segregam tanto IFN-γ como IL-2 é uma indicação de que a terapia está a funcionar. 0 método pode ser utilizado para avaliar a eficácia de fármacos ou vacinas antipatogénicos conhecidos ou para testar a eficácia de potenciais novos fármacos ou vacinas antipatogénicos. Num individuo com uma infeção patogénica, uma diminuição no número de (ou quantidade relativa de) células secretoras de IFN-γ apenas e/ou um aumento no número de (ou quantidade relativa de) células secretoras de IL-2 indica que a terapia é eficaz. Do mesmo modo, um aumento na predominância de células que segregam tanto IFN-Y como IL-2 é também uma indicação positiva de eficácia.

No teste de uma vacina, o perfil dos três tipos de células sensíveis a antigénios pode ser examinado após a infeção para determinar a eficácia da vacina. Tipicamente, um perfil associado a baixa carga de patogénios indica que a vacina é eficaz e um perfil associado com alta carga de patogénios é menos promissor.

Assim, o indivíduo testado num método pode ter recebido um fármaco ou vacina antipatogénicos. 0 método pode compreender ainda a comparação do estado da referida infeção com o estado previamente determinado da referida infeção no referido indivíduo, desse modo monitorizando a eficácia do referido fármaco ou vacina antipatogénicos no referido indivíduo.

Em alternativa, o indivíduo pode ter recebido um teste de fármaco ou vacina antipatogénicos. Neste exemplo, o método 16 pode compreender ainda a comparação do estado da referida infeção com o estado previamente determinado da referida infeção no referido indivíduo, desse modo determinando a eficácia do referido fármaco ou vacina de teste. A divulgação também fornece um kit para realizar os métodos da invenção compreendendo meios para a deteção de células que segregam IFN-γ, IL-2, ou tanto IFN-γ como IL-2 em resposta a um antigénio patogénico (de preferência por micobactérias). 0 kit pode incluir, opcionalmente, instruções para correlacionar o perfil de células secretoras de IFN-γ, IL-2 e/ou IFN-γ e IL-2 com o estado de infeção. Por exemplo, as instruções podem ser para correlacionar a deteção de células secretoras de IFN-γ, IL-2 e/ou IFN-γ e IL-2 com a carga de patogénios.

Tipicamente, os meios para detetar o reconhecimento permitem ou auxiliam a deteção com base nas técnicas discutidas acima. Assim, os meios podem permitir a deteção de IFN-γ e IL-2 segregados pelas células T após o reconhecimento. 0 kit pode, assim, incluir adicionalmente um agente de ligação específico para cada um de IFN-γ e IL-2, tal como um anticorpo. 0 agente é tipicamente imobilizado sobre um suporte sólido. Isto significa que, após a ligação do agente, o IFN-γ e/ou IL-2 permanecerão na proximidade da célula T que os segrega. Assim, os "pontos" do complexo IFN-Y/agente e/ou IL-2/agente são formados sobre o suporte, cada ponto representando uma célula T que está a segregar IFN-γ e/ou IL-2. A quantificação dos pontos, e tipicamente a comparação contra um controlo, permite a determinação dos números relativos de células que segregam IFN-γ, IL-2, ou tanto IFN-γ como IL-2. 17 0 kit pode ainda compreender um meio para detetar os complexos ΙΕΝ-γ/agente e/ou IL-2/agente. Uma mudança detetável pode ocorrer no próprio agente após ligação a IFN-γ e/ou IL-2, tal como uma mudança de cor. Em alternativa, um segundo agente marcado, direta ou indiretamente, para a deteção pode ser deixado a ligar ao complexo ΙΕΝ-γ/agente e/ou IL-2/agente para permitir a determinação dos pontos. Como discutido acima, o segundo agente pode ser especifico para o IFN-γ ou IL-2, mas ligar-se num local diferente em IFN-γ ou IL-2 do primeiro agente. 0 suporte imobilizado pode ser uma placa com poços, tal como uma placa de microtitulação. Cada ensaio pode, portanto, ser levado a cabo num poço separado na placa. 0 kit pode compreender adicionalmente um meio para as células T, agentes de deteção ou tampões de lavagem a serem utilizados nos passos de deteção. 0 kit pode compreender adicionalmente reagentes adequados para a separação a partir da amostra, tais como a separação de PBMCs ou células T a partir da amostra. 0 kit pode ser concebido para permitir a deteção das células T diretamente na amostra sem requerer qualquer separação dos componentes da amostra. 0 kit pode também compreender controlos, tais como controlos positivos ou negativos. 0 controlo positivo pode permitir que o sistema de deteção seja testado. Assim, o controlo positivo tipicamente imita o reconhecimento do péptido em qualquer um dos métodos acima mencionados. Tipicamente nos kits concebidos para determinar o reconhecimento in vitro, o controlo positivo é o IFN-γ e/ou IL-2 . 18 0 kit pode ainda compreender um meio para recolher uma amostra contendo células T do ser humano, tal como uma amostra de sangue. 0 kit pode compreender um meio para separar células mononucleares ou células T a partir de uma amostra a partir do indivíduo.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Exemplo 1 Perfil de citoquinas de IFN-γ e IL-2, de células T CD4+ em tuberculose ativa e durante e depois da terapia antituberculose PBMCs congeladas foram estimuladas com grupos de péptidos ESAT-6 ou CFP-10 específicos de M. tuberculosis (15-mers sobrepostos por 10 aminoácidos) durante 5 h a 37 °C. O IFN-γ e IL-2 segregados foram então capturados na superfície da célula secretora, durante 45 minutos a 37 °C, seguido de enriquecimento para células positivas a EFN-γ e IL-2 com os kits de enriquecimento celular de IFN-γ (APC) e IL- 2 (PE) e de deteção de acordo com o fabricante (Miltenyi Biotec, Ltd) . As PBMCs foram manchadas com anticorpos anti-CD4, anti-IFN-γ, anti-IL-2 e anticorpos anti-CD14 conjugados com PerCP, anti-CD19 conjugados com PerCP para excluir os monócitos e células B, respetivamente, e Via-Sonda para excluir células mortas. As parcelas foram fechadas em células Via-Sonda CD4+ CD14- CD19-.

Os resultados são mostrados na Figura 1. As células T CD4+ secretoras de IFN-γ e IFN-y/IL-2 específicas de ESAT-6 e CFP-10 codominavam em indivíduos com tuberculose ativa, nos 19 quais a carga bacteriana é elevada (Figura IA e B) . Em contraste, as células T secretoras de IFN-y/IL-2 predominaram durante e após o tratamento, que erradicou bacilos típicos in vivo, com a perda de células T CD4+ secretoras de IFN-γ apenas, e com o aparecimento de células T CD4+ secretoras de IL-2 (Figura 1C e D) . Estes dados foram observados repetidamente em 4 casos de tuberculose ativa e em 9 amostras de acompanhamento de 5 pacientes, 3 meses no tratamento e depois do mesmo.

Os mesmos resultados são também mostrados na Figura 2, em que são comparadas as proporções relativas e as frequências de células T CD4+ secretoras de IFN-γ, IFN-y/IL-2 e IL-2 específicas de ESAT-6 e CFP-10, entre amostras a partir de pacientes com tuberculose ativa, antes do início do tratamento, com amostras após o início do tratamento. A proporção relativa e também a frequência absoluta de células T CD4+ secretoras de IFN-γ apenas específicas de ESAT-6 e CFP-10, foram mais elevadas na tuberculose ativa não tratada, em comparação com o acompanhamento durante e após o tratamento, enquanto a proporção relativa de células T CD4+ secretoras de IL-2 apenas específicas de ESAT-6 e CFP-10 foram maiores durante o acompanhamento em comparação com a tuberculose ativa não tratada.

Exemplo 2: Perfil de citoquinas de IFN-γ e IL-2 de células T CD4+ na tuberculose autocurada

As PBMCs foram estimuladas com ESAT-6 e CFP-10 e enriquecidas para células secretoras de IFN-γ e IL-2, tal como descrito para a Figura 1. As células T CD4+ secretoras de IFN-γ, IFN-y/IL-2 e IL-2 foram observadas em participantes autocurados nos quais os bacilos viáveis 20 persistem. Os participantes autocurados são um grupo de risco de reativação da doença.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Isis Innovation Limited <12 0> Correlativo Clinico <130> <140> <141> N.97216 SER/SA <1 60> 2 <17 0> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 95 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <4 0 0> 1 21

Met Thr Glu Gin Gin Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15

Ala Ile Gin Gly Asn Vai Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly 20 25 ' 30

Lys Gin Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Glu Ala Tyr Gin· Gly Vai Gin Gin. Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu 50 55 60

Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly 65 70 75 80

Gin Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Vai Thr Gly Met Phe Ala 85 90 95

<210> 2 <211> 100 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2

Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gin Glu Ala Gly 15 10 15

Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gin Ile Asp Gin Vai 20 25 30

Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gin Gly Gin Trp Arg Gly Ala Ala Gly 35 40 45 Thr Ala Ala Gin Ala Ala Vai Vai Arg Phe Gin Glu Ala Ala Asn Lys 50 55 60 Gin Lys Gin Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gin Ala Gly 65 70 75 80 Vai Gin Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gin Gin Gin Ala Leu Ser Ser 85 90 95 Gin Met Gly Phe

Lisboa 100

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para avaliar e/ou monitorizar uma infeção por micobactérias, o referido método compreendendo: (i) o contacto de uma amostra contendo células T a partir do referido indivíduo, com um antigénio micobacteriano; (ii) a deteção de quaisquer células que segreguem IFN-γ e/ou IL-2; (iii) a determinação se a amostra compreende: (a) células que segregam IFN-γ apenas; (b) células que segregam IL-2 apenas; e (c) células que segregam tanto IFN-γ como IL-2, em que o perfil de (a) , (b) e (c) indica o estado da infeção.

2. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido indivíduo recebeu: um fármaco ou vacina que trata a referida infeção; ou um fármaco ou vacina de teste.

3. Um método de acordo com a reivindicação 2, compreendendo ainda a comparação do estado da referida infeção com o estado previamente determinado da referida infeção no referido indivíduo, desse modo: monitorizando a eficácia do referido fármaco ou vacina no referido indivíduo; ou determinando a eficácia do referido fármaco ou vacina de teste.

4. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida infeção é uma infeção por Mycobacterium tuberculosis. 2

5. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido indivíduo tem a doença TB ativa ou infeção tuberculosa latente (ITL).

6. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido indivíduo recuperou da tuberculose (TB), e o referido método compreende ainda a determinação da probabilidade de reativação, em que a probabilidade de reativação está correlacionada positivamente com a carga micobacteriana.

7. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido indivíduo está em risco de contrair a referida infeção.

8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o indivíduo é uma criança pequena e/ou está imunocomprometido.

9. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o método de monitorização é efetuado em vários intervalos de tempo para determinar uma alteração no estado da infeção.

10. Um método de acordo com a reivindicação 9, em que o método de monitorização é realizado pelo menos 3 a 20 vezes, de preferência de 6 a 10 vezes, e/ou é realizado pelo menos a cada 40 dias e/ou pela duração do período de risco de reativação e/ou é realizado para determinar se a tuberculose latente está a tornar-se ativa. 3

11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o antiqénio é ESAT-6 ou CFP-10.

12. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o antigénio é um fragmento ou homólogo de uma proteína de ocorrência natural, que é reconhecida por uma célula T que reconhece uma sequência de epítopos de células T naturais na proteína.

13. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que (a), (b) e (c), são detetados utilizando anticorpos imobilizados contra IFN-γ e IL-2.

14. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo a determinação da carga de patogénio num indivíduo, em que a presença de (a) está positivamente correlacionada com a carga de patogénios, e a presença de (b) está negativamente correlacionada com a carga de patogénios.

15. Utilização de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores de um kit compreendendo: meios para a deteção de células que segregam IFN-γ, IL-2, ou tanto IFN-Y como IL-2; e um antigénio micobacteriano. Lisboa,