PT2016198E - Método para a predição de um risco de reacções adversas a fármacos por meio da determinação de hla-b 1502 - Google Patents
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Description
ΕΡ2016198Β1
DESCRIÇÃO MÉTODO PARA A PREDIÇÃO DE UM RISCO DE REACÇÕES ADVERSAS A FÁRMACOS POR MEIO DA DETERMINAÇÃO DE HLA-B 1502
ANTECEDENTES
Uma reacção adversa a fármacos (RAF) é um efeito indesejado e não intencional de um fármaco.
Particularmente, uma reacção adversa a fármacos ocorre nas doses utilizadas para a profilaxia, o diagnóstico ou a terapêutica. De acordo com uma meta-análise extensamente citada, as RAF foram classificadas entre a quarta e a sexta causas mais comuns de morte (Lazarou et al., JAMA, 279(15): 1200- 1205, 1998). As RAF cutâneas são as responsáveis por aproximadamente 2-3 % de todas as admissões de hospitais (Bigby et al., JAMA, 256(24): 3358-3363, 1986). Elas variam de maculopapular suave (MPE), com uma gravidade crescente, às RAF que ameaçam a vida, tais como a sindrome de hipersensibilidade (SHS), a sindrome de Stevens-Johnson (SSJ) e a necrólise epidérmica tóxica (NET; sindrome de Lyell) . A taxa de mortalidade desta última pode ser tão elevada quanto 40%. A SHS é caracterizada pelos envolvimentos de múltiplos órgãos (por exemplo, hepatite ou nefrite) acompanhados com manifestações sistémicas (por exemplo, febre, artragia, eosinofilia e linfadenopatia) além de rachaduras da pele (Roujeau et al., N. Engl. J. Med., 331: 1272-1285, 1994). A SSJ e NET são distúrbios mediados por imuno-complexos de hipersensibilidade caracterizados pelo desenvolvimento rápido de exantema de empolamento de máculas purpúreas e lesões do tipo alvo acompanhadas com envolvimento de músculos e destacamentos da pele (Roujeau et al., J, Invest, Dermatol, 1994, 102: 218S-30S). São principalmente 1 ΕΡ2016198Β1 ΕΡ2016198Β1 causados por anticonvulsivos, não-esteroidais, Engl. J. Med., anticonvulsivos fenobarbital) e fármacos, tais como sulfonamidas, alopurinol, fármacos anti-inflamatórios e por antimaláricos (Roujeau et al., N. 333 (24) : 1600-1607, 1995) . Em Taiwan, (por exemplo, CBZ, fenitoina e o alopurinol são os fármacos mais comuns que causam SSJ/NET.
Os desenvolvimentos recentes de farmacogenómicos implicaram que a susceptibilidade a RAF está associada a alelos genéticos particulares. Por exemplo, verificou-se que os polimorfismos genómicos de genes de tiopurina metiltransferase estão intimamente relacionados com RAF induzidas por azatioprina, um fármaco para doenças reumatológicas ou o cancro (Yates et al., Ann. Intern. Med., 126(8): 608-614, 1997). Também foi sugerido que a susceptibilidade a SSJ/NET/SHS induzidas por determinados fármacos é determinada geneticamente (Gennis MA, Am. J. Med., 91(6): 631-634, 1991; Edwards SG, Postgrad. Med. J., 75(889): 680-681, 1999). No entanto, os factores genéticos responsáveis exactos têm que ser ainda identificados.
Chung W-H et al, Nature, vol. 428(6982), p. 486, (2004) e documento US-A-2005/100926 ambos revelam que HLA-B1502 está significativamente associado a SSJ/NET induzida por carbamazepina.
Estes estudos farmacogenómicos sugerem que a detecção de alelos associados a RAF num paciente é uma abordagem útil para avaliar se esse paciente está a correr o risco de desenvolver RAF. Este tipo do diagnóstico molecular certificado pelas Clinicai Laboratory Improvement Amendments é oferecido agora por laboratórios de referência nos Estados Unidos e na Europa. 2 ΕΡ2016198Β1
Para determinar a presença de um alelo genético particular, um ou mais nucleótidos específicos alélicos precisam ser detectados. Em muitos casos, regiões múltiplas dentro do alelo devem ser o alvo para obter uma determinação exacta. Por exemplo, os métodos actualmente disponíveis para determinar um alelo de HLA-B (por exemplo, HLA-B*1502 ou HLA-B*5801) requerem a detecção de pelo menos seis regiões dentro desse alelo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta um método de predição do risco de um paciente desenvolver reacções adversas a fármacos, particularmente SSJ, NET ou SHS. Descobriu-se que o HLA-B*1502 está associado a SSJ/ΝΕΤ induzida por uma variedade de fármacos, por exemplo, carbamazepina (CBZ). Além disso, o HLA-B*5801 está associado particularmente a SSJ/ΝΕΤ induzida por alopurinol. 0 HLA-B*5801 também está associado à SHS induzida por alopurinol. Reacções cutâneas mais suaves induzidas por CBZ, tais como rachaduras maculopapulares, eritema multiforme, urticária, e erupção de fármaco fixada, estão associadas particularmente ao HLA-B*4601.
Consequentemente, o presente pedido proporciona um método de avaliação do risco de um paciente de acordo com as reivindicações.
Um alelo genético pode ser detectado pela detecção directa de regiões/nucleótidos dentro do alelo mediante a utilização de ADN genómicos preparados a partir de bioamostras, por exemplo, sangue, saliva, urina ou cabelo. 0 alelo também pode ser detectado, por exemplo, por métodos serológicos ou de microcitotoxicidade. Ele também pode ser determinado ao detectar um marcador genético equivalente do 3 ΕΡ2016198Β1 alelo, que pode ser, por exemplo, um PNS (polimorfismo de nucleótido simples), um marcador de microssatélite ou outros tipos de polimorfismos genéticos. Em outras palavras, a presença do haplotipo de HLA-B*1502, 5801 ou 4601, e não do alelo por si mesmo, é indicativa de um risco para reacções adversas a fármacos. Os marcadores genéticos equivalentes exemplificadores do haplotipo de HLA-B B*1502 incluem DRB1*1202, Cw*0801, Cw*08 06, A*1101, e MICA*019.
Revelado está um método de perfilagem farmacogenómica. Este método inclui a determinação da presença de pelo menos um alelo de HLA-B seleccionado do grupo que consiste em HLA-B*1502, HLA-B*5801 e HLA-B*4601. A presença de pelo menos dois alelos seleccionados do grupo é determinada, tais como HLA-B*1502 e HLA-B*5801 ou a presença de todos os três alelos é determinada. O método pode compreender opcionalmente a determinação de outros factores genéticos. Esses outros factores genéticos podem ser associados à predisposição para qualquer doença ou condição médica, incluindo RAF. Por exemplo, estes outros factores genéticos podem ser seleccionados do grupo que consiste em tiopurina metiltransferase e os genes para a sindrome do QT longo.
Revelado está um método para determinar se um paciente é portador de HLA-B*1502 ou HLA-B*5801. Este método inclui as etapas de: (1) detecção de uma primeira região seleccionada das regiões 1-6 de HLA-B*1502 ou das regiões 1-6 de HLA-B*5801, (2) detecção de uma segunda região seleccionada das regiões 1-6 de HLA-B*1502 ou das regiões 1-6 de HLA-B*5801, em que a segunda região é diferente da primeira região, e (3) determinação se o paciente é portador do alelo de interesse, em que a presença das primeiras e segundas regiões indica que o paciente é portador de HLA-B*1502 ou HLA-B*5801. Estas regiões podem ser detectadas por PCR em Tempo Real ou ensaio de 4 ΕΡ2016198Β1 hibridação de Oligonucleótido Específico de Sequência Competitiva com ELISA (CSSO-ELISA). Num exemplo, a detecção de duas regiões seleccionadas das regiões 1-6 de HLA-B*1502 ou das regiões 1-6 de HLA-B*5801 é suficiente para determinar a presença ou a ausência de HLA-B*1502 ou de HLA-B*58 01. Alternativamente, três ou mais regiões dentro de HLA- B*1502 ou de HLA-B*580 são detectadas. A detecção da região 1, da região 2, e da região 3 de HLA-B*1502 pode ser conseguida, respectivamente, mediante a identificação dos nucleótidos nas posições 1 e 3 dentro da região 1, nas posições 1 e 6 dentro da região 2, e nas posições 1 e 3 dentro da região 3 (incluindo os nucleótidos no cordão de sentido ou então no cordão antissenso nestas posições). A detecção das regiões 1-6 de HLA-B*5801 pode ser conseguida, respectivamente, mediante a identificação dos nucleótidos nas posições 1, 2, e 5 dentro da região 1, nas posições 1, 4, 6, 7, 8, 15, 16, e 20 dentro da região 2, nas posições 2, 4, 5, 8, e 9 dentro da região 3, nas posições 3 e 5 dentro da região 4, nas posições 1 e 9 dentro da região 5, e nas posições 3 e 10 dentro da região 6.
Revelado está um kit para a detecção de um alelo genético, por exemplo, HLA-B*1502 ou HLA-B*5801. Este kit contém uma primeira sonda e uma segunda sonda, cada qual visando uma região seleccionada das regiões 1-6 de HLA-B*1502 ou das regiões 1-6 de HLA- B*5801. As duas sondas visam regiões diferentes. 0 kit também pode incluir uma terceira sonda que vise um alelo de controlo interno. Também pode incluir uma ou mais sondas adicionais para detectar uma ou mais regiões adicionais dentro de HLA-B*1502 ou de HLA-B*5801. 5 ΕΡ2016198Β1
Revelado está ainda um método para determinar se um composto é um candidato que induz uma RAF (por exemplo, SSJ/NET, SHS, ou uma RAF cutânea mais suave) num paciente que é portador de um alelo de HLA (por exemplo, HLA-B*1502, HLA-B*58 01, ou HLA-B*4601) associado à RAF induzida por um fármaco (por exemplo, CBZ, alopurinol ou fenitoina). Este método inclui as etapas de: (1) isolamento de células T de um paciente de RAF que é portador de um alelo de HLA associado à RAF, (2) expansão das células T reactivas à fármaco que induz a RAF, (3) isolamento das células que apresentam antigeno do paciente, (4) colocação das células T expandidas em contacto com um composto na presença de APCs, e (5) examinar se o composto activa as células T expandidas. Um composto que activa as células T é um candidato que induz a RAF num paciente que é portador do mesmo alelo de HLA.
Um paciente tem um "risco" quanto a uma RAF se a probabilidade do paciente desenvolver uma RAF for maior do que a probabilidade da população geral desenvolver RAF. A probabilidade do paciente desenvolver a RAF é pelo menos aproximadamente 1,3 vezes maior, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 2 vezes maior, e ainda mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 vezes maior, e com a máxima mais preferência pelo menos aproximadamente 10 vezes maior quanto à probabilidade da população geral desenvolver a RAF. A probabilidade pode ser determinada por qualquer método conhecido no estado da técnica, tal como ao utilizar a incidência de factores de risco. Por exemplo, um determinado factor de risco está presente em 5 % da população geral. Se este factor estiver actual em 10 % dos pacientes que têm uma RAF, a seguir a probabilidade de um paciente com este factor de risco para desenvolver a RAF é a dobra 2 tão elevada quanto a probabilidade da população geral para desenvolver a RAF. 6 ΕΡ2016198Β1
Um "factor de risco" para uma RAF é um factor que está associado à RAF. A sensibilidade de um factor de risco é preferivelmente de pelo menos aproximadamente 40 %, e mais preferivelmente de pelo menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 % ou 90 %. Ainda mais preferivelmente, a sensibilidade é de pelo menos 95 %. A "sensibilidade" de um factor de risco para predizer uma RAF é a percentagem dos pacientes com RAF que possuem o factor de risco. Em outras palavras, se cada paciente de SSJ tiver o alelo A, a sensibilidade do alelo A para predizer a SSJ é de 100 %. Se 20 entre 40 pacientes de SSJ tiverem o alelo B, então a sensibilidade do alelo B para predizer a SSJ é de 50 %.
Um "marcador genético equivalente" de um alelo de interesse refere-se a um marcador genético que é ligado ao alelo de interesse, isto é, indica um desequilíbrio da ligação com o alelo de interesse. "Perfilagem farmacogenómica" refere-se à determinação dos factores genéticos presentes num indivíduo que estão associados a doenças ou condições médicas, particularmente reacções adversas a fármacos. Tipicamente, um painel de factores genéticos é determinado na perfilagem farmacogenómica, e os factores podem ou não ser associados à mesma doença, condição médica, ou reacção a fármacos.
Os pormenores de uma ou mais implementações da invenção são apresentados na descrição a seguir.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Alguma evidência sugere que a patogénese de várias RAF de múltiplos sistemas similares envolve a apresentação restrita a MHC de um fármaco ou de seus metabólitos, que se ligam directamente às moléculas de MHC ou então se ligam às 7 ΕΡ2016198Β1 proteínas endógenas, e a activação de células T (Svensson et al., Pharmacol. Rev., 53(3):357-379, 2000). Verificou-se que as células T citotóxicas CD8+ T de infiltração na pele são dominantes nas reacções bolhosas tais como SSJ/NET (Hari et al. , Clin. Exp. Allergy, 31(9): 1398-1408, 2001), ao passo que as células T auxiliares CD4+ eram características de RAF cutâneas mais suaves, tal como a erupção maculopapular (Pichler et al., Int, Arch. Allergy Immunol., 113(1-3): 177- 180, 1997).
Verificou-se que HLA-B*1502, HLA-B*5801, e HLA- B*4601 estão associados respectivamente a SSJ/NET induzidas por CBZ, com SSJ/NET/SHS induzidas por alopurinol, e com as RAF cutâneas mais suaves (por exemplo, erupção maculopapular, eritema multiforme, urticária, ou erupção de fármaco fixada) induzidas por CBZ. Desse modo, esses alelos HLA-B são marcadores genéticos úteis para determinar se um paciente está a correr o risco de desenvolver RAF (por exemplo, SSJ, NET, SHS, ou RAF cutâneas mais suaves) induzidas por compostos de CBZ, compostos de alopurinol, ou então por fármacos dos mesmos que têm estruturas similares. CBZ, também conhecido como Tegretol, Tegol, G- 32883, Biston, Calepsin, Carbatrol, Epitol, Finlepsin, Sirtal, Stazepina, Telesmin, ou Timonil, é um anticonvulsivo aromático. Outros anticonvulsivos aromáticos, incluindo a fenitoina (Dilantin) e o fenobarbital, causam RAF similares a CBZ. Portanto, o HLA-B*1502 também pode ser empregado para avaliar o risco de RAF causados por estes outros anticonvulsivos aromáticos. Os anticonvulsivos aromáticos para os quais o HLA-B*1502 pode ser utilizado como um factor de risco também incluem compostos ou metabólitos de CBZ, fenitoina ou fenobarbital. Os metabólitos destes fármacos são conhecidos no estado da técnica (veja-se, por exemplo, Gennis et al., 1991; Leeder, Epilepsia, 39 Suppl. 8 ΕΡ2016198Β1 7: S8-16, 1998; Naisbitt et al., Mol. Pharmacol., 63(3): 732-741, 2003), tal como CBZ-10, 11-epóxido, CBZ-10, 11- diol, CBZ- 2,3-diol, dihidro CBZ, CBZ catecol e CBZ o-quinona, p-hidroxi fenitoina, dihidrodiol fenitoina, catecol fenitoina, metil catecol fenitoina, e o-quinona fenitoina.
Alopurinol é um fármaco para o hiperuricemia e a gota crónica. O Quadro I mostra exemplos de compostos que podem induzir SSJ/NET num portador de HLA-B*1502.
Quadro I. Compostos de fármaco associados à SSJ nos _pacientes com HLA-B* 1502_
Nomes de ingrediente activo ou o Nome Comercial Estruturas do ingrediente activo carbamazepina, Epitol, Tegretol, Microtrol Bipotrol, carbamazepina, carbamazepina, Pharmavene, carbamazepina, Carbatrol, SPD-417 5H-Dibenz [b,f]azepina-5-carboxamida [CAS] Oxcarbazepina, Trileptal GP-47680, GP-47779, GP-47779 MHD, KIN-493, oxacarbazepina, TRI-476, TRI-477, TRI-477 (MHD), Trileptal NP, [CAS] : 5H-Dibenz[b,f]azepina-5-carboxamida, 10,11-dihidro-10-oxo V Λ. licarbazepina BIA-2-093 BIA-2-005 [CAS] : (S)- (-)-10-acetoxi-l0,1l-dihidro-5H-dibenzo/b,f/azepina-5-carboxamida Q ίΛ /,-J "V-N, 9 ΕΡ2016198Β1 modafinil, Sparlon(fármaco de Nova f o Í! Formulação), [CAS] : Acetamida, 2- [(difenilmetil)sulfinil]- i •Γ ^ A presença de HLA-B*5801 num paciente indica que o paciente está a correr o risco de SSJ/NET ou SHS induzida por compostos de alopurinol, ou então compostos estruturalmente similares a alopurinol, ou os metabólitos dos mesmos. 0 Quadro II mostra exemplos dos compostos que podem induzir SSJ/NET ou SHS nos pacientes que são portadores de HLA-B*5801.
Quadro II: Compostos de fármacos associados à SSJ nos pacientes que são portadores de HLA-B* 5801
Nomes Estrutura do ingrediente activo Alopurinol, Aloprim, ziloprim, Apo-Alopurinol, Purinol rVj, Oxipurinol, Oxiprim [CAS] : 1H-Pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6(5H,7H)-diona Õ Febuxostat, TEI-6720, TMX-67 [CAS]: ácido 5-tiazolcarboxílico, 2-[3-ciano-4-(2-metilpropoxi)fenil]-4-metil- V* \ \ O......· ?" " “’v*‘r :: \ ./ ç // x /w ' ~~ ** y~ a" ‘.t Y-700 ácido 1-(3-Ciano-4-neopentiloxifenil)pirazol-4-carboxílico V ..V ^ V1'" v Λ 10 ΕΡ2016198Β1 modafinil, Sparlon (fármaco de Nova Ci i> ' ! >! Formulação), [CAS] : Acetamida, 2- i| .A.*- [(difenilmetil)sulfinil]- A presença de HLA-B*4601 num paciente indica que o paciente está a correr o risco de desenvolver RAF cutâneas suaves, por exemplo, erupção maculopapular, induzida por CBZ.
Outros alelos HLA-B também podem ser predispostos para RAF cutâneas. Por exemplo, a espondilite de ancilose é intensamente associada a os alelos HLA-B27, tais como B*2701-b*2723. (Khan, Curr. Opin. Rheumatol., 12 (4): 235-238, 2000/ Feltkamp et al., Curr. Opin. Rheumatol., 13(4): 285-290, 2001). A presença de um marcador genético (por exemplo, um alelo de HLA) pode ser determinada pela detecção directa desse marcador ou das regiões particulares dentro do mesmo. Os ADN genómicos para a detecção de alelo podem ser preparados a partir de um paciente pelos métodos bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, o sistema de purificação PUREGENE ADN da Gentra Systems, Minnesota. A detecção de uma região dentro de um marcador genético de interesse inclui o exame do(s) nucleótido (s) localizado no cordão de sentido ou de antissenso dentro dessa região. Os métodos conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para detectar uma região particular, por exemplo, a hibridação de oligonucleótidos específicos em sequência, PCR em tempo real, ou CSSO-ELISA (M. Hiratsuka et al, J. of Biochemical and Biophysic. Methods, 67: 87-94, 2006) . A presença de HLA-B*1502 pode ser determinada pela 11 ΕΡ2016198Β1 detecção de pelo menos duas das regiões 1 a 6 mostradas na Figura 1. A presença destas regiões pode ser determinada ao detectar nucleótidos em determinadas posições dentro destas regiões, por exemplo, as posições 1 e 3 na região 1, as posições 1 e 6 na região 2, e as posições 1 e 3 na região 3. A presença de quaisquer duas das regiões 1 a 6 indica que o paciente é um portador de HLA-B*1502. A presença de HLA-B*5801 pode ser determinada ao detectar pelo menos duas das regiões 1 a 6 mostradas na Figura 2. A presença destas regiões pode ser determinada ao detectar os nucleótidos em determinadas posições dentro destas regiões, por exemplo, as posições 1, 2, e 5 na região 1, as posições 1, 4, 6, 7, 8, 15, 16, e 20 na região 2, as posições 2, 4, 5, 8, e 9 na região 3, as posições 3 e 5 na região 4, posições 1 e 9 na região 5, e as posições 3 e 10 na região 6. A presença de quaisquer duas das regiões 1 a 6 indica que o paciente é um portador de HLA-B*5801.
Os produtos do ADN obtidos a partir de PCR podem ser detectados ao utilizar sondas especificas de sequências, por exemplo, sondas de hidrólise da TaqMan, Beacons, Scorpions; ou sondas de hibridação. Estas sondas são projectadas de maneira tal que se ligam às regiões de interesse, por exemplo, as regiões 1 a 6 de HLA-B*1502 ou as regiões 1 a 6 de HLA-B*5801. Os produtos de PCR também podem ser detectados por agentes de ligação de ADN, por exemplo, SIBR® Green. A presença de um alelo de interesse também pode ser determinada ao detectar os marcadores genéticos equivalentes para o alelo. Os marcadores genéticos perto do alelo de interesse tendem a co-segregar, ou mostram um desequilíbrio de ligação, com o alelo. Consequentemente, a presença destes marcadores (marcadores genéticos 12 ΕΡ2016198Β1 equivalentes) é indicativa da presença do alelo de interesse, o que, por sua vez, é indicativo de um risco para o desenvolvimento de RAF. Os marcadores genéticos exemplificadores equivalentes a HLA- B*1502 incluem DRB1*12 02, Cw*0801, Cw*0806, A*1101, e MICA*019. Os marcadores exemplificadores equivalentes a HLA- B*5801 incluem A*3303, Cw*0302, DRB1*0301, e MICA*00201.
Um marcador genético equivalente pode ser de qualquer tipo, por exemplo, um alelo de HLA, um marcador de microssatélite, ou um marcador de polimorfismo de um único nucleótido (PNS). Um marcador genético equivalente útil é normalmente de aproximadamente 200 kb ou menos (por exemplo, 100 kb, 80 kb, 60 kb, 40 kb, ou 20 kb) do alelo de interesse. Os métodos descritos acima ou conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para detectar a presença ou a ausência de um marcador genético equivalente.
Alternativa ou adicionalmente, ARN, ADN, ou os produtos de proteína dos alelos de interesse podem ser detectados para determinar a presença ou a ausência do alelo. Por exemplo, métodos de sorotipificação ou de microcitotoxidade podem ser utilizados para determinar o produto de proteína de um alelo de HLA.
Para aumentar ainda mais a exactidão da predição do risco, o alelo do interesse e/ou o seu marcador genético equivalente pode ser determinado juntamente com os marcadores genéticos das moléculas acessórias e as moléculas co- estimuladoras que estão envolvidas na interacção entre células apresentadoras de antígenos e células T. Estes marcadores genéticos incluem marcadores de microssatélite e marcadores de polimorfismo de um único nucleótido (PNS). As moléculas acessórias e co-estimuladoras incluem as moléculas da superfície da célula 13 ΕΡ2016198Β1 (por exemplo, CD80, CD86, CD28, CD4, CD8, receptor de células T (TCR), ICAM 1, CDlla, CD58, CD2, etc.) e citocinas inflamatórias ou pró-inflamatórias, quimiocinas (por exemplo, TNF-α), e mediadores (por exemplo, complementos, proteínas de apoptose, enzimas, componentes da matriz extracelular, etc.). Também são de interesse os marcadores genéticos de enzimas metabolizadoras de fármacos que são envolvidos no bioactivação ou na detoxificação dos fármacos. Estes marcadores genéticos também incluem os marcadores de microssatélite e de PNS. A enzima metabolizadora de fármaco inclui enzimas da fase I (por exemplo, a superfamília de citocromo P450, etc.) e enzimas da fase II (por exemplo, hidrolase de epóxido microssomal, arilamina N- acetiltransferase, UDP-glucuronosil-transferase, etc.).
Revelado está um método para a perfilagem farmacogenómica. Um painel de factores genéticos é determinado para um determinado indivíduo, e cada factor genético está associado à predisposição para uma doença ou uma condição médica, incluindo RAF. No método, o painel de factores genéticos inclui pelo menos um alelo seleccionado do grupo que consiste em HLA-B*1502, HLA- B*5801 e HLA-B*4601. 0 painel pode incluir dois alelos ou todos os três alelos do grupo. Além de HLA-B*1502, 5801 e/ou 4601, o painel pode incluir quaisquer outros factores genéticos conhecidos, tais como tiopurina metiltransferase e os genes para a síndrome do QT longo. Os marcadores genéticos para moléculas acessórias, moléculas co-estimuladoras e/ou enzimas metabolizadoras de fármacos descritos acima também podem ser incluídos.
Revelado está um kit que contém sonda para detectar marcadores genéticos, por exemplo, HLA-B*1502, HLA-B*5801 ou HLA-B* 4601 . O termo "sonda" aqui utilizado refere-se a 14 ΕΡ2016198Β1 qualquer substância útil para detectar uma outra substância. Desse modo, uma sonda pode ser um oligonucleótido ou um oligonucleótido conjugado que hibridiza especificamente a uma região particular dentro de um alelo de interesse. 0 oligonucleótido conjugado refere-se a um oligonucleótido ligado covalentemente ao cromóforo ou às moléculas que contêm um ligando (por exemplo, um antigeno), que seja altamente especifico a um receptor molecular (por exemplo, um anticorpo especifico para o antigeno). A sonda também ser um iniciador de PCR, juntamente com um outro iniciador, para amplificar uma região particular dentro do alelo de interesse. Além disso, a sonda pode ser um anticorpo que reconheça um alelo de interesse ou um produto de proteína de alelo. Opcionalmente, o kit pode conter uma sonda que vise um alelo de controlo interno, que pode ser qualquer alelo apresentado na população geral, por exemplo GAPDH, β-actina, KIR. A detecção de um alelo de controlo interno é destinada a assegurar o desempenho do kit. 0 kit também pode incluir ferramentas e/ou reagentes para colher amostras biológicas dos pacientes, bem como aquelas para a preparação do ADN genómico, ADNc, ARN ou proteínas das amostras. Por exemplo, os iniciadores de PCR para amplificar as regiões relevantes do ADN genómico podem ser incluídos. 0 kit também pode conter sondas para os factores genéticos úteis na perfilagem farmacogenómica, por exemplo, a tiopurina metiltransferase. 0 kit pode conter uma primeira sonda e uma segunda sonda, cada uma delas para detectar uma região seleccionada das regiões 1 a 6 de HLA-B*1502 ou das regiões 1 a 6 de HLA-B* 5 8 01. A primeira e a segunda sondas visam regiões diferentes. Estas duas sondas podem ser um par de iniciadores de PCR, ou oligonucleótidos etiquetados úteis 15 ΕΡ2016198Β1 em ensaios de hibridação. Opcionalmente, o kit pode incluir uma terceira sonda para detectar um alelo de controlo interno. Ele também pode incluir sondas adicionais para detectar regiões adicionais dentro de HLA-B*1502 ou de HLA- B* 5 8 01.
Revelado está um método de identificação de um composto de fármaco que induz uma RAF (por exemplo, SSJ/NET ou SHS) num paciente que é portador de alelo de HLA associado à RAF (por exemplo, HLA-B*1502, HLA-B*5801 ou HLA-B* 46 01) . Sugere-se que os fármacos podem ser apresentados por determinados complexos de HLA para activar os linfócitos T, induzindo consequentemente as RAF. Sugere-se que as células T reactivas a estes fármacos estão envolvidas no desenvolvimento de RAF induzidas por estes fármacos. Desse modo, os compostos que podem activar estas células T são candidatos para induzir RAF num paciente que é portador de um ou mais alelos HLA associados a estas RAF. Em consequência disto, este método pode ser utilizado como um método de selecção no desenvolvimento de novos fármacos para encontrar os compostos do fármaco que poderiam induzir tais RAF. A genotipificação pode ser executada num paciente de RAF para determinar se o paciente for portador de um alelo de HLA associado à doença. Os linfócitos T e as células apresentadoras de antígenos (por exemplo, células ou monócitos B) podem ser isolados do paciente e cultivados in vitro ao seguir os métodos bem conhecidos no estado da técnica. (Naisbitt DJ, Mol. Pharmacol. 2003 Mar; 63(3): 732- 41, Wu et al, J. Allergy Clin Immunol 2006 Jul; 118(1): 233- 41. E-publicado em 27 de Abril de 2006). As células B isoladas dessa maneira podem ser transformadas pelo vírus de Epstein-Bar para gerar linhas de células B. As células T reactivas a um fármaco podem ser expandidas na 16 ΕΡ2016198Β1 presença do fármaco e de células apresentadoras de antígenos autológos. As célula T expandidas podem então ser expostas a um composto de teste na presença de células apresentadoras de antígenos autológos para determinar se o composto de teste pode activar as célula T. Em caso positivo, o composto de teste é um candidato que pode induzir a RAF num paciente que é portador do mesmo alelo de HLA.
Os exemplos a seguir devem ser interpretados como meramente ilustrativos, e não limitadores do restante da descrição de qualquer maneira. EXEMPLO 1. Detecção de HLA-B*1502 e de HLA-B*5801 Mediante a Utilização de PCR em Tempo Real
Os ADN genómicos foram extraídos do sangue ou da saliva de um paciente. Três pares de iniciadores de PCR de cada uma das regiões 1 e 5, das regiões 1 e 4, ou das regiões 1, 3 e 4 visadas de HLA-B*1502 (veja-se a Figura 1) foram sintetizados. Além disso, um par de iniciadores que visam as regiões 2 e 4 de HLA-B*5801 (veja-se a Figura 2) foi sintetizado. As regiões visadas foram amplificadas e detectadas mediante a utilização do sistema de PCR em Tempo Real SIBR® Green (Applied Biosystem). Resumidamente, os iniciadores, os ADN genómicos e a mistura principal de PCR SIBR® Green (incluída no sistema de PCR em tempo real) foram misturados entre si e a PCR foi executada por: (i) activação da polimerase a 95 °C por dez minutos, (i i) desnaturação a 95 °C por quinze segundos e recozimento/alongamento de cadeias de ADN a 71 °C por um minuto, (iii) execução de 40 ciclos de desnaturação/recozimento/alongamento, e (iv) desassociação do produto amplificado de seu molde a 95 °C por quinze segundos, e a 60 °C por um minuto. A amplificação de PCR de 17 ΕΡ2016198Β1 um receptor parecido com imunoglobulina aniquilador de células (KIR) foi aplicada como um controlo interno. A presença ou a ausência de HLA-B*1502 ou de HLA-B*5801 num paciente foram determinadas com base no valor de Ct de HLA-B*1502 ou de HLA- B*5801 e na diferença dos valores de Ct (valor ACt) entre HLA-B*1502/HLA-B*5801 e KIR. 0 valor de Ct (ciclo limite) é determinado ao identificar o número do ciclo em que a intensidade da emissão de corante repórter está acima do ruido de fundo. 0 ciclo limite é determinado na fase mais exponencial da reacção e é mais confiável do que as medições do ponto final dos produtos acumulados de PCR utilizados por métodos tradicionais de PCR. 0 ciclo limite é inversamente proporcional ao número de cópias do molde alvo, quanto maior o número do molde, mais baixo o ciclo limite medido. 170 amostras de ADN qenómico extraídas de linhas de células B humanas e 35 amostras do ADN genómico preparadas a partir do sangue humano ou da saliva humana foram testadas para detectar a presença de HLA-B*1502 seguindo o método descrito acima. Os valores de Ct de HLA-B*1502 e de KIR estavam no intervalo de 23-27 e de 19-25, respectivamente. Os HLA-B*1502 foram reconhecidos como positivos quando o intervalo ACt entre HLA-B*1502 e KIR era menor do que 7. Nestes 170 de supercontrolo, 15 g de ADN com HLA-B*1502 estavam presentes e foram verificados por kits Dynal SSO, e os resultados indicam que a sensibilidade e a especificidade deste método atingem > 99 %. 170 amostras do ADN genómico extraídas de linhas de células B humanas e 87 amostras do ADN genómico preparadas a partir do sangue humano ou da saliva humana foram testadas para detectar a presença de HLA-B*5801 seguindo o método descrito acima. Para as amostras do ADN derivadas dos pacientes HLA-B*5801 positivos, os valores de Ct de 18 ΕΡ2016198Β1 HLA- B*5801 e KIR estavam no intervalo de 22-28 e de 10-26, respectivamente. Os HLA-B*5801 foram reconhecidos como positivos quando o intervalo de ACt entre HLA-B*5801 e KIR era menor do que 7. Para as amostras do ADN derivadas dos pacientes HLA-B*5801 negativos, o valor de Ct de HLA-B*5801 era de aproximadamente 34 e ACt era maior do que 13. Em todas as amostras, verificou-se que 51 g de ADN 51 eram HLA-B*5801 positivos, e foram verificados por kits Dynal SSO. Estes resultados indicam que a sensibilidade e a especificidade alcançaram > 99 %.
EXEMPLO 2. Detecção de HLA-B*1502 e de HLA-B*5801 Através da Utilização de CSSO-ELISA
Os procedimentos para a execução de CSSO-ELISA são esboçados na Figura 3.
De maneira geral, ao utilizar ADN genómicos como moldes, as PCRs foram executadas para obter os produtos que contêm as regiões especificas mostradas na Figura 1 ou na Figura 2. Tanto o iniciador de avanço quanto o iniciador reverso foram etiquetados com um Ligando 1 (Ll), que podia ser reconhecido pelo Molecular I ligado com uma enzima (por exemplo, HRP) . As reacções de PCR foram projectadas e executadas para obter os produtos que contêm uma ou mais regiões especificas, isto é, as regiões 1 a 6 de HLA-B*1502 ou as regiões 1 a 6 de HLA-B*5801. Os oligonucleótidos específicos de sequência de competição (CSS01 e CSS02) foram projectados. CSS01 reconhece especificamente uma das regiões la 6 de HLA-B*1502 ou das regiões 1 a 6 de HLA-B*5801, e CSS02 foi projectado para ser o iniciador do tipo comum de HLA- B*15 (isto é, alelos não-B*1502 ou não-B*-5801. O CSS01 foi etiquetado com o Ligando 2, que pode ser reconhecido por II Molecular revestido numa placa de reacção ou tira. Os produtos de PCR obtidos desse modo 19 ΕΡ2016198Β1 foram hibridizados com os dois CSSOs na placa de reacção ou numa tira. Após a remoção de qualquer molécula livre por meio de lavagem, o substrato da enzima foi adicionado à placa de reacção. A reacção enzimática, sinalizada pela presença de uma cor, é indicativa da presença de HLA-B*1502 ou de HLA-B*5801. EXEMPLO 3. Correlação entre SSJ/NET induzida por CBZ e HLA-B*1502
Um total de 238 pacientes de RAF (descendentes de Mongoloides ou Mongoloides) foi recrutado do Chang Gung Memorial Hospital ou de diversos outros centros médicos por toda Taiwan para este estudo. Seu histórico de ingestão de fármaco incluindo a dosagem e a duração, e os fenótipos de RAF foram registados. Os critérios de diagnóstico da morfologia clínica foram definidos de acordo com Roujeau, J. Invest Dermatol., 102(6): 28s-30s, 1994. Por exemplo, a SSJ foi definida como o destacamento da pele de menos de 10 % da área da superfície do corpo, sobreposição de SSJ-NET como um destacamento da pele de 10-30 %, e NET como mais de 30 %. A SSJ, a sobreposição de SSJ-NET e NET são colectivamente indicados como SSJ/NET.
Para cada paciente, o fármaco suspeito foi retirado e o paciente observado quanto aos sintomas. Os pacientes que desenvolveram uma RAF cutânea que não cede com a retirada do fármaco foram excluídos.
De acordo com os critérios descritos acima, 112 pacientes foram diagnosticados com SSJ/NET e 126 pacientes tiveram uma reacção mais suave de hipersensibilidade a vários fármacos. Entre os 112 pacientes de SSJ/NET, 42 foram expostos a CBZ (tegretol), 17 tinham ingerido alopurinol, e 53 estavam sob tratamento com medicações com 20 ΕΡ2016198Β1 excepção de CBZ e alopurinol. 73 pacientes tolerantes a tegretol foram incluídos como controlos. Voluntários da população geral da população de Taiwan (n = 94; faixa de idade: 20 a 80 anos) também foram recrutados. O estudo foi aprovado pela junta de revisão institucional, e o consentimento informado foi obtido.
Todos estes pacientes foram submetidos a genotipificação. Resumidamente, os reagentes para executar um ensaio de transferência de linha reversa utilizando oligonucleótido específico de sequência (SSO) foram comprados junto à DYNAL Biotech Ltd. (Bromborough, Reino Unido). Os produtos de PCR foram gerados ao utilizar iniciadores biotinilados para o segundo e o terceiro exões dos loci da classe I ou da classe II de HLA, e então hibridizados a uma transferência de linha de SSO de sondas imobilizadas numa membrana de náilon. A presença de produto de PCR biotinilado ligado a uma sonda específica é detectada ao utilizar a peroxidase de estreptavidina de raiz forte (HRP) e um substrato solúvel cromogénico para produzir uma "linha azul" na posição da sonda positiva. O padrão de reactividade da sonda foi interpretado pelo software de genotipificação Dynal RELI™ SSO (DYNAL Biotech Ltd.; Bromborough, Reino Unido). As ambiguidades potenciais também foram resolvidas pela tipificação com base em sequência e no arranjo em sequência do ADN executados de acordo com o manual técnico do IHWG (International Histocompatibility Working Group), veja-se Genomic Analysis of the Human MHC DNABased Typing for HLA Alleles and Linked Polymorphisms. Mareei G.J. Tilanus, editor chefe, ISBN N° 0-945278-02-0.
Para alguns pacientes, a genotipificação de PNS foi 21 ΕΡ2016198Β1 executada mediante a utilização de espectrometria de massa MALDI-TOF de alto rendimento. Resumidamente, os iniciadores e as sondas foram projectados mediante a utilização do software SpectroDESIGNER (Sequenom, San Diego, CA, EUA). As reacções de cadeia de polimerase multiplex (PCR) foram executadas, os dNTPs não incorporados foram defosforilados mediante a utilização de fosfatase alcalina de camarão (Hoffman-LaRoche, Basel, Suíça), seguido por uma extensão de iniciador. A reacção de extensão de iniciador purificado foi tingida num chip de silício de 384 elementos (SpectroCHIP, Sequenom), analisada mediante a utilização de um espectrómetro de massa Bruker Biflex III MALDI-TOF SpectroREADER (Sequenom) e os espectros processados com SpectroTYPER (Sequenom).
As frequências de alelos nos grupos diferentes foram comparadas pelo método de quadrados de Chi com a correcção de Yates pela construção de quadros de 2 x 2. Os valores de P foram corrigidos para as comparações dos alelos múltiplos de HLA (Pe) pela multiplicação dos valores de P brutos pelo número observado dos alelos HLA presentes dentro dos loci. As relações das probabilidades foram calculadas com modificação de Haldane, o que acrescenta 0,5 a todas as células para acomodar as possíveis contagens iguais a zero.
Conforme mostrado no Quadro 1, um alelo variante de ADN no locus de HLA-B (HLA-B*1502) foi associado nos pacientes com SSJ/NET induzida por fármaco, particularmente nos pacientes que recebem CBZ (tegretol). 22 ΕΡ2016198Β1
Quadro 1. Frequência de HLA-B*1502 em 42 pacientes de _Taiwan que têm SSJ-NET induzida por CBZ_
Alelo Pacientes N=42 Controlosl3 N=142 Controlos2b N=94 Controlos3c N=73 X2 Relação de Probabilidades Pa B*1502 B*1502 42 (100 %) 42 (100 %) 9 (6,3)% 5 (5,3 %) 137,28 110,919 1194,47 1383,2 3, 6x10“3° 2,15xl0~24 B*1502 42 (100 %) 3 (4,1 %) 98,936 1712 9, lxl0"22 a, pacientes que tiveram uma RAF mais suave b, população geral de Taiwan c, pacientes que são tolerantes a CBZ X2, Qui-quadrados com correcção de Yates Pc, calculado ao multiplicar os valores observado dos alelos HLA-B (35). com excepção de SSJ de P brutos pelo número 0 HLA-B*1502 foi detectado em 42 entre 42 (100 %) pacientes de SSJ/NET que receberam CBZ. O alelo também foi encontrado em 17 entre 53 (32 %) pacientes de SSJ/NET que receberam outros fármacos (8 fenitoina, 2 alopurinol, 2 amoxicilina, 1 sulfasalazina, 1 cetoprofeno, 1 ibuprofeno, e 2 fármacos desconhecidos). Particularmente, 8 entre 17 pacientes (47,05 %) que desenvolveram SSJ/NET depois da ingestão de fenitoina também eram portadores do alelo HLA-B*1502. Por outro lado, o alelo foi encontrado somente em 4,1 % (3/73) do grupo tolerante a CBZ, em 0 % (0/32) do grupo tolerante a fenitoina, em 6,3 % (9/142) dos pacientes que tiveram RAF mais suaves com excepção de SSJ, e em 5,3 % (5/94) da população em geral. Através da utilização do grupo tolerante como um controlo, a relação das probabilidades, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, e valor preditivo negativo para B*1502 associados a SSJ/NET induzida por CBZ, foi de 171 %, 100 %, 95, 89 %, 96,0 %, e 100 %, respectivamente. Com um valor preditivo e uma sensibilidade tão elevados, a tipificação deste alelo de HLA-B pode ser utilizada na identificação de pacientes com risco elevado quanto a SSJ/NET induzida por fármaco, particularmente SSJ/NET induzida por CBZ ou fenitoina. 23 ΕΡ2016198Β1
Verificou-se que as RAF suaves induzidas por CBZ estão associadas com um outro alelo, HLA-B*4601. Dez entre dezasseis (62,5 %) dos pacientes com estas reacções mais suaves a CBZ tinham HLA-B*4601. Por outro lado, o alelo foi encontrado somente em 26 % (19/73) do grupo tolerante a CBZ. A relação das probabilidades para RAF cutâneas mais suaves induzidas por CBZ associadas ao B*4601 era de 4,73. Consequentemente, o HLA-B*4601 pode ser utilizado na avaliação de risco para RAF cutâneas suave induzidas por CBZ .
Quadro 2. Dados de Fenótipo/genótipo dos pacientes que têm _RAF cutâneas induzida por CBZ_ ID Fármaco suspeito Fenótipo Genótipo de HLA-B 1 Carbamazepina SSJ B*1502/*3802 2 Carbamazepina SSJ B*1502/B*3501 3 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4006 4 Carbamazepina SSJ B*1502/B*3802 5 Carbamazepina SSJ B*1502/B*3802 6 carbamazepina, fenitoina SSJ B*1502/B*3802 7 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4001 8 Carbamazepina SSJ B*1502/B*3901 9 Carbamazepina SSJ B*1502/B*5801 10 Carbamazepina SSJ B*1502/B*5801 11 Carbamazepina SSJ B*1502/B*1525 12 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4002 13 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4006 14 Carbamazepina SSJ B*1502/B*5801 15 Carbamazepina Sobrepõem-se SSJ/NET B*1301/B*1502 16 Carbamazepina Sobrepõem-se SSJ/NET B*1502/B*3501 17 Carbamazepina SSJ B*1502/B*3802 18 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4601 19 Carbamazepina SSJ B*1301/B*1502 24 ΕΡ2016198Β1 20 Carbamazepina SSJ B*1502/B*5801 21 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4601 22 Carbamazepina, ΑΙΝΕ SSJ B* 15 02 23 Carbamazepina SSJ B*1502/B*3501 24 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4601 25 Carbamazepina SSJ B* 502/B*4601 26 Carbamazepina SSJ B*1502/B*5801 27 Carbamazepina SSJ B*1501/B*1502 28 Carbamazepina SSJ B*1502/B*4001 29 Carbamazepina SSJ B* 15 02 30 carbamazepina, meloxicam, sulidano, fenitoina SSJ B*1502/B*5801 31 Carbamazepina SSJ B*1502/4601 32 Carbamazepina SSJ B*1502/5801 33 Carbamazepina SSJ B*1502/4601 34 Carbamazepina SSJ B*1502/5502 35 Carbamazepina SSJ B* 15 02 36 carbamazepina, fenitoina SSJ B*1502/4002 37 Carbamazepina SSJ B*1502/4001 38 Carbamazepina SSJ B* 15 02 39 carbamazepina, fenitoina SSJ B*1502 40 Carbamazepina Sobrepõem-se SSJ/NET B*1502/4001 41 Carbamazepina Sobrepõem-se SSJ/NET B*1502/4601 42 Carbamazepina SSJ B*1502/3802 43 Carbamazepina erupção maculopapular B*5801/B*4601 44 Carbamazepina eritema multiforme B*400/B*4601 45 Carbamazepina erupção maculopapular B*1301/B*4001 46 Carbamazepina angioedema E B*4601/B*5401 47 Carbamazepina erupção maculopapular B*4001/B*4601 48 Carbamazepina, ΑΙΝΕ erupção maculopapular B*4001/B*4001 49 Carbamazepina erupção maculopapular B*1301/B*5502 50 Carbamazepina inchaço dos lábios, úlcera oral e genital B*4601/B*5801 51 Carbamazepina Maculopapular B*4601/B*5801 25 ΕΡ2016198Β1 52 Carbamazepina angioedema E B*4001 33 Carbamazepina erupção maculopapular B*4001/B*5101 54 Carbamazepina erupção maculopapular B*1301/4001 53 Carbamazepina erupção maculopapular B*4001/B*4601 56 Carbamazepina eritema multiforme B*4601/B*5401 57 Carbamazepina erupção maculopapular B*4601 58 Carbamazepina eritema multiforme B*4601/5101 EXEMPLO 4. Correlação entre SSJ/NET induzida por Alopurinol e HLA-B* 58 01
Verificou-se que o HLA-B*5801 está associado à SSJ/NET induzida por alopurinol. Este alelo de HLA-B foi encontrado em todos os 17 (100 %) pacientes de SSJ/RAF grave tratados com alopurinol (Quadros 3 e 4), mas foram encontradas em somente 18 % da população geral de Taiwan (relação de probabilidades de 155, sensibilidade de 100 %, especificidade de 82 %, valor preditivo positivo de 84,7 %, valor preditivo negativo de 100 %, Pc = 3,7 x 1CT9) . Estes resultados sugerem que o HLA-B*5801 é um marcador genético útil, tanto sozinho quanto em combinação com outros marcadores genéticos, para avaliar se um paciente que ingere alopurinol está a correr o risco de desenvolver SSJ/NET.
Quadro 3. Frequência de HLA-B*5801 em 17 pacientes de Taiwan com RAF cutâneas graves induzidas por alopurinol
Alelo Pacientes Controlosl3 Controlos2b X2 Relação de Pc n=17 n=142 n=94 Probabilidades
B*5801 17 (100%) 26 (18,3%) 47,2 153, 86 2,1X10"1CI B*5801 17 (100%)_17 (18,0%) 41,7_155_3,7X10~9 a, pacientes que tiveram uma RAF com excepção de RAF cutânea induzida por alopurinol b, população geral de Taiwan c, pacientes que são tolerantes a CBZ X2, Chi-quadrados com correcção de Yates Pc, calculado ao multiplicar os valores de P brutos pelo número observado dos alelos HLA-B (35). 26 ΕΡ2016198Β1
Quadro 4. Dados de Fenótipo/genótipo de pacientes com RAF cutâneas induzidas por alopurinol ID do paciente Fármaco suspeito Fenótipo Genótipo de HLA— B 59 alopurinol SSJ B*0705/B*5801 60 alopurinol SSJ B* 4 0 01/B* 5 8 01 61 alopurinol SSJ B*1554/B*5801 62 alopurinol SSJ B*3901/B*5801 63 alopurinol SSJ B*5801 64 alopurinol SSJ B*3901/B*5801 65 alopurinol SSJ B*3901/B*5801 6 6 alopurinol SSJ B* 4 0 01/B* 5 8 01 67 alopurinol SSJ B*1502/B*5801 68 alopurinol SSJ B* 4 0 01/B* 5 8 01 69 alopurinol SSJ e vasculite na perna B*4601/B*5801 70 alopurinol SSJ e liquenóide B*4001/B*5801 71 alopurinol SSJ B*4002/B*5801 72 alopurinol SSJ B*4001/B*5801 73 alopurinol SSJ B*5101/B*5801 74 alopurinol SSJ B*1301/5801 75 alopurinol SSJ B*5801 EXEMPLO 5. Correlação entre HLA-B*5801 e SHS induzida por Alopurinol
Verificou-se também que o HLA-B*5801 está ligado à SHS induzida por alopurinol, que inclui a erupção cutânea (por exemplo, macuopapular difusa, dermatite esfoliativa), febre, eosinofilia, linfócitos circulando atípicos, leucocitose, ferimento hepatocelular agudo, ou piora da função renal (Arellano et al. , Ann. Pharmacoter., 27: 337, 1993). 31 pacientes foram estudados, entre os quais 21 tinham SSJ, 3 tinham, SSJ/NET, 1 tinha NET, e 15 tinham SHS. Em todos os casos registados, o alopurinol foi considerado como o fármaco ofensivo se o aparecimento da síndrome de RAF ocorresse dentro dos primeiros dois meses da exposição 27 ΕΡ2016198Β1 ao alopurinol e os sintomas de RAF desaparecessem com a retirada do fármaco. Os pacientes com qualquer uma das sequintes condições foram excluídos: ausência dos sintomas após a reexposição ao alopurinol, e pacientes com erupções mais suaves da pele que não preencheram os critérios de SHS, SSJ ou NET. 0 aparecimento dos sintomas de SHS para todos os 31 pacientes ocorreu dentro dos dois primeiros meses da exposição ao alopurinol e dois pacientes tiveram um segundo ataque dentro de dois dias da reexposição ao alopurinol. Doze pacientes receberam outro(s) fármaco(s) além do alopurinol, mas seus registos médicos não revelaram nenhuma RAF quando estes medicamentos foram ingeridos concomitantemente sem alopurinol. Todos os pacientes estavam com hiperuricemia e/ou artrite da gota, bem como outras doenças crónicas, incluindo hipertensão (14/31), doença renal crónica (16/31), e diabetes (9/31).
Noventa e oito pacientes de artrite da gota que tinham ingerido alopurinol por pelo menos seis meses (média = 38 meses, intervalo = 6 - 107 meses) sem nenhuma sindrome de RAF foram incluídos como controlo tolerante a alopurinol. A distribuição dos sexos do grupo tolerante é comparável à prevalência geral da gota nas pessoas chinesas. Além disso, 93 indivíduos normais serviram como grupo de controlo normal. As variáveis demográficas destes três grupos são mostradas no Quadro 5. 28 ΕΡ2016198Β1
Quadro 5. Variáveis demográficas, dosagem e duração da exposição ao alopurinol nos pacientes de RAF graves, nos pacientes tolerantes, bem como nos indivíduos normais RAF graves Tolerante Indivíduos (n = 31) (n = 98) normais (n = 93) Sexo Masculino 12 89 52 Feminino 19 9 41 Idade (anos) Média (intervalo) 57,9 (18 - 91) 57,3 (21 - 84) 53,9 (22 - 91) Dosagem de alupurinol (mg/dia) Média (intervalo) 143,3 (50 - 300) 159,2 (100 - 400) Nenhum Duração da exposição a alopurinol Média (intervalo) 28,2 dias 38 meses (6 - 107) Nenhum (1 - 56) 0 alelo HLA-B*5801 estava presente em todos os 31 (100 %) pacientes com RAF graves induzidas por alopurinol, em 16 (16,3 %) dos 98 pacientes tolerantes a alopurinol (relação de probabilidades de 315 Pc < 10”15), e em 19 (20 %) dos 93 indivíduos normais (relação de probabilidades de 241, Pc < 10”13) . Em relação ao grupo tolerante a alopurinol, a ausência de HLA-B*5801 teve um valor preditivo negativo de 100 % para as RAF induzidas por alopurinol, e a presença deste alelo teve um valor preditivo positivo de 66 %.
Consequentemente, o HLA-B*5801 é um marcador útil com elevada especificidade (84 %) e sensibilidade (100 %) para RAF graves induzidas por alopurinol, incluindo RAF cutâneas (por exemplo, SSJ/NET ou SHS) e DRESS (reacção a fármaco com eosinofilia e sintomas sistémicos) induzida por alopurinol. EXEMPLO 6. Marcadores genéticos equivalentes a HLA- B*1502 ou a HLA-B*5801
Os marcadores genéticos perto de um alelo de HLA de interesse tendem a co-segregar, ou mostram um desequilíbrio 29 ΕΡ2016198Β1 de ligação, com o alelo de interesse. Em consequência disto, a presença destes marcadores (marcadores genéticos equivalentes) é indicativa da presença do alelo.
Para testar a incidência de marcadores genéticos equivalentes potenciais nos pacientes com RAF, diversos marcadores no haplotipo HLA-B*1502 foram determinados para a sua associação com RAF. Certamente que os marcadores de HLA do haplotipo HLA-B*15 02, tais como DRB1*1202, Cw*0801, Cw*0806, A*1101, e MICA*019, tiveram uma frequência significativamente alta nos pacientes de SSJ/NET que tinham sido expostos a CBZ (Quadro 6).
Os marcadores associados ao HLA-B*5801 também foram determinados. A distribuição de alelo foi analisada em quatro pacientes que eram homozigóticos para HLA-B*5801 e o haplotipo ancestral deste alelo foi definido como incluindo HLA-A*3303, Cw*0302, B*5801 e DRB1*0301. Este haplotipo ancestral foi apresentado em 12 (38,7 %) dos 31 pacientes das RAF de alopurinol (Quadro 7), mas somente em 7,1 % dos pacientes tolerantes e em 9,7 % dos indivíduos normais.
Quadro 6. Correlação entre marcadores de haplotipos ancestrais de B*1502 e RAF CBZ SSJ/NET (n = 42) CBZ mais suave (n = 16) Tolerante a CBZ (n = 73) Alopurinol SSJ/NET (n = 17) População geral (n = 94) HLA-B*1502 42 (100 %) 0(0%) 3 (4,1 %) 1 (5,8 %) 5 (5,3 %) HLA-Cw* 0 8 01 38 (90 %) ND 10 (13,7 %) 2 (11,7 %) 10 (10,6 %) HLA-Cw* 0 8 0 6 3 (7,1 %) ND 0(0%) 0(0%) 0 (0 %) HLA-A*1101 31 (73,8 %) ND ND ND 28 (29,8 %) HLA-DRB1* 12 01 35 (83,3 %) ND ND ND 19 (20,2 %) 30 ΕΡ2016198Β1
Quadro 7. Frequências de locus individuais ou combinados de haplotipo ancestral HLA-B*5801 em pacientes com RAF graves induzidas por alopurinol, em pacientes tolerantes a _alopurinol, e em indivíduos normais_
Alopurinol-(n = 31) RAF Tolerante a alupurinol (n = 98) Indivíduos normais (n = 93) B*5801 31 (100 %) 16 (16,3 %)1 19 (20,4 %) 2 Cw*0,302 29 (93,5 %) 1,5 (17,3 %) 19 (20,4 %) A*3303 20 (64,5 %) 18 (18,4 %) 20 (21,5 %) DRBI* 0301 21 (67,7 %) 14 (14,3 %) 14 (15,1 %) B*5801, Cw*0302 29 (93,5 %) 15 (15,3 %) 19 (20,4 %) B*5801, Cw*0302, 20 (64,5 %) 13 (13,3 %) 16 (17,2 %) A*3303 B*5801, Cw*0302, 19 (61,3 %) 9 (9,2 %) 10 (10,8 %) DRB1*0301 B*5801, Cw*0302, 12 (38,7 %) 7 (7,1 %) 9 (9,7 % A*3303, DRB1*0301 1 Relação de Probabilidades (Alopurinol-RAF/Tolerante): 315 (95 o "o Cl, 18,3-5409,5), pc = 7,5 x 10~16. 2 Relação de Probabilidades (Alopurinol-RAF/Normal) 241 (95 o "O Cl, 14,1-4111), Po = 6, 1 x 10~13.
Os marcadores de MHC associados ao HLA-B*5801 também foram determinados mediante a utilização do ensaio de polimorfismo de repetição em tandem curto (PRTC). Resumidamente, vinte marcadores satélites altamente polimórficos localizados na região de MHC foram seleccionados do banco de dados NCBI (isto é, D6S258, D6S2972, D6S510, D6S265, D6S388, D6S2814, HLAC_CA1, HLABC_CA2, MIB, MICA, TNFd, BAT2_CA, D6S273, D6S1615, DQCAR, G51152, D6S2414, D6S1867, D6S1560, e D6S1583). A heterozigosidade média destes marcadores era de 0,72 com um espaçamento estimado de 230 kb.
Os iniciadores foram projectados com base nas sequências destes marcadores descritos no banco de dados. As PCRs foram executadas para amplificar e detectar a presença ou a ausência destes marcadores nos pacientes 31 ΕΡ2016198Β1 mediante a utilização de termociclos GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) (num volume de 5 μΐ que contém 10 ng de ADN genómico e 0,33 μΜ de cada iniciador). Até seis produtos de PCR que têm tamanhos apropriados e que exibem sinais fluorescentes foram agrupados antes da electroforese com gel capilar. O tamanho dos amplicões polimórficos foi determinado pela electroforese do sequenciador de ADN ABI 3730 (Applied Biosystems), mediante a utilização do padrão de tamanho LIZ500 como um padrão de tamanho interno (Applied Biosystems). O dimensionamento dos alelos foi calculado mediante a utilização da versão 3.0 do programa GENMAPPER (Applied Biosystems). A chamada e o depósito dos alelos foram executados mediante a utilização do programa SAS. Três indivíduos do controlo CEPH (1331-01, 1331-02, 1347-2) e H20 foram incluídos em todas as experiências de genotipificação para finalidades do controlo de qualidade.
Um bloco de alelos localizado entre HLA-C e TNFd foi encontrado no grupo de pacientes de RAF induzida por alopurinol, mas não no grupo tolerante a alopurinol, mediante a utilização de um gráfico de desequilíbrio de ligação. Neste bloco, um haplotipo (MIB*358-MICA*206-TNFd*140) perto do alelo de HLA-B foi identificado. A associação deste haplotipo com as RAF é consistente com a associação de HLA-B*5801 com as mesmas RAF (p = 0,0018). Ao utilizar marcadores de PRTC e o arranjo em sequência do alelo de MICA, verificou-se que todos os pacientes de RAF induzida por alopurinol são portadores do mesmo alelo de B (B*5801), o alelo de MICA (MICA*00201) e o marcador de TNF PRTC (TNFd*14 0).Com excepção de um paciente, verificou-se que todos os outros também são portadores do mesmo marcador de MIB (MIB*358). 32 ΕΡ2016198Β1 EXEMPLO 7. Reactividade Cruzada de Células T Reactivas a CBZ, a Oxcarbazepina e a Licarbazepina
Dois pacientes que têm SSJ/NET induzidas por CBZ foram recrutados no Chang Gung Memorial Hospital. Um dos pacientes era portador de HLA-B*1502/b*4601, e o outro de HLA-B*1502/b*5101. Os ADN genómicos foram extraídos dos pacientes mediante a utilização do sistema de purificação do ADN PUREGENE (Gentra Systems, Minnesota, EUA). Os alelos HLA-B foram verificados mediante a utilização de transferências de linhas reversas de oligonucleótidos específicos de sequência (DYNAL Biotech Ltd., Bromborough, Reino Unido).
As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram isoladas dos pacientes através de centrifugação do gradiente de densidade Ficoll-Isopaque (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) . Uma parte das CMSP foi transformada pelo vírus de Epstein-Bar para estabelecer linhas de células B autolólogas.
As células T reactivas a CBZ foram expandidas tal como descrito abaixo. As CMSP preparadas dos pacientes foram cultivadas num meio RPMI completo que contém 10 % de soro humano desactivado por calor, IL-2 (25 U/ml) , e CBZ (25 (pg/ml) (Sigma) numa incubadora a 5 % de C02 a 37 °C por sete dias. As células T foram expandidas então através do co-cultivo com células B autólogas irradiadas (50 Gy) na presença de CBZ por dez dias. Após dois ciclos do procedimento de co-cultivo acima, as células T activadas por CBZ foram colhidas e submetidas aos ensaios ELISPOT (eBioscience).
As células T reactivas a CBZ foram testadas quanto à sua reactividade cruzada compostos, por exemplo, CBZ 10, 33 ΕΡ2016198Β1 11- epóxido, Oxcarbazepina (marca: trileptal),
Licarbazepina, e sunlindac. Resumidamente, os linfócitos T (5 x 103 células) foram misturados com as células B autológas (5 x 104 células) em 200 μΐ do meio RPMI que contém 10 % de FBS na presença ou na ausência de um composto de teste. As células foram então incubadas por 24 horas nas cavidades de uma placa de ELISPOT revestida com anticorpos anti-interferão γ (Millipore). Após a incubação, o sobrenadante da cultura de células foi colhido e o interferão γ nele contido foi detectado ao utilizar os métodos mediados por anticorpo conhecidos no estado da técnica.
Os resultados deste estudo indicam que as células T reactivas a CBZ eram retro-reactivas a CBZ 10, 11-epóxido, Oxcarbazepina, e Licarbazepina, mas não a Sulindac.
Lisboa, 23 de Julho de 2013 34
Claims (9)
- ΕΡ2016198Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de avaliação de um risco de um paciente humano para desenvolver uma reacção adversa a fármacos em resposta a um fármaco, que compreende detectar a presença de HLA-B* 1502 numa amostra obtida do paciente, e correlacionar a presença de HLA-B* 1502 na amostra com um risco aumentado para uma reacção adversa a fármacos no paciente em resposta ao fármaco, em que a reacção adversa a fármacos é sindrome de Stevens-Johnson ou necrólise epidérmica tóxica e o fármaco é oxcarbazepina ou licarbazepina.
- 2. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o fármaco é oxcarbazepina.
- 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o fármaco é licarbazepina.
- 4. 0 método de qualquer das reivindicações 1-3, em que a amostra obtida do paciente é uma amostra de ADN.
- 5. 0 método de qualquer das reivindicações 1-4, em que a presença do alelo HLA é determinada por meio da hibridação com um oligonucleótido que híbrida especificamente com o alelo.
- 6. 0 método de qualquer das reivindicações 1-3, em que a amostra obtida do paciente é uma amostra de ARN ou uma amostra de proteína.
- 7. 0 método de qualquer das reivindicações 1-5, em que a 1 ΕΡ2016198Β1 amostra é obtida de sangue periférico, saliva, urina, cabelo do paciente.
- 8. 0 método de qualquer das reivindicações 1-7, em que reacção adversa a fármacos é sindrome de Stevens-Johnson.
- 9. 0 método de qualquer das reivindicações 1-8, em que reacção adversa a fármacos é necrólise epidérmica tóxica. ou a a Lisboa, 23 de Julho de 2013 2
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