PT2084162E - Triazoles bicíclicos como moduladores de proteína quinase - Google Patents

Description

ΡΕ2084162 1

DESCRIÇÃO "TRIAZOLES BICÍCLICOS COMO MODULADORES DE PROTEÍNA QUINASE" 0 presente fascículo diz respeito a moduladores de proteína quinase que são triazoles bicíclicos, a composições farmacêuticas que os contenham, e a métodos de fabricar e de utilizar estes compostos e estas composições para tratar doenças mediadas pela actividade da quinase.

As proteína quinases de mamíferos são reguladores importantes das funções celulares. Uma vez que as disfunções da actividade das proteína quinases têm sido associadas a diversas doenças e patologias, as proteína quinases são alvos importantes para o desenvolvimento de fármacos. A família da tirosina quinase, e em especial o subconjunto de tirosina quinases receptoras, está enriquecido com alvos provados e putativos nos cancros. As proteína quinases receptoras (RTK) tais como as EGFR, HER2, KIT e KDR são proteínas bem caracterizadas com um papel bem estabelecido no cancro. Os fármacos que alvejam estas RTK, tais como Gleevec, Iressa, e Tarceva, têm sido aprovados para o tratamento de determinados cancros. Outras RTK estão menos bem caracterizadas mas também têm sido implicadas no cancro. Por exemplo, dados emergentes sugerem que os inibidores de TRKC, ROS, CSFIR/FMS e de ALK podem ser úteis no tratamento do cancro. MET e RON são dois alvos 2 ΡΕ2084162 especialmente atractivos para o desenvolvimento de novos agentes para o tratamento do cancro. 0 factor de crescimento de hepatócitos (HGF), também conhecido como factor de dispersão, é um factor de crescimento multifuncional que incrementa a transformação e o desenvolvimento de tumores por induzir a mitogénese e a mobilidade celular. Além disto, o HGF promove as metástases por estimular a mobilidade e a invasão celulares através de diversos caminhos de sinalização. Para produzir efeitos celulares, o HGF tem que se ligar ao seu receptor, MET, uma tirosina quinase receptora. MET, uma proteina heterodimé-rica largamente expressa, incluindo uma subunidade cx com 50 kilo Dalton (kDa) e uma subunidade β com 145 kDa (Maggiora et al., J. Cell Physiol., 173: 183-186, 1997), está sobre-expressa numa percentagem significativa dos cancros humanos e é amplificada durante a transição entre os tumores primários e as metástases. Incluem-se nos diversos cancros nos quais está envolvida uma sobre-expressão de MET, sem que eles se limitem a estes, o adenocarcinoma gástrico, o cancro renal, o carcinoma pulmonar de células pequenas, o cancro da próstata, o cancro cerebral, o cancro hepático, o cancro pancreático, e o cancro da mama. O MET também está implicado na aterosclerose e na fibrose pulmonar.

Identificou-se MET inicialmente como sendo uma transposição de transformação de ADN (TPR-MET) numa linha de células de osteossarcoma humano que havia sido tratada com N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina (Cooper, et al. 3 ΡΕ2084162 1984). A tirosina quinase receptora MET (também conhecida como receptor de factor de crescimento de hepatócitos, HGFR, MET ou c-Met) e o seu ligando factor de crescimento de hepatócitos ("HGF") têm numerosas actividades biológicas, incluindo a estimulação da proliferação, da sobrevivência, da diferenciação e da morfogénese, da tubulogénese ramificante, da mobilidade celular e do crescimento invasivo. Do ponto de vista patológico, a MET tem sido implicada no crescimento, na invasão e na metástase de muitas formas diferentes de cancro, incluindo o cancro renal, o cancro gástrico, o cancro do pulmão, o cancro dos ovários, o cancro hepático e o cancro da mama. Foram detectadas alterações somáticas, activantes, da MET em metástases de carcinoma humano e em cancros esporádicos tais como o cancro renal de células papilares. Também existem dados de que o caminho de sinalização da MET pode desempenhar um papel importante na resistência às terapias do cancro. Por exemplo, o gene da MET foi encontrado amplificado em pacientes de cancro pulmonar com recaida após uma reacção inicial a inibidores de EGFR tais como gefitinib e erlotininb. Além do cancro existem dados comprovando que a inibição da MET pode ser valiosa no tratamento de várias indicações, incluindo: invasão por Listeria, osteólise associada ao mieloma múltiplo, infecção com malaria, retinopatias diabéticas, psoriase, e artrite. As mutações da sequência de codificação da MET são relativamente rara em cancro humanos. No entanto, com base no precedente da selecção de mutações BCR-ABL em pacientes com leucemia mielogenosa crónica tratados com imatinib e 4 ΡΕ2084162 das mutações de EGFR em pacientes com cancro tratados com erlotinib e gefitinib, prevê-se que estas e/ou talvez mutações adicionais de MET que possam conferir resistência a fármacos se tornem cada vez mais prevalentes caso se passem a utilizar largamente os inibidores da MET no cancro. Portanto, os fármacos que de facto inibem algumas destas mutações da MET poderão tornar-se em ferramentas muito importantes em futuras terapias do cancro. A MET está intimamente relacionada com um grupo de cinco tirosina quinases receptoras que não têm sido tão bem estudadas como a MET ela própria. Nestas incluem-se Tyro3/Sky, MER, AXL, RYK e RON. A tirosina quinase RON é o receptor para a proteína estimulante dos macrófagos e é a mais proximamente relacionada com a MET, pertencendo à família de tirosina quinases receptoras da MET. Tal como a MET, a RON está implicada no crescimento, na invasão e na metástase de diversas formas diferentes de cancro, incluindo o cancro colo-rectal e o cancro da bexiga. Também existem dados mostrando que a AXL e a MER desreguladas podem desempenhar papéis importantes no cancro. A MER apresenta muitas propriedades consistentes com uma actividade de oncogene. Os murganhos transgénicos que expressam MER ma sua linhagem hematopoiética desenvolvem sintomas semelhantes aos de leucemia linfoblástica/linforna de células T, e que são expressos na maior parte dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) . Estudos em modelos em murganhos sugerem que a AXL é importante para o crescimento do cancro da mama em que a 5 ΡΕ2084162 AXL parece regular tanto processos angiogénicos como tumorigénicos. Estudos adicionais com linhas de células de cancro humano sugerem que a AXL se encontra envolvida nas metástases NSCLC e na resistência a fármacos. Embora se saiba muito pouco acerca dos papéis normais e patológicos da Tyro3/Sky, esta tirosina quinase receptora partilha determinadas propriedades e funções com as suas parentes mais bem estudadas, e também pode eventualmente provar ter um papel importante no cancro. A RYK também é expressa em alguns cancros, mas é uma tirosina quinase receptora órfã atípica que não apresenta actividade detectável como tirosina quinase e portanto é ainda incerto que possa ser considerada como um alvo nas terapêuticas de cancros devidos a pequenas moléculas.

Os WO 02/083139 e WO 02/083675 dizem respeito a compostos de triazolo[4,3 —b]piridazina para o tratamento do cancro.

Atento o facto de as quinases haverem sido implicadas em numerosas doenças e estados, tais como o cancro, existe uma necessidade de se desenvolverem novos e potentes inibidores de proteína quinases que se possam utilizar em tratamentos. A invenção presente cumpre estas e outras necessidades da técnica. Embora certas proteína quinases sejam especificamente apontadas neste documento, a invenção presente não se limita a inibidores destas proteína quinases, e inclui no seu âmbito inibidores de ΡΕ2084162 proteína quinases relacionadas com estas, e inibidores de proteínas homólogas.

Verificou-se que os compostos de triazole biciclico do presente fascículo podem ser utilizados para modular a actividade de quinases e para tratar doenças mediadas pela actividade de quinases. Em especial, os compostos do presente fascículo podem ser utilizados para modular e/ou para inibir tirosina quinases, incluindo a MET. Além disto, os compostos do presente fascículo podem ser utilizados para diminuir ou para inibir a actividade de quinase da MET numa célula ou num sujeito, e para modular a expressão de MET numa célula ou num sujeito. Os compostos descritos também são úteis para evitar ou para tratar num sujeito uma patologia proliferativa de células e/ou patologias relacionadas com a MET. Os moduladores descritos, triazoles biciclicos, são descritos em pormenor adiante. Além disto, são descritas neste documento as actividades inibidoras de compostos seleccionados.

Num aspecto, o fascículo proporciona compostos com a fórmula kA/ / '"\,- % /

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Noutros aspectos, o fascículo relaciona-se com métodos para modular a actividade das proteína quinases; com métodos para tratar o cancro, com composições farmacêuticas e métodos para se preparar e para se utilizar um composto com a fórmula I. A Figura 1 ilustra a diminuição do volume médio tumoral após a administração de um composto 4, em comparação com o volume médio tumoral no grupo tratado com veículo. A Figura 2 ilustra a inibição do crescimento tumoral (TGI) após a administração de um composto 4, em comparação com o volume médio tumoral no grupo tratado com veículo. A Figura 3 ilustra a diminuição da massa tumoral, após a administração de um composto 4, em comparação com o volume médio tumoral no grupo tratado com veículo. A Figura 4 ilustra a diminuição do volume tumoral 11 ΡΕ2084162 médio após a administração de um composto 41, em comparação com o volume médio tumoral no grupo tratado com veiculo. A Figura 5 ilustra a inibição do crescimento tumoral (TGI) após a administração de um composto 41, em comparação com o volume médio tumoral no grupo tratado com veiculo. A Figura 6 ilustra a diminuição da massa tumoral, após a administração de um composto 41, em comparação com o volume médio tumoral no grupo tratado com veiculo.

Aa abreviaturas utilizadas neste documento têm os seus significados habituais nas técnicas quimicas e biológicas.

Os compostos do presente fascículo podem existir como sais. 0 presente fascículo inclui esses sais. Incluem-se nos exemplos das formas salinas aplicáveis os clori-dratos, bromidratos, sulfatos, metanossulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartaratos (por exemplo (+)-tartaratos, (-)-tartaratos ou as suas misturas incluindo misturas racémicas, succinatos, benzoatos e sais com aminoácidos tais como o ácido glutâmico. Podem preparar-se estes sais por métodos que são conhecidos dos especialistas da técnica. Também se incluem os sais de adição a bases tais como os de sódio, potássio, cálcio, amónio, aminas orgânicas ou, ou sais semelhantes. Quando os ΡΕ2084162 compostos do presente fascículo contiverem funcionalidades relativamente básicas, podem obter-se sais de adição a ácidos levando ao contacto a forma neutra desses compostos com uma quantidade suficiente do ácido pretendido, quer por si só, quer num solvente inerte adequado. Incluem-se nos exemplos de sais de adição a ácidos aceitáveis os derivados de ácidos inorgânicos tais como os ácidos, clorídrico, bromídrico, nítrico, carbónico, mono-hidrogenocarbónico, fosfórico, mono-hidrogenofosfórico, di-hidrogenofosfórico, sulfúrico, mono-hidrogeno-sulfúrico, iodídrico, ou fosfo-roso e outros semelhantes, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos tais como os ácidos acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzóico, succínico, subé-rico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, benzenossul-fónico, p-toluílsulfónico, cítrico, tartárico, metanos-sulfónico, e outros semelhantes, também se incluem sais com aminoácidos, tais como o arginato e outros semelhantes, e sais com ácidos orgânicos tais como os ácidos glucurónico ou galacturónico e outros semelhantes. Alguns compostos específicos do presente fascículo contêm funcionalidades tanto ácidas como básicas, que permitem transformar os compostos quer em sais de adição com bases, quer com ácidos.

As formas neutras dos compostos são preferivelmente regeneradas levando o sal ao contacto com uma base ou com um ácido e isolando o composto de origem de um modo convencional. A forma de origem do composto difere das 13 ΡΕ2084162 diversas formas salinas em determinadas propriedades físicas, tais como a solubilidade em solventes polares.

Determinados compostos do presente fascículo podem existir sob forma não solvatada bem como sob formas solvatadas, incluindo formas hidratadas. Em geral, as formas solvatadas são equivalentes a formas não solvatadas e estão incluídas no âmbito do presente fascículo.

Determinados compostos do presente fascículo podem existir sob múltiplas formas cristalinas ou amorfas. Em geral, todas as formas físicas são equivalentes para as utilizações contempladas pelo presente fascículo e pretende-se que se considerem adentro do âmbito do presente fascículo.

Alguns compostos do presente fascículo possuem átomos de carbono assimétricos (centros ópticos) ou ligações duplas; os enantiómeros, racematos, diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos, formas estereoisoméricas que possam ser definidos, em termos da estereoquímica absoluta, como (R) ou (S) , ou como (D) ou (L para amino-ácidos, bem como os isómeros individuais, estão incluídos no âmbito do presente fascículo. Os compostos do presente fascículo não incluem aqueles que se sabe na técnica serem instáveis demais para se sintetizarem e/ou isolarem. 0 presente fascículo pretende incluir compostos sob as formas racémica e opticamente puras. Podem preparar-se isómeros 14 ΡΕ2084162 opticamente activos (R) e (S)-, ou (D) e (L) , utilizando sintões quirais ou reagentes quirais, ou resolver-se utilizando técnicas convencionais. Quando os compostos descritos neste documento contêm ligações olefinicas ou outros centros de assimetria geométrica, e a não ser que se especifique localmente algo em contrário, pretende-se que nos compostos se incluam ambos os isómeros geométricos E e Z. 0 termo "tautómero", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um de dois ou mais isómeros estruturais que existem em equilibrio e que são rapidamente transformados de uma forma isomérica nas outras.

Será aparente a um especialista da técnica que determinados compostos desta especificação podem existir sob formas tautoméricas, estando todas estas formas tautoméricas dos compostos no âmbito do fascículo. A não ser aonde se afirmar algo em contrário, as estruturas representadas neste documento pretendem incluir todas as formas estereoquimicas da estrutura; isto é, as configurações R e S em cada um dos centros assimétricos, portanto, estão incluídos no âmbito desta especificação isómeros estereoquimicos singelos, nem como as misturas enantioméricas e diastereoméricas dos compostos presentes. 0 termo "sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico" pretende incluir sais de compostos activos 15 ΡΕ2084162 que são preparados com ácidos ou com bases relativamente não tóxicos, dependendo das espécies substituintes especificas presentes em cada um dos compostos descritos neste documento. Quando os compostos do presente fascículo contiverem funcionalidades relativamente ácidas, podem obter-se os sais de adição a bases levando a forma neutra desses compostos a um contacto com uma quantidade suficiente da base pretendida, quer por si só, quer num solvente inerte adequado. Incluem-se nos exemplos de sais de adição a bases aceitáveis do ponto de vista farmacêutico os sais de sódio, potássio, cálcio, amónio, aminas orgânicas, ou de magnésio, ou sais semelhantes. Quando os compostos do presente fascículo contiverem funcionalidades relativamente básicas, podem obter-se os sais de adição a bases levando a forma neutra desses compostos a um contacto com uma quantidade suficiente do ácido pretendido, quer por si só, quer num solvente inerte adequado. Incluem-se nos exemplos dos sais de adição a ácidos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, os sais derivados de ácidos tais como o clorídrico, bromidrico, nitrico, carbónico, mono-hidrogenocarbónico, fosfórico, mono-hidrogenofosfórico, di-hidrogenofosfórico, sulfúrico, mono-hidrogeno-sulfúrico, iodidrico, ou fosforoso, ou outros semelhantes, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos relativamente não tóxicos tais como os ácidos acético, propiónico, isobu-tirico, maleico, malónico, benzóico, succinico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, benzenossulfónico, 16 ΡΕ2084162 p-toluílsulfónico, cítrico, tartárico, metanossulfónico, e outros semelhantes. Também se incluem sais de aminoácidos tais como o arginato e outros semelhantes, e sais de ácidos orgânicos tais como os ácidos glucurónico ou galacturónico e outros semelhantes {veja-se, por exemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Determinados compostos específicos do presente fascículo contêm tanto funcionalidades básicas como ácidas que permitem aos compostos serem transformados quer em sais de adição com bases, quer com ácidos.

Para além das formas salinas, o presente fascículo proporciona compostos, que existem sob a forma de precursores. Os precursores dos compostos descritos neste documento são aqueles compostos que sofrem facilmente alterações químicas em condições fisiológicas para proporcionar os compostos do presente fascículo. Para além disto, os precursores podem ser transformados nos compostos do presente fascículo por métodos químicos ou bioquímicos num ambiente ex vivo. Por exemplo, os precursores podem transformar-se lentamente nos compostos do presente fascículo quando são colocados num reservatório de um pacho transdérmico com um enzima adequado ou com um reagente químico.

Os termos "um", "uma", ou "o/a", quando utilizados em referência a um grupo de substituintes deste documento, significam pelo menos um. Por exemplo, quando um 17 ΡΕ2084162 composto é substituído com "um" grupo alquilo ou arilo, o composto é opcionalmente substituído com pelo menos um grupo alquilo e/ou pelo menos um grupo arilo. Além disto, quando uma espécie é substituída com um substituinte R, pode referir-se o grupo como "substituído com R". Quando uma espécie é substituída com R, a espécie é substituída com pelo menos um substituinte R, e cada substituinte R é opcionalmente diferente. A descrição dos compostos do presente fascículo é limitada por princípios de ligação química conhecidos dos especialistas da técnica. Portanto, quando um grupo pode ser substituído por um ou mais do que um número de substituintes, essas substituições são seleccionadas de modo a cumprir os princípios da ligação química e proporcionarem compostos que não sejam inerentemente instáveis e/ou que sejam conhecidos dos especialistas da técnica como provavelmente instáveis nas condições ambientes, tal como em condições aquosas, neutras, fisiológicas.

Os termos "tratando" ou "tratamento", em referência a uma doença específica, inclui a prevenção da doença.

Num aspecto, esta descrição proporciona compostos com as fórmulas: ΡΕ2084162 18 Γ γ\ rVA ) Ν Γ 1 k,..>k..A,s< Α\ I 3

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Noutro aspecto, a descrição proporciona compostos para utilização no tratamento 20 ΡΕ2084162

Noutro aspecto, a descrição proporciona compostos para utilização no tratamento de um ser humano.

Noutro aspecto, a descrição proporciona compostos para utilização no tratamento de um ser humano, em que o cancro seja cancro da mama, cancro do pulmão, melanoma, cancro colo-rectal, cancro dos ovários, cancro da próstata, cancro renal, cancro de células escamosas, glioblastoma, cancro do pâncreas, leiomiossarcoma, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais papilares, cancro gástrico, cancro da cabeça e pescoço, melanoma, e leucemia (por exemplo mielóide, mielóide crónica, linfoblástica aguda, linfoblástica crónica, de Hodgkins, e outras leucemias e cancros hematológicos).

Noutro aspecto, o fascículo proporciona compostos para utilização no tratamento do cancro num paciente humano, em que o cancro inclua mutações de MET, cancros com amplificação do gene de MET, cancros expressando a proteína MET, cancros expressando MET fosforilada, cancros com sinalização de MET activada, cancros expressando HGF, cancros expressando marcadores para outros alvos de quinases.

Noutro aspecto, a descrição proporciona compostos para utilização no tratamento de uma invasão por Listeria, a osteólise associada com o mieloma múltiplo, a infecção com malária, as retinopatias diabéticas, a psoríase e a artrite. ΡΕ2084162

Noutro aspecto, a descrição presente proporciona composições farmacêuticas contendo um composto da invenção presente num excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Noutro aspecto, a descrição presente proporciona métodos para modular a actividade de proteína quinase utilizando os triazoles bicíclicos moduladores de quinases da descrição presente. 0 termo "modular a actividade de quinase", tal como se utiliza neste documento, significa que a actividade da proteína quinase é incrementada ou diminuída quando em contacto com um triazole bicíclico modulador de quinase da descrição presente, em relação à actividade na ausência do triazole bicíclico modulador de quinase da descrição presente. portanto, a descrição presente proporciona um método de modular a actividade de proteína quinase levando ao contacto a proteína quinase com o triazole bicíclico modulador de proteína quinase do presente fascículo.

Numa concretização exemplificativa, o triazole bicíclico modulador de quinase inibe a actividade de quinase. 0 termo "inibe", tal como utilizado neste documento em referência à actividade de quinase, significa que a actividade de quinase diminui quando em contacto com um triazole bicíclico modulador de quinase em relação à actividade na ausência do triazole bicíclico modulador de quinase. Portanto, o presente fascículo também proporciona 22 ΡΕ2084162 um método para inibir a actividade da proteína quinase por contacto entre a proteína quinase com um triazole bicíclico modulador de quinase do presente fascículo.

Em determinadas concretizações, a proteína quinase é uma proteína tirosina quinase. Uma proteína tirosina quinase, tal como se utiliza neste documento, refere-se a um enzima que catalisa a fosforilação dos resíduos de tirosina nas proteínas com doadores de fosfato (por exemplo um nucleótido doador de fosfato tal como o ATP) . Incluem-se nas proteína tirosina quinases, por exemplo, tirosina quinases Abelson ("Abl") (por exemplo c-Abl e v-Abl), as tirosina quinases do receptor de Ron ("RON"), as tirosina quinases do receptor de Met ("MET"), as tirosina quinases semelhantes a Fms ("FLT") (por exemplo, FLT3), as tirosina quinases da família da src (por exemplo lyn, CSK), e a quinase 4 activada p21 ("PAK"), FLT3, aurora-A quinases, tirosina quinases B-linfóides ("Blk"), as quinases dependentes de ciclina ("CDK") (por exemplo CDK1 e CDK5), as proteína tirosina quinases da família src (por exemplo Fyn quinase), as glicogénio sintase quinases ("GSK") (por exemplo GSK3cx e GSK3P) , as proteína tirosina quinase de linfócitos ("Lck"), as quinases S6 ribossomais (por exemplo Rskl, Rsk2, e Rsk3), as tirosina quinases do esperma (por exemplo Yes), e subtipos e os seus homólogos exibindo actividade de tirosina quinase. 23 ΡΕ2084162

Em determinadas concretizações, a proteína quinase é uma tirosina quinase receptora de Met.

Noutra concretização, a quinase é uma quinase mutante, tal como uma MET mutante. As quinases MET mutantes úteis incluem, por exemplo, quinases MET contendo mutações, incluindo inserções e retiradas, nos domínios extracelular ou transmembranar, ou no domínio citoplásmico, incluindo uma ou mais das seguintes mutações: Serl058Pro, ValllOIle, Hisll2Tyr, Hisl24Asp, Metl49Thr, Vall206Leu, ou Metl268Thr.

Incluem-se nas MET quinases, por exemplo, MET quinases contendo mutações, incluindo inserções e retiradas, nos domínios extracelular ou transmembranar, ou no domínio citoplásmico, incluindo uma ou mais das seguintes mutações: Serl058Pro, ValllOIle, Hislll2Tyr, Hisll24Asp, Metll49Thr, Vall206Leu, ou Metl268Thr. ou 90

Em algumas concretizações, a quinase é homóloga a uma quinase conhecida (também referida neste documento como uma "quinase homóloga"). Podem despistar-se inicialmente os compostos e as composições úteis para inibir a actividade biológica de quinases homólogas, por exemplo, usando ensaios de ligação. Os enzimas homólogos incluem uma sequência de aminoácidos com o mesmo comprimento que seja idêntica em pelo menos 50 %, em pelo menos 60 %, em pelo menos 70 %, em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90 %, à sequência de aminoácidos da quinase de comprimento inteiro já conhecida, ou que apresente pelo menos 70 %, 80 %, 24 ΡΕ2084162 % de homologia aos domínios activos da quinase conhecida. Pode determinar-se a homologia utilizando, por exemplo, uma pesquisa PSI BLAST, tal como, mas não se limitando à descrita por Altschul, et al., Nuc. Acids Rec. 25: 3389-3402 (1997) . Em algumas concretizações, pelo menos 50 %, ou pelo menos 70 % da sequência fica alinhada nesta análise. Incluem-se em outras ferramentas para levar a cabo este alinhamento, por exemplo, DbClustal e ESPript, que se podem utilizar para gerar a versão PostScript do alinhamento. Veja-se Thompson et al., Nucleic Acids Research, 28: 2919-26, 2000; Gouet, et al., Bioinformatics, 15: 305-08 (1999). Os homólogos pode, por exemplo, ter um valor E em BLAST de 1 x 10”6 ao longo de pelo menos 100 aminoácidos (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-402 (1997) com a FLT3, a Abl, ou outra quinase conhecida, ou com qualquer domínio funcional de FLT3, Abl, ou de outra quinase conhecida.

Também se pode determinar a homologia comparando a bolsa de ligação do local activo do enzima com as bolsas de ligação do local activo de uma quinase conhecida. Por exemplo, em enzimas homólogos, pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % dos aminoácidos da molécula ou da sua homóloga têm coordenadas estruturais de aminoácidos de um domínio com dimensão comparável ao domínio da quinase, que apresentam desvios quadráticos médios dos carbonos em alfa de até cerca de 1,5 Â, até cerca de 1,25 Â, até cerca de 1Â, até cerca de 0,75 Á, até cerca de 0,5 Â, e/ou até cerca de 0,25 Â. 25 ΡΕ2084162

Os compostos e as composições do presente fascículo são úteis para inibir a actividade da quinase e também para inibir outros enzimas que se liguem a ATP. eles são portanto úteis para o tratamento de doenças e de patologias que podem ser aliviadas inibindo essa actividade de ligação a ATP. Incluem-se nos métodos de determinar esses enzimas que se ligam ao ATP aqueles que são conhecidos na técnica, aqueles que se descrevem neste documento em relação à selecção de enzimas homólogos, e à utilização da base de dados PROSITE, na qual podem ser identificados enzimas contendo assinaturas, tipos de sequências, motivos, ou perfis de famílias ou de domínios de proteínas.

Os compostos do presente fascículo, e os seus derivados, também podem ser utilizados como agentes de ligação a quinases. Como agentes de ligação, estes compostos e os seus derivados podem ser ligados a uma resina estável sob a forma de substratos permanentes para aplicações de cromatografia de afinidade. Os compostos desta especificação, e os seus derivados, também podem ser modificados (por exemplo, radiologicamente marcados ou marcados por afinidade, etc.) para serem utilizados na investigação de enzimas ou na caracterização, estrutura, e/ou função de polipéptidos.

Numa concretização exemplificativa, o triazole bicíclico moduladores de quinase do presente fascículo é um inibidor de quinase. Em algumas concretizações, o inibidor 26 ΡΕ2084162 de quinase apresenta um valor de IC5o para a constante de inibição (Ki) inferior a 1 micromolar. Noutra concretização, o inibidor de quinase apresenta um valor de IC5o ou constante de inibição (Kj.) inferior a 500 micromolar. Noutra concretização, o inibidor de quinase apresenta um valor de IC50 ou K± inferior a 10 micromolar. Noutra concretização, o inibidor de quinase apresenta um valor de IC50 ou K± inferior a 1 micromolar. Noutra concretização, o inibidor de quinase apresenta um valor de IC50 ou Ki inferior a 500 nanomolar. Noutra concretização, o inibidor de quinase apresenta um valor de IC50 ou Kj inferior a 10 nanomolar. Noutra concretização, o inibidor de quinase apresenta um valor de IC50 ou K± inferior a 1 nanomolar.

Noutro aspecto, o presente fasciculo proporciona compostos para utilização no tratamento de uma doença mediada pela actividade da quinase (doença ou patologia mediada por quinase) num organismo (por exemplo mamíferos, tais como os seres humanos) . Por doenças "mediadas por quinase" ou "associadas a quinase" pretende-se significar doenças nas quais a doença ou o sintoma podem ser aliviados inibindo a actividade de uma quinase (por exemplo em que a quinase esteja envolvida na sinalização, mediação, modulação, ou regulação do processo da doença). Por "doenças" pretende significar-se doenças, ou sintomas de doença.

Incluem-se nos exemplos de doenças associadas a quinase o cancro (por exemplo leucemia, tumores, e 27 ΡΕ2084162 metástases), alergia, asma, inflamação (por exemplo doenças inflamatórias das vias respiratórias), doenças obstrutivas das vias respiratórias, doenças auto-imunes, doenças metabólicas, infecção (por exemplo bacteriana, virai, a leveduras, fúngicas), doenças do SCN, tumores cerebrais, doenças neurais degenerativas, doenças cardiovasculares, e doenças associadas à angiogénese, à neovascularização, e à vasculogénese. Numa concretização exemplificativa, os compostos são úteis para tratar o cancro, incluindo a leucemia, e outras doenças ou estados que envolvam proliferação anormal de células, patologias mieloprolife-rativas, patologias hematológicas, asma, doenças inflamatórias ou obesidade.

Incluem-se em exemplos mais específicos de cancros tratados com os compostos do presente fascículo, cancro da mama, cancro do pulmão, melanoma, cancro colo-rectal, cancro da bexiga, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro renal, cancro de células escamosas, glio-blastoma, cancro pancreático, leiomio-sarcoma, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais papilares, cancro gástrico, cancro do fígado, cancro da cabeça e pescoço, melanoma, e leucemia (por exemplo mielóide, mielóide crónica, linfoblástica aguda, linfoblástica crónica, de Hodgkins, e outras leucemias e cancros hematológicos).

Outros exemplos específicos de doenças ou patologias para as quais os tratamentos com os compostos ou as composições da descrição são úteis quer no seu tratamento, 28 ΡΕ2084162 quer na sua prevenção, incluem mas não se limitam a rejeição de transplantes (por exemplo, rim, figado, coração, pulmão, células ilhotas, pâncreas, medula óssea, córnea, intestino delgado, aloenxertos de pele e outros transplantes), doença de enxerto contra hospedeiro, osteoartrite, artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes, retinopatia diabética, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerosa, e outras doenças intestinais), doenças renais, caquexia, choque séptico, lúpus, miastenia grave, psoriase, dermatite, eczema, seborreia, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, protecção das células estaminais durante a quimioterapia, selecção ex vivo ou purga ex vivo de transplantes autólogos ou alogénicos de medula óssea, doenças oculares, retinopatias (por exemplo, degeneração da mácula, retinopatia diabética, e outras retinopatias), doenças da córnea, glaucoma, infecções (por exemplo bacte-riana, virais, ou fúngicas), doenças do coração, incluindo, mas não se limitando a, restenose.

Noutro aspecto, a descrição proporciona terapias de combinação para tratar ou para inibir o despoletar de uma patologia proliferativa de células ou uma patologia relacionada com MET, num sujeito. A terapia de combinação inclui administrar-se ao sujeito uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico ou profiláctico de um composto com a Fórmula I, e um ou mais outras terapias anti proliferação celular incluindo quimioterapia, terapia com radiação, terapia genética e imunoterapia. 29 ΡΕ2084162

Noutro aspecto, os compostos do fascículo podem ser administrados em combinação com a quimioterapia. Tal como se utiliza neste documento, quimioterapia refere-se a uma terapia envolvendo um agente quimioterapêutico. Pode utilizar-se uma série de agentes quimioterapêuticos nos métodos de tratamento de combinação que se descrevem neste documento. Os exemplos dos agentes quimioterapêuticos incluem, mas não se limitam a: compostos de platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina); compostos taxanos (por exemplo, paclitaxcel, docetaxel); compostos campototecina (irinotecana, topotecana); alcaloides vinca (por exemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina); derivados de nucleósidos anti-tumor (por exemplo, 5-fluoro-uracilo, leucovorina, gemcitabina, capecitabina) agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, carmustina, lomustina, tiotepa); epipodofilotoxinas/podofilotoxinas (por exemplo etoposido, teniposido); inibidores de aroma-tase (por exemplo, anastrozole, letrozole, exemestano); compostos anti-estrogénio (por exemplo, tamoxifene, fulves-trant), antifolatos (por exemplo, premetrexed di-sódico); agentes hipometilantes (por exemplo, azacitidina) ; biológicos (por exemplo, gemtuzamab, cetuximab, rituximab, pertuzumab, trastuzumab, bevacizumab, erlotinib); antibió-ticos/antracilinas (por exemplo idarrubicina, actinomicina D, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, dactinomicina, carminomicina, daunomicina); antimetabolitos (por exemplo, clofarabina, aminopterina, arabinósido de citosina, metotrexato); agentes de ligação à tubulina (por 30 ΡΕ2084162 exemplo combretastatina, colchicina, nocodazole); inibi-dores de topoisomerase (por exemplo, camptotecina); agentes diferenciantes (por exemplo, retinóides, vitamina D e ácido retinóico); agentes inibidores do metabolismo do ácido retinóico (RAMBA) (por exemplo, acutano); inibidores de quinase (por exemplo, flavoperidol, mesilato de imatinibe, gefitinibe, erlotinibe, sunitinibe, lapatinibe, sorafinibe, temsirolimus, dasatinibe); inibidores de farnesiltrans-ferase (por exemplo, tipifarnibe); inibidores de histona desacetilase; inibidores do caminho proteassómico da ubiquitina (por exemplo, bortezomib, Yondelis).

Incluem-se em agentes úteis adicionais o verapamil, um antagonista de cálcio que se verificou ser útil em combinação com agentes antineoplásicos para estabelecer a quimio-sensibilidade em células de tumor resistentes aos agentes quimioterapêuticos aceites e para potenciar a eficácia desses compostos em lesões malignas sensíveis a fármacos. Veja-se Simpson W G, The calcium channel blocker verapamil and câncer chemotherapy. Cell Calcium. Dezembro de 1985; 6(6):449-67. Além disto, são contemplados agentes quimioterapêuticos ainda por emergir como sendo úteis em combinação com o composto do presente fascículo.

Noutro aspecto, o fascículo proporciona compostos que se podem administrar em combinação com a terapia de radiação. Tal como se utiliza neste documento, "terapia de radiação" refere-se a uma terapia incluindo expor-se o 31 ΡΕ2084162 sujeito que dela necessite à radiação. Essa terapia é conhecida dos especialistas da técnica. 0 esquema apropriado para a terapia de radiação será semelhante aos já empregues em terapias clinicas nas quais a terapia de radiação é utilizada por si só ou em combinação com outras quimioterapias.

Noutro aspecto, a descrição proporciona compostos que se podem administrar em combinação com uma terapia genética. Tal como se utiliza neste documento, "terapia genética" refere-se a uma terapia que alvejava de genes específicos envolvidos no desenvolvimento de tumores. Incluem-se em terapias genéticas possiveis restaurarem-se genes inibidores do cancro defeituosos, a tradução ou a transfecçao com ADN de sentido reverso correspondente a genes que codificam para os factores de crescimento bem como os seus receptores, estratégias baseadas em ARN tais como ribozimas, falsos ARN chamarizes, ARN mensageiros de sentido reverso e pequenas moléculas que interferem com o ARN (siARN), bem como os assim denominados genes suicidas.

Noutro aspecto, o fascículo proporciona compostos que se podem administrar em combinação com uma imuno-terapia. Tal como se utiliza neste documento, "imuno-terapia" refere-se a uma terapia que alveja proteínas específicas envolvidas no desenvolvimento de tumores, através de anticorpos específicos para essa proteína. Por exemplo, têm sido utilizados no tratamento do cancro 32 ΡΕ2084162 anticorpos monoclonais contra factor de crescimento endotelial vascular.

Quando se utiliza um segundo fármaco além de um composto do fascículo, ambos os fármacos podem ser administrados em simultâneo (por exemplo em separado ou em composições unitárias) sequencialmente por uma ordem qualquer, aproximadamente na mesma altura, ou com horários de doseamento em separado. Neste último caso, administrar-se-ão os dois compostos adentro de um período e numa quantidade e de um modo que seja suficiente para assegurar que se consegue um efeito de sinergia ou vantajoso. Entender-se-á que o método e a rodem de administração preferidos bem como as quantidades de dosagens respectivas e os regimes para cada componente da combinação dependerão do agente quimioterapêutico específico que se está a administrar em conjunto com o composto da invenção presente, das vias pelas quais são ambos administrados, do tumor específico que se esteja a tratar e do hospedeiro específico que recebe o tratamento.

Tal como será entendido pelos indivíduos com conhecimentos médios da técnica, as doses apropriadas dos agentes quimioterapêuticos serão em geral semelhantes ou inferiores às que já são em pregues em terapias clínicas nas quais os quimioterapêuticos são administrados por si sós ou em combinação com outros quimioterapêuticos. 0 método óptimo e a ordem de administração, bem 33 ΡΕ2084162 como as quantidades na dosagem e o regime podem ser facilmente determinados pelos especialistas da técnica recorrendo a métodos convencionais e atenta a informação descrita neste documento.

Apenas a titulo de exemplo, administram-se vantajosamente compostos de platina numa dosagem de entre 1 e 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, por exemplo 50 a 400 mg/m2, em especial para a cisplatina numa dosagem de cerca de 75 mg/m2 e para a carboplatina de cerca de 300 mg/m2 por episódio de tratamento. A cisplatina não é absorvida por via oral e tem portanto que ser veiculada por injecção, por via endovenosa, subcutânea, intratumoral ou intraperitoneal.

Apenas a titulo de exemplo, os compostos taxano são administrados vantajosamente numa dosagem de entre 50 e 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, por exemplo 75 a 250 mg/m2, em especial para o paclitaxel numa dosagem de cerca de entre 175 e 250 mg/m2 e para o docetaxel de entre cerca de 75 e 150 mg/m2, por episódio de tratamento.

Apenas a titulo de exemplo, os compostos campto-tecina são administrados vantajosamente numa dosagem de entre 0,1 e 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, por exemplo de entre 1 e 300 mg/m2, em especial para o irinotecano numa dosagem de entre cerca 34 ΡΕ2084162 de 100 e 350 mg/m2 e para o topotecano de entre cerca de 1 e 2 mg/m2, por episódio de tratamento.

Apenas a titulo de exemplo, os alcaloides vinca podem ser vantajosamente administrados numa dosagem de entre 2 e 30 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, em especial para a vinblastina numa dosagem de entre cerca de 3 e 12 mg/m2, para a vincristina numa dosagem de entre cerca de 1 e 2 mg/m2, e para a vinorelbina numa dosagem de entre cerca de 10 e 30 mg/m2, por episódio de tratamento.

Apenas a titulo de exemplo, podem administrar-se vantajosamente os derivados de nucleósidos anti-tumorais numa dosagem de entre cerca de 200 e 2.500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, por exemplo 700 a 1500 mg/m2. Utiliza-se habitualmente o 5-fluorouracilo (5-FU) por administração endovenosa com doses variando entre 200 e 500 mg/m2 (preferivelmente entre 3 e 15 mg/kg/dia). Administra-se vantajosamente a gemcitabina numa dosagem de entre cerca de 800 e 1.200 mg/m2 e administra-se vantajosamente a capecitabina a entre cerca de 1.000 e 2.500 mg/m2, por episódio de tratamento.

Apenas a título de exemplo, podem administrar-se vantajosamente os agentes alquilantes numa dosagem de entre 100 e 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, por exemplo 120 a 200 mg/m2, em especial para a ciclofosfamida numa dosagem de entre cerca de 100 e 500 35 ΡΕ2084162 mg/m2, para o clorambucilo numa dosagem de entre cerca de 0,1 e 0,2 mg/kg de massa corporal, para a carmustina numa dosagem de entre cerca de 150 e 200 mg/m2, e para a lomustina numa dosagem de entre cerca de 100 e 150 mg/m2, por episódio de tratamento.

Apenas a titulo de exemplo, podem administrar-se vantajosamente derivados de podofilotoxina numa dosagem de entre cerca de 30 e 300 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, por exemplo 50 a 250 mg/m2, em especial para o etoposido numa dosagem de entre cerca de 35 e 100 mg/m2, e para o teniposido de cerca de 50 a 250 mg/m2, por episódio de tratamento.

Apenas a titulo de exemplo, podem administrar-se vantajosamente os derivados de antraciclina numa dosagem de entre cerca de 10 e 75 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, por exemplo 15 a 60 mg/m2, em especial para a doxorrubicina numa dosagem de entre cerca de 40 e 75 mg/m2, para a daunorrubicina numa dosagem de entre cerca de 25 e 45 mg/m2, e para a idarrubicina numa dosagem de entre cerca de 10 e 15 mg/m2, por episódio de tratamento.

Apenas a titulo de exemplo, podem administrar-se vantajosamente compostos anti-estrogénio numa dosagem de dentre cerca de 1 e 100 mg ao dia, consoante o agente especifico e o estado que se estiver a tratar. Administra-se vantajosamente o tamoxifene por cia oral numa dosagem de 36 ΡΕ2084162 entre cerca de 5 e 50 mg, preferivelmente 10 a 20 mg duas vezes ao dia, continuando a terapia durante um periodo de tempo suficiente para se conseguir e se manter um efeito terapêutico. Administra-se vantajosamente o toremifene por via oral numa dosagem de cerca de 60 mg uma vez ao dia, continuando a terapia durante um periodo de tempo suficiente para se conseguir e se manter um efeito terapêutico. Administra-se vantajosamente o anastrozole por via oral numa dosagem de cerca de 1 mg uma vez ao dia. Administra-se vantajosamente o droloxifene por via oral numa dosagem de cerca de 20-100 mg uma vez ao dia. Administra-se vantajosamente o raloxifene por via oral numa dosagem de cerca de 60 mg uma vez ao dia. Administra-se vantajosamente o exemestano por via oral numa dosagem de cerca de 25 mg uma vez ao dia.

Apenas a titulo de exemplo, podem administrar-se vantajosamente biológicos numa dosagem de entre cerca de 1 e 5 mg por metro quadrado (mg/m2) de área superficial do corpo, ou tal como se sabe na técnica, caso seja diferente desta. Por exemplo, administra-se vantajosamente o trastuzumab numa dosagem de entre 1 e 5 mg/m2, em especial de entre 2 e 4 mg/m2, por episódio de tratamento.

Podem administrar-se as dosagens, por exemplo uma, duas ou mais durante um episódio de tratamento, que se poderá repetir por exemplo volvidos mais 7, 14, 21 ou 28 dias. 37 ΡΕ2084162

Podem administrar-se os compostos do presente fasciculo a um sujeito por via sistémica, por exemplo, endovenosa, oral, subcutânea, intramuscular, intradérmica, ou parenteral. Também se podem administrar os compostos da invenção presente a um sujeito por via local. Incluem-se nos exemplos não limitativos de sistemas de administração local a utilização de dispositivos medicinais intralu-minais, nos quais se incluem cateteres intravasculares para administração de fármacos, tubos, stents farmacológicos e revestimentos endoluminais.

Podem ainda administrar-se os compostos do presente fasciculo a um sujeito em combinação com um agente alvejante para se conseguir uma concentração local elevada do composto no sitio alvejado. Além disto, os compostos da invenção presente podem ser formulados para libertação rápida ou lenta com o objectivo de se manterem os fármacos ou agentes em contacto com os tecidos alvejados durante um periodo que pode ser de entre horas e semanas.

Noutro aspecto, o presente fasciculo proporciona uma composição farmacêutica incluindo um triazole biciclico modulador de quinase misturado com um excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico. Um individuo com conheci-entos da técnica reconhecerá que as composições farmacêuticas incluem os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico dos triazoles biciclicos moduladores de quinase descritos acima. 38 ΡΕ2084162

Numa aplicação em terapêutica e/ou de diagnóstico, os compostos do fascículo podem ser formulados para uma série de modos de administração, incluindo administração sistémica e tópica ou localizada, podem encontrar-se as técnicas e formulações em geral no Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a edição) Lippincott, Williams & Wilkins (2000).

De acordo com outro aspecto, o fascículo proporciona composições farmacêuticas incluindo compostos com a fórmula I, e um veículo, adjuvante ou meio aceitável do ponto de vista farmacêutico. A quantidade de composto nas composições da descrição é tal que seja eficaz para inibir de uma forma detectável uma proteína quinase, em especial a MET, numa amostra biológica ou num paciente.

Tal como se utiliza neste documento, o termo "MET" é sinónimo de "Met", "c-MET", "c-Met", ou de outras designações conhecidas dos especialistas da técnica. Num aspecto, uma composição do presente fascículo é formulada para administração a um paciente que necessite dessa composição. Noutro aspecto, a composição do fascículo é formulada para uma administração oral a um paciente.

Os compostos de acordo com o fascículo são eficazes numa larga gama de dosagens. Por exemplo, no tratamento de seres humanos adultos, as dosagens de entre 0,01 e 10.000 mg, de entre 0,5 e 1.000 mg, de entre 1 e 500 mg ao dia, e de entre 5 e 100 mg ao dia, são exemplos das 39 ΡΕ2084162 dosagens que se podem utilizar. A dosagem exacta dependerá da via de administração, a forma na qual o composto é administrado, do sujeito a tratar, da massa corporal do sujeito a tratar, e da preferência e experiência do médico assistente.

Os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico são em geral bem conhecidos das pessoas com conhecimentos médios da técnica, e podem incluir, a titulo de exemplo mas não limitativo, os sais acetato, benzenossulfonato, besi-lato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, brometo, edetato cálcico, camsilato, carbonato, citrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, gluta-mato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, de hidrabamina, bromidrato, cloridrato, hidroxinaftoato, iodeto, isetiona-to, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salici-lato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartarato, ou teoclato. Podem encontrar-se outros sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, por exemplo, no Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a edição) Lippincott, Williams & Wilkins (2000). Incluem-se nos sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico preferidos, por exemplo, acetato, benzoato, brometo, carbonato, citrato, gluconato, bromidrato, cloridrato, maleato, mesilato, napsilato, pamoato (embonato), fosfato, salicilato, succinato, sulfato, ou tartarato. 40 ΡΕ2084162

Dependo das condições específicas que se estão a tratar, podem formular-se estes agentes em formas de dosagem líquidas ou sólidas e administrar-se sistemicamente ou localmente. Os agentes podem ser veiculados, por exemplo, sob formas com libertação num período determinado, ou lenta, como é do conhecimento dos especialistas da técnica. Podem encontrar-se técnicas de formulação e de administração no Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a edição), Lippincott, Williams & Wilkins (2000) . Podem incluir-se como vias adequadas as vias de administração oral, bucal, por inalação de um borrifo, sublingual, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosal, nasal ou intestinal; a veiculação parenteral, incluindo injecções por via intramuscular, subcutânea, intramedular, bem como intratecal, intraventricular directa, endovenosa, intra-articular, intra-esternal, intrassinovial, intra-hepática, intralesional, intracraniana, intraperitoneal, intranasal, ou intraocular ou outros modos de veiculação.

Para injecção, podem formular-se os agentes do fascículo e diluir-se em soluções aquosas, tal como em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão de soro salino fisiológico. para uma administração transmucosal como estas, utilizam-se na formulação agentes de penetração apropriados face à barreira a permear, estes agentes de penetração são em geral conhecidos na técnica. A utilização de veículos inertes aceitáveis do 41 ΡΕ2084162 ponto de vista farmacêutico para formular os compostos descritos neste documento para se praticar o fasciculo em dosagens adequadas para uma administração sistémica encontra-se no âmbito do fasciculo. Seleccionando adequadamente o veiculo e as práticas de fabrico adequadas, as composições do presente fasciculo, em especial, as formuladas como soluções, podem ser administradas por via parenteral, tal como por injecção endovenosa. Os compostos podem ser facilmente formulados utilizando veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico bem conhecidos na técnica para se obterem dosagens adequadas para administração por via oral. Esses veículos permitem aos compostos do fascículo serem formulados como comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, suspensões, e outras semelhantes, para ingestão por via oral por um paciente a tratar.

Para administração nasal ou por inalação, os agentes do fascículo também podem ser formulados por métodos conhecidos pelos especialistas da técnica, e nelas se podem incluir, por exemplo, mas sem se limitar a, exemplos de substancias solubilizantes, diluentes, ou dispersantes tais como, soro fisiológico, conservantes, tais como álcool benzílico, promotores da absorção, e fluorocarbonetos.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização no presente fascículo incluem composições nas quais os ingredientes activos estão contidos, numa quanti- ΡΕ2084162 dade eficaz para conseguir o propósito para o qual se destinam. A determinação das quantidades eficazes está bem ao alcance das capacidades dos especialistas da técnica, em particular atenta o fascículo pormenorizada proporcionada neste documento.

Para além dos ingredientes activos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmacêuticos adequados aceitáveis do ponto de vista farmacêutico incluindo excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos activos em preparações que se podem utilizar em farmácia. As preparações formuladas para uma administração por via oral podem assumir a forma de comprimidos, drageias, cápsulas, ou soluções.

Podem obter-se as preparações farmacêuticas para utilização oral combinando o composto activo com excipientes sólidos, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, depois de se adicionarem auxiliares adequados, caso tal se pretenda, para se obterem núcleos de comprimidos ou de drageias. Os excipientes adequados são, em especial, cargas tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações celulósicas tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trico, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose sódica (CMC) , e/ou polivi-nilpirrolidona (PVP: povidona). caso tal se pretenda, podem adicionar-se agentes desintegrantes, tais como polivinil- 43 ΡΕ2084162 pirrolidona com ligações cruzadas, agar, ou ácido algínico ou um seu sal tal como o alginato de sódio.

Revestem-se adequadamente os núcleos de drageia. para este objectivo, podem utilizar-se soluções concentradas de açúcar, que podem conter opcionalmente goma-arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol (PEG), e/ou dióxido de titânio, soluções de lacas, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Podem adicionar-se corantes ou pigmentos aos revestimentos dos núcleos de comprimidos ou das drageias para identificação ou para caracterizar diferentes combinações das doses de composto activo.

Incluem-se nas preparações farmacêuticas que se podem utilizar por via oral as cápsulas feitas em gelatina dura, bem como cápsulas moles, seladas, feitas em gelatina, com um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras em gelatina podem conter os ingredientes activos misturados com cargas tais como lactose, aglome-rantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Nas cápsulas moles, podem dissolver-se ou suspender-se os compostos activos em líquidos apropriados, tais como óleos gordos, parafina líquida, ou polietilenoglicóis líquidos (PEG). Além disto, podem adicionar-se estabilizantes.

Consoante o estado específico ou a doença que se pretenda tratar ou evitar, podem administrar-se agentes 44 ΡΕ2084162 terapêuticos adicionais, que sejam normalmente administrados para tratar ou para evitar aquele estado, em conjunto com os inibidores desto fasciculo. Por exemplo, podem combinar-se agentes quimioterapêuticos ou outros agentes anti-proliferativos com os inibidores desto fasciculo para tratar doenças proliferativas e cancro. Incluem-se nos exemplos dos agentes quimioterapêuticos conhecidos, sem que eles se limitem a estes, adriamicina, dexametasona, vin-cristina, ciclofosfamida, fluorouracilo, topotecano, taxol, os interferões, e derivados de platina.

Também se podem combinar outros exemplos de agentes com os inibidores desto fasciculo incluindo, sem qualquer limitação, agentes anti-inflamatórios tais como corticosteróides, bloqueadores de TNF, IL-1 RA, aza-tioprina, ciclofosfamida, e sulfassalazina; agentes imuno-moduladores e imunossupressores tais como ciclosporina, tacrólimo, rapamicina, micofenolato mofetilo, interferões, corticosteróides, ciclofosfamida, azatioprina, e sulfassa-lazina; factores neurotróficos tais como inibidores de acetilcolinesterase, inibidores de MAO, interferões, anti-convulsivos, bloqueadores de canais iónicos, riluzole, e agentes contra o Parkinsonismo; agentes para tratar doenças cardiovasculares tais como bloqueadores beta, inibidores de ECA, diuréticos, nitratos, bloqueadores do canal de cálcio, e estatinas; agentes para tratar doenças do figado tais como corticosteróides, colestiramina, interferões, e agentes antivirais; agentes para tratar patologias do sangue tais como corticosteróides, agentes contra a leucemia, e 45 ΡΕ2084162 factores de crescimento; agentes para tratar a diabetes tais como insulina, análogos à insulina, inibidores da alfa glucosidase, biguanidos, e sensibilizadores à insulina; e agentes para tratar patologias de imunodeficiência tais como a gama-globulina.

Estes agentes adicionais podem ser administrados em separado, como parte de um regime com múltiplas dosagens, integrando a composição contendo o inibidor. Em alternativa, estes agentes podem fazer parte de uma única forma de dosagem, misturados em conjunto com o inibidor numa única composição. 0 presente fascículo não deve ser limitada no seu âmbito pelas concretizações que se utilizam para a exemplificar, as quais se pretende constituam ilustrações de aspectos individuais do fascículo. De facto, tornar-se-ão aparentes diversas modificações do fascículo para além das que se descrevem neste documento, aos especialistas da técnica, quando confrontados com a descrição acima. Pretende-se que essas modificações integrem o âmbito do fascículo. Além disto, pode combinar-se uma ou mais características de qualquer uma das concretizações do fascículo com qualquer uma ou mais características de qualquer outra concretização do fascículo, sem que isto constitua um afastamento em relação ao âmbito do fascículo. Por exemplo, os triazoles bicíclicos moduladores de quinase descritos na secção de Triazoles Bicíclicos Moduladores de Quinase são igualmente aplicáveis nos métodos de tratamento 46 ΡΕ2084162 e nos métodos de inibição de quinases que se descrevem neste documento. As referências citadas ao longo deste pedido são exemplos do nivel de conhecimentos da técnica e são desta forma incorporadas integralmente neste documento por citação, para quaisquer que sejam os propósitos pretendidos, quer a sua incorporação haja sido ou não anteriormente declarada.

Ensaios

Podem facilmente ensaiar-se os compostos of o presente fasciculo para se determinarem as suas capacidades moduladoras de proteína quinases, de ligação a proteína quinases, e/ou de evitar o crescimento ou a proliferação de células. Apresentam-se adiante alguns exemplos de ensaios úteis.

Ensaios de Inibição de Quinases e de Ligação a

Quinases

Quantifica-se a inibição de diversas quinases por métodos que são do conhecimento dos indivíduos com conhecimentos médios da técnica, tais como os diversos métodos que se apresentam neste documento, bem como os descritos no Upstate Kinase Profiler Assay Protocols, publicação de Junho de 2003.

Por exemplo, quando se levam a cabo ensaios in vitro, dilui-se tipicamente a quinase à concentração ΡΕ2084162 adequada para se formar uma solução de quinase. Adicionam-se um substrato da quinase e um doador de fosfato, tal como ATP, à solução de quinase. Deixa-se a quinase transferir um fosfato para o substrato da quinase de modo a formar-se o substrato fosforilado. Pode detectar-se directamente a formação do substrato fosforilado por um qualquer meio apropriado, tal como a radioactividade (por exemplo utilizando [γ-32Ρ-ΑΤΡ]), ou pela utilização de anticorpos secundários detectáveis (por exemplo, por ELISA). Em alternativa, pode detectar-se a formação de um substrato fosforilado utilizando qualquer técnica apropriada, tal como a detecção da concentração em ATP (por exemplo usando um sistema de ensaio Kinase-Glo® (Promega)). Identificam-se os inibidores de quinase detectando a formação de um substrato fosforilado na presença e na ausência de um composto em teste (veja-se a secção de Exemplos, adiante).

Também se pode determinar a capacidade do composto para inibir uma quinase numa célula utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, podem levar-se células contendo uma quinase a um contacto com um agente activante (tal como um factor de crescimento) que activa a quinase. A quantidade de substrato intracelular fosforilado que se forma na ausência e na presença do composto em teste pode ser determinada lisando as células e detectando a presença de substrato fosforilado por um método adequado qualquer (por exemplo por ELISA). Quando a quantidade de substrato fosforilado produzida na presença do composto em teste é menor do que a quantidade produzida 48 ΡΕ2084162 na ausência do composto em teste, é indicada uma inibição da quinase. São descritos ensaios mais pormenorizados para a determinação de quinases celulares, na secção de Exemplos, adiante.

Para se determinar a ligação de um composto a uma quinase, pode utilizar-se qualquer um dos métodos conhecidos dos indivíduos com conhecimentos médios da técnica. Por exemplo, pode utilizar-se um estojo de teste manufacturado pela Discoverx (Fremont, CA), o estojo ED-Staurosporine NSIPm Enzyme Binding Assay (veja-se a Patente U.S. N°. 5.643.734). Também se pode determinar a actividade da quinase tal como na Patente U.S. 6.589.950, emitida a 8 de Julho de 2003.

Podem seleccionar-se inibidores de quinase adequados de entre os compostos do fascículo, por um despiste cristalográfico de proteínas, tal como descrito em, por exemplo, Antonysamy, et al., Publicação de PCT N°. WO 03/087816 Al, que se incorpora integralmente neste documento por citação, para todos os propósitos.

Os compostos do presente fascículo podem ser despistados com um computador para se avaliar e visualizar a sua capacidade para se ligarem e/ou para inibirem diversas quinases. A estrutura pode ser despistada por meios informáticos de entre uma série de compostos do presente fascículo, para se determinar a sua capacidade para se ligarem a uma quinase em diversos locais. Estes 49 ΡΕ2084162 compostos podem ser utilizados como alvos ou como compostos-guia nos esforços desenvolvidos em quimica médica para identificar, por exemplo, inibidores com importância terapêutica potencial (Travis, Science, 262: 1374, 1993). Podem sobrepor-se as estruturas tridimensionais desses compostos sobre uma representação tridimensional de quinases ou de um seu local activo, ou de uma sua bolsa de ligação, para se avaliar se o composto se ajusta espacialmente à representação referida, e portanto à proteina. Neste despiste, a qualidade do ajuste dessas entidades ou compostos à bolsa de ligação pode ser avaliada quer através da complementaridade das suas formas, quer através de uma estimativa da energia da sua interacção (Meng, et al., J. Comp. Chem. 13: 505-24, 1992). O despiste dos compostos do presente fascículo consoante se ligam e/ou modulam quinases (por exemplo inibem ou activam quinases) de acordo com o presente fascículo, envolve em geral levarem-se em consideração dois factores. Em primeiro lugar, o composto tem que ser capaz de se associar física e estruturalmente, quer de um modo covalente, quer de um modo não covalente, com quinases. Por exemplo, as interacções covalentes podem ser importantes para se conceberem inibidores irreversíveis ou suicidas de uma proteína. As interacções moleculares não covalentes que são importantes na associação das quinases ao composto incluem ligações por pontes de hidrogénio, interacções iónicas, de van der Waals, e interacções hidrofóbicas. Em segundo lugar, o composto tem que ser capaz de assumir uma 50 ΡΕ2084162 conformação e uma orientação em relação á bolsa de ligação, que lhe permita associar-se com quinases. Embora determinadas partes do composto não participem directamente nesta associação com quinases, essas partes podem também influenciar a conformação global da molécula e elas podem ter um impacto significativo na sua potência, os requisitos conformacionais incluem a estrutura tridimensional total e a orientação dos grupos químicos ou dos compostos em relação á totalidade ou a uma parte da bolsa de ligação, ou o espaçamento entre grupos funcionais de um composto que inclua diversos grupos químicos que interactuem directamente com quinases.

Os programas de acoplamento descritos neste documento, tais como, por exemplo, DOCK, ou GOLD, são utilizados para identificar compostos que se ligam ao local activo e/ou à bolsa de ligação. Podem despistar-se compostos para uma ou mais bolsas de ligação na estrutura da proteína, um ou mais conjuntos de coordenadas para a mesma proteína, levando em conta diferentes conformações dinâmicas moleculares da proteína. Pode então utilizar-se uma classificação consensual para identificar os compostos que dão o melhor ajuste à proteína (Charifson, P.S. et al., J. Med. Chem. 42: 5100-9 (1999)). Podem também classificar-se dados obtidos de mais do que uma estrutura molecular da proteína de acordo com os métodos descritos em Klingler et al., Pedido de Utilidade U.S., entrado a 3 de Maio de 2002, intitulado "Computer Systems and Methods for Virtual Screening of Compounds". Obtêm-se então os compostos que 51 ΡΕ2084162 apresentam o melhor ajuste a partir do produtor da biblioteca química, ou sintetizam-se, e utilizam-se em ensaios de ligação e em bioensaios.

Podem utilizar-se técnicas de modelação computadorizadas para avaliar o potencial de efeito de modulação ou de ligação de um composto químico em relação a quinases. Se a modelação computacional indicar uma interacção forte, pode então sintetizar-se a molécula e testar-se quanto à sua capacidade de se ligar a quinases e afectar (por ligação ou activação) a sua actividade.

Os compostos moduladores de quinases ou outros que se liguem a elas podem ser avaliados com um computador através de uma série de passos nos quais os grupos químicos ou os fragmentos são despistados e seleccionados quantio á sua capacidade de se associarem às bolsas de ligação individuais ou a outras áreas de quinases. Este processo pode iniciar-se através de uma inspecção visual de, por exemplo, o local activo, no mostrador do computador, com base nas coordenadas das quinases. Podem então posicionar-se fragmentos ou grupos químicos seleccionados com uma série de orientações, ou acoplados, numa bolsa individual de ligação de quinases (Blaney, J.M. e Dixon, J.S., Perspectives in Drug Discovery and Design, 1: 301, 1993). Pode conseguir-se o acoplamento manualmente utilizando programas tais como o Insight II (Accelrys, San Diego, CA), o MOE (Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Quebec, Canadá); e o SYBYL (Tripos, Inc., St. Louis, MO, 1992), ΡΕ2084162 seguindo-se uma minimização da energia e/ou dinâmica molecular com os campos de forças de mecânica molecular padrão, tal como utilizando CHARMM (Brooks, et al., J.

Comp. Chem. 4: 187-217, 1983), AMBER (Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 765-84, 1984) e C2 MMFF (Merck Molecular Force Field; Accelrys, San Diego, CA) Pode conseguir-se um acoplamento mais automatizado utilizando programas tais como o DOCK (Kuntz et al., J. Mol. Biol., 161: 269-88, 1982; pode obter-se o DOCK junto da University of Califórnia, San Francisco, CA) ; o AUTODOCK (Goodsell & Olsen, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 195-202, 1990; pode obter-se o AUTODOCK junto do Scripps Research Institute, La Jolla, CA); o GOLD (Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC); Jones et al., J. Mol. Biol. 245: 43-53, 1995); e o FLEXX (Tripos, St. Louis, MO; Rarey, M., et al., J. Mol. Biol. 261: 470-89, 1996). Estão descritos outros sistemas apropriados, por exemplo, em Halperin, et al.

Durante a selecção dos compostos pelos métodos acima, a eficiência com a qual um destes compostos se pode ligar a quinases pode ser testada e optimizada por avaliação computacional. Por exemplo, um composto que tenha sido concebido ou seleccionado para funcionar como inibidor de quinases pode ocupar um volume que não se sobreponha ao volume ocupado pelos residuos do local activo quando o substrato nativo está ligado, no entanto, as pessoas com conhecimentos médios da técnica verão que existe alguma flexibilidade, permitindo alguma transposição nas cadeias 53 ΡΕ2084162 principais e nas cadeias laterais. Além disto, um indivíduo com conhecimentos médios pode conceber compostos que poderiam explorar transposições nas proteínas aquando da ligação, tais como, por exemplo, os que resultem num ajuste induzido. Um inibidor eficaz de quinase pode demonstrar uma diferença energética relativamente pequena entre os seus estados ligado e livre (isto é, ele pode apresentar uma pequena energia de deformação aquando da ligação e/ou pouca tensão conformacional quando se liga). deste modo, os inibidores de quinases mais eficientes deverão, por exemplo, ser concebidos com uma energia de deformação aquando da ligação menor ou igual a 10 kcal/mol, menor ou igual a 7 kcal/mol, menor ou igual a 5 kcal/mol, ou menor ou igual a 2 kcal/mol. Os inibidores de quinase podem interactuar com a proteína em mais do que uma conformação, apresentando todas elas energias totais de ligação semelhantes. Nesses casos, a energia de deformação aquando da ligação é tomada como sendo a diferença entre a energia do composto livre e a energia média das conformações observadas quando o inibidor se liga ao enzima.

Estão disponíveis programas computacionais específicos na técnica, para avaliar a energia de deformação dos compostos e a interacção electrostática. Incluem-se nos exemplos dos programas concebidos para estas aplicações: Gaussian 94, revisão C (Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA. ©1995); AMBER, versão 7. (Kollman, University of Califórnia em S. Francisco, ©2002); QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., San Diego, CA, ©1995); Insight II/Discover 54 ΡΕ2084162 (Accelrys, Inc., San Diego, CA, ©1995); DelPhi (Accelrys, Inc., San Diego, CA, ©1995); e AMSOL (University of Minnesota) (Quantum Chemistry Program Exchange, Indiana University). Estes programas podem ser implementados, por exemplo, utilizando um servidor, tal como se conhecem na técnica, por exemplo, um servidor LINUX, SGI ou Sun. Os especialistas da técnica conhecerão outros sistemas computacionais e programas para estes efeitos.

Os indivíduos com conhecimentos médios da técnica podem expressar a proteina quinase utilizando métodos conhecidos na técnica, bem como os métodos descritos neste documento. Os polipéptidos nativos e mutados de quinase que se descrevem neste documento podem ser sintetizados quimicamente por completo ou em parte recorrendo a técnicas que são bem conhecidas neste domínio (veja-se, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co., NY, 1983).

Podem utilizar-se sistemas de expressão de genes para a síntese de polipéptidos nativos ou mutados. Podem construir-se vectores de expressão contendo o polipéptido nativo ou mutado codificando para a sua sequência e para os sinais apropriados de controlo de transcrição/tradução, que são conhecidos dos especialistas da técnica. Incluem-se nestes métodos técnica de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação/recombinação genética in vivo. Vejam-se, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 55 ΡΕ2084162

Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, NY, 1989.

Podem utilizar-se sistemas de vectores de expressão do hospedeiro para expressar quinase. Nestes se incluem, sem que a estes eles de limitem, micro-organismos tais como vectores de expressão de bactérias transformadas com ADN recombinante de bacteriófagos, ADN plasmidico ou ADN cosmidico, contendo a sequência de codificação; levedura transformada com vectores de expressão de levedura contendo a sequência de codificação; sistemas de células de insectos infectados com vectores de expressão virais (por exemplo, de baculovirus) contendo a sequência de codificação; sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão recombinantes de virus (por exemplo, virus mosaico da couve-flor, CaMV; virus mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vectores de expressão recombi-nantes de plasmideos (por exemplo, plasmideo Ti) contendo a sequência de codificação; ou sistemas de células animais. Também se pode expressar a proteina em sistemas de terapia do gene humano, incluindo, por exemplo, expressar-se a proteina para aumentar a quantidade de proteína num indivíduo, ou expressar uma proteína transformada terapêutica. Os elementos de expressão para estes sistemas variam tanto na sua potência como nas suas especificidades.

Vectores especificamente concebidos permitem trica de ADN entre hospedeiros tais como por exemplo ΡΕ2084162 bactérias e leveduras ou bactérias e células animais. Um vector de expressão adequadamente construído pode conter: uma origem de replicação para a replicação autónoma nas células hospedeiras, um ou mais marcadores seleccionáveis, um número limitado de locais úteis para enzimas de restrição, o potencial para um elevado número de cópias, e promotores activos. Define-se um promotor como uma sequência de ADN que dirige a ARN polimerase de modo a ela se ligar ao ADN e iniciar a sintese do ARN. Um promotor forte é um promotor que faça iniciar os mARN a uma frequência elevada. 0 vector de expressão também pode conter diversos elementos que afectam a transcrição e a tradução, incluindo, por exemplo, promotores constitutivos e induziveis. Estes elementos dependem amiúde do hospedeiro e/ou do vector. Por exemplo, quando se faz uma clonagem em sistemas bacterianos, podem utilizar-se promotores induziveis, tais como o promotor T7, pL do bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor hibrido ptrp-lac) e outros semelhantes; quando se faz uma clonagem em sistemas de células de insectos, podem utilizar-se promotores tais como o promotor de poliedrina de baculovirus; quando se faz uma clonagem em sistemas de células de plantas, podem utilizar-se promotores derivados do genoma de células de plantas (por exemplo, promotores do choque térmico; o promotor para a subunidade pequena de RUBISCO; o promotor para a proteina de ligação de clorofila a/b) ou de virus de plantas (por exemplo, o promotor 35S de ARN de CaMV; o promotor da proteina de revestimento de 57 ΡΕ2084162 TMV); quando se faz uma clonagem em sistemas de células de mamíferos, podem utilizar-se promotores de mamíferos (por exemplo, o promotor da metalotioneína) ou promotores virais de mamíferos, (por exemplo, o promotor tardio de adenoví-rus; o promotor 7,5 K do vírus vaccinia; o promotor SV40; o promotor do vírus de papiloma bovino; e o promotor do vírus de Epstein-Barr).

Podem utilizar-se diversos métodos para se introduzir o vector nas células hospedeiras, por exemplo, transformação, transfecção, infecção, fusão de protoplas-tos, e electroporação. As células contendo vectores de expressão são propagadas clonalmente e analisadas individualmente para se determinar se produzem os polipéptidos apropriados. Podem utilizar-se diversos métodos de selec-ção, incluindo, por exemplo, resistência a antibióticos, para se identificarem as células hospedeiras que foram transformadas. Pode fazer-se a identificação dos clones das células hospedeiras que expressam a proteína de diversas maneiras, incluindo mas não se limitando à reactividade imunológica contra anticorpos anti-quinase, e a presença de actividade associada à célula hospedeira.

Também se pode conseguir a expressão de cADN utilizando mARN sintético produzido in vitro. Pode traduzir-se eficientemente mARN sintético em diversos sistemas isentos de células, incluindo mas não se limitando a extractos de germe de trigo e extractos de reticulócitos, bem como conseguir-se uma tradução eficiente em sistemas baseados em ΡΕ2084162 células, incluindo, mas não se limitando, à microinjecção em oócitos de rã.

Para se determinar (em a(s) sequência (s) de cADN de que se obtêm niveis óptimos de actividade e/ou de proteína, constroem-se moléculas de cADN modificado. Um exemplo não limitativo de um cADN modificado ocorre quando a utilização dos codões do cADN foi optimizada para a célula de hospedeiro na qual o cADN será expresso. As células do hospedeiro são transformadas com as moléculas de cADN e medem-se os teores em ARN de quinase e/ou em proteína.

Determinam-se quantitativamente os teores em proteína quinase nas células hospedeiras por diversos métodos tais como técnicas de imunoafinidade e/ou de afinidade para ligandos, com pérolas de afinidade específica para a quinase ou com anticorpos específicos para se isolar proteína marcada ou não marcada com metionina-35S. Analisa-se a proteína marcada ou não por SDS-PAGE. Detecta-se a proteína não marcada por transferência Western, por ELISA ou por RIA empregando anticorpos específicos.

Após a expressão da quinase numa célula recombi-nante do hospedeiro, podem recuperar-se os polipéptidos para se obter a proteína sob forma activa. Estão disponíveis diversos processos de purificação que são adequados para serem utilizados. Pode purificar-se quinase recombi-nante a partir de lisados de células ou de meios de cultura acondicionados, por diversas combinações de, ou por apli- 59 ΡΕ2084162 cação individual de, por fraccionamento, ou por passos de cromatografia que são conhecidos na técnica.

Além disto, pode separar-se quinase recombinante das outras proteínas celulares utilizando uma coluna de imunoafinidade construída com anticorpos monoclonais ou policlonais específicos para a proteína nascente de comprimento inteiro ou para fragmentos polipeptídicos seus. Também se pode utilizar outras metodologias de purificação baseadas em afinidade que são conhecidas na técnica.

Em alternativa, podem recuperar-se os polipépti-dos de uma célula hospedeira sob uma forma inactiva, desdobrada, por exemplo, a partir de corpos de inclusão de bactérias. As proteínas recuperadas desta forma podem ser dissolvidas utilizando um desnaturante, por exemplo, clori-drato de guanidínio, e depois dobradas de novo a uma forma activa utilizando métodos em conhecidos dos especialistas da técnica, tais como a diálise.

Ensaios de Crescimento de Células É conhecida uma série de ensaios de crescimento de células na técnica, que são úteis para se identificarem compostos de triazole bicíclicos (isto é "compostos em teste") capazes de inibir (por exemplo diminuir) o crescimento de células e/ou a sua proliferação.

Por exemplo, sabe-se que diversas células 60 ΡΕ2084162 necessitam de quinases específicas para o seu crescimento e/ou proliferação. A capacidade de uma dessas células para crescer na presença de um composto em teste pode ser avaliada, e comparada com o seu crescimento na ausência do composto em teste, identificando-se deste modo as propriedades anti-proliferativas com composto em teste. Um método habitual deste tipo é medir-se o grau de incorporação de um marcador, tal como timidina tritiada, no ADN de células em divisão. Em alternativa, a inibição da proliferação celular pode ser avaliada determinando a actividade metabólica total de células com um marcador substituto que se correlacione com o número de células. Podem tratar-se as células com um indicador metabólico na presença e na ausência do composto em teste. As células viáveis metabolizam o indicador metabólico formando deste modo um produto metabólico detectável. Quando os teores em produto metabólico detectável diminuem na presença de composto em teste, em relação aos valores na ausência do composto em teste, está indiciada a inibição do crescimento e/ou da proliferação celular. Incluem-se nos exemplos de indicadores metabólicos, por exemplo, sais de tetrazólio e AlamorBlue® (veja-se a secção de Exemplos adiante).

Uma determinação de quinases que estimulam a migração de células é o ensaio de raspagem. Este ensaio é utilizado para avaliar inibidores de quinases por acontecimentos miméticos tais como a cicatrização de feridas. Numa variante deste ensaio utilizado para testar inibidores de MET, deixa-se formar numa placa de células uma 61 ΡΕ2084162 monocamada confluente de células. Formada esta monocamada, gera-se um ferimento linear na monocamada raspando mecanicamente a monocamada para se formar deste modo um canal isento de células. Adiciona-se um factor de crescimento de que a quinase necessite para o crescimento celular, na presença ou na ausência do composto em teste. Caso o canal se volte a fechar na presença do composto em teste, indicia-se um falhanço do composto em teste na inibição da quinase permitindo deste modo a migração de células e o seu crescimento para se fechar o canal. Em alternativa, a presença do canal depois de se adicionar o composto em teste indicia que o composto em teste inibia a quinase, impedindo deste modo o crescimento das células. A selecção das células apropriadas, das condições de crescimento adequadas, bem como dos factores de crescimento, estão todas bem dentro das capacidades de um especialista da técnica (veja-se a secção de Exemplos adiante).

Preparação de Compostos Moduladores de Proteína

Quinase

Exemplo de Síntese

Sintetizam-se os compostos do fascículo por uma combinação adequada de métodos sintéticos geralmente bem conhecidos. As metodologias úteis na sintese dos compostos do fascículo são tanto facilmente aparentes como acessíveis aos especialistas da técnica relevante. A descrição que se segue é incluída para se ilustrarem alguns destes métodos 62 ΡΕ2084162 diversos disponíveis para utilização na montagem dos compostos do fascículo. No entanto, a descrição não pretende definir o âmbito das reacções nem as sequências das reacções que são úteis na preparação dos compostos do presente fascículo. Os compostos desta especificação podem ser produzidos pelos processos e usando as técnicas descritas na secção de Exemplos adiante, bem como por técnicas de síntese orgânica que são bem conhecidas.

Grupos Protectores

Os compostos do presente fascículo podem ser sintetizados utilizando um ou mais grupos protectores conhecidos em geral na técnica da síntese química. 0 termo "grupo protector" refere-se a espécies químicas que bloqueiam algumas ou todas as espécies reactivas de um composto e evitam que essas espécies participem em reacções químicas até os grupos protectores serem removidos, por exemplo, as espécies descritas e listadas em Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a edição, John Wiley & Sons (1999). Pode ser vantajoso, quando se empregam grupos protectores diferentes, que cada grupo protector (diferente) seja removível por uma metodologia diferente. Grupos protectores que sejam clivados em condições reaccionais completamente diferentes permitem a remoção diferencial desses grupos protectores. Por exemplo, podem remover-se grupos protectores com ácido, base, e por hidrogenólise. os grupos tais como o tritilo, o dimetoxi-tritilo, o acetal e o t-butildimetilsililo são lábeis em 63 ΡΕ2084162 meio ácido e podem ser utilizados para proteger espécies reactivas carboxilo e hidroxilo na presença de grupos amino protegidos com grupos Cbz, que se podem remover por hidro-genólise, e de grupos Fmoc, que são lábeis na presença de uma base. Podem bloquear-se as espécies reactivas ácido carboxilico e hidroxilo com grupos lábeis na presença de base tais como, sem limitação, metilo, etilo, e acetilo, na presença de aminas bloqueadas com grupos lábeis na presença de ácidos, tais como carbamato de t-butilo ou de carbamatos que são estáveis tanto em meio ácido como básico, mas que se podem remover por hidrólise.

Também se podem bloquear as espécies reactivas ácido carboxilico e hidroxilo com grupos protectores removíveis por hidrólise tais como o grupo benzilo, enquanto se podem bloquear grupos amina capazes de estabelecerem ligações por pontes de hidrogénio com ácidos, com grupos base lábeis, tais como Fmoc. Podem bloquear-se espécies reactivas ácido carboxilico com grupos protectores removíveis por oxidação, tais como 2,4-dimetoxibenzilo, enquanto os grupos amino coexistentes podem ser bloqueados com carbamatos de sililo lábeis a fluoreto.

Os grupos bloqueadores alilo são úteis na presença de grupos protectores ácidos e básicos uma vez que os primeiros são estáveis e podem ser subsequentemente removidos com catalisadores metálicos ou ácidos π. Por exemplo, um grupo ácido carboxilico bloqueado com alilo pode ser desprotegido numa reacção catalisada por paládio(0), na 64 ΡΕ2084162 presença de carbamato de t-butilo lábil a ácidos ou de grupos acetato protectores de amina, lábeis a base. Outra forma de grupo protector ainda é uma resina à qual se pode ligar um composto ou um intermediário. Enquanto o residuo estiver ligado á resina, aquele grupo funcional estará bloqueado e não pode reagir. Uma vez libertado da resina, o grupo funcional fica livre para reagir.

Incluem-se, por exemplo, nos grupos de bloqueio ou protecção típicos: Η P* Η*2* X alilo

Bn

Caz a loa jCHjj {NsO-tC^ (CH&E? M?

O (c*%bc,^ir o

Xeoc

t-butilo TBDMS

(CaHsbC'

Boa

D

HaCr scefciio

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são incluídos para ilustrar, mas não para delimitar o fascículo. A preparação de concretizações do presente fascículo está descrita nos exemplos que se seguem. Os indivíduos com conhecimentos médios da técnica entenderão que as reacções químicas e os 65 ΡΕ2084162 métodos de síntese que se proporcionam podem ser modificados para se prepararem muitos dos outros compostos do presente fascículo. Quando determinados compostos do presente fascículo não tiverem sido exemplificados, os indivíduos com conhecimentos médios da técnica entenderão que estes compostos podem ser preparados modificando os métodos de síntese apresentados neste documento, e utilizando métodos de síntese conhecidos na técnica. Os exemplos 2, 3, 11, 14 e 19 dizem respeito a intermediários.

Exemplo 1: Preparação de Intermediário

Intermediário 1: 6-Bromo-5-nitro-quinolina no2

Arrefeceu-se uma solução de 6-bromoquinolina (2,0 g, 9,61 mmol) em ácido sulfúrico concentrado (10 mL) até 0°C. Adicionou-se nitrito de sódio (27 mg, 0,384 mmol), e em seguida adicionou-se gota a gota ácido nítrico concentrado (0,8 mL). Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante 45 minutos, e depois a temperatura reaccional durante 1 h, antes de se verter sobre gelo, obtendo-se um precipitado amarelo. Neutralizou-se a mistura a pH 7 com hidróxido de amónio. Filtrou-se o precipitado, lavou-se com água e secou-se em vazio para se obterem 2,26 g de 6-bromo-5-nitro-quinolina sob a forma de um sólido verde-claro (93 % de rendimento): RMN de ΧΗ (CDCI3) δ 7,62 (dd, 1H) , 7,94 66 ΡΕ2084162

(d, 1H) , 8,07 (d, 1H) , 8,17 (d, 1H) , 9,06 (dd, 1H) ; MS (m/z) 253, 255 [M+H+] .

Intermediário 2: 6-Bromo-7-fluoro-quinolina

F

Br

Aqueceu-se suavemente uma mistura de 4-bromo-3- fluoroanilina (2,85 g, 15 mmol), sulfato férrico (0,95 g, 6,25 mmol), glicerol (5,66 g, 61 mmol), nitrobenzeno (0,93 mL, 9,1 mmol), e ácido sulfúrico concentrado (2,61 mL) . Depois de uma primeira reacção vigorosa, ferveu-se a mistura durante 7 h. Evaporou-se então o nitrobenzeno em vazio. Acidificou-se a solução aquosa com ácido acético glacial, e separou-se um precipitado castanho escuro, que se recolheu e purificou por cromatografia rápida (sili-cagel, éter de petróleo/acetato de etilo = 8/1) para se obterem 1,44 g de 6-bromo-7-fluoro-quinolina sob a forma de cristais brancos (rendimento de 42,5 %) .

Intermediário 3: 6-Bromo-5-fluoro-quinolina

F

Aqueceu-se suavemente uma mistura de 4-bromo-3-fluoroanilina (100 g, 526 mmol), 30 g de sulfato ferroso, 200 g de glicerol, 40 g de nitrobenzeno e 100 mL de ácido 67 ΡΕ2084162 sulfúrico concentrado. Depois de uma primeira reacção vigorosa, ferveu-se a mistura durante cinco horas. Removeu-se o nitrobenzeno por destilação em vazio. Acidificou-se a solução aquosa com ácido acético glacial e separou-se um precipitado castanho escuro, que se purificou por cromatografia rápida (silicagel, éter de petróleo/acetato de etilo = 12/1) para se obter uma mistura de 6-bromo-7-fluoro-quinolina e 6-bromo-5-fluoro-quinolina sob a forma de um sólido branco (80 g, 68 %) . Aqueceu-se a mistura ao refluxo em éter de petróleo. Arrefeceu-se a solução até à temperatura ambiente e filtrou-se para se obter 6-bromo-7-fluoro-quinolina. Adicionou-se ao filtrado HCl/metanol, e filtrou-se o precipitado resultante. Basificou-se o sólido branco, separou-se por filtração e secou-se para se obter 6-bromo-5-fluoro-quinolina sob a forma de um sólido branco. RMN de (DMSO-d6, 300 MHz) : δ 9, 0 (d, 1H) , 8,5 (d, 1H) , 8,0 (m, 1H) , 7,8 (d, 1H) , 7,7 (m, 1H) .

Intermediário 4: 6-Bromo-7-metil-quinolina

Aqueceu-se suavemente uma mistura de 4-bromo-3-metilanilina (20 g, 107,5 mmol), sulfato férrico (6,6 g, 43,4 mmol), glicerol (40,8 g, 440 mmol), nitrobenzeno (8,12 g, 66 mmol), e ácido sulfúrico concentrado (23 mL). Depois de uma primeira reacção vigorosa, aqueceu-se a mistura à fervura durante 3 h e depois evaporou-se para remover o 68 ΡΕ2084162 excesso de nitrobenzeno. Adicionou-se à solução uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio, até pH=7-8, depois filtrou-se a solução e extraiu-se com diclorometano. Secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre Na2SC>4, filtrou-se e concentrou-se em vazio. Purificou-se o sólido por cromatografia rápida em coluna para se obter um sólido amarelo, que em seguida se lavou com éter de petróleo para se obterem 7,5 g de 6-bromo-7-metil-quinolina (rendimento de 31 %) : RMN de XH (CDC13) : 2,60 (s, 3H) , 7,36 (m, 1H) , 7,96 (s, 1 H) , 8,04 (m, 2H) , 8,89 (m, 1H) .

Intermediário 5: 6-Bromo-5-fluoro-benzotiazole

Passo 1: 6-Bromo-5-fluoro-benzotiazol-2-ilamina

Adicionou-se a uma solução de 4-bromo-3-fluoro-anilina (3,68 g, 19,37 mmol) em AcOH glacial (40 mL) , tiocianato de amónio (2,95 g, 38,74 mmol). Quando a mistura reaccional estava quase límpida, colocou-se num banho de água fria e adicionou-se-lhe gota a gota ao longo de um período de 10 minutos uma solução de bromo (3,1 g, 19,37 mmol) em AcOH glacial (10 mL) . Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 1 h, e depois concentrou-se em vazio. Retomou-se o resíduo em solução aquosa 1 N de KOH e acetato de etilo. Extraiu-se depois a fase aquosa com acetato de etilo, e adsorveu-se o conjunto ΡΕ2084162 das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-70 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 2,73 g de 6-bromo-5-fluoro-benzotiazol-2-ilamina sob a forma de um sólido amarelo claro (rendimento de 57 %) : RMN de (DMSO-d6) δ 7,29 (d, 1H) , 7,78 (s largo, 2H) , 7,99 (d, 1H) ; MS (m/z) 247, 249 [M+H+] .

Passo 2: 6-Bromo-5-fluoro-benzotiazole

Adicionou-se gota a gota a uma solução de 6-bromo-5-fluoro-benzotiazol-2-ilamina (2,73 g, 11,05 mmol) em DMF (60 mL) , nitrito de terc-butilo (1,58 mL, 13,26 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 50°C durante 3 h, e depois concentrou-se em vazio. Agitou-se o resíduo em solução aquosa 1 N de KOH durante 10 minutos, depois adicionou-se acetato de etilo e agitou-se a mistura de um dia para o outro. Separaram-se os insolúveis por filtração, lavou-se com água e depois com acetato de etilo. Separou-se o filtrado resultante, lavou-se a fase orgânica com salmoura e adsorveu-se directamente sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-30 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 1,33 g de 6-bromo-5-fluoro- benzotiazole sob a forma de um sólido amarelo-claro (rendimento de 52 %) : RMN de (DMSO-d6) δ 8,13 (d, 1H), 8,63 (d, 1H) , 9,50 (s, 1H) ; MS (m/z) 232, 234 [M+H+] . 70 ΡΕ2084162

Intermediário 6: 6-Bromo-5-metil-benzotiazole e 6-bromo-7-metil-benzotiazole

Passo 1: 6-Bromo-5-metil-benzotiazol-2-ilamina e 6-bromo-7-metil-benzotiazol-2-ilamina

Adicionou-se a uma solução de 4-bromo-3-metil-anilina (9,68 g, 52,02 mmol) em AcOH glacial (150 mL), tiocianato de amónio (7,92 g, 104,04 mmol). Quando a mistura reaccional estava quase límpida, colocou-se num banho de água fria e adicionou-se-lhe gota a gota uma solução de bromo (2,67 mL, 52,02 mmol) em AcOH glacial (5 mL) . Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 1,5 h. Filtrou-se o precipitado resultante e lavou-se com AcOH. Retomou-se o bolo branco sujo em água e neutralizou-se até pH 9 com solução aquosa 1 N de NaOH. Filtrou-se o sólido resultante, lavou-se com água e secou-se em vazio para se obterem 4,83 g de uma mistura a 4:1, respectivamente de 6-bromo-7-metil-benzotiazol-2-ilamina e 6-bromo-5-metil-benzotiazol-2-ilamina (rendimento de 38 %) : MS (m/z) 243, 245 [M+H+]+; 6-Bromo-7-metil-benzotiazol-2- ilamina: RMN de (DMSO-d6) δ 2,42 (s, 3H) , 7,10 (d, 1H), 7,39 (d, 1H) , 7,61 (s largo, 2H) . 6-Bromo-5-metil- benzotiazol-2-ilamina: RMN de XH (DMSO-d6) δ 2,35 (s, 3H), 7,31 (s, 1H), 7,57 (s largo, 2H), 7,88 (s, 1H) . 71 ΡΕ2084162

Passo 2: 6-Bromo-5-metil-benzotiazole e 6-Bromo-7-metil-benzotiazole

Adicionou-se gota a gota, a uma solução de uma mistura a 4:1 de, respectivamente, 6-bromo-7-metil-benzotiazol-2-ilamina e 6-bromo-5-metil-benzotiazol-2-ilamina (4,5 g, 18,6 mmol) em DMF (100 mL) , nitrito de terc-butilo (2,65 mL, 22,3 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 50°C durante 1,5 h, e depois concentrou-se em vazio. Retomou-se o residuo em solução aquosa 1 N de carbonato de potássio e acetato de etilo. Extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo (3 x), e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-50 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 2,1 g de uma mistura a 5:1 de, respectivamente, 6-bromo-7-metil-benzotiazole com 6-bromo-5-metil-benzotiazole (rendimento de 50 %): MS (m/z) 228, 230 [M+H+]+; 6-Bromo-7-metil-benzotiazole: RMN de 1H (DMSO-d6) δ 2,63 (s, 3H), 7,75 (d, 1H) , 7,87 (d, 1H) , 9,42 (s, 1H) . 6-Bromo-5-metil-benzo- tiazole: RMN de XH (DMSO-d6) δ 2,63 (s, 3H) , 8,09 (s, 1H) , 8,48 (s, 1H), 9,37 (s, 1H).

Intermediário 7: 6-Bromo-l-metil-l.ff-benzimidazole

72 ΡΕ2084162

Passo 1: 2,4-Dibromo-l-nitro-benzeno

Adicionou-se em porções, a uma solução arrefecida em gelo de 1,3-dibromobenzeno (10 g, 42,4 mmol) em ácido sulfúrico concentrado (200 mL), nitrato de amónio (3,39 g, 42,4 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante 15 minutos, depois verteu-se sobre uma mistura de água e gelo. Extraiu-se a mistura aquosa com diclorometano (2 x). Lavou-se o conjunto das fases orgânicas com água e depois com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2 x), secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se, e concentrou-se em vazio. Triturou-se o resíduo em hexano, filtrou-se, e secou-se em vazio para se obterem 7,63 g de 2,4-dibromo-l-nitro-benzeno sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 64 %) : RMN de (CDC13) δ 7,62 (dd, 1H) , 7,78 (d, 1H) , 7, 95 (d, 1H) .

Passo 2: (5-Bromo-2-nitro-fenil)-metil-amina

Adicionou-se a uma solução de 2,4-dibromo-l-nitro-benzeno (2,0 g, 7,14 mmol) em etanol (50 mL) , uma solução aquosa a 40 % de metilamina (50 mL) . Agitou-se a mistura reaccional a 80°C num reactor fechado durante 3 h, depois arrefeceu-se a 0°C. Adicionou-se água e filtrou-se o precipitado, lavou-se com água, e secou-se em vazio para se obterem 1,26 g de (5-bromo-2-nitro-fenil)-metil-amina sob a forma de um sólido cor de laranja (rendimento de 76 %): RMN de XH (CDC13) δ 3,04 (s, 3H) , 6,79 (dd, 1H) , 7,03 (d, 1H) , 8,05 (d, 1H) , 8,0-8,1 (s largo, 1H) ; MS (m/z) 231,233 [M+H+] +. ΡΕ2084162 73

Passo 3: 6-Bromo-l-metil-líí-benzimidazole

Adicionou-se a uma suspensão de (5-bromo-2-nitro-fenil)-metil-amina (1,2 g, 5,19 mmol) em etanol (25 mL) , cloreto de estanho(II) (1,97 g, 10,39 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 80°C durante 4 h, e depois concentrou-se em vazio. Adicionou-se ao residuo tolueno (12 mL) , ortoformato de trimetilo (0,625 mL, 5,71 mmol), e ácido paratoluenossulfónico (49 mg, 0,26 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 110°C durante 15 h, e depois concentrou-se em vazio e adsorveu-se o residuo sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-8 % de metanol/diclorometano proporcionou 482 mg de 6-bromo-l-metil-l-ff-benzimidazole sob a forma de um sólido cor de laranja escuro (rendimento de 44 %): RMN de 1H (DMSO-d6) δ 3,83 (s, 3H) , 7,33 (dd, 1H) , 7,59 (d, 1H) , 7,86 (d, 1H) , 8,21 (s, 1H); MS (m/z) 211, 213 [M+H+]+.

Intermediário 8: Ester 3-metil-3Jí-benzimidazol-5-ilico do ácido trifluorometanossulfónico

F3C

ch3

N

N

Passo 1: 3-Metilamino-4-nitro-fenol

Adicionou-se a um reactor para trabalhar sob 74 ΡΕ2084162 pressão 3-fluoro-4-nitro-fenol (5,0 g, 31,82 iranol) e uma solução aquosa de metilamina a 40 % (10 mL) . Agitou-se a mistura reaccional a 85°C durante 5 h, e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente, verteu-se sobre água, e acidificou-se até pH 1 com uma solução aquosa 1 N de HC1. Filtrou-se o precipitado resultante, lavou-se com água, e secou-se em vazio para se obterem 5,23 g de 3-metilamino-4-nitro-fenol sob a forma de um sólido cor-de-laranja (rendimento de 98 %) : RMN de ΧΗ (DMS0-d6) δ 2,88 (d, 3H) , 6,14 (dd, 1H) , 6,17 (d, 1H) , 7,96 (d, 1H) , 8,25 (q, 1H) , 10,8 (s largo, 1H); MS (m/z) 167 [M-H]”.

Passo 2: 3-Metil-3H-benzimidazol-5-ol

Adicionou-se a uma suspensão de 3-metilamino-4-nitro-fenol (300 mg, 1,786 mmol) em ácido fórmico (4 mL) , ferro em pó (1,0 g, 17,86 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 100°C de um dia para o outro, e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e diluiu-se com metanol. Filtrou-se e lavaram-se os insolúveis com metanol. Concentrou-se o filtrado em vazio e adsorveu-se sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-15 % de metanol/di-clorometano proporcionou 249 mg de 3-metil-3H-benzimidazol-5-ol sob a forma de um sólido castanho-claro (rendimento de 94 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 3,71 (s, 3H) , 6,69 (dd, 1H), 6,81 (d, 1H) , 7,40 (d, 1H), 7, 94 (s, 1H), 9,3 (s largo, 1H); MS (m/z) 149 [M+H] +. 75 ΡΕ2084162

Passo 3: Éster 3-metil-3.ff-benzimidazol-5-i.lico de ácido trifluorometanossulfónico

Adicionou-se a uma suspensão de 3-metil-3H-benzimidazol-5-ol (245 mg, 1, 655 mmol) em THF (5 mL) num balão para reacção sob micro-ondas, carbonato de potássio (417 mg, 3,02 mmol) e iV-fenil-bis (trifluorometanossulfo-nimida) (1,18 g, 3,31 mmol). Tapou-se o balão para micro-ondas e aqueceu-se num reactor de micro-ondas a 120°C durante 20 minutos. Retomou-se a mistura reaccional em água e acetato de etilo. Extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-40 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 235 mg de éster 3-metil-3ff-benzimidazol-5-ίlico do ácido trifluorometanossulfónico sob a forma de um óleo castanho (rendimento de 51 %): RMN de (DMS0-d6) δ 3,88 (s, 3H) , 7,28 (dd, 1H) , 7,80 (d, 1H) , 7,87 (d, 1H), 8,37 (s, 1H); MS (m/z) 281 [M+H]+.

Intermediário 9: Éster 7-metil-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico

Passo 1: 7-Metil-quinolin-6-ol

Purgou-se um frasco com azoto e carregou-se com 76 ΡΕ2084162 6-bromo-7-metil-quinolina (2,0 g, 9 iranol) , com KOH moído (2,02 g, 36 mmol), com tris(dibenzilidenoacetona)dipa-ládio(O) (165 mg, 0,18 mmol), e com X-Phos (ligando Strem, 343 mg, 0,72 mmol). Adicionaram-se água (6 mL) e 1,4-dioxano (6 mL) , e agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 2h. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, acidificou-se a mistura reaccional até pH 5 com solução aguosa 1 N de HCl e extraiu-se com acetato de etilo (2 x). Adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-100 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 1,37 g de 7-metil-quinolin-6-ol sob a forma de um sólido amarelo-claro (rendimento de 95 %: RMN de ΧΗ (DMS0-d6) δ 2,34 (s, 3H) , 7,12 (s, 1H) , 7,32 (dd, 1H) , 7,73 (s, 1H) , 8,07 (dd, 1H) , 8,60 (dd, 1H) , 10,1 (s largo, 1H); MS (m/z) 160 [M+H]+.

Passo 2: Éster 7-metil-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico

Adicionou-se a uma suspensão de 7-metil-quinolin-6-ol (870 mg, 5,47 mmol) em THF (10 mL) num reactor para micro-ondas, carbonato de potássio (2,27 g, 16,41 mmol) e N-fenil-bis(trifluorometanossulfonimida) (3,9 g, 10,94 mmol). Tapou-se o reactor para micro-ondas e aqueceu-se num forno de micro-ondas a 120°C durante 20 minutos. Retomou-se a mistura reaccional em água e acetato de etilo. Extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por 77 ΡΕ2084162 cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-30 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 1,48 g de éster 7-metil-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico sob a forma de um óleo limpido (rendimento de 93 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 2,53 (s, 3H) , 7,60 (dd, 1H) , 8,12 (s, 1H) , 8,15 (s, 1H) , 8,50 (dd, 1H) , 8,97 (dd, 1H); MS (m/z) 292 [M+H]+.

Intermediário 10: N-Óxido do éster quinolin-6-ilico do ácido Trifluorometanossulfónico

O P3<V0 Oí

Adicionou-se a uma solução de éster quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico (200 mg, 0,721 mmol) em diclorometano (3 mL), mCPBA (213 mg, 0,865 mmol). Agitou-se a mistura reaccional durante 2 h, e depois diluiu-se com diclorometano e lavou-se com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (3 x). Adsorveu-se a fase orgânica sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 50-100 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 185 mg de iV-óxido do éster quinolin-6-ilico do ácido trifluorometanossulfónico, sob a forma de um sólido branco (rendimento de 87 %) : RMN de 1H (DMSO~d6) δ 7,60 (dd, 1H) , 7,91 (dd, 1H) , 8,05 (d, 1H) , 8,40 (d, 1H) , 8,68 (m, 2H); MS (m/z) 294 [M+H]+. 78 ΡΕ2084162

Intermediário 11: 3-(3-Fluoro-4-nitro-fenilsulfa-nil) -6- (l-metil-l.ff-pirazol-4-il) -[1,2,4]triazolo[4,3-Jb] piridazina

Desgaseificou-se uma solução de éster 3-fluoro-4-nitro-fenílico do ácido trifluoro-metanossulfónico (1,51 g, 4,74 mmol), di-isopropiletilamina (1,5 mL, 8,62 mmol) em DMF (14 mL) sob azoto, borbulhando-se azoto através dela durante 10 minutos. Adicionaram-se-lhe em conjunto e de uma só vez tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio (99 mg, 0,108 mmol, catalisador Strem) e Xantphos (125 mg, 0,215 mmol), e em seguida adicionou-se 6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol (1,0 g, 4,31 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 3 h, e depois concentrou-se em vazio. Retomou-se o resíduo em solução aquosa saturada de cloreto de amónio, e metanol a 10 % em diclorometano. Extraiu-se a fase aquosa com metanol a 10 % em diclorometano, e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas directamente sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano proporcionou 387 mg de 3-(3-fluoro-4-nitro-fenilsulfanil)-6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[ 1,2,4 ] triazolo [ 4,3-£>] piridazina sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 24 %): RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 3,90 (s, 3H) , 7,20 (dd, 1H) , 7,59 (dd, 1H) , 7,87 (d, 1H), 8,06 (m, 2H), 8,46 (s, 1H), 8,54 (d, 1H); MS (m/z) 372 [M+H] +. ΡΕ2084162 79

Intermediário 12: Éster 3-fluoro-4-nitro-fenilico do ácido trifluoro-metanossulfónico

no2 F 0r F3C'Ss

Adicionou-se sequencialmente a um balão para micro-ondas 3-fluoro-4-nitrofenol (2,0 g, 12,73 mmol), carbonato de potássio (5,28 g, 38,19 mmol), N-fenil-bis(trifluorometanossulfonimida) (5,46 g, 15,27 mmol), e THF (10 mL). Tapou-se o balão para micro-ondas e aqueceu-se num forno de micro-ondas a 120°C durante 20 minutos. Retomou-se a mistura reaccional em água e acetato de etilo. Extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo e lavou-se o conjunto das fases orgânicas com salmoura, e adsorveu-se directamente sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-20 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 2,93 g de éster 3-fluoro-4-nitro-fenílico do ácido trifluorometanossulfónico sob a forma de um liquido amarelo-claro (rendimento de 80 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 7,68 (d, 1H) , 8,13 (d, 1H) , 8,39 (t, 1H) .

Intermediário 13: 2-(6-Bromo-quinolin-4-iloxi)- etanol HO—o

Adicionou-se gota a gota, a uma suspensão de 80 ΡΕ2084162 hidreto de sódio (suspensão a 60 %, 40 mg, 0,99 mmol) em DMF (3 mL) sob uma atmosfera de azoto, etilenoglicol. Agitou-se a mistura reaccional durante 20 minutos antes de se lhe adicionar 4-cloro-6-bromoquinolina (200 mg, 0,825 mmol) de uma só vez. Agitou-se a mistura reaccional a 90°C durante 22 h. Adicionaram-se mais 20 mg de hidreto de sódio passadas 16 h. Arrefeceu-se a mistura até à temperatura ambiente e concentrou-se em vazio. Dissolveu-se o residuo em metanol e adsorveu-se a solução sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano proporcionou 127 mg de 2-(6-bromo-quinolin-4-iloxi)-etanol sob a forma de um sólido branco (rendimento de 57 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 3,93 (q, 2H) , 4,32 (t, 2H) , 5,21 (t, 1H) , 7,14 (d, 1H) , 7,94 (m, 2H), 8,50 (d, 1H), 8,82 (d, 1H) ; MS (m/z) 268, 270 [M+H]+.

Intermediário 14: 6-Bromo-4-(4-metil-4Jí-[l, 2,4]-triazol-3-ilsulfanil)-quinolina

Carregou-se um frasco com tampa com 4-cloro-6-bromoquinolina (500 mg, 2,06 mmol), 4-metil-4H-[ 1,2,4]triazole-3-tiol (238 mg, 2,06 mmol), carbonato de potássio (427 mg, 3,09 mmol), e DMF (5 mL) . Agitou-se a mistura reaccional a 60°C durante 18 h e depois a 90°C 81 ΡΕ2084162 durante mais 24h, e arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Verteu-se a mistura reaccional sobre água (50 mL) , e filtrou-se o precipitado resultante, lavou-se com água e secou-se numa estufa de vácuo a 70°C de um dia para o outro para se obterem 600 mg de 6-bromo-4-(4-metil-4H-[1,2,4]triazol-3-ilsulfanil)-quinolina sob a forma de um sólido branco (rendimento de 91 %): RMN de (DMSO-d6) δ 3,63 (s, 3H) , 6,90 (d, 1H) , 8,02 (m, 2H) , 8,40 (d, 1H) , 8,74 (d, 1H), 8,92 (s, 1H); MS (m/z) 321, 323 [M+H]+.

Intermediário 15: Éster 3-bromo-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico

o2

FlC'Sb

Br

Passo 1: Quinolin-6-ol

Aqueceu-se suavemente uma mistura de 4-aminofenol (44,7 g, 0,41 mol) , sulfato ferroso (14 g, 0,05 mol) , glicerol (120 mL, 1,65 mL) , p-nitrofenol (33,3 g, 0,24 mol), e ácido sulfúrico concentrado (20 mL), a 70°C. Em seguida adicionou-se gota a gota uma segunda porção de ácido sulfúrico concentrado (25 mL) à mistura reaccional, e agitou-se a mistura ao refluxo durante 8 horas. Depois de se arrefecer até à temperatura ambiente, basificou-se a mistura reaccional até pH=5,5 usando uma solução aquosa a 15 % de hidróxido de sódio, num banho de gelo. Filtrou-se o precipitado resultante, secou-se e obtiveram-se 25 g de 82 ΡΕ2084162 quinolin-6-ol sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 42 %) .

Passo 2: Éster quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico

Dissolveu-se quinolin-6-ol (2,9 g, 20 mmol) em piridina (30 mL) . Arrefeceu-se a mistura até 0°C com um banho de gelo, sob azoto, e adicionou-se lentamente TÍ20 (4 mL, 24 mmol) à mistura reaccional. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 5 horas, antes de se retomar em diclorometano (50 mL) e solução aquosa saturada de NaHCCg (50 mL) . Separou-se a fase orgânica e lavou-se com salmoura (5 x 30 mL). Secou-se a fase orgânica sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se em vazio. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna para se obterem 3,9 g de éster quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico sob a forma de um óleo castanho (rendimento de 70 %) .

Passo 3: Éster 3-bromo-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico

Adicionou-se gota a gota, a uma mistura de éster quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico (3,88 g, 14 mmol) e piridina (2,26 mL, 28 mmol) em CCI4 (50 mL) , bromo (0,86 mL, 16,8 mmol). Aqueceu-se a mistura ao refluxo durante 2 h e arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Decantou-se o líquido existente no frasco e lavou-se com 83 ΡΕ2084162

NaHC03 e com água. Tratou-se o sólido escuro presente no fundo do frasco com NaHC03 e com diclorometano. Lavou-se o conjunto das fases orgânicas com água mais uma vez e secou-se antes de se evaporar à secura. Purificou-se o produto em bruto por cromatografia rápida em coluna eluindo com éter de petróleo/acetato de etilo (de 10/1 a 1/1) para se obterem 1,3 g de éster 3-bromo-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico: RMN de ΧΗ (300MHz, CDCI3) δ: 7,62 (m, 1H) , 7,68 (d, 1H) , 8,20 (d, 1H) , 8,36 (m, 1H) , 8,98 (d, 1H); MS (m/z) 356 [M+H]+.

Intermediário 16: Ester 5-(l-meti-l.ff-pirazol-4-il)-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico

Passo 1: 6-Metoxi-quinolina

Aqueceu-se suavemente uma mistura de p-metoxianilina (24,6 g, 0,2 mol), sulfato ferroso (8,34 g, 0,03 mol), glicerol (73,6 g, 60 mL), p-nitrofenol (16,68 g, 0,12 mol), e ácido sulfúrico concentrado (10 mL) , a 70°C. Em seguida adicionou-se gota a gota uma segunda porção de ácido sulfúrico concentrado (25 mL) à mistura reaccional, e agitou-se ao refluxo durante 8 horas. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, basificou-se a mistura reaccional até pH=5,5 com uma solução aquosa de hidróxido ΡΕ2084162 de sódio a 15 %, num banho de gelo. Filtrou-se o precipitado resultante, secou-se obtendo-se 16 g de 6-metoxi-quinolina sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 50 %) .

Passo 2: 5-Bromo-6-metoxi-quinolina

Adicionou-se gota a gota, a uma mistura de 6-metoxi-quinolina (13,0 g, 0,082 mol) e piridina (13,2 mL, 0,164 mol) em CC14 (130 mL) , bromo (8,4 mL, 0,164 mol. Aqueceu-se a mistura ao refluxo durante 2 h e arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Decantou-se o liquido no frasco e lavou-se com solução aquosa saturada de NaHCCh e com água. Tratou-se o sólido escuro do fundo do frasco com NaHC03 e com diclorometano. Lavou-se o conjunto das fases orgânicas de novo com água e secou-se antes de se evaporar à secura. Purificou-se o produto em bruto por cromatografia rápida em coluna eluindo com éter de petróleo/acetato de etilo (de 10/1 a 1/1) para se obterem 7 g de 5-bromo-6-metoxi-quinolina sob a forma de um sólido vermelho (rendimento de 36 %).

Passo 3: 6-Metoxi-5-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)- quinolina

Aqueceu-se uma mistura de 5-bromo-6-metoxi-quinolina (6,5 g, 0,021 mol), éster pinacólico do ácido 1-metil-4-pirazoleborónico (8,74 g, 0,042 mol), Na2CC>3 (6,687 g, 0,063 mol), Pd(dppf)Cl2 (1,7 g, 0,001 mol), H2O (32 mL) 85 ΡΕ2084162 e 1,4-dioxano (80 mL) a 100°C de um dia para o outro. Depois de se arrefecer até à temperatura ambiente, removeu-se a maior parte do dioxano em vazio. Diluiu-se a mistura com acetato de etilo (50 mL) e salmoura (50 mL). Separou-se a fase orgânica e extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo (2 x 50 mL). Secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o residuo por cromatografia em coluna para se obterem 7 g do composto 6-metoxi-5- (l-metil-líí-pirazol-4-il) -quinolina.

Passo 4: 5-(l-Metil-l.ff-pirazol-4-il)-quinolin-6- ol

Colocou-se o composto 6-metoxi-5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolina (5,5 g, 0,023 mol) e diclorometano (50 mL) num balão. Adicionou-se uma solução de tribrometo de boro (27,6 mL, solução 1 M em diclorometano, 27,6 mmol) a 0°C. Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante 15 minutos, depois removeu-se o banho de arrefecimento e agitou-se a mistura reaccional durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Terminou-se a reacção adicionando lentamente à mistura um excesso de ácido clorídrico aquoso a 10 %, depois basificou-se a solução até pH=6 com solução aquosa de hidróxido de sódio a 20 %. Extraiu-se a mistura com acetato de etilo e lavou-se a fase orgânica com salmoura, secou-se sobre Na2S04, e filtrou-se. Removendo o solvente obteve-se 4 g de 5-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) -quinolin-6-ol sob a forma de um sólido amarelo. 86 ΡΕ2084162

Passo 5: Éster 5-(l-metil-lJí-pirazol-4-il)-qui-nolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico

Dissolveu-se 5- (l-metil-lfí-pirazol-4-il) -quino-lin-6-ol (2,9 g, 12,89 iranol) em piridina (30 mL) e arrefeceu-se a mistura até 0°C com um banho de gelo, sob um caudal de azoto. Adicionou-se lentamente Tf20 (2,6 mL, 15,47 mmol). Em seguida agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 5 horas. Retomou-se a mistura em diclorometano (50 mL) e solução aquosa saturada de NaHCCb (50 mL) . Separou-se a fase orgânica e lavou-se com salmoura (5 x 30 mL) . Secou-se a fase orgânica sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna para se obterem 3,9 g de éster 5-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) -quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico (rendimento de 84 %) : RMN de XH (30 0 MHz, CDC13) δ: 4, 05 (s, 3H), 7, 48-7,44 (m, 1H) , 7,69-7,61 (m, 3H) , 8,18 (d, 1H) , 8,32 (m, 1H) , 8, 98 (m, 1H); MS (m/z) 358 [M+H]+.

Intermediário 17: Éster 3-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)-quinolin-6-ilico do ácido trifluoro-metanossulfónico

87 ΡΕ2084162

Passo 1: Éster quinolin-6-ilico do ácido acético

Dissolveu-se quinolin-6-ol (135 g, 0,93 mol) em piridina (500 mL) e arrefeceu-se a 0°C com um banho de gelo, sob uma corrente de azoto. Adicionou-se lentamente cloreto de acetilo (79 mL, 1,16 mol) à mistura reaccional. Em seguida agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 3 horas. Retomou-se a mistura em acetato de etilo (400 mL) e solução aquosa saturada de NaHCCR (200 mL) . Separou-se a fase orgânica e lavou-se com salmoura (5 x 200 mL) . Secou-se a fase orgânica sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se em vazio. Purificou-se o resíduo por cromatograf ia em coluna para se obterem 120 g de éster quinolin-6-ílico do ácido acético sob a forma de um sólido branco (rendimento de 69 %).

Passo 2: Éster 3-bromo-quinolin-6-ílico do ácido acético

Adicionou-se gota a gota, a uma mistura de éster quinolin-6-ílico do ácido acético (120 g, 0,642 mol) e piridina (114 mL, 1,41 mol) em 6 L de CCI4, Br2 (66 mL, 1,28 mol). Aqueceu-se a mistura ao refluxo durante 2 horas antes de se arrefecer até à temperatura ambiente. Decantou-se o líquido existente no balão e lavou-se com uma solução aquosa saturada de NaHCCb e com água. Retomou-se o sólido escuro no fundo do balão entre solução aquosa de NaHCCh e diclorometano. Lavou-se o conjunto das fases orgânicas de novo com água e secou-se antes de se evaporar à secura em 88 ΡΕ2084162 vazio. Purificou-se o produto em bruto por cromatografia rápida em coluna eluindo com éter de petróleo/acetato de etilo (de 10/1 a 1/1), para se obterem 108 g do éster 3-bromo-quinolin-6-ílico do ácido acético sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 63 %) .

Passo 3: 3-(l-Metil-lJí-pirazol-4-il)-quinolin-6- ol

Aqueceu-se uma mistura de éster 3-bromo-quinolin-6-ílico do ácido acético (108 g, 0,406 mol), éster pinacólico do ácido l-metil-4-pirazoleborónico (169 g, 0,752 mol), Na2CC>3 (129 g, 1,28 mol), Pd(dppf)Cl2 (32,8 g, 0,0406 mol), H20 (607 mL) e 1,4-dioxano (1.000 mL) a 100°C de um dia para o outro. Depois de se arrefecer até à temperatura ambiente, removeu-se a maior parte do dioxano em vazio. Retomou-se a mistura em acetato de etilo (500 mL) e salmoura (500 mL) . Separou-se a fase orgânica e extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo (2 x 500 mL) . Secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se em vazio. Purificou-se o residuo por cromatografia em coluna para se obterem 54 g de 3-(l-metil-lfí-pirazol-4-il)-quinolin-6-ol sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 59 %) .

Passo 4: Éster 3-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)-qui-nolin-6-ilico do ácido trifluoro-metanossulfónico

Arrefeceu-se uma solução de 3- (1-metil-lfí- 89 ΡΕ2084162 pirazol-4-il)-quinolin-6-ol (54 g, 0,24 mol) em piridina (400 mL) até 0°C num banho de gelo, em corrente de azoto. Adicionou-se anidrido triflico (48 mL, 0,28 mol) à mistura reaccional lentamente e agitou-se à temperatura ambiente durante 5 horas. retomou-se a mistura reaccional em diclorometano (300 mL) e solução aquosa saturada de NaHC03 (200 mL). Separou-se a fase orgânica e lavou-se com salmoura (5 x 300 mL) . Secou-se a fase orgânica sobre Na2SC>4, filtrou-se e concentrou-se em vazio. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna para se obterem 58 g de éster 3-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) -quinolin-6-ílico do ácido trifluoro-metanossulfónico sob a forma de um sólido branco (rendimento de 70 %) ; RMN de ΧΗ (CDCls, 300 MHz) : 9, 30 (d 1H) , 8,62 (d, 1H) , 8,43 (s, 1H) , 8,16 (d, 1H) , 8, 11 (s 1H), 8,10 (d, 1H), 7,76 (m, 1H), 3,92 (s, 3H); MS (m/z) 358 [M+H]+.

Intermediário 18: Éster etílico do ácido 2-(4-iodo-pirazol-l-il)-2-metil-propiónico

i de iodopirazole (1,0 de sódio (dispersão a Depois de se agitar uma solução de 2-4,59 mmol) em DMF (4

Adicionou-se a uma solução g, 5,10 mmol) em DMF (10 mL), hidreto 60 % em óleo, 245 mg, 6,12 mmol) . durante 10 minutos, adicionou-se bromoisobutirato de etilo (0,681 mL, mL). Agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 18 90 ΡΕ2084162 horas. Diluiu-se a mistura com acetato de etilo e lavou-se a fase orgânica com água, com salmoura e secou-se sobre sulfato de sódio para se obterem 1,3 g de éster etílico do ácido 2-(4-iodo-pirazol-l-il)-2-metil-propiónico sob a forma de um óleo límpido (rendimento de 83 %) ; RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 1,11 (t, 3H) , 1,73 (s, 6H) , 4,08 (q, 2H), 7,57 (s, 1H), 8,11 (s, 1H); MS (m/z) 309 [M+H]+.

Intermediário 19: 4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]- dioxaborolan-2-il)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-1H-pirazole

h3C h3C^ h3c

p-\ ch3 '-Si h3c ch3

Preparou-se o composto em título consoante o processo descrito no US: 2006/10.142.307 AI

Intermediário 20: l-metil-d3-4-(4,4,5,5—tetra- metil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole h3G. Ph3 Η3°7Λ 4 h3c L N-CD3

Adicionou-se a uma solução de 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (5,0 g, 25,8 mmol) e Cs2C03 (10,1 g, 30, 96 mmol) em DMF (105 mL) , CD3I (1,77 mL, 28,38 mmol). Agitou-se a mistura durante 3 horas e depois extraiu-se com acetato de etilo e lavou-se ΡΕ2084162 com água (3 x) e com salmoura (3 x) e secou-se sobre sulfato de sódio, removeram-se os voláteis para se obter o l-metil-d3-4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (2,7 g, rendimento de 50 %) ; RMN de ΧΗ (DMSO-dô) δ 1,25 (s, 12H) , 7,55 (s, 1H) , 7,90 (s, 1H) ; MS (m/z) 212 [M+H] +.

Intermediário 21: 5- (l-metil-l.ff-pirazol-4-il) -1H-pirrolo[2,3-b]piridina:

Colocaram-se 5-bromo-l.ff-pirrolo [2,3-b] piridina (1,0 g, 5,05 miriol) , l-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2] dioxaborolan-2-il)-lfí-pirazole (1,17 g, 5,55 mmol) e Pd(dppf)Cl2 (37 mg, 0,045 mmol) num balão de fundo redondo purgado com N2. Dissolveram-se os reagentes em DMA (6 mL) e purgou-se com N2. Adicionou-se então lentamente uma solução aquosa de K2C03 (978 mg em 6 mL) à mistura reaccional, mantendo a temperatura inferior a 40°C, e purgou-se durante 10 minutos com N2. Aqueceu-se então a solução a 75°C de um dia para o outro. Parou-se o aquecimento e adicionaram-se 12 mL de H20. Aqueceu-se então a solução a 60°C durante 1 h. Em seguida, transferiu-se a solução para uma ampola de decantação e extraiu-se com diclorometano (100 mL x 2). Secou-se a fase orgânica sobre Na2SC>4 e concentrou-se, 92 ΡΕ2084162 adsorvendo-se sobre silicagel. Purificou-se a mistura reaccional por cromatografia rápida utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano para se obterem 780 mg de 5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo[2,3-b]piridina (rendimento de 78 %) : RMN de 1H (DMSO-de) δ 3,94 (3H, s) , 6,49 (1H, d), 7,38 (1H, d), 7,84 (1H, s) , 7,97 (1H, s) , 8,12 (1H, d), 8,38 (1H, d); MS (m/z) 199 [M+H]+.

Intermediário 22: Éster terc-butílico do ácido (6-bromo-quinolin-4-il)-carbâmico

Adicionou-se a uma solução de 6-bromo-quinolina-4-ilamina (100 mg, 0,45 mmol) [preparada consoante o J. Med. Chem. 1978, 21, 271] e 4-dimetilaminopiridina (5,5 mg, 0,045 mmol) em diclorometano (2 mL), anidrido de tBOC (122 mg, 0,56 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente de um dia para o outro, e depois concentrou-se em vazio. Purificou-se o produto em bruto por cromatografia rápida utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano para se obterem 123 mg de éster terc-butilico do ácido (6-bromo-quinolin-4-il)-carbâmico (rendimento de 85 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-de) δ 1,54 (s, 9H) , 7,90 (m, 2H) , 8,03 (d, 1H) , 8,75 (s, 1H) , 8,79 (d, 1H) , 10,00 (s, 1H); MS (m/z) 325 [M+H]+. 93 ΡΕ2084162

Intermediário 23: Éster terc-butilico do ácido (6-bromo-quinolin-3-il)-carbâmico

Br

Desgaseificou-se uma solução de ácido 6-bromo-quinolina-3-carboxílico (500 mg, 1,98 inmol) e trietilamina (3,97 mmol) em terc-butanol (2 mL) borbulhando azoto através dela durante 5 minutos, e adicionou-se-lhe DPPA (3, 97 mmol, 858 mg) . Agitou-se a mistura reaccional ao refluxo durante 4 h. Removeu-se o solvente em vazio, e retomou-se o resíduo em água e acetato de etilo. Extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo (2 x) , e lavou-se o conjunto das fases orgânicas sequencialmente com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e com salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se, e concentrou-se em vazio. Purificou-se o resíduo por cromato-grafia rápida utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano para se obterem 347 mg de éster terc-butilico do ácido (6-bromo-quinolin-3-il)-carbâmico (rendi- mento de 54 %) : RMN de XH (DMSO-dg) δ 1,53 (s, 9H) , 7, 69 (dd, 1H) , 7,85 (d, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,48 (s, 1H) , 8,85 (d, 1H) , 10,00 (s lg, 1H); MS (m/z) 325 [M+H] + .

Intermediário 24: Éster 4-etil-quinolin-6-ílico do ácido trifluoro-metanossulfónico o2 F=c'% ΡΕ2084162

Passo 1: 4-Etil-quinolin-6-ol

Desgaseificou-se uma mistura de tolueno (17 mL) com solução aquosa 2 M de carbonato de sódio (5 mL) borbulhando azoto durante 20 minutos através da mistura. Adicionou-se-lhe 4-cloro-6-metoxi-quinolina (500 mg, 2,58 iranol) e tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) (90 mg, 0,0774 mmol), e em seguida uma solução 1 M de trietilborano em hexano (15,5 mL, 15,5 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 90°C durante 4 dias, adicionando-lhe periodicamente mais catalisador de paládio (270 mg no total) e mais solução de trietilborano (30 mL no total) para que a reacção prosseguisse. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e retomou-se em água e acetato de etilo. Separou-se a fase orgânica, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se, e adsorveu-se sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida utilizando um gradiente de 0-70 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 579 mg de 4-ethyl-6-metoxi-quinolina impura sob a forma de um sólido ceroso branco sujo. Tratou-se o sólido com ácido sulfúrico concentrado (6 mL) e água (4 mL) . Agitou-se a mistura reaccional ao refluxo durante 5 h e verteu-se sobre gelo. Adicionou-se hidróxido de amónio até pH 9 e extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo (2 x) . Adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida utilizando um gradiente de 0-80 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 195 mg de 4-etil-quinolin-6-ol sob a forma de um sólido 95 ΡΕ2084162 branco sujo (rendimento de 44 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 1,30 (t, 3H) , 2,96 (q, 2H) , 7,25 (d, 1H) , 7,28 (m, 2H) , 7,86 (d, 1H) , 8,56 (d, 1H) , 9, 98 (s largo, 1H) ; MS (m/z) 174 [Μ+Η] +.

Passo 2: Ester 4-etil-quinolin-6-ilico do ácido trifluoro-metanossulfónico

Num balão para micro-ondas colocaram-se sequencialmente 4-etil-quinolin-6-ol (177 mg, 1,022 mmol), carbonato de potássio (424 mg, 3, 066 mmol), IV-fenil-bis (tri-fluorometanossulfonimida) (730 mg, 2,044 mmol), e THF (5 mL). Tapou-se o balão e aqueceu-se num reactor de microon-das a 120°C durante 20 minutos. Retomou-se a mistura reaccional em água e acetato de etilo. extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo e secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e adsorveu-se sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-50 % de acetato de etilo/hexano proporcionou 286 mg de éster 4-etil-quinolin-6-ílico do ácido trifluoro-metanossulfónico sob a forma de um óleo limpido (rendimento de 92 %): RMN de XH (DMSO-dé>) δ 1,31 (t, 3H) , 3,13 (q, 2H) , 7,53 (d, 1H) , 7,86 (dd, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,30 (d, 1H), 8,92 (d, 1H); MS (m/z) 306 [M+H]+.

Intermediário 25: 1-Etil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole ΡΕ2084162 96

HjC®3 CH3 Η*./'?

H3C

I N

Preparou-se o composto em titulo consoante o processo descrito em Ivachtchenko, A.V. et al., J. Heterocyclic Chem. 2004, 41, 931.

Intermediário 26: Éster terc-butílico do ácido 3-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3]dioxolan-2-il)-pirazol-1— ilmetil]-azetidina-l-carboxilico

Preparou-se o composto em titulo consoante o processo descrito no WO 2006/021.881.

Intermediário 27: Éster terc-butílico do ácido 3— [4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-pirazol-1-il]-azetidina-l-carboxilico

Preparou-se o composto em titulo consoante o processo descrito no WO 2006/021.881. 97 ΡΕ2084162

Exemplo 2: 6-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il) - [1,2,4] - triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol

Passo 1: 3-Cloro-6-(l-metil-lJí-pirazol-4-il)- plridazina

Desgaseificou-se borbulhando azoto uma mistura de 3,6-dicloropiridazina (20,1 g, 135 mmol) , éster pinacólico do ácido l-metil-4-pirazoleborónico (22,46 g, 108 mmol) e K2CO3 (44,71 g, 324 mmol) em 500 mL de dioxano e 200 mL de H2O. Adicionou-se a esta mistura aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paládio(II) com diclorometano (5,28 g, 7,2 mmol), borbulhando-se azoto através da mistura durante mais 20 minutos. Aqueceu-se a mistura reaccional a 80°C durante 4 h, depois concentrou-se em vazio. Purificou-se o residuo por cromatografia rápida em coluna com diclorometano como eluente para se obterem 21 g de 3-cloro-6- (l-metil-lií-pirazol-4-il) -piridazina (rendimento de 76 %) : RMN de (CDC13) δ 3,99 (s, 3H) , 7,45 (d, 1H) , 7,56 (d, 1H), 7,97 (s, 1H), 8,11 (s, 1H).

Passo 2: [6-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)-piridazin- 3-il]-hidrazina

Adicionou-se a uma suspensão de 3-cloro-6-(1- 98 ΡΕ2084162 metil-lií-pirazole-4-il)-piridazina (21,0 g, 108 mmol) em etanol (370 mL), mono-hidrato de hidrazina (36 mL). Agitou-se a mistura reaccional ao refluxo durante 18 h, depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Recolheu-se o precipitado por filtração, lavou-se com etanol frio e secou-se em vazio para se obterem 18 g de [6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-piridazin-3-il]-hidrazina sob a forma de um sólido bege (rendimento de 87 %) : RMN de 1H (DMSO-d6) δ 3, 88 (s, 3H) , 4,28 (s, 2H) , 7,02 (d, 1H) , 7,59 (d, 7,83 (s, 1H) , 7, 91 (s, 1H) , 8,19 (s, 1H) ; MS (m/z) [M+H+] +.

Passo 3: 6-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)-[l,2,4]tri-azolo[4,3-b]piridazina-3-tiol Método a:

Adicionaram-se a uma solução de [6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-piridazin-3-il]-hidrazina (18 g, 94,7 mmol) em etanol (230 mL) e água (63 mL), KOH (5,63 g, 100 mmol), e em seguida CS2 (12 mL, 198 mmol). Agitou-se a mistura e aqueceu-se ao refluxo durante 2 h em atmosfera de azoto. Arrefeceu-se a mistura até à temperatura ambiente e concentrou-se em vazio. Dissolveu-se o resíduo em solução aquosa 1 N de hidróxido de sódio e separaram-se os insolúveis por filtração. Acidificou-se o filtrado a um pH 2-3 com solução aquosa 1 N de HC1. Recolheu-se o precipitado resultante, lavou-se com água, e secou-se em vazio para se obterem 17,7 g de 6- (l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [1,2,4] tri- 99 ΡΕ2084162 azolo [ 4,3-b] piridazina-3-tiol sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 80,5 %): RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 3,95 (s, 3H), 7,73 (d, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,16 (d, 1H) , 8,53 (s, 1H), 14,7 (s, 1H); MS (m/z) 233 [M+H]+. Método b:

Misturaram-se [6- (l-metil-lH-pirazol-4-il)-piri-dazin-3-il]-hidrazina (1,0 g, 5,3 mmol) e l,l'-tiocar-bonildi-imidazole (1,08 g, 6,1 mmol) em DMF (10 mL) e aqueceu-se a 50°C durante 2 h. Em seguida deixou-se arrefecer a mistura até à temperatura ambiente. Adicionou-se hexano (10 mL) e em seguida THF (4 mL) , agitou-se durante 10 minutos e depois filtrou-se e lavou-se com THF (2 mL e depois 4 mL) . Secou-se o sólido em vazio para se obterem 738 mg de 6-(l-metil-lií-pirazol-4-il) - [1,2,4] tri-azolo[4,3-b]piridazina-3-tiol sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 60 %).

Prepararam-se os seguintes compostos consoante o exemplo 2: 6-fenil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol, 6- (3-f luoro-f enil) -[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol, 3- (3-mercapto- [l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)-benzonitrilo, 2-fluoro-4-(3-mercapto-[1,2,4]triazolo[4,3— jb] piridazin-6-il) -IV-metil-benzamida.

Exemplo 3: 6-(3-Fluoro-fenil)-[1,2,4]triazolo- [4,3-b][1,2,4]triazina-3-tiol 100 ΡΕ2084162

Passo 1: Oxima do (3-fluoro-fenil)-oxo-acetal- deído

Adicionou-se a uma mistura de dióxido de selénio (58,3 g, 525 mmol) em 20 mL de água e 400 mL de 1,4- dioxano, numa só porção, 1-(3-fluoro-fenil)-etanona (69,0 g, 500 mmol) . Aqueceu-se a mistura ao refluxo de um dia para o outro, depois filtrou-se através de terra de diatomáceas. Adicionou-se o filtrado a um volume igual de água e ajustou-se o pH 4 com solução aquosa de hidróxido de sódio a 5 %. Adicionou-se a esta mistura oxima da acetona (40,2 g, 550 mmol) e agitou-se a mistura durante 24 h. Diluiu-se a mistura com 1,5 L de água, extraiu-se a mistura com acetato de etilo (2 x 400 mL) , e extraiu-se a fase orgânica com salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio anidro, e concentrou-se para se obter um residuo oleoso, que se purificou por cromatografia rápida sobre silicagel (eluindo com éter de petróleo puro) para se obter o composto sob a forma de um sólido amarelo-claro (68,0 g, 81,4 %) . RMN de ΧΗ (DMSO-d6) : δ 12,78 (s, 1H) , 8,02 (s, 1H), 7,82-7,50 (m, 4H).

Passo 2: 6-(3-Fluoro-fenil)-2H-[1,2,4]triazin-3- ona

Aqueceu-se uma solução de oxima do (3-fluoro- 101 ΡΕ2084162 fenil)-oxo-acetaldeído (70 g, 419 mmol), cloridrato de semicarbazida (46,7 g, 419 mmol) e trihidrato de acetato de sódio (57,0 g, 419 mmol) em 560 mL de solução aquosa de etanol a 50 % a 50~ 60°C e manteve-se a essa temperatura de um dia para o outro. Depois de a mistura reaccional arrefecer, isolou-se por filtração o sólido cristalino resultante, lavou-se bem com água, e secou-se em vazio para se obterem 90,7 g de um sólido branco (96, 6 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-d6): δ 12,32 (s, 1H) , 12,27 (s, 1H) , 8,45 (s, 1H) , 7,78 (dd, 1H), 7,63 (d, 1H) , 7,42 (dd, 1H), 7,19 (dt, 1H) , 6, 90 (s, 2H) .

Aqueceu-se ao refluxo uma suspensão do sólido branco (22,4 g, 100 mmol) em 630 mL de uma solução aquosa a 5 % de ácido clorídrico, mantendo-se ao refluxo durante 1 hora, durante a qual a suspensão mudou de uma massa branca fluida para uma massa pegajosa que endureceu quando a mistura arrefeceu. Isolou-se o sólido por filtração, lavou-se bem com água e secou-se, e depois dissolveu-se em 150 mL de ácido acético. Aqueceu-se a solução resultante ao refluxo de um dia para o outro, e removeu-se o solvente em vazio. Triturou-se o resíduo com etanol-hexano (a 1:3) para se obter composto em título em bruto (15,1 g, 79,0 %) sob a forma de um sólido amarelo amorfo.

Passo 3: 3-Cloro-6-(3-fluoro-fenil)-[1,2,4]tri- azina

Manteve-se ao refluxo de um dia para o outro uma 102 ΡΕ2084162 mistura de 6-(3-fluoro-fenil)-2H-[1,2,4]triazin-3-ona (15,2 g, 7 9,5 mmol, em bruto) e 2 mL de DMF em 250 mL de oxi-cloreto de "fósforo e clorofórmio as 1:1. Concentrou-se então a mistura sob pressão reduzida, diluiu-se com cloreto de metileno e verteu-se sobre gelo sob agitação. Depois de o gelo fundir neutralizou-se a mistura com uma solução de bicarbonato de sódio, e separaram-se as fases, extraiu-se a fase aquosa com diclorometano uma vez, lavou-se o conjunto das fases orgânicas com água, secou-se e concentrou-se a um óleo castanho que se purificou por cromatografia em coluna (eluindo com éter de petróleo) para se obter o composto em titulo sob a forma de um sólido amarelo-claro (3,5 g, 21,0 %) : RMN de (CDC13) : δ 8,88 (s, 1H) , 7,87-7,82 (m, 2H) , 7,60-7,52 (m, 1H), 7,32-7,27 (m, 1H).

Passo 4: [6-(3-Fluoro-fenil)-[1,2,4]triazin-3-il]-hidrazina

Arrefeceu-se uma solução de 3-cloro-6-(3-fluoro-fenil) - [1,2,4] triazina (2,09 g, 10,0 mmol) em 13,6 mL de piridina seca a 0°C com um banho de gelo e adicionou-se-lhe 1,7 mL de hidrato de hidrazina. Aqueceu-se então a mistura a 65°C e manteve-se esta temperatura durante cerca de 0,5 horas. Depois de se arrefecer até à temperatura ambiente, verteu-se a mistura sobre água e gelo. Recuperou-se o sólido resultante por filtração e lavou-se bem com água, secou-se e raspou-se com hexano para se obter o composto em titulo (1,85 g, 90,2 %) sob a forma de um sólido cristalino branco: RMN de 1H (DMSO-d6) : d 8,97 (b, 1H), 8,90 (s, 1H) , 103 ΡΕ2084162 7,89-7,82 (m, 2H) , 7,59-7,51 (m, 1H) , 7,30~7,24(m, 1 H) , 5,47(b, 2H); MS (m/z) 206 [M+H+]+.

Passo 5: 6-(3-Fluoro-fenil)-[1,2,4]triazolo[4,3-

Jb] [1,2,4] triazina-3-tiol

Adicionou-se a uma suspensão de [6-(3-fluoro-fenil)-[1,2,4]triazin-3-il]-hidrazina (400 mg, 0,789 mmol) em etanol (12 mL) hidróxido de potássio aquoso 2 N (1 mL) e em seguida bissulfureto de carbono (1 mL) . Agitou-se a mistura reaccional ao refluxo durante 1 h, depois arre-feceu-se até à temperatura ambiente e concentrou-se em vazio. Dissolveu-se o resíduo em hidróxido de potássio aquoso 1 N, aqueceu-se e sonicou-se e depois separaram-se os insolúveis por filtração. Acidificou-se o filtrado a pH 2-3 com HC1 aquoso 1 N. Filtrou-se o precipitado resultante, lavou-se com água, e secou-se em vazio para se obter o composto em título sob a forma de um sólido cor de laranja (242 mg, rendimento de 50 %) : RMN de λΗ (DMSO-d6) :57,52 (dt, 1H) , 7,70 (dt, 1H), 7, 97-8, 04 (m, 2H), 9,36 (s, 1H), 14,05 (s, 1H); MS (m/z) 248 [M+H+]+.

Exemplo 4: 6-[6-(l-metil-lJí-pirazol-4-il)- [1,2,4] triazolo [4,3-Jb] piridazin-3-ilsulfanil] -quinolina (Composto 4)

104 ΡΕ2084162 Método a:

Desgaseificou-se uma solução de 6-bromoquinolina (45 mg, 0,215 mmol), di-isopropiletilamina (0,075 mL, 0,43 mmol) em DMF (1 mL) sob azoto, borbulhando azoto através dela durante 5 minutos. Adicionaram-se-lhe tris(dibenzili-denoacetona)dipaládio (11 mg, 0,011 mmol), Xantphos (13 mg, 0,022 mmol), e 6-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [ 1,2,4 ] triazolo-[4,3-b]piridazina-3-tiol (50 mg, 0,215 mmol), e desgasei-ficou-se a mistura durante mais 5 minutos. Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 23 h. Adicionaram-se mais catalisador de paládio (11 mg) e ligando (13 mg) ao fim de 6 h. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente, filtrou-se através de um filtro de 0,45 μιη, e purificou-se directamente a mistura em bruto por HPLC despoletada pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H20, modificado com 0,1 % de HCOOH) para se obterem 45 mg de 6-[6-(1-metil-líí-pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 58 %).

Prepararam-se os compostos seguintes consoante o método a: 6-(6-fenil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3- ilsulfanil)-quinolina, 6-fenil-3-([l,2,4]triazolo[4,3-a]pi-ridin-6-ilsulfanil)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina, 3-(lh-benzotriazol-5-il-sulfanil)-6-fenil[1,2,4]triazolo-[4,3-b]piridazina, 6-[6-(3-fluoro-fenil)-[l,2,4]triazolo-[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina, 3 - (benzotiazol-6-i1sulfanil)-6- (3-fluoro-fenil)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piri- 105 ΡΕ2084162 dazina, 6-(3-fluoro-fenil)-3-([l,2,4]triazolo[4,3-a]piri-din-6-ilsulfanil)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina, (mistura a 2:1 de) 3-(7-metil-benzotiazol-6-ilsulfanil)-6-(l-metil-lb-pirazol-4-il) -[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina e 3- (5-metil-benzotiazol-6-ilsulfanil)-6-(1-metil-lH-pirazol- 4- il)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina, 6-[6-(3-fluoro- fenil)-[1,2,4]triazolo[4,3-b] [1,2,4]triazin-3-ilsulfanil]-quinolina, 7-fluoro-6-[6-(1-metil-lH-pirazol-4-il)—[1,2,4]— triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina, 2-fluoro-n-metil-4-[3-(quinolin-6-ilsulfanil)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il]-benzamida, 6-[6-(l-metil-lb-pirazol-4-il) -[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quina-zolina, 3-(benzotiazol-6-ilsulfanil)-6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina, 3- (5 —fluoro-benzo-tiazol-6-ilsulfanil) - 6- (l-metil-lií-pirazol-4-il) — [1,2,4] — triazolo[4,3-b]piridazina, 7-metil-6-[6-(1-metil-lH-pira-zol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina, 2-fluoro-4-[3-(7 — fluoro-quinolin-6-ilsulfanil)- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-6-il]-n-metil-benzamida, 2-fluoro-n-metil-4-[3-(7-metil-quinolin-6-ilsulfanil) - [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-6-il]-benzamida, 2-fluoro-n-metil-4-[3-(3-metil-3b-benzimidazol-5-ilsulfanil)- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-6-il]-benzamida, 3-[3-(qui-nolin-6-ilsulfanil)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il]-benzonitrilo, 3-[3-(benzotiazol-6-ilsulfanil)-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il]-benzonitrilo, 3-[3-(7-fluoro-quinolin-6-ilsulfanil)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il]-benzonitrilo, 3-metil-6-[6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-2- ΡΕ2084162 ilamina, 4-metoxi-6-[6-(1-metil-lfí-pirazol-4-il)-[1,2,4]-triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina, metil-{6-[6-(1-metil-lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pirida-zin-3-ilsulfanil]-quinolin-4-il}-amina, dimetil-{6—[6—(1— metil-lfí-pirazol-4-il) -[1,2,4] triazolo [4,3-b] piridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-4-il}-amina, 7-fluoro-6-(6-metil- [l,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina, 2-{6-[6-(1-metil-lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]pi-ridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-4-iloxi}-etanol, 3-metil-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina, éster terc-butílico do ácido {6-[6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfa-nil]-quinolin-3-il}-carbâmico, éster terc-butilico do ácido { 6- [6- (1 -metil- lfí-pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[4,3-b]pi-ridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-4-il}-carbâmico, 5-fluoro-6-[6-(1-metil-lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pirida-zin-3-ilsulfanil]-quinolina. Método b:

Desgaseificou-se uma solução de 6-bromoquinolina (550 mg, 2,64 mmol), di-isopropiletilamina (1,13 mL, 6,46 mmol) em DMA (4 mL) sob azoto, borbulhando azoto através dela durante 20 minutos. Adicionaram-se-lhe tris(diben-zilidenoacetona)dipaládio (105 mg, 0,108 mmol, catalisador Strem), Xantphos (125 mg, 0,216 mmol), e 6-(1-metil-lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol (500 mg, 2,155 mmol) em corrente de azoto. Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 22 h, desaparecendo a suspensão 107 ΡΕ2084162 sólida. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e filtrou-se através de uma pequena coluna de silicagel, utilizando DMF como eluente. Verteram-se então directamente as fases orgânicas sobre uma mistura de água com gelo deixando-se repousar durante 15 minutos. Filtrou-se o precipitado e lavou-se com água. Moeu-se o bolo resultante em éter dietilico, filtrou-se, e secou-se em vazio para se obterem 770 mg de um sólido amarelo. Agitou-se o sólido em isopropanol ao refluxo durante 1 h, filtrou-se, lavou-se com isopropanol, e secou-se numa estufa de vácuo a 70°C durante 3 dias para se obterem 500 mg de 6—[6— (l-metil-lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina sob a forma de um sólido amarelo com 8 % de impurezas (rendimento de 64 %) .

Exemplo 5: 6-[6-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il) - [1,2,4] triazolo [4,3-Jb] piridazin-3-ilsulfanil]-5-nitro-quinolina (Composto 13)

Desgaseificou-se uma solução de KOH (146 mg, 2,6 mmol) em etanol (10 mL) borbulhando azoto através dela durante 15 minutos. Adicionaram-se à solução 6-(l-metil-lfí-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[4,3-jb]piridazina-3-tiol (500 mg, 2,15 mmol) e 6-bromo-5-nitroquinolina (600 mg, 2,36 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 70°C durante 4 h, e 108 ΡΕ2084162 depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente, diluiu-se com 10 % de metanol/diclorometano e adsorveu-se sobre sili-cagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre sili-cagel utilizando um gradiente de 0-7 % de metanol/diclorometano proporcionou 659 mg de 6- [ 6- (l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [ 1,2,4 ] triazolo [ 4,3-jb] piridazin-3-ilsulf anil ] - 5-nitro-quinolina sob a forma de um sólido amarelo escuro (rendimento de 76 %) .

Exemplo 6: 7—Metll—6—[6—(1—metil—1H—pirazol—4— il) - [1,2,4] triazolo [4,3-ib] pIridazin-3-ilsulfanIl] -quinolina (Composto 16)

Desgaseificou-se uma solução de éster 7-metil-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico (1,38 g, 4,74 mmol), di-isopropiletilamina (1,5 mL, 8,61 mmol) em DMF (8 mL) sob azoto, borbulhando azoto através dela durante 20 minutos. Adicionaram-se lhe tris(dibenzilideno-acetona)dipaládio (99 mg, 0,11 mmol, catalisador Strem) e Xantphos (125 mg, 0,215 mmol) em conjunto de uma só vez, e em seguida adicionou-se 6-(l-metil-lfí-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol (1 g, 4,36 mmol) numa corrente de azoto. Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 1 h. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e verteu-se sobre uma solução aquosa 2 M de NaOH (100 mL) . Filtrou-se o precipitado resultante, ΡΕ2084162 lavou-se com água, e secou-se ao ar durante 30 minutos. Dissolveu-se o bolo resultante em MeOH (80 mL) e CHCI3 (80 mL) , e adicionou-se 2 g de carvão activado descorante. Agitou-se a suspensão a 60°C durante 2,5 h. Adicionou-se-lhe Celite (10 g) e filtrou-se a mistura a quente através de uma pequena coluna de silicagel. Evaporou-se o filtrado em vazio para se obter um sólido bege. uma recristalização a partir de EtOH e clorofórmio proporcionou 1,0 g de 7-metil-6- [6- (l-metil-lfi-pirazol-4-il) -[1,2,4] triazolo [4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina sob a forma de cristais brancos (rendimento de 62 %).

Prepararam-se os seguintes compostos consoante o exemplo 6: 6-[ 6-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [1,2,4] triazolo- [4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina, 3-(3-Metil-3H-benzimidazol-5-ilsulfanil) -6- (l-metil-lfí-pirazol-4-il) -[ 1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina, N-óxido de 6-[6-(1-metil-lfí-pirazol-4-il) - [1,2,4] triazolo [4,3-b]piridazin-3-ilsul-fanil]-quinolina, 6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piri-dazin-3-ilsulfanil)-quinolina, metil-{3-[5-(1-metil-lH- pirazol-4-il)-quinolin-6-ilsulfanil]-[1,2,4]triazolo[4,3 — b]piridazin-6-il}-amina, 4-etil-6-[6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina.

Exemplo 7: 3- (3-Etil-3Jí-benzimidazol-5-ilsulfa- nil)-6-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina (composto 30) 110 ΡΕ2084162

Adicionou-se a 3-(3-fluoro-4-nitro-fenillsulfa-nil)-6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina (50 mg, 0,135 mmol) uma solução 2 M de etilamina em THF (1 mL) . Agitou-se a mistura reaccional a 70°C durante 1 h, e depois concentrou-se em vazio. Suspendeu-se o residuo em ácido fórmico (1 mL) e adicionou-se ferro em pó (75 mg, 1,35 mmol) . Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 16 h, e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e separou-se a barra de agitação com a maior parte do ferro. Concentrou-se a mistura reaccional em vazio e tratou-se o residuo resultante com uma solução aquosa 2 M de hidróxido de sódio. Filtrou-se o precipitado, lavou-se com água e depois com éter dietilico. Diluiu-se então em 2 mL de DMSO, filtrou-se através de um filtro de 0,45 μιη, e purificou-se directamente a mistura reaccional por HPLC despoletada pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H2O, modificada com 0,1 % de HCOOH) para se obterem 25 mg de 3-(3-etil-3A-benzimidazol-5-ilsulfanil)-6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina sob a forma de um sólido branco (rendimento de 49 %).

Prepararam-se os seguintes compostos consoante o exemplo 7: 3-[3-(2-metoxietil)-3ií-benzimidazol-5-ilsul- fanil]-6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina, sal de ácido fórmico da dimetil-(2-{6-[6-(1- 111 ΡΕ2084162 metil-lH-pirazol-4-il) -[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-benzimidazol-l-il}-etil)-amina.

Exemplo 8: 6-[6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)- [1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-sulfinil]-quinolina (composto 38)

Adicionou-se gota a gota, a uma solução de 6-[6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina (500 mg, 1,393 mmol) em DMF (10 mL) , uma solução de ácido 3-cloroperbenzóico (a 70-75 %, 721 mg, 4,178 mmol) em DMF (5 mL) ao longo de um periodo de 20 minutos. Agitou-se a mistura reaccional durante 19 h, e adicionou-se-lhe uma solução aquosa a 10 % de NaOH (60 mL). Extraiu-se a fase aquosa com 10 % de metanol/diclorometano (3 x) e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-8 % de metanol/diclorometano proporcionou 66 mg de um sólido branco. Dissolveu-se em DMSO quente, e filtrou-se a solução arrefecida através de um filtro de 0,45 μιτι. Uma purificação por HPLC despoletada pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H20, modificada com 0,1 % de HCOOH) proporcionou 5,7 mg de 6—[6— (l-metil-llí-pirazol-4-il) -[1,2,4] triazolo [4,3-b]piridazina-3-sulfinil]-quinolina sob a forma de um sólido branco (rendimento de 1,1 %). ΡΕ2084162

Exemplo 9: 6-[6-(l.ff-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazo- lo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina (composto 39)

Passo 1: 3-Cloro-6-[1-(2-trimetilsilanil-eto- ximetil) -lJí-pirazol-4-il] -piridazina

Desgaseificou-se uma mistura de 3, 6-dicloropiri-dazina (505 mg, 3,4 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil- [l,3,2]dioxaborolan-2-il)-l-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lfí-pirazole (1 g, 3,1 mmol) e K2CO3 (1,3 g, 9,3 mmol) em 10 mL de dioxano e 4 mL de H20, com azoto. Adicionou-se a esta mistura aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferro-ceno]paládio(II) com diclorometano (45 mg, 0,06 mmol) e borbulhou-se azoto através da mistura resultante durante mais 15 minutos. Aqueceu-se a mistura reaccional a 100°C durante 4 h, e depois de arrefecer até à temperatura ambiente removeu-se a fase aquosa com uma pipeta. Concentrou-se a fase orgânica e adsorveu-se sobre silicagel, purificando-se por cromatografia rápida em coluna eluindo com hexanos:acetato de etilo de 100:0 a 60:40 , obtendo-se o composto em titulo sob a forma de um sólido branco (640 mg, 2,06 mmol, rendimento de 66 %) : RMN de (CDCI3) δ

0,02 (9H, s), 0,96 (2H, t) , 3,64 (2H, t) , 5,52 (2H, s) , 7,52 (1H, d), 7,62 (1H, d), 8,10 (1H, s), 8,34 (1H, s); MS (m/z) 311 [M+H+]+. ΡΕ2084162

Passo 2: {6-[1-(2-Trimetilsilanil-etoximetil)-1H-pirazol-4-il]-piridazin-3-il}-hidrazina

Adicionou-se a uma suspensão de 3-cloro-6-[1-(2-trimetilsilanil-etoximetil) -lfí-pirazol-4-il] -piridazina (640 mg, 2,06 mmol) em etanol (5 mL) , mono-hidrato de hidrazina (1,34 mL, 1,4 g, 28 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 50°C durante 18 h, depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Recolheu-se o precipitado por filtração, lavou-se com etanol frio e secou-se em vazio para se obter o composto em titulo sob a forma de um sólido branco (500 mg, 1, 6 mmo1 , rendimento de 7 9 %) : RMN de XH (DMS0-d6) δ 0, 00 (9H, s), 0,89 (2H, t) , 3,61 (2H, t) , 4 ,34 (2H, s ig), 5,48 (2H, s), 7,09 (1H, d) , 7,69 (1H, • d) , 7 ,94 (1H, s ig), r 8, 1 08 (1H, s) , 8, 44 (1H , s) ; MS (m/z) 307 [M+H+] +.

Passo 3: 6-[1-(2-Trimetilsilanil-etoximetil)-1H- pirazol-4-il]-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol

Adicionou-se a uma solução de {6-[1-(2-trimetil-silanil-etoximetil) -lfí-pirazol-4-il ] -piridazin-3-il}-hidrazina (490 mg, 1,6 mmol) em etanol (6,5 mL) e água (1,8 mL) K2CO3 (359 mg, 2,6 mmol), e em seguida CS2 (0,212 mL, 3,5 mmol). Agitou-se a mistura e aqueceu-se a 80°C durante 3 h em atmosfera de azoto. Arrefeceu-se a mistura até à temperatura ambiente e concentrou-se a 50 % do volume em vazio, acidificando-se a pH 1 com HC1 aquoso 1 N. Recolheu- 114 ΡΕ2084162 se o precipitado resultante, lavou-se com água, e secou-se em vazio para se obter o composto em titulo sob a forma de um sólido vermelho escuro (rendimento quantitativo): RMN de (DMSO-d6) δ 0,01 (9H, s) , 0, 90 (2H, t) , 3,63 (2H, t) 5, 56 (2H, s) , 7,82 (1H, d) , 8,24 (1H, d), 8,27 (1H, s) 8, 80 (1H, s), 15,23 (1H, s lg) ; MS (m/z) 349 [M+H] +

Passo 4: 6-{6-[1-(2-Trimetilsilanil-etoximetil)- lií-pirazol-4-il] -[1,2,4] triazolo [4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil}-quinolina

Desgaseificou-se uma solução de trifluorometanos-sulfonato de 6-quinolinilo (436 mg, 1,57 mmol), di-isopropiletilamina (0,746 mL, 4,29 mmol) em DMF (3,8 mL) sob azoto, borbulhando azoto através dela durante 30 minutos. Adicionaram-se em conjunto numa só porção tris-(dibenzilidenoacetona)dipaládio (33 mg, 2,5 mol %, catalisador Strem) e Xantphos (41 mg, 5 mol %), e em seguida 6-[ 1- (2-trimetilsilanil-etoximetil) -lff-pirazol-4-il ] — [1,2,4] — triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol (498 mg, 1,43 mmol) em corrente de azoto. Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 3 h e adicionou-se 500 mg de carvão descorante activado. Agitou-se a suspensão a 70°C durante 20 minutos, e depois filtrou-se directamente a mistura quente através de uma pequena coluna com Celite, utilizando DMF como eluente. Evaporou-se o solvente em vazio e retomou-se o residuo em diclorometano e lavou-se com uma solução aquosa 1 N de NaOH e concentrou-se adsorvendo-se o residuo em silicagel e purificou-se por cromatografia rápida em coluna 115 ΡΕ2084162

eluindo com diclorometano :metanol de 100:0 a 92:8 para se obter o composto em título sob a forma de uma espuma amarelo-clara (250 mg, 0,53 mmol, rendimento de 37 %) : RMN de XH (DMSO-d6) δ 0, 00 (9H, s) , 0,90 (2H , t) , 3, 62 (2H, t) 5, 54 (2H, s), 7, 62 (1H, dd) , 7,83 (1H, dd) , 7, 91 (1H, d) 8, 07 (1H, d), 8,18 (1H, s) , 8,23 (1H, d) , 8 ,43 (1H, dd) 8, 57 (1H, d), 8,75 (1H, d) , 8, 96 (1H, dd) ; MS (m/z) 47 [M+H]+.

Passo 5: 6-[6-(l.ff-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo- [4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina

Adicionou-se a uma solução de 6-{6-[1-(2-tri-metilsilanil-etoximetil) -lfí-pirazol-4-il] -[1,2,4] triazolo-[ 4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil}-quinolina (150 mg, 0,32 mmol) em diclorometano (8 mL) a 0°C, ácido trifluoroacé-tico. Passadas 3 horas concentrou-se a mistura à secura e retomou-se em diclorometano, neutralizando-se por adição de uma solução aquosa de NaHCCb. Adicionou-se a esta emulsão uma mistura de clorofórmio/metanol (a 95/5) (20 mL) e salmoura (30 mL) . Separou-se a fase orgânica e filtrou-se, lavando-se o resíduo sólido com água e depois com Et20, e secando-se para se obter um sólido amarelo (64 mg) . retomou-se este sólido em metanol (2 mL) adicionando-se-lhe etilenodiamina (1 mmol) e aqueceu-se a 50°C durante 1 hora. Arrefeceu-se a mistura até à temperatura ambiente e recolheu-se o sólido por filtração, secando-se para se obter o composto em título sob a forma de um sólido branco (57 mg, 0.17 mmol, rendimento de 53 %). 116 ΡΕ2084162

Exemplo 10: 3-(l-metil-lií-pirazol-4-il)-6-[6-(1- metil-lJí-pirazol-4-il) -[1,2,4] triazolo [4,3-b] piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina (composto 40)

Passo 1: 3-Bromo-6-[6-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina

Adicionou-se gota a gota, a uma solução de 6-[6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina (1 g, 2,785 mmol) em ácido acético glacial (20 mL) , bromo (0,716 mL, 13,93 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 5 minutos e depois a 100°C durante 3 h. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente, e concentrou-se a mistura em vazio. Retomou-se o resíduo em solução aquosa a 10 % de NaOH e 10 % de metanol/diclorometano. Separou-se a fase orgânica, lavou-se com solução aquosa 1 M de Na2S2C>3, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se, e adsorveu-se sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-7 % de metanol/diclorometano proporcionou 381 mg de 3-bromo-6-[6-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [1,2,4] triazolo [4,3-bJpiridazin-3-ilsulfanil]-quinolina sob a forma de um sólido bege (rendimento de 31 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-d6) : δ 3,89 (s, 3H) , 117 ΡΕ2084162 7,77 (dd, 1H) , 7,80 (d, 1H) , 7,99 (d, 1H) , 8,00 (s, 1H) , 8,43 (s, 1H) , 8,48 (d, 1H), 8,68 (d, 1H), 8,92 (d, 1H) ; MS (m/z) 438, 440 [M+H+]\

Passo 2: 3-(l-metil-l.ff-pirazol-4-il)-6-[6-(1- metil-l.ff-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina

Carregou-se um balão para micro-ondas com 3-bromo- 6- [ 6- (l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina (38 mg, 0,087 mmol), éster pinacólico de ácido l-metil-4-pirazoleborónico (22 mg, 0,104 mmol), e diclorobis(trifenilfosfina)paládio(0) (3 mg, 0,004 mmol). Adicionaram-se 1,2-dimetoxietano (0,4 mL) e uma solução aquosa 2 M de carbonato de potássio (0,4 mL). tapou-se o balão e tratou-se com micro-ondas a 120°C durante 20 minutos. Separou-se a fase orgânica, diluiu-se com metanol, e adsorveu-se sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano proporcionou 24 mg de um sólido amarelo. Purificou-se mais o sólido sequencialmente por HPLC despoletada pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H20, modificado com 0,1 % de HCOOH) e por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando 50 % de CH3CN/diclorometano e em seguida 10 % de metanol/diclorometano para se obterem 10,5 mg de 3-(l-metil-lH-pirazol-4-il) -6- [6- (l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolina sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 28 %). 118 6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-bipiri- ΡΕ2084162

Exemplo 11: dazina-3-tiol

Passo 1: (6-Metil-piridazin-3-il)-hidrazina

Adicionou-se a uma suspensão de 3-cloro-6-metil-piridazina (3 g, 23,3 mmol) em etanol (45 mL), hidrato de hidrazina (45 mL), e aqueceu-se a mistura resultante ao refluxo durante 3 h. Removeu-se a maior parte do solvente sob pressão reduzida, recolheu-se o sólido branco obtido por filtração, e lavou-se com etanol. Após uma secagem obtiveram-se 2,3 g de (6-metilpiridazin-3-il)-hidrazina sob a forma de um sólido cristalino branco (rendimento de 80 %) .

Passo 2: 6-Metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piri- dazina-3-tiol

Adicionou-se a uma solução de KOH (11,3 g, 0,202 mol) em metanol (100 mL) , (6-metil-piridazin-3-il)-hidra zina (25 g, 0,202 mol), à temperatura ambiente. Colocou-se a mistura reaccional num banho de água e gelo e adicionou-se-lhe lentamente sulfureto de carbono (98 mL, 1,61 mol) . Aqueceu-se a solução amarela resultante ao refluxo de um dia para o outro e depois removeu-se o solvente. Acidificou-se o residuo amarelo com HC1 aquoso 2 N até 119 ΡΕ2084162 ρΗ~ 4, filtrou-se, e lavou-se com água. Por secagem, obtiveram-se 33 g de 6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piri-dazina-3-tiol sob a forma de um pó amarelo-claro (rendimento de 85 %) : RMN de XH (DMS0-d6; : δ 2,5 (s, 3H) , 7,28 (d, 1H) , 8,05 (d, 1H) , 14,66 (s lg, 1H) ; MS (m/z) 167 [M+H+] +.

Exemplo 12: 3-(l-metil-l.fr-pirazol-4-il)-6-(6- metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (composto 41)

Via 1

Passo 1: 3-Bromo-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina

Adicionou-se gota a gota, a uma solução de 6 — (6 — me til-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (370 mg, 1,26 mmol) em ácido acético glacial (10 mL), bromo (0,324 mL, 6,31 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 5 minutos e depois a 100 °C durante 2 h. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente, e concentrou-se a mistura em vazio, retomou-se o residuo em solução aquosa a 10 % de NaOH e 10 % de metanol/diclorometano. Separou-se a fase orgânica, lavou-se com solução aquosa a 5 % de Na2S03, e adsorveu-se 120 ΡΕ2084162 sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-5 % de metanol/diclorometano proporcionou 422 mg de 3-bromo-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quino- lina sob a forma de um sólido bege (rendimento de 90 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-de) : § 2,53 (s, 3H) , 7,41 (d, 1H) , 7,70 (dd, 1H) , 7,87 (d, 1H) , 7,99 (d, 1H) , 8,41 (d, 1H) , 8, 66 (d, 1H) , 8,93 (d, 1H) ; MS (m/z) 372, 374 [M+H+]\

Via alternativa:

Desgaseificou-se uma solução de éster 3-bromo-quinolin-6-ílico do ácido trifluorometanossulfónico (973 mg, 2,74 mmol), di-isopropiletilamina (0,87 mL, 4,98 mmol) em DMF (9 mL) sob azoto, borbulhando azoto através dela durante 20 minutos. Adicionou-se-lhe tris(dibenzili-denoacetona)dipaládio (114 mg, 0,124 mmol, catalisador Strem) e Xantphos (144 mg, 0,249 mmol), ambos em conjunto e numa só porção, e em seguida 6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol (450 mg, 2,49 mmol) sob uma corrente de azoto. Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 1 h. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e adicionaram-se-lhe 500 mg de carvão descorante activado. Agitou-se a suspensão durante 2,5 h, filtrou-se directamente a mistura através de uma pequena coluna de silicagel, utilizando DMF como eluente. Evaporou-se o solvente em vazio, e retomou-se o resíduo em água e 10 % de metanol/diclorometano. Separou-se a fase orgânica que se adsorveu sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia 121 ΡΕ2084162 rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-5 % de metanol/diclorometano proporcionou 534 mg de 3-bromo-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quino-lina sob a forma de um sólido de cor creme (rendimento de 58 %) .

Passo 2: 3-(l-metil-lJí-pirazol-4-il)-6-(6—metil- [1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina

Carregou-se um balão para micro-ondas com 3-bromo-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (40 mg, 0,107 mmol), éster pinacólico do ácido l-metil-4-pirazoleborónico (27 mg, 0,129 mmol), e diclorobis(trifenilfosfina)paládio(0) (4 mg, 0,005 mmol).

Adicionaram-se 1,2-dimetoxietane (0,5 mL) e uma solução aquosa 2 M de carbonato de sódio (0,5 mL). Tapou-se o balão e aqueceu-se com micro-ondas a 120°C durante 30 minutos. Separou-se a fase orgânica, extraiu-se a fase aquosa com 10 % de metanol/diclorometano (2 x), e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-6 % de metanol/diclorometano proporcionou 28 mg de um sólido branco sujo. Purificou-se este sólido por HPLC despoletada pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H2O, modificada com 0,1 % de HCOOH) para se obterem 11 mg de 3 — (1 — metil-lií-pirazol-4-il) -6- (6-metil - [1,2,4] triazolo [4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina sob a forma de um sólido branco (rendimento de 28 %). 122 ΡΕ2084162

Prepararam-se os seguintes compostos de acordo com a via 1 do exemplo 12: ácido {4-[6-(6-metil-[1,2,4]-triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolin-3-il] -pirazol-l-il}-acético, 6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]-piridazin-3-ilsulfanil)-3-[1-(2-morfolin-4-il-etil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina, 7-fluoro-3-(l-etil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfa-nil)-quinolina, 5-fluoro-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina.

Via 2: Processo num passo

Desgaseificou-se uma solução de éster 3-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) -quinolin-6-ílico do ácido trifluoro-metanossulfónico (15,9 g, 44,79 mmol), di-isopropil-etilamina (15,5 mL, 89,58 mmol) em DMF (150 mL) sob azoto, borbulhando azoto através dela durante 30 minutos. Adicionaram-se tris (dibenzilidenoacetona)dipaládio (2,0 g, 2,24 mmol, catalisador Strem) e Xantphos (2,54 g, 4,48 mmol) em conjunto e numa só porção, e em seguida 6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol (7,44 g, 44,79 mmol) em corrente de azoto. Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 4 h. Filtrou-se a mistura reaccional a quente e arrefeceu-se o filtrado para precipitar, recolheu-se o sólido e lavou-se com metanol para se obter um sólido branco sujo, que se purificou por cromatografia em coluna para se obterem 13,3 g de 3-(l-metil-lfJ-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (rendimento de 79 %). 123 ΡΕ2084162

Prepararam-se os seguintes compostos de acordo com a via 2 do exemplo 12:: 6- ( 6-etil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-3-(l-metil-lH-pirazol-4-il) -quinolina, metil-{3-[3-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-quinolin-6-ilsulfanil]-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il}-amina.

Exemplo 13: Ácido 2-metil-2-{4-[6-(6-metil- [1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolin-3-il]-pirazol-l-il}-propiónico (composto 45)

Carregou-se um balão para micro-ondas com éster etílico do ácido 2-(4-iodo-pirazol-l-il)-2-metil-propiónico (50 mg, 0,162 mmol), bis(pinacolato)diboro (50 mg, 0,195 mmol), acetato de potássio (48 mg, 0,486 mmol), aducto do cloreto de [l,l'-bis (difenilfosfino)ferroceno]paládio(II) com diclorometano (6,6 mg, 0, 008 mmol), e DMA (0,6 mL) . Lavou-se o balão com azoto e tapou-se. Aqueceu-se a mistura reaccional com micro-ondas a 130°C durante 30 minutos. Adicionaram-se-lhe 3-bromo-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (48 mg, 0,13 mmol) e diclorobis(trifenilfosfina)paládio(0) (5,7 mg, 0,008 mmol), e em seguida DMA (0,4 mL) e uma solução aquosa 2 M de carbonato de potássio (0,5 mL). Aqueceu-se a mistura reaccional com micro-ondas a 130°C durante 1 h. Adicionou- 124 ΡΕ2084162 se-lhe sulfato de sódio para absorver a água, e filtrou-se a fase liquida através de um filtro de 0,45 μιη. Diluiu-se a mistura em bruto até 2 mL com DMSO e purificou-se directamente por HPLC despoletado pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H20, modificada com 0,1 % de HCOOH) para se obterem 11 mg de ácido 2-metil-2-{4-[6-(6-metil-[l,2,4]triazolo-[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolin-3-il]-pirazol-l-il}-propiónico sob a forma de um sólido de cor creme (rendimento de 19 %) .

Exemplo 14: 6-Metilamino-[1,2,4]triazolo[4,3- b]piridazina-3-tiol

H SH

Passo 1: 6-Cloro-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pirida- zina-3-tiol

Adicionou-se gota a gota, a uma suspensão de (6- cloro-piridazin-3-il)-hidrazina (1 g, 6,917 mmol) em etanol (12 mL) uma solução de KOH (390 mg, 6,917 mmol) em água (12 mL) . Adicionou-se-lhe gota a gota sulfureto de carbono (0,84 mL, 13,84 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 48 h. Adicionaram-se mais 0,84 mL de CS2 e 390 mg de KOH, e continuou a agitar-se a mistura reaccional durante 24 h, antes de se concentrar em vazio. Tratou-se o resíduo com uma solução aquosa 1 M de NaOH e filtrou-se. Acidificou-se o filtrado até pH 3 com 125 ΡΕ2084162 solução aquosa 1 N de HC1, e separou-se o filtrado por filtração, extraiu-se o filtrado resultante com acetato de etilo (3 x) , e secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre sulfato de sódio, filtrou-se, concentrou-se e secou-se em vazio para se obterem 485 mg de 6-cloro- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol sob a forma de um sólido amarelo (rendimento de 38 %) : RMN de 1H (DMSO-d6) : δ 7,48 (d, 1H) , 8,24 (d, 1H); MS (m/z) 187 [M+H+] + .

Passo 2: 6-Metilamino-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pi-ridazina-3-tiol

Tratou-se 6-cloro-[l,2,4]triazolo[4,3-b]pirida- zina-3-tiol (330 mg, 1,77 mmol) com uma solução aquosa a 40 % em volume de metilamina. Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 17 h, depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e acidificou-se até pH 1-2 com solução aquosa 1 N de HC1. Filtrou-se o precipitado resultante, lavou-se com água, e secou-se em vazio para se obterem 185 mg de 6-metilamino-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol sob a forma de um pó amarelo (rendimento de 58 %) : RMN de ΧΗ (DMSO-de) : δ 2,83 (d, 3H) , 6,85 (d, 1H) , 7,44 (q largo, 1H) , 7,74 (d, 1H) , 14,2 (s, 1H) ; MS (m/z) 182 [M+H+] + .

Exemplo 15: Metil- (3- [4- (4-metil-4fr- [1,2, 4] tri-azol-3-ilsulfanil)-quinolin-6-ilsulfanil]-[1,2,4]triazolo-[4,3-b] piridazin-6-il}-amina (A), Metil-{3-[6-(4-metil-4Jí- [1.2.4] triazol-3-ilsulfanil)-quinolin-4-ilsulfanil]- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-6-il}-amina (B) , e 4,6-{6- 126 ΡΕ2084162

Metilamino-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil}-quinolina (C) (Compostos 47 e 48)

Desgaseificou-se uma solução de 6-bromo-4-(4-metil-4H-[1,2,4]triazol-3-ilsulfanil)-quinolina (106 mg, 0,331 mmol), di-isopropiletilamina (0,096 mL, 0,552 mmol) em DMF (1 mL) sob azoto, borbulhando através dela azoto durante 15 minutos. Adicionaram-se tris(dibenzilideno-acetona)dipaládio (25 mg, 0,028 mmol), Xantphos (32 mg, 0,056 mmol), e 6-metilamino-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pirida-zina-3-tiol (50 mg, 0,276 mmol). Agitou-se a mistura reac-cional a 100°C durante 16 h, arrefeceu-se até à temperatura ambiente, concentrou-se em vazio, e dissolveu-se o residuo em 10 % de metanol/diclorometano, e adsorveu-se sobre silicagel. Uma primeira purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-20 % de metanol/diclorometano proporcionou 44 mg de um sólido castanho. Uma segunda purificação por cromatografia rápida sobre amina-silicagel utilizando um gradiente de 0-8 % de metanol/diclorometano proporcionou 10 mg de (C) de um 127 ΡΕ2084162 sólido de cor creme e 17 mg de uma mistura impura de (A) e (B). Purificou-se mais a mistura por HPLC despoletado pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H20, modificada com 0,1 % de HCOOH) para se obterem 6,7 mg de uma mistura (a 1:1) de (A) e (B) sob a forma de um sólido branco (rendimento de 58 %).

Exemplo 16: 6-Metil-3- [5- (l-metil-lJí-pirazol-4-il)-lH-pirrolo[2,3-b]piridin-3-ilsulfanil]-[1,2,4]triazolo-[4,3-b]piridazina (composto 53)

Adicionou-se a uma solução de 5-(l-metil-lH-pirazol-4-il)-lH-pirrolo[2,3-b]piridina (28 mg, 0,141 mmol) e 6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina-3-tiol (35,3 mg, 0,212 mmol) em DMF (700 pL) , iodo (72 pL, 0,2 83 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 3 horas. Depois filtrou-se a mistura reaccional e purificou-se por HPLC despoletada pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H2O, modificada com 0,1 % de HCOOH) para se obterem 5,7 mg de 6-metil-3-[5-(l-metil-lfí-pirazol-4-il)-lfí-pirro-lo[2,3-b]piridin-3-ilsulfanil]-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina (rendimento de 11 %).

Preparou-se o seguinte composto de acordo com o exemplo 16: 6- (l-metil-lií-pirazol-4-il)-3-[5- (l-metil-lH- 128 ΡΕ2084162 pirazol-4-il)-lH-pirrolo[2,3-b]piridin-3-ilsulfanil]-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina.

Exemplo 17: Sal de 6- [6- (l-metil-lfí-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-4-ilamina com ácido trifluoroacético (composto 34)

sal om TFA

Adicionou-se a uma suspensão de éster terc-butílico do ácido { 6- [6- (l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [1,2,4] -triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-4-il} -carbâmico (15 mg, 0,031 mmol) em diclorometano (2 mL), TFA (1 mL). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 1 h, e concentrou-se em vazio. Dissolveu-se o residuo em DMSO, e liofilizou-se de um dia para o outro para se obterem 10,4 mg de sal de 6-[6-(1-metil-lH-pirazol-4-il)- [1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-4-ilamina com ácido trifluoroacético (rendimento de 90 %) .

Preparou-se o composto seguinte de acordo com o exemplo 17: sal de 6-[ 6-(l-metil-lfí-pirazol-4-il) - [ 1,2,4 ] -triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil]-quinolin-3-ilamina com ácido trifluoroacético. 129 ΡΕ2084162

Exemplo 18: 6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pi- ridazin-3-ilsulfanil) -4- (4-metil-4ií- [1,2,4]triazol-3-ilsulfanil)-quinolina (composto 57)

Desgaseificou-se uma solução de 4-cloro-6-bromoquinolina (1,6 g, 6,63 mmol), di-isopropiletilamina (1,93 mL, 11,05 mmol) em DMF (20 mL) sob azoto, borbulhando azoto através dela durante 30 minutos. Adicionaram-se-lhe tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio (506 mg, 0,552 mmol), Xantphos (640 mg, 1,105 mmol), e 6-metil-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazina-3-tiol (1,0 g, 5,525 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 100°C durante 18 h. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente, e retomou-se numa solução aquosa 1 N de NaOH e em 10 % de meta-nol/diclorometano. Extraiu-se a fase aquosa com 10 % de metanol/diclorometano (3 x) e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por croma-tografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-6 % de metanol/diclorometano proporcionou 468 mg de uma mistura (a 1:1) de 4-cloro-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina e 6-bromo-4-(6-metil- [1.2.4] triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina sob a forma de um sólido bege. Dissolveu-se a mistura (a 1:1) (70 mg) em DMF (0,5 mL) , e adicionou-se-lhe 4-metil-4H- [1.2.4] triazole-3-tiol (12 mg, 0,1 mmol). Agitou-se a 130 ΡΕ2084162 mistura reaccional a 60°C durante 21 h e depois a 80°C durante 25 h. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e concentrou-se em vazio. Retomou-se o resíduo em solução aquosa 1 N de NaOH e 10 % de metanol/di-clorometano. Extraiu-se a fase aquosa com 10 % de meta- nol/diclorometano (2 x) e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatogra-fia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano proporcionou 16 mg de 6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil) - 4-(4-metil-4fí- [ 1,2,4 ] triazol-3-ilsulf anil) -quinolina sob a forma de um sólido de cor creme (rendimento de 78 %) .

Exemplo dazina-3-tiol 19: 6-Etil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piri-

SH

Passo 1: 3-Cloro-6-vinil-piridazina desgaseificou-se uma mistura de 3,6-dicloropiri-dazina (6 g, 40,3 mmol), éster pinacólico de ácido vinilborónico (6,21 g, 6,83 mL, 40,3 mmol), carbonato de potássio (120 mmol, 16,7 g), 1,4-dioxano (60 mL) e água (24 mL) durante 15 minutos com azoto. Adicionou-se então aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paládio(II) com diclorometano (0,4 mmol, 292 mg) e aqueceu-se a mistura a 80 °C durante 4 horas. Removeu-se então a fase aquosa através de uma pipeta e concentrou-se a fase orgânica que 131 ΡΕ2084162 se adsorveu sobre silicagel e se purificou por cromatografia rápida em coluna (S1O2, hexano:acetato de

etilo de 100:0 a 60:40) para se obter 3-cloro- •6-vinil- piridazina sob a forma de um sólido branco (5,2 g, rendimento de 92 %) . RMN de ΧΗ (CDC13) δ 5,75 (1H, d), 6,25 (1H, d), 7,05 (1H, dd) , 7,49 (1H, d), 7,59 (1H, d) , MS m/z=141 (M+H+) +.

Passo 2: 3-Cloro-6-etil-piridazina

Agitou-se vigorosamente uma mistura de 3-cloro-6-vinil-piridazina (1 g, 7,09 mmol), paládio sobre carbono (a 10 % em peso, 200 mg) em acetato de etilo (14 mL) sob uma atmosfera de hidrogénio, à temperatura ambiente durante 4 horas. Filtrou-se então a mistura através de uma almofada de Celite e concentrou-se o filtrado que se adsorveu sobre silicagel e se purificou por cromatografia rápida em coluna (S1O2, hexano: acetato de etilo de 90:10 a 50:50), para se obter a 3-cloro-6-etilpiridazina sob a forma de um sólido branco (627 mg, rendimento de 63 %) . RMN de 1H (CDCI3) δ

1,27 (3H, t), 2,93 (2H, q), 7,72 (1H, d), 7,83 (1H, d), MS m/z = 143 (M+H+) +.

Passo 3: Sal cloridrato de (4-etil-fenil)-hidra- zina

Adicionou-se a uma solução de 3-cloro-6-etil-piridazina (1,0 g, 7,01 mmol) em etanol (14 mL) , mono-hidrato de hidrazina (14 mL) . Agitou-se a mistura 132 ΡΕ2084162 reaccional a 80°C durante 18 h, antes de se concentrar em vazio. Retomou-se o resíduo em salmoura e acetato de etilo. Lavou-se a fase orgânica com salmoura (3 x), secou-se sobre sulfato de sódio e filtrou-se. Saturou-se a fase aquosa com cloreto de sódio sólido e extraiu-se com acetato de etilo (3 x) . Secou-se o conjunto das fases orgânicas sobre sulfato de sódio e filtrou-se. Adsorveu-se o conjunto dos filtrados sobre silicagel e purificou-se por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano para se obterem 476 mg de N-(4-etil-fenil)-iV'-isopropilideno-hidrazina sob a forma de um sólido ceroso amarelo. Dissolveu-se o sólido (450 mg) em etanol (3 mL) e concentrou-se, adicionando-se-lhe HC1 (2 mL). Agitou-se a mistura reaccional a 80°C durante 48 h, e depois concentrou-se em vazio à secura. Triturou-se o sólido resultante com éter dietílico, destilou-se azeotropicamente com tolueno e secou-se em vazio para se obter um sólido castanho que se utilizou no passo seguinte sem qualquer purificação adicional.

Passo 4: 6-Etil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina- 3-tiol

Suspendeu-se o sólido castanho em etanol (3,8 mL), e adicionou-se-lhe KOH (425 mg, 7,59 mmol). Lavou-se o reactor com uma corrente de azoto e adicionou-se sulfureto de carbono (1,2 mL, 20,24 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 80°C durante 19 h, e depois concentrou-se em vazio. Tratou-se o resíduo com uma solução aquosa 1 N de 133 ΡΕ2084162

NaOH e filtrou-se. Tratou-se o filtrado com uma solução aquosa 1 N de HC1 até pH 2 e extraiu-se com acetato de etilo (3 x) . Concentrou-se em vazio o conjunto das fases orgânicas para se obterem 258 mg de um sólido amarelo escuro. Triturou-se o sólido com acetato de etilo e hexano, filtrou-se e secou-se em vazio para se obterem 192 mg de 6-etil-[1,2,4]triazolo[4,3 —b]piridazina-3-tiol sob a forma de um sólido bege (rendimento de 42 %a partir de N-(4-etil-fenil)-Ν'-isopropilideno-hidrazina) : RMN de ΧΗ (DMSO-de) : δ 1,26 (t, 3H) , 2,82 (q, 2H) , 7,35 (d, 1H) , 8,07 (d, 1H) , 14,2 (s largo, 1H); MS (m/z) 181 [M+H+]+.

Exemplo 20: 6-(6-Metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]pi- ridazin-3-ilsulfanil)-3-(lH-pirazol-4-il)-quinolina (Composto 59)

Carregou-se um balão para micro-ondas com 3-bromo-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfa-nil)-quinolina (970 mg, 2,606 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lfí-pirazole (930 mg, 2,866 mmol), e diclorobis(trifenil-fosfina)paládio(0) (92 mg, 0,13 mmol). Adicionaram-se 1,4-dioxano (10 mL) e uma solução aquosa 2 M de carbonato de sódio (5 mL). Tapou-se o balão e aqueceu-se com micro-ondas a 130°C durante 30 minutos. Retomou-se a mistura reaccional em água e 10 % de metanol/diclorometano. Extraiu-se a fase 134 ΡΕ2084162 aquosa com 10 % de metanol/diclorometano, e adsorveu-se o conjunto das fases orgânicas sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-8 % de metanol/diclorometano proporcionou 1,073 g do produto de acoplamento em bruto sob a forma de um óleo castanho claro. Tratou-se o óleo com TFA (10 mL). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 2 h, e em seguida concentrou-se em vazio. Tratou-se o resíduo com uma solução aquosa 1 N de NaOH, filtrou-se o precipitado, lavou-se sequencialmente com água e com acetato de etilo. Dissolveu-se o sólido amarelo resultante em 10 % de metanol/diclorometano e adsorveu-se sobre silicagel. Uma purificação por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando um gradiente de 0-10 % de metanol/diclorometano proporcionou 417 mg de 6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-3-(1H-pirazol-4-il)-quinolina impura. Purificaram-se 30 mg de material por HPLC despoletado pela massa (5 - 95 % de CH3CN/H2O, modificada com 0,1 % HCOOH) obtendo-se 12 mg de 6- (6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil) - 3-(lH-pirazol-4-il)-quinolina pura.

Exemplo 21: 3-(l-Etil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-me- til—[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (Composto 66)

135 ΡΕ2084162

Num balão para micro-ondas colocaram-se 3-bromo-6- (6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (200 mg, 0,54 mmol), l-etil-4-(4,4,5,5-tetra-metil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (149 mg, 0,67 mmol), K2C03 (186 mg, 1,34 mmol), 1,4-dioxano (7 mL) e água (3,5 mL) . Desgaseificou-se a solução borbulhando azoto através dela durante 10 minutos e depois adicionou-se Pd (dppf) 2CI2•diclorometano (20 mg, 0,0269 mmol). Tapou-se o balão e aqueceu-se a mistura com micro-ondas a 120°C durante 20 minutos. Arrefeceu-se o balão e depois extraiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se com água. Removeram-se os voláteis em vazio e adsorveu-se o residuo sobre silicagel, purificando-se por cromatografia rápida (Si02, diclorometano: CH3OH de 100:0 a 80:20) para se obter 3—(l — etil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pi-ridazin-3-ilsulfanil)-quinolina sob a forma de um óleo castanho (rendimento de 7 %).

Prepararam-se os seguintes compostos de acordo com o exemplo 21: éster terc-butilico do ácido 3—{4—[6—(6— metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-qui-nolin-3-il]-pirazol-l-il}-azetidina-l-carboxilico, éster terc-butilico do ácido 3-{4-[6-(6-Metil-[1,2,4]triazolo-[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolin-3-il]-pirazol-1-ilmetil}-azetidina-l-carboxilico.

Exemplo 22: 3-(l-Azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)- 6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (Composto 62) ΡΕ2084162

Adicionou-se a éster terc-butílico do ácido 3 —{4 — [6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolin-3-il]-pirazol-l-il}-azetidina-l-carboxílico (65 mg, 0,126 mmol) 6 mL de TFA:diclorometano (a 1:1). Deixou-se a mistura repousar durante 2 horas. Removeram-se os voláteis num evaporador rotativo e depois adicionou-se metanol (6 mL) e MP-carbonato (500 mg, 3,18 mmol/g). Separou-se a resina por filtração e removeram-se os voláteis em vazio para se obter 3-(l-azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina sob a forma de um sólido amarelo (rendimento quantitativo).

Prepararam-se os seguintes compostos de acordo com o exemplo 22: 3-(l-azetidin-3-ilmetil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina, 3- (l-azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-etil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina, 3-(l-azetidin-3-ilmetil-lH-pirazol-4-il)-6-(6-etil-[1,2,4]-triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina.

Exemplo 23: 3-[1-(l-Etil-azetidin-3-il)-lH-pira- zol-4-il]-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (Composto 61) 137 ΡΕ2084162

Adicionou-se a 3-(l-azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6- (6-metil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfa-nil)-quinolina (63 mg, 0,152 mmol) em diclorometano (3,0 mL) , acetaldeido (34 μ]1, 0, 608 mmol). Agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois adicionou-se-lhe triacetoxiborohidreto de sódio (80 mg, 0,380 mmol). Passada 1 hora diluiu-se a solução com diclorometano (3,0 mL) e lavou-se com bicarbonato de sódio (3,0 mL). Extraiu-se a fase aquosa com diclorometano (3,0 mL) . Lavou-se o conjunto das fases em diclorometano com salmoura (6 mL) , secou-se sobre Na2S04 e filtrou-se. Concentrou-se o filtrado em vazio adsorvendo-se sobre silicagel e purificou-se por cromatografia rápida (SiCq, diclorometano:CH3OH:NH4OH, de 95:4,995:0,005 a 80:19,98:0,02) para se obterem 23 mg de 3 - [1- (l-etil-azetidin-3-il)-lH-pirazol-4-il]-6-(6-etil-[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina (rendimento de 34 %).

Prepararam-se os seguintes compostos de acordo com o exemplo 23: 3-[1-(l-metilazetidin-3-il)-lH-pirazol-4-il]- 6- ( 6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfa-nil)-quinolina, 3- [1-(l-etil-azetidin-3-ilmetil)-lH-pira-zol-4-il]-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3- ΡΕ2084162 ilsulfanil)-quinolina, 3- [1- (l-isopropil-azetidin-3-il)-1H-pirazol-4-il]-6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina, 3-[1- (l-etil-azetidin-3-il)-lH-pira-zol-4-il]-6- (6-etil-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-ilsulfanil)-quinolina. A estrutura, o nome, dados fisicos e biológicos acerca dos compostos estão também descritos na Tabela I.

Tabela I

ΡΕ2084162 139

ΡΕ2084162 140

ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura RMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 9 I I Π s-CjT i (EMSO-d6) δ: 7,47 (dt, 1H), 7,56 (dd, 375 6-[6-(3-Fluoro-fenil)- 1H), 7,61 (dt, 1H), [1,2,4] trlazolo [4.3- 7,79 (dd, 1H), 7,83 jb][1.2. 4]triazin-3- (dt, 1H), 7,89 (d, ilsulfanil]-quinolina 1H), 7,99 (d, 1H), 8,17 (d, 1H), 8,33 (dd, 1H), 8,90 (dd, 1H), 9,48 (s, 1H) 10 I I (EMSO-d6) δ: 3,88 (s,3H), 7,53 (dd, 378 7-Fluoro-6-[6-(1-metil-líf- 1H), 7,78 (d, 1H), pirazol-4-il)- 7,91 (d, 1H), 7,99 [1,2,4]triazolo [4,3- (s, 1H), 8,22 (d, £>]piridazin-3-ilsulfanil] - 1H), 8,38 (dd, 1H), quinolina 8,40 (s, 1H), 8,45 (d, 1H), 8,92 (dd, 1H) 11 I II HjC'n-V^ s ΌΤΝ') (CD3OD) δ: 2,95 (s, 3H), 7,56-7,59 (m, 431 2-Fluoro-I\7-metil-4- [3- 1H), 7,70-7,72 (d, (quinolin-6-ilsulfanil)- 1H), 7,81-7,85 (m, (1,2,4) triazolo [4,3- 3H), 8,01 (d, 2H), b] piridazin-6-il]benzamida 8,21 (d, 1H), 8,34 (d, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,86 (d, 1H) ΡΕ2084162 142 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura KMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 12 II II N (EMSO-d6) δ: 3,90 (s, 3H), 7,74 (d, 361 6- [6- (1-metil-l.H-pirazol- 1H), 7,77 (dd, 1H), 4-il) - [1,2,4]triazolo [4,3 7,95 (s, 1H), 7,97 -jb] piridazin-3- (d, 1H), 8,20 (d, ilsulfanil]-quinazolina 1H), 8,38 (s, 1H), 8,41 (d, 1H), 8,84 (s largo, 1H), 9,20 (d, 1H) 13 II II HjC. tV» Ni\ s^vjT '"V noj (EMSO-d6) δ: 3,85 (s, 3H), 7,44 (d, 405 6- [6- (1-metil-lH-pirazol- 1H), 7,81 (d, 1H), 4-il) -[1,2,4]triazolo [4,3 7,82 (dd, 1H), 7,86 -£>] piridazin-3- (s, 1H), 8,10 (d, ilsulfanil]-5-nitro- 1H), 8,38 (s, 1H), quinolina 8,52 (d, 1H), 8,53 (d, 1H), 9,05 (dd, 1H) 14 I I h3Ç 'V T l| N (EMSO-d6) δ: 3,91 (s, 3H), 7,63 (dd, 366 3-(Benzotiazol-6- 1H), 7,77 (d, 1H), ilsulfanil)-6-(1- metil- 8, 05-8, 07 (m, 2H), 1 H-pir azol-4-il) - 8,40-8,47 (m, 3H), [1,2,4]triazolo[4,3- 9,41 (s, 1H) b] piridazina 15 I I HS (EMSO-d6) δ: 3,84 (s, 3H), 7,70 (d, 384 3-(5-Fluoro-benzotiazol-6- 1H), 7,98 (s, 1H), ilsulfanil)-6-(1-metil-lH 8,03 (d, 1H), 8,36- -pirazol-4-il)- 8,39 (m, 3H), 9,43 [1,2,4]triazolo[4,3- (s, 1H) £>] piridazina ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura EMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 H3Cs 16 I I H,Ç /\-N N-* J! ^ (EMSO-d6) δ: 2,65 374 N„jL N J (s, 3H), 3,89 (s, 7—ISfetil—6— [6- (1-metil) -1H- 3H), 7,45 (dd, 1H), pirazol-4-il)- 7,75 (d, 1H), 7,97 [1,2,4]triazolo [4,3- (s, 1H), 8,02 (s, i>]piridazin-3-ilsulfanil] - 1H), 8,04 (s, 1H), quinolina 8,27 (dd, 1H), 8,43 (d, 1H), 8,44 (s, 1H), 8,85 (dd, 1H) 17 I I H)CnVi (EMSO-d6) δ: 2,79 (d, 3H), 7,54-7,57 449 2-Fluoro-4-[3-(7-fluoro- (m, 1H), 7,72 (t, quinolin-6-ilsulfanil)- 1H), 7,81 (dd, 1H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,85 (dd, 1H), 7,93 jb]piridazin-6-il] -N-metil- (d, 1H), 8,12 (d, benzamida 1H), 8,29 (d, 1H), 8,39 (m, 2H), 8,63 (d, 1H), 8,93-8,95 (m, 1H) 18 I I w»Yi 2¾ T | N (EMSO-d6) δ: 2,64 (s, 3H), 2,79 (d, 445 2-Fluoro-i\7-rnetil-4- [3- (7- 3H), 7,46-7,49 (m, metil-quinolin-6- 1H), 7,74 (t, 1H), ilsulfanil)- 7,82-7,85 (m, 1H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,87 (m, 1H), 8,00 jb] piridazin-6-il ] benzamida (s, 1H), 8,08 (d, 1H), 8,11 (s, 1H), 8,27 (m, 1H), 8,39 (m largo, 1H), 8, 60 (d, 1H), 8,87 (m, 1H) ΡΕ2084162 144

ΡΕ2084162 145

ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura KMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 25 I I "S «-€h (EMSO-d6) δ: 3,81 (s, 3H), 3,92 (s, 363 3-(3-Metil-3H- 3H), 7,39 (d, 1H), benzimidazol-5- 7,41 (d, 1H), 7,63 ilsulfanil)-6-(1-methil- (d, 1H), 7,74 (d, lfí-pirazol-4-il) - 1H), 7,96 (d, 1H), [1,2,4]triazolo [4,3- 8,11 (s, 1H), 8,23 b] piridazina (s, 1H), 8,39 (d, 1H), 8,51 (s, 1H) 26 I I HjÇ A-N n-j s-\T n.jL n j Ύγ» á CH, (EMSO-d6) δ: 3,90 (s, 3H), 4,02 (s, 390 4-Metoxi-6-[6-(l-metil-lH- 3H), 7,06 (d, 1H), pirazol-4-il)- 7,76-7,78 (m, 2H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,91 (d, 1H), 8,05 £>]piridazin-3-ilsulfanil] - (s, 1H), 8,32 (d, quinolina 1H), 8,43 (d, 1H), 8,46 (s, 1H), 8,73 (d, 1H) 27 III N-Óxido de 6-[6-(1-metil- (EMSO-d6) δ: 3,89 (s, 3H), 7,47 (dd, 376 1H), 7,75 (dd, 1H), lH-pirazol-4-il)- 7,81 (d, 1H), 7,87 [1,2,4] triazolo [ 4,3, b] piri (d, 1H), 8,00 (s, dazin-3-ilsulfanil]- 1H), 8,16 (d, 1H), quinolina 8,44 (s, 1H), 8,46 (d, 1H), 8,49 (d, 1H), 8,55 (d, 1H) ΡΕ2084162 147

ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura EMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 31 I II "S s-0-¾ *VrW jf HjC° (EMS0-d6) δ: 3,05 (s, 3H), 3,51 (t, 407 3-{3-(2-Metoxi-etil)-3 H- 2H), 3,86 (s, 3H), benzimidazol-5- 4,34 (t, 2H), 7,32 ilsulfanil]-6-{l-metil-lH- (dd, 1H), 7,57 (d, pirazol-4-il}- 1H), 7,68 (d, 1H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,94 (s, 1H), 8,03 b] piridazina (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,33 (d, 1H), 8,45 (s, 1H) 32 II III s-Gi r HCOOH ".C (EMSO-d6) δ: 2,06 (s, 6H), 2,52 (t, 420 Sal formato de dimetil-(2- 2H), 3,93 (s, 3H), {6-{6-{1-metil-lH-pirazol- 4,30 (t, 2H), 7,38 4-il)-{l,2,4] triazolo [4,3- (dd, 1H), 7,63 (d, £>]piridazin-3-ilsulfanil] - 1H), 7,75 (d, 1H), benzimidazol-l-il}-etil]- 7,97 (d, 1H), 8,10 amina (s, 1H), 8,20 (s largo, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,52 (s, 1H) 33 I I HjÇ Í^V-N N~. S T L N NH2 TFA aalt (EMSO-d6) δ: 3,89 (s, 3H), 7,30 (s 375 Trifluoroacetato de 6-[8- lg, 1H), 7,35 (dd, (l-metil-lH-pirazol-4-il)- 1H), 7,75 (d, 1H), [l,2,4]triazolo[4,3 - 7,82 (d, 1H), 7,87 i>]piridazin-3-ilsulfanil] - (d, 1H), 8,02 (s, quinolin-3-ilamina 1H), 8,4 (dd, 3H) ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura EMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 34 II HjC /^rVNl N.J1 N J u .N h2n TFA salt (EMSO-d6) δ: 3,90 (s, 3H), 6,76 (d, 375 Trifluoroacetato de 6-[6- 1H), 7,78 (d, 1H), (l-metil-lH-pirazol-4-il}- 7,83 (d, 1H), 7,95 [1,2,4]triazolo{4,3- (dd, 1H), 8,01 (s, b]piridazin-3-ilsulfonil] - 1H), 8,41 (t, 1H), quinolin-4-ilamina 8,47 (d, 2H), 8,62 (d, 1H), 9,04 (d, 2H) 35 I I (EMSO-d6) δ: 1,50 (s, 9H), 3,89 (s, 475 Éster terc-butilico do 3H), 7,52 (dd, 1H), ácido {6-[6-(1-metil-lH- 7,78 (d, 1H), 7,86 pirazol-4-il)- (d, 1H), 8,01 (d, [1,2,4]triazolo [4,3- 2H), 8,45 (m, 3H), b]piridazin-3-ilsulfanil]- 8,79 (d, 1H) 9,95 quinolin-3-il}-carbâmico (s lg, 1H) 36 III HjC b\,N s-VJ hT. orV (EMSO-d6) δ: 1,52 (s, 9H), 3,88 (s, 475 Éster terc-butilico do 3H), 7,76 (d, 1H), ácido {6-[6-{1-metil-lH- 7,78 (d, 1H), 7,95 pirazol-4-il)- (d, 1H), 8,01 (s, [1,2,4]triazolo{4,3- 1H), 8,08 (d, 1H), b}piridazin-3-ilsulfanil}- 8,44 (s, 1H), 8,46 quinolin-4-il}carbâmico (d, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,81 (d, 1H), 10,21 (s, 1H) ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura KMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 37 II s-CrS hj<Vn'n4 ^ kV (EMSO-d6) δ: 2,53 (s, 3H), 7,39 (d, 294 6-(6-Metil- 1H), 7,55 (dd, 1H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,65 (dd, 1H), 7,98 d]piridazin-3-ilsulfanil) - (d, 1H), 8,00 (d, quinolina 1H), 8,32 (dd, 1H), 8,39 (d, 1H), 8,89 (d, 1H) 38 III HjC „ N7l N.JL N. J \sa< (EMSO-d6) δ: 3,86 (s, 3H), 7,62 (dd, 376 6- (6- (1-metil-l.H-pirazol- 1H), 7,79 (d, 1H), 4-il)-{1,2,4}triazolo[4,3- 7,99 (s, 1H), 8,00 d]piridazina-3-sulfinil] - (dd, 1H), 8,11 (d, quinolina 1H), 8,43 (s, 1H), 8,44 (d, 1H), 8,63 (dd, 1H), 8,71 (d, 1H), 8,96 (dd, 1H) 39 I II HN1 T 1 N (EMSO-d6) δ: 7,55 (1H, d), 7,75 (1H, 346 6—{6—(lH-Pirazol-4-il)- dd), 7,83 (1H, d), [1,2,4]triazolo[4,3- 7,98 (1H, d), 8,01 £>]piridazin-3-ilsufanil] - (1H, s), 8,16 (1H, quinolina d), 8,35 (1H, d), 8,46 (1H, d), 8,47 (1H, s), 8,90 (1H, dd), 13,40 (1H, s lg) ΡΕ2084162 151

ΡΕ2084162 152

ΡΕ2084162 (continuação)

ΡΕ2084162 154

ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura RMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 51 II (EMSO-d6) δ: 2,53 312 HjCTN n4n (s, 3H), 7,38 (d, 7-Fluoro-6-(6-metil- 1H), 7,54 (dd, 1H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,92 (d, 1H), 8,03 £>]piridazin-3-ilsulfanil) - (d, 1H), 8,34 (dd, quinolina 1H), 8,38 (d, 1H), 8,93 (dd, 1H) 52 I I s-vVS (EMSO-d6) δ: 2,54 392 η^>ν·νΛ (s, 3H), 3,89 (s, 7-Fluoro-3-(l-metil-lH- 3H), 7,41 (d, 1H), pirazol-4-il)-6-(6-metil- 7,79 (d, 1H), 7,89 [1,2 ,4]triazolo[4,3- (d, 1H), 8,03 (s, £>]piridazin-3-ilsulfanil) - 1H), 8,35 (s, 1H), quinolina 8,41 (d, 1H), 8,43 (d, 1H), 9,20 (d, 1H) λ-νη 53 I II rV> V (EMSO-d6) δ: 2,57 (3H, s), 3,86 (3H, 363 N-N CH, s), 7,28 (1H, d), 6-Metil-3-{5-(1-metil-lH- 7,90 (1H, d), 8,00 pirazol-4-il)-1H- (1H, d), 8,14 (1H, pirrolo [2,3-£>] piridin-3- d), 8,20 (1H, s), ilsulfanil}- 8,21 (1H, d), 8,56 [1,2,4]triazolo [4,3- (1H, d), 12,27 (1H, b]piridazina s) 54 II (EMSO-d6) δ: 2,45 (s, 3H), 2,53 (s, 308 3-Metil-6-(6-metil- 3H), 7,39 (d, 1H), [l,2,4]triazolo[4,3 - 7,57 (dd, 1H), 7,88 b] piridazin-3- (d, 1H), 7,93 (d, ilsulfanil)quinolina 1H), 8,07 (s, 1H), 8,38 (d, 1H), 8,76 (d, 1H) ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura EMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 55 I I *-Çt“'j (EMSO-d6) δ: 3,83 (s, 3H), 7,62 (dd, 378 5-Fluoro-6-[6-(1-metil-lH- 1H), 7,65 (t, 1H), pirazol-4-il)- 7,69 (d, 1H), 7,79 [1,2,4]triazolo [4,3- (d, 1H), 7,92 (s, £>]piridazin-3-ilsulfanil] - 1H), 8,36 (s, 1H), quinolina 8,37 (d, 1H), 8,48 (d, 1H), 8,94 (dd, 1H) 56 I I N) ^nn~chj (EMSO-d6) δ: 2,45 (s, 3H), 3,85 (s, 392 5-Fluoro-3-(1-metil-lH- 3H), 7,31 (d, 1H), pirazol-4-il)-6-(6-metil- 7,41 (dd, 1H), 7,73 [l,2,4]triazolo[4,3- (d, 1H), 8,16 (s, £>]piridazin-3-ilsulfanil) - 1H), 8,30 (d, 1H), quinolina 8,46 (s, 1H), 8,50 (d, 1H), 9,22 (d, 1H) 57 IV "YíVTp., γ-Ν (EMSO-d6) δ: 2,56 (s, 3H), 3,59 (s, 407 3H), 6,85 (d, 1H), 6-(6-Metil- 7,41 (d, 1H), 7,73 [1,2,4]triazolo [4,3- (dd, 1H), 8,03 (d, £>]piridazin-3-ilsulfanil) - 1H), 8,19 (d, 1H), 4 - (4-metil-4.fi- 8,40 (d, 1H), 8,68 [1,2,4]triazolo-3- (d, 1H), 8,89 (s, ilsulfanil)quinolina 1H) 58 I I S-Qj HiC'~YNN'ÍN k>/ V'™’ (EMSO-d6) δ: 0,98 (t, 3H), 2,67 (m, 388 6-(6-Metil- 2H), 3,71 (s, 3H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,26 (d, 1H), 7,42 £>]piridazin-3-ilsulfanil) - (m, 1H), 7,68 (d, 4 )-3-(1-metil-lfí-pirazol- 1H), 7,76 (d, 1H), 4-il)-quinolina 7,88 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,23 (m, 2H), 8,99 (d, 1H) ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura KMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 59 I II s-cn TL ju ·ν Γνμ (EMSO-d6) δ: 2,35 (s, 3H), 7,32 (d, 360 6-(6-Metil- 1H), 7,41 (m, 1H), [1,2,4]triazolo [4,3- 7,62 (d, 1H), 7,77 £>]piridazin-3-ilsulfanil) - (d, 1H), 7,95 (s, 3- (lfí-pirazol-4-il) - 1H), 8,23 (d, 1H), quinolina 8,27 (m, 2H), 9,05 (d, 1H) 60 I I HjC /^VN νΊ\ sA-4 n*JL n Λ νΛ r CH3 (EMSO-d6) δ: 1,21 (t, 3H), 3,03 (q, 388 4-Etil-6-[6-metil-lH- 2H), 3,89 (s, 3H), pirazol-4-il)- 7,40 (d, 1H), 7,69 [l,2,4]triazolo[4,3- (dd, 1H), 7,78 (d, £>]piridazin-3-ilsulfanil] - 1H), 7,96 (d, 1H), quinolina 8,01 (s, 1H), 8,28 (d, 1H), 8,45 (m, 2H), 8,78 (d, 1H) 61 I I Γ^\— N s-\T ') VS-4 T In Γνυ' (EMSO-d6) δ: 2,53 (s, 3H), 3,35 (m, 443 3-[1-(l-Etil-azetidin-3- 2H), 3,71 (m, 2H), il) -líf-pirazol-4-il] -6- (6- 4,99 (m, 1H), 5,71 metil-[1,2,4]triazolo[4,3- (s, 2H), 7,39 (d, £>]piridazin-3-ilsulfanil) - 1H), 7,59 (dd, 1H), quinolina 7,78 (d, 1H), 7,94 (d, 1H), 8,14 (s, 1H), 8,41 (d, 1H), 8,43 (1H, d), 8,60 (1H, s), 9,19 (1H, d) ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Enzimático c-MET IC50 Ensaio XTT (GTL16) IC50 Estrutura EMN de 1H (500 MHz) MS (m/z) [M+H+] + 62 I I 3-(l-Azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-metil-[1,2,4] triazolo [4,3-i>]piridazin-3-ilsulfanil) -quinolina (EMSO-d6) δ: 2,50 (s, 3H), 3,84 (m, 2H), 3,98 (m, 2H), 5,23 (quinteto, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,61 (dd, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,44 (d, 1H), 8,59 (s, 1H), 9,20 (d, 1H) 415 63 I I j-OQí N ~\?N“ 3-[1-(l-metil-azedin-3-il)-lH-pirazol-4-il) -6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-i>]piridazin-3-ilsulfanil) -quinolina (EMSO-d6) δ: 2,34 (s, 3H), 2,53 (s, 3H), 3,41 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 4,98 (quinteto, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,60 (dd, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,44 (d, 1H), 8,60 (s, 1H), 9,20 (d, 1H) 429 64 I I Xxi~^4 0 Éster terc-butilico do ácido 3-{4-[6-(6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-£>]piridazin-3-ilsulfanil) -quinolin-3-il]-pirazol-1-il}-azetidina-1-carboxílico (EMSO-d6) δ: 1,42 (s, 9H), 2,54 (s, 3H), 4,17 (m lg, 2H), 4,34 (m lg, 2H), 5,26 (m, 1H) 7,40 (d, 1H), 7,60 (dd, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,45 (d, 1H), 8,63 (s, 1H), 9,21 (1H, d) 515 ΡΕ2084162 (continuação)

Corrpostos Ensaio Ensaio XTT Estrutura KMN de 1H (500 MS (m/z) Enzimático (GTL16) MHz) [M+H+] + c-MET IC50 IC50 65 I I £ (EMSO-d6) δ: 1,35 529 N }=\ ΓΝ “ (s, 9H), 2,52 (s, Éster terc-butilico do 3H), 3,00 (m, 1H), ácido 3-{4-[6-(6-metil- 3,70 (m lg, 2H), [l,2,4]triazolo[4,3- 3, 90 (m lg, 2H), b]piridazin-3-ilsulfanil)- 4,37 (d, 2H), 7,39 quinolin-3-il]-pirazol-1- (d, 1H), 7,60 (dd, ilmetil}-azetidina-1- 1H), 7,80 (d, 1H), carboxilico 7,94 (d, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,39 (d, 1H), 8,40 (s, 1H), 9,16 (d, 1H) 66 I I ViN /-¾ V-N (EMSO-d6) δ: 1,42 (t, 3H), 2,53 (s, 388 0·^ 3H), 4,18 (q, 2H), 3- (l-Etil-l.H-pirazol-4- 7,39 (d, 1H), 7,58 il)-6-(6-metil- (dd, 1H), 7,79 (d, [l,2,4]triazolo[4,3- 1H), 7,93 (d, 1H), i>]piridazin-3-ilsulfanil)- 8,07 (s, 1H), 8,38 quinolina (d, 1H), 3,39 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 9,17 (d, 1H) 67 I I W J (EMSO-d6) δ: 0,84 457 (t, 3H), 2,37 (q, 3-[1-(l-Etil-azetidin-3- 2H), 2,52 (s, 3H), ilmetil)-lH-pirazol-4-il]- 2,81 (m, 1H), 2,93- 6-(6-metil- 3,00 (m, 2H), 3,19- [l,2,4]triazolo[4,3- 3,25 (m, 2H), 4,32 i>]piridazin-3-ilsulfanil)- (d, 2H), 7,40 (d, quinolina 1H), 7,59 (dd, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,93 (d, 1H), 8,07 (d, 1H), 8,38-8,43 (m, 3H), 9,17 (d, 1H) ΡΕ2084162 160

ΡΕ2084162 (continuação)

Compostos Ensaio Enzimático c-MET IC50 Ensaio XTT (GTL16) IC50 Estrutura EMN de 1H (500 MHz) MS (m/z) [M+H+] + 71 w S—\—N '“O UNH 3-(-Azetidin-3-il-lH-pirazol-4-il)-6-(6-etil-[1,2,4]triazolo [4,3-£>]piridazin-3-ilsulfanil) -quinolina 429 72 '"7> N 3-(l-Azetidin-3-ilmetil-lH-pirazol-4-il)-6 -(6-etil- [1,2,4] triazolo [4,3-£>]piridazin-3-ilsulfanil) -quinolina 443 em que: I IC50 < lOOnM; II 100 nM < IC50 < 1 pM; III 1 pM < IC50 < 10 pM; e IV IC50 > 10 pM.

Exemplo 24: ensaios in vitro

Podem utilizar-se ensaios conhecidos pelos especialistas da técnica para a determinação das actividades inibidoras de quinase dos compostos e das composições do presente fascículo. Incluem-se nos ensaios de quinase, sem que eles se limitem a estes, os exemplos que se seguem. 162 ΡΕ2084162

Avaliaram-se os dados dos despistes utilizando a equação seguinte: Z ' =1-[3* (σ++σ_) / | μ+-μ- | ] (Zhang, et al., 1999 J. Biomol. Screening 4(2) 67-73), em que μ denota a média e σ o desvio padrão. Os índices designam os controlos positivo ou negativo. 0 valor da classificação Z' para um ensaio de despiste robusto deveria ser > 0,50. O limiar típico será = μ+-3*σ+. Qualquer valor inferior ao liar foi designado um "acertar". Analisou-se a resposta à dose utilizando a equação: y=min+ { (max-min) / (1 + 10 [composto]“logIC5o) } em que y é o coeficiente angular inicial observado, max é o coeficiente angular na ausência de inibidor, min é o coeficiente angular a inibidor infinito, e o valor de IC50 é a concentração de composto que corresponde a ^ da amplitude total observada (Amplitude=max-min).

Ensaio de MET Baseado em Luminescência

Materiais: substrato poli Glu-Tyr (a 4:1) (Sigma, N° de Cat0 P-0275), ATP (Sigma, N° de Cat° A-3377, FW=551), tampão HEPES, pH 7,5, albumina de soro de bovino (BSA) (Roche 92423420), MgCl2, Estaurosporina (Streptomyces sp.r Sigma, N° de Cat° 85660-1MG), placa branca Costar de 384 poços de fundo chato (VWR, N° de Cat° 29444-088) . MET quinase (ver adiante), Kinase-Glo™ (Promega, N° de Cat° V6712) .

Soluções de Partida: poli Glu-Tyr a 10 mg/mL em água, armazenada a -20°C; tampão HEPES 100 mM, pH 7,5 (5 mL 163 ΡΕ2084162 da solução de partida 1 M + 45 mL de H20 miliQ); ATP 10 mM (5,51 mg/mL em dH20) armazenada a -20°C (diluída diariamente: 50 pL num total de 10 mL de H20 miliQ = solução de trabalho 50 μΜ em ATP) ; 1 % de BSA (1 g BSA em 100 mL de tampão HEPES 0,1 M, pH 7,5, armazenada a -20°C), MgCl2 100 mM; Estaurosporina 200 μΜ, reagente 2X Kinase-Glo™ (preparado de frasco ou armazenado a -20°C).

Montagem do Ensaio Padrão para placa de 384 poços (20 pL por reacção de quinase, 40 pL por reacção de detecção): MgCl2 10 mM; 0,3 mg/mL de poli Glu-Tyr; 0,1 % de BSA; 1 pL de compostos em teste (em DMSO); 0,4 pg/mL de MET quinase; ATP 10 pM; tampão HEPES 100 mM. Os controlos positivos continham DMSO sem nenhum composto em teste. Os controlos negativos continham estaurosporina 10 pM. Iniciaram-se as reacções de quinase no instante t=0 pela adição de ATP. Incubaram-se as reacções de quinase a 21 °C durante 60 minutos, depois adicionou-se 20 pL de reagente Kinase-Glo™ por poço, para terminar a reacção da quinase e iniciar a reacção luminescente. Passados 20 minutos de incubação a 21°C, detectou-se a luminescência num luminómetro para leitura de placas.

Purificação de Met:

Voltaram a suspender-se as pastilhas de células de metade de uma cultura de 12 L de células de insecto Sf9 que expressavam o domínio da quinase de Met humana, num tampão contendo Tris-HCl 50 mM, pH 7,7 e NaCl 250 mM, num ΡΕ2084162

do lado B volume de cerca de 40 mL por 1 L de cultura original. Adicionou-se um comprimido de mistura de inibidores de protéase isenta de EDTA Roche Complete, (N° de Cat° 1873580) por cada 1 L de cultura original. Agitou-se a suspensão durante 1 hora a 4°C. Removeram-se os detritos por centrifugação durante 30 minutes a 39, 800 x g a 4°C. Decantou-se o sobrenadante para um copo de 500 mL e adicionaram-se-lhe 10 mL de suspensão a 50 % de Qiagen Ni-NTA Agarose (N° de Cat° 30250) que havia sido previamente equilibrada com Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 50 mM, 10 % de Glicerol, Imidazole 10 mM, e Metionina 10 mM, e agitou-se durante 30 minutos a 4°C. Verteu-se então a amostra para uma coluna de gota a gota a 4°C e lavou-se com 10 volumes e coluna de Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, com 10 % de Glicerol, Imidazole 10 mM, e Metionina 10 mM. Eluiu-se a proteína utilizando um gradiente em passos com dois volumes de coluna do mesmo tampão contendo sequencialmente Imidazole 50mM, 200 mM, e 500 mM. O marcador de 6x Histidina foi clivado de um dia para o outro utilizando 40 unidades de protéase TEV (Invitrogen N° de Cat° 10127017) por 1 mg de proteína, enquanto se dialisava em Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, 10 % de Glicerol, Imidazole 10 mM, e Metionina 10 mM a 4°C. Removeu-se o marcador de 6x Histidina passando a amostra através de uma coluna Pharmacia IMAC de 5 mL (N° de Cat° 17-0409-01) carregada com Níquel e equilibrada com Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, 10 % de Glicerol, Imidazole 10 mM, e Metionina 10 mM. A proteína clivada estava ligada à coluna de Níquel a uma pequena afinidade e foi eluída com um gradiente em passos. Correu-se o gradiente em passos com 15 % e depois com 80 % 165 ΡΕ2084162 (lado A = Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, 10 % de

Glicerol, Imidazole 10 mM, e Metionina 10 mM; Lado B = Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, 10 % de Glicerol,

Imidazole 500 mM, e Metionina 10 mM 500mM) durante 4

volumes de coluna cada. A proteína Met eluiu no primeiro passo (15 %) , enquanto a Met não clivada e o marcador de Histidina eluiram nas fracções de 80 %. Juntaram-se as fracções de 15 % depois de uma análise por SDS-PAGE confirmar a presença de Met clivada; purificou-se mais por cromatografia de filtração sobre gel numa coluna Amersham Biosciences HiLoad 16/60 Superdex 200 de grau preparativo (N° de Cat° 17-1069-01) equilibrada com Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, NaCl 150 mM, 10 % de Glicerol e DTT 5 mM. Combinaram-se as fracções mais limpas e concentrou-se até ~ 10,4 mg/mL por centrifugação numa unidade de filtro centrífugo de 10.000 Da MWCO Amicon Ultra-15 (N° de Cat° UFC901024).

Perfilagem SelectScreen™ de Quinase (Invitrogen

Corp.) ™ ✓ ...

SelectScreen e uma marca registada de um protocolo para um ensaio de despiste de quinases desenvolvido pela Invitrogen Corporation, Madison, Wis. Podem encontrar-se pormenores acerca das condições de operação no local da empresa na internet. A Tabela II resume as % de inibição dos compostos 4 e 41 contra um painel de quinases, a uma concentração de 1 μΜ. ΡΕ2084162

Tabela II

Quinase Testada % de Inibição @ 1 μΜ Composto 4 Composto 41 ABL1 T315I 11 47 ABL1 Y253F 20 30 AKT1 (PKB alfa) 5 -1 ALK -10 23 AURKA (Aurora A) 18 49 AURKB (Aurora B) 7 61 BRAF V599E 36 7 CDKl/ciclina B 5 17 CSF1R (FMS) 19 79 EGFR (ErbBl) -2 0 EPHA2 -23 2 FES (FPS) 5 1 FGFR3 -4 26 FLT3 D835Y 8 35 FRAP1 (mTOR) 0 GRK4 2 -4 GSK3B (GSK3 beta) 5 1 HCK 8 9 IGF1R -3 6 IKBKB (IKK beta) -5 1 JAK2 JH1 JH2 V617F -11 9 KDR (VEGFR2) 5 16 KIT T670I -12 4 MAP2K1 (MEK1) 16 3 ΡΕ2084162 (continuação)

Quinase Testada % de Inibição Θ 1 μΜ Composto 4 Composto 41 MAP4K4 (HGK) -1 27 MAPK1 (ERK2) 9 0 MERTK (cMER) 7 10 MET (cMet) 92 98 MET M1250T 64 89 MST1R (RON) 9 53 NTRK3 (TRKC) 7 85 PDGFRA T674I -9 -1 PDK1 7 6 PIM1 4 0 PLK1 0 0 PRKCD (PKC delta) 4 5 PTK2B (FAK2) 6 12 RET 5 21 ROS1 7 41 RPS6KB1 (p7 0 S 6K) 3 5 TEK (Tie2) 8 4 TYR03 (RSE) 19 22

Ensaios com Células

Mantiveram-se células GTL16 em Meio DMEM suplementado com 10 % de soro fetal de bovino (FS LG) , L-Glutamina 2 mM e and 100 unidades de penicilina/100 yg de estreptomicina, a 37°C em 5 % de CO2. 168 ΡΕ2084162

Criaram-se células Ba/F3 TPR-MET transduzindo de forma estável o gene humano TPR-MET em células Ba/F3 utilizando um sistema retroviral. Cultivaram-se todas as linhas de células em meio RPMI-1640 suplementado com IX penicilina/estreptomicina e 10 % de soro fetal de bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mantiveram-se as células num incubadora humidificada sob 5 % de CO2 a 37°C.

Ensaios de Sobrevivência de Células

Testaram-se os compostos em duplicado, usando os seguintes ensaios.

Ensaio XTT em 96 poços (células GTL16): No dia anterior ao do ensaio aspirou-se o meio de cultura e adicionou-se 's células meio de ensaio. No dia do ensaio, cultivaram-se as células em meio de ensaio contendo diversas concentrações de compostos (em duplicado) numa placa de 96 poços com fundo chato durante 72 horas a 37°C sob 5 % de CO2. 0 número inicial de células era de 5.000 células por poço, e o volume era de 120 yL. No final da incubação de 72 horas, adicionaram-se a cada poço 40 yL de mistura de marcação XTT (solução a 50:1 de hidrato de ácido 31 — [1—(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazólio]-bis(4-metoxi-6-nitro)benzenossulfónico a 50:1) e reagente de acoplamento electrónico: PMS (sulfato de N-metildibenzopirazina e metilo). Passadas mais 5 horas de incubação a 37°C, mediu-se a absorvância a 450 nm com uma correcção da linha de base a 650 nm, num espectrofotómetro. 169 ΡΕ2084162

Ensaio XTT em 96 poços (células Ba/F3): Cultivaram-se as células em meios de cultura contendo diversas concentrações dos compostos (em duplicado) numa placa de 96 poços durante 72 horas a 37°C. 0 número inicial era de 5.000-8.000 células por poço, e o volume era de 120 pL. No final da incubação de 72 horas, adicionou-se a cada poço 40 pL de mistura de marcação XTT (solução de hidrato de ácido 3 ' - [ 1- (fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazólio]-bis(4-metoxi-6-nitro)benzenossulfónico a 50:1) e reagente de acoplamento electrónico: PMS (sulfato de N-metildibenzopirazina e metilo) . Passadas mais 2-6 horas de incubação a 37°C, mediu-se a absorvância a 405 nm com uma correcção da linha de base a 650 nm, nem espectrofotómetro.

Ensaios de Fosforilação

Ensaio de fosforilação de Meti plaquearam-se células GTL16 a lxlO6 células por placa de Petri de 60 x 15 mm (Falcon) em 3 mL de meio de cultura. No dia seguinte adicionaram-se diversas concentrações dos compostos em meio de cultura, e incubou-se durante 1 hora a 37°C sob 5 % de CO2. Passada 1 hora aspiraram-se os meios, e lavaram-se as células uma vez com IX PBS. Aspirou-se o PBS e recolheram-se as células de cada poço em 100 pL de tampão de lise RIPA modificado (Tris.HCl pH 7,4, 1 % de NP-40, 5 mM em EDTA, 5 mM em NaPP , 5 mM em NaF, 150 mM em NaCl, Mistura de inibidores de protease (Sigma), 1 mM em PMSF, 2 mM em

NaVCp) e transferiram-se para tubos de Eppendorf de 1,7 mL 170 ΡΕ2084162 e incubaram-se sobre gelo durante 15 minutos. Após a lise, centrifugaram-se os tubos (10 minutos, 14.000 g, 4°C). Transferiram-se então os lisados para novos tubos de Eppendorf. Diluiram-se as amostras a 1:2 (250.000 células/tubo) com tampão de carga 2X SDS PAGE e aqueceram-se durante 5 minutos a 98°C. Separaram-se os lisados num Gel NuPage com 4-12 % de Bis-Tris Gel 1,0 mm x 12 poços (Invitrogen), a 200 V, 400 mA durante cerca de 40 minutos. Transferiram-se então as amostras para um filtro de membrana de 0,45 mícron em Nitrocelulose, Papel de Filtro Sanduíche (Invitrogen) durante 1 hora a 75V, 400 mA. Depois da transferência colocaram-se as membranas em tampão de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Removeu-se o tampão de bloqueio e adicionou-se uma diluição a 1:500 de anticorpo anti-Fosfo-Met (Tyr 1234/1235) (Cell Signaling Technologies, N° de Cat° 3126L) em 5 % de BSA, com 0,05 % de Tween®20 em IX PBS, e incubaram-se as transferências de um dia para o outro à temperatura ambiente. No dia seguinte lavaram-se as transferências três vezes com IX PBS, 0,1 % de Tween®20. Adicionou-se-lhes uma diluição a 1:3.000 de anticorpo HRP conjugado de cabra anti-coelho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, N° de Cat° 111-035-003) em tampão de bloqueio, e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Lavaram-se 3 vezes as transferência com PBS, contendo 0,1 % de Tween®20, e visualizaram-se por quimioluminescência com Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce N° 34078). ΡΕ2084162 171

Exemplo 25: modelo de xenotransplante tumoral GTL16

Materiais e métodos

Os murganhos fêmea atímicos nus (nu/nu, da

Harlan) tinham 6-8 semanas de idade e massas corporais de 18-22 g no inicio do estudo. Os animais dispunham de livre acesso a ração e água ao longo do estudo. Alojaram-se os murganhos com leitos para animais de laboratório irradiados, Alpha-dri® bed-o-cobs®, em micro-jaulas estáticas isoladas sob um ciclo de 12 hora de luz, a 7,0-74°F e sob uma humidade de 40-60 %. Todos os procedimentos envolvendo animais forma conduzidos respeitando as normas da NIH no Guide for the Care and Use of Laboratory Animais, e todos os protocolos foram aprovados por uma Comissão interna de Cuidados Com e Utilização de Animais (IACUC).

Implantação do tumor

Iniciaram-se os xenotransplantes a partir de células tumorais GTL-16 cultivadas e mantidas por um Departamento de Bilogia Celular interno. Cada murganho do teste recebeu uma injecção subcutânea contendo 4 x 106 células suspensas em 100 pL de meio RPMI isento de soro. Distribuiram-se os tumores aleatoriamente por grupos de tratamento, no Dia 5, quando a dimensão média dos tumores atingia cerca de 150 mm3. Cada um dos grupos de dose 172 ΡΕ2084162 continha n=5 murganhos. Calculou-se o volume de cada tumor utilizando a fórmula:

Volume do tumor = w2xl em que w = largura e 1 = comprimento, em mm, do tumor. Pode estimar-se a massa do tumor assumindo que 1 mg é equivalente a 1 mm3 de volume de tumor.

Análise da inibição do crescimento tumoral

Calculou-se a TGI a partir da diferença entre os volumes médios dos tumores entre os murganhos tratados com veiculo e os tratados com fármaco, exprimindo-se em percentagem.

%TGI = Volume Médio do Tumorcontrol„ - Volume Médio do Tumortratadocomfârmaco χ 10Q

Volume Mediano do Tumorcontrolo

Define-se o MTV como sendo o volume tumoral médio (MTV) para o número de animais, n, que restam no estudo no dia a que se refere.

Resultados

Mostram-se os resultados o estudo do crescimento de tumores de GTL 16 para o composto 4 na Figura 1, na Figura 2, e na Figura 3. 173 ΡΕ2084162

Na Figura 1, administrou-se o composto 4 por via oral (PO) a 10, 20, 30, e 100 mg/kg duas vezes ao dia (Q12H) e 60 mg/kg uma vez ao dia (Q24H) durante 14 dias consecutivos. O tratamento começava no Dia 4. No ultimo dia do tratamento as doses de 10, 20, 30, 100 mg/kg PO Q12H e de 60 mg/kg PO Q24H diminuíram o volume médio tumoral de, respectivamente, 65 % (p<,0001), 75 % (p<,0001), 81 % (p<, 0001), 87 % (p<, 0001) e 75 % (p<, 0001), em comparação com o volume médio tumoral do grupo tratados com veículo. O composto 4 demonstrou inibir a autofosforilação da MET mais do que 90 % em tumores de murganhos tratados com estas doses. No ultimo dia do tratamento, a autofosforilação da MET nos tumores que se retiraram foi avaliada por Transferência Western em diversos momentos ao longo do tempo (1, 2, 6, 12 horas após a última dose) e comparada com a dos controlos a veículo. Dos tumores nos murganhos tratados com 10, 30 e 100 mg/kg PO Q12H, os teores em fosfo-MET eram menores do que 10 % os dos tumores do grupo de controlo tratados com veículo. A Figura 2 mostra os efeitos de administração oral e intraperitoneal do composto 4 sobre a inibição do crescimento de tumores (TGI) de tumores GTL16 em murganhos nus. Todos os tratamentos começaram no Dia 4 após a implantação das células de tumor. No final do regime de doseamento durante 14 dias, calculou-se a % de TGI final pela diferença entre os volumes médios de tumor de animais tratados com veículo e de animais tratados com fármaco, expressa em percentagem do volume médio de tumor no grupo tratados com veículo. 174 ΡΕ2084162 A Figura 3 mostra os efeitos da administração oral e intraperitoneal do composto 4 sobre o crescimento dos tumores de GTL16. Inocularam-se por via subcutâneas murganhos fêmea atimicos nus, no flanco direito com 4 x 106 células GTL16 num volume de veiculação de 100 yL. Deixaram-se crescer os tumores durante quatro dias. Dosearam-se os murganhos por via oral com 10, 20, 30, e 100 mg/kg duas vezes ao dia, e por via oral a 60 mg/kg uma vez ao dia, durante 14 dias consecutivos. No dia do final do estudo, retiraram-se imediatamente os tumores intactos e pesaram-se, servindo o peso húmido final do tumor (miligrama) como apontador primário da eficácia.

Os resultados do estudo do crescimento dos tumores de GTL16 para o composto 41 estão ilustrados na Figura 4, na Figura 5, e na Figura 6.

Na Figura 4, administrou-se o composto 41 por via oral (PO) a 1, 3, 10, e 30 mg/kg duas vezes ao dia (Q12H) durante 13 dias consecutivos. O tratamento iniciou-se no Dia 6. No último dia do tratamento as doses de 1, 3, 10, 30 mg/kg PO Q12H diminuíram o volume médio de tumor em, respectivamente, 42 % (p=,0030), 67 % (p<,0001), 80 % (p<, 0001), e 87 % (p<, 0001), em comparação com o volume médio de tumor do grupo tratado com veículo. A Figura 5 mostra os efeitos da administração oral e intraperitoneal do Composto 41 sobre a inibição do 175 ΡΕ2084162 crescimento de tumores (TGI) para tumores GTL16 em murganhos nus. Todos os tratamentos começaram no Dia 6 depois de se implantarem células de tumor. No final do regime de doseamento de 13 dias, as % finais de TGI foram calculadas através das diferenças entre o volume médio dos tumores no grupo tratado com veiculo e nos grupos tratados com fármaco, expressos como percentagens do volume médio dos tumores do grupo de controlo tratado com veiculo. A Figura 6 mostra os efeitos de uma administração oral de Composto 41 sobre o crescimento de tumores GTL16. Inocularam-se por via subcutânea murganhos fêmea atimicos nus no flanco direito com 4 x 106 células GTL16 num volume de veiculação de 100 yL. Deixaram-se crescer os tumores durante seis dias. Dosearam-se os murganhos por via oral com 1, 3, 10, e 30 mg/kg duas vezes ao dia durante 13 dias consecutivos. No dia de terminar o estudo, retiraram-se imediatamente os tumores intactos e pesaram-se, servindo o peso húmido final do tumor (miligrama) como apontador primário da eficácia.

Abreviaturas IP Intraperitoneal PO Via Oral BID Duas vezes ao dia Q12H De 12 em 12 horas Q24H De 24 em 24 horas

RPMI

Roswell Park Memorial Institute 176 ΡΕ2084162 NIH National Institute de Health IACUC Animal Care and Use Committee TGI Inibição do Crescimento Tumoral MTV Volume Tumoral Médio

Lisboa, 28 de setembro de 2012

Claims (4)

1.ΡΕ2084162 1 REIVINDICAÇÕES Um composto que tenha a formula: S '"\ ) / "ywx-NxxX. X/ Ν'-' f'- \ / ;>.....nh rv< V A*·''' VT‘ Nr" % i L ,N Nk BxC—H. A Kx W, i * X/ u J, ?Γ'“4t 1 N N> γ-'-Χ, / >"N ' \ Jl X -.'í^V x Αχί F l v >< HjC / )--¾ Η,ς ---X Af \\ ‘ 's. rvA > / Ϊ c i S CH> Λ»τ^ 1 M N xw Nv' HjC, rv« Λλ) -X X .N. · -vv^· WN‘ // \ ! ) > "ΚΛ \ "r^ 'N''\Cw AV J 'Y>‘ Jsj'* \ xX/ 'Χ-Λ *N # \ X jrX·'^ r\J v-x -X 8 % «st ί L ,¾ 'V-'U X-S^N N\ * V-'·' . / r\/ Vw f“ no2 ÍÍ5Ç Ví- m' χ-χ l .X·'1 -i- : , -· · \ x\„..v t 9 f%c &- V χ > ’ " s" s \í \i v> / >—« λΛ) HtC HsÇ XV T ?r \ I N % Xv .*N\ v- N. N S’" / Jjrx HjC, Í^Vn 'NO1' V, XV tí- X**· w / Ns*** -vx yr V kX/ X «jC-s tf;C 0 ? v. w r. ϋ Vv / x\ rx-A 7 Λ. h^n A/\, k L 1, « SxX/ kA/ rVA > ΡΕ2084162 2 - “k ' Υ'Υ r rv2'3 z x> ^ λ ,?Ύ. _,J $ '?Υ\ | N L .W. / "K Λ Y^sfkL ,LY ~w-xr\.A ) Χγ** h5c ru L >' rv^ r~V-£ S,i Y\í 1 ^ ΓΧ-γ P~~\ s-""\ i y Y .1. N- 7 X- \Y ^"νΛ I 7 -' '"V CMj K/.; Y~3Y.A y*·^k,-V f"'· v-7 rv4 j /Yjl s~Y i z ,γ, γ- Ν'' \ liK Cflj H,C . γ^-Ο 'ν····::Ύ.....*''.L ..U/ V’' N k3c'À CKj H-iC γ\Λ > íhCΓ"\κΧ, N ...Ns. y V N Y ./ N. § V-N tt2C \,.^N »Ύ,../ ...o kA/ ,NX síjC αγ H*C Wíj /:' Ύ;- S >Y r\^J. ' Vs/v, t \ ,v_-.Y f'~Y f W$C ">í ,rV\ V·*- ~-\,Y íijt: !*-Λ . ! E / r-V», V-'·" \ / Y^w-i v"V 5 N RN v2V V ,v v X. P *\ I r > •k i ) >' >Λ »>C -,NY Y„A "'kk tf § í * --KJ HS- r\ l·! .· 'vy J L j ^-ά Y Y/ rV/ \iS---v, V“^I > 7 CKS ÍÍ^Cv ,>Y J ΝΓ \ ' x-k... tf ,Λ'ϊϊΥ 1 ^¾¾.^ N 7. ck^ ΓΥ ·* r-~ w-7, 7 vX]/ í > *>“ k HjC ,v V $r «·I L 7 v/S' iYJ •u Ut vkv Γ1 n ΡΕ2084162 3 HtCv V. HjC <Γ~ΝΗ ,/'Μ ΙΑ .·- *· Μ· ) \ Ν'--, · / 1 £ V\ vv-4 V 1 4 í* '7^'coos VaX/ A r^\. r"\ H,C I k /* Λ. HjC Ctij HjC' ,-N> Γ'Χ / í? vs v# s... r? !K<; .1 Λ /55*--\ ,λΙ» m /.....\..4 . / --( t 'ní / .4¾¾^ / -ví S WNf ) \ ,IL „-<! iiiC T" f \ /S k ΐ ( " Ν' 1 1 H x^·1 r\J > ,N-. K \ N'-n- CHj íí k,ç ν\,Λ .V N' \ tf X "\X / 0., \ "'Λ H*CX N" \ íj'· '7 L /* rv4. An CHj κ$ς l tf ' X f~m j' \ Γ S'-\ 1 í A "V /1 r^-Λ -/ ! i ,« r\x% HxC- .. N·. 3 ϊ ji: ! '•vjS'· N / ^ V L ,w_ k 1 ^ ' 'N' An c. ·> CH( w / N-N “\ CHj HsC ciN. Jt / f5- J r % p | „ / A...-- ^V'·- tr'% · ~N A / ^ \ -.¾ / f „ F V*\ KSCX ^Oí? :ΓΝ„. X - / JT) s, CM< / ίΓ"Η N-. & N í Y"H rU ) kA/ kA "Υ'ττ v ..AÀ >9 Γ' V-\ íM'“l S-\J ^ ί·ί.;> JL / "* ^ v** ^> ·*·*\ N -jsr V Ofi ΡΕ2084162 4 rJ\.A J fy4. *rv, A W^· L r-\ rJ\-Â χ-\ V,-«H Ai ΛfV-V ^v, . *v*X> /Λ "\ Xν"γγ V-'X p- VK ,S~\ /”** \.-Λ .í! ««={ x tí \ O' .A /“"1 rfi Ό jN f N^\X-A-, N N c;k N " *αΗ-νWÍ M } h xt I me /'“Α--·* s) AK'Ci% \-;K, , / N~KW* f ') \s=^ fA W - V-N·-^· -Ά, \:S-· f***\ Vx o i, N w< N >«-, -η ·- ' .^N. d~A r - \Á N \ ^T~N & V\ w X, M 1 ΝΉ N*S A N M ou um seu enantiómero, diastereómero, racemato ou sal ou solvato aceitável do ponto de vista farmacêutico destes.

2. Uma composição farmacêutica incluindo um composto, enantiómero, diastereómero, sal ou solvato aceitável do ponto de vista farmacêutico consoante a reivindicação 1, num excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico.

3. Um composto, enantiómero, diastereómero, sal ou solvato aceitável do ponto de vista farmacêutico consoante a reivindicação 1, para utilização no tratamento do cancro. 5 ΡΕ2084162

4. Um composto, enantiómero, diastereómero, sal ou solvato aceitável do ponto de vista farmacêutico consoante a reivindicação 3, em que o cancro seja cancro da mama, cancro do pulmão, melanoma, cancro colo-rectal, cancro da bexiga, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro renal, cancro de células escamosas, glioblastoma, cancro do pâncreas, leiomiossarcoma, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais papilares, cancro gástrico, cancro hepático, cancro da cabeça e pescoço, melanoma ou leucemia. Lisboa, 28 de setembro de 2012