PT2101792E - Utilização de carragenina para tratamento de infecções por rinovírus - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE CARRAGENINA PARA TRATAMENTO DE INFECÇOES POR RINOVÍRUS"

ÁREA TÉCNICA A presente invenção situa-se no campo da imunologia e dos agentes antivirais e refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo iota-carragenina como um ingrediente activo antiviral e às suas aplicações na prevenção ou tratamento terapêutico de infecções por rinovirus.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os picornavirus representam uma família de vírus muito grande de vírus pequenos que contêm ácido ribonucleico responsáveis por muitas doenças humanas e animais graves. Os picornavirus incluem quatro grandes grupos: enterovírus, rinovirus, cardiovírus e aptovírus.

Os rinovirus humanos consistem em pelo menos 100 serotipos e são os principais agentes causadores do resfriado comum. Devido ao grande número de serotipos, o desenvolvimento de uma vacina é problemático; os agentes antivirais podem por isso ser a melhor abordagem para o 2 ΡΕ210111792 tratamento. Os rinovírus são compostos por uma cápside circundante, que contém quatro proteínas virais VP1, VP2, VP3 e VP4. As proteínas VP1, VP2 e VP3 estão organizados em 60 unidades de repetição icosaédricas protaméricas. Crê-se que estas sejam a causa da diversidade antigénica associada a estes vírus.

As infecções por rinovírus (HRV) levam ao resfriado comum, com sintomas tais como febre, tosse e congestão nasal. A infecção por HRV é o segundo agente mais frequentemente identificado associado a pneumonia e bronquiolite em lactentes e crianças pequenas e geralmente provoca exacerbações de doença das vias aéreas pré-existente em pessoas com asma, doença pulmonar obstrutiva crónica ou fibrose quística. A infecção por HRV está associada a de um terço a metade das exacerbações de asma dependendo da idade e está ligada a hospitalizações por asma tanto em adultos como em crianças.

As abordagens de tratamento incluem a aplicação de ARN específico de rinovírus, tal como descrito na DE 19825395, que liga a região do canhão da cápside, que é necessário para a ligação do receptor hospedeiro (por exemplo, ICAM-1, molécula 1 de adesão intercelular) e infecção de células.

Outro método compreende a administração de proteínas ICAM-1 solúveis ou derivados de ICAM-1 tal como descrito na US 6326004 e US 6096862 (tlCAM-1, ICAM-1 truncada) para neutralizar as partículas virais (viriões). 3 ΡΕ210111792

Compostos químicos com actividade antiviral contra rinovírus estão descritos na EP 0523803.

Os sintomas de rinovírus são causados por uma reacção excessivamente ou inespecífica do sistema imuno-lógico. Consequentemente as formas comuns de tratamento de uma infecção por rinovírus incluem a administração de analgésicos tais como aspirina ou acetaminofeno/para-cetamol, bem como versões localizadas visando a garganta (muitas vezes administradas na forma de pastilhas), descongestionantes nasais que reduzem a inflamação no nariz por constrição de vasos sanguíneos locais, supressores da tosse (que funcionam suprimindo o reflexo da tosse do cérebro ou diluindo o muco nos pulmões) e anti-histamínicos de primeira geração tais como bromofeniramina, clorfe-niramina e clemastina (que reduzem a secreção das glândulas de muco e assim combatem narizes entupidos/rinorreias mas também podem tornar o utilizador sonolento).

Os polissacáridos sulfatados incluindo as carrageninas são conhecidos na arte pela sua eficácia antiviral. Num artigo de revisão muito interessante, Μ. E. Gonzalez et al. (1987, Antimicrob. Agents Chemother., 31, 1388-1393) descrevem uma eficácia antiviral de diferentes polissacáridos sulfatados incluindo iota-carragenina contra diversos vírus de animais. A iota-carragenina apresentou actividade antiviral contra os vírus encapsulados HSV-1, HSV-2, vírus Semliki Forest (SFV), o vírus vaccinia e vírus 4 ΡΕ210111792 da peste suína africana (ASF) e contra o vírus da encefalomiocardite nú (CEM). A iota-carragenina não teve efeito sobre os vírus encapsulados vírus da estomatite vesicular (VSV) e vírus do sarampo e nos vírus nús vírus da pólio tipo 1 e adenovírus tipo 5. 0 documento US 2003/181415 A descreve actividade antiviral de polissacáridos sulfatados, tais como o sulfato de celulose, contra vários vírus encapsulados e em particular o vírus herpes simplex (HSV), o vírus do papiloma e o HIV. O documento WO 2005/004882 A descreve o tratamento terapêutico de infecções virais, excluindo a infecção por rinovírus, com polissacáridos sulfatados tais como carrageninas. O documento US 2005/171053 AI descreve a utilização de lambda-carragenina para inibição da disseminação de uma infecção sexualmente transmissível, incluindo a infecção pelo HIV-1.

Yamada et al. (1997, Carbohydrate Polymers, Appl. Scien. Publishers 32, 51-55) descrevem uma actividade anti-HIV-1 de lambda-, kapa- e iota-carragenina e dos seus derivados sulfatados. S. F. Tischer et ai. (2006, Carbohydrate Polymers, Appl. Scien. Publishers 63, 459-465) descrevem 5 ΡΕ210111792 uma actividade de carragenina isolada de Meristiella gelidium contra herpes simplex e vírus do dengue.

Carlucci et al. (2004, Antiviral Research, Elsevier Science BV. 64, 137-141) descrevem um efeito protector da lambda-carragenina na infecção genital pelo vírus herpes simplex em murganhos.

Pujol et al. (2006, Planta Medica 72, 121 -125) descrevem uma actividade antiviral de uma carragenina isolada de Gigartina skottsbergii contra a infecção intraperitoneal pelo vírus herpes simplex murino. O termo "carragenina" é frequentemente utilizado como um termo colectivo para polissacáridos sulfatados linear à base de galactose baseado extraídos de algas (Rhodophyceae). É utilizada principalmente como espessante, agente gelificante, estabilizante ou emulsionante em produtos farmacêuticos e alimentares. Existem mais de 10 carrageninas diferentes dependendo do género das algas das quais são extraídas. Os três principais tipos são iota-, kapa- e lambda-carragenina, que diferem ligeiramente na sua estrutura e grau de sulfatação. A iota-carragenina é um galactano sulfatado formador de um gel mole predominantemente extraído das algas vermelhas Gigartina stellata e Chondrus crispus. A kapa-carragenina dá geles rígidos e fortes e é predominantemente produzida a partir de Kappaphycus cottonii. A lambda-carragenina, que é a forma mais comum, é frequentemente utilizada para espessar produtos lácteos. 6 ΡΕ210111792

Apesar da actividade antiviral há muito conhecida de algumas carrageninas contra virus tais como e.g. HIV ou HSV, o mecanismo de como as carrageninas apresentam actividade antiviral ainda requer clarificação. À luz do exposto, a presente invenção proporciona agora uma composição antiviral à base de carragenina adequada na profilaxia ou tratamento terapêutico de infecções por rinovirus (rinite).

Experiências que conduziram à presente invenção surpreendentemente demonstraram que, apesar de possíveis reservas na arte, carrageninas seleccionadas exercem actividade antiviral contra infecções por rinovirus (rinite), com a iota-carragenina a produzir os melhores resultados.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Portanto, a presente invenção refere-se à utilização de iota-carragenina como um ingrediente activo antiviral no fabrico de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento terapêutico de uma infecção por rinovirus. 0 termo "ingrediente activo antiviral" aqui utilizado refere-se a um composto de carragenina que quando aplicado numa dose ou quantidade eficaz interfere, directa 7 ΡΕ210111792 ou indirectamente, ou directa e indirectamente, com o ciclo de infecção por rinovírus de uma célula eucariótica, mais especificamente com pelo menos um parte do ciclo de infecção por rinovírus seleccionado do grupo que consiste em penetração do vírus de uma célula eucariótica, replicação do vírus numa célula eucariótica, empacotamento de virus, e libertação do virus da célula eucariótica infectada. Também abrange qualquer efeito na inibição não específica de um aumento do titulo do virus ou na redução não especifica do nível do título do vírus num sistema hospedeiro eucariota ou de mamíferos. 0 termo refere-se ainda a um composto que tem eficácia profiláctica na medida em que protege, pelo menos em certa medida, ou reduz a probabilidade de adoecer com uma infecção virai. A presente composição farmacêutica pode assim ser administrada antes ou depois do início de uma infecção virai. 0 termo "profilaxia" ou "tratamento profiláctico" tal como aqui utilizado refere-se à administração da presente composição farmacêutica de modo a proteger de, pelo menos em certa medida, ou reduzir o risco de adoecer com uma infecção virai. 0 termo "terapêutica" ou "tratamento terapêutico" tal como aqui utilizado refere-se à administração da presente composição farmacêutica a um indivíduo infectado com vírus para aliviar o impacto patológico da infecção, incluindo a redução da gravidade e/ou frequência de sintomas emergentes, ou eliminação desses sintomas, ΡΕ210111792 remediação de possíveis lesões causadas por ou associadas a essa infecção virai, e incluindo a inibição ou prevenção de infecção microbiana secundária virai, bacteriana, fúngica ou de qualquer outro tipo. 0 termo colectivo "carragenina" tal como utilizado daqui em diante refere-se a uma mistura de homo-ou hetero-polímeros de iota- e opcionalmente kapa- e lambda-carragenina, nomeadamente uma mistura de homo- ou hetero-polímeros de iota- e lambda-carragenina, uma mistura de homo- ou hetero-polímeros de iota- e kapa-carragenina, ou uma mistura de homo- ou hetero-polímeros de iota-, kapa-e lambda-carragenina, salvo indicação explícita em contrário ou salvo se um significado diferente for derivável do espirito da descrição pertinente.

Um homopolímero de iota-carragenina é um composto de carragenina molecularmente puro de iota-carragenina. Um heteropolimero de carragenina compreende subunidades de pelo menos dois tipos diferentes de carrageninas, de preferência seleccionados do grupo que consiste em subunidades de iota-, kapa- e lambda-carragenina.

Quando aqui é feita referência a seguir, o termo "mistura" de carrageninas também se pode referir a uma composição de matéria compreendendo como um ingrediente activo antiviral pelo menos um tipo de heteropolimero de carragenina, sendo assim a "mistura" principalmente uma mistura de diferentes subunidades de carragenina como parte 9 ΡΕ210111792 da referida pelo menos uma carragenina heteropolimérica presente na composição.

Noutra forma de realização a invenção refere-se a essa composição anti-rinovirica para utilização profiláctica ou terapêutica, em que a referida infecção por rinovirus é uma infecção por rinovirus aguda ou crónica. A presente composição à base de carragenina é adequado para aplicação tópica para tratar inflamação da pele ou de mucosas. Mas também é possivel a aplicação sistémica, e.g. parentérica ou oral, especialmente quando adaptada para conter principalmente fracções de carragenina de baixo peso molecular. A carragenina útil na presente invenção tem um peso molecular médio que varia desde cerca de 15000 a 5000000 Da. A fracção de baixo peso molecular compreende carragenina com um peso molecular médio que varia desde cerca de 15 000 a cerca de 50000 Da, a fracção de peso molecular médio desde cerca de 50000 a cerca de 500000 Da, e a fracção de alto peso molecular desde cerca de 500000 a cerca de 5000000 Da.

Numa forma de realização preferida a composição farmacêutica está adaptada para utilização tópica ou nas mucosas. Formas galénicas adequadas das preparações prontas a utilizar são cremes, geles, pomadas, pós (incluindo pós para inalação), formulações para pulverização, espumas, ou soluções liquidas tais como cremes para a pele, soluções para gargarejar ou gotas nasais. Outras formas de 10 ΡΕ210111792 preparação galénica adequadas serão evidentes para as pessoas com conhecimentos correntes da matéria, incluindo, por exemplo, os sistemas de administração nasal de fármacos descritos na US 6391452. antivirais a pelo menos um opcionalmente,

Além dos ingredientes activos presente composição tipicamente compreende veículo farmaceuticamente aceitável e, outros aditivos ou ingredientes.

Um veiculo adequado pode ser um diluente, e.g. água ou soro fisiológico, um excipiente, ou outro veículo adequado e útil para a administração dos ingredientes activos. Os aditivos opcionais podem ser seleccionados do grupo que consiste em S1O2, T1O2, um aglutinante tal como celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, goma tragacanta, gelatina, amido, lactose, mono-hidrato de lactose, ácido algínico ou milho; um lubrificante ou tensoactivo tal como estearato de magnésio ou lauril sulfato de sódio; um deslizante tal como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante tal como sacarose ou sacarina. Outros aditivos na preparação podem ser, mas não estão limitados a tampões ou agentes de ajustamento do pH, e.g. seleccionados de ácido cítrico, ácido acético, ácido fumárico, ácido clorídrico, ácido málico, ácido nitrico, ácido fosfórico, ácido propiónico, ácido sulfúrico, ácido tartárico ou as suas combinações.

Podem estar presentes outros ingredientes 11 ΡΕ210111792 incluindo fármacos não à base de carragenina ou substâncias farmacologicamente activas. A carragenina pode ser utilizada na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo pode utilizar-se sais de sódio de carragenina. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, sais de potássio, litio e amónio de carragenina.

Numa forma de realização preferida da invenção a composição é para utilização tópica e compreende iota-carragenina numa quantidade entre 0,01% e 20%, de preferência entre 0,1% e 10%, mais preferencialmente entre 0,5% e 5% em peso (p/p) da preparação.

Normalmente, a composição vai ser proporcionada como uma preparação estéril, não pirogénica. No caso de uma preparação liquida a esterilidade pode ser obtida, por exemplo, por filtração através de um filtro de membrana adequado. Os métodos para o fabrico de composições farmacêuticas estéreis ou assépticas são bem conhecidos na arte e não fazem parte da presente invenção.

No entanto, a composição farmacêutica da presente invenção também pode estar revestida em superfícies sólidas de artigos de higiene e artigos sanitários, por exemplo, artigos higiénicos faciais e artigos sanitários faciais que são tipicamente utilizados nas áreas oral e/ou nasal tais como tecidos ou papéis nasais, e lenços de assoar. Mais 12 ΡΕ210111792 especificamente , a composição farmacêutica pode ser aplicada, e.g. pulverizada, tal como um desinfectante, em luvas, tecidos ou papéis higiénicos incluindo lenços de papel, para exercer um efeito virucida pelo menos em certa medida, contribuindo assim para a redução da auto-infecção repetida de um individuo por pontas dos dedos contaminadas e também para reduzir a propagação virai entre indivíduos diferentes que estão em contacto próximo, e.g. de mão para mão, uns com os outros. Dependendo da natureza do artigo sanitário ou higiénico, o artigo pode estar coberto, molhado, ou impregnado com a composição farmacêutica.

Esses artigos tratados com carragenina também podem incluir mas não estão restritos a cotonetes, máscaras contra poeira ou máscaras faciais. Até os batons podem ser formulados para conter uma quantidade eficaz antiviral de iota-carragenina. Estes artigos higiénicos ou sanitários podem ser utilizados profilacticamente ou juntamente com o tratamento terapêutico contra uma infecção virai e podem auxiliar na prevenção ou redução de um risco de infecção.

Consequentemente, numa forma de realização a invenção refere-se a essa utilização, em que a composição antiviral é aplicada na superfície sólida de um artigo de higiene ou limpeza, especialmente de uma luva higiénica ou sanitária, tecido ou papel, especialmente um tecido ou papel para o nariz, por revestimento ou impregnação.

As iota-, kapa- e lambda-carrageninas úteis na 13 ΡΕ210111792 presente invenção estão disponíveis comercialmente, mas também podem ser preparadas por extracção de algas de acordo com procedimentos de extracção conhecidos na arte.

Na sua forma de realização preferida, a invenção refere-se a utilização dos homo- e hetero-polímeros de iota-carragenina, opcionalmente com kapa- e/ou lambda-carragenina.

Numa forma de realização específica a composição farmacêutica antiviral da presente invenção está substancialmente isenta de formas de carragenina diferentes de iota-, kapa- e lambda-carragenina, embora possam estar presentes quantidades vestigiais dessas outras carra-geninas. Para diversas aplicações, a iota-carragenina pode ser substancialmente o único tipo de carragenina presente na composição.

Noutra forma de realização a invenção refere-se à utilização de iota-carragenina no fabrico de uma composição antiviral, em que a composição compreende ainda kapa- ou lambda-carragenina, ou uma mistura das referidas carrageninas.

Noutra forma de realização a invenção refere-se a essa utilização, em que a composição compreende não menos de 50%, não menos de 70%, não menos de 80%, e de preferência não menos de 95% (p/p) em peso seco de iota-carragenina, em relação ao peso seco total de todas as 14 ΡΕ210111792 carrageninas presentes na composição. As percentagens são expressas em percentagem em peso (% p/p) em relação ao peso seco de todas as carrageninas presentes na composição.

Os valores da concentração de carragenina acima referidos analogamente aplicam-se às carrageninas homo- e hetero-poliméricas.

Verificou-se que a carragenina é não tóxica por administração oral ou dérmica, ou por inalação, mesmo quando aplicada em doses extremamente elevadas e portanto é classificada como "genericamente reconhecido como segura ("generally recognized as safe", GRAS) pela Food and Drug Administration (FDA).

Noutra forma de realização, a invenção refere-se à utilização de iota-carragenina no fabrico de uma composição antiviral, que compreende ainda pelo menos um composto adicional farmaceuticamente activo antiviral, de preferência sulfato de celulose.

Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se ao uso de iota-carragenina, no fabrico de uma composição farmacêutica para exercer uma função adjuvante anti-rinovirica. 0 referido pelo menos um outro composto farmaceuticamente activo ou fármaco pode ser seleccionado do grupo que consiste num esteróide, e.g. cortisona, e um anti-histamínico. 15 ΡΕ210111792

Noutra forma de realização a preparação farmacêutica antiviral é para o tratamento ou profilaxia num indivíduo que é particularmente susceptível a, ou está em risco acrescido de uma infecção por rinovírus tal como um doente de alto risco seleccionados do grupo que consiste num doente asmático, uma pessoa com alergias, e uma pessoa que tenha uma doença inflamatória.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig.l mostra os resultados de um ensaio de inibição da morte celular induzida por HRV (ensaio XTT).

Ordenadas = OD quantificada a 492 nm; abcissa = diferentes amostras de ensaio; 1 = células não infectadas; 2 = células infectadas, não tratadas; 3 = células infectadas tratadas com iota-carragenina; 4 = células infectadas tratadas com kapa-carragenina; 5 = células infectadas tratadas com lambda-carragenina; Fig.l A = células infectadas com HRV-2; Fig.l B = células infectadas com HRV-14. A Fig. 2 mostra a determinação dos títulos de pico de sobrenadantes de células HeLa infectadas por ensaios TCID50.

Ordenadas = título de TCID50; abcissa = concentração de iota-carragenina em yg/mL; U = células não tratadas; T (tratamento) = as células foram infectadas durante uma hora e a concentração indicada de iota- 16 ΡΕ210111792 carragenina foi adicionada uma hora após o tratamento; P (profilaxia) = a suspensão de virus foi pré-incubada com a concentração indicada de iota-carragenina durante uma hora antes da infecção. 0 processamento adicional foi idêntico a T: as células foram infectadas numa multiplicidade de infecção de 0,01. Os titulos máximos foram observados ao dia 3 para HRV-2 (Fig. 2A) e ao dia 4 para HRV-14 (Fig. 2B) . A Fig. 3 mostra a eficácia de iota-carragenina na inibição da replicação de rinovirus em células epiteliais nasais humanas infectadas determinada por ensaios de TCIDso.

Ordenadas = titulo de TCID50 em logs; abcissa = concentração de iota-carragenina em pg/mL; MOCK = células de controlo não tratadas; Fig. 3A = células infectadas com HRV-1A; Fig. 3B = células infectadas com HRV-2; Fig. 3C = células infectadas com HRV-8; Fig. 3D = células infectadas com HRV-16; Fig. 3E = células infectadas com HRV-39; Fig. 3F = células infectadas com HRV-83. A Fig. 4 mostra a eficácia de iota-carragenina contra rinovirus após tratamento repetido, determinada pelo ensaio de redução de CPE.

Ordenadas = redução de CPE em %; abcissa = concentração de iota-carragenina em pg/mL; Estirpe HRV2P0 = estirpe original de rinovirus (sem ciclo de replicação); 17 ΡΕ210111792

Estirpe HRV2P10 = estirpe de rinovirus HRV2P0 após 10 ciclos de replicação selectivos em células HeLa.

Para que a invenção aqui descrita possa ser mais bem entendida, apresenta-se os exemplos a seguir. Os exemplos são apenas para fins ilustrativos. Entender-se-á ainda que a presente invenção vai também incluir variações das formas de realização expressamente descritas na medida em que seria contemplado por uma pessoa com conhecimentos correntes da matéria.

Exemplo 1: Efeito de diferentes tipos de carra-geninas contra rinovirus humano de tipo 2 (HRV-2) e de tipo 14 (HRV-14) Células HeLa subconfluentes foram incubadas com uma suspensão de virus que foi pré-incubada durante 5 min com 125 yg/mL dos polímeros tal como indicado na Figura 1. 48 horas depois, a viabilidade das células foi determinada com o ensaio TOX2 XTT (Sigma).

Tal como ilustrado na Figura 1, verificou-se que o polímero mais eficaz foi a iota-carragenina (coluna 3) , que foi eficaz contra ambos os tipos de rinovirus, enquanto que a lambda-carragenina (coluna 5) e a kapa-carragenina (coluna 4) demonstraram eficácia contra HRV-2, mas não contra HRV-14. As barras de erro indicam o desvio padrão entre seis poços independentes. 18 ΡΕ210111792

Exemplo 2

Os polímeros indicados na Tabela 1 foram testados num ensaio de inibição da morte celular induzida por HRV-2 e HRV-14 (ensaio de XTT) com uma concentração de 100 yg/mL.

Tal como ilustrado na Tabela 1, a iota-carra-genina ofereceu protecção contra ambos os tipos de rinovírus (um " + " indica pelo menos 95% de protecção, em comparação com células de controlo não infectadas). A kapa-carragenina e a lambda-carragenina eram activas contra HRV-2, mas não contra HRV-14. Os polímeros de quitosano, carboximetilcelulose e carboximetilquitosano não apresentaram qualquer efeito inibidor.

Tabela 1: Actividade antiviral de vários polímeros testados

Polímero HRV-2 HRV-14 Iota-carragenina + + Kapa-carragenina + _ Lambda-carragenina + _ Quitosano — — Carboximetilcelulose _ _ Carboximetilquitosano - -

Exemplo 3 A iota-carragenina foi eficaz contra HRV-2 e HRV-14 num tratamento e profilaxia de um modelo de replicação 19 ΡΕ210111792 virai. Observou-se uma redução significativa do título virai de pico a concentrações iguais ou superiores a 6,25 yg/mL. No entanto, a iota-carragenina foi mais eficaz no modelo de profilaxia contra HRV-2 em que foi observada uma redução de mais de 99,9% do titulo virai de pico.

Exemplo 4: Efeito da iota-carragenina contra uma selecção de subtipos de rinovirus humano Células HeLa subconfluentes em placas com 96 poços foram incubadas com uma suspensão de virus numa MOI (multiplicidade de infecção) de 0,5. 20 min após a infecção com a suspensão do virus, adicionou-se meio nutriente contendo polímero em diluições de 3 vezes. 48-72 horas depois a viabilidade das células foi determinada com o ensaio TOX2 XTT (Sigma) . Os valores da EC5o foram calculados com o software Excel-Fit.

Tabela 2

Vírus HRV-1 HRV-2 HRV-8 HRV-14 HRV-16 HRV-39 EC50 0,7 yg/mL 21 yg/mL <0,5 yg/mL 400 yg/mL 381 yg/mL 117 yg/mL A iota-carragenina era activa contra todos os rinovirus humanos testados em células HeLa previamente infectadas. As concentrações de carragenina necessárias para inibir 50% do efeito citopático variam dentro de uma gama ampla de <0,5 yg/mL para HRV-8 e 400 yg/mL para HRV-14. Este resultado indica que a iota-carragenina inibe a 20 ΡΕ210111792 replicação de um largo espectro de subtipos rinovírus em células HeLa infectadas.

Exemplo 5: Inibição da replicação de rinovírus em células epiteliais nasais humanas por iota-carragenina Células epiteliais nasais humanas primárias (Promocell) foram semeadas em placas com 24 poços (2,9 * 104 células por poço) e cultivadas durante três dias a 37 °C, 5% de C02 e 95% de humidade. As células foram infectadas a uma confluência de quase 60% com estirpes de rinovírus HRV-1A, HRV-2, HRV-8, HRV-14, HRV-16, HRV-39, HRV-83 e HRV-84. Os rinovírus HRV-1A, HRV-2, HRV-8, HRV-16, HRV-39 e HRV-83 efectuaram uma replicação lítica em células epiteliais nasais humanas. HRV-14 e HRV-84 não lisaram as células e portanto não foram objecto de ensaios adicionais. Os vírus foram pré-incubados com iota-carragenina em concentrações de 4, 40 e 400 yg/mL e um controle MOCK. O MOI era de 0,34. Os sobrenadantes foram colhidos entre 48 e 72 horas após a infecção e utilizados na determinação do título TCID50.

Tal como ilustrado na Figura 3, o tratamento com iota-carragenina reduziu o título virai de todos os vírus nos sobrenadantes pelo menos dois passos log a uma concentração de 40 pg/mL (> 99%) em comparação com células de controlo tratadas com MOCK (o eixo de Y mostra o título do vírus em logs). Estes dados demonstram claramente que a iota-carragenina inibe a replicação do vírus em células 21 ΡΕ210111792 epiteliais humanas primárias. Uma vez que parece que presentemente não existe um modelo animal disponível para ensaios in vivo do rinovirus humano, as células epiteliais nasais humanas aqui utilizadas representam o modelo in vitro actualmente disponível mais importante. As barras de erro indicam o desvio padrão entre três amostras testadas independentes.

Exemplo 6: Determinação da eficácia da iota-carragenina contra infecção por rinovirus após tratamento repetido (verificação do possivel desenvolvimento de resistência virai). 0 vírus HRV2P0 original e o HRV2P10 virus, obtido após 10 ciclos de replicação selectiva em células HeLa, foram testados num ensaio de redução de CPE (efeito citopático) . As células HeLa (8 * 104 células por poço) foram semeadas em placas com seis poços. As células foram infectadas com um meio nutriente adequado suplementado com polímero de carragenina em concentrações finais de carragenina de 1,6, 5,3, 17, 50, 150 e 450 yg/mL, e contendo ainda vírus a um MOI de 0,1. Como controlos, um poço foi infectado com MOCK com meio nutriente suplementado com carragenina e isento de virus, e outro poço foi infectado com uma suspensão de vírus tratada com MOCK, i.e. uma suspensão de vírus contendo meio nutriente mas sem carragenina. Depois de um periodo de incubação de 20 minutos após a infecção, as placas foram lavadas duas vezes e adicionou-se meio de controlo (isento de virus, suple- 22 ΡΕ210111792 mentado com carragenina nas concentrações seleccionadas) a todos os poços, excepto ao controlo negativo com tratamento simulado (i.e., infecção pura, não inibida). Foram colhidas amostras de cada poço experimental logo que foi visível um claro efeito citopático no poço de controlo negativo, não protegido. Para o ciclo de selecção subsequente, utilizou-se sobrenadante contendo vírus amostrado dos poços tratados com carragenina que apresentavam uma CPE claramente detectável em relação ao controlo não infectado para a infecção de células HeLa. Tipicamente, as respostas de CPE eram detectáveis nas amostras experimentais apenas nas duas concentrações de carragenina mais baixas, i.e., a 1,6 e 5,3 yg de carragenina por 1 mL. 0 procedimento foi repetido 10 vezes, e as amostras de vírus resultantes foram comparadas num ensaio de inibição de CPE com o stock de vírus original. Resumidamente, 48 horas após a infecção adicionou-se um reagente T0X2 (Sigma) , determinou-se os valores da OD450nm e determinou-se a redução de CPE em % do controlo não infectado.

Para verificar o possível desenvolvimento de resistência do vírus ao tratamento com carragenina, o vírus utilizado para a primeira inoculação (vírus 2_001 na Fig. 4) e um vírus obtido após 10 ciclos de replicação selectiva (20_001 vírus na Fig. 4) foram testados num ensaio de redução de CPE utilizando células HeLa, seguindo um protocolo experimental que era ligeiramente diferente do 23 ΡΕ210111792 descrito acima. Resumidamente, as células HeLa foram infectadas com o respectivo virus a um MOI de 0,1, e 20 minutos após a infecção o inoculo foi removido e adicionou-se meio nutriente contendo polímero de carragenina em concentrações finais de 1,6, 5,3, 17, 50, 150 e 450 yg/mL, (ver abcissas da Fig. 4). 48 horas após a infecção adicionou-se um reagente T0X2 (Sigma), determinou-se os valores de OD450nm e determinou-se a redução de CPE em % do controlo não infectado (Fig. 4, ordenadas). As barras de erro indicam o desvio padrão entre 6 poços independentes.

Tal como representado graficamente na Figura 4, não foi detectada diferença significativa na suscepti-bilidade do vírus ao tratamento com carragenina nas amostras obtidas do sobrenadante do primeiro e do décimo ciclo de infecção. Isto indica que não surgiram mutantes de escape durante o processo de selecção. Estes dados sugerem por isso que pode ser improvável um escape de rinovírus durante a terapêutica in vivo com iota-carragenina mesmo em casos de terapêutica continuada ou repetida durante um período de tempo prolongado.

Lisboa, 18 de Junho de 2010

Claims (15)

1. ΡΕ210111792 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de carragenina numa quantidade antiviral eficaz como um ingrediente activo antiviral no fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento profiláctico ou terapêutico de uma infecção por rinovirus.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida infecção por rinovirus é uma infecção por rinovirus aguda ou crónica.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição está adaptada para utilização tópica ou nas mucosas, de preferência para utilização como um produto para pulverização nasal, um pó, incluindo um pó para inalação, um gel, uma pomada, uma espuma, ou uma solução liquida particularmente uma loção, uma solução para gargarejar ou gotas.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a composição compreende ainda pelo menos um veiculo ou aditivo farmaceuticamente aceitável.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a composição está adaptada para utilização tópica e compreende iota-carragenina numa quantidade entre 0,01% e 20%, de preferência entre 0,1% e 2 ΡΕ210111792 10%, mais preferencialmente entre 0,5% e 5% (p/v) da preparação.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a composição compreende ainda pelo menos uma outra carragenina, seleccionada de kapa-carra-genina e lambda-carragenina.
7. 7. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a composição compreende não menos de 50%, opcionalmente não menos de 80%, e de preferência não menos de 95% (p/p) , com base no peso de iota-carragenina, em relação ao total de carrageninas presentes na composição .
8. 8. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que a composição compreende ainda pelo menos um outro componente farmaceuticamente activo anti-viral.
9. 9. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que a composição está revestida numa superfície sólida de um artigo de higiene ou limpeza, particularmente de uma luva higiénica ou sanitária, tecido ou papel, especialmente um tecido ou papel para o nariz.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a composição compreende ainda pelo 3 ΡΕ210111792 menos um outro componente farmaceuticamente activo, de preferência um esteróide ou uma anti-histamina.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que a referida infecção por rinovirus é num indivíduo que é um doente de alto risco seleccionado do grupo que consiste num doente asmático, uma pessoa que sofre de alergia e uma pessoa que sofre de uma doença inflamatória.
12. 12. Artigo sólido de higiene ou sanitário revestido ou impregnado com a composição antiviral de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8.
13. 13. Artigo sólido de higiene ou sanitário de acordo com a reivindicação 12, sendo o artigo seleccionado do grupo que consiste em luvas, tecidos higiénicos, papéis higiénicos, artigos higiénicos faciais e artigos sanitários faciais, utilizados nas zonas oral e/ou nasal, particularmente tecidos ou papéis nasais, e lenços de assoar.
14. 14. Iota-carragenina para utilização numa quantidade antiviral eficaz como um ingrediente activo antiviral numa composição farmacêutica para o tratamento profiláctico ou terapêutico de uma infecção por rinovirus. 4 ΡΕ210111792
15. 15. Iota-carragenina para utilização de acordo com a reivindicação 14, em que a composição está adaptada para utilização tópica e compreende iota-carragenina numa quantidade entre 0,01% e 20%, de preferência entre 0,1% e 10%, mais preferencialmente entre 0,5% e 5% (p/v) da preparação. Lisboa, 18 de Junho de 2010 ΡΕ210111792 1 ϋ i:

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    1 ΡΕ210111792 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * DE 1SS253S5 * US 6328804 B * US 88SS882 A - EP 0S23SS3A SJS 3033164415A WO2GD50S4.SS2A US 2065174853 .41 US 63S1452 B Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Gomafei SLE. et Jta&ntaafe. Aoefsis ChsmsM-sr., 4967, w*. SI, 1368-1393 * Yamada «lai. Cartetíy^sfe Psiysieís. Ap^. Sssen. POfcters, 1937, vcS. 32, 51-55 * S^Tíscíseretai. CafeQàydnsÉB Pa^srisjs. AppLSs- PutJÈsteS, 2006. vet 63,459-465 * Carlaccí et st' ÁoMrsê Reseafd^, Bsew«r Sdeoce SV, 2804, vai 64,137-141: * Po>oi et si. Ptmta Medica. 2608, vot. 72. 121-125