PT2101877E - Neutralização de atividade de blocos de invasão cd95 de células de glioblastoma in vivo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NEUTRALIZAÇÃO DE ATIVIDADE DE BLOCOS DE INVASÃO CD95 DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA IN VIVO"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com um medicamento para tratar um individuo com glioblastoma multiforme de alto grau através da prevenção ou perturbação da ligação do CD95 ao seu ligando, CD95L, in vivo.

ANTECEDENTES A invasão do tecido circundante do cérebro por células tumorais isoladas representa um dos principais obstáculos a uma terapia eficaz de glioblastoma multiforme (GBM). Os gliomas compreendem a maioria dos tumores com origem no sistema nervoso central (SNC). Em adultos, os tumores mais comuns são neoplasias de alto grau derivadas de astrocitos ou oligodendrocitos. A Organização Mundial de Saúde classifica estes tumores malignos de acordo com o seu grau de anaplasia em grau II (astrocitoma difuso) , grau III (astrocitoma anaplásico) e grau IV (GBM)1.

Os gliomas contribuem para mais de 50% de todos os tumores cerebrais e são, até ao momento, os tumores cerebrais primários mais comuns em adultos. Apesar do desenvolvimento de novas tecnologias de diagnóstico, a taxa de sobrevivência é extremamente baixa. Somente 3% permanecem vivos cinco anos após o diagnóstico. A evolução clinica dos gliomas malignos depende da invasão das células tumorais isoladas em tecido normal do cérebro. As células migratórias podem escapar à ablação cirúrgica do tumor e 2 são depois os principais alvos de radioterapia e quimioterapia adjuvante pós-cirúrgica. Os agentes quimioterapêuticos e a irradiação agem principalmente através da indução de apoptose. Esta indução da apoptose envolve frequentemente a ativação do sistema recetor/ligando de morte CD95 (Apo-l/Fas). No entanto, a maioria das células malignas de glioma são resistentes a apoptose induzida por CD95. Aqui nós mostramos que a ativação de CD95 aumenta a migração/invasão em culturas de glioma humano, primário e a longo prazo, resistente a apoptose. Quer dizer, a ativação de CD95 pode implicar iniciar a atividade de CD95 pelo uso de um anticorpo agonista de CD95 ou CD95L recombinante. A tendência dos tumores de glioma primários migrarem durante a apoptose aumenta com o grau de malignidade. 0 CD95 medeia a migração via do passo PI3K/ILK/GSK3-beta;/MMP de um modo independente de caspase. Para além disso tentámos descobrir a molécula ligante a jusante de CD95. Um candidato possível foi Fosfoproteína enriquecida em Diabetes/Fosfoproteína enriquecida em Astrocitos-15-kDalton" (PED/PEA-15). Experiências de quebra excluíram PED/PEA-15 como molécula ligante num passo de sinalização de migração mediada através do Sistema CD95/CD95L. 0 mais importantemente a radiação-gama também aumentou a migração de células resistentes a morte induzida por CD95. A migração mediada por irradiação pode ser bloqueada pela neutralização de CD95L. Portanto, uma reação de tumor à estimulação de CD95 deve determinar as opções terapêuticas seguintes. Ver Kleber, S., "Gamma irradiation leads to CD95 dependent invasion in apoptosis resistant glioblastoma cells," Ph.D. Thesis, Deutsches Krebsforschungszentrum, University of Heidelberg, janeiro 3, 2006 (urn:nbn:de:bsz:16-opus-59926, disponível em www.ub.uni- 3 heidelberg.de/archiv/5992/), que é aqui incorporada como referência na integra.

Os principais tipos de gliomas são ependimomas, astrocitomas, e oligodendrogliomas, embora também existam formas celulares mistas de condições de células de glioma, tais como oligoastrocitomas.

Para além disso a uma caracterização celular, os tumores de glioma são também caracterizados de acordo com a patologia e a gravidade da invasão celular, o que é tipicamente reconhecido pelos peritos na matéria como um sistema de classificação por "gradação". 0 sistema de classificação mais comummente usado é o sistema de classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) para astrocitomas. o sistema da OMS atribui aos astrocitomas um grau desde I até IV, em que I é o menos agressivo e IV é o mais agressivo. Portanto, o astrocitoma pilocitico é um exemplo de um glioma de Grau I da OMS; o astrocitoma difuso é um exemplo de Grau II da OMS; o astrocitoma anaplásico (maligno) é um exemplo de Grau III da OMS; e o glioblastoma multiforme é um exemplo de Grau IV da OMS. 0 último é o glioma mais comum em adultos e, infelizmente, tem o pior prognóstico para os doentes atingidos.

Genericamente, os gliomas de "baixo grau" são tipicamente bem-diferenciados, de crescimento mais lento, biologicamente menos agressivos, e pressagiam um melhor prognóstico para o doente; enquanto que os gliomas de "alto grau", são indiferenciados ou anaplásicos, de crescimento rápido e podendo invadir os tecidos adjacentes, carregam um pior prognóstico. Gliomas de alto grau são tumores altamente vasculares e têm uma tendência para infiltrar 4 tecidos, criar necrose e hipóxia, e destroem a barreira sangue-cérebro onde o tumor está localizado.

Existem também gliomas infratentoriais, que ocorrem principalmente em crianças e em adultos supratentoriais. Os gliomas infratentoriais estão localizados em todas as áreas cerebrais interiores abaixo da superfície inferior dos lóbulos temporal e occipital, estendendo-se para a coluna cervical superior, e inclui o cerebelo. A região supratentorial está localizada acima do tentório do cerebelo e contém o cérebro anterior. 0 grau do tumor é um importante fator de prognóstico: sobrevivência média para os astrocitomas de grau III é 3 a 4 anos e para os astrocitomas de grau IV de 10 a 12 meses. O glioma mais frequente (65%) é o GBM1. A resistência celular a múltiplos estímulos pró-apoptóticos e à invasão de células tumorais migratórias no tecido normal circundante do cérebro são os principais obstáculos a uma terapia eficaz. 0 tratamento atual de gliomas malignos (grau III e IV) envolve cirurgia, seguida por radiação e quimioterapia. Os agentes quimioterapêuticos e a irradiaçao-γ atuam primariamente induzindo a apoptose. A indução da apoptose envolve frequentemente a ativação do sistema de morte do ligando CD95/CD95 (CD95L; ApolL/FasL)2,3. A ligação de CD95L trimerizado pelo receptor CD95 conduz ao recrutamento do adaptador FADD de proteína (domínio de morte associada a Fas, M0RT1)4 e caspase 8 e 10 num complexo de sinalização indutor de morte (DISC)5. O FADD contém um domínio de morte (DD) e um dominio efetor de morte (DED). Através do seu DD, FADD liga-se ao DD de CD956 . O DED recruta a procaspase-8 contendo DED para o DISC7. A procaspase-8 no DISC é ativada 5 através da auto-clivagem e compromete a célula a apoptose por ativação de caspases efetoras a jusante8. 0 sistema CD95/CD95L é usado por células de glioma maligno para aumentar sua capacidade de invasão. 0 CD95 induz a invasão celular através da via de PI3K/ILK/GSK3P e posterior expressão de metaloproteinases. 0 aumento da expressão CD95L é exibido por células de glioma irradiadas que escapam a ablação cirúrgica. A atividade de CD95 induzida por irradiação aumentou a migração de células de glioma. Num modelo singénico de murino de GBM intracraniano, a expressão de CD95/CD95L foi surpreendentemente regulada mediante interação com o estroma circundante do cérebro. 0 grau de expressão de CD95 e CD95L correlaciona-se positivamente com o grau do tumor. Aqui nós mostramos que o acionamento de CD95 causou a apoptose de tumores menos malignos (1-11 OMS), enquanto que os tumores de grau IV foram resistentes à apoptose induzida pelo CD95. Nestas células altamente malignas, o CD95 medeia a migração / invasão. A ligação de CD95 pelo CD95L activa PI3K e ILK, conduzindo assim a inibição da GSK3P e para a indução de metaloproteinases. A irradiação de células resistentes à apoptose aumentou a expressão de CD95 e CD95L, que por sua vez aumentou a expressão de metaloproteinases e, subsequentemente, a migração / invasão. Num modelo de rato singénico de gliomas intracranianos, CD95 e a expressão de CD95L foi regulada positivamente após interacção com o estroma circundante. A neutralização da actividade de CD95 reduziu drasticamente o número de células que invadem o hemisfério contralateral. 6 A WO 2004/085478 A relaciona-se com o aumento de proteínas de fusão Fc.

Barnhart, B.C. et al., EMBO Journal 2004, 23, 3175 relaciona-se com o ligando CD95 o qual induz a motilidade e a capacidade de invasão das célula tumorais resistentes a apoptose. A WO 99/55134 relaciona-se com composições e métodos para identificar inibidores e ativadores do passo de sinalização de apoptose. A US 6,060,238 relaciona-se com métodos e composições para regulação da apoptose.

Haupschein, R.S. et al., Câncer Res. 65, 1887 relaciona-se com um filme proteómico funcional o qual identifica um papel modulador para CD44 na apoptose mediada por recetor de morte.

RESUMO A presente invenção é definida pelo estabelecido no conjunto de reivindicações juntas.

Numa forma de realização, agente que neutraliza a actividade de CD95 é um composto que impede a ligação de CD95 ao CD95L ou interrompa um complexo de CD95/CD95L.

Numa forma de realização o composto liga-se a CD95 ou liga-se a CD95L ou liga-se ao complexo CD95/CD95L.

Em outra forma de realização, o composto é um anticorpo que se liga a CD95. Numa outra forma de realização, o composto 7 é um anticorpo que se liga a CD95L. Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser monoclonais, policlonais ou quiméricos. No entanto, também os anticorpos de cadeia simples ou fragmentos de anticorpo funcionais podem ser usados. Numa forma de realização, o anticorpo que se liga a CD95 é Nokl.

Assim, a presente invenção contempla qualquer agente de neutralização ou "inibidor" de CD95 ou CD95L ou actividade CD95R (receptor CD95).

Para a produção de anticorpos de acordo com a invenção, vários hospedeiros incluindo cabras, coelhos, ratos, ratinhos, seres humanos, e outros, podem ser imunizados por injeção com a proteína ou qualquer seu fragmento ou oligopéptido que tem propriedades imunogénicas. Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica. É preferido que os péptidos, fragmentos ou oligopéptidos usados para induzir anticorpos para a proteína têm uma sequência de aminoácidos consistindo de pelo menos cinco aminoácidos, e mais preferencialmente pelo menos 10 aminoácidos. Os anticorpos monoclonais para as proteínas podem ser preparados utilizando qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas de células contínuas em cultura. Estes incluem, mas não estão limitadas a, a técnica de hibridoma, a técnica de hibridoma de células B humanas. Além disso, as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", emenda de genes de anticorpo de ratinho para genes de anticorpos humanos para obter uma molécula com especificidade antigénica e actividade biológica apropriadas podem ser usadas. Os anticorpos podem ser utilizados com ou sem modificação, e podem ser marcados 8 unindo-os, covalentemente ou não covalentemente, com, por exemplo, uma molécula repórter. Vários imunoensaios podem ser utilizados para o rastreio para identificar anticorpos possuindo a especificidade desejada. Numerosos protocolos para ensaios de ligação competitivos e imunoradométricos utilizando quer anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidades estabelecidas são bem conhecidos na técnica. Tais imunoensaios envolvem tipicamente a medição da formação de complexos entre a proteina, i.e. CD95 e o seu anticorpo especifico. Um imunoensaio de base monoclonal, de dois sitios, utilizando anticorpos monoclonais reactivos para dois epitopos de proteínas de não interferência são preferidos, mas pode também ser empregue um ensaio de ligação competitiva.

Um inibidor pode ser um inibidor de ligando de CD95 (ligando Fas; ligando AP01). Por exemplo, os inibidores de CD95-ligando podem ser selecionados a partir de (a) um anticorpo ligando anti-CD95 inibitório ou um seu fragmento; (b) uma molécula receptora de CD95 solúvel ou uma porção de ligação ao ligando CD95 destes; e (c) um inibidor ligando Fas selecionado a partir de FLINT, DcR3 ou seus fragmentos.

Também contemplados são anticorpos anti-CD95L inibitórios e fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos e as moléculas CD95R solúveis ou porções de ligação a CD95L das mesmas. Exemplos de anticorpos anti-CD95L inibidores adequados são descritos em EP-A-0 842 948, WO 96/29350, e WO 95/13293, bem como anticorpos quiméricos ou humanizados obtidos a partir destes, cf. por exemplo WO 98/10070. Ainda preferidas são moléculas receptoras de CD95 solúveis, por exemplo, uma molécula receptora de CD95 solúvel sem domínio de transmembrana, tal como descrito na EP-A-0 595 659 e EP- 9

Α-0 965 637 ou péptidos CD95R, tal como descrito na WO 99/65935.

Numa forma de realização, um inibidor de CD95L, que compreende um domínio extracelular da molécula de CD95R, tal como os aminoácidos 1-172 (MLG...SRS) da sequência de CD95 madura de acordo com a Patente U.S. No. 5, 891,434, o qual pode ser fundido a um domínio de polipéptido heterólogo, em particular de uma molécula de imunoglobulina Fc incluindo a região de dobradiça, por exemplo a partir da molécula de IgGl humana. Uma proteína de fusão compreende um domínio extracelular de CD95 e um domínio Fc humano está descrito em WO 95/27735.

Portanto, de acordo com uma forma de realização preferida, 0 agente que se liga ao CD95L é uma proteína de fusão compreendendo um domínio extracelular de CD95 e um domínio de Fc humana. De acordo com uma forma de realização especialmente preferida, o agente que se liga ao CD95L é APG101 (CD95-FC, SEQ ID NO: 1). APG101 compreende os domínios CD95R-ECD (aminoácidos 17-172; domínio extracelular de ECD) e IgGl-Fc (aminoácidos 173-400). O APG101 e seus derivados são divulgados em W095/27735 e W02004/085478 . O inibidor de ligando Fas FLINT ou DcR3 ou um fragmento, por exemplo, um seu fragmento solúvel, por exemplo, o domínio extracelular, opcionalmente, fundidos com um polipéptido heterólogo, em particular de uma molécula de imunoglobulina Fc é descrito em WO 99/14330 ou WO 99/50413. FLINT e DcR3 são proteínas que são capazes de se ligar ao ligando de CD95. 10

Numa forma de realização adicional da presente invenção, o inibidor é um inibidor de CD95R o qual pode ser selecionado de (a) um inibidor do anticorpo receptor de anti-CD95 ou um seu fragmento, e (b) um fragmento de ligando CD95 inibidor. Um fragmento de um anticorpo receptor anti-CD95 inibidor de acordo com a invenção apresenta em preferência o mesmo local de ligação ao epitopo que o que faz o anticorpo correspondente. Numa outra forma de realização da invenção um fragmento de um fragmento de um anticorpo receptor anti-CD95 inibidor tem substancialmente a mesma actividade de inibição de CD95R que o anticorpo correspondente. Um fragmento de ligando CD95 inibidor apresenta de preferência substancialmente a mesma actividade de inibição que a que apresenta o fragmento de ligando correspondente inibidor de CD95.

Exemplos de anticorpos anti-CD95R inibidores e fragmentos de CD95L inibidores adequados são descritos na EP-AO 842 948 e EP-A-0 862 919.

Também divulgado é que o inibidor pode ser uma molécula efetora de ácido nucleico. A molécula efetora de ácido nucleico pode ser ADN, ARN, PNA ou um híbrido ADN-ARN. Podem ser vectores de expressão de cadeia simples ou de cadeia dupla. Vetores de expressão derivados de retrovírus, adenovírus, herpes ou de vacinas de vírus ou de diversos plasmídeos bacterianos podem ser usados para a aplicação de sequências de nucleótidos aos órgãos alvo, tecidos ou população de células. Essas construções podem ser usadas para introduzir sequências sentido ou antisentido não traduzíveis numa célula. Mesmo na ausência de integração no ADN, esses vectores podem continuar a transcrever moléculas de ARN até serem desativadas por nucleases endógenas. A expressão transiente pode durar um mês ou mais, com um 11 vetor não-replicante e ainda mais se os elementos de replicação apropriadas fazerem parte do sistema de vetor. A molécula de ácido nucleico efetora pode ser especialmente selecionada a partir de moléculas antisentido, moléculas de ARNi e ribozimas, as quais são capazes de inibir a expressão do gene CD95R e/ou CD95L. Ver, por exemplo, a U.S. 20060234968. Também divulgado é que a outra forma de realização, o glioma de alto grau é um glioma de Grau III da OMS. De acordo com a invenção o glioma de grau elevado é um glioma de Grau IV da OMS.

De acordo com uma forma de realização especialmente preferida da invenção o agente de neutralização da atividade de CD95 previne uma interação entre CD95 e a proteina p85 de PI3K.

De acordo com a presente invenção da atividade de CD95 pode ser determinada pela pessoa perita na técnica por qualquer tipo de ensaio adequado, tal como descrito no Exemplo 25 ou Exemplo 26.

Também divulgado é uma composição farmacêutica, que compreende pelo menos um agente que neutraliza a atividade de CD95 a um indivíduo com gliomas de alto grau. Também divulgado é que o agente é Nokl ou CD95-FC (APG101) . CD95-FC liga a CD95L e desse modo previne a sua ligação a CD95.

Também divulgado é que a composição farmacêutica compreende pelo menos um agente que liga CD95 e pelo menos um outro agente que se liga a CD95L. A presente invenção fornece também um método para tratar um doente com glioma. Também divulgado é que o tratamento do doente é através da administração de uma das composições farmacêuticas aqui divulgadas. Numa forma de realização, o glioma é um glioma 12 classificado pela OMS como de Grau IV, ou um glioma de "alto grau".

Também divulgado é que a composição farmacêutica pode ainda compreender agentes activos para o tratamento de cancro e, em particular para o tratamento de gliomas de alto grau.

As composições farmacêuticas podem ser administradas isoladamente ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como o composto de estabilização, que pode ser administrado em qualquer transportador farmacêutico estéril biocompativel, incluindo soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um doente isoladamente ou em combinação com outros agentes, fármacos ou hormonas. As composições farmacêuticas usadas nesta invenção poderão ser administradas por qualquer dos vários meios incluindo via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, por via subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual ou rectal.

Além dos componentes activos, estas composições farmacêuticas podem conter transportadores adequados farmaceuticamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações, que podem ser usados farmaceuticamente. Mais pormenores sobre as técnicas de formulação e administração podem ser encontrados na última edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Composições farmacêuticas adequadas para uso como aqui divulgado incluem composições em que os componentes ativos estão contidos numa quantidade eficaz para se atingir o fim 13 proposto. A determinação de uma dose eficaz está dentro das capacidades dos especialistas na técnica. Para muitos compostos, a dose terapêutica eficaz pode ser estimada inicialmente quer em ensaios de cultura de células, por exemplo, linhas de células de pré-adipócitos ou em modelos animais, geralmente ratinhos, coelhos, cães ou porcos. 0 modelo animal também pode ser usado para determinar o intervalo de concentração e a via de administração apropriados. Essa informação pode então ser utilizada para determinar as doses úteis e vias de administração em humanos. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade de ingrediente activo, por exemplo, um ácido nucleico ou uma proteina como aqui divulgados ou um anticorpo, o qual é suficiente para o tratamento de uma condição especifica. A eficácia terapêutica e a toxicidade podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais de experiência, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A razão entre os efeitos tóxicos e terapêuticos das doses é o indice terapêutico, e pode ser expressa como a razão, LD50/ED50. As composições farmacêuticas que exibem índices terapêuticos grandes são preferidas. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e os estudos em animais são usados na formulação de uma gama de dosagem para uso humano. A dosagem contida em tais composições é, de preferência, dentro de uma gama de concentrações em circulação que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta gama dependendo da dosagem de aplicação, da sensibilidade do doente, e da via de administração. A dosagem exacta será determinada pelo médico, à luz de factores relacionados com o sujeito que necessita do tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar níveis suficientes do grupo activo ou para manter o efeito desejado. Fatores que podem 14 ser levados em conta incluem a gravidade do estado de doença, a saúde geral do individuo, idade, peso e sexo do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinação do medicamento(s), sensibilidade de reação e tolerância/resposta à terapia.

As composições farmacêuticas de ação prolongada podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana ou uma vez a cada duas semanas, dependendo da meia vida e da taxa de eliminação da formulação particular. As quantidades de dosagem normais podem variar desde 0,1 até 100,000 microgramas, até uma dose total de cerca de 1 g, dependendo da via de administração. A orientação quanto a dosagens particulares e métodos de administração é fornecida na literatura e geralmente disponível aos praticantes da técnica. Os peritos na técnica empregam formulações diferentes para nucleótidos e para proteínas ou para os seus inibidores. De modo semelhante, a administração de polinucleótidos ou polipéptidos será específica para particulares células, condições, localizações, etc. É também divulgado um método de classificação para rastreio de um agente, o qual modula/afeta, preferencialmente neutraliza a atividade de CD95, que compreende os passos de (a) incubação de uma mistura que compreende (i) CD95 ou um seu fragmento funcional (ii) um agente candidato sob condições em que CD95 ou um seu fragmento funcional, possui uma atividade de referência; (b) detetar a actividade de CD95 ou um seu fragmento funcional, para determinar a atividade na presença do agente; (c) determinar a diferença entre a actividade na presença do agente e a actividade de referência. 15

De acordo com um ensaio, um agente a ser testado para romper a interacção entre CD95 e PI3K, de preferência entre CD95 e a subunidade p85 de PI3K.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Sensibilidade à morte induzida por CD95 e expressão de CD95. (a) As linhas de células de glioblastoma A172, T98G e LN18 foram incubadas com as doses indicadas de LZ-CD95L (ng/mL), estaurosporina (1 μΜ) , ou deixadas sem tratamento (Co) . Após 24 h e 48 h a fragmentação do ADN foi analisada por FACS. (b) A análise de FACS de expressão de CD95 na superfície A172, T98G e LN18. (c) As culturas Esferóides foram incorporadas numa

matriz de colagénio e tratadas com LZ-CD95L (5ng/mL). A invasão de células individuais na matriz foi observada com um microscópio de lapso de tempo superior a 24 horas. A distância das células invasoras (n = 10 por esferóide; 3 esferóides por tratamento) à beira do esferóide foi desenhada na média dos gráficos ± D.P. * P<0,05 (d) Imagens de contraste de fase representativas de esferóides T98G e LN18 a 0 h e 24 h após tratamento. Os resultados são representativos de três experiências independentes

Figura 2: Células resistentes à morte induzida por CD95 regulada para cima MMP-2 e MMP-9 (a) As células T98G e LN18 foram tratadas com a-Apo-1 (1 ng/mL) durante os tempos indicados. A expressão de MMP-2 e MMP9 foi medida por PCR quantitativo de tempo real. Os 16 dados são os resultados de cinco experiências independentes, como média ± D.P., * P<0,05, ** P<0,01.

Figura 3: A migração induzida por CD95 é mediada através da activação de ILK / AKT e a inibição da GSK3 [beta]

(a) A GSK3P foi fosforilada e desse modo inibida nas células T98G e LN 18 por tratamento com α-Αρο-1 (1 μg/ mL). (b) As células T98G foram infetadas com um vetor de lentivirus vazio (Co) ou com um mutante GSK3P constitutivamente activo (GSK S9A). As células GSK S9A infectadas com T98G migraram significativamente menos que os seus vetores homólogos vazios mediante o tratamento com a-Apo-1 (2 μg/mL) ou LZ-CD95L (CD95L, 5ng/mL) às 36 h. Um anticorpo neutralizante para CD95L (Nokl lC^g) bloqueou a migração induzida por CD95L do vetor e as células infectadas GSK S9A, (c) as células T98G infectadas GSK S9A e os respectivos controlos foram estimuladas com as doses indicadas de LZ-CD95L (ng/mL) durante 48 h e a fragmentação de ADN foi analisada por FACS. (d) Curvas de crescimento de T98G Co e GSK S9A são mostrados, (e) 0 inibidor de ILK (KP-SD1, 10 μΜ) bloqueou α-Αρο-1-{2^q/mL) e a migração das células T98G induzidas por LZ-CD95L (5ng/mL) , (f) 0 inibidor PI3K (LY 290059, 25 μΜ) bloqueou a activação induzida por α-Αρο-l de AKT e a inibição de GSK3p em células T98G, (g) β-catenina ativa (verde) foi translocada para o núcleo após estimulação com α-Αρο-1 (1 μρ/ιηύ) , fosfo-GSK3P (vermelho) não se alterou após a estimulação de CD95. A DAPI (azul) foi usada para visualizar os núcleos em células T98G. (h) A clivagem de Caspase-8 em T98G, LN18 e

Jurkat 16 (J16) foi detetada após estimulação de CD95 por

Western Blotting, (i) O inibidor de ERK (PD 98059, 25 μΜ) 17 não interferiu com a migração induzida por CD95 Os resultados são expressos como média ± D.P., * P<0,05, P<0,01, e são representativos de duas experiências independentes P: fosforilação, T: total.

Figura 4: Expressão do sistema CD95/CD95L em glioblastomas primários A análise FACS da expressão da superfície de CD95 em astrocitoma, oligodendroglioma primários e linhas de células de glioblastoma com passagens baixas (<4). Para a fragmentação de ADN as células foram tratadas com as doses indicadas de LZ-CD95L (CD95L) durante 24 h e 48 h, e analisadas por FACS.

Figura 5: Função do sistema CD95/CD95L em glioblastomas primários resistentes à apoptose A análise de FACS de expressão de superfície de CD95 em NCH primário (89, 125 e 270), linhas de células de glioblastoma altamente repicadas 50) . Para a fragmentação de ADN as células foram tratadas com doses indicadas de LZ-CD95L (ng/mL) durante 24 h e 48 h, e analisadas por FACS. Os resultados são representados como média ± D.P. e são representativos de três experiências independentes, (b) As células NCH 89, 125 e 270 mostraram uma regulação positiva dos níveis de mARN MMP-2 e MMP9 40 h após de tratamento a-Apo-1 (1 μρ/ηΠΙ) , como detetado por PCR quantitativo em tempo real. Os resultados são representados como média ± D.P., * P<0,05, ** P<0,01, *** P <0,005 e são representativos de três experiências independentes. (c) O ensaio de migração para células NCH 89, 125 e 270 tratadas com a-Apo-1 (0,1 μρ/ΐΐΟΟ + Proteína) . Os resultados são expressos como 18 média ± D.P. * P<0,05, ** P<0,01 e são representativos de duas experiências independentes.

Figura 6: Migração induzida por irradiação-γ em células de glioblastoma T98G e primárias (a + b) T98G as células foram de γ-irradiadas nas doses indicadas e que os niveis de ARNm de CD95 e CD95L (a) e MMP-2 e -9 (b) foram determinados por PCR quantitativo em tempo real, após 40 h. Os resultados são representados como a média ± D.P., * P <0,05, ** P <0,01 e são representativos de três experiências independentes, (c + d) Indução de migração em T98G (c) e células NCH primárias (NCH 125, 270 e 89) (d) depois de irradiação-γ. Um anticorpo neutralizante para CD95L (Nokl, 10 μg) bloqueou a migração induzida por irradiação-γ. Os resultados são expressos como média ± D.P., * P< 0,05 e representativos de duas experiências independentes, (e) pontuação CD95L de 9 gliomas recorrentes diferentes após radioterapia. Três áreas por tumor foram analisadas e as células positivas para CD95L foram contadas e as pontuações atribuídas de acordo com o número de células positivas. Os tumores recorrentes analisados foram NCH 907, 202, 910, 860, 655, 408, 30, 388 e 715. (f) As colorações foram realizada em secções de tecido de tumor recorrentes consecutivas de CD95L, CD95 e MMP9, bem como a coloração dupla de GFAP (verde) e CD95L (vermelho).

Figura 7: CD95 e CD95L são reguladas para cima em células de glioma de murino in vivo e induzem a migração (a) Coloração imunohistoquímica para CD95L de GBM primário, (b-c) A expressão de superfície CD95 e CD95L na linha de 19 células de glioma de murino SMA-560 foi determinada em condições normais de cultura de células, após a formação de esferóides ou a seguir à implantação intracraniana. Variações de CD95 (b) e CD95L (c) (GeoMean de BD CellQuest Pro), sob as condições acima mencionadas foram normalizadas para níveis de expressão sob condições de cultura de células. Os resultados representam três experiências independentes e são expressos como média ± D.P., * P <0,05. (d) Culturas esferóides foram incorporadas numa matriz de colagénio e os anticorpos foram tratados com anticorpos para CD95 (Jo2), um anticorpo neutralizante para CD95L (MFL3) ou o anticorpo de controlo de isotipo adequado nas concentrações indicadas. A migração das células foi monitorizada durante 48 h e a distância das células à beira do esferóide é descrita (n = 10 células, 3 esferóides por tratamento). (e) Montagem experimental. A migração de explantes tumorais em colagénio após tratamento com isotipo MFL3 ou o controlo adequado é representado como descrito acima (n = 10, 3 esferóides por tratamento). (f) Os números de células SMA-560 no hemisfério contralateral de ratinhos Vm/Dk tratados quer com MFL3 ou o anticorpo de controlo de isotipo foram contados e normalizados para a superfície do tumor. Os resultados mostrados são representativos de duas experiências independentes e expressos como média ± D.P., P <0,05, ** P<0, 001.

Figura 8: Inibição da GSK3P é independente de caspase

(a) A GSK3P é fosforilada e desse modo inibida em T98G e células LN18 após tratamento com LZ-CD95L (5ng/mL). (b) A

pré-incubação com o inibidor de caspase zVAD-fmk (40 μΜ) não interfere com a inibição induzida por a-Apo-1 (2 μρ/ηϋΐ) de GSK3p. (c) A quebra de PED com siARN bloqueou a activação de ERK, mas não alterou a inibição de GSK3P 20 induzida por α-Αρο-l. Os resultados são representativos de duas experiências independentes.

Figura 9: Expressão e função do sistema de CD95/CD95L nos glioblastomas primários (a-b) análise de FACS de expressão de superfície de CD95 em linhas de células de glioblastoma primário (NCH 82, 37, 125, 149, 89, 156, 270 e 199), com passagens elevadas (> = 50). Para fragmentação as células de ADN foram tratadas com as doses indicadas de LZ-CD95L (ng/mL) durante 24 h e 48 h e analisadas por FACS. Os resultados são apresentados como média ± D.P. e são representativos de duas experiências independentes, (c) os níveis de ARNm de CD95 e CD95L em tecido de tumor humano, são determinados por PCR quantitativo em tempo real. Os resultados são representativos de duas experiências independentes.

Figura 10: Influência de irradiação na migração de glioblastoma primário

Análise FACS de expressão de superfície de CD95 em linhas de células de glioblastoma primário (NCH 342, 354, 357, 378, 417, 419 e 2421). A indução de migração dessas células primárias NCH mediante irradiação-γ, que poderia ser bloqueada por um anticorpo neutralizante para CD95L (Nokl, 10 μg) . Os resultados são expressos como média ± D.P., P <0,05, P < 0,01, *** P < 0,005 e representativos de duas experiências independentes.

Figura 11: CD95 aciona a invasão de células resistentes a apoptose via MMPs 21 (A) As linhas de células de glioblastoma T98G e LN18 foram incubadas com as concentrações indicados de CD95L-T4, Estaurosporina (St, 1 μΜ) ou deixadas sem tratamento (Co). Após 24h a fragmentação do ADN foi analisada por FACS (painel superior). Análise FACS de expressão de superfície de CD95 em T98G e LN18 (painel inferior) . (B) As células T98G e LN18 foram tratadas com CD95L-T4 ou deixadas sem tratamento, para detetar a migração de células individuais através de uma câmara de Boyden, com 8 μπι de tamanho de poro. (C) As células T98G foram tratadas com CD95L-T4 durante 24 h ou deixadas sem tratamento. Posteriormente, a actividade de MMP-9 foi avaliada pela técnica de Zimografia de Gel. (D e E) As células T98G e LN18 foram tratadas com aApo-1, durante 48 h, ou deixadas sem tratamento. A expressão da MMP-2 e MMP-9 foi medida por PCR quantitativo em tempo real. Os dados são resultados de cinco experiências independentes como média ± D.P., * P <0,05. (F) As células T98G foram transfetadas com uma pool de siARN contra a MMP-2 e MMP-9 (shM-MPs) ou com Lipofectamina (lipo)isoladamente. 48h após a transfeção, as células foram tratadas com CD95L-T4, 48h depois foi medida a migração num ensaio de migração de duas dimensões. (G) A expressão da MMP-2 e MMP-9, tal como medido por RT-PCR quantitativo. Os resultados são expressos como média ± D.P., * P<0,05; P<0,001; *** P<0,0001 e são representativos de pelo menos duas experiências independentes.

Figura 12: CD95 ativam a invasão das células de glioma primárias resistentes a apoptose via MMPs (A) Linhas de células NCH89, 125 e 270 cultivadas a curto prazo foram incubadas com as concentrações indicadas de CD95L-T4, Estaurosporina (St., 1 μΜ) ou deixada sem tratamento (Co). Após 24h a fragmentação do ADN foi 22 analisada por FACS (painéis superiores) . Análise FACS de expressão de CD95 na superfície NCH89, 125 e 270 (painéis inferiores). (B) As células NCH foram tratados durante 48 h com aApo-1 ou deixadas sem tratamento, para detetar a migração de células únicas através de uma câmara de Boyden, com 8 μπι de tamanho de poro. Os resultados são expressos como média ± D.P. ** P <0,01 e são representativos de três experiências independentes. ( (C e D) NCH89, 125 e 270 células foram tratadas com α Apo-1, durante 48 h. A expressão da MMP-2 (C) e MMP-9 (D) foi medido por PCR quantitativo em tempo real. (E) As células NCH125 foram transfetadas com uma pool de siARN contra a MMP-2 e MMP-9 (SHM-MPs) sozinhas ou com Lipofectamina (Lipo). 48h após a transfeção, as células foram tratadas com CD95L-T4, a migração foi mais tarde medida num ensaio de migração 48h bidimensionais. (F) Expressão da MMP-2 e MMP-9, tal como medido por RT-PCR quantitativo. Os resultados são expressos como média ± D.P., * P <0,05, ** P <0,001, *** P <0, 0001 e são representativos de pelo menos duas experiências independentes.

Figura 13: CD95 induz a migração através do PI3K/AKT/GSK3P (A) A fosforilação de AKT e ERK é mostrada nas células T98G e LN18 após tratamento com CD95L-T4 nos pontos de tempo indicados. (B) Em células T98G, LN18 e NCH 125 e 270, mas não em NCH89, a fosforilação da AKT exibiu uma forma de sino dependente da concentração, após a estimulação com CD95L-T4, respectivamente. (C) O tratamento das células T98G com CD95L-T4 (10 ng/mL) e αΑρο-1 (1 μg/mL) induziu a fosforilação de GSK3b. A cinética da inibição de GSK3b exibiu uma curva em forma de sino. (D) As células T98G foram infetadas com um vetor de lentivírus vazio (Co) ou um mutante constitutivamente ativo GSK3b (GSK S9A) . Nas 23 células T98G infectadas com GSK S9A 36h migrou significativamente menos do que os seus homólogos vetor vazio sobre o tratamento com aApo-1 ou CD95L. Um anticorpo neutralizante para CD95L (Nokl) bloqueou a migração induzida por CD95L de células infectadas por GSK S9A ou por vectores. (E) A catenina-b acumula no citosil das células T98G 30 minutos após tratamento com o CD95L-T4 (10 ng/mL). (F) Catenina-b ativa (verde) translocada para o núcleo após estimulação com aApo-1. DAPI (azul) e P-GSK3P (vermelho) foi usada para visualizar os núcleos e citosol, respectivamente em células T98G. (G e H) 24 horas após a transfeção transitória de T98G com o repórter Catenina-b/TCF transcricional (TOP-FLASH; G) , o plasmideo de controlo (FOP-FLASH; G), ou a construção NFkB-repórter (NFkB-Luc; H) As células foram tratadas com CD95L-T4 (G e H) , LiCl (G) ou deixada sem tratamento (G e H). A atividade de luciferase foi ensaiada 12h (G) ou 8 h (H) e em seguida normalizada para a expressão de luciferase renilla. Os resultados são expressos como média ± D.P. * P <0,05; P<0,001, *** P<0,0001 e são representativos de duas experiências independentes. P: fosforilada, T: total.

Figura 14: Src e p85 associadas a CD95 para activar AKT (A e B) Células LN18 e T98G foram estimuladas com CD95L-T4 nos pontos de tempo e concentrações indicados. Nos painéis esquerdos CD95 foi imunoprecipitado e os imunoprecipitados imunotransferidos com anticorpos anti-p85, anti-CD95 e anti-Src. Nos painéis do meio, p85 foi imunoprecipitado e os imunoprecipitados sondadas com anticorpos anti-p85 e anti-CD95. Grânulos de proteína A são incluídos como um controlo negativo. Os lisados celulares integrais (CMT) sondados com anti-p85, anti-CD95 e anti-Src estão mostrados nos painéis direitos. (C) As células T98G foram tratadas 24 durante os tempos e concentrações indicados com CD95L-T4. Os CD95 foram imunoprecipitados e os imunoprecipitados foram imunotransferidos com anticorpo anti-Yes. (D) células T98G e NCH 125 foram transfetadas com siARN contra Yes ou Fyn ou com Lipofectamina (Lipo) sozinha. 72h após a transfeção, as células foram tratadas com CD95L-T4, 24 horas depois a migração foi medida num ensaio de migração de duas dimensões. (E) Expressão de Yes-mARN como medido por RT-PCR quantitativo e niveis de proteína Yes como avaliado por análise de FACS é mostrada. (F) , células T98G e NCH125 foram transfetadas com siARN contra Yes, um plasmídeo de sobre expressão Yes (pCMV- Yes) ou ambos. 72h após a transfeção, as células foram tratadas com CD95L-T4, 24 horas depois da migração foi medida num ensaio de migração de duas dimensões. (G) siARN Yes e PI3K inibidor (LY 290059) bloquearam a fosforilação induzida por CD95 de AKT. P: fosforilada; T: total; *: banda especifica; n.s.:. banda não específica.

Figura 15: Formação DISC ineficiente em células de glioma resistentes à apoptose (A) 48h após a transfeção transiente de T98G e NCH 125 ou com um HA-PTEN (PTEN), ou o vector vazio (Mock), as células foram tratadas com CD95L-T4 (500 ng/mL). Para detetar a morte celular em células que sobre expressam PTEN, foi realizada uma coloração de FACS intracelular contra o marcador HA. Posteriormente foi realizada análise de dispersão para a parte da frente em células de HA positivas. Os resultados são expressos como média ± D.P. e são representativos de duas experiências independentes. (B) As células T98G foram tratadas durante 1 h com aApo-1, zVAD-fmk, uma combinação de zVAD-fmk e aApo-1 ou deixada sem tratamento (Co) . A fosforilação de GSK3P foi analisada 25 por Western Blot. (C) A clivagem do caspase-8 em T98G, LN18 e Jurkat 16 (J16) foi detetada por análise de Western Blot, a 5 min após a estimulação de CD95. (D) Em células T98G e LN18 tratadas com CD95LT4 durante 5 min, ou CD95 (painéis superiores) ou da caspase-8 (painéis inferiores) foram imunoprecipitados. Os imunoprecipitados foram imunotransferidos com anticorpo anti-FADD e anti-CD95 (painéis superiores) e com anti-CD95 e anti-caspase-8 (painéis inferiores). As células Jurkat foram incluídas como um controlo positivo. (E) As células T98G foram transfetadas ou com Yes shARN ou com um shARN não-alvo, como um controlo negativo. Após 72h, as células foram tratadas com CD95L-T4 ou deixadas por tratar e a imunoprecipitação de CD95 foi realizada, os imunoprecipitados foram então imunotransferidos com anticorpo anti-FADD, a cadeia pesada de IgG serve como controlo de carga. À direita é mostrada a eficiência de quebra avaliada pelo RTPCR quantitativo. (F) A expressão quantitativa de FADD, Yes e Fyn em células T98G e LN18 foi medido por análise de FACS. Os resultados são expressos como média ± D.P., * P <0,05 e são representativos de três experiências independentes. MIF: média de intensidade de fluorescência P: fosforilada; T: total.

Figura 16: Modelo esquemático para CD95 sinalização de invasão em glioblastoma CD95L induz o recrutamento do Yes membro da família Src e a subunidade p85 de PI3K (representado aqui pelas suas duas subunidades: p85 e pllO) para CD95, ativando desse modo AKT. Os fosforilados AKT ativados e GSK3b inativados, permitiram a translocação da catenina-b nos núcleos, onde induzem a transcrição das MMPs. Esta via de sinalização pode ser bloqueada por siARN contra Yes, ou MMP-2 e -9, o 26 inibidor específico de PI3K em (Ly290059) ou infeção por lentivírus com um mutante dominante activo de GSK3 β (S9A) .

Figura 17: Expressão de CD95L, Yes e fosfo-Src em amostras clinicas de GBM (A) Coloração imuno-histoquímica representativa do CD95L (vermelho) em GBM humano primário. Note-se a expressão aumentada de CD95L na interface tumor/hospedeiro (A.b), em comparação com as áreas tumorais mais sólidos (A.a*) ou parênquima cerebral (A.c). (B) Coloração imuno-histoquímica de quinases da família Src fosforilada (p-Src; B.a,c,e,f) e Yes (B.b,d,g,h). B.a-d. Resumo da zona de infiltração tumoral, notar robusta fosforilação de Src e expressão do Yes na zona de interacção tumor/hospedeiro (para a esquerda) e reduzida ou nenhuma p-Src em áreas de tumores sólidos (à direita*) . A expressão Yes foi encontrada na interface tumor/hospedeiro (B.b,d e g) e em áreas de tumores sólidos dispersos (B.h). Forte fosforilação da Src em células tumorais nas zonas de tumores sólidos (B.f) e na zona de infiltração (B.e).

Figura 18: CD95 e CD95L é regulada posltlvamente em células de glloma de murlno in vivo e induz a migração (A e B) A expressão de superfície CD95 e CD95L na linha de células de glioma de murino SMA-560 foi determinada sob condições normais de cultura de células, após a formação de esferóides ou a seguir à implantação intracraniana. As alterações foram normalizadas para os níveis e condições das culturas celulares. Os resultados representam três experiências independentes e são apresentados como média ± D.P., * P <0,05. (C) As culturas esfereróides foram incorporadas numa matriz de colagénio e tratadas com 27 anticorpos para CD95 (Jo2), um anticorpo neutralizante para CD95L (MFL3) ou o anticorpo de controlo de isotipo adequado nas concentrações indicadas. A migração das células foi monitorizada durante 48h e a distância de células para a borda do esferóide é descrita (n = 10 células, 3 esferóides por tratamento). (D) Esquema experimental. Migração de colagénio em explantes de tumores após tratamento ou com MFL3 ou o controlo de isotipo adequado é apresentado como descrito acima (n = 10, 3 esferóides por tratamento) . (E)

As imagens representativas de isotipo imunocorado com GFP ou tumores SMA tratados com MFL3. São mostrados o hemisfério carregando tumor e o contralateral (ipsilateral). Numerosas células SMA-560 (GFP-positivas) no hemisfério contralateral de ratinhos Vm/Dk ou tratados com MFL3 ou o anticorpo de controlo de isotipo foram contadas e normalizadas para a área do tumor. Os resultados apresentados são representativos de duas experiências independentes e expressos como média ± D.P., * P<0,05, P<0,001. Barra de escala: 100 μΜ

Figura 19: Produção de CD95L-T4

Localização dos aminoácidos N- e C-terminais dentro de TRAIL-RBD, formando um antiparalelo cordão-β. (A) O alargamento da estrutura TRAIL-RBD (terminal N: verde; terminal C: vermelho). (B) Posição do terminal C e N dentro da estrutura do TRAIL-RBD. Linha de cima: vista lateral do eixo central do TRAIL-RBD. Linha de baixo: vista de cima do eixo central da TRAIL-RBD. Da esquerda para a direita: mono-, di- e trimero. (C) Sequência de aminoácidos CD95L-T4. O péptido de sinal está sublinhado (Metl-Gly20) . O terminal N (seta verde) e os aminoácidos de terminal C (seta vermelha) do CD95L-RBD são propostos para formar um antiparalelo cordão-β. A sequência T4-Foldon é impressa em 28 azul (itálico). (D) Modelo de complexos TRAIL-T4-DR5. Linha Superior: vista lateral de TRAIL-DR5 co-complexo com o T4-Foldon (azul claro) posicionado acima do TRAIL-RBD (azul escuro). As cadeias DR5 são coloridas de vermelho escuro. Os aminoácidos terminais N da TRAIL-RBD e T4-Foldon são coloridos de verde, os aminoácidos do terminal C são coloridos de vermelho. Linha de cima: vista lateral do eixo central do TRAIL-RBD. Linha de baixo: vista de cima do eixo central da TRAIL-RBD. Esquerda: Modelo de fita. Direita: modelo de superfície. (E) , Purificação por afinidade de CD95L-T4. CD95L-T4 contendo o sobrenadante das células HEK293T transientemente transfetadas foi purificado por afinidade usando Sepharose de Etreptactina. As proteínas especificamente eluídas por destiobiotina foram posteriormente analisadas por SDS-PAGE e coloração com prata. A posição de CD95L-T4 é indicada por uma seta. CD95L-T4 mostra um peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa. A diferença para o peso molecular teórico de 23 kDa, é provavelmente devida à glicosilação. (C) Análise de CD95L-T4 purificado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) . Para a determinação do peso molecular aparente nativo o CD95L-T4 foi separado por SEC, utilizando uma coluna Superdex 200. O gráfico mostra o perfil de eluição (OD 280 nm) do CD95L-T4 por Estreptactina purificada. As Frações B3-C2 colhidas da SEC (ver B) foram analisadas por SDS-PAGE e coloração de prata. (G) Determinação do peso molecular aparente. Curva de calibração da coluna Superdex 200 com base nos volumes de retenção das proteínas indicadas. O peso molecular nativo aparente de CD95L-T4 é 90,3 kDa, indicando uma proteína trimérica estável. AP-G101 antagoniza a actividade indutora de apoptose de CD95L-T4 nas células Jurkat. (H)-T4 CD95L induz a apoptose em células Jurkat de uma forma dependente da dose, tal como mostrado por um aumento na actividade de 29

Caspase 3/7. A adição de 10 μg/mL de anti-StrepMAB, um anticorpo de reticulação os trimeros CD95L-T4, amplia a extensão da apoptose. (I) A actividade indutora de apoptose de 250 ng/mL de CD95L-T4 nas células Jurkat é antagonizada pelo APG101 de um modo dependente da dose.

Figura 20: Sistema de CD95/CD95L e sensibilidade à apoptose em glioblastomas primária (A e B) Análise de FACS da expressão de superfície de CD95 em linhas de células primárias de glioblastoma (NCH82, 37, 125, 149, 89, 156, 270 e 199), com passagens elevadas (>5 0) . Para as células de fragmentação de ADN foram tratadas com doses indicadas de CD95L (ng/mL) durante 24 h e 48 h e analisadas por FACS. Os resultados são apresentados como média ± D.P. e são representativos de duas experiências independentes. (C) os níveis de mARN de CD95 e CD95L em tecido de tumor humano, determinados por PCR quantitativo em tempo real. Os resultados são representativos de duas experiências independentes.

Figura 21: Moduladores de activação de PI3K mediada por CD95 (A) As células LN18 foram incubadas com as concentrações indicadas de CD95L-T4 com ou sem um anticorpo neutralizante para CD95L (Nokl), aAPO-1, Estaurosporina (St., 1 μΜ) , ou deixado sem tratamento (Co) . Após 24h e 48h a fragmentação de ADN foi analisada por FACS (B) T98G e as linhas de células em cultura de curto prazo, NCH89 e 125 foram incubadas com as concentrações indicadas de aApo-1, Estaurosporina (St., 1 μΜ) , ou deixado sem tratamento (Co) . Após 24h e 4 8h a fragmentação do ADN foi analisada por FACS. (C) As células NCH125 e NCH270 foram tratadas durante 30 48 h com CD95L-T4 ou deixadas sem tratamento, para detetar a migração de células únicas através de uma câmara de Boyden, com 8 μτη de tamanho de poro. (D) Fosforilação GSK em células T98G medida por coloração de FACS intracelular. (E) As células T98G infetadas por GSK S9A e os respectivos controlos foram estimuladas com as doses indicadas de CD95L (ng/mL) durante 48h e a fragmentação do ADN foi analisada por FACS. São mostradas as curvas de crescimento de T98G Co e GSK S9A. (F) As células T98G e NCH125 foram transfetadas com siARN contra Yes ou Fyn ou com Lipofectamina sozinha (lipo). É mostrada a expressão de Fyn medida por RT-PCR quantitativo. Os resultados são expressos como média ± D.P., * P <0,05; ** P <0,001; *** P <0, 0001.

Figura 22: A Tabela 1 DESCRIÇÃO PORMENORIZADA É geralmente apreciado que o complexo CD95/CD95L induz apoptose18. No entanto, há evidências crescentes de que CD95 pode mediar processos independentes de apoptose, tais como proliferação, angiogénese, fibrose e inflamação19,20. A sobre expressão de CD95 em células de carcinoma do pulmão de Lewis resultou numa vantagem de sobrevivência de células · · 2 tumorais m vivo . Ao longo das mesmas linhas, o desencadear de CD95 tem sido relatado que conduz a progressão do ciclo celular em células de glioma22. Em astrocitoma maligno, a ligação CD95 promoveu a expressão das quimiocinas pró-inflamatórias e a angiogénese23-25 . Relata-se aqui que a ativação de CD95 nos glioblastomas inicia uma cascata de eventos de sinalização que conduzem, finalmente, ao aumento da capacidade de invasão. A migração induzida por CD95 foi observada pela primeira vez células tubulares renais cultivadas26 e, recentemente, tem sido relatada em células tumorais do ovário, mama, pulmão e 31 rim13. Neste último estudo, um gradiente de soro foi adicionado ao estimulo CD95, a fim de instigar e dirigir a migração celular13. As células do glioblastoma, pelo contrário, caracterizam-se pelo seu fenótipo de propensão à invasão e migram na ausência de um estimulo adicional.

Aqui são divulgados métodos para bloquear in vitro, ex-vivo e in vivo o comportamento de glioblastoma altamente invasivo pela única neutralização da atividade de CD95. É também divulgada qualquer método ou mecanismo para neutralizar ou bloquear de outro modo a atividade de CD95, tal como pelo uso de um anticorpo que se liga a ele ou por regulação negativa ou inibindo a expressão do gene CD95 ou tradução de transcrito CD95 mARN.

Para invadir e propagar no cérebro normal circundante, as células tumorais precisam de digerir os componentes da matriz extracelular, incluindo fibronectina, laminina e colagénio do tipo IV. A família de enzimas melhor caracterizada que degradam ECM é a família MMP. Glioblastomas deficientes em MMP9 são menos invasivos in vitro e in vivo21. Glioblastomas produzem níveis significativamente mais elevados de MMP9 do que os gliomas de baixo grau e de tecido cerebral normal27. Os níveis de MMP9 aumentaram durante o crescimento das células de glioblastoma que tinham sido implantadas intracranianamente em ratinhos nus . Estas proteases tem também um papel no estabelecimento e manutenção de um microambiente que facilita a sobrevivência de células tumorais. Por consequência, MMPs regulam a angiogénese tumoral e inibição da MMP9 reduziu as estruturas tipo capilares em culturas mistas de células endoteliais e glioma27. As mesmas características aplicam a expressão de CD95L: (i) os níveis correlacionam positivamente com o grau de 32 malignidade23'29'30, (ii) , os niveis aumentam após inoculação intracraniana, (iii) , em amostras humanas de GBM uma das suas localizações preferenciais é nos vasos tumorais. É aqui demonstrado que a ativação de CD95 aumenta a expressão de mARN de MMP9 e MMP2 em linhas de células de glioblastoma estabelecidas e as culturas primárias e a quebra de MMP2 e MMP2 bloqueia a migração induzida por CD95. A região promotora de MMP9 contém locais de ligação putativos para o AP-1, NFkB, Spl e AP-2 31. 0 complexo de transcrição AP-1 desempenha um papel essencial para estimular a transcrição de MMP9 31,32. a transcrição dirigida por AP-1 de MMP9 em células de glioblastoma foi previamente relatado para ser a jusante da via PI3K/ILK/GSK9'10 ou em vez disso pode exigir a actividade ERK e JNK33. c-Jun, um componente putativo do complexo transcrição AP-1, foi identificado como um dos genes alvo TCF/p-catenina mais altamente induzidos 36'37. a inibição de GSK3 β, tal como aqui relatado, permite à β-catenina não fosforilada acumular-se e translocar-se para o núcleo, onde funciona como um co-factor para os fatores de transcrição da família TCF/Lef 35. Além disso, a actividade de NFkB foi observada concomitantemente. Uma vez que CD95L-T4 diminui a atividade de ERK, acreditamos que em células T98G a AKT regula a actividade de NFkB através de fosforilação/ativação da quinase IKK, que por sua vez fosforila o IKB e permite a libertação de NFKB activado66. Alternativamente, o IKB pode transativar a subunidade p65 64 . Em contraste, a indução da motilidade e invasibilidade relatado anteriormente para as 33 linhas de células de tumor ou endodérmica origem mesodérmica envolve ERKi NFKB e atividade da caspase-813.

Em contraste, o tratamento de células de glioblastoma com CD95L não fez nenhuma ativação da ERK nem a caspase-8, a clivagem. A invasão mediada por CD95 de células de glioblastoma não pôde ser bloqueada por um ERK ou um inibidor geral de caspase. Em vez disso, nestas células de origem neuroectodérmica invasibilidade foi regulado pela via PI3K/ILK/GSK, porque ela pode ser bloqueado por uma PI3K-, um inibidor de ILK e por uma forma dominante activa da GSK3 β. A atividade de PI3K é também necessária para a associação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) , que, em seguida, aumenta a expressão de MMP9 via ERK . Assrm, a actrvrdade mediada por CD95 de PI3K facilita um aumento adicional na actividade de MMP9 por EGFR. Portanto, a activação de CD95 induz a migração/invasão através da via PI3K/AKT/GSK3 β/β— catenina/MMP e/ou o PI3K/AKT/NFkB/ MMP. GSK3 β é encontrado num complexo multiprotéico com a proteína supressora do tumor da polipose adenomatoso do cólon (APC), axina e β-catenina. Nas células não estimuladas, GSK3 β fosforila β-catenina, marcando-o para ubiquitinação e degradação posterior35. A inibição da βεΚ3β desestabiliza este complexo de degradação, o que permite a β-catenina não fosforilada acumular-se e translocar-se para o núcleo, onde funciona como um co-factor para transcrição dos fatores da família dos factores de aumento das células-T/linfóide (TCF/LEF)35. C-Jun, um componente putativo do complexo de transcrição AP-1, foi identificado como um dos genes alvo TCF/β—catenina mais altamente induzidos36,37 . 34

Foi recentemente verificado que C-Jun fosforilada interage com TCF4 e, assim, regular a tumorogénese intestinal integrando as vias JNK e GSK. Nós supomos que as elevadas atividades basais de ERK e JNK, juntamente com a inibição de GSK3P determina a actividade tumorogénica de CD95. Neste contexto, os presentes inventores verificaram que elevados níveis basais de GSK3P fosforilada correlacionam-se positivamente com a capacidade de aumentar a migração de CD95 (dados não apresentados), enquanto que os níveis de expressão de CD95 de superfície não tem qualquer influência. Por consequência, os gliomas malignos apresentam maiores pools de livres β-catenina fosforilada do que os menos malignos (dados próprios não publicados).

No passado, vários relatos têm apontado um importante papel para a fosforilação da tirosina em sinalização induzida por CD9558'59. Estes relatórios preliminares, no entanto, sugeriram que a fosforilação em tirosina induzida por CD95 é um pré-requisito para a apoptose mediada por CD9556'60'69. Nessa linha, a fosfatase SHP-1, PCH-2 e SHIP foram encontrados para se associaram com CD95 para neutralizar a sobrevivência das vias iniciadas por fatores54. Recentemente, a fosforilação da tirosina induzida por Src de caspase-8 verificou-se prejudicar a apoptose induzida por CD9553. Descrevemos agora uma nova associação do membros da família Sr-c Yes e p85 com CD95. TRANCE, outro membro da família TNF, ativa PI3K através de um complexo de sinalização que envolve c-Src e TRAF671. A inibição de Fyn, outro membro da família Src, diminuiu migração induzida por CD95 das células de glioblastoma, embora não significativamente. Isto pode ser explicado pelo facto de Fyn estar envolvido na sinalização mediada por EGFR em células neurais e EGFR é um receptor de muito importante para a invasão de glioma que foi encontrado em associação com o CD95. Assim, a inibição da sinalização mediada por 35 CD95 pode afectar a sinalização mediada pelo EGFR e vice-versa. Se outra molécula adaptadora está ainda a faltar no complexo de ativação de PI3K do CD95 (PAC) continua a ser sujeito de estudos futuros. Alternativamente, Yes e p85 pode interagir diretamente com CD95 através de fosfotirosina previamente identificada contendo motivo no DD de CD9554. Consequentemente, nas células T98G, a quebra de Yes permite o recrutamento induzido por CD95L-T4 de FADD para CD95, indicando que Yes e FADD pode competir pela ligação ao CD95. Nessa linha, a análise dos niveis de expressão Yes revelou uma muito maior expressão nas células T98G que nas LN18. Mais importante, a expressão do Yes e a fosforilação da familia das quinases Src foi consistentemente encontrada no local de interacção do tumor/hospedeiro em amostras clinicas de GBM, indicando o seu envolvimento na invasão tumoral.

Bamhart et al. (2004) 13 mostraram anteriormente que o CD95L exógeno induz a migração de células tumorais de origem endodérmica, in vitro. Nestas células CD95L induz a migração através da caspase-8 e ERK13. Estes autores especulam que o CD95L pode estar envolvido na evasão do tumor a quimioterapia e radioterapia, uma vez que ambos os tratamentos aumentam a expressão de CD95L. No nosso estudo observou-se que CD95L também induz a migração de células de GBM. Além disso, o presente estudo representa um avanço conceptual significativo no campo da biologia do tumor uma vez que demonstra pela primeira vez que: (i) a única interação de células tumorais com o parênquima envolvente induz a expressão de CD95L em células hospedeiras e do tumor (ii) os sinais de invasão de CD95L em células de GBM através Yes/PI3K/MMPs e não através caspase-8/ERK como é o caso das células tumorais de origem endodérmica, (iii) a neutralização de atividade de CD95 bloqueia a migração de 36 células basais de GBM in vivo num modelo singénico de rato de GBM que reproduz a situação clínica. Além disso, este estudo mostra que a estequiometria molecular dos componentes de sinalização PI3K parece determinar a resposta celular a CD95.

Em resumo, os dados atuais indicam que os tumores Grau IV da OMS são resistentes a apoptose induzida por CD95, mas aumentou a sua capacidade de invasão por estimulação de CD95.

Apesar da resistência clínica conhecida à irradiação de GBM1, a terapia corrente para GBM engloba cirurgia seguida por irradiação e quimioterapia adjuvante. 0 regime de irradiação padrão utiliza uma dose ideal de 60 Gy geralmente dada em frações diárias de 1,8 a 2 Gy durante aproximadamente 6 semanas com radioterapia concomitante focalmente dirigida. A área alvo é a área tipicamente aumentada vista na MR1 com um adicional de 2 a 3 cm de margem38. Este regime foi desenvolvido com base no conhecimento de que a principal falha do tratamento de gliomas malignos é a recorrência do tumor no espaço a 2 cm do local original do tumor, o que ocorre em aproximadamente 80% a 90% dos casos38. A radiação induz danos por interação direta com o alvo celular ou indirectamente, através da interação com outros átomos ou moléculas (por exemplo, água) dentro da célula para produzir radicais livres que afetam secundariamente as estruturas criticas. Além disso, a irradiação tem sido demonstrado que aumenta a expressão de recetores de morte e ligantes de morte, os quais em alguns casos, matam a célula via apoptose3. É também divulgado que a irradiação de células de glioblastoma aumenta grandemente os níveis de CD95 e CD95L. No entanto, as células permanecem resistentes a destruição induzida por radiação. Em vez disso, nós mostramos que as células 37 irradiadas apresentam um potencial de migração altamente dependente de CD95L. Mesmo as células que não migram significativamente após a única estimulação de CD95 fizeram-no após a irradiação. Assim, um aumento dos niveis de CD95 mediado por irradiação adicional ou possíveis alterações no total da atividade de quinase pode tornar as células sensíveis à migração induzida por CD95. Nessa linha, a terapia por irradiação X é o único fator ambiental inequivocamente ligado a um maior risco dos tumores cerebrais, incluindo glioma, muitas vezes, dentro de dez , , o q , anos apos a terapia . Mais importante, em contraste com os tumores originais onde CD95 e CD95L foram expressos apenas no interior do tumor, a expressão de GBM recorrente de CD95L e CD95 aumentaram drasticamente. Em linha com os dados in vitro, não se detetaram células apoptóticas perto das células CD95L positivas, mas em vez disso um aumento da expressão de MMP9.

Estratégias experimentais atuais para bloquear o foco da invasão de glioblastoma na inibição da actividade de MMP pela expressão dos inibidores naturais TIMP2 e TIMP4 ou dependem do direccionamento direto do gene alvo de MMP ARNm por estratégias anti-sentido. No entanto, enquanto TIMP2 diminui a angiogénese e a invasão também protege as células tumorais da apoptose40. Outras estratégias para inibir a produção de MMP consistem em atingir as vias de transdução do sinal que conduzem à sua expressão, as quais estão, não só de forma semelhante, envolvidas na indução da invasão tumoral, mas também em algumas funções neuronais básicas, tornando assim estas estratégias menos atraentes para aplicação clinica.

Em contraste, enquanto a atividade CD95 é necessária para remodelação da neurite durante o desenvolvimento do cérebro embrionário41 e de depuramento das células cerebrais 38 danificadas no cérebro doente42-45 nenhuma atividade CD95 é detetável no cérebro do adulto saudável. Assim, a segmentação de CD95 deve ter menos efeitos colaterais do que os outros fatores de indução da migração, que são normalmente envolvidos em funções normais do cérebro.

Assim, CD95 aparece como um alvo muito potente e atrativo para o tratamento da primeira linha de glioblastoma humano.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Reagentes e procedimentos gerais

Foram usados os seguintes anticorpos: anti G247-4 de CD95L humano (1: 200), o anticorpo neutralizante para CD95L (Nokl), o anti-CD95 de murino (Jo2), o anti CD95L de murino (MFL3) e o controlo de isotipo adequado, um hamster IgGl, λΐ, foram adquiridos na Becton Dickinson. Os anticorpos contra CD95 (a-Apo-1) foram gerado como descrito previamente46, GSK3p fosforilada (P-Ser9-GSK3p, 1 : 1000), AKT fosforilado (P-Ser473-KT, 1:1000), AKT total (T-AKT, 1:1000), quinases da familia Src (Src, 1: 1000), Src fosforilada (P-Tyr416 1:50) e total de β-catenina (1:1000) foram adquiridos a partir de New England Biolabs. Os anticorpos contra CD95 (CD95, 1:1000), GSK3P total (t- GSK3p, 1:1000), ERK1/2 fosforilada (P-ERK, 1:1000), Yes total (Yes, 1 : 1000 ou 1:200), o total de Fyn (1:200) e ERK total (T-ERK, 1:1000) foram adquiridos na β-catenina activa (P-Ser37 ou P-Thr41; 1:800) foram adquiridos na Upstate, GE-213 anti-MMP9 (1:100) foi adquirido na Oncogene, anti-GFP (1:400) foi adquirido a partir de Molecular Probes, anti-GADPH foi adquirido na Abcam e o anticorpo anti- 39 caspase-8 (1:10) foi gerado no nosso laboratório a partir de sobrenadante de hibridoma47. O anticorpo anti-PED (1:2000) foi gentilmente cedido pelo Dr. Herve Chneiweiss. Para a visualização de anticorpos específicos em colorações histológicas foram usados estreptavidina-fosfatase alcalina/VermelhoRápido ambos adquiridos na Dako. Para os estudos de imunofluorescência usaram-se antiodies monoclonais Alexa Fluor 488 (1:500, Sondas Moleculares) e anti-Rodamina (Dianova 200 1). O inibidor de MAPK, PD98059 (25 μΜ), o inibidor de PI3K Ly 290059 (25 μΜ) e o inibidor pancaspase zVAD-fmk (40 μΜ) foram adquiridos a partir de Calbio-chem. O inibidor de ILK (20 μΜ) foi gentilmente fornecido por S. Dedhar. As células foram pré-incubadas 30 minutos com inibidores (LY 290059 e zVAD-fmk) antes do tratamento ou com CD95L-T4 ou αΑρο-1. A geração de Leucinezipper-CD95L (LZ-CD95L) foi realizada como descrito previamente41. Os agentes bloqueadores (zVAD-fmk, PD98059, LY 290059 e KP-SD1) foram administrados 30 minutos antes do tratamento com LZ-CD95L ou aApo-1. As células foram lisadas para análise bioquímica adicional. A extração de proteínas e imunobloting foi realizada como descrito anteriormente41. EXEMPLO 2 - Amostras Primárias

Espécimes de tecido de tumores NCH foram obtidos no intra-operativamente, após consentimento informado dos doentes e aprovação da comissão de ética local. O tecido fresco foi dividido em duas partes, uma parte para estabelecer culturas de tumor primário e outra para extração de ARN. Os dados clínicos dos respectivos doentes a que se refere a classificação do tumor, idade na cirurgia e sexo estão resumidos na Tabela I (Fig. 22). 40 EXEMPLO 3 - Experimentação Animal

Experiências com animais foram aprovadas pelo German Câncer Research Center comissão de uso e cuidados animais institucionais e o Regierungsprásidium Karlsruhe. Para injeções intracranianas, usaram-se ratinhos Vm/Dk isogénicos com 8 a 12 semanas de idade. 5.000 células SMA-560 foram colhidas por tripsinização, ressuspendidas em 1 μ]1 de meio de Eagle modificado da Dulbeccos (DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS) , 1% de penicilina/estreptomicina (PS) e 1% de L-Glutamina 200 mM) e carregado numa seringa Flexilfil de 10 μ]1 (WPI, Berlim, Alemanha). Um orifício de trepanação foi perfurado 2,75 mm lateral ao bregma e a agulha foi introduzida até uma profundidade de 3 mm. Os ratinhos foram sacrificados 7, 14 ou 18 dias após as injecções. EXEMPLO 4 - Explantes tumorais

Catorze dias após a inoculação do tumor, sacrificaram-se os ratinhos e extraíram-se os tumores. Os explantes dos tumores foram então incubados durante 1 hora qualquer em meio, meio mais o anticorpo de controlo de isotipo (10 μρ/ηϋΟ) ou meio com MFL3 (10 μρ/ιτΟΟ) . Após incorporação dos explantes em colagénio, a invasão de células foi registada durante 72 horas com um microscópio de lapso de tempo (Olympus, Alemanha). EXEMPLO 5 - Células e culturas esferóides

As linhas de células de glioblastoma T98G estabelecidas A172, LN e 18 e as células primárias de glioblastoma (NCHS) foram cultivadas em meio DMEM (suplementado com 10% de FCS e 1% de PS) numa incubadora C02 a 36,5°C e 90% de humidade. As linhas de células NCH foram estabelecidas em laboratório 41 de C. Herold-Mende como descrito48. Para a análise bioquímica e molecular lxlO6 células foram plaqueadas para placas de cultura de 10 cm com meio e incubadas como descrito anteriormente. Os esferóides foram produzidos como descrito previamente49. Em resumo, células T98G e LN18 (2-3 x 104) foram colocadas em gotas em suspensão (20 μΐ,) , sobre as tampas das placas de cultura de 10 cm contendo 10 mL de DMEM. Após 48 h, os agregados celulares foram recolhidos e transferidos para uma placa de base revestida com agar a 2% cheia com meio. Após mais 48 h os esferóides foram incorporados em um gel de colagénio tridimensional para análise de invasão. OAG 33 EXEMPLO 6 - Ensaio de Invasão de Colagénio

Um modelo fisiológico para investigar a invasão é o ensaio em gel de colagénio tridimensional. Os esferóides foram tratados 1 hora antes de ser incorporado numa solução de gel de colagénio (Vitrogen 3 mg/mL de solução, na concentração final de 2,4 mg/mL), com aApo-1 (2 μg/mL), LZ-CD95L (5 ng/mL) ou Nokl (50 ng) /LZ-CD95L (5 ng/mL) . Após polimerização do gel de colagénio (3, 060 min a 37°C) DMEM foi colocado no cimo dos géis. A invasão das células na matriz de colagénio foi documentado com um microscópio de lapso de tempo (Olympus, Alemanha). A distância de células invasoras individuais à beira do esferóide (n = 10 por esferóide; 3 esferóides por tratamento) foi determinada com o software de imagem J 1.34 (com base na imagem de NIH). EXEMPLO 7 - Homogeneização de tecidos

Para a análise FACS, os tumores foram removidos nos pontos de tempo indicados, com tripsina durante 20 min a 37°C, 42 lavadas três vezes em PBS/10% de FCS, trituradas com pipetas de Pasteur de vidro, filtrada através de uma malha de nylon de 100 μηι (BD Falcon) e ressuspendidas em PBS/10% FCS para Análise por Classificador celular activado de fluorescência (FACS, Becton Dickinson). EXEMPLO 8 - Ensaio de migração A migração das células de glioma in vitro foi medida pela migração através de insertos transpoços revestidos com colagénio I (Falcon) . 5 x 104 células foram colocadas em placas em 200 μύ de meio em insertos transpoços revestidos com colagénio (50μg/mL) com 8 μπι de tamanho de poro. As células eram ou γ-irradiadas antes do plaqueamento ou tratadas após o plaqueamento com a-Apol (2 μρ/ιπύ ou 0,1 μρ/ηϋΟ + Proteina A para reticulação) , LZ-CD95L (5 ng/mL) , Nokl (50 ng)/LZ-CD95L (5ng/mL), Nokl (50ng) sobrenadante LZ (SN, 5 ng/mL), CD95L (10 ng/mL) e CD95L-T34. De preferência, 24h após o plaqueamento as células foram deixadas sem alimento com DMEM basal durante mais 24 horas, antes de serem tratadas. O número de células migradas foi contado completamente às 12 h, 24 h e 36 h após o tratamento. Em todas as experiências em triplicado foram contadas em cada tratamento. EXEMPLO 9 - Pontuação e análise de tumor A pontuação de CD95L em gliomas originais e recorrentes foi realizada por análise de três áreas (ampliação de 250 vezes) de cada tumor corado CD95L. As células positivas foram contadas de um modo cego duplo e as pontuações atribuídas de acordo com o número de células positivas. 43

Para a análise de migração induzida por CD95 in vivo, uma suspensão de 5.000 células SMA-560 e 3 μρ de MFL3 ou o anticorpo de isotipo apropriado foi injetado no estriado esquerdo de ratinhos Vm/Dk. Após uma semana, os ratinhos foram sacrificados e os cérebros extraido. Após coloração imuno-histoquimica, as células GFP positivas no hemisfério contralateral de três áreas representativas por amostra foram contadas e normalizada para a superficie do tumor, tal como avaliado por software CellAR (Olympus, Alemanha). EXEMPLO 11 - irradiação-γ 2,5 x 105 células foram plaqueadas em placas de cultura de 6 cm 12 h antes da irradiação. As células foram irradiadas com 1, 3, 10 e 50 Gy, à temperatura ambiente utilizando uma fonte 137Cs (Célula Gama 1000, Atomic Energy of Canada, Ltd., ON) em 10,23 Gy/min. As células foram tratadas com Nokl (10 μρ/ηϋΐ) ou deixada sem tratamento imediatamente após a irradiação. Seguidamente as células foram usadas para os ensaios de migração, a extracção de ARN ou ensaio Nicoletti. EXEMPLO 12 - Análise Estatística A análise estatística dos dados de migração e expressão de mARN foi realizada utilizando o teste t de Student não paramétrico para comparar as diferenças entre os grupos de tratamento e controlos. Os intervalos de confiança foram determinados a 95%, e * valores P <0,05, ** valor P <0,01.

Valor P <0,005 foram considerados estatisticamente significativos. 44 EXEMPLO 13 - Imunoprecipitação

2 X 107 células foram tratadas ou com 10, 500 e 5 μg/mL de CD95L-T4, durante 1 minuto e 5 minutos (a menos que indicado em contrário) a 37°C ou deixadas sem tratamento, lavou-se duas vezes em PBS suplementado com inibidores de fosfatase (NaF, NaN3, pNPP, naPPi, β-Glicerolfosfato, 10 mM cada, e 2 mM de ortovanadato), e subsequentemente lisadas em tampão A (20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, coquetel de inibidores de protease [Roche], 1% de Triton X-100 [Serva, Heidelberg, Alemanha], glicerol a 10%, e inibidores da fosfatase [NaF, NaN3, pNPP, NaPPi, β-glicerolfosfato, 10 mM cada e ortovanadato 2 mM] ) (condição estimulada) ou lisadas sem tratamento (condição não estimulada). A concentração de proteina foi determinada utilizando kit BCA (Pierce). 1 mg de proteina foi imunoprecipitada durante a noite com anti-caspase-8, como previamente descrito58, 5 μρ de aApo-1 ou 2,5 μρ de anti-p85 e 30 μ]1 de proteina A Sepharose. As pérolas foram lavadas 5 vezes com 20 volumes de tampão de lise. Os imunoprecipitados foram analisados em 15% ou 7,5% de SDS-PAGE. Subsequentemente, os géis foram transferidos para membrana de nitrocelose Hybond (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha) , bloqueados com BSA a 2% em PBS/Tween (PBS mais 0,05% de Tween 20) durante 1 hora, e incubadas com os anticorpos primários em BSA PBS/Tween a 2%, a 4°C durante a noite. As manchas foram desenvolvidas com um método de quimiluminescência seguindo o protocolo do fabricante (PerkinElmer Life Sciences, Rodgan, Alemanha). 45 EXEMPLO 14 - A análise celular por citometria de fluxo Coloração extracelular:

Expressão de CD95 na superfície das células individuais foi analisada por FACS. lxlO6 células/mL de soro fisiológico tampão fosfato contendo 10% de soro fetal de vitela (PBS 10%FCS) foram incubadas com aApo-1 (0,01 μρ/μΐ^ durante 20 minutos sobre gelo, seguido pelo anticorpo secundário (1:30 de cabra-anti-ratinho conjugado com ficoeritrina; Dianova) durante 30 minutos. A análise citométrica de fluxo foi realizada num FACSCalibur (Becton Dickinson) usando um Quest Software celular. Um mínimo de 10.000 células por amostra foi analisado.

Coloração FACS intracelular:

Para medir tanto a eficiência de sobre expressão de PTEN, a eficiência de quebra de Yes ou os níveis basais de FADD, Fyn e Yes, foram realizadas colorações FACS intracelulares. As células foram tratadas com tripsina, o sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi ressuspenso em 4% de paraformaldeído em tampão PB, durante 15 minutos sobre gelo. Após incubação, as células fixadas foram centrifugadas (3000 rpm, 4°C, 5 minutos), o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado duas vezes com PBS/0,1% de saponina e 10% de FCS. As amostras foram incubadas em gelo durante 30 minutos com o primeiro anticorpo a-HÁ 1:1000 Roche, a-Yes 1:200 ou a-Fyn 1:200 Santa Cruz), seguido por dois passos de lavagem com PBS/0,1% de saponina e FCS a 10% antes da adição do anticorpo secundário a-rato-PE, 1:33 ou Pharmingen a-coelho-Alexa488® 1:250 Sondas Moleculares) durante 20 minutos adicionais. As células coradas foram lavadas duas vezes com PBS/0,1% de Saponina e 10% de FCS e o sedimento 46 ressuspendido no mesmo tampão. As células foram então analisadas por FACS. Os valores foram dados como média intensidade de fluorescência normalizada (MIF) para o antigénio especifico. EXEMPLO 15 - Deteção de apoptose (ensaio de Nicoletti)

Para quantificar a fragmentação do ADN, as células destacadas com tripsina/EDTA (Gibco), foram centrifugadas a 200 x g, e fixadas com etanol a 70% a -20°C durante 1 hora. As células fixadas foram coradas com uma solução de iodeto de propidio (50 citrato de sódio 0,0025% e 0,0025% de Triton-X-100) durante 1 hora ou durante a noite a 4°C e analisadas por FACS. EXEMPLO 16 - ZIMOGRAFIA DE GELATINA PARA MMP-2 E -9 O meio condicionado não tratado ou tratado (10 ng/mL e 20 ng/mL de CD95L-T4) células T98G foram colocadas sob condições não redutoras num gel de SDS-poliacrilamida a 10% contendo 1 mg/mL de gelatina. Após electroforese e lavagem do gel com o Triton X-100 (2,5% v/v, duas vezes durante 30 minutos) , o gel foi incubado em tampão de reação MMP [50 mmol/L de Tris-HCl (pH 7,8), 200 mmol/L NaCl, 5 mmol/L deCaC12] a 37°C durante 16 h. A atividade gelatinolitica foi detetada como bandas transparentes na coloração com solução de Coomassie Brilliant Blue G-250 e incubação em solução de descoloração (ácido acético a 10%, 20% de metanol). 47

EXEMPLO 17 - IMUNOHISTOQUÍMICA Células T98G foram fixadas com PFA a 4%, a 37 °C, durante 15 minutos, incubadas com cloreto de amónio 50 mM e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 minutos. Após bloqueio, as células foram incubadas com os respectivos anticorpos primários, e as imunorreatividades foram visualizadas com um anticorpo monoclonal ou policlonal acoplada a rodamina ou isotiocianato de fluoresceina (ITCF).

Amostras clinicas de GBM OMS IV foram fixadas com PFA a 4% e embebidos em parafina. Secções consecutivas de 5 μιη de espessura foram com os anticorpos do rato contra CD95L, Yes e fosfo-Src (Tyr416). Para validação dos anticorpos anti-CD95L e anti-CD95, foram usadas amígdalas humanas. Após incubação com anticorpos secundários acoplados com biotina, seguido por incubação com secções estreptavidina-fosfatase alcalinas (Dako) foram desenvolvidas com Fastred (Dako) , e incorporados com Glycergel (Dako).

Os tumores de murino foram fixados com PFA a 4%. Após a inclusão em parafina, fatias consecutivas de 5 μιη de espessura foram imunomarcadas com GFP anti coelho. EXEMPLO 18 - Infeção de Lentivirus

As células T98G e LN18 foram infetadas com o vetor de lentivirus pEIGW e pEIGW-GSK3ps9A numa infeção múltipla (MOI) de 5. Os plasmídeos foram construídos por substituição da sequência de eGFP entre o promotor EFla e o elemento WPRE em pWPTSeGFP (gentilmente cedido por D. Trono, Genebra) com a cassete IRES-eGFP de plRES2-EGFP (Clontech, Alemanha). O vetor de lentivirus recombinante PEIGW-GSK3 pS9A foi construido usando pcDNA3 HA-GSK3pS9A (gentilmente cedido por Trevor C. Dale). Este vetor 48 codifica um mutante constitutivamente activo GSK3b contendo uma substituição de serina por alanina no resíduo 9 (GSK3PS9A). Todos os lentivírus foram propagados usando métodos anteriormente descritos41. A expressão de todos os transgenes foi confirmada em células infetadas por análise FACS de expressão de GFP. A percentagem de células infetadas foi de 80-90%.

EXEMPLO 19 - PCR EM TEMPO REAL O ARN das células tratadas quer com αΑρο-1 (1 μg/mL) ou deixada sem tratamento foi extraído com o Qiagen RNeasy Mini Kit às 48h, salvo indicação contrária. Após a transcrição reversa, o ARNm alvo foi detetado por PCR em tempo real de Taqman com os seguintes iniciadores específicos do gene: CD95-forw. 5'- ACT GTG ACC CTT GCA CCA AAT-3'; CD95-rev. 5'- GCC ACC CCA AGT TAG ATC TGG-3'; CD95-sonda 5'- AAT CAT CAA GGA ATG CAC ACT CAC CAG CA-3'; CD95L-forw 5' - AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC-3'; CD95L-rev 5' -AAA GCA GGA CAA TTC CAT AGG. TG-3'; CD95L-sonda 5'- TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG G-3'; ΜΜΡ-9-forw. 5'- GAT CCA AAA CTA CTC GGA AGA CTT G-3'; ΜΜΡ-9-rev. 5'- GAA GGC GCG GGC AAA-3'; ΜΜΡ-9-sonda 5'- CGC GGG CGG TGA TTG ACG AC'3;. MMP-2-forw 5'- GGA CAC ACT AAA GAA GAT GCA GAA GT-3'; MMP-2 ver. 5'- CGC ATG GTC TCG ATG GTA TTC-3'; ΜΜΡ-2-sonda 5'- AGT GCC CCA GCA AGG TGA TCT TGA CC-3'; b-actina-dir 5'- ACC CAC ACT GTG CCC ATC TAC GA-'; b-actina-ver. 5'- CAG CGG AAC CGC TCA TTG ATG CCA G-3'; sonda de actina-b-5' - ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGC GT-3'. Para a prova de quebra de Yes, o ARNm alvo foi detetado por PCR SybrGreen em tempo real com o uso dos seguintes iniciadores da família Src quinase: Yes-dir. 5'- TAT GCG TGC CAG ATT GCT G-3'; Yes-rev. 5'- ZZC AGG AGC TGT CCA TTT GA-3'; Fyn-dir. 5'- TGA ACA GCT CGG AAG GAG AT - 3' ; Fyn-rev. 5'- GGT TTV ACT CTC CGC GAT AA - 3'; 49 como limpeza do gene Gapdh foi usado com as seguintes sequências:. Gapdh-dir. 5'- GGT CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG-3'; Gapdh-rev 5'- CCT CCG ACG CCT GCT TCA CCA C-3'. 0 PCR em tempo real foi medido numa ABIPRISM-7300Í (Applied Biosystems, EUA).

EXEMPLO 20 - SOBREEXPRESSÃO PTEN A sobre expressão de plasmídeos PTEN (PBP-PTEN-HA) e o vector vazio (pBP) foram gentilmente cedidas por Frank Furnari (San Diego, EUA)59. As células T98G foram transfetadas com pBP-PTEN-HA e pBP (6 μg) usando as células JetPei. As células transfetadas foram cultivadas durante um adicional de 48 - 72 horas antes do tratamento.

EXEMPLO 21 - EXPERIÊNCIAS DE QUEBRA

Experiências de quebra foram realizadas por transfeção transiente com Lipofectamina 2000™ (Invitrogen Life Technologies) seguindo o manual de instruções. Experiências de migração foram realizadas usando ou siARN validado contra Yes (Qiagen SI00302218) , e um segundo siARN, visando um membro diferente da família das quinases Src, Fyn (Qiagen SI00605451) , que foi usado como um controlo negativo ou pools de vetores shARNmir-pGIPZ validados para Yes, MMP-2 e MMP-9 e um vetor shARNmir-pGIZ não-alvo como um controlo negativo (RHS 4430-98843955, -98820654, 99161516, -98514235, -98709361, -99137419, -99291751, - 99298712, -99138418 e RHS4346-OB, respectivamente, Open

Biosystems, EUA). Após transfeção transiente com siARNs diferentes as células foram cultivadas durante 72h antes de tratados com CD95LT4 (10 ng/mL e 20 ng/mL), a migração foi analisada 24 h depois do tratamento com um ensaio de migração bidimensional. A quebra foi controlada por PCR 50 quantitativo em tempo real e FACS. Para excluir os efeitos fora do alvo do Yes-siARN, as células foram transfetadas com siARN contra Yes, um plasmideo de sobre expressão Yes (p-CMV-Yes) ou ambos e cultivadas durante 48 horas antes de serem transferidas para uma placa de migração. Após 48h adicionais as células foram tratadas com CD95L-T4 (10 ng/mL e 20 ng/mL). A migração foi medida 24 horas após o tratamento, num ensaio de migração de duas dimensões.

Para os estudos de imunoprecipitação, as células transfetadas foram cultivadas durante 72 h antes do tratamento.

EXEMPLO 22 - ENSAIOS DE GENE REPÓRTER DE LUCIFERASE

Vetores repórter de luciferase foram gentilmente fornecidos a partir das seguintes fontes: pTOPFLASH e pFOPFLASH (Randall T. Moon, Howard Hughes Medicai Institute of Washington, EUA) e o NFKB plasmideo com seis sitios NFKB de ligação (Min Li-Weber, German Câncer Research Center Heidelberg, Alemanha). As experiências de transfeção foram realizadas com reagente Lipofectamina 2000™ (Invitrogen Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 χ 104 células por poço, 24 h antes da transfeção. As construções Firefly-Luciferase foram co-transfectadas com um plasmideo CMV-Renilla-Luciferase (10 ng) para normalizar os valores de luciferase. A atividade luciferase foi medida 24h após a transfeção, dependendo da construção, usando kits disponíveis comercialmente da Promega (Madison, WI, EUA). A luminescência foi quantificada usando um luminómetro de microplacas de 96 poços Ascient. Todas as transfeções foram realizadas em 51 quadruplicado, em pelo menos duas ocasiões independentes, e as barras de erro representadas como m.d.p.. EXEMPLO 23 - GERAÇÃO DE CD95L-T4

Engenharia genética humana de CD95-ligando-T4 (CD95L-T4) 0 complexo TRAIL/DR5 bem como a estrutura TNF-α foram usadas como modelos de desenvolvimento de estratégias para expressão do dominio de ligação recetor de CD95L humano (CD95L-RBD). Desde que a estrutura de CD95L-RBD humano trimérico é, em principio, semelhante às estruturas de TNF-a- ou TRAIL-RBD (entradas PDB: 1TNF e 1D0G/1DU3, respectivamente51, 55, 62 ) , as seguintes observações foram tidas em conta: 1. Os aminoácidos N- e C-terminais de RBD de TRAIL e TNF-α formam um cordão antiparalelo β. 2. Os aminoácidos terminais deste cordão β estão localizadas ao lado uma da outra, no mesmo local da molécula perto do eixo central do trímero TRAIL-RBD (ver Figura 19) .

Isto significa que, por razões estereoquimicas, o uso de terminais N- e C- na mesmo molécula para a fusão dos domínios de proteínas (por exemplo, para a adição de motivos de estabilização ou tags) é mutuamente exclusivo. A estabilização ideal motivo deve ser uma pequena trímero, bem definido, localizado perto do eixo central do trímero CD95L com os seus terminais C e N em locais opostos do motivo de estabilização, a fim de minimizar o risco de interferência com os sítios de interacção de ligando/receptor. Um domínio proteico trimérico adequado cumprindo estes critérios é o motivo T4-Foldon de fibritina 52 do bacteriófago T461-65 De acordo com as considerações acima mencionadas o T4-Foldon foi fundido no terminal C ao CD95L-RBD humano (Glul42-Leu281 de CD95L). Entre o CD95L-RBD e o T4-Foldon, foi colocado um elemento ligante flexivel (GSSGSSGSSGS) e um marcador de hexahistidina e uma marca strep II (HHHHH-HSAWSHPQFEK) foi adicionada C terminal. Esta marca de afinidade foi ligada ao T4-Foldon por um elemento ligante flexivel (SGPSSSSS). Para permitir a expressão baseada na secreção, um péptido de sinal de humano lgk foi fundido com o terminal N (Glul42) . 0 local de clivagem de péptido de sinal previsto formado pela fusão do lgk lider para o CD95LRBD é esperado para libertar um produto final com uma glutamina localizada no terminal N, o que corresponde a Glul42 de CD95L humano. A sequência de aminoácidos do CD95L-T4-construção mostrado na Figura 19C foi retrotraduzida e seu uso de codões otimizados para a expressão com base em células de mamíferos. A síntese do gene foi realizada por ENTELECHON GmbH (Regensburg, Alemanha). A cassete de expressão final foi subclonada pCDNA4-HisMaxbackbone, usando um único sítio Hind-III- e Not-I- sítios do plasmídeo. Um resumo esquemático, incluindo todas as características acima descritas, é apresentado exemplificativamente para o complexo TRAIL-T4-DR5 (Figura 19 D).

Expressão e purificação de CD95L-T4

As células HEK 293T cultivadas em DMEM + GlutaMAX (Gibco) suplementado com 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μρ/πύΐ de estreptomicina, foram transfetadas transientemente com um plasmídeo que codifica CD95L-T4. O sobrenadante da cultura de célula recombinantes contendo CD95L-T4 foi colhido três dias após a transfeção e clarificado por centrifugação a 300 g, seguido por 53 filtração através de filtro estéril de 0,22 μιη. Para a purificação por afinidade 1 mL de estreptactina sepharose (IBA GmbH, Gottingen, Alemanha) foi compactada numa coluna e equilibrada com 15 mL de tampão W (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0). O sobrenadante da cultura de células foi aplicado na coluna com uma taxa de fluxo de 4 mL/min. Subsequentemente, a coluna foi lavada com tampão de W e o CD95L-T4 ligado foi eluido gradualmente por adição de 7 x 1 mL de tampão E (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, Destiobiotina 2,5 mM, pH 8,0). O teor de proteina das fracções eluidas foi analisado por SDS-PAGE e coloração com prata (Figura 19 E) . As frações E2-E5 foram posteriormente concentradas por ultrafiltração e posteriormente analisado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) . A SEC foi realizada numa coluna Superdex 200 usando um sistema de cromatografia Akta (GEHealthcare). A coluna foi equilibrada com solução salina tamponada com fosfato e o concentrado, CD95L-T4 purificado em estreptactina (E2-E5) foi carregado na coluna SEC com um fluxo de 0,5 mL/min. A eluição de CD95L-T4 foi monitorizada por absorvância a 280 nm. O peso molecular aparente de CD95L-T4 purificado foi determinada com base na calibração da coluna de Superdex 200 com proteínas padrão de filtração em gel (Figura 19 C e G) (Bio-Rad GmbH, Munique, Alemanha).

Ensaio de apoptose

Um ensaio celular com uma linha de células T humano Jurkat A3 permanente A (cat. no. CRL2570, ATCC), foi utilizada para determinar a atividade indutora de apoptose de CD95L-T4. As células Jurkat foram cultivadas em frascos com meio RPMI 1640 + GlutaMAX (Gibco) suplementado com FBS a 10% (Biochrom) , 100 unidades/mL de penicilina e 100 μρ/ηϋΐ de estreptomicina (Gibco). Antes do ensaio, as 100.000 células foram semeadas por poço numa placa de microtitulação de 96 54 poços. A adição de concentrações diferentes de CD95L-T4 aos poços (volume final: 200 μ]1) foi seguida de uma incubação de 3 h a 37 °C. As células foram lisadas por adição de 20 μ]7 de tampão de li se (250 mM de HEPES, 50 mM de MgCl2, 10 mM de EGTA, 5% de Triton- X-100, 100 mM de DTT, 10 mM de AEBSF, pH 7,5) e as placas foram colocadas sobre gelo durante 30 minutos. A apoptose é acompanhada por um aumento da actividade da caspase-3 e caspase-7. Assim, a clivagem do substrato Ac-DEVD-AFC especifico para caspase-3/-7 (Biomol) foi usada para determinar a extensão da apoptose. Na verdade, a atividade da caspase correlaciona-se com a percentagem de células em apoptose determinada morfologicamente após coloração das células com iodeto de propidio e Hoechst-33342 (dados não mostrados). Para o ensaio da actividade da caspase, 20 μ]1 de lisado celular foi transferido para uma placa de microtitulação preta de 96 poços. Após a adição de 80 μΐϋ de tampão contendo 50 mM de HEPES, 1% de sacarose, 0,1% de CHAPS, 50 μΜ de Ac-DEVD-AFC, e DTT a 25 mM, pH 7,5, a placa foi transferida para um leitor de placa de microtitulação Tecan Infinite F500 e o aumento na intensidade de fluorescência foi monitorizado (comprimento de onda de excitação de 400 nm, comprimento de onda de emissão de 505 nm) (Figura 19. H).

Este ensaio de apoptose também foi usado para a determinação da actividade biológica do agente biofarmacêutico APG101. APG101 - uma proteína de fusão do domínio extracelular do receptor CD95 humano (o parceiro de ligação no in vivo do ligando CD95) , com Fc humano antagoniza o efeito indutor de apoptose de CD95L. Antes da adição de CD95L-T4 com as células de Jurkat, CD95L-T4 a uma concentração constante foi incubada durante 30 minutos a 37°C, com diferentes concentrações de APG101 (Figura 19 I). 55

EXEMPLO 24 - CD95 MEDEIA A INVASÃO DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA RESISTENTES À APOPTOSE

Em linhas de células de glioma malignos humano de longo prazo, examinámos em primeiro lugar a indução de apoptose após activação de CD95. 0 tratamento com o ziper de leucina (LZ)-CD95L induziu efeitos variáveis nas diferentes linhas de células de glioma: LZ-CD95L não induzem a apoptose nas células A172, causou apoptose somente em altas doses em células T98G ou já mediou a apoptose em baixas doses nas células LN18 (Fig. la) A especificidade da morte induzida de LZ-CD95L foi comprovada pela neutralização da apoptose por um anticorpo contra CD95L (N0K1; dados não mostrados). A resistência de A172 à apoptose induzida por CD95 pode ser atribuida ao baixo nivel de expressão de superficie de CD95 (Fig. lb) . As linhas de células LN18 e T98G, no entanto, exibiram diferenças de sensibilidade à apoptose comparativamente mostrando entretanto níveis elevados de expressão de superfície de CD95 (Fig. lb). A potência para activar CD95 proporcionalmente correlaciona-se com o grau de oligomerização de CD95L. Uma vez que o CD95L disponível tem uma tendência para formar agregados, nos desenvolvemos um CD95L humano com uma capacidade de construção de trímero estável, o CD95L-T4 (Figura 19). Linhas de células de glioma diferentes apresentaram diferentes sensibilidades para o tratamento com CD95L-T4: A apoptose foi induzida mesmo em baixas concentrações em células LN18, mas não em células T98G (Figura 11A). A especificidade da morte induzida de CD95L-T4 foi testada por neutralização da apoptose por um anticorpo para CD95L (N0K1;. Figura 21). As duas linhas de células LN18 e T98G, no entanto, exibiram comparavelmente elevados níveis de expressão de superfície de CD95 (Figura 56 11Α) . Estas linhas de células expressaram também outras moléculas necessárias para a apoptose mediada por CD95, tal como FADD, caspase-8 ou caspase-3 (Figura 15C e D) 63, 72 .

As células malignas de glioma são caracterizadas pelo seu potencial replicativo, indução de angiogénese, migração/invasão e evasão de apoptose. A estimulação de CD95 não alterou a taxa de proliferação de células T98G (dados não mostrados) . Para testar o comportamento de invasão geramos culturas esferóides de células T98G e LN 18 e plaquearam-se numa matriz de colagénio. 0 tratamento com LZ-CD95L aumentou a invasão de células que migram para as imediações da matriz numa extensão maior do que em células T98G LN18 (Fig. lc, Fig. 11 B) . Este foi também o caso quando as células foram plaqueadas na câmara superior de duas câmaras separadas por uma membrana revestida de colagénio. As células altamente sensíveis à apoptose LN18 não reagiram à activação de CD95 com o aumento da migração. As células T98G, pelo contrário, aumentaram o seu potencial de migração após tratamento com LZ-CD95L, ou com um anticorpo estimulante para CD95 (aApo-1) (fig. 3b). A migração de células de glioma requer clivagem de componentes da matriz extracelular através de MMPs. Em células T98G, a actividade MMP-9, como avaliada pela técnica de zimografia, aumentou após o tratamento com CD95L-T4 (Figura 11C) . Por consequência, a estimulação de CD95 aumentou a expressão dos niveis de mARN de MMP-2 e MMP-9 na tendência de T98G para a migração mas não nas células LN-18 sensíveis à apoptose (Figura 11D e E). Mais importante, a migração induzida por CD95 das células T98G poderia ser bloqueada com pool siARN contra a MMP-2 e -9, indicando que estes MMPs são necessários para a migração induzida por CD95 (Figura 1F e G) . 57

Numa outra série de experiências foram usadas culturas de glioma de curto prazo derivado de doentes com tumores. Estas células exibiram as aberrações genéticas tipicas de GBM, incluindo perdas de cópia única dos locais PTEN e CDKN2a e ganho de cópia única do local EGFR, avaliadas por análises de série-CGH (Bernhard Radlwimmer, comunicação pessoal). Cada cultura derivada de GBM primário aqui examinada exibiu elevada expressão de superfície de CD95 (n=18) e niveis similares ou superiores de resistência à apoptose induzida por CD95 (n=8), em comparação com as observada na linha de células T98G propensa a invasão (figura 12A, Figura 20 e dados não mostrados). Ambos os niveis de expressão de CD95 de superfície e de resistência à apoptose mediada por CD95 não foram afectados pelo número de passagens em cultura (dados não mostrados). Examinamos ainda a invasão induzida por CD95 nas culturas derivadas de GBM NCH89, NCH125 e NCH270. A ativação de CD95 em NCH125 e NCH270 aumentou a expressão de MMP-2 e MMP-9 e, subsequentemente, a migração induzida (Figura 12B a D) . A estimulação de CD95 em células NCH89 nem aumentou a migração nem a expressão de MMP-9 (Figura 12B a D). Assim, a resposta a migração para CD95 não se correlaciona estritamente com o grau de resistência à apoptose. Na mesma linha, a expressão de CD95 e CD95L ARNm diferiu entre os tumores de GBM primários altamente invasivos testados (Figura 20) . As MMPs são necessárias para a migração de -NCH125 induzida por CD95L-T4, tal como uma pool siARN para MMP-2 e -9 bloqueou significativamente a migração (Figura 12E) . 58

EXEMPLO 25 - CD95 MEDEIA A INVASÃO DO PASSO VIA A PI3K/ILK/GSK/MMP DE MODO INDEPENDENTE DE CASPASE A invasão de células de glioma requer clivagem de componentes da matriz extracelular através de metaloproteinases de matriz (MMP), como já descrito acima. Por conseguinte, os niveis de mARN de MMP9 e MMP-2 aumentaram consideravelmente após ativação do CD95 nas T98G propensas a migração mas não nas células LN18 resistentes a apoptose (Fig. 2) . A quinase ligada a integrina (ILK) foi recentemente referida mediar a expressão de MMP9 através da inibição de glicogénio sintase quinase-3 β (GSK3P)9'10. Inibição da fosforilação via GSK3 β no seu resíduo serina-9 (fosfo-Ser9) foi observada em células T98G mediante tratamento com LZ-CD95L ou anticorpo aApo-1 (Fig. 3a e Fig. 8.). A fosforilação da GSK3P foi também encontrada em células LN18, mas com diferentes cinéticas (Fig. 3a e Fig. 8.). As células T98G propensas a migração exibiram mais altos níveis de fosfo-Ser9-GSK3P basal e aumentando gradualmente a fosforilação de longa duração da GSK3P mediante activação de CD95 (Fig. 3a e Fig. 8.). As células LN18 propensas a apoptose mostraram uma fosforilação transiente (5-10 min) da GSK3P mediante ativação de CD95 (Fig. 3a). A sobre expressão da GSK3P mutante constitutivamente activa (GSK S9A) bloqueou a migração das células T98G induzida por CD95 (Fig. 3b) . As células T98G expressando GSK S9A e os seus homólogos de tipo selvagem exibiram níveis comparáveis de sensibilidade a apoptose induzida pelo CD95 e da taxa de crescimento (Fig. 3 c-d) . Assim, a inibição da migração por GSK3P constitutivamente activa em células T98G não pode ser atribuída a uma taxa de proliferação celular diferente. Consequentemente, o pré-tratamento com o inibidor KP-DP-1 de ILK bloqueou a 59 migração mediada por CD95 de células T98G sem afetar a migração da base (Fig. 3e). ILK ativa a proteina quinase B (PKB/AKT) e inibe a atividade GSK3P num modo dependente de fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K)11. Por conseguinte, a inibição de PI3K bloqueada por LY294002 induzida por CD95 a atividade de AKT e a Ser9 fosforilação da GSK3P em células T98G, sem alterar o estado de fosforilação da quinase do recetor extracelular (ERK) (Fig. 3f). A β-catenina forma um complexo juntamente com GSK3P ativa, a polipose coli adenomatosa (APC) e complexo de degradação de proteínas axina. A fosforilação de β-catenina por 6ΞΚ3β visa a degradação proteosomal. Como consequência da inibição da ΰΞΚ3β, a β-catenina acumula-se e transloca-se para o núcleo, onde se engata a extremidade terminal N de proteínas de ligação a ADN da família TCF/Lef12 induzindo a expressão de diferentes genes-alvo incluindo as MMPs. Em células T98G, desencadeia a translocação nuclear induzida por CD95 de β—catenina ativa, não fosforilada na serina 37 que visa GSK ou Treonina 41 (Fig. 3G). Tomadas em conjunto, a ativação de CD95 induz a migração/invasão através do passo de PI3K/ILK/GSK3β/β-catenina/MMP.

CD95 transduz o sinal de apoptose através da ativação de caspases. Foi recentemente relatado que o CD95 medeia a migração através da activação de caspase-8, e NFKB ERK em linhas de células tumorais do mesênquima resistentes à apoptose induzida por CD9513. Em contraste com as células LN18, a estimulação CD95 de células T98G não induziu a clivagem de caspase-8 (Fig. 3h) . Consequentemente, o pré-tratamento de células T98G com um inibidor de caspase de largo espectro, benzoil-VAD.fluorometil cetona (zVAD.fmk) não bloqueiam a fosforilação ser9 da 6ΞΚ3β em células T98G 60 (Fig. 8) . Pré-tratamento de células T98G com o inibidor PD98059 de MEK também não interfere com a migração induzida por CD95 (Fig. 3i).

Para além das caspases, a fosfoproteína enriquecida em diabetes/fosfoproteína enriquecida em astrócitos-15 kDa (PED/PEA-15) tem uma DED e pode, portanto, interagem com outras moléculas no DISC. A sobre expressão de PED foi avaliada para bloquear a apoptose CD95 e TNFR-1 induzida por activação simultânea de ERK e inibição de quinase Jun N-terminal (JNK)14'15. A atividade anti-apoptótica de PED aumenta se fosforilada por AKT16. Em células T98G, a interferência curta (si)-ARN para PED mas não um siARN controlo diminuiu os niveis de PED e a sua ativação reportada de ERK, mas não a inativação de CD95 mediada por GSK3P (Fig. 8). Além disso, os niveis de FLIPL, outra molécula que pode ser recrutada para o DISC e inibir a apoptose, permaneceram inalterados após o tratamento com LZCD95L (dados não mostrados).

Um dos melhores indutores descritos de invasão de GBM é EGF. A sua ligação ao EGFR promove a expressão de MMP-9 através da ativação de MAPK/ERK e o passo de PI3K27. Ο PI3K ativa AKT/PKB, o qual por sua vez é capaz de fosforilar GSK3p levando a sua inativação. Para testar se a sinalização PI3K ou MAPK poderia ser responsável pela invasão observada determinou-se a fosforilação de ERK e AKT. A estimulação de células T98G e LN18 com AKT activado por CD95L-T4 mas não ERK (Figura 13A) . Curiosamente, a atividade de ERK foi ainda bloqueada com o aumento do tempo seguinte à estimulação (Figura 13A) . Nas células T98G, NCH125 e NCH270 propensa à invasão, a fosforilação da AKT exibiram uma curva em forma de sino dependente da concentração (Figura 13B). Em contraste, em células NCH89, 61 que não reage a CD95 com o aumento da invasão, CD95L-T4 não activou AKT acima dos niveis basais (Figura 13B). A inibição da GSK3P, via fosforilação na sua serina-9 (fosfo-Ser9) foi observada em células T98G mediante o tratamento com CD95L-T4 ou aApo-1 de anticorpo por Western Blot e de coloração de FACS (Figura 13C e Figura 21). A sobre expressão de uma GSK3P mutante constitutivamente ativa (GSK S9A) via infecção de lentivirus bloqueou migração das células T98G induzida por CD95 (Figura 13D) . Células T98G expressando GSK S9A e os seus homólogos de tipo selvagem exibiram taxas de crescimento comparáveis e niveis de sensibilidade à apoptose induzida por CD95 (Figura 21). Assim, a inibição da migração por GSK3P constitutivamente activa em células T98G não pode ser atribuído a uma taxa de proliferação celular diferente. A GSK3P ativa forma um complexo com β-catenina, a polipose coli adenomatosa (APC) e proteínas axina - o complexo de degradação. A fosforilação de β-catenina por GSK3P visa-a para degradação de proteosoma. Como consequência da inibição da GSK3P, a β-catenina acumula-se e transloca-se para o núcleo, onde se engata a extremidade N-terminal de proteínas de ligação a ADN da familia TCF (factor de células T)/Lef (factor de reforço linfóide)12, induzindo a expressão de genes alvo diferentes, incluindo c-Jun, um fator de transcrição essencial para a expressão de MMP-931' 32. Alternativamente, a inibição da atividade de GSK3P pode aumentar diretamente a expressão de AP-110. Para estudar se a estimulação de CD95 desencadeia a atividade de transcrição de β-catenina examinamos a expressão da atividade repórter transcricional da β-catenina citoplasmática e da β-catenina nuclear. LiCl, um conhecido 62 inibidor da GSK3P e indutor da actividade transcricional da β-catenina foi usado como um controlo positivo. Em células T98G, desencadeando a acumulação citoplasmática de β-catenina induzida por CD95 30 minutos após a estimulação com CD95L-T4 (Figura 13E) . Além disso, foi observada a translocação nuclear de β-catenina activa, não fosforilada na GSK dirigida Ser 37 ou Thr 41 (Figura 13F) . Atividade TCF/Lef-repórter (TOP-FLASH) foi também significativamente induzida por CD95L-T4 (Figura 13G). A mutação do dominio de ligação TCF/Lef aboliu a indução CD95L-T4 da atividade luciferase (FOP-FLASH; Figura 13G) . Além disso, a actividade de NFKB aumentou significativamente 8h após estimulação com 20 mas não de 10 ng/mL de CD95L-T4 (Figura 13H) . Tomados em conjunto, a ativação de CD95 induz a migração/invasão através da PI3K/AKT/GSK3p/p-catenina/MMP e possivelmente o passo PI3K/AKT/NFKB/MMP.

EXEMPLO 26 - MIGRAÇÃO INDUZIDA POR CD95 É TAMBÉM DETETADA EM CULTURAS DE GLIOMA PRIMÁRIO RESISTENTES À APOPTOSE

Numa outra série de experiências foram usadas culturas de glioma de curto prazo derivadas de tumores de doentes. As células de astrocitoma difuso (OMS II) exibiram maior expressão na superfície de CD95 e foram relativamente sensíveis a apoptose mediada por CD95 (Fig. 4). Em contraste, as células provenientes de oligodendroglioma (OMS III) ou o glioblastoma (OMS IV) foram altamente resistentes a apoptose mediada por CD95, apesar de a expressão de superfície elevada CD95 (Fig. 4 e Fig. 9.). Cada cultura derivada de GBM primário aqui examinada exibiu elevada expressão de superfície de CD95 (n=18) e os níveis iguais ou superiores de resistência à apoptose induzida por CD95 (n=8), em comparação com as observadas na linha celular T98G propensa a invasão (Fig. 9) . Ambos os níveis 63 de expressão de superfície de CD95 e a resistência à apoptose mediada por CD95 não foram afectados pelo número de passagens em cultura (dados não mostrados). Foram testados mais três culturas derivadas de GBM que eram relativamente (NCH125) ou altamente resistente (NCH89 e NCH270) à apoptose induzida por CD95. A ativação de CD95 em NCH125 e NCH270 aumentou a expressão de MMP9 e MMP-2 e posteriormente a migração (Fig. 5a-c). A estimulação de CD95 em células NCH89 nem aumentou a migração nem a expressão de MMP9 e MMP-2 (Fig. 5b-c). Assim, a resposta de migração de CD95 não se correlaciona rigorosamente com o grau de resistência à apoptose. Na mesma linha, a expressão de CD95 e de CD95L ARNm foi muito diferente entre os tumores de GBM primários altamente invasivos testados (Fig. 9) .

EXEMPLO 27 - A IRRADIAÇÃO AUMENTA A CAPACIDADE DE INVASÃO PELA VIA DO SISTEMA CD95/CD95L

No cenário clínico, as células invasoras que escapam à cirurgia de são os alvos da radioterapia e quimioterapia adjuvante. Tem sido relatado que a irradiação-γ aumenta a expressão de CD95 e CD95L e, assim, induz a apoptose3. Considerando os dados presentes queríamos avaliar se a irradiação induzida pelo CD95 e CD95L poderia também aumentar a capacidade de invasão das células de glioma. Primeiro, mostramos que a irradiação das células T98G aumenta a expressão de CD95 e CD95L mARN (Fig. 6a). A maior expressão de CD95 e CD95L mARN foi encontrada na dose de 3 Grays (Gy) . Com a mesma dose, a MMP-2 mARN foi significativamente induzida (Fig. 6b) . A MMP9 ARNm foi também significativamente regulada positivamente a 3 e 10 Gy, mas em menor extensão (Fig. 6b). Mais importante ainda, a expressão de MMP foi espelhada por uma taxa de migração 64 mais elevada das células irradiadas que podem ser revertidas por neutralização de CD95L (Fig. 6c). As culturas primárias de GBM exibiram também um fenótipo mais invasivo após a irradiação (Fig. 6d e Fig. 10.). A migração induzida por irradiação foi totalmente dependente de CD95L (Fig. 6d) . Interessantemente, mesmo em culturas de NCH89 que não exibem um fenótipo invasivo após a ativação directa de CD95, 10 Gy de irradiação aumentou o número de células que migram via de CD95L (Fig. 6d) . A irradiação induziu significativamente a migração de uma maneira dependente do CD95 em nove de dez culturas primárias derivadas de GBM aqui examinados (Fig. 6d e Fig. 10.). A única cultura que não apresenta uma tendência significativa para migrar mediante a estimulação de CD95 tinham menores níveis de expressão de superfície de CD95 (NCH 417; Fig. 10). Nós estudamos a expressão destas moléculas em tumores recorrentes que surgem após a cirurgia e a irradiação do tumor original. Os níveis de expressão de CD95L dentro do tumor foram pontuados como 0 a 4 (Fig. 6e) . Embora os níveis no primeiro glioma detetado nunca foram superiores a 0 (1-24 células positivas a CD95L por campo), um aumento drástico de expressão CD95L após a radioterapia foi detetada em oito dos nove tumores recorrentes estudados (Fig. 6e). O CD95L foi detetado em células tumorais positivas para GFAP (Fig. 6f) . A expressão adicional de CD95 e de MMP9 foi detetada na mesma região, em fatias consecutivas (Fig. 6f) . Importante, as células apoptóticas não foram observadas perto de células que expressam CD95L (dados não mostrados). 65 EXEMPLO 28 - PI3K É ATIVADO PELA VIA DO RECRUTAMENTO DE SRC PARA CD95

Src liga a actividade CD95 a PI3K, como mostrado por experiências de co-imunoprecipitação (Figura 14A a C) . De facto, o tratamento de células T98G e LN18 com recrutamento induzido CD95L-T4 de Src e a subunidade p85 de PI3K para CD95. A associação de p85 com CD95 foi examinada por imunoprecipitação ou CD95 ou p85. 0 grau de associação de p85 com CD95 inversamente correlacionada com a concentração de CD95L-T4 nas células T98G (Figura 14B) . No entanto, em células LN18 o recrutamento p85 para CD95 foi detectado apenas a concentrações elevadas de CD95L-T4 (Figura 14A). A imunoprecipitação de CD95 permitiu a deteção de um membro da familia Src em cinco minutos após o tratamento com baixa concentração de CD95L-T4 (Figura 14A e B). A associação Src diminuiu numa concentração mais elevada (Figura 14A e B) . Assim, a baixas concentrações de CD95L-T4 tanto Src como p85 associadas a niveis detectáveis com CD95 em células T98G, mas apenas em células LN18 foi detectado Src. Além disso, depois de uma triagem com anticorpos para vários SFKs, como Fyn, Lyn, pp60 e Yes, identificamos Yes como o membro da familia Src que liga CD95 a PI3K (Figura 14C) . Para validar o papel de Yes na migração das células de glioma, foram realizadas experiências de quebra. Em células transfetadas com Yes siARN, a expressão do Yes, como avaliada por FACS e de qRT-PCR, foi reduzida enquanto que a expressão de Fyn, outro membro da familia Src, permaneceu inalterada (Figura 14E) . 0 siARN para Yes, mas não para

Fyn, significativamente suprimiu a migração induzida por CD95L-T4e de células T98G de NCH125 (Figura 14D) . Este bloco de migração foi resgatado por sobre expressão de Yes em células T98G e LN18 (Figura 14F). Tal como o inibidor de a PI3K LY290059, o siARN para Yes também inibiu fosforilação de AKT induzida por CD95 (Figura 14G).

EXEMPLO 29 - FORMAÇÃO INEFICIENTE DE DISC EM CÉLULAS DE GLIOMA RESISTENTES A APOPTOSE 0 papel do passo PI3K repressor de PTEN (MMAC1, TEP1) foi examinado . Enquanto as células LN18 propensas a apoptose têm PTEN intacto, células T98G carregam uma mutação pontual (codão 42 CTT a CGT; Glicina para Glutamina) num alelo e falta do segundo alelo de PTEN e uma perda total de um do cromossoma 1057'59. Contudo, a sobre expressão de PTEN, não sensibiliza as células T98G nem NCH125 para a apoptose mediada por CD95 (Figura 15A).

Questionamos ainda se as caspases estavam envolvidas na activação de PI3K induzida por CD95. A inibição de caspases pelo inibidor geral de caspases zVAD-fmk não impediu a fosforilação de GSK3P (Figura 15B). Da mesma forma, a clivagem de caspase-8 induzida por CD95 só podia ser detetado em LN18, mas não em células T98G (Figura 15C) . Para investigar se os componentes de DISC foram eficientemente recrutados nessas células nós analisamos o recrutamento FADD em imunoprecipitados de CD95. Considerando que, após a estimulação com CD95L-T4 o recrutamento de FADD para CD95 aumentou nas células 18LN, nenhum aumento foi detectado nas células T98G (Figura 15D). Por conseguinte, o recrutamento da caspase-8 para CD95 aumentada após a estimulação com CD95L-T4 em células LN18 e J16, mas não em células T98G (Figura 15D) . Mais importante ainda, em células T98G, a quebra de siARN de Yes habilita a indução de CD95L-T4 de recrutamento FADD para CD95 (Figura 15E) . Ao longo desta linha, enquanto que os niveis de expressão de FADD eram semelhantes nas células LN18 e T98G, 67 os níveis de Yes eram significativamente mais elevados nas células T98G (Figura 15F). Ao contrário de Yes, a expressão de Fyn foi significativamente mais elevada em células LN18 (Figura 15F).

EXEMPLO 30-0 SISTEMA DE CD95/CD95L É UM IMPORTANTE MEDIADOR DA INVASÃO DE GLIOMA IN VIVO A expressão de CD95L em doentes que sofrem de Glioblastoma multiforme mostrou uma distribuição tipo triângulo de CD95L em todos os tumores examinados (Fig. 7a, 17a). No interior do tumor, apenas pequenas quantidades de CD95L foram expressos (Fig. 7a.1, 17A.a). A expressão aumentada na interface tumor-parênquima (Fig. 7a.2), atingiu um pico no parênquima cerebral adjacente ao tumor (figura 7a.3, 17A.b) e voltaram a diminuir com o aumento da distância ao glioma (figura 7a.4, 17A.c). Foi detectado CD95L nas células do glioma, neurónios e macrófagos (dados não mostrados). A expressão adicional de CD95L dentro do tumor foi observada em células de glioma que cercam vasos tumorais. Do mesmo modo, a fosforilação de quinases da família Src (pSrc) e expressão de Yes foram consistentemente encontradas na interface tumor-hospedeiro em todas as amostras examinadas, sugerindo um papel na invasão tumoral (Figura 17B) . Dentro das áreas de tumores sólidos, a expressão de Yes variou altamente entre as amostras de tumores, desde muito alta até à expressão apenas nas células tumorais dispersas. Nestes domínios expressando altamente Yes a fosforilação de Src ou não foi detectada ou a deteção foi bastante limitada (Figura 17B).

Para a tradução das nossas observações numa forma in vivo mais fisiológica examinamos o papel do sistema CD95/CD95L num modelo do rato de Glioblastoma multiforme. Para estes 68 estudos, a linha de células de glioma de murino SMA-560 estabelecida foi injetada intracranianamente num hospedeiro Vm/Dk singénico, como descrito. 0 uso de um modelo de tumor singénico foi importante para permitir a indução de tumor da expressão de CD95L no tecido cerebral circundante. AS células SMA-560 expressam apenas baixos niveis de receptor de CD95 na superfície das mesmas (Fig. 7b, 18A) e nenhum CD95L (fig. 7c, 18B), quando mantidas nas condições de cultura de células. Como relatado por outros17 verificamos que as células SMA-560 foram resistentes à apoptose induzida por CD95 (dados não mostrados). Após a formação de esferóides, os niveis de CD95 aumentaram ligeiramente (Fig. 7b, 18A), enquanto que a análise de FACS não conseguiu identificar CD95L na superfície da célula (fig. 7c, 18B). Apesar da quantidade relativamente pequena de níveis de CD95 de superfície, os esferóides formados a partir dessas células apresentam o aumento da migração em ensaio de invasão de colagénio após a estimulação de CD95 num modo dependente da dose (Fig. 7d, 18C). De acordo com a nossa descoberta de que os esferóides não expressam CD95L (Fig. 7c, 18B), o bloqueio da CD95L usando o anticorpo neutralizante CD95L MFL3 não alterou a invasão (Fig. 7d, 18C) .

Curiosamente, a análise de FACS dos níveis de superfície de CD95 e CD95L mostraram um aumento significativo de ambas as moléculas (figura 7b e 7c, 18A e 18B), quando as células isoladas a partir de tumores sólidos, foram analisadas 14 e 18 dias após a inoculação. Isto indica a necessidade de interação tumor-hospedeiro e, portanto, uma conversa cruzada entre os factores do hospedeiro e as células tumorais como determinado no caso de GBM de murino. 69

Para uma análise mais pormenorizada do significado funcional deste aumento, foram extraídas a partir de fragmentos de tumores sólido 14 dias após a injeção intracraniana de células pré-incubadas e destes para uma hora, com qualquer meio sozinho, meio com MFL3 ou o anticorpo isotipo adequado, respectivamente. Depois de incorporadas em géis de colagénio, a migração foi monitorizada durante um período de 72 horas (fig. 7e, 18D) . Surpreendentemente, a pré-incubação com o anticorpo MFL3 neutralizante de CD95L, mas não com o isotipo ou o meio sozinho, diminuiu a migração das células para fora do núcleo do tumor em cerca de 50% (fig. 7e, 18D).

Para verificar estes resultados in vivo, nós injetámos células SMA-560 e MFL3 positivas para GFP ou o anticorpo isotipo adequado para o corpo estriado esquerdo de Vm/Dk. O tratamento de ratinhos com MFL3 reduziu significativamente a migração de células tumorais para o hemisfério contralateral (Fig. 7f, 18E) . Concluímos a partir destes dados que o sistema de CD95/CD95L é um importante mediador da invasão glioma maligno na circundante do cérebro in vi vo. 70

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Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Medicamento para uso no tratamento de um indivíduo com glioma de elevado grau, compreendendo um agente que neutraliza a actividade de CD95 através da prevenção da ligação de CD95 a CD95L ou pela destruição do complexo CD95/CD95L, em que o glioma de alto grau é um glioma de Grau IV da OMS, em que o agente é um inibidor CD95 ou CD95L selecionado a partir de (a) um anticorpo inibidor anti-CD95L ou um seu fragmento funcional, (b) uma molécula de CD95 solúvel ou uma sua porção ligando de CD95L, (c) um inibidor de CD95L selecionado a partir de FLINT, DcR3 ou seus fragmentos, (d) um anticorpo que se liga a CD95 ou um seu fragmento funcional, (e) moléculas antisentido, moléculas ARNi e ribozimas que são capazes de inibir a expressão do CD95, e (f) uma proteína de fusão compreendendo um domínio de CD95 extracelular e um domínio Fc humano.

2. Medicamento para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é um anticorpo que se liga a CD95.

3. Medicamento para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é um anticorpo que se liga a CD95L.

4. Medicamento para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o agente é uma molécula recetora de CD95 ou uma porção desta ligada a ligando CD95. 2

5. Medicamento para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o agente é uma proteina de fusão compreendendo um domínio extracelular CD95 e um domínio Fc humano.

6. Medicamento para uso de acordo com a reivindicação 5, em que a proteína de fusão é APG101 como apresentado na SEQ ID NO:1. Lisboa, 16 de Julho de 2013