PT2145189E - Pseudovírus de papilomavírus para deteção e terapêutica de tumores - Google Patents

Pseudovírus de papilomavírus para deteção e terapêutica de tumores Download PDF

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carcinoma
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Roberts Jeff
T Schiller John
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Us Health
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Description

DESCRIÇÃO
PSEUDOVÍRUS DE PAPILOMAVÍRUS PARA DETEÇÃO E TERAPÊUTICA DE
TUMORES
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se aos campos da biologia molecular e medicina. Mais especificamente, são divulgados no presente documento método para a deteção de tumores e tratamento de indivíduos que sofrem de cancro utilizando pseudovirus de papiloma e partículas idênticas a vírus (VLPs).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro é diagnosticado em mais de 1 milhão de pessoas cada ano, apenas nos Estados Unidos. Apesar dos numerosos avanços na investigação médica, o cancro permanece a segunda causa principal de morte nos Estados Unidos, sendo responsável por aproximadamente 1 em cada quatro mortes. Embora estejam disponíveis numerosos tratamentos para vários cancros, muitas formas de cancro permanecem incuráveis, intratáveis e/ou tornam-se resistentes a terapêuticas padrão. Por exemplo, os tumores podem ser inoperáveis devido à sua localização ou podem metastizar, tornando difícil ou impossível tratar a doença. As terapêuticas atuais têm deficiências consideráveis. Por exemplo, a terapêutica por radiação pode causar danos às superfícies epiteliais, inchaço, infertilidade, fadiga, fibrose, perda de cabelo, secura e cancro. A quimioterapia pode induzir náusea, vómitos, diarreia, obstipação, anemia, desnutrição, perda de cabelo, perda de memória, depressão do sistema imunitário e, consequentemente, infeções e sépsis, hemorragia, neoplasmas secundários, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e ototoxicidade. Claramente, a necessidade de técnicas robustas para diagnosticar e tratar o cancro é manifesta.
Foi demonstrado que os vírus têm uma tremenda utilidade numa variedade de aplicações biomédicas. Muitas destas técnicas tiram partido da capacidade única dos vírus para entrar nas células com uma elevada eficiência. Algumas destas aplicações exploram a expressão e replicação génica virai para induzir a expressão de um gene heterólogo inserido. É bem conhecido que uma variedade de vírus distribuem e expressam genes nas células (sejam genes virais ou outros) , que podem ser úteis, por exemplo, na terapêutica génica, no desenvolvimento de vacinas ou na biologia do cancro.
Existe uma extensa literatura sobre a utilização de vetores virais, particularmente aqueles baseados em adenovirus, vírus adeno-associados (AAV), herpesvirus e retrovirus, para aumentar a potência da terapêutica antitumoral, contudo, estas metodologias são incipientes.
Nieland et al., Journal of Cellular Biochemistry 73:145-152 (1999), descrevem partículas idênticas a vírus de papilomavírus quiméricas que induzem uma resposta imunitária antitumoral protetora e terapêutica específica de auto-antigénio murina. Schiller e Lowry, Expert Opinion On Biological Therapy, vol. 1, n.° 4, 1 de julho de 2001 páginas 571-581, descrevem vacinas à base de partículas idênticas a papilomavírus. Cho et al., Cancer Letters 162 (2001) 75-85
descrevem a melhoria da transferência génica para linhas celulares de cancro do colo do útero utilizando agentes não virais. Touze e Coursaget, Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, N.° 5, 1317-1323, descrevem a transferência génica in vitro utilizando partículas idênticas a papilomavírus humano. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num aspeto, a invenção proporciona um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma que compreende um marcador detetável para utilização num método de deteção da presença de células cancerosas num indivíduo que tem, ou é suspeito de ter, células cancerosas; em que o dito método compreende: identificar um indivíduo que tem, ou é suspeito de ter, células cancerosas; administrar ao dito indivíduo uma quantidade detetável do dito pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma que compreende um marcador detetável e detetar a presença de células cancerosas ligadas ao dito pseudovirus de papiloma ou à dita VLP de papiloma que compreende um marcador detetável.
Noutro aspeto, a invenção proporciona uma composição que compreende um agente terapêutico formulado com um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização num método de tratamento de cancro através da inibição da proliferação de células cancerosas e/ou morte das células cancerosas sem inibição da proliferação e/ou morte das células normais num indivíduo identificado com um cancro, em que o dito agente terapêutico é citotóxico para uma célula cancerosa. A invenção é definida pelas reivindicações anexas.
Formas de realização da presente divulgação referem-se a métodos para a deteção da presença de células cancerosas, (por exemplo, uma célula tumoral), ligada a pelo menos um pseudovirus de papiloma (PsV) ou partícula idêntica a vírus (VLP) de papiloma. Algumas abordagens envolvem identificar um indivíduo que tem, ou é suspeito de ter, células cancerosas, administrar ao dito indivíduo uma quantidade detetável de um pseudovirus de papiloma ou uma VLP que compreende um marcador detetável, e detetar a presença ou ausência de células cancerosas ligadas ao pseudovirus de papiloma ou à VLP que compreende o marcador detetável. Em algumas formas de realização, o marcador está acoplado quimicamente ao pseudovirus ou VLP. Noutras formas de realização, é medida a presença, ausência, ou quantidade de pseudovirus ou VLP de papiloma ligada às células cancerosas e a presença, ausência ou quantidade de pseudovirus ou VLP de papiloma ligada a células normais. Emmais formas de realização, o pseudovirus compreende um gene que codifica um marcador (por exemplo, luciferase ou GFP). Outros marcadores, incluindo marcadores fluorescentes, radioativos ou quimiluminescentes, que podem ser incorporados ou acoplados ao PsV ou VLP, também estão contemplados para utilização com algumas formas de realização.
Formas de realização adicionais divulgadas no presente documento referem-se a métodos para monitorizar uma terapêutica para cancro num indivíduo incluindo identificar um indivíduo com cancro, proporcionar ao indivíduo uma terapêutica para cancro, administrar ao dito indivíduo uma quantidade detetável de um pseudovirus de papiloma ou uma VLP que compreende um marcador detetável e determinar a presença ou quantidade de PsV ou VLP ligada às células cancerosas no indivíduo depois, ou durante o curso do tratamento com a terapêutica para cancro. Através da utilização de inoculações sucessivas com PsV ou VLP marcados de forma fluorescente, por exemplo, pode ser avaliada a eficácia em tempo real da terapêutica particular ao longo do tempo. Em algumas formas de realização, o marcador está acoplado quimicamente ao pseudovirus ou VLP. Noutras formas de realização, é medida a presença ou quantidade de pseudovirus ou VLP de papiloma ligada às células cancerosas e a presença ou quantidade de pseudovirus ou VLP de papiloma ligada às células normais. Em algumas formas de realização, o pseudovirus inclui um gene que codifica o marcador ou, opcionalmente, um ácido nucleico terapêutico (por exemplo, um ácido nucleico oligo T).
Mais formas de realização divulgadas no presente documento referem-se a métodos para inibir de forma seletiva a proliferação de células cancerosas e/ou matar células cancerosas sem inibir a proliferação e/ou matar células normais incluindo identificar um indivíduo com um cancro e administrar ao indivíduo identificado uma quantidade inibidora de uma composição que compreende um pseudovirus ou VLP de papiloma e um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico está acoplado quimicamente ao pseudovirus ou VLP de papiloma. Noutras formas de realização, o agente terapêutico está incorporado dentro do pseudovirus ou VLP de papiloma. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico é uma toxina. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico compreende um ácido nucleico oligo T. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico compreende um radionuclídeo. Formas de realização adicionais divulgadas no presente documento referem-se a kits que incluem um pseudovirus ou VLP de papiloma, veículos farmacêuticos e instruções para utilização dos componentes do kit.
Consequentemente, aspetos da presente divulgação estão relacionados com métodos de deteção da presença de células cancerosas ligadas a um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma compreendendo identificar um indivíduo que tem, ou é suspeito de ter, células cancerosas; administrar ou proporcionar ao dito indivíduo uma quantidade detetável de um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma que compreende um marcador detetável; e detetar a presença de células cancerosas ligadas ao dito pseudovirus de papiloma ou à dita VLP de papiloma que compreende um marcador detetável. Em algumas formas de realização, o marcador está acoplado quimicamente ao dito pseudovirus ou VLP o o dito pseudovirus compreende um gene que codifica o dito marcador e emmais formas de realização é medida a presença ou quantidade do pseudovirus ou VLP ligada às ditas células cancerosas e a presença ou quantidade de pseudovirus ou VLP ligada a células normais. 0 marcador utilizado nestas formas de realização pode ser fluorescente, radioativo ou quimiluminescente ou detetável de outra forma.
Aspetos da presente divulgação também incluem métodos para a avaliação de uma terapêutica de cancro que compreende identificar um indivíduo com cancro; proporcionar ao dito indivíduo uma terapêutica para cancro; administrar ou proporcionar ao dito indivíduo uma quantidade detetável de um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma que compreende um marcador detetável; e determinar a presença ou quantidade do dito pseudovirus ou dita VLP ligada às células de cancro no dito indivíduo, antes de um tratamento com a dita terapêutica para cancro e durante ou depois de um período do dito tratamento. Em algumas formas de realização, o marcador está acoplado quimicamente ao dito pseudovirus ou à dita VLP ou o dito pseudovirus compreende um gene que codifica o dito marcador e em algumas formas de realização, é medida a presença ou quantidade do dito pseudovirus ou da dita VLP ligada às ditas células cancerosas e a presença ou quantidade do dito pseudovirus ou da dita VLP ligada às células normais. 0 marcador utilizado pode ser fluorescente, radioativo, quimiluminescente ou um marcador detetável de outra forma.
Aspetos da presente divulgação também incluem métodos para inibir a proliferação de células cancerosas e/ou matar células cancerosas sem inibir a proliferação e/ou matar células normais compreendendo identificar um indivíduo com um cancro; e administrar ou proporcionar ao dito indivíduo identificado uma composição que compreende um agente terapêutico formulado com um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico está acoplado quimicamente ao dito pseudovirus ou à dita VLP e noutras formas de realização o agente terapêutico está incorporado dentro do dito pseudovirus ou dita VLP. 0 agente terapêutico pode ser uma toxina, radionuclídeo, ganciclovir ou aciclovir, ou oligo T, preferentemente, oligo T, de número inferior ou igual a 200, 175, 150, 125, 100, 95, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ou 10 nucleótidos. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico é um ácido nucleico que expressa oligo T e o dito ácido nucleico está operativamente ligado a um promotor Pol III. Em algumas formas de realização, os métodos acima são utilizados para inibir, matar, avaliar ou diagnosticar o estado de um cancro que é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, linfoma, mieloma, plasmocitoma, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, cancro pancreático, cancro da mama, cancro ovárico, cancro da próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais hepatoma, carcinoma dos duetos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro do colo do útero, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, neuroglioma e retinoblastoma.
Ainda mais formas de realização incluem kits compreendendo urn pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma, um veículo farmacêutico, e instruções para a utilização dos componentes do kit e método para detetar a presença de cancro do colo do útero num indivíduo, compreendendo proporcionar ao dito indivíduo uma composição que compreende uma VLP de papiloma acoplada a ou contendo um marcador; remover VLPs não ligadas que compreendem o dito marcador; e detetar a presença de células de cancro ligadas à dita VLP que compreende o dito marcador.
Em algumas destas formas de realização, o marcador está acoplado quimicamente à dita VLP e em algumas formas de realização, é medida a presença ou quantidade da dita VLP ligada às ditas células cancerosas e a presença ou quantidade da dita VLP ligada às células normais. 0 marcador pode ser fluorescente, radioativo, quimiluminescente ou um marcador detetável de outra forma.
Aspetos da presente divulgação também incluem uma composição que compreende um ácido nucleico que compreende um domínio oligo T de pelo menos 10 e menos do que ou igual a 200 resíduos T consecutivos, tal como um domínio oligo T consistindo essencialmente em 45 nucleótidos ou um domínio oligo T que consiste em 45 nucleótidos. Estes ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos que codificam estas moléculas podem ser operativamente ligados ao promotor Pol III.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figs. la-ld. Efeitos da interrupção mecânica, N-9 e carragenina sobre a infeção por pseudovirus HPV16 da mucosa cervicovaginal de ratinho. Resultados obtidos por imagem multiespectral (representativos de duas ou três experiências separadas), expressos como um sinal médio por pixel, para ratinhos (seis por grupo) são indicados no eixo Y e géis utilizados para preparar o inoculo de pseudovirus são indicados no eixo X. 0 método de pré-tratamento é indicado pela chave. Barras de erro representam o erro padrão da média. (Fig. la) Comparação da potenciação da infeção por interrupção mecânica e química. (Fig. lb) Proteção proporcionada por carragenina quando misturada com o inoculo. (Fig. lc) Proteção proporcionada por lubrificantes de venda livre quando misturados com o inoculo. (Fig. ld) Proteção proporcionada por carragenina quando misturada com N-9 durante o pré-tratamento.
Fig. 2. Análise quantitativa da infeção do trato reprodutivo murino. Ratinhos tratados com conceptrol foram infetados de forma simulada (parte superior) ou desafiados com pseudovirus HPV-16-tdTomato (parte inferior). Depois de 3 d, todo o trato reprodutor foi extraído por dissecação e a parede ventral da vagina e do cérvix foi incisada sagitalmente. (Fig. 2a) Imagem de Composite Maestro (epitélio da mucosa virado para cima) com um algoritmo de desmistura (unmixing) aplicado. 0 sinal vermelho representa a localização de infeção em comparação com a autofluorescência de fundo. (Fig. 2b) Sinal de tdTomato desmisturado convertido para escala de cinzentos. A delineação do tecido denota a região de interesse (Region of Interest, ROI). (Fig. 2c) Análise de ImageJ. Foi calculado o sinal médio por pixel dentro da ROI. Fig. 3. 0 trato genital intacto do ratinho foi completamente resistente à infeção depois da deposição de 107 unidades infeciosas pseudovirais na vagina ou canal endocervical. Fig. 4. Cápsides de HPV acopladas a corante fluorescente verde não se ligaram ao epitélio escamoso nem ao simples gue reveste o trato reprodutivo do ratinho fêmea.
Fig. 5. As linhas celulares tumorais epiteliais foram permissivas para infeção com pseudovirus de HPV5 e 16. Fig. 6. Linhas celulares tumorais não epiteliais foram permissivas para infeção com pseudovirus de HPV5 e 16. Fig. 7. Desenho experimental para testar se os pseudovirus de papiloma infetam, preferentemente, células tumorais num modelo de metástase tumoral peritoneal SHIN3-dsr.
Fig. 8. 0 pseudovirus de HPV16 infeta de forma eficiente e seletiva células de cancro ovárico implantadas na membrana peritoneal conforme demonstrado pela obtenção de imagens por fluorescência multiespectral.
Fig. 9. Desenho experimental para testar se os pseudovirus de papiloma infetam, preferentemente, células tumorais num modelo de metástase tumoral peritoneal SK0V3.
Fig. 10. O pseudovirus de HPV16 infeta de forma eficiente e seletiva células de cancro ovárico implantadas na membrana peritoneal conforme demonstrado através da medição da atividade de luciferase.
Fig. 11. O pseudovirus de HPV16 infeta de forma eficiente e seletiva células de cancro ovárico implantadas na membrana peritoneal conforme demonstrado pela obtenção de imagens por fluorescência multiespectral.
Fig. 12. O pseudovirus de HPV16 infeta de forma eficiente e seletiva células de cancro ovárico implantadas na membrana peritoneal conforme demonstrado pela obtenção de imagens por fluorescência multiespectral.
Fig. 13. O pseudovirus HPV16 infeta de forma eficiente e seletiva metástates pulmonares conforme demonstrado pela obtenção de imagens por fluorescência multiespectral.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO É divulgada no presente documento a descoberta inesperada de que os pseudovirus e VLPs de papiloma se ligam seletivamente a e infetam células cancerosas mas não células normais. Sem se desejar estar ligado a qualquer teoria particular ou criar uma exceção desta forma, contempla-se que, em comparação com os vetores de transferência génica virai atuais, os pseudovirus de papiloma e VLPs oferecem, de forma inesperada, muitos benefícios. Os pseudovirus de papiloma e VLPs não se envolverão na interação de competição com células normais, que podem prejudicar a distribuição eficaz dos vetores virais às células cancerosas. A incapacidade dos pseudovirus de papiloma e VLPs para se ligarem a células normais em tecidos intactos (por exemplo, não transformados ou não cancerosos) também minimizará a citotoxicidade do tratamento. Adicionalmente, dado que os pseudovirus ou VLPs matam, preferentemente, células cancerosas, eles induzirão, preferentemente, uma resposta imunitária contra as células cancerosas. Por último, pseudovirus e/ou VLPs para muitos tipos de papilomavírus podem ser rapidamente gerados e os anticorpos neutralizantes de papilomavírus são restritos de tipo. Consequentemente, a inibição mediada por anticorpos neutralizantes e o reforço com pseudovirus ou VLP de papiloma homólogos podem ser superados através da utilização de pseudovirus ou VLP de papiloma de outro tipo.
Conforme descrito no presente documento, pretende-se que, onde seja fornecido um intervalo de valores, se entenda que cada valor interveniente, até à décima da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente indique o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nesse intervalo estabelecido está abrangido dentro das formas de realização. Também está englobado nas formas de realização que os limites superior e inferior destes intervalos mais pequenos possam independentemente ser incluídos nos limites mais pequenos, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo estabelecido. Onde o intervalo estabelecido inclui um ou ambos os limites, intervalos que excluam um ou ambos daqueles limites incluídos estão também incluídos nas formas de realização. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento possuem o mesmo significado como habitualmente entendido por um perito na especialidade ao qual as formas de realização pertencem. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalente àqueles descritos no presente documento possam também ser utilizados na prática ou testagem das formas de realização, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas no presente documento destinam-se a divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas.
As publicações discutidas no presente documento são proporcionadas apenas pela sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada no presente documento deve ser considerado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de antedatar tal publicação por virtude de invenção anterior. Adicionalmente, as datas de publicação proporcionadas podem ser diferentes das datas de publicação atuais que podem ter de ser independentemente confirmadas.
Deve ser notado que, conforme utilizado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "uma/um" e "o/a" incluem referentes plurais a não ser que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, referência a "um método" inclui uma pluralidade de tais métodos e referência a "uma dose" inclui referência a uma ou mais doses e equivalentes dos mesmos conhecidos para os peritos na especialidade, e assim por diante.
Em alguns contextos, os termos "indivíduo", "hospedeiro", "sujeito" e "paciente" são utilizados indistintamente para referir-se a um animal que é o objeto de tratamento, observação e/ou experiência. "Animal" inclui vertebrados e invertebrados, tais como peixe, marisco, répteis, aves, e, em particular, mamíferos. "Mamífero" inclui, sem limitação, ratinhos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, cães, gatos, ovelhas, cabras, vacas, cavalos, primatas, tais como macacos, chimpanzés, e símios, e, em particular, seres humanos.
Em alguns contextos, os termos "melhorar", "tratar", "tratamento", "terapêutica" ou "terapia" não significam necessariamente a cura ou abolição total da doença ou condição. Qualquer alívio de quaisquer sinais ou sintomas indesejados de uma doença ou condição, em qualquer medida, pode ser considerado uma melhoria e, em alguns aspetos, um tratamento e/ou terapêutica. Além disso, o tratamento pode incluir atos que podem piorar o sentimento geral de bem-estar ou aspeto do paciente. 0 termo "quantidade/dose terapeuticamente eficaz" ou "quantidade inibitória" é utilizado para indicar uma quantidade de um composto ativo, ou agente farmacêutico, que desencadeia uma resposta biológica ou medicinal. Esta resposta pode ocorrer num tecido, sistema, animal ou ser humano e inclui o alívio dos sintomas da doença que está a ser tratada. Conforme utilizado no presente documento, em relação aos vetores pseudovirais da invenção, o termo "quantidade/dose terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade/dose de um vetor ou composição farmacêutica que contém o vetor que é suficiente para produzir uma resposta antitumoral eficaz após a administração ao indivíduo. 0 termo "ácidos nucleicos", conforme utilizado no presente documento, pode ser ADN ou ARN. Ácidos nucleicos também podem incluir nucleótidos modificados que permitem uma leitura correta por uma polimerase e não alteram a expressão de um polipéptido codificado por esse ácido nucleico. Os termos "ácido nucleico" e "oligonucleótido" são utilizados indistintamente para referir-se a uma molécula que compreende múltiplos nucleótidos. Conforme utilizados no presente documento, os termos referem-se a oligorribonucleótidos bem como a oligodesoxirribonucleótidos. Os termos também devem incluir polinucleósidos (ou seja, um polinucleótido menos o fosfato) e qualquer outro polímero contendo uma base orgânica. Ácidos nucleicos incluem vetores, por exemplo, plasmídeos, bem como oligonucleótidos. Moléculas de ácidos nucleicos podem ser obtidas a partir de fontes de ácidos nucleicos existentes, mas são preferentemente sintéticas (por exemplo, produzidas pela síntese de oligonucleótidos). A frase "sequência de nucleótidos" inclui tanto as cadeias de sentido como de antissentido como cadeias simples individuais ou no dúplex. A frase "sequência de ácidos nucleicos que codifica" refere-se a um ácido nucleico que direciona a expressão de uma proteína ou péptido específico. As sequências de ácidos nucleicos incluem ambas a sequência de cadeia de ADN que é transcrita em ARN e a sequência de ARN que é traduzida em proteína. As sequências de ácidos nucleicos incluem ambas as sequências de ácidos nucleicos de comprimento completo e as sequências não de comprimento completo a partir das sequências de comprimento completo. Estando adicionalmente entendido que a sequência inclui os codões degenerados da sequência ou sequências nativas que podem ser introduzidos para proporcionar uma preferência de codões numa célula hospedeira específica.
Por "ADN" entende-se uma forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina, ou citosina) sob a forma de cadeia dupla ou cadeia simples, seja relaxada ou super-enrolada. Este termo refere-se à estrutura primária e secundária da molécula, e não a limita a quaisquer formas terciárias particulares. Assim, este termo inclui ADN de cadeia simples ou dupla encontrada, inter alia, em moléculas de ADN lineares (por exemplo, fragmentos de restrição), vírus, plasmídeos e cromossomas. Na discussão da estrutura de moléculas de ADN particulares, as sequências podem ser descritas no presente documento de acordo com a convenção normal de fornecer apenas a sequência na direção 5' para 3' ao longo da cadeia de ADN não transcrita (ou seja, a cadeia que tem a sequência homóloga ao ARNm). 0 termo captura moléculas que incluem as quatro bases adenina, guanina, timina ou citosina, bem como moléculas que incluem análogos de base que são conhecidos na técnica.
Um "gene" ou "sequência de codificação" ou uma sequência, que "codifica" uma proteína particular, é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (no caso de ADN) e traduzida (no caso de ARNm) num polipéptido in vitro ou in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras ou de controlo apropriadas. Os limites do gene são determinados por um codão de iniciação no terminal 5' (amino) e um codão de terminação no terminal 3' (carboxi). Pode ser incluído um gene, mas não está limitado a, ADNc a partir de ARNm procariótico ou eucariótico, sequências de ADN genómico a partir de ADN procariótico ou eucariótico, e mesmo sequências de ADN sintético. Uma sequência de terminação da transcrição estará, normalmente, localizada a 3' em relação à sequência do gene. 0 termo "elementos de controlo" refere-se coletivamente a regiões promotoras, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, domínios reguladores a montante, origens de replicação, sítios internos de entrada no ribossoma ("IRES"), potenciadores, e semelhantes, que coletivamente proporcionam a replicação, transcrição e tradução de uma sequência de codificação numa célula recetora. Estes elementos de controlo não têm de estar todos sempre presentes desde que a sequência de codificação selecionada seja capaz de ser replicada, transcrita e traduzida numa célula hospedeira apropriada. 0 termo "região promotora" é utilizado no presente documento no seu sentido comum para referir-se a uma região nucleotídica que compreende uma sequência regulatória de ADN, em que a sequência regulatória é derivada a partir de um gene que é capaz de se ligar a ARN polimerase e iniciar a transcrição de uma sequência de codificação a jusante (direção 3'). 0 termo "operativamente ligado" refere-se a um arranjo de elementos, em que os componentes assim descritos estão configurados de modo a realizar a sua função habitual. Assim, os elementos de controlo operativamente ligados a uma sequência de codificação são capazes de afetar a expressão da sequência de codificação. Os elementos de controlo não têm de ser contíguos com a sequência de codificação, desde que funcionem para direcionar a expressão da mesma. Assim, por exemplo, sequências intervenientes não traduzidas, mas transcritas, podem estar presentes entre uma sequência promotora e a sequência de codificação e a sequência promotora ainda pode ser considerada "operativamente ligada" à sequência de codificação.
Para a finalidade de descrição da posição relativa de sequências de nucleótidos numa molécula de ácido nucleico particular ao longo do presente pedido, tal como quando uma sequência de nucleótidos particular é descrita como estando situada "a montante", "a jusante", "5'" ou "3'" em relação a outra sequência, deve ser entendido que é a posição das sequências na cadeia não transcrita de uma molécula de ADN que está a ser referida como é convencional na técnica. 0 termo "homologia" refere-se à percentagem de identidade entre dois polinucleótidos ou duas frações de polipéptido. A correspondência entre a sequência a partir de uma fração com outra pode ser determinada por técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser determinada através de uma comparação direta da informação de sequência entre duas moléculas de polipéptido pelo alinhamento da informação da sequência e utilizando programas informáticos prontamente disponíveis. Alternativamente, a homologia pode ser determinada através de hibridação de polinucleótidos sob condições, que foram duplexes estáveis entre regiões homólogas, seguido por digestão com nuclease(s) específica(s) de cadeia simples, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Duas sequências de ADN ou polipeptidicas são "substancialmente homólogas" uma da outra quando pelo menos cerca de 80 %, preferentemente pelo menos cerca de 90 %, e mais preferentemente pelo menos cerca de 95 % do nucleótidos ou aminoácidos correspondem ao longo de um comprimento definido das moléculas, conforme determinado utilizando os métodos acima.
Por "isolado", quando se faz referência a uma sequência de nucleótidos, entende-se que a molécula indicada está presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. Assim, uma "molécula de ácido nucleico isolada, que codifica um polipéptido particular", refere-se a uma molécula de ácido nucleico, que é substancialmente livre de outras moléculas de ácido nucleico que não codificam o polipéptido em questão; contudo, a molécula pode incluir algumas bases ou frações adicionais, que não afetam de forma deletéria as características básicas da composição.
Os termos "vetor", "vetor de clonagem", "vetor de expressão" e "vetor auxiliar" significam o veículo através do qual uma sequência de ADN ou ARN (por exemplo, um gene exógeno) pode ser introduzida numa células hospedeira, de modo a promover a expressão (por exemplo, transcrição e/ou tradução) da sequência introduzida. Os vetores incluem plasmídeos, fagos, vírus, pseudovirus, etc. Conforme utilizado no presente documento em relação aos vetores pseudovirais, o termo "vetor de expressão" é utilizado mais comumente para referência a um vetor que é capaz de infetar uma célula hospedeira, enquanto o termo "vetor auxiliar" é utilizado para referência a um vetor que é capaz de mediar o empacotamento adequado do "vetor de expressão" numa partícula idêntica a vírus. "Transferência génica" ou "distribuição génica" refere-se a métodos ou sistemas para inserir, de forma fiável, ADN exógeno em células hospedeiras.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "transfeção" entende-se como incluindo quaisquer meios, tais como, mas não limitados a, adsorção, microinjeção, eletroporação, lipofeção e semelhantes para introdução de uma molécula de ácido nucleico exógena numa célula hospedeira. 0 termo "transfetada" ou "transformada", quando utilizada para descrever uma célula, significa uma célula que contém uma molécula de ácido nucleico introduzida de forma exógena e/ou uma célula cuja composição genética foi alterada pela introdução de uma molécula de ácido nucleico exógena.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "tumor" refere-se a um tecido que compreende células transformadas que crescem de forma descontrolada. Um tumor pode ser benigno (tumor benigno) ou maligno (tumor ou cancro maligno). Tumores incluem leucemias, linfomas, mielomas, plasmocitomas, e semelhantes; e tumores sólidos. Exemplos de tumores sólidos que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem sarcomas e carcinomas tais como, mas não limitados a: fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, cancro pancreático, cancro da mama, cancro ovárico, cancro da próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais hepatoma, carcinoma dos duetos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro do colo do útero, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, neuroglioma e retinoblastoma. 0 termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de um intervalo de erro aceitável para o valor particular conforme determinado por um perito na especialidade, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, por exemplo, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca" pode significar dentro de 1 ou mais do que 1 desvios padrão, segundo a prática na técnica. Alternativamente, "cerca" pode significar um intervalo de até 20 %, preferentemente até 10 %, mais preferentemente até 5 %, e mais preferentemente ainda até 1 % de um dado valor. Alternativamente, particularmente em relação a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar uma ordem de grandeza, preferentemente dentro de 5 vezes, e mais preferentemente dentro de 2 vezes, de um valor. Quando valores particulares são descritos no pedido e reivindicações, a menos que seja indicado o contrário, deve ser assumido o termo "cerca" significando dentro de um intervalo de erro aceitável para o valor particular.
Conforme utilizado no presente documento, "veiculo" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antifúngicos e antibacterianos, agentes de retardamento de absorção e isotónicos, tampões, soluções de veículo, suspensões, coloides e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização nas composições terapêuticas é contemplada. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições. A frase "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou semelhantes indesejada quando administradas a um ser humano. A preparação de uma composição aquosa que contém uma proteína com um ingrediente ativo é bem compreendida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em líquidos anteriormente à injeção também podem ser preparadas.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "sequência ou gene heterólogo" significa uma sequência de ácidos nucleicos (ARN ou ADN), que não é encontrada naturalmente em associação com as sequências de ácidos nucleicos da molécula especificada, por exemplo, um genoma de papilomavírus. A secção abaixo proporciona um maior detalhe sobre algumas abordagens que podem ser utilizadas para preparar partículas idênticas a vírus e pseudovirus.
Preparação de partículas idênticas a vírus e pseudovirus 0 termo "partícula idêntica a vírus" ("VLP") refere-se a uma estrutura organizada que compreende matrizes ordenadas que se auto-organizam de uma ou mais proteínas da cápside virai que não incluem um genoma virai. Por exemplo, podem ser preparadas VLPs tendo apenas proteína da cápside de papilomavírus Ll, ou tendo ambas proteínas de cápside de Ll e L2 em conjunto. Os métodos utilizados para preparar partículas de cápside recombinantes para muitos papilomavírus são conhecidos na técnica. Algumas abordagens são descritas, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. N.° 2006/0269954. O termo "proteína recombinante" refere-se a uma proteína que é produzida utilizando técnicas de biologia molecular, por exemplo, tecnologia de ADN recombinante. Como um exemplo, "proteína recombinante" pode referir-se a uma proteína a partir de um ácido nucleico geneticamente manipulado, tal como uma "construção de ácido nucleico recombinante". Qualquer proteína, péptido ou polipéptido pode ser codificado por uma construção de ácido nucleico ou construção de ácido nucleico recombinante manipulada. O termo "expressão proteica" refere-se aos processos de transcrição e tradução de ácidos nucleicos para produção de polipéptidos.
Os "pseudovirus" ou "pseudovirus de papiloma" ou "vetores de transferência génica de papilomavírus" referem-se a uma ou mais proteínas da cápside de papilomavírus que montam e empacotam ácidos nucleicos heterólogos (por exemplo, ADN) com ou sem ácidos nucleicos virais (por exemplo, ADN) em partículas infeciosas. Os métodos utilizados para produzir pseudovirus de papiloma são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nos documentos de Patente U.S. N°s 6.599.739, 7.205.126 e 6.416.945; e em Buck e Thomspon, Production of Papillomavirus-Based Gene Transfer Vectors. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, dezembro de 2007. 0 termo "estrutura capsomérica" ou "cápside" ou "partícula de cápside" inclui VLPs e pseudovirus. A seguinte secção descreve algumas das formas de realização diagnósticas contempladas.
Diagnósticos
Algumas formas de realização divulgadas no presente documento referem-se a métodos para a deteção da presença de células cancerosas ligadas a pseudovirus ou VLP de papiloma de papiloma. Algumas abordagens envolvem identificar um indivíduo que tem, ou é suspeito de ter, células cancerosas, administrar ao dito indivíduo uma quantidade detetável de um pseudovirus de papiloma ou uma VLP que compreende um marcador detetável e detetar a presença de células cancerosas ligadas a um pseudovirus ou VLP de papiloma que compreende um marcador detetável.
Outras formas de realização divulgadas no presente documento referem-se a métodos para a deteção da presença de condições pré-malignas (por exemplo, displasia ou doença hiperproliferativa) . Algumas abordagens envolvem identificar um indivíduo que tem, ou é suspeito de ter, uma condição pré-maligna, administrar ao dito indivíduo uma quantidade detetável de um pseudovirus de papiloma ou uma VLP que compreende um marcador detetável e detetar a presença de células pré-malignas ligadas a um pseudovirus ou VLP de papiloma que compreende um marcador detetável.
Formas de realização divulgadas no presente documento referem-se a métodos para identificar todos os tipos de cancro, tumores, metástases e condições pré-malignas (por exemplo, displasia ou doença hiperproliferativa). Sem estar ligado a qualquer teoria particular, acredita-se que o pseudovirus ou VLP de papiloma se liga seletivamente a e distribui o marcador a células cancerosas sem ligação a células normais em tecidos intactos, onde o número de células normais em tecidos intactos ligadas ao pseudovirus ou VLP é inferior ou igual a 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0, 03 %, 0, 02 % ou 0, 01 % do número total de células ligadas pelo pseudovirus ou VLP. 0 marcador detetável pode ser um gene repórter carregado dentro do pseudovirus de papiloma ou um marcador acoplado quimicamente a uma proteína da cápside do pseudovirus ou VLP de papiloma.
Genes repórter
Uma vez que os vetores pseudovirais de papiloma são vetores de transferência génica, contempla-se que as células cancerosas sejam seletivamente marcadas com genes repórter que são incorporados no pseudovirus. Conforme utilizado no presente documento um "repórter" ou um "gene repórter" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de ser transcrita como ARNm quando operativamente ligada a um promotor, exceto que o termo "gene repórter" conforme utilizado no presente documento, não se destine a incluir sequências de papilomavírus de tipo selvagem. Genes repórter preferidos incluem luciferase (por exemplo, luciferase de pirilampo ou luciferase de Renilla), βgalactosidase, cloranfenicol acetil transferase (CAT), timidina quinase (TK) e proteínas fluorescentes (por exemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente amarela, proteína fluorescente azul, proteína fluorescente ciano, ou variantes das mesmas, incluindo variantes melhoradas).
Estes genes podem ser incorporados em pseudovirus de papiloma utilizando técnicas bem conhecidas para aqueles peritos na especialidade. Métodos adequados são descritos, por exemplo, em Buck e Thomspon, Production of Papillomavirus-Based Gene Transfer Vectors. Current Prolocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, dezembro de 2007, que é aqui expressamente incorporada no presente documento como referência na sua totalidade.
Qualquer sequência de ácidos nucleicos repórter pode ser utilizada como um gene repórter se for detetável por um ensaio de repórter. Ensaios de repórter incluem qualquer método conhecido para a deteção de uma sequência de ácidos nucleicos ou o seu produto proteico codificado, direta ou indiretamente. Ensaios de repórter podem ser levados a cabo in vitro ou in vivo. Por exemplo, um ensaio de repórter pode medir o nível de expressão ou atividade do gene repórter através da medição do nível de ARNm repórter, o nível de proteína repórter, ou a quantidade de atividade de proteína repórter. O nível de ARNm repórter pode ser medido, por exemplo, utilizando RT-PCR, coloração com brometo de etidio de um gel de ARN padrão, Northern blotting, extensão de iniciadores ou ensaio de proteção de nucleases. O nível de proteína repórter pode ser medido, por exemplo, utilizando quimiluminescência, análise por microscopia, coloração de Coomassie de um gel de SDS-PAGE, Western blot, dot blotting, slot blotting, ELISA, ou RIA. A atividade da proteína repórter pode ser medida utilizando um ensaio específico para o repórter que está a ser utilizado. Por exemplo, ensaios padrão para luciferase, CAT, B-galactosidase, ensaios de timidina quinase (TK) (incluindo varrimentos de corpo inteiro; veja-se Yu, Y. et ai. (2000) Nature Medicine 6:933-937 e Blasberg, R. (2002) J. Cereb. Blood Flow Metab. 22:1157-1164), e proteínas fluorescentes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um dispositivo de obtenção de imagens Maestro (CRi, Woburn, MA) pode ser utilizado para detetar a expressão de genes repórter. A presença do marcador pode ser detetada no indivíduo utilizando métodos conhecidos na técnica para um varrimento in vivo. Estes métodos dependem do tipo de marcador utilizado. Os peritos com experiência são capazes de determinar o método apropriado para a deteção de um marcador particular. Métodos e dispositivos que podem ser utilizados nos métodos diagnósticos da invenção incluem, mas não são limitados a, tomografia computadorizada (CT), varrimento de corpo inteiro como tomografia de emissão de positrões (PET), tomografia de emissão de fotão único (SPECT), obtenção de imagens por ressonância magnética (MRI), sonografia, quimiluminescência, e o sistema de obtenção de imagens in vivo Maestro™ (CRi, Inc.) . 0 varrimento in vivo pode ser realizado numa região local do indivíduo (por exemplo, pode ser feito o varrimento da área esofágica) ou pode ser realizado o varrimento de todo o corpo. Células cancerosas que expressam os marcadores genéticos distribuíudos como pseudovirus podem ser identificados conforme se segue: para o gene HSV-tk, pode ser administrada ao indivíduo 9- [ (4 [18F]fluoro-3-hidroximetilbutil)guanina (FHBG) radiomarcada, administrada por via intravenosa, cerca de 6000 mCi/kg de peso corporal do recetor, (comercialmente disponível a partir do PET Imaging Science Center, U. of South California). A expressão da atividade de HSV-tk em células cancerosas resulta na acumulação de FHBG radiomarcado e pode ser monitorizada por Tomografia de Emissão de Positrões (PET) . Células cancerosas que expressam GFP in vivo podem ser monitorizadas por exame microscópico de fluorescência de secções de tecido. Secções de tecido de células cancerosas que expressam Fluc ou Rluc podem ser monitorizadas por câmaras in vivo de Dispositivo de Carga Acoplada Arrefecida (CCD) (comercialmente disponíveis de Xenogen Corp., Alamenda,
Calif). A atividade de D2R pode ser identificada através da administração de 3-(2-[ 18F] fluoroetil) espiperona ([18F]FESP) e monitorizada por PET. A seguinte secção descreve exemplos de marcadores que podem ser quimicamente acoplados a pseudovirus ou VLPs e exemplos de métodos que podem ser utilizados para acoplar quimicamente marcadores a pseudovirus ou VLPs. Marcadores acoplados quimicamente
Algumas formas de realização também se referem a métodos para identificação de cancros, tumores, metástases e condições pré-malignas utilizando pseudovirus ou VLP de papilomas marcadas através de acoplamento químico. Marcadores acoplados quimicamente incluem, mas não são limitados a, corantes fluorescentes, substâncias fosforescentes, radionuclídeos e outras moléculas conhecidas na técnica que podem ser detetadas direta ou indiretamente.
Exemplos de corantes fluorescentes incluem, mas não são limitados a, 7-amino-actinomicina D, laranja de acridina, amarelo de acridina, corantes Alexa Fluor (Molecular Probes), auramina 0, corante de Auramina-rodamina, benzantrona, 9,10-Bis (feniletinil)antraceno, 5,12-Bis (feniletinil)naftaceno, CFDA-SE, CFSE, calceína, carboxifluoresceína, 1- Cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, 2- Cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, coumarina, cianina, DAPI, extintor de fluorescência, Dioc6, corantes DyLight Fluor (Thermo Fisher Scientific), brometo de etídio, fluoresceína, fura-2, éster de fura-2-acetoximetil, proteína fluorescente verde e derivados, corantes Hilyte Fluor (AnaSpec), corante Hoechst, amarelo da índia, luciferina, perileno, ficobilina, ficoeritrina, ficoeritrobilina, iodeto de propídio, piranina, rodamina, RiboGreen, rubreno, tris(batofenantrolina dissulfonato) ruténio (II), SYBR Green, estilbeno, sulforodamina 101, TSQ, Texas Red, umbeliferona, ou proteína fluorescente amarela.
Exemplos de substâncias fosforescentes incluem, mas não estão limitados a fósforo, antraceno, fluoreto de bário, germanato de bismuto, sulfito de cádmio, tungstato de cádmio, oxissulfito de gadolínio, brometo de lantânio, poliviniltolueno, scheelite, iodeto de sódio, estilbeno, aluminato de estrôncio, granada de ítrio e alumínio, seleneto de zinco ou sulfeto de zinco.
Exemplos de marcadores radioisotópicos adequados incluem, mas não são limitados a, 3H, 251I, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 186Re, 188Re ou 212Bi. Pseudovirus ou VLPs radiomarcados preferíveis são capazes de distribuir mais do que 6000 rads ao tumor e possuem afinidade suficiente de modo que a medula óssea do paciente não está exposta a mais do que 300 rads. Em algumas formas de realização, 100, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, ou 1000 rads às células cancerosas. Por exemplo, 1311 marcado acoplado à superfície de pseudovirus ou VLPs é um exemplo de um pseudovirus ou VLP marcado dentro do âmbito destas formas de realização. A utilização de pseudovirus ou VLPs marcados com 131I bem como outros pseudovirus ou VLPs radiomarcados, também está dentro do âmbito destas formas de realização . Os pseudovirus ou VLPs podem ser radiomarcados, por exemplo, pelo método Iodogen de acordo com métodos establecidos. A deteção pode ocorrer in vitro ou in vivo. Por exemplo, corantes fluorescentes (por exemplo, Alexa Fluor 488) podem ser acoplados aos pseudovirus através de métodos bem conhecidos na técnica (veja-se por exemplo, Buck e Thomspon, Production of Papillomavirus-Based Gene Transfer Vectors. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, dezembro de 2007).
Em algumas formas de realização, um composto de obtenção de imagens radioativo está acoplado quimicamente aos pseudovirus ou VLPs. Traçadores químicos radioativos que emitem radiação tais como raios gama podem ser acoplados aos pseudovirus ou VLPs para proporcionar informação de diagnóstico. No caso de camadas que encerram óxido de itrio, um emissor de positrões como 87Y pode ser adicionado para permitir a obtenção de imagens. No caso de fosfato de lantânio, existe uma variedade de emissores gama que podem ser utilizados para adicionar um componente de obtenção de imagens ao componente de tratamento.
Um marcador pode ser acoplado quimicamente diretamente ao pseudovirus ou VLP (por exemplo, sem um grupo de ligação) através de um grupo amino, um grupo sulfidrilo, um grupo hidroxilo ou um grupo carboxilo.
Em algumas formas de realização, um marcador é ligado ao pseudovirus ou VLP através de um grupo de ligação. 0 grupo de ligação pode ser qualquer grupo de ligação biocompativel, onde "biocompatível" indica que o composto ou grupo pode ser não tóxico e pode ser utilizado in vitro ou in vivo sem causar danos, moléstia, doença ou morte. 0 marcador pode ser ligado ao grupo de ligação, por exemplo, através de uma ligação de éter, uma ligação de éster, um ligação tiol ou uma ligação amida. Grupos de ligação biocompatíveis adequados incluem, mas não são limitados a, um grupo éster, um grupo amida, um grupo imida, um grupo carbamato, um grupo carboxilo, um grupo hidroxilo um hidrato de carbono, um grupo succinimida (incluindo, por exemplo, succinato de succinimidilo (SS), propionato de succinimidilo (SPA), butanoato de succinimidilo (SBA), carboximetilato de succinimidilo (SCM), succinamida de succinimidilo (SSA) ou N-hidroxi succinimida (NHS)), um grupo epóxido, um grupo oxicarbonilimidazol (incluindo, por exemplo, carbonildimidazol (CDI)), um grupo nitro fenilo (incluindo, por exemplo, carbonato de nitrofenilo (NPC) ou carbonato de triclorofenilo (TPC)), um grupo trisilato, um grupo aldeído, um grupo isocianato, um grupo vinilssulfona, um grupo tirosina, um grupo cisteína, um grupo histidina ou uma amina primária.
Marcadores acoplados quimicamente podem ser detetados utilizando qualquer dos métodos descritos para a deteção de genes repórter. Numa forma de realização, o pseudovirus ou VLP de papiloma é marcado com um radioisótopo e é detetado no paciente utilizando um instrumento cirúrgico responsivo a radiação (Thurston et al., documento de patente U.S. N.° 5.441.050) . Noutra forma de realização, o pseudovirus ou VLP de papiloma é marcado com um composto fluorescente e é detetado no paciente utilizando um instrumento de rastreio responsivo a fluorescência. Noutra forma de realização, o pseudovirus ou VLP de papiloma é marcado com um metal emissor de positrões e é detetado no paciente utilizando tomografia de emissão de positrões. Ainda noutra forma de realização, o pseudovirus ou VLP de papiloma é marcado com um marcador paramagnético e é detetado num paciente utilizando obtenção de imagens por ressonância magnética (MRI). A seguinte secção proporciona um maior detalhe sobre algumas formas de realização que podem ser utilizadas para monitorizar a terapêutica para cancro. Monitorização da terapêutica para cancro A frase "monitorização de terapêutica para cancro" refere-se a determinar a quantidade relativa de células de cancro no corpo de um paciente antes, durante e/ou depois da terapêutica anti-cancro.
Algumas formas de realização divulgadas no presente documento referem-se a métodos para monitorizar o progresso ou eficácia da terapêutica para o cancro num indivíduo. Indivíduos identificados como tendo cancro e que estão a passar por terapêutica para cancro podem ser administrados com pseudovirus de papilomavírus ou VLP incluindo marcadores como descrito acima.
Os indivíduos podem ser administrados com um pseudovirus ou VLP de papiloma que inclui um marcador antes do início do tratamento ou durante o tratamento. Células contendo o marcador podem ser testadas e esta medida pode ser comparada com uma obtida num momento subsequente durante a terapêutica e/ou depois da terapêutica estar concluída. Desta maneira, é possível avaliar a inibição da proliferação das células cancerosas, e a eficácia da terapêutica. Uma vez que apenas as células cancerosas vivas conterão o marcador, a terapêutica pode continuar até que seja detetada uma quantidade minima de marcador.
Algumas formas de deteção divulgadas no presente documento também se referem a métodos para determinar a quantidade de células cancerosas presentes num indivíduo. Através da deteção do marcador, é possível determinar se as células de cancro estão presentes no indivíduo e a quantidade de marcador medido é proporcional à quantidade de células cancerosas presentes no indivíduo.
Kits diagnósticos e terapêuticos
Algumas formas de realização inlcuem métodos que utilizam os pseudovirus ou VLPs em kits para a deteção e/ou tratamento de tumores . Os kits baseiam-se na especificidade melhorada para pseudovirus ou VLPs para células cancerosas em vez de para células não cancerosas.
Os kits de diagnóstico podem compreender uma quantidade eficaz de um pseudovirus ou VLP de papiloma marcado. Os kits podem compreender adicionalmente uma quantidade apropriada de células de controlo não cancerosas. 0 pseudovirus, VLP e/ou células podem ser fornecidas congeladas, liofilizadas ou crescendo sobre meio sólido ou líquido. Os kits de diagnóstico podem compreender adicionalmente ingredientes inertes e outros componentes de kit como frascos, aplicadores, componentes de embalagem e semelhantes, que são conhecidos para os peritos na especialidade.
Numa forma de realização, pode ser montado um kit para a deteção diagnóstica de cancro do colo do útero. 0 kit pode incluir um pseudovirus ou VLP de papiloma incluindo um marcador (por exemplo, um marcador fluorescente) . 0 pseudovirus ou VLP pode estar presente no kit num meio líquido que pode ser aspirado para dentro da mucosa cervicovaginal de um indivíduo. Depois de um período de incubação para permitir que o pseudovirus ou VLP se ligue seletivamente a células cancerosas suspeitas, a mucosa cervicovaginal pode ser lavada para remover o excesso de pseudovirus ou VLP não ligado. Subsequentemente, um dispositivo de deteção (por exemplo, um dispositivo de deteção fluorescente) pode ser utilizado para detetar e/ou medir o marcador incluido no pseudovirus ou VLP. A deteção de marcador irá indicar a presença de células cancerosas. Aplicações biomédicas
Formas de realização divulgadas no presente documento também se referem a métodos para inibir seletivamente a proliferação de células cancerosas (ou células pré-malignas) e/ou matar células cancerosas) sem inibir a proliferação de e/ou matar células normais. Em algumas formas de realização, um indivíduo que tem cancro é identificado utilizando técnicas clinicas ou de diagnóstico conhecidas na técnica. É depois proporcionada ao indivíduo uma quantidade inibitória de pseudovirus ou VLP de papiloma que inclui um agente terapêutico. Dado que o pseudovirus ou VLP de papiloma se liga seletivamente a células cancerosas, pode ser proporcionada uma terapêutica para cancro focada e sensível. Em algumas formas de realização, uma condição pré-maligna pode ser tratada utilizando os métodos divulgados no presente documento.
Em alguns contextos, a frase "inibindo de forma seletiva" ou "inibição específica" indica que a quantidade de células normais que exibem uma inibição da proliferação ou são mortas é inferior que ou igual a 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,001 %, 0,0001 %, 0,00001 %, ou 0 % do número total das células que foram colocadas em contacto com o pseudovirus ou VLP de papiloma ou num sítio de inoculação (por exemplo, um sítio de 1 cm2, 1 mm2, 1 pm2 ou 1 nm2) . Uma determinação de inibição específica, ligação especifica, ou inibição específica ou ligação seletiva de pseudovirus ou VLPs a células de cancro ou células pré-malignas pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica ou como descrito no presente documento (por exemplo, ensaios de ligação competitivos ou análises de Scatchard). Em alguns contextos, a ligação especifica, inibição especifica ou ligação seletiva ou inibição seletiva podem ser determinadas por simples observação, conforme mostrado no Exemplo 11.
Genes terapêuticos
Agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, genes terapêuticos, proteínas codificadas pelos genes terapêuticos, citotoxinas, e radionuclídeos. Os genes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, genes supressores de tumores, genes pró-apoptóticos, citocinas, enzimas, hormonas e genes imunomoduladores.
Um "gene terapêutico" refere-se a um gene que pode ser administrado a um indivíduo para o propósito de tratamento ou prevenção de uma doença. Por exemplo, um gene terapêutico pode ser um gene administrado a um indivíduo para tratamento de cancro. Exemplos de genes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, Rb, CFTR, pl6, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zacl, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF, timidina quinase, mda7, fus, interferão alfa, interferão beta, interferão gama, ADP, p53, ABL1, BLC1, BLC6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TALI, TCL3, YES, MADH4, RBI, TP53, WT1, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAIV, ApoE, RaplA, citosina desaminase, Fab, ScFv, BRCA2, zacl, ATM, HIC-1, DPC- 4, FHIT, PTEN, ING1, N0EY1, N0EY2, 0VCA1, MADR2, 53BP2, IRF-1, Rb, zacl, DBCCR-1, rks-3, COX-1, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, EIA, p300, VEGF, FGF, tromboespondina, BAI-1, GDAIF ou MCC.
Em determinadas formas de realização, o gene terapêutico pode ser um gene supressor de tumor. Um gene supressor de tumor refere-se a um gene que, quando presente numa célula, reduz a tumorigenicidade, malignidade, ou fenótipo hiperproliferativo da célula. Esta definição inclui ambas a sequência de ácidos nucleicos de comprimento completo do gene supressor de tumor, bem como sequências de comprimento não completo de qualquer comprimento derivadas a partir das sequências de comprimento completo. Estando adicionalmente entendido que a sequência inclui os codões degenerados da sequência ou sequências nativas que podem ser introduzidos para proporcionar uma preferência de codões numa célula hospedeira especifica.
Exemplos de ácidos nucleicos supressores de tumor dentro desta definição incluem, mas não estão limitados a, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, pl6, pl9, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, uteroglobina, Skp2, BRCA-1, BRCA- 2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MENl, MEN2, MTS1, NFl, NF2, VHL, WRN, WTl, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, scFV, MAC1, FCC, MCC, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta* (BLU) , Luca-1 (HYAL1) , Luca- 2 (HYAL2) , 123F2 (RASSFl) , 101F6, Gene 21 (NPRL2), ou um gene que codifica um polipéptido SEM A3 e FUS1. Outros genes supressores de tumor exemplificativos são descritos em bases de dados publicamente disponíveis de genes supressores de tumor. Ácidos nucleicos que codificam genes supressores de tumor, conforme discutido acima, incluem genes supressores de tumor, ou ácidos nucleicos derivados dos mesmos (por exemplo, ADNc, ARNc, ARNm, e subsequências dos mesmos que codificam fragmentos ativos das respetivas sequências de aminoácidos supressoras de tumor), bem como vetores que compreendem estas sequências. Um perito na especialidade estaria familiarizado com genes supressores de tumor que podem ser aplicados nas formas de realização.
Em determinadas formas de realização, o gene terapêutico pode ser um gene que induz a apoptose (ou seja, um gene pró-apoptótico). Uma "sequência de aminoácidos de genes pró-apoptóticos" refere-se a um polipéptido que, quando presente numa célula, induz ou promove a apoptose. A presente invenção contempla a inclusão de qualquer gene pró-apoptótico conhecido para os peritos na especialidade. Genes pró-apoptóticos exemplificativos incluem CD95, caspase-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PERP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK, BID e mda7. Um perito na especialidade estaria familiarizado com genes pró-aopotóticos, e outros tais genes não especificamente estabelecidos no presente documento que podem ser aplicados nos métodos e composições da presente invenção. 0 gene terapêutico pode também ser um gene que codifica uma citocina. 0 termo "citocina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população celular que atuam sobre outra células como como mediadores intracelulares. Uma "citocina" refere-se a um polipéptido que, quando presente numa célula, mantém alguma ou toda a função de uma citocina. Esta definição inclui sequências de comprimento completo bem como de comprimento não completo de qualquer comprimento derivadas a partir de sequências de comprimento completo. Estando adicionalmente compreendido, conforme discutido acima, que a sequência inclui os codões degenerados da sequência ou sequências nativas que podem ser introduzidos para proporcionar uma preferência de codões numa célula hospedeira específica.
Exemplos de tais citocinas incluem, mas não estão limitados a, linfocinas, monocinas, fatores de crescimento e hormonas polipeptídicas tradicionais. Incluídas entre as citocinas estão hormonas de crescimento tais como hormona de crescimento humana, N-metionil-hormona de crescimento humana e hormona do crescimento bovina; hormona da paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteícas tais como a hormona foilculo-estimulante (FSH), hormona estimulante da tiroide (TSH) e hormona luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; prostaglandina, fator de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio placentário, proteína OB; fator de necrose tumoral alfa e beta; substância de inibição muleriana; péptido associado a gonadotropina de ratinho; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO) ; fatores de crescimento nervoso tal como NGF-beta; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformante (TGFs) tais como TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento I e II semelhante a insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferões tais como interferão-alfa, beta e gama; fatores de estimulação de colónias (CS-Fs) tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de macrófagos granulócitos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL- 13, IL-14, IL-15 IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-24, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO ligando kit OU FLT-3.
Outros exemplos de genes terapêuticos incluem genes que codificam enzimas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, ACP desaturase, uma ACP hidroxilase, uma ADP-glucose piroforilase, uma ATPase, uma álcool desidrogenase, uma amilase, uma amiloglucosidase, uma catalase, uma celulase, uma ciclooxigenase, uma descarboxilase, uma dextrinase, uma esterase, uma ADN polimerase, uma ARN polimerase, uma hiluronano sintase uma galactosidase, uma glucanase, uma glucose oxidase, uma GTPase, uma helicase, uma hemicelulase, uma hialuronidase, uma integrase, uma invertase, uma isomerase, uma quinase, uma lactase, uma lipase, uma lipoxigenase, uma liase, uma lisozima, uma pectinesterase, uma peroxidase, uma fosfatase, uma fosfolipase, uma fosforilase, uma poligalacturonase, uma proteinase, uma peptidase, uma pulanase, uma recombinase, uma transcriptase reversa, uma topoisomerase, uma xilanase, um gene repórter, uma interleucina ou uma citocina.
Exemplos adicionais de genes terapêuticos incluem o gene que codifica carbamoilo sintetase I, ornitina transcarbamilase, arginosuccinato sintetase, arginosuccinato liase, arginase, fumarilacetoacetato hidrolase, fenilalanina hidroxilase, alfa-1 antitripsina, glucose-6-fosfatase, recetor de lipoproteína de baixa densidade, porfobilinogénio desaminase, fator IX, fator IX, cistationa beta-sintase, cetoácido de cadeia ramificada descarboxilase, albumina, isovaleril-CoA desidrogenase, propionilo CoA carboxilase, metil malonil CoA mutase, glutaril CoA desidrogenase, insulina, beta-glucosidase, piruvato carboxilase, fosforilase hepática, fosforilase quinase, glicina descarboxilase, proteína H, proteína T, ATPase transportadora de cobre da doença de Menkes, ATPase transportadora de cobre da doença de Wilson, citosina desaminase, hipoxantina-guanina fosforibosil-transferase, galactose-1-fosfato uridiltransferase, fenilalanina hidroxilase, glucocerbrosidase, esfingomielinase, alfa-L-iduronidase, glucose-6-fosfato desidrogenase, timidina quinase de HSV, ou timidina quinase humana.
Genes terapêuticos também incluem genes que codificam hormonas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam a hormona do crescimento, prolactina, lactogénio placentário, hormona luteinizante, hormona folículo-estimulante, gonadotropina coriónica, hormona estimulante da tiroide, leptina, adrenocorticotrofina, angiotensina I, angiotensina II, beta-endorfina, hormona estimulante de melanócitos beta, colecistoquinina, endotelina I, galanina, péptido inibitório gástrico, glucagão, insulina, lipotrofinas, neurofisinas, somatostatina, calcitonina, péptido relacionado com o gene da calcitonina, péptido relacionado com o gene da calcitonina beta, hipercalcemia de fator de malignidade, proteína relacionada com a hormona da paratiroide, péptido idêntico a glucagão, pancreastatina, péptido pancreático, péptido YY, PHM, secretina, péptido intestinal vasoativo, oxitocina, vasopressina, vasotocina, encefalinamida, metorfinamida, hormona estimulante de melanócitos alfa, fator natriurético atrial, amilina, componente amiloide P, hormona libertadora de corticotrofina, fator de libertação de hormona do crescimento, hormona de libertação de hormona luteinizante, neuropéptido Y, substância K, substância P, ou hormona de libertação de tirotrofina.
Um "ácido nucleico ou gene imunoestimulante" conforme utilizado no presente documento é qualquer ácido nucleico que contém um motivo ou cadeia principal imunoest imulante que induz uma resposta imunitária. A resposta imunitária pode ser caracterizada como, mas não está limitado a, uma resposta imunitária de tipo Thl ou uma resposta imunitária de tipo Th2. Tais respostas imunitárias são definidas pelos perfis de produção de citocinas e anticorpos que são desencadeadas pelas células imunitárias ativadas.
Exemplos dos genes imunomoduladores incluem quimiocinas, moléculas adesivas, citocinas, molécula coestimuladora, fatores de crescimento e moléculas recetoras. As quimiocinas incluem MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTEs, IL-8 e MCP-1. Exemplos das moléculas adesivas incluem construções da família da selectina, moléculas idênticas a mucina, construções da família da integrina, e construções da superfamília das imunoglobulinas. Exemplos das construções da família da selectina, incluem L-selectina, P-selectina e E-selectina. As moléculas idênticas a mucina são ligandos para as construções da família da selectina. Exemplos da molécula idêntica a mucina incluem CD34, GlyCAM-1, e MadCAM-1. Exemplos das construções da família da integrina incluem LFA-1, VLA-1, Mac-1 e pl50.95. Exemplos de construções da superfamília das imunoglobulinas incluem PECAM-1, ICAMs (ICAM-1, ICAM-2, e ICAM-3), CD2, e LFA- 3. Exemplos de citocina incluem mutantes de M-CSF, GM-CSF, G-CSF, CSF, IL-4, e IL-18 (incluindo a eliminação dos primeiros aproximadamente 35 resíduos de aminoácidos que estão presentes no precursor de uma proteína mas não estão presentes na proteína na forma madura). Exemplos de moléculas coestimuladoras incluem B71, B72, CD40 e ligandos de CD40 (CD40L) . Exemplos de fatores de crescimento incluem IL-7, fatores de crescimento nervoso, e um fator de crescimento endotelial vascular. Exemplos de moléculas recetoras incluem um produto de expressão de gene letal Fas, um recetor de fator de necrose tumoral, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3 TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 e DR6. As composições da presente invenção podem conter caspase (ICE).
Genes terapêuticos também incluem genes que codificam polipéptidos que são citotóxicos para as células cancerosas. Proteínas citotóxicas incluem, mas não estão limitadas a, ricina, toxina de tintureira, toxina A da difteria, saporina, gelonina, e exotoxina A de Pseudomonas.
Conforme será apreciado por parte dos peritos na especialidade, o termo "gene terapêutico" inclui sequências genómicas, sequências de ADNc, e segmentos génicos manipulados mais pequenos que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipéptidos, domínios, péptidos, proteínas de fusão e mutantes. A molécula de ácido nucleico que codifica um gene terapêutico pode compreendem uma sequência de ácidos nucleicos contígua de cerca de 5 até cerca de 12000 ou mais nucleótidos, nucleósidos ou pares de bases.
Agentes terapêuticos acoplados quimicamente
Formas de realização divulgadas no presente documento também se referem a métodos para inibição da proliferação de cancros, tumores e metástases utilizado pseudovirus ou VLPs de papiloma acoplados quimicamente a agentes terapêuticos. Agentes terapêuticos acoplados quimicamente incluem, mas não estão limitadas a, proteínas terapêuticas conforme descritas acima, citotoxinas e radionuclídeos.
Citotoxinas incluem, mas não estão limitadas a, ricina, toxina de tintureira, toxina A da difteria, saporina, gelonina, e exotoxina A de Pseudomonas.
Numa forma de realização os pseudovirus ou VLPs de papiloma podem ser acoplados a uma partícula de radionuclídeo. O pseudovirus ou VLP pode ligar-se a um sítio de ligação nas células cancerosas alvo, e o radionuclídeo pode administrar uma dose de radiação letal. A estratégia básica do tratamento com radionuclídeos consiste em que o acoplamento de um radionuclídeo ao pseudovirus ou VLP causa uma acumulação potenciada do radionuclídeo no sítio alvo. A acumulação do radionuclídeo no sítio alvo faz com que a terapêutica de radiação seja administrada perto do sítio alvo com um raio que se aproxima do comprimento de trajeto médio da partícula emitida.
Podem ser considerados para terapêutica vários radionuclídeos diferentes. A escolha de radionuclídeo toma em características físicas e químicas do radionuclídeo, incluindo semivida, propriedades de emissão de radiação, propriedades de radiomarcação, disponibilidade, distribuição e estabilidade in vivo. Radionuclídeos adequados possuem uma semivida suficientemente longa para a localização alvo, pouca ou nenhuma radiação gama, energia de partícula beta intermédia, produtos de desintegração estáveis, e fixação estável com um sistema de anticorpo. Muitos radionuclídeos emissores de partículas-β estão disponíveis. Estes incluem, por exemplo, ítrio-90 (90Y), iodo-131 (1311) , cobre-67 (67Cu) e rénio-186 (186Re) . Radionuclídeos emissores de partículas alfa (a) incluem astatina-211 (211At), e bismuto-212 (212Bi) . Os emissores alfa e beta são preferidos porque as ligações de percurso médio estão limitadas a dúzias de mm limitando, desta forma, o tratamento às proximidades imediatas do alvo. Partículas beta podem ser mais adequadas para tumores maiores devido ao maior comprimento de percurso médio da emissão beta. As partículas alfa possuem, geralmente, energias extremamente altas (maiores do que 5 MeV) e taxas de transferência de energia linear altas, que são úteis para administrar doses elevadas a uma área limitada.
Formas de realização divulgadas no presente documento referem-se a combinações de métodos diagnósticos e/ou terapêuticos descritos no presente documento. Por exemplo, podem ser construídos pseudovirus que compreendem um gene terapêutico e um radionuclídeo. Noutras formas de realização, podem ser construídos pseudovirus que compreendem ARN oligo T e um gene terapêutico.
Profármacos 0 termo "profármaco" conforme utilizado no presente documento refere-se a um fármaco que é inativo tal como se encontra e se torna ativo quando é quimicamente alterado no corpo por uma enzima metabolizadora de fármaco (por exemplo, derivados de purina e pirimidina utilizados como agentes quimioterapêuticos para o cancro) . Exemplos dos profármacos no presente documento preferentemente incluem ganciclovir, aciclovir, taxol, canfotecina, derivados do nucleósido guanina (por exemplo, A-5021) , e semelhantes. Um profármaco no presente documento preferível para a presente invenção é um profármaco que é convertido numa forma ativa através de um gene suicida contido num pseudovirus ou VLP de papiloma. 0 termo "gene suicida" conforme utilizado no presente documento refere-se a um gene que pode matar a célula na qual é expresso. De forma representativa, tal gene é um gene metabolicamente tóxico. Por exemplo, é aqui exemplificado um método para a introdução de um gene suicida incorporado numa construção de pseudovirus ou em células cancerosas para levá-las ao suicídio. Por exemplo, timidina quinase pode ser incorporada num pseudovirus ou VLP. ARN oligo T para indução da regressão tumoral
As vacinas terapêuticas antitumorais e terapêutica génica antitumoral produziram um sucesso clínico limitado, apesar de extensos esforços. Uma abordagem simples que fosse capaz de combinar as duas atividades poderia conduzir a uma terapêutica antitumoral mais eficaz. Para alcançar isto, foi construído um vetor de transferência génica que expressa ARN oligo T. Em algumas formas de realização, o ARN é expresso a partir de um promotor, por exemplo, um promotor Pol III, como parte de um pseudogenoma de papilomavírus depois da transdução de PsV. Este ARN não será poliadenilado mas formará um dúplex com as caudas de poli A de ARNms celulares. Os ARNs de cadeia dupla assim gerados podem conduzir a citotoxicidade através da ativação de apoptose e imunidade mediadas por PKR através da ativação de TLR 3. 0 tamanho pequeno e a função dupla desta cassete de expressão deixa em aberto a possibilidade de expressar outros genes no pseudogenoma de até 8 kb. Genes para o aumento da imunogenicidade, tais como GMCSF, ou citotoxicidade, tais como TK, poderiam ser cotransduzidos pelo PsV oligo T. PsVs oligo T não podem ser eficazmente produzidos na maioria das células uma vez que o oligo T seria gerado nas células produtoras de PsV e induziria, assim, a apoptose antes da montagem do PsV. Contudo, a linha 293 e linhas derivadas de 293, expressam ARNs VA a adenovirus, que interagem com PKR e impedem a sua ativação por ARNds. 0 PsV oligo T pode ser eficazmente produzido numa linha 293TT. Outras linhas celulares adequadas incluem aquelas que podem expressar ARNs VA 1 e antigénio T grande de SV40 tais como células 2 93FT (Invitrogen) . 0 pseudogenoma oligo T induziu citotoxicidade depois da introdução em linhas celulares que carecem de ARNs VA. 0 ácido nucleico oligo T pode ser menor ou igual a 200, 175, 150, 125, 100, 95, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ou 10 nucleótidos. Formulações
Formas de realização divulgadas no presente documento também se referem a métodos de administração de pseudovirus ou VLPs a um indivíduo de modo a estabelecer o contacto de células cancerosas com pseudovirus ou VLPs. As vias de administração podem variar com a localização e natureza do tumor, e incluem, por exemplo, intravascular, intradérmica, transdérmica, parentérica, intravenosa, intramusculares, intranasal, subcutânea, regional, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravesical, intratumoral, inalação, perfusão, lavagem, injeção direta, e administração e formulação oral. O termo "intravascular" é entendido como referindo-se à administração para dentro da vasculatura de um paciente, significando para o interior ou num vaso ou vasos do paciente. Em determinadas formas de realização, a administração pode ser para dentro de um vaso considerado como sendo uma veia (intravenosa), enquanto noutras a administração pode ser para dentro de um vaso considerado como sendo uma artéria. Veias incluem, mas não estão limitadas a, a veia jugular interna, uma veia periférica, uma veia coronária, uma veia hepática, a veia portal, veia safena maior, a veia pulmonar, veia cava superior, veia cava inferior, uma veia gástrica, uma veia esplénica, veia mesentérica inferior, veia mesentérica superior, veia cefálica, e/ou veia femoral. Artérias incluem, mas não estão limitadas a, artéria coronária, artéria pulmonar, artéria braquial, artéria carótida interna, arco aórtico, artéria femoral, artéria periférica e/ou artéria ciliar. Contempla-se que a administração pode ser através de ou a uma arteriola ou capilar. A injeção na vasculatura tumoral é especificamente contemplada para tumores discretos, sólidos e acessíveis. A administração local, regional ou sistémica também pode ser apropriada. Para tumores maiores do que cerca de 4 cm, o volume a ser administrado pode ser de cerca de 4-10 ml (preferentemente 10 ml) , enquanto para tumores menores do que cerca de 4 cm, pode ser utilizado um volume de cerca de 1-3 ml (preferentemente 3 ml) . Injeções múltiplas administradas como uma dose única compreendem volumes de cerca de 0,1 até cerca de 0,5 ml. Os pseudovirus ou VLPs podem, de forma vantajosa, ser colocados em contacto através da administração de injeções múltiplas ao tumor, espaçadas em intervalos de aproximadamente 1 cm.
No caso de intervenção cirúrgica, os pseudovirus ou VLPs podem ser administrados no pré-operatório, para tornar um tumor inoperável num objeto de resseção. Alternativamente, os pseudovirus ou VLPs podem ser administrados no momento da cirurgia, e/ou posteriormente, para tratamento de doença residual ou metastática. Por exemplo, um leito de tumor submetido a resseção pode ser injetado ou perfundido com uma formulação que compreende pseudovirus ou VLP que torna o pseudovirus ou VLP vantajosos para o tratamento de tumores. A perfusão pode ser continuada após a resseção, por exemplo, deixando um catéter implantado no local da cirurgia. Pode ser levado a cabo o tratamento pós-cirúrgico periódico. A administração continua também pode ser aplicada quando apropriado, por exemplo, quando um tumor é excisado e o leito do tumor é tratado para eliminação de doença residual microscópica. Tal perfusão continua pode ocorrer durante um período desde cerca de 1-2 horas, até cerca de 2-6 horas, até cerca de 6-12 horas, até cerca de 12-24 horas, até cerca de 1-2 dias, até cerca de 1-2 semanas ou mais, após o início do tratamento. De um modo geral, a dose da composição terapêutica através de perfusão contínua será equivalente aquela dada por uma injeção única ou injeções múltiplas, ajustada ao longo de um período de tempo durante o qual ocorre a perfusão.
Os regimes de tratamento também podem variar, e normalmente dependem do tipo de tumor, localização do tumor, progressão da doença e sáude e idade do paciente. Obviamente, determinados tipos de tumor necessitarão de um tratamento mais agressivo, enquanto ao mesmo tempo, determinados pacientes não podem tolerar protocolos mais desgastantes. 0 clínico será o mais indicado para tomar tais decisões com base na eficácia e toxicidade (se existir) conhecidas das formulações terapêuticas.
Em determinadas formas de realização, o tumor a ser tratado pode não ser, pelo menos inicialmente, passível de resseção. Tratamentos com as construções pseudovirais ou VLPs terapêuticas podem aumentar a possibilidade de resseção do tumor devido à diminuição nas margens ou através da eliminação de determinadas porções particularmente invasivas. Após os tratamentos, a resseção poderá ser possível. Tratamentos adicionais subsequentes à resseção podem servir para a eliminação de doença residual microscópica no local do tumor.
Um curso de tratamento típico, para um tumor primário ou para um leito de tumor pós-excisão, pode envolver múltiplas doses. 0 tratamento de tumores primários típico pode envolver uma aplicação de 6 doses ao longo de um período de duas semanas. 0 regime de duas semanas pode ser repetido uma, duas, três, quatro cinco, seis ou mais vezes. Durante um curso de tratamento, a necessidade de completar as dosagens planeadas pode ser reavaliada.
Os tratamentos podem incluir várias "doses unitárias". Dose unitária refere-se a uma dose que contém uma quantidade predeterminada da composição terapêutica. A quantidade a ser administrada, e a via e formulação particulares, encontram-se dentro da experiência dos peritos nas técnicas clinicas. Uma dose unitária não tem de ser administrada como uma injeção única mas podem compreender a infusão continua ao longo de um período de tempo estabelecido. Dose unitária na presente invenção pode convenientemente ser descrita em termos de unidades formadoras de placas (ufp) para uma construção virai. Doses unitárias variam desde 103, 10a, 105, ΙΟ6, ΙΟ7, 101, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ufp e superiores. Alternativamente, dependendo do tipo de pseudovirus e do título alcançável, serão administradas 1 a 100, 10 a 50, 100-1000, ou até cerca de 104, 105, ΙΟ6, ΙΟ7, 108, ΙΟ9, 1011, 1011, 1012, 1013, ΙΟ14, 1015 ou mais partículas pseudoinfeciosas ao paciente ou às células do paciente. Composições e formulações injetáveis A injeção de pseudovirus ou VLPs pode ser administrada por seringa ou qualquer outro método utilizado para injeção de uma solução, desde que o pseudovirus ou VLP possa passar através do calibre da agulha necessária para injeção. Um novo sistema de injeção sem agulha foi recentemente descrito (documento de patente U.S. N.° 5.846.233) tendo um bocal que define uma câmara de âmpola para reter a solução e um dispositivo de energia para empurrar a solução para fora do bocal para o sítio de administração, também foi descrito um sistema de seringa para utilização na terapêutica génica que permite injeções múltiplas de quantidades predeterminadas de uma solução, de forma precisa, a qualquer profundidade (documento de patente U.S. N.0 5.846.225).
Soluções dos compostos ativos como uma base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adeguadamente misturadas com um tensioativo, tal como hidroxipropilcelulose. Também podem ser preparadas dispersões em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e utilização, estas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de microrganismos. As formas farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis (documento de patente U.S. N.° 5.466.468). Em todos os casos a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista uma injeção fácil. Deve ser estável sob condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veiculo pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos, e/ou óleos vegetais. Uma fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula adequado no caso das dispersões e através da utilização de tensioativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser ocasionada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada através da utilização nas composições de agentes atrasando a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Para a administração parentérica numa solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido deve, em primeiro lugar, ser tornado isotónico com solução salina ou glucose suficiente.
Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratumoral e intraperitoneal. A este respeito, meios aquosos estéreis que podem ser empregues serão bem conhecidos para os peritos na especialidade à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCl isotónica e ser adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto, (veja-se, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580) . Ocorrerá necessariamente alguma variação na dosagem dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. A pessoa responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a dose apropriada para o sujeito individual. Além disso, para administração humana, as preparações deverão cumprir os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza tal como exigido pelo Office of Biologies standards da FDA.
Soluções estéreis injetáveis são preparadas através da incorporação dos compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização através de filtração. De um modo geral, as dispersões são preparadas através da incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação das soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo acrescido de qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução anteriormente filtrada estéril do mesmo.
As composições divulgadas no presente documento podem ser formuladas numa forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos tais como, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio, ou férrico, e tais bases inorgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes. Após a formulação, as soluções serão administradas de uma forma compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal como seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas farmacêuticas tais como soluções injetáveis, cápsulas de libertação de fármacos e semelhantes.
Os seguintes exemplos proporcionam ilustrações de algumas das formas de realização descritas no presente documento mas não se destinam a limitar a invenção. EXEMPLO 1 A transmissão genital de HPV num modelo de ratinho é potenciada por nonoxinol-9 e inibida por carragenina
Um modelo de ratinho de infeção cervicovaginal com HPV16 que recapitula a fase de estabelecimento da infeção de papilomavírus foi desenvolvido conforme se segue.
Ratinhos BALB/cAnNCr de seis a oito semanas de idade, fêmeas foram obtidos a partir do National Institutes of Health e alojados e manipulados de acordo com as suas orientações. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo National Cancer Institute's Animal Care and Use Committee. Amenos que indicado o contrário, todos os ratinhos receberam 3 mg de Depo-Provera (Pfizer) diluído em 100 μΐ de PBS estéril numa injeção subcutânea, 4 dias antes do desafio com pseudovirus.
Para o desafio vaginal, ratinhos designados para o pré-tratamento N-9 receberam 50 μΐ do composto contendo N-9 por via intravaginal 6 horas antes da inoculação intravaginal com pseudovirus. 0 material foi administrado com uma pipeta de deslocamento positivo M50 (Gilson), e umas pinças de disseção convencionais foram usadas para ocluir o canal vaginal para atingir uma retenção máxima do material. Ratinhos designados para perturbação mecânica foram submetidos a um procedimento em conjunto com a inoculação de pseudovirus no qual um coletor de células Cytobrush (Cooper-Surgical) foi inserido na vagina e girado no sentido horário girou e anti-horário 10 vezes. O inoculo de pseudovirus foi uma dose de 20 μΐ composta por 5 μΐ de pseudovirus purificado com um titulo de -5 x 109 Ul/ml misturado com 15 μΐ de uma preparação de carboximetilcelulose (CMC) a 3 %, com a exceção de algumas experiências, nas quais 5 ml de inoculo foram misturados com 5 μΐ da preparação indicada, ou nas quais 15 μΐ de inoculo foram misturados com 5 μΐ de CMC a 4 %. Nos ratinhos pré-tratados com N-9, esta dose foi administrada como uma inoculação única, não traumática, intravaginal utilizando uma pipeta de deslocamento positivo M20. Nos ratinhos tratados com Cytobrush, o inoculo foi administrado em duas doses, 10 μΐ antes e 10 μΐ depois do tratamento com Cytobrush, utilizando uma pipeta de deslocamento positivo M20. A menos que indicado o contrário, o trato reprodutivo foi recolhido no dia 3 após o desafio, depois de que os ratinhos tenham sido submetidos a eutanásia através de inalação de CO2. Para o desafio endocervical, o canal endocervical foi pré-tratado através de instilação direta de 15 μΐ de CMC a 1 % ou 15 μΐ de CMC a 1 % com N-9 a 4 %. Seis horas depois do pré-tratamento, 7 μΐ (-1,4 x 107 UI) de pseudovirus misturados com 7 μΐ de CMC a 1 % foram também depositados diretamente no canal endocervical.
Os resultados destes testes iniciais mostraram que o modelo de ratinho de infeção cervicovaginal com HPV16 recapitulou de forma bem-sucedida a fase de estabelecimento da infeção por papilomavirus. No seguinte exemplo, foram avaliados os efeitos de nonoxinol-9 e carragenina no modelo de ratinho. EXEMPLO 2 A transmissão genital de HPV num modelo de ratinho é potenciada por nonoxinol-9 e inibida por carragenina
Foi investigada a capacidade dos pseudovirus para infetar células mecanicamente danificadas, células tratadas com nonoxinol-9 e células tratadas com carragenina. Os detalhes desta experiência são conforme se segue. A abrasão mecânica suave do epitélio genital com um coletor de células Cytobrush permitiu níveis detetáveis de infeção por pseudovirus. Também foi determinado se a perturbação química do epitélio genital poderia promover a infeção. 0 N-9 é um tensioativo não iónico, ativo de membrana que é amplamente utilizado como um espermicida e é conhecido por perturbar a arquitetura normal do epitélio genital animal e humano. Uma formulação de carboximetilcelulose (CMC) a 3 % designada para imitar a viscosidade de um gel lubrificante vaginal típico foi feita com e sem N-9 a 4 %. Os géis foram instilados na vagina 6 horas antes dos ratinhos serem inoculados com pseudovirus por via intravaginal. Os ratinhos pré-tratados com CMC apenas não estavam infetados de forma detetável, enquanto aqueles pré-tratados com Cytobrush ou com CMC e N-9 eram altamente suscetíveis à infeção (P = 0, 05, 0,003, respetivamente) (Fig. la) . Com efeito, a intensidade de sinal repórter no último grupo foi em média cinco vezes mais forte do que o sinal relacionado com infeção induzido pelo tratamento com Cytobrush (P = 0,008). Conceptrol, um espermicida baseado em CMC de venda livre, que contém N-9 a 4 %, também sensibilizou o trato genital á infeção por pseudovirus num maior grau do que aquele do tratamento com Cytobrush (P = 0,02).
Uma ampla variedade de tipos de HPV genital podem ser potencialmente inibidor in vitro pela carragenina, um polissacarídeo económico cujas propriedades de gelificação conduziram à sua incorporação em alguns lubrificantes vaginais de venda livre. Para testar se a carragenina pode bloquear a infeciosidade in vivo, ratinhos foram desafiados com pseudovirus de HPV16 pré-misturados a 1:1 com t-carragenina a 1 % ou uma preparação de CMC a 3 % para controlar a viscosidade da preparação de carragenina. A carragenina impediu a infeção na mucosa genital tornada suscetível a infeção por perturbação mecâninca (Cytobrush) ou perturbação guímica (N-9) (Fig. lb). Dois lubrificantes comerciais contendo carragenina (Divine N.0 9 e BlOglide) que demonstraram uma forte atividade inibitória num ensaio de pseudovirus in vitro impediram, de forma semelhante, a infeção detetável in vitro (Fig. lc) . Para imitar de forma mais aproximada as condições sob as quais a carragenina pode ser utilizada na prática comum como um microbicida tópico para prevenir a transmissão de HPV genital, N-9 em carragenina ou N-9 em gel de CMC de controlo foram aplicados por via intravaginal 6 horas antes do desafio com pseudovirus. Conforme esperado, o gel à base de CMC contendo N-9 tornou a mucosa suscetível a infeção por pseudovirus de HPV significante (P = 0,03), enquanto o gel à base de carragenina impediu a infeção detetável (Fig. ld) . Quando cada uma das condições de carragenina foram comparadas com os controlos negativos, os valores de P foram > 0,1.
As experiências anteriores demonstram que a perturbação mecânica permite a infeção por PsV, o tratamento com N-9 potência a infeção, e o tratamento com carragenina inibe a infeção. O exemplo abaixo demonstra um método que pode ser utilizado para acoplar um marcador a um pseudovirus. EXEMPLO 3
Acoplamento de corante Alexa Fluor 488 a pseudoviriões O acoplamento do corante Alexa Fluor 488 aos pseudoviriões de HPV16-RFP foi realizado de acordo com as instruções do fabricante para a marcação proteica (A10235, Molecular Probes). As cápsides acopladas com corante foram purificadas por filtração em gel sobre uma coluna de esferas de agarose de 50 a 150 pm a 2 % (Agarose Bead Technologies). A retitulação da preparação de pseudovirião conjugado com corante confirmou que a sua infeciosidade permaneceu comparável com aquela de pseudovirus não marcados. A experiência anterior mostra que os marcadores podem ser acoplados de forma bem-sucedida com pseudovirus e a infeciosidade dos pseudovirus marcados é comparável com aquela de pseudovirus não marcados. 0 seguinte exemplo demonstra uma técnica para a obtenção de imagens de marcadores acoplados a, ou expressos em pseudovirus. EXEMPLO 4
Obtenção de imagens por fluorescência multiespectral e análise estatística
Para gerar um ensaio mais quantitativo para a infeção cervicovaginal, foi desenvolvido um método para a medição da expressão de gene repórter total em amostras de tecidos inteiros utilizando um dispositivo de obtenção de imagens por fluorescência multiespectral. Para estas análises, avaliou-se a vagina e cérvix completos dos ratinhos quanto à expressão do gene repórter, o que gerou dados sobre a distribuição e intensidade da infeção e a intensidade média por pixel, permitindo assim a comparação quantitativa entre amostras (Fig. 2). 0 trato reprodutivo de cada ratinho, desde os genitais externos até à metade inferior dos cornos uterinos, foi excisado e armazenado em PBS em gelo durante <6 horas antes da obtenção das imagens. Um dispositivo de obtenção de imagens Maestro (CRi, Woburn, MA) com um filtro de excitação verde e um filtro de emissão de alta passagem de 580 nm foi utilizado para obter imagens desde 550 nm a 9,00 nm em incrementos de comprimento de onda de 10 nm. Utilizando a assinatura espectral de RFP em tecidos infetados como um sinal e a autofluorescência de fundo em tecidos não infetados como ruido, foi aplicado um algoritmo de desmistura espectral às imagens compostas para determinar a intensidade e localização de infeção. O software de fonte aberta Image J, disponível online, foi utilizado para calcular o sinal médio por pixel numa região de interesse (ROI) na representação de escala de cinzentos de sinal desmisturado. A média dos números assim gerados representa o resultado de cada condição experimental particular. Em alguns casos, para determinar se a diferença entre estas médias foi estatisticamente significativa, foi realizado um teste-t de Student não emparelhado e os resultados foram relatados no texto como um valor de P.
Ratinhos tratados com conceptrol foram infetados de forma simulada ou desafiados com pseudovirus HPV-16-tdTomato. Após 3 dias, todo o trato reprodutor foi extraído por dissecação e a parede ventral da vagina e do cérvix foi incisada sagitalmente. Foi aplicada uma imagem Composite Maestro com algoritmo de desmistura. 0 sinal vermelho representou a localização de infeção em comparação com a autofluorescência de fundo. 0 sinal de td-Tomato desmisturado foi convertido para escala de cinzentos. Análise de ImageJ. Foi calculado o sinal médio por pixel dentro da ROI. Para ratinhos tratados de forma simulada, a área ROI foi de 3,3 X 107 e o sinal médio por pixel foi de 21,4. Para ratinhos desafiados com pseudovirus, a área ROI foi de 3,5 X 107 e o sinal médio por pixel foi de 1316,1. EXEMPLO 5 A mucosa cervicovaginal intacta é resistente à infeção por HPV (Métodos do exemplo de N-9/carragenina)
PsV com proteína fluorescente vermelha (RFP) foi utilizada para estudar a infeção por papilomavírus do trato genital de ratinho. Surpreendentemente, verificou-se gue o trato genital intacto do ratinho foi completamente resistente à infeção depois da deposição de 107 unidades infeciosas na vagina ou canal endocervical. (Fig. 3) De forma ainda mais surpreendente, o vírus acoplado a corante fluorescente verde não se ligou ao epitélio escamoso nem ao simples que reveste o trato reprodutivo feminino. (Fig. 4) EXEMPLO 6
Os pseudovirus de HPV não infetam o tecido normal intacto
Pseudoviriões de HPV16 contendo o plasmídeo que expressa RFp (aproximadamente 108 unidades infeciosas de cultura de tecidos) foram administrados de forma não traumática sobre as seguintes superfícies teciduais: mucosa orofaríngica, língua, intestino delgado, intestino grosso, canal anal, conjuntiva ocular, traqueia, brônquios, peritoneu parietal, serosa do trato gastrointestinal, mesentério do trato gastrointestinal, fígado, baço, bexiga, útero, ovários, pele externa e parênquima pulmonar. A infeção, conforme avaliada por fluorescência vermelha utilizando microscopia confocal, apenas foi observada no parênquima pulmonar. 0 seguinte exemplo demonstra que os pseudovirus infetam linhas celulares cancerosas de forma seletiva. EXEMPLO 7
Os pseudovirus de HPV infetam muitas linhas celulares derivadas de tumores humanos
Um painel de 59 linhas celulares tumorais humanas foi obtido do National Cancer Institute's Developmental Therapeutics Program (DTP) In Vitro Cell Line Screening Pro ject (IVCLSP), para a finalidade de testar a capacidade de serem infetadas por pseudovirus de HPV (Figs. 5 e 6) . Os pseudoviriões de HPV5 e HPV16 foram escolhidos para o rastreio como representativos de HPVs com tropismo para a pele e mucosas, respetivamente. Os pseudovirus infeciosos purificados contendo plasmídeos repórter com GFP foram preparados conforme descrito em Buck, C.B., Pastrana, D.V., Lowy, D.R., Schiller J.T. Generation of HPV pseudovirions using transfection and their use in neutralization assays. Methods Mol. Med. 119:445-462, 2005. Para o HPV5, foram utilizados os plasmídeos p5Llw, p5L2w e fwb; e para o HPV16, foram utilizados os plasmídeos pl6shell e pfwb. Os pseudovirus purificados foram titulados em células 293TT conforme descrito em Buck et al. acima, e o título das soluções-mãe foi determinado como sendo 1,4 X 10E9 unidades infeciosas/ml para HPV16 e 2,2 X 10E7 unidades infeciosas/ml para HPV5.
As 59 linhas celulares tumorais do DTP foram inoculadas em placas de microtitulação de 96 poços de fundo plano em 100 μΐ a densidades de colocação em placa variando desde 5.000 a 40.000 células/poço dependendo do tempo de duplicação das linhas celulares individuais.
Adicionalmente, HeLa, uma linha celular epitelial cervial humana, (n.° de catálogo CCL-2, ATCC, Manassas, VA 20108) foi inoculada da mesma forma que as linhas tumorais a 5.000 células/poço. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo soro fetal bovino a 5 % e L-glutamina a 2 mM. Depois da inoculação celular, as placas de microtitulação foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2, 95 % de ar e 100 % de humidade relativa durante 24 horas antes da adição de pseudovirus. Foram feitas três diluições seriadas a dez vezes de cada pseudovirus em DPBS + NaCl a 0,8 M. Cinco μΐ de cada diluição, pseudovirus não diluído e DPBS + NaCl a 0,8 M (fundo) foram adicionados a poços em duplicado por cada linha celular. As placas foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2, 95 % de ar e 100 % de humidade relativa durante 24 horas antes da adição de 150 μΐ/poço meio RPMI 1640 contendo soro fetal bovino a 5 % e L-glutamina a 2 mM. As placas foram incubadas durante outras 48 horas antes da análise por FACS (72 horas de tempo de infeção total). As células de cada poço foram colhidas separadamente e submetidas a análise por FACS. A percentagem de células positivas para GFP foi determinada por cada amostra. Foi calculada a média dos valores obtidos a partir de amostras em duplicado e o fundo foi subtraído. Uma diluição de pseudovirus que produziu 1-10 % de células positivas para GFP (no intervalo linear da análise por FACS) foi utilizada para calcular os títulos virais de HPV5 e HPV16. Conforme mostrado nas Figuras 5 e 6, o painel de linhas celulares tumorais foi permissivo para a infeção por pseudovirus HPV5 e 16. As experiências acima indicam que os pseudovirus de papiloma infetam especificamente linhas celulares de cancro. O seguinte exemplo demonstra que os pseudovirus infetam seletivamente células tumorais in vivo. EXEMPLO 8
Os pseudovirus de HPV infetam preferencialmente células tumorais num modelo de metástase de tumor peritoneal
Um modelo de tumor de cancro ovárico murino estabelecido foi utilizado para testar a eficiência e especificidade da infeção por pseudovirus de implantes nodulares de tumor peritoneal. Este modelo utiliza SHIN3-DSR1, que é uma linha celular de cancro ovárico humano estavelmente transfetada com um plasmideo de proteína fluorescente vermelha (RFP) de modo que a RFP seja constitutivamente expressa nas células tumorais (Fiq. 7). Xenoenxertos de tumor intraperitoneal foram estabelecidos em ratinhos nus fêmea 14 dias depois da injeção i.p. de 2 X 106 SHIN3-DSR1s em 200 ul de PBS estéril. Três dias depois da injeção i.p. de 5 X 109 unidades infeciosas (UI) de HPV16-GFP em 300 ul de PBS estéril, os ratinhos foram submetidos a eutanásia e as membranas peritoneais foram analisadas por obtenção de imagens por fluorescência multiespectral. A anatomia do tecido do qual foram obtidas as imegans e a estrutura concetual para a obtenção de imagens são semelhantes aquelas encontradas na Referência 1, Fig 4c. Especificamente, uma porção da membrana peritoneal do mesentério do intestino foi selecionada de forma aleatória e espalhada numa placa não fluorescente. As duas imagens compostas separadas foram obtidas com um dispositivo de obtenção de imagens Maestro. Para a primeira, um filtro passa-banda desde 445 a 490 nm e um filtro de alta passagem acima de 515 nm foram utilizados para luz de emissão e excitação, respetivamente. O filtro sintonizável no Maestro foi automaticamente escalonado em incremetos de 10 nm desde 500 a 800 nm enquanto a câmara capturou imagens em cada intervalo de comprimento de onda com uma exposição constante. Para a segunda, o filtro passa-banda e o filtro de alta passagem foram de 503 a 555 e 580, respetivamente, e os incrementos de comprimento de onda de 10 nm variaram desde 500 a 800. Foi aplicado um algoritmo de desmistura espectral à primeira imagem para obter uma imagem desmisturada de GFP e de autofluorescência. Foi aplicado um algoritmo separado à segunda imagem para obter uma imagem desmisturada de RFP e de autofluorescência. Estas duas imagens finais são exibidas, em conjunto com a sobreposição, demonstrando um elevado grau de colonização de sinal. Após a obtenção de imagens multiespectral, estes tecidos foram rapidamente congelados, seccionados num criótomo e analisados por microscopia confocal. Isto confirmou a infeção por HPV16-GFP através da demonstração da expressão de GFP em nódulos tumorais de SHIN3-DSR que expressam RFP. Adicionalmente, a análise confocal demonstrou uma infeção por pseudovirus minima, se existia alguma, da membrana peritoneal normal adjacente. Esta experiência indicou que o pseudovirus de HPV16 infetou eficientemente células cancerosas implantadas na membrana peritoneal (Fig. 8). Mostrou adicionalmente que a infeção era altamente especifica para células tumorais, com superficies peritoneais normais poupadas da infeção.
Resultados semelhantes foram obtidos num modelo murino que utilizou SK0V3, uma linha celular de cancro ovárico humano, foram injetadas (Fig. 9) . Tal como acima, xenoenxertos de tumor intraperitoneal foram estabelecidos em ratinhos nus fêmea 14 dias depois da injeção i.p. de 1 X 105 células SK0V3. Três dias depois da injeção i.p. de 1 X 108 unidades infeciosas (UI) de PsV HPV16-luciferase ou PsV HPV16-RFP, os ratinhos foram submetidos a eutanásia e as membranas peritoneais foram analisadas por obtenção de imagens por fluorescência multiespectral conforme discutido acima. HPV16-luciferase Não foi observado qualquer sinal nos ratinhos de controlo que não tinham ambos PsV HPV16-luciferase e tumores, mas onde substrato (d-luciferina 120 mg/kg i.p.) foi adicionado. Adicionalmente, não foi observado qualquer sinal nos ratinhos de controlo que não tinham de tumores, mas receberam HPV16-luciferase e substrato. Nos ratinhos que possuíam tumores, HPV16-luciferase, e substrato, foi observado um sinal significativo. (Fig. 10)
HPV16-RFP Não foi observado qualguer sinal nos ratinhos de controlo que foram injetados com PsV HPV16-RFP mas que não tinham tumores. Nos ratinhos que possuíam tumores e receberam PsV HPV16-RFP, foi observada uma fluorescência significativa. (Figs. 11 e 12).
Estas experiências confirmaram a verificação de que o pseudovirus de HPV16 infetou eficientemente células de cancro ovárico implantadas na membrana peritoneal. Elas confirmaram adicionalmente que a infeção foi altamente específica para células tumorais, com superfícies peritoneais normais poupadas da infeção. EXEMPLO 9
Terapêutica com gene suicida mediada por pseudovirus de HPV para carcinoma ovárico
Com base no inquérito da linha celular derivada de tumor humano NCI-60, e nos resultados da experiência descrita acima, contempla-se que a administração intraperitoneal de pseudovirus resultará em infeção eficiente e específica de células de cancro ovárico confinada à cavidade peritoneal, e que este método pode ser utilizado para tratar cancros ováricos. Numa abordagem, um método de terapêutica com gene suicida, na qual a transdução do gene para timidina quinase (TK) de herpes simplex é seguida por tratamento sistémico com o profármaco, gangiclovir. Em ambos o modelo de ratinho nu SHIN3, e no modelo de ratinho imunocompetente singeneico MOSEC para cancro ovárico, contempla-se que as células tumorais intraperitoneais xenoenxertadas serão eficientemente transduzidas pelo pseudovirus de HPV16-TK, e que células tumorais que expressam TK converterão o ganciclovir administrado sistemicamente no seu metabolito trifosfato tóxico, matando as células tumorais. Isto resultará numa resposta terapêutica, conforme medida pela carga tumoral diminuída e tempo de sobrevivência aumentado em ratinho xenoenxertados. Alternativamente, pseudovirus que expressam o oligo T podem ser utilizados para induzir a regressão das células tumorais. Além disso, com base nas experiências da linha celular NCI-60, contempla-se que explantes frescos de carcinomas ováricos humanos serão permissivos à infeção de pseudovirus. Este fenómeno é ilustrado utilizando um protocolo semelhante a um anteriormente descrito2, no qual o sistema de cultura de tecidos de corte fino de Krumdieck é utilizado para preparar secções finas de nódulos cancerosos adequados para análise da transdução virai ex vivo. (Veja-se por exemplo, 1. Hama, Y. et al. A target cell-specific activatable fluorescence probe for in vivo molecular imaging of cancer based on a self-quenched avidin-rhodamine conjugate. Cancer Res 67, 2791-9 (2007) e 2. Kirby, T.O. et al. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res 10, 8697-703 (2004)). EXEMPLO 10
Pseudovirus de HPTV que expressam oligo para citotoxicidade e imunidade combinadas para tumores
Pseudovirus que expressam oligo T foram preparados de modo a proporcionar uma abordagem simples para combinar vacinas terapêuticas antitumorais e terapêutica génica citotóxica antitumoral.
Construção de plasmideo pPolyT:
Dois oligos (GCGGCGTCTAGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTT; SEQ ID NO: 1) e GCGGCGTCTAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAA; SEQ ID NO: 2) foram rapidamente hibridados, depois estendidos com ADN polimerase T4 (New England Biolabs) . 0 ADN duplexado resultante foi digerido com Xba I e ligado no sitio de Xba I de uma construção de promotor pol-I/terminador murina, p417-Ron (obtida de Ron A.M. Fouchier, Erasmus Medical Center, Holanda). Os clones foram sequenciados, e um foi selecionado um clone com um trato T de 45 pares de bases na cadeia de sentido.
Documentação experimental de citotoxicidade de pPolyT:
Células HaCaT foram transfetadas com pBluescript II KS+ (Stratagene) ou pPolyT utilizando Lipofectamina LTX (Invitrogen). 48 horas mais tarde, as células foram inspecionadas por microscópio de luz e tratadas com um substrato metabólico colorimétrico (WST-1, Roche) . Células que recebem pPolyT exibiram uma morfologia reticulada e foram bastante escassas em relação às células transfetadas (ou não transfetadas) com pBluescript. A renovação de WST-1 foi reduzida em >2 vezes nas células transfetadas com pPolyT. EXEMPLO 11 A administração intravenosa de pseudovirus de HPV é dirigida a metástases pulmonares
De acordo com um protocolo estabelecido para produção de metástases de tumor pulmonar (veja-se, por exemplo, Qian et al. Prophylactic, therapeutic and anti-metastatic effects of an H PV- 16 mE6A/mE7/TBhsp70A fusion protein vaccine in an animal model. Immunology Letters 102(2): 191-201 (2006)), uma série de ratinhos foi injetada com 2xl04 células TC-1 por via intravenosa 2 semanas antes da experiência. Todos os ratinhos foram depois tratados com aproximadamente 1 X 107 PsV HPV16-luciferase por via intravenosa, incluindo os animais de controlo, que receberam solução salina em vez de células tumorais. A atividade da luciferase foi subsequentemente medida após a introdução de substrato. Não foi detetado qualquer sinal nos ratinhos de controlo. Nos ratinhos que tinham sido inoculados com células tumorais, foi detetado um sinal significativo, indicando que os pseudovirus se dirigiram eficazmente às metástases pulmonares (Fig. 13). Esta experiência demonstrou que a administração intravenosa de pseudovirus resulta num direcionamento especifico de células tumorais e não afeção do tecido normal, de forma semelhante ao padrão demonstrado depois da administração por outras vias. EXEMPLO 12
Diagnóstico e tratamento de cancro do colo do útero
Foi proporcionada a um indivíduo com cancro do colo do útero uma composição que compreende uma VLP de papiloma acoplada a um radionuclídeo (por exemplo, 3H, 125 I, 13I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 186Re, 188Re, ou 212Bi) . A composição pode ser proporcionada numa quantidade de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg. Alternativamente, a composição pode ser proporcionada numa quantidade suficiente para administrar 100, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, ou 10000 rads às células cancerosas. A composição pode ser proporcionada numa conveniente aplicação vaginal e a composição pode estar sob a forma de um líquido ou um gel. A composição que compreende a VLP de papiloma acoplada ao radionuclídeo é proporcionada ao indivíduo e é permitido às VLPs marcadas ligarem-se às células de cancro do colo do útero durante 2, 4, 6, ou 8 horas. Depois da ligação, as VLPs marcadas não ligadas são removidas por lavagem sucessiva. A quantidade de radioatividade presente no canal vaginal é avaliada por determinações de dosimetria (por exemplo, crachás de dosimetria) . Um novo crachá é proporcionado diariamente durante 4 semanas e os crachás são recolhidos no final da avaliação e uma diminuição gradual na exposição radioativa será observada ao longo do tempo.
Também está previsto que seja tomada uma biópsia do colo do útero semanalmente de modo a avaliar a redução histológica das células cancerosas durante a experiência. Os resultados mostrarão que as VLPs radiomarcadas se ligaram seletivamente e identificaram as células de cancro do colo do útero no canal vaginal do indivíduo e, ao longo do tempo, a radioatividade contribuiu para a redução da presença e proliferação das células cancerosas e para o restabelecimento da morfologia celular normal, em comparação com indivíduos controlo não tratados.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, THE Roberts, Jeff Lowy, Douglas R. Schiller, John T .
<12 0> PSEUDOVÍRUS DE PAPILOMAVÍRUS PARA DETEÇÃO E TERAPÊUTICA DE TUMORES
<130> NIH360.001VPC <150> 61/065.897 <151> 14-02-2008 <150> 60/928.498 <151> 08-05-2007 <160> 2 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0
<210> 1 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligo T Iniciador A <4 0 0> 1 gcggcgtcta gaattttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttt 59 <210> 2 <211> 59
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligo T Iniciador B <400> 2 gcggcgtcta gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 5 9
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
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Lisboa, 8 de Junho de 2016

Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma que compreende um marcador detetável para utilização num método de deteção da presença de células cancerosas num indivíduo que tem, ou é suspeito de ter células cancerosas; em que o dito método compreende: identificar um indivíduo que tem, ou é suspeito de ter, células cancerosas; administrar ao dito indivíduo uma quantidade detetável do dito pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma que compreende um marcador detetável e detetar a presença de células cancerosas ligadas ao dito pseudovirus de papiloma ou à dita VLP de papiloma que compreende um marcador detetável.
  2. 2. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização de acordo com a reivindicação 1 em que a dita deteção é levada a cabo num indivíduo antes de um tratamento com terapêutica para cancro e durante ou depois de um período do dito tratamento.
  3. 3. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o dito marcador está acoplado quimicamente ao dito pseudovirus ou à dita VLP ou o dito pseudovirus compreende um gene que codifica o dito marcador.
  4. 4. Uma composição que compreende um agente terapêutico formulado com um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização num método de tratamento de cancro através da inibição da proliferação de células cancerosas e/ou morte das células cancerosas sem inibição da proliferação e/ou morte das células normais num indivíduo identificado com um cancro, em que o dito agente terapêutico é citotóxico para uma célula cancerosa .
  5. 5. Uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o dito agente terapêutico está acoplado quimicamente ao dito pseudovirus ou à dita VLP ou está incorporado dentro do dito pseudovirus ou dita VLP.
  6. 6. Uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o dito agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em: a) um gene selecionado a partir do grupo que consiste em: i) um gene supressor de tumor; ii) um gene pró-apoptótico; iii) um gene que codifica uma citocina, uma linfocina, uma monocina, um fator de crescimento, uma enzima ou uma hormona; iv) um gene imunomodulador; v) um gene que codifica um polipéptido que é citotóxico para uma célula cancerosa; e vi) um gene suicida; b) uma citotoxina; c) um radionuclideo; d) um profármaco; e, e) um ácido nucleico terapêutico.
  7. 7. Uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o dito agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em ganciclovir ou aciclovir, oligo T, e um ácido nucleico que expressa oligo T em que o dito ácido nucleico está operativamente ligado a um promotor Pol III.
  8. 8. Uma composição para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o dito oligo T é inferior que ou igual a 200, 175, 150, 125, 100, 95, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, ou 10 nucleótidos.
  9. 9. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização no método para deteção da presença de células de cancro de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma composição para utilização no método de tratamento de cancro de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, em que o cancro é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, linfoma, mieloma, plasmocitoma, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, cancro pancreático, cancro da mama, cancro ovárico, cancro da próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais hepatoma, carcinoma dos duetos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro do colo do útero, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, neuroglioma e retinoblastoma.
  10. 10. Um kit que compreende urn pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma, um veículo farmacêutico, e instruções para utilização dos componentes do kit, em que o pseudovirus ou VLP compreende um agente terapêutico que é citotóxico para uma célula cancerosa.
  11. 11. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma que compreende um marcador detetável para utilização num método de deteção da presença de células de cancro do colo do útero num indivíduo, em que o dito método compreende: proporcionar ao dito indivíduo uma composição que compreende uma VLP de papiloma acoplada a ou contendo um marcador; remover VLPs não ligadas que compreendem o dito marcador; e detetar a presença de células de cancro ligadas à dita VLP que compreende o dito marcador.
  12. 12. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o dito marcador está acoplado quimicamente à dita VLP.
  13. 13. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 11 ou 12, que compreende adicionalmente medir a presença ou quantidade do dito pseudovirus ou da dita VLP ligada às ditas células cancerosas e a presença ou quantidade do dito pseudovirus ou da dita VLP ligada às células normais.
  14. 14. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 11 ou 12, em que o dito marcador é fluorescente.
  15. 15. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 11 ou 12, em que o dito marcador é radioativo.
  16. 16. Um pseudovirus de papiloma ou uma VLP de papiloma para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 11 ou 12, em que o dito marcador é quimiluminescente. Lisboa, 8 de Junho de 2016
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