PT2197900E

PT2197900E - Péptidos receptores duplamente cíclicos mutados que inibem anticorpos anti-receptor adrenérgico β1

Info

Publication number: PT2197900E
Application number: PT08801676T
Authority: PT
Inventors: Martin Lohse; Roland Jahns; Valerie Jahns; Viacheslav Nikolaev
Original assignee: Univ Wuerzburg J Maximilians
Priority date: 2007-08-24
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2012-10-24
Also published as: AU2008291296B2; EP2559698B1; JP2010536356A; CN103992406A; WO2009027063A3; CA2697108A1; CN101835793A; ES2391358T3; WO2009027063A2; JP2013176369A; CN101835793B; EP2559698A3; EP2559698A2; EP2497777A2; PL2197900T3; HK1176363A1; EP2497777A3; JP5248610B2; US9062095B2; EP2197900A2

Description

ΕΡ 2 197 900/ΡΤ DESCRIÇÃO "Péptidos receptores duplamente cíclicos mutados que inibem anticorpos anti-receptor adrenérgico βΐ" 0 presente invento refere-se a novos ciclo-péptidos mutantes homólogos de β-AR compreendendo apenas dois resíduos de cisteína capazes de formar uma ligação intramolecular. Divulgam-se também aqui péptidos lineares que podem formar esses ciclo-péptidos mutantes e moléculas de ácido nucleico que codificam esses ciclo-péptidos mutantes e péptidos lineares. Além disso, divulgam-se vectores e células hospedeiras recombinantes compreendendo a referida molécula de ácido nucleico. Proporciona-se um método para produzir os ciclo-péptidos mutantes divulgados. Proporciona-se adicionalmente uma composição compreendendo os péptidos do invento. 0 presente invento também se refere a meios, métodos e utilizações terapêuticos e de diagnóstico, que beneficiam dos péptidos do invento e a meios, métodos e utilizações para detectar anticorpos anti-receptor adrenérgico β tais como anticorpos anti-receptor adrenérgico βι. A dilatação cardíaca progressiva e a falha de bombeamento de etiologia desconhecida denominou-se cardiomiopatia dilatada "idiopática" (DCM) (Richardson 1996 Circulation, 93, 841-842). A DCM representa uma das principais causas de insuficiência cardíaca grave com uma incidência anual de até 100 doentes e uma prevalência de 300-400 doentes por milhão (relatório AHA 2007). As mutações em genes que codificam proteínas estruturais dos miócitos (Morita 2005) e várias cardiotoxinas incluindo álcool, antracilinas e mais recentemente anticorpos monoclonais com utilização terapêutica (e.g., trastuzumab) são responsáveis por cerca de um terço dos casos de DCM (Chien 2000, Fabrizio e Regan 1994). A etiologia dos dois terços remanescentes é contudo ainda mal compreendida. Presentemente pensa-se que grande maioria das DCM tem origem numa infecção inicial (principalmente vírica) que leva a miocardite aguda que após activação do sistema imunitário pode progredir para miocardite auto-imune (crónica) resultando em dilatação 2 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ cardíaca e insuficiência cardíaca congestiva grave; esta última progressão ocorre especialmente quando associada (a) ao desenvolvimento de auto-anticorpos contra proteínas do sarcolema de miócitos ou proteínas membranares que são essenciais para a função cardíaca (Freedman 2004, Jahns 2006), ou (b) à inflamação crónica do miocárdio e persistência vírica (Kiihl 2005) . Estas revelações recentes são adicionalmente fortalecidas pelo facto dos doentes com DCM terem frequentemente alterações tanto na imunidade celular como na imunidade humoral (Jahns 2006, Limas 1997, Luppi 1998,

Mahrholdt 2006) . Nestas condições uma reacção inflamatória aguda inicial pode prosseguir para uma espécie de inflamação de baixo grau (MacLellan 2003) facilitando o desenvolvimento de respostas imunitárias anómalas ou desviadas relativamente ao estímulo infeccioso primário (Freedman 2004, Kiihl 2005, MacLellan e Lusis 2003, Maekawa 2007, Smulski 2006).

No contexto da sua resposta humoral verificou-se que um número considerável de doentes de DCM desenvolveram anticorpos de reacção cruzada e/ou auto-anticorpos contra vários antigénios cardíacos incluindo proteínas mitocondriais (e.g., translocador do nucleótido adenina, lipoamida e piruvato desidrogenase (Pohlner 1997, Schultheiss 1985, Schultheiss 1988, Schulze 1999)), proteínas do sarcolema (e.g., actina, laminina, miosina, troponina (Caforio 2002, Gõser 2006, Li 2006, Neumann 1990, Okazaki 2003)) e proteínas de membrana (e.g., receptores adrenérgicos de superfície celular ou receptores muscarinérgicos (Christ. 2006, Fu 1993, Jahns 1999b, Magnusson 1994). Destes, apenas alguns anticorpos seleccionados parecem ser contudo capazes de provocar lesões do tecido do miocárdio e de induzir por si sós insuficiência cardíaca congestiva grave. Além disso, a predisposição genética individual (incluindo os respectivos fenótipo de antigénio de leucócitos humanos (HLA) e fenótipo de complexo de histocompatibilidade major (MHC) (Limas 1996)) pode também contribuir significativamente para a susceptibilidade contra reacções imunitárias autodirigidas e para a expressão fenotípica da doença (Limas 2004, MacLellan 2003). 3

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT Têm sido propostas homologias entre moléculas superficiais dos miócitos tal como receptores membranares e viricos ou proteínas bacterianas como um mecanismo para a elaboração de auto-anticorpos cardíacos endógenos por mimetismo de antigénios (Hoebeke 1996, Mobini 2004). A doença cardíaca de Chagas, uma cardiomiopatia inflamatória de evolução lenta, é um dos exemplos mais proeminentes para este mecanismo (Elies 1996, Smulski 2006). A doença tem origem numa infecção com o protozoário Trypanosoma cruzi; o mimetismo molecular entre a proteína Ρ2β ribossómica de T. cruzi e a parte N-terminal da segunda ansa extracelular do receptor adrenérgico βι (βι-AR) resulta na geração de anticorpos de reacção cruzada em cerca de 30% dos doentes de Chagas (Ferrari 1995). Devido aos auto-anticorpos contra receptor de doentes com DCM reconhecerem preferentemente a parte C-terminal da mesma ansa (Wallukat 1995), especulou-se que esses anticorpos podem ter origem no mimetismo molecular entre o βι-AR e um patogénio vírico ainda não identificado (Magnusson 1996). Outro mecanismo provavelmente mais relevante que leva à produção de auto-anticorpos cardíacos endógenos seria lesão cardíaca primária seguida de libertação (súbita ou crónica) de uma "quantidade crítica" de determinantes antigénicos da membrana ou citoplasma de miócitos anteriormente ocultos do sistema imunitário. Tal lesão ocorre mais provavelmente após infecção aguda (miocardite), tóxica ou doença cardíaca isquémica (enfarte do miocárdio) que resulta em apoptose ou necrose de miócitos (Caforio 2002, Rose 2001). A apresentação de auto-antigénios do miocárdio ao sistema imunitário pode então induzir uma resposta auto-imune, que na pior das hipóteses resulta no perpetuar dos danos imuno-mediados aos miócitos envolvendo respostas imunitárias celulares (e.g., células T) ou humorais (e.g., células B) ou co-activação dos sistemas imunitários inato e adaptativo (Eriksson 2003, Rose 2001). miócitos dos

De um ponto de vista patofisiológico, parece razoável ligar o potencial nocivo (e.g., indutor de cardiomiopatia) de um auto-anticorpo específico do coração com a acessibilidade e com a relevância funcional do alvo correspondente. Os receptores superficiais dos miócitos estão facilmente 4 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT acessíveis aos auto-anticorpos (Okazaki 2005). Os dois candidatos mais promissores são o receptor cardíaco βι-AR (que representa o subtipo predominante de receptor adrenérgico no coração) e o receptor de acetilcolina M2-muscarínico; detectaram-se auto-anticorpos contra ambos os receptores em doentes de DCM (Fu. 1993, Jahns 1999b, Matsui 1995) . Enquanto os anticorpos anti-muscarinicos (apresentando uma acção do tipo agonista no receptor cardíaco acetilcolina M2) têm sido principalmente associados a efeitos cronotrópicos negativos ao nível sinoatrial (e.g., disfunção do nódulo sinoatrial, fibrilação auricular (Baba 2004, Wang. 1996)), os anticorpos anti-Pi-AR agonistas têm sido associados tanto com a ocorrência de arritmia grave ao nível ventricular (Christ 2001, Iwata 2001a) como com o desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda (inadaptada), mudando finalmente para aumento ventricular esquerdo e insuficiência cardíaca progressiva (Iwata 2001b, Jahns 1999b, Khoynezhad 2007). Ambos os auto-anticorpos parecem ser dirigidos contra a segunda ansa extracelular dos respectivos receptores. Para gerar uma resposta auto-imune, as proteínas membranares dos miócitos (e.g., receptores) devem ser degradadas para pequenos oligopéptidos capazes de formar um complexo com uma molécula MHC ou HLA de classe II do hospedeiro (Hoebeke 1996) . No caso do βι-AR humano, a análise baseada em computador de partes de aminoácidos potencialmente imunogénicas demonstrou que a única parte da molécula do receptor contendo epítopos de células B e de células T e que está acessível a anticorpos foi de facto a segunda ansa do receptor extracelular (βι-ECn) (Hoebeke 1996) . Tal pode explicar a utilização bem-sucedida de péptidos de segunda ansa para a geração de anticorpos de receptor específicos de βι em diferentes modelos animais (Iwata 2001 b, Jahns. 2000, Jahns 1996). Além disso, na última década vários grupos demonstraram independentemente que os anticorpos de segunda ansa reconhecem preferentemente βι-AR nativos intactos em vários ensaios imunológicos (ELISA de células completas, imunoprecipitação, imunofluorescência), indicando que estão "conformacionais" (Hoebeke 1996, Jahns 2006). Ensaios funcionais revelaram que os mesmos anticorpos também afectaram a função de receptor, tal como produção de cAMP intracelular 5 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ e/ou actividade de proteína quinase dependente de cAMP (PKA), sugerindo que podem actuar como reguladores alostéricos de actividade βι-AR (Jahns 2000, Jahns 2006). A estrutura de βι-AR foi também analisada por Warne (2008 Nature. DOI:10. 1038).

Seguindo os postulados de Witebsky (Witebsky 1957) a evidência indirecta para a etiologia auto-imune de uma doença requer a identificação do estímulo (e.g., o auto-antigénio responsável) e indução de uma resposta imunitária dirigida contra auto-antigénio num animal experimental, que deve então desenvolver uma doença semelhante. A evidência directa requer contudo a reprodução da doença por transferência de anticorpos patogénicos homólogos ou células T auto-reactivas de um animal para outro da mesma espécie (Rose 1993).

Para analisar o potencial patogénico de anticorpos anti-βι-AR, Jahns et al. escolheram uma abordagem experimental in vivo, que verifica os critérios de Witebsky para evidência directa de doenças auto-imunes. A DCM foi induzida por imunização de ratos consanguíneos contra βι-ECu (100% de homologia de sequência entre humano e rato; evidência indirecta); a doença foi então reproduzida em animais saudáveis por transferência isogénica de "auto-anticorpos" anti^i-AR de rato (evidência directa) (Jahns 2004). Os animais desenvolveram dilatação e disfunção ventricular esquerda (VE) progressiva, uma diminuição relativa da espessura da parede VE e regulação negativa selectiva de βι-AR, uma caracteristica que é também observada em DCM humana (Lohse 2003) .

Estes resultados, conjuntamente com um efeito a curto prazo do tipo agonista dos anticorpos in vivo (Jahns 2004) , sugerem que tanto o fenótipo induzido como o fenótipo cardiomiopático transferido podem ser principalmente atribuídos à activação de receptor, moderada mas sustentável, conseguida por anticorpos estimulantes anti-Pi-AR. Esta hipótese é apoiada pelo grande conjunto de dados disponíveis sobre os efeitos cardiotóxicos de activação de βι-AR excessiva e/ou a longo prazo observada após manipulação genética ou 6 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ farmacológica (Engelhardt 1999, Woodiwiss 2001). Assim, a imuno-cardiomiopatia dilatada induzida por anti-Pi-AR (DiCM) pode agora ser considerada como uma entidade de doença patogenética própria conjuntamente com outras doenças auto-imunes dirigidas a receptor estabelecidas tais como miastenia grave ou doença de Graves (Freedman 2004, Hershko 2005, Jahns 2004, Jahns 2006) . A importância clinica dos auto-anticorpos cardíacos é difícil de avaliar dado que se podem também detectar títulos reduzidos de tais anticorpos na população saudável como parte do reportório imunológico natural (Rose 2001). Contudo, relativamente a anticorpos anti-pi-AR activos funcionalmente, dados anteriores de Jahns et al. demonstraram que a sua prevalência é quase desprezável em indivíduos saudáveis (<1%) desde que se utilize um processo de rastreio baseado em sistemas celulares que apresentem o alvo (e.g., o βι-AR) na sua conformação natural (Jahns 1999b). Utilizando o último método de rastreio, a ocorrência de auto-anticorpos anti-Pi-AR pode também ser excluída em doentes com doença cardíaca hipertensiva ou valvular crónica (Jahns 1999a). Contrariamente, a prevalência de anti-pi-AR estimulantes foi -10% em cardiomiopatia isquémica (ICM) e -30% em cardiomiopatia dilatada (DCM) (Jahns 1999b), o que foi significativamente superior aos controlos saudáveis mas numa gama mais reduzida relativamente a relatos anteriores sobre conjuntos DCM (33% a 95% de prevalência) (Limas 1992, Magnusson 1994, Wallukat 1995) . Parece possível que tais diferenças nos métodos de rastreio que têm como objectivo detectar auto-anticorpos anti-Pi-AR activos funcionalmente sejam a causa da vasta gama de prevalências relatada anteriormente (Limas 1992). De facto, apenas uma fracção minoritária de auto-anticorpos anti-3i-AR humanos definidos por ELISA foi capaz de se ligar a β-AR nativa localizada na superfície celular. Apenas esta fracção reconheceu (tal como determinado por imunofluorescência) e activou (tal como determinado pelos aumentos na actividade celular de cAMP e/ou PKA) a βι-AR humana expressa na membrana de células eucarióticas intactas (Jahns 2000, Jahns 1999b). Assim, os 7

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT sistemas de células que apresentam o alvo na sua conformação natural representam uma ferramenta essencial no rastreio de auto-anticorpos anti-β-ΑΚ funcionalmente relevantes (Nikolaev 2007).

Clinicamente demonstrou-se que a presença de auto-anticorpos anti-βι-ΑΚ em DCM estava associada a uma função cardíaca mais gravemente deprimida (Jahns 1999b), a ocorrência de arritmia ventricular mais grave (Chiale 2001) e uma maior incidência de morte cardíaca súbita (Iwata 2001a). Dados recentes comparando doentes de DCM positivos para anticorpos com doentes de DCM negativos para anticorpos ao longo de um período de seguimento superior a 10 anos confirmou não apenas uma prevalência mais elevada de arritmia ventricular na presença de anti-βι-ΑΚ activador, mas também revelou que a positividade de anticorpos permitiu prever um aumento de quase três vezes do risco de mortalidade cardiovascular (Stõrk 2006). Tomados conjuntamente, os dados clínicos disponíveis sublinham a relevância patofisiológica de anticorpos anti-βι-ΑΚ activos funcionalmente em DCM.

Uma estratégia farmacológica geralmente aceite hoje em dia será a utilização de agentes beta-bloqueadores de modo a atenuar ou mesmo abolir os efeitos estimulantes mediados por auto-anticorpo, pelo menos se os bloqueadores β puderem de facto evitar a activação de βι-AR induzida por anticorpo (Freedman 2004, Jahns 2000, Matsui 2001, Jahns 2006). As novas abordagens terapêuticas incluem de facto a eliminação de anti-βι-ΑΚ estimulantes por imuno-adsorção não selectiva ou selectiva (Hershko 2005, Wallukat 2002) ou ter como alvo directo os anticorpos anti^i-ECu e/ou as próprias células B produtoras de anti^i-ECu (ou seja, indução de tolerância imunitária) (Anderton 2001). A imuno-adsorção não selectiva, contudo, devido a um aumento do risco de infecção após redução de imunoglobulina, necessita da substituição de IgG humana com base em questões de segurança (Felix 2000) com todos os possíveis efeitos secundários de proteínas humanas substituídas que são conhecidos na especialidade incluindo reacções anafilácticas graves e morte. 8 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ W0 01/21660 divulga determinados péptidos homólogos a epitopos da Ia e 2a ansas de βι-AR e propõe aplicar esses péptidos para intervenção médica de cardiomiopatia dilatada (DCM). Embora WO 01/21660 mencione marginalmente que os péptidos podem ser modificados de modo a protegê-los contra protéases séricas, por exemplo por ciclização, não se apresentaram exemplos e concretizações correspondentes e não se apresenta qualquer efeito in vitro ou in vivo dos péptidos propostos no decurso de DCM ou no decurso de titulações receptor-anticorpo. Além disso, em WO 01/21660 pretende-se confiar nas abordagens de imuno-adsorção não selectiva acima mencionadas e que são acompanhadas dos correspondentes riscos mencionados.

Contrariamente a isto utilizaram-se os ciclo-péptidos homólogos de βι-ECn desenvolvidos de novo (e.g. βι-ECn-CP) seis semanas após a indução activa de anticorpos estimulantes anti^i-ECu. Os βι-ECn-CP são ciclo-péptidos contendo 3 resíduos de cisteina e portanto podem formar ligações intramoleculares, pelas quais há a opção potencial de formar individualmente duas ligações intramoleculares (além da ciclização entre os terminais N e C) . Os βι-ECn-CP reduziram significativamente a quantidade de anticorpos anti^i-ECu em circulação e evitaram eficazmente o desenvolvimento de dilatação e disfunção cardíacas (Boivin 2005). Os βι-ECn-CP acima mencionados foram também divulgados em WO 2006/103101.

Tendo em conta a especialidade presente, o problema técnico subjacente ao presente invento é o de proporcionar meios e métodos melhorados e de fácil obtenção para a intervenção médica de doenças relacionadas com anticorpos anti-β-ΑΚ, particularmente com anticorpos anti^i-ECn. O problema técnico resolve-se proporcionando as concretizações caracterizadas nas reivindicações.

Assim, num primeiro aspecto, o presente invento refere-se a ciclo-péptidos mutantes homólogos de β-AR (também aqui 9 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ denominados como "péptidos cíclicos" ou "ciclo-péptidos" e semelhantes), particularmente a ciclo-péptidos mutantes homólogos de βχ-AR, nomeadamente ciclo-péptidos mutantes homólogos de βχ-ECn. A estrutura destes mutantes de ciclo-péptidos/péptidos cíclicos caracteriza-se por serem capazes de formar apenas uma ligação dissulfureto intramolecular individual.

Nomeadamente, no primeiro aspecto, o presente invento refere-se a um péptido cíclico de fórmula I: ciclo(x-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-Xi-x) (I), em que a) x é um aminoácido diferente de Cys; b) h é qualquer número inteiro de 1 a 15; c) i é qualquer número inteiro de 0 a 14; d) xc é Pro; e e) y é um aminoácido diferente de Cys, e em que o referido péptido cíclico consiste de pelo menos 16 e no máximo 25 aminoácidos e compreende a parte de aminoácidos

Asp-XxxrXxxi-Arg^Arg-Cys-XxxrAsn-.A^iJ-ProoL^ (SEQID NO, 45); ou GIu~Ser~Asp«Xxx j-Xxx4~Arg~Arg>Cys*Xxx3-Asr}*A$p<*?ro-Lys (SEQID NO. .46), em que Xxxi, Xxx3 e Xxx4 é um aminoácido diferente de Cys, e em que o referido péptido cíclico i) é capaz de reduzir uma activação mediada por anticorpo de receptor adrenérgico βχ (βι-AR); ii) é capaz de ligar (auto)anticorpos contra a segunda ansa extracelular (ECn) de βχ-AR; e/ou iii) é capaz de inibir a interacção entre βχ-AR e (auto)anticorpos contra ECn de βχ-AR. 10 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ São concretizações particularmente preferidas, tal como discutido anteriormente, péptidos cíclicos específicos tais como representados nas fórmulas VII, IX, IX', VI ou VIII. O presente invento resolve o problema técnico acima identificado dado que, tal como aqui documentado seguidamente e nos exemplos anexos, verificou-se surpreendentemente que péptidos cíclicos mutantes contendo apenas duas cisteínas, que se podem formar a partir de uma única ligação dissulfureto intramolecular definida e individual, são também capazes de inibir anticorpos anti-3-AR e são úteis na inibição de anticorpos estimulantes anti-pi-AR.

Verificou-se adicionalmente surpreendentemente no contexto do presente invento que os mutantes de péptido com uma estrutura cíclica (i.e. os péptidos cíclicos) tal como aqui descritos e proporcionados são melhores do que os seus homólogos lineares em termos de reconhecimento ou remoção de anticorpos anti-p-AR conformacionais e do seu potencial neutralizante de anticorpos (i.e. farmacêutico). Obtiveram-se estas constatações pela utilização exemplar de ensaios de competição de ELISA e ensaios funcionais (cAMP) de FRET, respectivamente.

Além disso, os péptidos cíclicos do invento compreendendo apenas duas cisteínas, que podem formar uma única ligação dissulfureto intramolecular definida e individual, podem ser facilmente obtidos/produzidos, caracterizados bioquimicamente e purificados. Tal é especialmente verdade quando se pretendem fracções puras dos mesmos isómeros de ciclo-péptido. No contexto deste invento, evita-se uma mistura de isómeros de ciclo-péptidos, i.e. estereoisómeros, compreendendo isómeros de ciclo-péptidos com diferentes ligações dissulfureto intramoleculares. Tal como aqui documentado seguidamente, devido a evitar esta mistura pode obter-se um produto médico específico e limpo (cumprindo os padrões de boas práticas de fabrico) compreendendo isómeros todos com a mesma ligação dissulfureto intramolecular. 11

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Foi adicionalmente surpreendentemente verificado no contexto do presente invento e tal como ilustrado nos exemplos anexos, que a natureza exacta da permuta de um dos resíduos de cisteína por um resíduo de serina determinou marcadamente a potência de neutralização do anticorpo de péptidos cíclicos derivados de βι-ECn.

Particularmente, uma permuta Cys^Ser tal como a da posição 18 do ciclo-péptido 25-mero aqui exemplar e preferentemente divulgado (fórmulas VII/IX), na posição 17 do ciclo-péptido 22-mero aqui exemplar e preferentemente divulgado (fórmula IX') ou na posição 14 do ciclo-péptido 18-mero aqui exemplar e preferentemente divulgado (fórmulas VI/VIII), respectivamente, proporciona péptidos cíclicos (péptidos cíclicos Cys-Ser) com excelentes efeitos de neutralização de anticorpo e farmacológicos in vitro (figuras 4-11 e 27), enquanto a permuta Cys-Ser na posição 17, 16 ou 13 do péptido cíclico aqui exemplarmente divulgado como 25-mero, 22-mero ou 18-mero, respectivamente (péptidos cíclicos Ser-Cys), não tinha surpreendentemente praticamente qualquer efeito inibitório. Este efeito inibitório não pode ser detectado relativamente às suas propriedades na remoção de anticorpo nem em termos da sua capacidade de inibir efeitos funcionais de anticorpo; como neutralização de estimulação de receptor in vitro tal como apresentado, por exemplo, nas figuras 4-10).

Verificou-se adicionalmente no contexto do presente invento que se pode obter uma imitação estérica praticamente perfeita do domínio ECII-pi-AR através de um péptido cíclico homólogo da segunda ansa compreendendo 22 aminoácidos, por exemplo 21 aminoácidos da sequência primária original publicada de βι-AR humano, i.e. os aminoácidos 200 (R) a 221 (T) (numeração de acordo com Frielle et al. 1987, PNAS 84, páginas 7920-7924), com um resíduo de aminoácido adicional (por exemplo glicina (G) ) para fechar o ciclo sintético na posição 222 para formar um ciclo-péptido de 22 AA. 12 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Sem nos limitarmos à teoria, a actividade cardio- protectora e imuno-moduladora dos péptidos cíclicos depende largamente das suas conformações. Verificou-se adicionalmente no contexto deste invento que uma introdução do mais pequeno aminoácido de ocorrência natural, a glicina no local (previsto) de fecho do anel (ou na posição correspondente a este) leva a um aumento de ligação de auto-anticorpos anti-βι-AR, i.e. aparentemente aumenta adicionalmente a semelhança do ciclo-péptido 22 AA com o domínio ECu-Pi-AR. Nomeadamente, os exemplos anexos, entre outros, indicam que os ciclo-péptidos cic22AA têm uma eficácia de bloqueamento de anticorpos significativamente mais elevada in vivo do que outros ciclo-péptidos que imitam ECn maiores (i.e., péptidos cic25AA) ou mais pequenos (i.e., péptidos cicl8AA). Estudos de modelação com auxilio de computador com os referidos ciclo-péptidos 22 AA confirmaram uma excelente imitação da estrutura da segunda ansa extracelular prevista com uma diferença de tamanho calculada de apenas 4,5 angstrõm (4,5 Á) na base do ciclo-péptido (contrariamente ao local assumido de ligação de anticorpo), comparativamente com a hélice inversa da segunda ansa extracelular nativa prevista (consultar também a figura 24 anexa). Além disso, demonstrou-se aqui e nos exemplos anexos que especialmente o referido ciclo-péptido 22 AA reduz o título de auto-anticorpos anti-pi-AR com uma eficácia extraordinariamente elevada.

Dado que a substituição de uma das três cisteínas presentes no péptido 22 AA ciclico permite a introdução de uma ponte de dissulfureto reforçada (como um segundo ciclo "interno", gerado por ciclização dupla) entre as duas cisteínas remanescentes, o ciclo-péptido 22 AA cíclico resultante também representa um produto definido inequivocamente bioquimicamente (consultar igualmente as figuras 25 e 26).

Foi também surpreendentemente verificado que uma permuta GlnwD-Glu na posição 25 (ciclo-péptidos mutantes 25-meros) ou 18 (ciclo-péptidos mutantes 18-meros) não influenciou significativamente a capacidade de bloqueamento dos ciclo- 13

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT péptidos independentemente do seu comprimento; i.e., 25 comparativamente com 18 aminoácidos tal como apresentado nas figuras 6, 7 e 9).

Os exemplos seguintes também documentam que os péptidos ciclicos tal como aqui revelados apresentam caracteristicas melhoradas, por exemplo comparativamente com péptidos compreendendo três residuos Cys (por exemplo os péptidos ciclicos Cys/Cys divulgados em WO 2006/103101). São exemplos de caracteristicas melhoradas dos péptidos ciclicos deste invento uma capacidade extremamente boa de bloqueamento de anticorpos anti-3i~AR e sua capacidade de produção avançada de acordo com padrões de boas práticas de fabrico.

No contexto do presente invento, as determinações in vitro foram confirmadas na generalidade em ensaios in vivo (figuras 12-16 e 28/29). Interessantemente, a diferença da eficácia de bloqueamento dos ciclo-péptidos mutantes Cysi8fi7 ou i4->Ser18fl7 ou i4 comparativamente com a de péptidos lineares foi ainda mais pronunciada in vivo (figuras 5, 7 e 14-16). O modelo de rato estabelecido de cardiomiopatia auto-imune induzida por anticorpo anti-betal-adrenérgico (Jahns, 2004) serviu para avaliar a eficácia dos mutantes de ciclo-péptido homólogos de betal-ECII gerados in vivo. Os dados in vivo indicaram que a eficácia dos ciclo-péptidos mutados divulgados (e.g. ciclo-péptido 18AA Cys/Ser) pode depender igualmente da dose administrada (figuras 14-16).

Além disso, as experiências in vivo demonstraram que a capacidade de bloqueamento de anticorpo dos ciclo-péptidos mutantes não é aparentemente afectada por uma redução do número de aminoácidos de um ciclo-péptido 25-mero para um 18-mero; tanto os dados in vitro como os dados in vivo demonstram uma comparabilidade excelente destes dois ciclo-péptidos mutantes contendo 2 cisteínas numa única ligação dissulfureto 25AA Cys/Ser ou 18AA Cys/Ser. Note-se contudo que tanto Cys/Ser 25AA-mero a 1,0 mg/kg como a uma dose elevada (i.e., 4,0 mg/kg de peso corporal) de mutantes Cys/Ser 18AA-mero 14

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT levam a um aumento transitório inicial dos titulos de anticorpo e assim adiaram uma redução significativa de titulos de anticorpo receptor até à terceira ou quarta aplicação de ciclo-péptido (terceiro ou quarto mês de terapia). Este fenómeno não ocorreu com doses de 1,0 ou 2,0 mg/kg de peso corporal de mutantes de ciclo-péptido 18AA Cys/Ser (figura 16B,C).

Os animais aos quais se administraram especialmente os péptidos ciclicos 18-mero ou 25-mero tal como aqui divulgados não apresentaram quaisquer sinais de anomalias e apenas se detectou o efeito pretendido do péptido administrado, nomeadamente apenas o bloqueamento de anticorpos anti-pi-AR. Assim, os péptidos tal como aqui proporcionados não apresentam quaisquer efeitos secundários ou toxicidade não desejável ao regime de dosagem aplicado. Tal foi adicionalmente aqui demonstrado mostrando que não se exerceu qualquer toxicidade no rim pelos péptidos ciclicos do invento (não se detectou qualquer obstrução mecânica das membranas dos glomérulos; figura 23) . Além disso, os parâmetros laboratoriais de rotina são indicativos da função renal ter permanecido normal em 12 meses de aplicação de péptidos ciclicos e não diferiu dos animais de controlo não tratados, (figura 22A, B). A capacidade de bloqueamento de anticorpo dos ciclo- péptidos mutantes deste invento não é afectada pelo comprimento do péptido, desde que o péptido não seja mais curto que 18 AA e não seja mais longo que 25 AA. Tal foi demonstrado de forma exemplar pela redução do número de aminoácidos do péptido desde 25 até 18. Na gama entre 18 e 25 aminoácidos, os péptidos ciclicos com 22 aminoácidos são os mais eficazes de acordo com este invento e assim, são uma concretização especialmente preferida. Apresenta-se um exemplo de tal péptido ciclico 22-mero especialmente preferido na fórmula IX'.

Uma vantagem dos mutantes de ciclo-péptido do presente invento é que por mutação de uma cisteina especifica (preferentemente a Cys correspondente a Cys 216 da sequência 15 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ de aminoácidos de βι-AR) para um resíduo de serina e a formação de reforço de uma ponte S-S intramolecular possível única através de um segundo processo de ciclização específico de S-S, aumenta a sua restrição conformacional. Comparativamente a péptidos conhecidos na especialidade o aumento desta restrição dos péptidos do invento leva a uma molécula que mimetiza melhor o epítopo apresentado na conformação nativa da segunda ansa βι-ECn à superfície da célula.

Os bloqueadores beta, tal como bisoprolol, que são utilizados na especialidade para o tratamento de DCM e outras doenças que são causadas por anticorpos anti-βι-AR estimulantes, reduzem significativamente tanto o ritmo cardíaco como a pressão arterial. Contrariamente, uma aplicação in vivo dos ciclo-péptidos mutantes do presente invento não tem impacto negativo sobre a função pulmonar, o ritmo cardíaco ou a pressão arterial (figuras 20 e 21). Além disso, uma série de parâmetros laboratoriais importantes para avaliar a função hepática e renal não foram influenciados por injecções repetidas de ciclo-péptido (figuras 22a/b e 23). Assim, os péptidos cíclicos do presente invento são, entre outros, especialmente adequados para o tratamento de diferentes grupos de doentes que de outro modo não poderiam ser tratados por utilização de um bloqueador beta, i.e. doentes que, por exemplo, já sofrem de bradicardia ou para os quais a utilização de bloqueadores beta não é possível devido a contra-indicações (tal como os que sofrem de doença pulmonar obstrutiva ou hipotensão).

Tal como mencionado, uma vantagem adicional dos meios e métodos do presente invento, particularmente em relação a meios e métodos baseados em péptidos (cíclicos) derivados de βι-ECn a ainda com 3 cisteínas (tal como, por exemplo divulgados em WO 2006/103101), é que se pode evitar a formação de misturas de isómeros de ciclo-péptidos. A caracterização bioquímica de uma mistura de isómeros de ciclo-péptidos diferentes, formados durante a ciclização de 16 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ péptidos compreendendo três ou mais resíduos de Cys, é laboriosa. Assim, a produção de fracções de péptido cíclico puro contendo apenas um tipo de isómero de ciclo-péptido consome tempo e dinheiro quando se utilizam péptidos compreendendo três ou mais resíduos de Cys. Tal é particularmente verdade quando os péptidos cíclicos se produzem segundo os padrões de boas práticas de fabrico.

Contrariamente, os péptidos cíclicos do presente invento podem ser facilmente caracterizados e produzidos como fracções puras do mesmo isómero. Tal leva a uma reprodutibilidade elevada. A vantagem específica dos péptidos do presente invento é a de serem evitadas as misturas de isómeros, que têm que ser separadas e devem ser caracterizadas em ensaios laboriosos e a de se omitir ultimamente pelo menos uma etapa de produção adicional (separação e/ou caracterização bioquímica) (consultar igualmente Sewald 2002). O presente invento baseia-se, entre outras, nas experiências descritas nos exemplos em apêndice.

No contexto destes exemplos, substituiu-se uma das cisteínas na posição 17 ou na posição 18 do ciclo-péptido βι-ECu 25AA por um resíduo de serina (mutação Cysi7 ou i8_Seri7 ou is), de modo a que apenas se possa formar uma ligação dissulfureto (S-S) intramolecular simples e individual (figura 1). Este tipo de medidas proporciona o potencial de reduzir efeitos secundários e de manter ou aumentar a eficácia biológica das construções do presente invento. Podem obter-se os péptidos cíclicos deste invento, contrariamente aos péptidos da especialidade anterior que formam misturas de isómeros, por processos de fabrico simples, robustos e altamente reprodutíveis. Estes podem ser eficazmente submetidos a aumento de escala. Além disso, estes processos evitam a separação de misturas de isómeros e são adequados a padrões de boas práticas de fabrico. Os exemplos anexos proporcionam os correspondentes métodos de fabrico/produção. 17 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Nos exemplos anexos, a ciclização dos péptidos do invento foi obtida, entre outros, pela introdução de uma mutação "DGlu", e.g. no local de fecho (do anel) do péptido cíclico; apresenta-se a mutação Gln<->-DGlu na figura 2) .

Além disso, reduziu-se o número de aminoácidos (AA) de 25AA para 22AA e adicionalmente para 18AA em conjuntos adicionais de ciclo-péptidos mutantes do presente invento. Esta medida apresenta o potencial de minimizar os potenciais efeitos secundários imunológicos das construções. Os ciclo-péptidos mutantes 18AA continham uma troca cisteína^serina na posição 14 ou na posição 13 (ciclo-péptidos mutantes 18AA contendo Cysi3-Seri4 ou Seri3-Cysi4, respect ivamente) em combinação ou não com uma troca (adicional) glutamina/ácido D-glutâmico, e.g. no local de fecho do anel do péptido cíclico (mutação Gln-»D-Glu) (figura 2). Os ciclo-péptidos mutantes 22AA continham uma troca cisteína^serina na posição 17 (22AA contendo Cysi6-Ser17) , opcionalmente combinada com a introdução de um resíduo Gly na posição 22 (um possível local de fecho de anel do péptido cíclico; figura 24). "intermediário"

Tomados conjuntamente, os dados experimentais in vitro assim como os dados in vivo aqui proporcionados demonstram claramente que a capacidade de bloqueamento de anticorpo dos ciclo-péptidos mutantes divulgados não é afectada pela redução do número de aminoácidos de um ciclo-péptido 25-mero para um ciclo-péptido 18-mero quando se utiliza uma dose na gama de 0,25 a 5,0 mg/kg de peso corporal e em particular desde 1,0 a 2,0 mg/kg de peso corporal. Os dados in vitro e in vivo demonstram uma comparabilidade excelente dos dois mutantes de ciclo-péptido contendo 2 cisteínas numa única ligação dissulfureto 25AA Cys/Ser (fórmulas VII/IX) ou 18AA Cys/Ser (fórmulas VI/VIII) a uma dose de 1,0 mg/kg de peso corporal; figuras 16 a 21. Contudo, os péptidos cíclicos "intermediários" de 19 a 24 AA apresentam uma actividade aumentada de acordo com este invento. Nomeadamente, os péptidos cíclicos de 22 AA apresentam um aumento de actividade de acordo com este invento. Um exemplo preferido de tal péptido cíclico "intermediário" é um péptido cíclico 18 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ compreendendo ou consistindo dos resíduos de aminoácido tal como apresentados na fórmula IX'.

Além disso, a natureza exacta da troca de um dos resíduos de cisteína por um resíduo de serina (i.e., mutação Cys/Ser ou Ser/Cys) determina de forma marcante a potência in vitro e também in vivo dos péptidos cíclicos divulgados (figuras 6-10 e 14-16).

Os receptores adrenérgicos β (β-AR), nomeadamente os receptores adrenérgicos βι (βι-AR), são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, a sequência de nucleótidos e de aminoácidos (SEQ ID NO. 40) de βι-AR humano (também denominado receptor adrenérgico β-l (ADRB1)) pode obter-se da entrada de base de dados NM_000684 ou NP_000675. Sabe-se que os β-AR formam dois domínios extracelulares aqui denominados como ECj e ECu ou β (i> —ECi e β(ι)-ΕΟΙΙ. Tal como anteriormente mencionado, os péptidos cíclicos do presente invento apresentam similaridade de sequência com βι-ECu, nomeadamente com a parte de aminoácidos DEARRCYNDPKCCDFV (SEQ ID NO. 33) ou RAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR (SEQ ID NO. 34) do βι-AR humano (posições de aminoácidos 204 a 219 ou 200 a 222, respectivamente) ou nomeadamente com a parte de aminoácidos DEARRCYNDPK (SEQ ID NO. 45) ou ESDEARRCYNDPK (SEQ ID NO. 46) do βι-AR humano. A expressão "β-AR" tal como aqui utilizada refere-se preferentemente a um receptor adrenérgico βι (βι-AR) , com maior preferência ao βι-AR humano anteriormente descrito.

Um péptido cíclico aqui proporcionado tem pelo menos uma das características seleccionadas do grupo que consiste de: a) ser capaz de ligar (auto)anticorpos contra a ansa ECu do receptor adrenérgico βι (βι-AR); b) ser capaz de inibir a interacção entre βι-AR e (auto)anticorpos contra a ansa ECu de βι-AR; e c) ser capaz de reduzir uma activação de βι-AR mediada por anticorpos. 19

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT A estrutura de βι-AR foi analisada, entre outros, por Warne (2008 Nature. DOI: 10.1038).

Tal como anteriormente mencionado, define-se o péptido ciclico do presente invento pela fórmula geral ciclo(x-Xh-Cys-x-x-x-xc-x-cys-y-xi-x) (fórmula I). Nesta fórmula, "y" pode ser qualquer residuo de aminoácido excepto Cys, preferentemente "y" pode ser qualquer residuo de aminoácido excepto Pro e excepto Cys. De um modo geral, "y" pode ser qualquer aminoácido, desde que este aminoácido não forme uma ligação intramolecular (e.g. uma ligação dissulfureto) com outro aminoácido do péptido ciclico aqui proporcionado (e.g. com outra Cys do péptido ciclico aqui proporcionado). Preferentemente, "y" pode ser qualquer aminoácido semelhante a Cys (i.e. com uma estrutura quimica semelhante e/ou um comportamento semelhante numa estrutura tridimensional do péptido), com a excepção de não formar uma ligação intramolecular (e.g. uma ligação dissulfureto) com outro aminoácido do péptido ciclico aqui proporcionado (e.g. com outra Cys do péptido ciclico aqui proporcionado) . Com maior preferência, "y" pode ser qualquer aminoácido polar com excepção de Cys, tal como Thr ou Ser. Com a maior preferência, no péptido ciclico aqui proporcionado, "y" é Ser ou um análogo de Ser. "Análogo de Ser" neste contexto significa um residuo, nomeadamente um residuo de aminoácido, com um carácter estrutural semelhante ao de Ser. "Análogo de Ser" refere-se a, por exemplo, um ou mais residuo (s) (de aminoácido) com uma estrutura química semelhante à de Ser e/ou um comportamento semelhante ao de Ser numa estrutura tridimensional de péptido. Como um exemplo adicional "y" pode também ser uma selenocisteína ou um seu análogo.

De um modo geral, o significado de expressões tais como "qualquer (resíduo) de aminoácido com excepção de Cys" ou "(residuo) de aminoácido diferente de Cys" é evidente para o perito na especialidade. Nomeadamente, tal como utilizado ao longo deste invento, tais expressões referem-se a qualquer aminoácido desde que este aminoácido não forme uma ligação intramolecular (e.g. uma ligação dissulfureto) com outro 20 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ aminoácido do péptido cíclico aqui proporcionado (e.g. com outra Cys do péptido cíclico aqui proporcionado).

Tal como mencionado, uma característica principal dos péptidos cíclicos deste invento é a de compreenderem apenas duas Cys capazes de formar uma ligação intramolecular. Tais péptidos cíclicos podem obter-se, por exemplo, por substituição de uma terceira Cys de um péptido homólogo ao β4-ECn por um aminoácido diferente. Deste modo, a Cys a ser substituída é aquela que corresponde à 2a ou preferentemente, à 3a Cys do βι-ECn que estão em proximidade directa entre si (posições de aminoácidos 215 e 216 de βι-AR humano (consultar igualmente NP_000675 e SEQ ID NO. 40). Estes dois resíduos Cys são aqui referidos como "Cys-Cys", "Cys/Cys", "Cys2i5-Cys2i6" ou "Cys2i5/Cys2i6" e semelhantes).

Os péptidos mutantes ou mutações resultantes tal como aqui divulgados são consequentemente designados como péptidos mutantes ou mutações "Cys-Ser", "Cys/Ser", CySi3, 16 ou 17-Seri4, 17 ou IS," ou "Cys43, i6 ou 17/Seri4, 17 ou 18V OU péptidos mutantes ou mutações "Ser-Cys", "Ser/Cys", "Seri3 ou i7-Cysi4 ou is" ou "Seri3 ou i7/Cysi4 ou is", dependendo de qual das Cys é substituída e de quantos aminoácidos compreendem o péptido mutante.

Alternativamente, os péptidos mutantes tal como aqui divulgados são definidos por referência às trocas específicas de aminoácidos em determinada posição. Assim, os péptidos mutantes/mutações denominam-se, por exemplo, péptidos mutantes/mutações "Cysi4, 17 ou i8^Seri4, 47 ou is" ou péptidos mutantes/mutações "Cysi3 ou 17-»Ser13 ou 17", dependendo se é a Cys correspondente a Cys2i6 ou a Cys correspondente a Cys2i5, respectivamente, de βι-AR que é substituída por um aminoácido diferente. Os índices "14, 17 ou 18" ou "13 ou 17" referem-se à posição no péptido cíclico do invento exemplificado, em que a posição 1 corresponde ao primeiro "x" tal como definido na fórmula I, i.e ciclo(x-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-Xi-x). 21 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Assim, utilizam-se expressões como péptidos mutantes/mutações "Cysi3-Ser14" ou "Cysi3/Seri4" com o mesmo sentido de péptidos mutantes/mutações "Cysi4^Seri4" referindo-se neste exemplo em particular aos péptidos 18-mero aqui divulgados. Utilizam-se expressões como péptidos mutantes/mutações "Cysi6-Seri7" ou "Cysi6/Ser47" com o mesmo sentido de péptidos mutantes/mutações "Cysi7^Seri7v, referindo-se neste exemplo em particular aos péptidos 22-mero aqui divulgados. Utilizam-se expressões como péptidos mutantes/mutações "Cysi7-Ser18" ou "Cysi7/Ser18" com o mesmo sentido de péptidos mutantes/mutações "Cysi8->Ser18" referindo-se neste exemplo em particular aos péptidos 25-mero aqui divulgados.

Analogamente utilizam-se expressões como péptidos mutantes/mutações "Seri3-Cysi4" ou "Seri3/Cysi4" com o mesmo sentido de péptidos mutantes/mutações "Cysi3^Ser43" referindo-se neste exemplo em particular aos péptidos 18-mero aqui divulgados e utilizam-se expressões como péptidos mutantes/mutações "Seri7-Cysi8" ou "Seri7/Cysi8" com o mesmo sentido de péptidos mutantes/mutações "Cysi7^Seri7" referindo-se neste exemplo em particular aos péptidos 25-mero aqui divulgados.

Os exemplos de indices anteriormente proporcionados referem-se à posição do aminoácido indicado no interior do péptido 18-mero, 22-mero ou 25-mero aqui divulgado em particular, respectivamente. No contexto deste invento, o ponto de partida relativamente a uma posição de aminoácido indicada proporcionada para um péptido cíclico aqui divulgado é o aminoácido do terminal N do esqueleto linearizado do péptido cíclico (tal como o primeiro "x" na fórmula I, consultar anteriormente). 0 ponto de partida relativamente a uma posição de aminoácido indicada proporcionada para um péptido cíclico aqui divulgado é o seu aminoácido N-terminal.

As revelações tal como aqui proporcionadas e nos exemplos anexos demonstram uma comparabilidade dos ciclo-péptidos 25AA, 22 AA e 18AA sem qualquer mutação Cys com os mutantes cíclicos 22 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT 25ΑΑ, 22ΑΑ ou 18ΑΑ Cysis, 17 ou i4^Seri8, 17 ou 14 (Cys-Ser) , mas não com os mutantes cíclicos 25AA ou 18AA Cysi7 ou i3->Seri7 ou i3 (Ser-Cys) .

Tal como igualmente anteriormente mencionado nas fórmulas do péptido cíclico do presente invento, h pode ser qualquer número inteiro entre 1 e 15, preferentemente entre 5 e 9 e/ou i pode ser qualquer número inteiro entre 0 e 14, preferentemente entre 1 e 14, com maior preferência entre 0 e 6 e ainda com maior preferência entre 1 e 6. Assim, h pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 e/ou i pode ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14. Preferentemente h é 5, 8 ou 9 e/ou i é 3, 4 ou 6. Com maior preferência h é 8 e/ou i é 4. Em concretizações especialmente preferidas deste invento, Xh representa as partes especificas de aminoácidos DEARR (SEQ ID NO. 35), AESDEARR (SEQ ID NO. 47) ou RAES DEARR (SEQ ID NO. 36) e/ou Xi representa as partes específicas de aminoácidos DFV (SEQ ID NO. 37), DFVT (SEQ ID NO. 48) ou DFVTNR (SEQ ID NO. 38). Em concretizações particulares mais preferidas deste invento xh representa a parte específica de aminoácidos AESDEARR (SEQ ID NO. 47) e/ou xi representa a parte específica de aminoácidos DFVT (SEQ ID NO. 48). O péptido cíclico do presente invento (ou a sua parte cíclica) pode consistir de pelo menos 18 aminoácidos e no máximo 25 aminoácidos. Assim, o péptido cíclico do presente invento pode consistir de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos, em que especialmente 18 ou 25 aminoácidos são preferidos e especialmente 22 aminoácidos são mais preferidos. Numa concretização menos preferida também se abrangem péptidos mais pequenos, i.e. péptidos compreendendo 16 ou 17 aminoácidos.

Um péptido cíclico especialmente preferido no contexto deste invento é aquele com um comprimento de (21 + 1=) 22AA, com um tamanho máximo e mínimo definido para a molécula cíclica dependendo da respectiva composição de aminoácidos, constituído por 21 aminoácidos da sequência primária original 23 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT do receptor adrenérgico betai humano (i.e., aminoácidos 200 a 221; Frielle 1987, PNAS 84, 7920-7924) com uma glicina adicional como o 22° aminoácido no presumível local de fecho do anel (posição 222).

Sem nos limitarmos à teoria, o número de aminoácidos e consequentemente o comprimento da estrutura primária (i.e. o esqueleto de aminoácido) dos péptidos cíclicos que ligam anticorpos anti-3i-AR é crucial para os seus efeitos biológicos e/ou fabrico bem-sucedido/eficaz.

Um comprimento de péptido igual ou superior a 26 aminoácidos (estrutura primária) pode estimular directamente (ou seja, sem a utilização de proteínas transportadoras) células T imunocompetentes e pode assim provocar um aumento paradoxal e não pretendido de produção de anticorpo anti- receptor-β! através de estimulação de células B mediada por células T.

Um comprimento de péptido inferior a 16 aminoácidos (estrutura primária) leva a cristalização indesejada durante o processo de produção e a problemas em dissolver os produtos sintetizados numa solução aquosa, e.g. com o objectivo de utilizar em injecções i.v. ou s.c.

Numa concretização menos preferida deste invento proporcionam-se péptidos cíclicos abrangidos pelas definições anteriormente proporcionadas a) a e) de fórmula I e consistindo de apenas 16 aminoácidos ou com ainda menor preferência, consistindo apenas de 17 aminoácidos. Um exemplo não limitativo de tal péptido cíclico menos preferido é o péptido ciclo(Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Tyr-Gln/DGlu) (que se forma a partir de um esqueleto de aminoácidos tal como representado em SEQ ID NO. 39). É aqui especialmente preferível que o péptido cíclico divulgado contenha apenas uma Pro. Assim, é especialmente preferível que nem o y nem um x das fórmulas aqui representadas, com excepção de xc, seja Pro. No interior da 24 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT parte de aminoácidos, xG tal como representando na fórmula I (ou outras fórmulas) é Pro. É particularmente aqui pretendido que o aminoácido ácido Asp preceda a Pro contida no péptido cíclico do invento. Assim é preferível que x tal como representado na fórmula I (ou outras fórmulas) que precede xc seja o aminoácido ácido Asp.

Mais especificamente, o péptido cíclico do presente invento pode definir-se pela fórmula I' ou I'': ciclo (xi-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-Xi-x) (1' ) ; ciclo(xin-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-Xi-x) (I'').

Ainda mais especificamente, o péptido cíclico do presente invento pode definir-se pela fórmula 1'' ' ou 1''' ' ·. ciclo (xI-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-x1-xII) ciclo (xIII-xh-Cys-x-x-x-xG-x-Cys-y-xi-Xiv) (I' ' ' ' ) .

De um modo geral, xi e χπ tal como representados nas fórmulas I' e I' ' ' (e nas outras fórmulas aqui representadas) podem ser, tal como mencionado, qualquer aminoácido com excepção de Cys. Contudo, especialmente quando o fecho do anel dos péptidos cíclicos do invento ocorre entre xi e xn, é especialmente pretendido que xi e Xn sejam aminoácidos capazes de formar uma ligação peptídica ou semelhante entre si em condições de ciclização "cabeça com cauda". As ciclizações "cabeça com cauda" são conhecidas na especialidade (e.g. Kates e Albericio: Solid phase synthesis, CRC-Press, 2000; Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005) e apresentam-se exemplos de tal na parte experimental. Possíveis exemplos de aminoácidos que podem ser xz são Gly, Vai, Thr, Ser e preferentemente Ala. Possíveis exemplos de aminoácidos que podem ser xn são Glu e preferentemente Gin. Com menor preferência xn pode também ser Asp ou Asn. Com a 25 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ maior preferência χι é Ala e xn é Gin ou Glu (preferentemente DGlu).

Assim, nos péptidos cíclicos deste invento xn tal como referido na fórmula 1' e 1'' ' pode ser Gin ou Glu, em que Glu pode também ser DGlu (D-Glu; ácido D-glutâmico). Contudo, são aqui preferidos aminoácidos de ocorrência natural. Consequentemente é mais preferível que χπ seja Gin. 0 perito na especialidade é capaz de escolher resíduos de aminoácidos adequados para ser χτ e/ou xn da fórmula I' e 1''' de acordo com este invento com base nos ensinamentos aqui proporcionados e no seu conhecimento da especialidade (e.g. Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005).

Xm e xIV tal como representados nas fórmulas I'' e I'''' (e nas outras fórmulas aqui representadas) podem, tal como mencionado, ser qualquer aminoácido com excepção de Cys. Contudo, particularmente quando o fecho do anel dos péptidos cíclicos do invento ocorre entre Xm e xIV, é especialmente pretendido que xm e xIV sejam aminoácidos capazes de formar uma ligação peptídica ou semelhante entre si em condições de ciclização "cabeça com cauda". Um possível exemplo de um aminoácido que pode ser xm é Arg. Um exemplo possível e mais preferido de um aminoácido que pode ser xIV é Gly ou um análogo de Gly. "Análogo de Gly" neste contexto significa um resíduo, especialmente um resíduo de aminoácido, com uma característica estrutural semelhante à de Gly. Nomeadamente "análogo de Gly" refere-se, por exemplo, a um residuo (de aminoácido) com tamanho igual (ou mesmo menor) a um resíduo Gly. Verificou-se surpreendentemente no contexto deste invento que especialmente um resíduo (de aminoácido) pequeno como Gly na posição "Xiv" leva a mimetização melhorada de ECn de βι-AR pelos correspondentes péptidos cíclicos do invento. O perito é capaz de escolher resíduos de aminoácidos adequados para serem xm e/ou xIV na fórmula I'' e I'''' de acordo com este invento com base nos ensinamentos aqui proporcionados e no seu 26 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ conhecimento da especialidade (e.g. Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005). É adicionalmente especialmente aqui preferido que os péptidos cíclicos deste invento não tenham Trp e/ou His. Assim, pretende-se especialmente no contexto do invento, que nem x nem y tal como representados em qualquer das fórmulas I a i'''' seja Trp ou His.

Além disso, prefere-se que os péptidos cíclicos proporcionados não tenham locais susceptíveis para protéases de hidrólise ou clivagem tais como, por exemplo, protéases séricas. Os significados das expressões "hidrólise" e " protéases (séricas)" são bem conhecidos na especialidade.

Um péptido tal como aqui proporcionado pode também descrever-se como um péptido consistindo ou compreendendo uma sequência de aminoácidos homóloga a SEQ ID NO. 33 (representando uma parte de aminoácidos de tipo selvagem compreendendo os epítopos de βι-ECn) , em que (a) o aminoácido correspondente à posição 13 (ou com menor preferência, correspondente à posição 12) de SEQ ID NO. 33 não é Cys e o aminoácido correspondente às posições 6 e 12 (ou com menor preferência, correspondente à posição 6 e 13) de SEQ ID NO. 33 é Cys, (b) em que a referida sequência de aminoácidos não contém qualquer Cys adicional capaz de formar uma ligação intramolecular no interior do péptido, i.e. no interior da parte do péptido que é homóloga a SEQ ID NO. 33 e em que o péptido pode funcionar como um péptido cíclico de acordo com este invento, e.g. é capaz de bloquear anticorpos anti-p-AR ou em que o péptido pode formar tal péptido cíclico.

Opcionalmente, as condições adicionais aqui proporcionadas relativamente à estrutura dos péptidos lineares e/ou cíclicos divulgados, aplicam-se aqui com as alterações correspondentes. 0 péptido assim definido consiste de uma parte de na 16 aminoácidos homóloga a SEQ ID NO. 33 flanqueada nos terminais N e C por um ou mais aminoácidos preferentemente aminoácidos de ocorrência natural tal como "xj" / "xm" 27 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT posição 1 e ο "xn/"xiv" na última posição das fórmulas 1' a j'''' aqui proporcionadas.

No contexto do invento e em particular no contexto da SEQ ID NO. 33 (de tipo selvagem), "homólogo" significa idêntico ao nível do aminoácido para pelo menos 18,75%, pelo menos 37,5%, pelo menos 50%, pelo menos 56,25%, pelo menos 62,5%, pelo menos 68, 75%, pelo menos 75%, pelo menos 81,25%, pelo menos 87,5% ou 93,75% em que são preferidos os valores mais elevados.

Em geral o significado da expressão "aminoácido" ou "resíduo aminoácido" é conhecido na especialidade e é aqui utilizado em conformidade. Desse modo, deve notar-se que quando um "aminoácido" é uma componente de um péptido/proteína a expressão "aminoácido" é aqui utilizada no mesmo sentido que "resíduo de aminoácido".

Nomeadamente, pretende-se preferentemente que um "aminoácido" ou "resíduo de aminoácido" tal como aqui referido seja um aminoácido de ocorrência natural, com maior preferência um L-aminoácido de ocorrência natural (com excepção do DGlu anteriormente mencionado). Contudo, apesar de ser menos preferido, um "aminoácido" ou "resíduo de aminoácido" no contexto deste invento pode também ser um aminoácido de ocorrência não natural (i.e. sintético) tal como, por exemplo, norleucina ou β-alanina ou especialmente no caso de "y" das fórmulas aqui representadas, selenocisteína ou um seu análogo.

Também é conhecido na especialidade o significado das expressões "aminoácido(s) ácido(s)", "aminoácido(s) básico(s)", "aminoácido(s) alifático(s)" e "aminoácido(s) polar(es)" (por exemplo, Stryer, Biochemie, Spectrum Akad. Verlag, 1991, Item I. 2.). Estas expressões são utilizadas consequentemente ao longo deste invento. Desse modo, também se aplicam as condições específicas aqui proporcionadas relativamente aos péptidos cíclicos do invento. 28 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Nomeadamente pretende-se que a expressão "aminoácido(s) ácido(s)" tal como aqui utilizada signifique um aminoácido seleccionado do grupo compreendendo Asp, Asn, Glu e Gin preferentemente Asp e Glu; pretende-se que a expressão "aminoácido(s) básico(s)" tal como aqui utilizada signifique um aminoácido seleccionado do grupo compreendendo Arg, Lys e His preferentemente Arg e Lys; pretende-se que a expressão "aminoácido(s) alifático(s)" tal como aqui utilizada signifique qualquer aminoácido seleccionado do grupo compreendendo Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Arg, Lys, Cys e Met; e pretende-se que a expressão "aminoácido(s) polar(es)" tal como aqui utilizada signifique qualquer aminoácido seleccionado do grupo compreendendo Cys, Met, Ser, Tyr, Gin, Asn e com menor preferência Trp.

Num aspecto mais geral, o péptido ciclico tal como aqui divulgado pode ser um péptido ciclico de fórmula II, III ou III' : ciclo (xi-xi-xi-x-x2-X2-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-Xi-Xn) (II); ciclo (xi-x2-x-xi-x-xi-xi-x-x2-x2-cys-x-x-x-xc-x-cys-y-xi-xn) (III) ; ciclo (xin-x-xi-x-xi-xi-x-x2-x2-cys-x-x-x-xc-x-cys-y-xi-xiv) (III' ) , em que a) xi é individual e independentemente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos ácidos; e/ou b) X2 é individual e independentemente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos básicos.

Num aspecto mais especifico, o péptido ciclico tal como aqui revelado pode ser um péptido ciclico de fórmula IV, V ou V' : ciclo (xI-xi-Xi-x4-X2-X2-Cys-X3-X5-x-xc-X2-Cys-y-Xi-X3-x3-xII) (IV) ; 29 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ ciclo (xi-x2-x4-xi-x4-xi-xi-x4-x2-x2-Cys-x3-x5-x-xc-x2-Cys-y-xi-x3“ Χ3-Χ4-Χ5-Χ2-Χ11) (V) ; ciclo (XlII-X4“Xl_X4_Xl_Xl_X4“X2_X2_CyS-X3-X5-X-XC-X2-CyS-y-Xi-X3-X3- Χ4-Χιν) (ν' ) , em que a) xi é individual e independentemente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos ácidos; b) x2 é individual e independentemente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos básicos; c) x3 é individual e independentemente seleccionado do grupo que consiste de Leu, Ile, Vai, Met, Trp, Tyr e Phe; d) X4 é individual e independentemente seleccionado do grupo que consiste de Ser, Thr, Ala e Gly; e/ou e) X5 é individual e independentemente seleccionado do grupo que consiste de Gin e Asn.

Num aspecto adicional, os péptidos cíclicos compreendem uma parte de aminoácido tal como definido pela posição de aminoácido 2-12 ou 2-14 de fórmula II ou IV, uma parte de aminoácido tal como definido pela posição de aminoácido 4-16 ou 4-18 de fórmula III ou V ou uma parte de aminoácido tal como definido pela posição de aminoácido 3-15 ou 3-17 de fórmula III' ou V'. Num aspecto mais geral, o péptido cíclico tal como aqui revelado pode ser um péptido cíclico de fórmula II, III ou III'.

Num aspecto adicional particular, o péptido cíclico tal como aqui revelado pode compreender a parte de aminoácidos aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas; aci-neu-aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas; aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas-Cys-Ser; ou aci-neu-aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas-Cys-Ser, 30 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ em que "aci" representa aminoácido ácido, "neu" representa aminoácido neutro e "bas" representa aminoácido básico. Cada resíduo de aminoácido das duas partes de aminoácido anteriores pode também definir-se independentemente como o resíduo de aminoácido correspondente de qualquer uma das fórmulas I, II, III, III', IV, V e V' tal como aqui proporcionadas. O péptido cíclico tal como aqui proporcionado compreende a parte de aminoácido

Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 45) ou

Glu-Ser-Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 46), em que Xxx4 se define como "x" ou "x4", Xxx3 define-se como "x" ou "x3" e/ou Xxx4 define-se como "x" ou "x4" tal como mencionado nas fórmulas acima representadas. Por exemplo, a parte de aminoácido anteriormente mencionada pode ser

Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 45) ou

Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 46).

Pretende-se especialmente aqui que os péptidos cíclicos deste invento compreendam um ou mais epítopos existentes em βι-ECu tal como, por exemplo, epítopos presentes em qualquer uma das partes de aminoácido anteriormente mencionadas (ou em partes dos péptidos cíclicos divulgados compreendendo estas partes de aminoácido). Neste contexto, a expressão "epítopo" refere-se especialmente a uma parte de aminoácido à qual se liga um (auto)anticorpo anti-p4-AR. Especificamente um epítopo no contexto deste invento consiste em pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 14 aminoácidos. O perito na especialidade está em posição de deduzir qual ou quais o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) especifico(s) de βι-ECu que 31

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT contribuem para um ou mais epítopo(s) aos quais os (auto)anticorpos anti-pi-AR se ligam. Assim, este pode deduzir quais os residuos de aminoácidos específicos que têm pelo menos que estar compreendidos nos péptidos cíclicos deste invento de modo a assegurar que estes péptidos liguem (auto)anticorpos anti-Pi-AR. Para este objectivo, podem utilizar-se vários meios e métodos conhecidos na especialidade (por exemplo, meios e métodos para mapeamento de epítopo (tal como PepSpots™, Biacore, varrimento de aminoácidos (tal como varrimento de alanina)).

Exemplos não limitativos de um péptido cíclico de acordo com este invento são péptidos cíclicos seleccionados do grupo que consiste de: a) péptidos cíclicos formáveis ou formados pela sequência de aminoácidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 41, 43, Ia4el7a20; b) péptidos cíclicos formáveis ou formados por uma sequência de aminoácidos tal como codificada por uma sequência de

nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 42, 44, 9 a 12, 25 a 28, 49, 50, 53 e 54; e c) péptidos cíclicos formáveis ou formados por uma sequência de aminoácidos tal como codificada por uma sequência de nucleótidos que é diferente da sequência de nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 42, 44, 9 a 12, 25 a 28, 49, 50, 53 e 54 devido à degenerescência do código genético.

De acordo com este invento, são especialmente preferidos aqueles péptidos cíclicos que sejam péptidos mutantes Cys-Ser, i.e. com a Cys correspondente à terceira Cys do βι-ECn (uma Cys na posição 216 de βχ-AR) trocada por Ser. Os exemplos anteriormente proporcionados referem-se a tais péptidos cíclicos especialmente preferidos. Tal como demonstrado nos exemplos anexos tais péptidos cíclicos são especialmente úteis para inibição ou diagnóstico de anticorpos anti^i-AR. 32 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Proporciona-se a estrutura específica dos péptidos cíclicos especialmente preferidos anteriormente exemplificados por qualquer uma das seguintes fórmulas VI a IX': ciclo(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-

Phe-Val-Thr-Gly) (IX’); ciclo(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln) (VI); ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-

Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg*Gln) (VII); ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val- DGIu) (VIII); e ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-

Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGIu) (IX).

Exemplos não limitativos dos péptidos cíclicos menos preferíveis são péptidos cíclicos seleccionados do grupo que consiste de: a) péptidos cíclicos formáveis ou formados pela sequência de aminoácidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 5 a 8 e 21 a 24; b) péptidos cíclicos formáveis ou formados por uma sequência de aminoácidos tal como codificada por uma sequência de

nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 13 a 16 e 29 a 32; e c) péptidos cíclicos formáveis ou formados por uma sequência de aminoácidos tal como codificada por uma sequência de nucleótidos que é diferente da sequência de nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 2 9 a 32 devido à degenerescência do código genético. 33 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Proporciona-se a estrutura específica dos péptidos cíclicos menos preferidos anteriormente exemplificados por qualquer uma das seguintes fórmulas X a XIII: ciclo(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Gln) (X); ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser:Cys-

Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln) (XI); ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val- DGIu) (XII); cicla(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-|_ys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGIu) (XIII).

Os péptidos anteriores são menos preferidos dado que os péptidos tal como os péptidos mutantes "Cys-Ser" (péptidos cíclicos "Cys-Ser") são entre outros, mais funcionais in vivo do que os aqui definidos e menos preferidos péptidos mutantes "Ser-Cys" (péptidos cíclicos "Ser-Cys").

Neste contexto note-se que os exemplos mais preferidos dos péptidos cíclicos de acordo com este invento são especialmente aqueles péptidos cíclicos cuja função farmacológica e/ou diagnóstica foi demonstrada nos exemplos anexos (e.g. aqueles que se caracterizam por qualquer uma das fórmulas VI a IX').

Considerar-se-á que para os diferentes péptidos do presente invento é possível uma certa flexibilidade e variabilidade de sequência primária, i.e. o esqueleto de sequência de aminoácidos, desde que se assegure a estrutura secundária e terciária global dos respectivos péptidos, que é definida por pelo menos alguns resíduos de aminoácidos fixos e pelo seu arranjo espacial (consultar, e.g., fórmula I, anteriormente) . 34 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Com base nos ensinamentos aqui proporcionados o perito na especialidade está facilmente em posição de por um lado, verificar as variantes correspondentes dos péptidos do invento; por outro lado, o perito na especialidade é capaz de testar se determinada variante de péptidos do presente invento ainda tem a função pretendida, por exemplo a capacidade de se ligar especificamente a anticorpos β-AR e consequentemente tem o potencial para uma intervenção médica correspondente, tal como as aplicações terapêuticas e diagnósticas aqui descritas e proporcionadas. A orientação experimental correspondente para tais testes, i.e. os ensaios respectivos, é aqui proporcionada e descrita nos exemplos nomeadamente nos exemplos anexos.

Assim também se revelam aqui variantes dos péptidos aqui divulgados e descritos desde que, primeiramente, estas variantes ainda sejam activas funcionalmente de acordo com este invento, i.e. activas funcionalmente como parceiras de ligação para anticorpos anti-p-AR, nomeadamente para anticorpos anti-3i-AR contra o βι-ECu mais especificamente activas funcionalmente como inibidoras de βι-AR e ainda com maior preferência activas na inibição da interacção entre βι-AR e anticorpos anti-Pi-AR contra o βι-ECu, com maior preferência auto-anticorpos anti^i-AR contra o βι-ECu; e em segundo lugar, essas variantes não estejam presentes na forma de misturas de isómeros ou não formem misturas de isómeros quando ciclizam de acordo com um método de produção tal como aqui divulgado. Pretende-se que estas variantes tenham apenas dois determinados resíduos Cys a formar ou que sejam capazes de formar apenas uma ligação intramolecular individual (e.g. ligação dissulfureto).

Entre as variantes dos péptidos do presente invento, por exemplo, pretende-se que um ou mais aminoácidos dos referidos péptidos seja(m) substituído(s) por um outro ou mais aminoácido(s) de ocorrência natural ou sintético. Neste contexto, prefere-se que esta(s) troca(s) de aminoácido(s) seja(m) troca(s) de aminoácido(s) conservativa(s); i.e. que o aminoácido de substituição pertença à mesma categoria de 35

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT aminoácidos do aminoácido a ser substituído. Por exemplo, um aminoácido ácido pode ser substituído por outro aminoácido ácido, um aminoácido básico pode ser substituído por outro aminoácido básico, um aminoácido alifático pode ser substituído por outro aminoácido alifático e/ou um aminoácido polar pode ser substituído por outro aminoácido polar.

Assim, são particularmente preferidos e proporcionados variantes dos (ciclo)péptidos do presente invento, variantes em que pelo menos um aminoácido ácido é substituído por um aminoácido diferente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos ácidos, pelo menos um dos aminoácidos básicos é substituído por um aminoácido diferente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos básicos, pelo menos um aminoácido polar é substituído por um aminoácido diferente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos polares e/ou pelo menos um aminoácido alifático é substituído por um aminoácido diferente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos alifáticos (desde que se verifiquem os requisitos anteriormente mencionados).

Pretende-se particularmente que a troca de aminoácidos que leva a variantes dos péptidos (cíclicos) divulgados seja de modo a que o padrão de polaridade e carga do interior da estrutura terciária da variante resultante ainda mimetize substancialmente a estrutura tridimensional do(s) epítopo(s) ECu correspondentes de βι-AR.

Relativamente às "variantes" dos (ciclo)péptidos do presente invento as Cys aqui definidas podem também ser substituídas por outros aminoácidos, desde que a substituição ainda leve a uma ligação intramolecular individual tal como uma ligação dissulfureto, no interior do ciclo-péptido, i.e. evitar a formação de misturas de isómeros durante a ciclização e/ou uma mimetização correcta da ECu de βι-AR. Tal aminoácido pode entre outros, ser um aminoácido de ocorrência não natural, tal como um aminoácido de ocorrência não natural com um grupo -SH capaz de formar uma ligação dissulfureto. Contudo, prefere-se aqui que a Cys proporcionada na fórmula I, 36 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ anteriormente, seja de facto um aminoácido de ocorrência natural preferentemente a própria Cys.

Considerar-se-á igualmente pelo perito na especialidade que um ou mais dos aminoácidos que formam o péptido (cíclico) do presente invento podem ser modificados. De acordo com isso, qualquer aminoácido tal como aqui utilizado pode também representar a sua forma modificada. Por exemplo, um resíduo de alanina tal como aqui usado pode compreender um resíduo de alanina modificado. Tais modificações podem entre outras, ser uma metilação ou acilação ou semelhantes, pelo que tal modificação ou aminoácido modificado é preferentemente abrangida pelo presente invento desde que o aminoácido assim modificado e mais particularmente o péptido contendo o referido aminoácido assim modificado ainda seja activo funcionalmente tal como aqui definido, tal como activo funcionalmente como um inibidor de anticorpos anti-3i-AR, preferentemente activo na inibição da interacção entre βι-AR e anticorpos e com maior preferência auto-anticorpos dirigidos contra βι-AR. Os ensaios respectivos para determinar se tal péptido, i.e. um péptido compreendendo um ou vários aminoácidos modificados, cumpre este requisito, são conhecidas do perito na especialidade e entre outras também são aqui descritas nomeadamente na parte de exemplos aqui. 0 invento também proporciona derivados dos péptidos (cíclicos) divulgados tais como sais de ácidos fisiológicos orgânicos e inorgânicos tais como HC1, H2SO4, H3PO4, ácido málico, ácido fumárico, ácido citrónico, ácido tartárico, ácido acético.

Tal como aqui utilizadas, as sequências dos péptidos aqui divulgados são indicadas do terminal N para o terminal C, pelo que o terminal N é do lado esquerdo e o terminal C é do lado direito da respectiva representação da sequência de aminoácidos. Quando em referência a péptidos cíclicos, indicam-se as sequências correspondentes do lado correspondente ao lado esquerdo da fórmula I para o lado correspondente ao lado direito da fórmula I. 37 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Um "péptido cíclico" ou "ciclo-péptido" e semelhantes de acordo com o presente invento é um péptido que forma intramolecularmente uma estrutura de anel molecular no interior do seu esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária por pelo menos uma, preferentemente pelo menos duas, com maior preferência exactamente duas ligações intramoleculares com carácter covalente. A formação desta estrutura em anel molecular é no contexto deste invento também denominada "ciclização".

Numa concretização especialmente preferida, o péptido cíclico deste invento tem duas ligações intramoleculares com carácter covalente em que uma dessas ligações é uma ligação intramolecular entre as extremidades N-terminal e C-terminal de um péptido do esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária do péptido cíclico divulgado e a outra é uma ligação intramolecular entre dois aminoácidos não terminais deste péptido. Tal com mencionado estes dois aminoácidos não terminais podem ser duas Cys.

De um modo geral a "ciclização" de acordo com este invento pode ocorrer em pelo menos uma ligação que é uma ligação covalente seleccionada do grupo que consiste de ligações S-S, ligações peptídicas, ligações de carbono tais como C-C ou C=C, ligações éster, ligações éter, ligações azo, ligações C-S-C, ligações C-N-C e ligações C=N-C.

Nomeadamente, a ligação peptídica mencionada ao longo deste invento pode formar-se pelo grupo NH2 de um aminoácido N-terminal e o grupo COOH de um aminoácido C-terminal de um péptido que forme o esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária do péptido cíclico divulgado.

Preferentemente uma ligação intramolecular entre as extremidades N-terminal e C-terminal de um péptido que forme a o esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária do péptido cíclico divulgado é uma ligação peptídica e uma 38 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ ligação intramolecular entre dois aminoácidos não terminais deste péptido é uma ligação S-S (i.e. ligação dissulfureto).

No contexto deste invento pode formar-se uma ligação S-S intramolecular no interior do péptido cíclico proporcionado entre dois resíduos Cys no interior do esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária do referido péptido cíclico.

No interior dos péptidos cíclicos deste invento podem formar-se não apenas as duas ligações covalentes intramoleculares particulares anteriores mas podem também ocorrer ligações intramoleculares adicionais, com a condição de que se mantenha a funcionalidade dos péptidos cíclicos aqui descrita e que os péptidos cíclicos possam ainda ser facilmente caracterizados bioquimicamente o que significa, e.g., que não se formam misturas de isómeros durante a ciclização de aminoácidos do correspondente esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária.

Por exemplo tais ligações intramoleculares adicionais são ligações adicionais formadas por uma cadeia lateral de grupos NH2 e grupos COOH dos aminoácidos constituintes.

As expressões tais como "esqueleto de aminoácido" ou "sequência de aminoácidos primária" tal como utilizada ao longo do presente invento referem-se por um lado, à componente ou parte estrutural de um péptido cíclico que é formável ou formada pela sua sequência de aminoácidos correspondente; por outro lado, estas expressões referem-se aos péptidos lineares capazes de formar os péptidos cíclicos deste invento por ciclização.

Num aspecto particular, divulga-se um péptido cíclico que é obtenível pelo método para produzir um péptido cíclico tal como aqui proporcionado. As definições aqui anteriormente proporcionadas também se aplicam relativamente a este péptido cíclico particularmente divulgado. 39 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Num aspecto, também se divulgam tais péptidos pelos quais os péptidos cíclicos divulgados são formáveis ou são formados. Particularmente esses péptidos são os péptidos lineares que formam ou são capazes de formar os péptidos cíclicos aqui divulgados, i.e. o seu esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária.

De um modo geral tal péptido linear pode ser qualquer péptido cuja ligação covalente do terminal N e C resulte num péptido cíclico tal como divulgado de acordo com o presente invento. Por exemplo, tal péptido linear pode ser algum tipo de composto intermediário num procedimento de produzir os péptidos cíclicos deste invento, tal como o método para produzir um péptido cíclico tal como aqui divulgado.

De um modo geral a extremidade N-terminal e C-terminal de um péptido linear aqui divulgado pode ser qualquer par de aminoácidos existente em proximidade directa entre si no interior do esqueleto de aminoácidos de um péptido cíclico divulgado no contexto deste invento. Por outras palavras, a ciclização (fecho do anel) do péptido cíclico deste invento pode ocorrer geralmente entre quaisquer dos referidos pares de aminoácidos. 0 perito na especialidade está facilmente em posição de investigar tais pares de aminoácidos em particular que são eficazes/adequados para actuar como as extremidades N-terminal e C-terminal de um péptido linear aqui divulgado, i.e. que são ef icazes/adequados para actuar como um par de aminoácidos que está envolvido no fecho do anel/ciclização tal como definido no contexto deste invento.

Num exemplo preferido mas não limitativo, a ciclização (fecho do anel) de um péptido linear deste invento pode ocorrer entre Ala e Gin ou Glu, i.e. o aminoácido N-terminal deste péptido linear seria Ala e o aminoácido C-terminal seria Gin ou Glu. São exemplos de tais péptidos lineares capazes de formar o péptido cíclico do presente invento SEQ ID NO. 1 a 4 e com menos preferência SEQ ID NO. 5 a 8. 40 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Noutro exemplo preferido mas não limitativo, a ciclização (fecho do anel) de um péptido linear deste invento pode ocorrer entre Lys e Pro, i.e. o aminoácido N-terminal deste péptido linear seria Lys e o aminoácido C-terminal seria Pro. São exemplos de tais péptidos lineares capazes de formar o péptido cíclico do presente invento SEQ ID NO. 17 a 20 e com menos preferência SEQ ID NO. 21 a 24.

Num exemplo mais preferido mas não limitativo, nomeadamente quando se proporciona um péptido cíclico 22-mero, a ciclização (fecho do anel) de um péptido linear tal como aqui divulgado pode ocorrer entre Arg e Gly, i.e. o aminoácido N-terminal deste péptido linear seria Arg e o aminoácido C-terminal seria Gly. Um exemplo de tal péptido linear capaz de formar o péptido cíclico do presente invento é SEQ ID NO. 41.

Noutro exemplo mais preferido mas não limitativo, nomeadamente quando se proporciona um péptido cíclico 22-mero, a ciclização (fecho do anel) de um péptido linear tal como aqui divulgado pode ocorrer entre Lys e Pro, i.e. o aminoácido N-terminal deste péptido linear seria Lys e o aminoácido C-terminal seria Pro. Um exemplo de tal péptido linear capaz de formar o péptido cíclico do presente invento é SEQ ID NO. 43.

Além do seu esqueleto de aminoácido, os péptidos cíclicos do invento podem compreender adicionalmente (e.g. ter ligado covalentemente) (a) substituinte(s) adicional/adicionais, tal como marcadores, âncoras (tal como âncoras membranares proteáceas), caudas (tal como caudas de HIS) e semelhantes. Os peritos na especialidade conhecem substituintes e métodos para os adicionar ao péptido cíclico deste invento.

Os exemplos de marcadores neste contexto incluem entre outros, fluorocromos (tais como fluoresceína, rodamina, vermelho de Texas, etc.), enzimas (tais como peroxidase de rábano, β-galactosidase, fosfatase alcalina), isótopos radioactivos (tais como 32P, 33P, 35S, 1251 ou 1231, 1351, 1241, 11C, 150), biotina, digoxigenina, metais coloidais, compostos quimiluminescentes ou bioluminescentes (tais como 41 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ dioxetanos, luminol ou acridinas). Um marcador particularmente pretendido que pode estar ligado ao péptido deste invento é um fluorocromo pertencente a um par de fluorocromos de FRET, por exemplo uma GFP variante (e.g. GFP, eGFP, EYFP ou ECFP).

Estão disponíveis várias técnicas para marcar biomoléculas, são bem conhecidas dos peritos na especialidade e consideram-se abrangidas pelo âmbito do presente invento e compreendem entre outras, acoplamento covalente de enzimas ou grupos biotinilo, fosforilações, biotinilações, iniciação aleatória, traduções com corte, introdução de caudas (utilizando transferases terminais). Tais técnicas são, e.g., descritas em Tijssen, "Practice and theory of enzyme immunoassays", Burden e von Knippenburg (Ed.), Volume 15 (1985); "Basic methods in molecular biology", Davis LG, Dibmer MD, Battey Elsevier (1990); Mayer, (Ed.) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, Londres (1987); ou na série "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. Os métodos de detecção compreendem entre outros, auto-radiografia, microscopia de fluorescência, reacções enzimáticas directas e indirectas, etc. 0(s) substituinte(s) podem ligar-se (e.g. covalentemente) aos péptidos cíclicos do invento directamente ou através de ligantes. O perito na especialidade está facilmente em posição de investigar ligantes apropriados para serem utilizados neste contexto.

Num aspecto adicional, divulga-se aqui uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica o esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária de um péptido cíclico tal como divulgado no contexto deste invento.

Divulga-se aqui adicionalmente uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica os péptidos lineares tal como aqui descritos. 42

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Por exemplo tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 42, 44, 9 a 12, 25 a 28, 49, 50, 53 e 54 ou com menor preferência, SEQ ID NO. 13 a 16 e 29 a 32 ou uma sequência de nucleótidos que difira dessas devido à degenerescência do código genético.

Os significados das expressões "molécula(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de ácido nucleico" e "sequência(s) de nucleótidos" e semelhantes são bem conhecidas na especialidade e são utilizadas em conformidade no contexto do presente invento.

Por exemplo; quando utilizados ao longo deste invento estas expressões referem-se a todas as formas de sequências de nucleótidos e/ou sequências/moléculas de ácidos nucleicos de ocorrência natural ou geradas de forma recombinante, assim como a sequências de nucleótidos e/ou sequências/moléculas de ácidos nucleicos sintetizadas quimicamente. Estas expressões também abrangem análogos de ácidos nucleicos e derivados de ácidos nucleicos tais como e.g. ADN travado, ANP, tiofosfatos de oligonucleótido e ribo-oligonucleótidos substituídos. Além disso estas expressões referem-se também a qualquer molécula que compreenda nucleótidos ou análogos de nucleótidos.

Preferentemente as expressões "molécula(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de ácido nucleico" e "sequência(s) de nucleótidos" e semelhantes referem-se a ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN). As "molécula(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de ácido nucleico" e "sequência(s) de nucleótidos" podem ser produzidas por metodologia de química sintética conhecida pelo perito na especialidade ou por utilização de tecnologia recombinante ou podem isolar-se a partir de fontes naturais ou por uma sua combinação. O ADN e o ARN podem compreender opcionalmente nucleótidos não naturais e podem ser em cadeia simples ou dupla. "Molécula(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de ácido nucleico" e "sequência(s) de nucleótidos" também se referem a ADN e ARN em sentido e anti-sentido ou seja, uma sequência de 43 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ nucleótidos que é complementar a uma sequência de nucleótidos específica em ADN e/ou ARN.

Além disso as expressões "molécula(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de ácido nucleico" e "sequência(s) de nucleótidos" e semelhantes podem referir-se a ADN ou ARN ou seus híbridos ou qualquer das suas modificações que são conhecidas no estado da especialidade (consultar, e.g., US 5525711, US 4711955, US 5792608 ou EP 302175 para exemplos de modificações). Estas moléculas podem ser em cadeia simples ou dupla, lineares ou circulares, naturais ou sintéticas e sem qualquer limitação de tamanho. Por exemplo, a(s) "molécula(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de ácido nucleico" e "sequência(s) de nucleótidos" podem ser ADN genómico, ADNc, ARNm, ARN anti-sentido, ribozimas ou um ADN que codifica tais ARN ou quimeroplastos (Cole-Strauss Science 1996 273(5280) 1386-9). Podem estar na forma de um plasmídeo ou de ADN ou ARN vírico. "Molécula(s) de ácido nucleico", "sequência(s) de ácido nucleico" e "sequência (s) de nucleótidos" e semelhantes podem também referir-se a um ou mais oligonucleótido(s), em que se incluem quaisquer modificação do estado da especialidade tal como modificações tal como fosfotiolatos ou ácidos nucleicos peptídicos (ANP).

As moléculas de ácido nucleico tal como aqui divulgadas são particularmente úteis para produzir um péptido cíclico do invento, por exemplo pelo método correspondente aqui divulgado.

Noutro aspecto, também se divulga aqui um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico tal como aqui divulgada e anteriormente descrita. O referido vector pode ser um vector de clonagem ou um vector de expressão, por exemplo, um fago, plasmídeo, vector virico ou retrovirico. Os vectores retrovíricos podem ter replicação competente ou replicação deficiente. No último caso, a propagação vírica ocorrerá geralmente apenas em hospedeiros/células de complementação. Pode juntar-se a 44 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ molécula de ácido nucleico aqui divulgada a um vector específico contendo marcadores seleccionáveis para propagação num hospedeiro. De um modo geral, introduz-se um vector plasmídico num precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio ou precipitado de cloreto de rubídio ou num complexo com um lípido carregado ou em agregados baseados em carbono tal como fulerenos. Sendo o vector um vírus, pode ser empacotado in vitro utilizando uma linha celular de empacotamento apropriada antes da aplicação a células hospedeiras.

Preferentemente a molécula de ácido nucleico tal como aqui divulgada está ligada operacionalmente a sequências de controlo de expressão (e.g. no interior do vector aqui revelado) permitindo expressão em células procarióticas ou eucarióticas ou suas fracções isoladas. A expressão do referido polinucleótido compreende transcrição da molécula de ácido nucleico preferentemente num ARNm traduzível. Os elementos de regulação que asseguram expressão em células eucarióticas, preferentemente células de mamífero, são bem conhecidos dos peritos na arte. Estes compreendem habitualmente sequências de regulação que asseguram iniciação de transcrição e opcionalmente sinais de poli-A que asseguram terminação de transcrição e estabilização do produto de transcrição. Os elementos de regulação adicionais podem incluir facilitadores de transcrição assim como facilitadores de tradução. Os elementos de regulação possíveis que permitem expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, e.g., o promotor lac, trp ou tac em E. coli e exemplos para elementos de regulação que permitem expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor A0X1 ou GAL1 em levedura ou o promotor CMV, SV40, RSV (vírus de sarcoma de Rous), facilitador CMV, facilitador SV40 ou um intrão de globina em células de mamíferos e de outros animais. Além de elementos que são responsáveis pela iniciação de transcrição, tais elementos de regulação podem também compreender sinais de terminação de transcrição tal como local SV40-poli-A ou o local tk-poli-A a jusante do polinucleótido. Neste contexto conhecem-se na especialidade vectores de expressão adequados 45 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ tais como vector de expressão de ADNc Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogen), pSPORTl (GIBCO BRL) . Preferentemente o referido vector é um vector de expressão e/ou um vector de transferência de gene. Os vectores de expressão derivados de virus tais como retrovirus, adenovirus, vírus vaccinia, vírus adeno-associados, virus herpes ou vírus do papiloma bovino podem ser usados para entrega dos polinucleótidos ou vector tal como aqui divulgado numa população de células alvo. Podem utilizar-se métodos que são bem conhecidos dos peritos na especialidade para construir um vector tal como aqui divulgado; consultar, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1994). Alternativamente os polinucleótidos e vectores tal como aqui divulgados podem reconstituir-se em lipossomas para entrega a células alvo. A expressão "suas fracções isoladas" refere-se a fracções de células eucarióticas ou procarióticas ou tecidos que são capazes de transcrever ou transcrever e traduzir ARN do vector aqui divulgado. As referidas fracções compreendem proteínas que são necessárias para transcrição de ARN ou transcrição de ARN e tradução do referido ARN para um polipéptido. As referidas fracções isoladas podem ser e.g., fracções nucleares e citoplasmáticas de células eucarióticas tais como reticulócitos. Estão comercialmente disponíveis kits para transcrição e tradução de ARN que abrangem as referidas fracções isoladas de células ou tecidos e.g., como reticulolisado TNT (Promega).

Mais uma vez, tal como as moléculas de ácido nucleico divulgadas, também os vectores tal como aqui descritos são particularmente úteis para produzir um péptido cíclico do invento por exemplo pelo método correspondente aqui divulgado.

Num aspecto adicional divulga-se aqui uma célula hospedeira recombinante compreendendo a molécula de ácido 46 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ nucleico e/ou ο vector tal como aqui divulgado. No contexto deste aspecto a molécula de ácido nucleico e/ou o vector tal como aqui divulgado pode ser utilizada, entre outros, para conceber racionalmente por engenharia genética células hospedeiras, e.g., de modo a expressar e isolar o esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária do péptido ciclico aqui divulgado e consequentemente o péptido linear tal como aqui divulgado. A referida célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica; consultar anteriormente. A molécula de ácido nucleico ou vector que está presente na célula hospedeira pode ser integrada no genoma da célula hospedeira ou pode ser mantida extra-cromossomicamente. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica tal como uma célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal, de mamífero ou preferentemente humana. As células fúngicas preferidas são, por exemplo, as do género Saccharomyces em particular as da espécie S. cerevisiae ou as pertencentes ao grupo de fungos híficos, por exemplo várias estirpes penicillia ou aspergilla. Pretende-se que a expressão "procariótico" inclua todas as bactérias que podem ser transformadas ou transfectadas com uma molécula de ácido nucleico para a expressão de uma esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária do péptido cíclico aqui divulgado e consequentemente do péptido linear aqui divulgado. Os hospedeiros procarióticos podem incluir bactérias gram negativas assim como gram positivas tal como, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. Uma molécula de ácido nucleico que codifica para um esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária do péptido cíclico aqui divulgado e consequentemente do péptido linear aqui divulgado pode utilizar-se para transformar ou transfectar um hospedeiro utilizando qualquer das técnicas usualmente conhecidas dos peritos na especialidade. São bem conhecidos na especialidade métodos para preparar genes fundidos e ligados operacionalmente e para expressá-los em células bacterianas ou animais (Sambrook, anteriormente). As 47

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT construções genéticas e métodos aqui descritos podem ser utilizados para expressão do esqueleto de aminoácidos / sequência de aminoácidos primária e péptido linear anteriormente mencionados em, e.g., hospedeiros procarióticos.

De um modo geral utilizam-se em conexão com o hospedeiro vectores de expressão contendo sequências de promotor que facilitam a transcrição eficaz do polinucleótido inserido. 0 vector de expressão contém tipicamente uma origem de replicação, um promotor e um terminador assim como genes específicos que são capazes de proporcionar selecção fenotípica das células transformadas. Os hospedeiros procarióticos transformados podem ser cultivados em fermentadores e cultivados de acordo com técnicas conhecidas na especialidade para obter um crescimento celular óptimo. Podem então isolar-se os péptidos expressos do meio de crescimento, lisados celulares ou fracções membranares celulares. 0 isolamento e purificação dos péptidos expressos em micróbios ou de outro modo pode ser por quaisquer meios convencionais tais como por exemplo, separações cromatográficas preparativas e separações imunológicas tais como aquelas que envolvem a utilização de anticorpos monoclonais ou policlonais (Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1994)).

Mais uma vez tal como para as moléculas de ácido nucleico e vectores tal como aqui descritos, também as células hospedeiras correspondentes são particularmente úteis para produzir um péptido cíclico do invento por exemplo pelo método correspondente aqui divulgado.

Ainda noutro aspecto o presente invento refere-se a um método para produzir um péptido cíclico do presente invento compreendendo as etapas de a) (i) cultivar uma célula hospedeira recombinante tal como aqui divulgada em condições tais que o esqueleto de aminoácidos do péptido cíclico aqui divulgado (ou do 48 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ péptido linear aqui divulgado) seja expresso e recuperação do referido esqueleto de aminoácido (ou referido péptido linear); ou (ii) sintetizar quimicamente o esqueleto de aminoácidos do péptido cíclico aqui divulgado (ou do péptido linear aqui divulgado); e b) ciclização do referido esqueleto de aminoácido (ou referido péptido linear) para formar o péptido cíclico aqui divulgado.

As definições aqui apresentadas anteriormente relativas à expressão "ciclização" aplicam-se aqui, com as alterações necessárias. No contexto especifico do método anterior, o significado da expressão "ciclização" abrange tanto a formação da ponte intramolecular (ligação dissulfureto) como o fecho do anel por ligação covalente dos terminais N e C dos esqueletos dos péptidos cíclicos a serem produzidos.

As definições aqui proporcionadas relativamente ao péptido cíclico, ao seu esqueleto de aminoácido ou ao péptido linear correspondente de acordo com este invento, assim como relativamente à célula hospedeira aqui divulgada aplicam-se aqui, com as alterações necessárias.

Tal como já mencionado anteriormente relativamente aos péptidos cíclicos e lineares divulgados, numa concretização preferível deste aspecto adicional do invento o aminoácido N-terminal do esqueleto de aminoácidos/péptido linear a ser ciclizado de modo a produzir um péptido cíclico deste invento é Ala, Arg ou Lys e o aminoácido C-terminal correspondente é Gin, Gly ou Glu (sendo também possível DGlu) ou Pro. Contudo, tal como anteriormente mencionado, também se pretendem outros aminoácidos N-terminais e C-terminais, i.e. podem utilizar-se também outros locais de ciclização (fecho de anel) no contexto do método divulgado. 0 perito na especialidade é facilmente capaz de aplicar o método aqui divulgado para produzir na prática um péptido 49 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ cíclico com base nos seus conhecimentos gerais comuns e na especialidade anterior tal como WO 2006/103101, que revela uma metodologia geral sobre como sintetizar péptidos e em particular péptidos cíclicos. De igual modo, os ensinamentos do invento, por exemplo na parte experimental em anexo (exemplo 1) proporcionam orientação técnica nesse sentido.

No exemplo 1 não limitativo do invento sintetizaram-se primeiramente os ciclo-péptidos mutantes na forma dos seus péptidos lineares/esqueletos de aminoácido (por exemplo por aplicação de uma abordagem de síntese química tal como a estratégia Fmoc / terc-butilo (tal como descrito em WO 2006/103101; Chen W.C. e White P.D.: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press 2003)) e foram então ciclizados covalentemente no esqueleto por condensação do grupo carboxilo C-terminal com o grupo amino do aminoácido N-terminal (ciclização "cabeça-cauda"; Kates S. e Albericio F.: Solid phase synthesis, CRC-Press, 2000).

Subsequentemente estabelece-se uma ligação dissulfureto entre os dois resíduos de cisteína dos péptidos lineares que são capazes de formar uma ligação dissulfureto (e.g. entre CyS7 e Cysi3 do péptido 18-mero, entre Cysio e Cysi6 do péptido 22-mero ou entre Cysn e Cysi7 do péptido 25-mero) por interacção química conhecida na especialidade (e.g. Benoiton N.L.: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005).

Em geral, no contexto da etapa de "ciclização" do método anteriormente descrito; o fecho do anel do esqueleto linear dos péptidos cíclicos a ser produzidos pode efectuar-se antes ou após a formação da ponte S-S. Noutras palavras, a ponte S-S entre os dois resíduos Cys da cadeia de AA dos péptidos pode ser a primeira etapa do procedimento de "ciclização" do processo de produção descrito e o fecho do anel pode ser a segunda etapa ou vice-versa. O perito na especialidade é capaz de investigar qual destas abordagens específicas é adequada para determinado conjunto de pré-condições de produção. 50

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Tal como anteriormente mencionado, os péptidos lineares / esqueletos de aminoácidos dos péptidos cíclicos a serem produzidos podem também ser produzidos por técnicas de engenharia recombinante. Tais técnicas são bem conhecidas na especialidade (e.g. Sambrook, anteriormente). Tal como também anteriormente mencionado através deste tipo de produção dos referidos péptidos lineares / esqueletos de aminoácidos pode tirar-se particular vantagem das moléculas de ácido nucleico, vectores e/ou células hospedeiras aqui divulgadas e descritas. As definições correspondentes proporcionadas anteriormente aplicam-se aqui, com as alterações necessárias.

Conhecem-se na especialidade várias abordagens de síntese de péptidos em especial abordagens de péptidos cíclicos, (e.g. Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005). O perito na especialidade está facilmente em posição de aplicar o conhecimento anterior da especialidade aos requisitos específicos do método divulgado para produzir péptidos cíclicos com base nos ensinamentos aqui proporcionados.

Tal como já anteriormente mencionado, também se divulga aqui um péptido cíclico obtenível ou obtido pelo método anteriormente descrito mas também um péptido linear correspondente (esqueleto de aminoácido / sequência primária do péptido cíclico correspondente) obtenível ou obtido pelo método anteriormente descrito como algum tipo de produto intermédio (particularmente um produto obtenível ou obtido pela etapa a) do método anteriormente descrito).

De um modo geral o péptido cíclico de acordo com o presente invento pode, entre outros, utilizar-se em abordagens de intervenção médica. Tais abordagens compreendem a utilização como um agente de diagnóstico ou fazendo parte deste para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças ou a utilização como uma composição ou como parte, preferentemente uma composição farmacêutica, uma composição de diagnóstico ou um kit de diagnóstico, preferentemente para a 51

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT detecção de anticorpos anti-p-AR com maior preferência para a detecção de anticorpos anti-pi-AR.

Tal como mencionado os anticorpos tal como aqui definidos ou descritos são preferentemente auto-anticorpos.

Descrevem-se aqui utilizações e aplicações não limitativas dos compostos divulgados nomeadamente do péptido cíclico de acordo com o presente invento, por exemplo no seguinte. 0 presente invento também se refere a uma composição compreendendo um péptido ciclico tal como proporcionado no contexto do presente invento e opcionalmente um transportador.

Numa concretização particular deste aspecto, a referida composição é uma composição farmacêutica e o referido transportador é um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição deste invento, especialmente a composição farmacêutica deste invento é especialmente para a utilização no tratamento, melhoria ou prevenção tal como aqui descrito e definido. Assim, a composição farmacêutica deste invento pode ser para utilização no tratamento, melhoria ou prevenção de uma doença na qual a actividade de um β-AR está aumentada ou para o tratamento de um doente com anticorpos contra um β-AR. Além disso a composição farmacêutica deste invento pode ser para utilização na indução de tolerância imunitária de um doente nomeadamente tolerância imunitária de um doente relativamente às partes imunogénicas de βι-AR endógeno.

Além de conter pelo menos um péptido cíclico do presente invento, a composição (farmacêutica) proporcionada pode compreender dois ou vários (tal como pelo menos 3 ou pelo menos 5) péptidos cíclicos do presente invento.

Do mesmo modo, não apenas um mas também dois ou vários (tal como pelo menos 3 ou pelo menos 5) dos referidos péptidos cíclicos podem ser para utilização na administração a um doente com necessidade de intervenção médica de acordo com o 52 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ presente invento. Desse modo a administração dos referidos mais que um péptidos cíclicos pode ser simultânea ou sucessiva.

Além disso numa concretização específica o presente invento refere-se à composição farmacêutica, ao método ou utilizações para intervenção médica ou ao péptido cíclico ou à composição farmacêutica tal como aqui divulgado, em que o referido péptido cíclico é para ser administrado conjuntamente ou a referida composição farmacêutica compreende pelo menos um agente farmaceuticamente activo adicional. 0 referido pelo menos um agente farmaceuticamente activo adicional pode ser um bloqueador de receptor β, preferentemente um bloqueador β-AR selectivo tal como, por exemplo, um bloqueador p!-AR seleccionado do grupo que consiste de atenolol, metoprolol, nebivolol, bisoprolol e semelhantes. Sem limitações teóricas este tipo de combinação em particular proporciona protecção da regulação negativa de βι-AR induzida por anticorpo e selectiva pelos péptidos cíclicos aqui proporcionados dado que βι-AR é ao mesmo tempo regulado positivamente por bloqueadores beta, tais como bisoprolol ou metoprolol e resulta em última análise num efeito sinergístico dos péptidos cíclicos e do(s) bloqueador(es) β adicionais. 0 transportador opcionalmente compreendido na composição (farmacêutica) do invento ou a ser administrado conjuntamente com a composição (farmacêutica) ou o péptido cíclico do invento pode ser especificamente um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Tais transportadores são bem conhecidos na especialidade. 0 perito na especialidade está facilmente em posição de investigar quais os transportadores que são particularmente adequados para serem utilizados de acordo com o presente invento. 53

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

No que se segue descrevem-se vários esquemas de administração não limitativos e a utilização de um correspondente transportador adequado farmaceuticamente aceitável.

Para utilização numa administração da composição farmacêutica e/ou dos péptidos cíclicos de acordo com este invento através de injecção subcutânea (s.c.) ou intravenosa (i.v.), podem formular-se os compostos do invento em solução aquosa preferentemente em tampões compatíveis fisiologicamente tais como solução de Hank, solução de Ringer ou soro fisiológico tamponado. Para administração transmucosa e transpulmonar utilizam-se na formulação penetrantes adequados à barreira a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na especialidade. A utilização de transportadores farmaceuticamente aceitáveis para formular os compostos de acordo com o presente invento em dosagens ou composições farmacêuticas adequadas para administração sistémica, i.e. intravenosa/intra-arterial ou subcutânea encontra-se abrangida pelo âmbito do presente invento. Com escolha adequada de transportador e prática de fabrico adequada as composições do presente invento, em particular aquelas que se formulam como soluções, podem ser administradas parentericamente tal como por injecção intravenosa. Os compostos podem ser facilmente formulados utilizando transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na especialidade em dosagens adequadas para administração subcutânea ou oral. Tais transportadores permitem que os compostos de acordo com o presente invento sejam formulados como comprimidos, pílulas, cápsulas, drageias, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes para ingestão oral por um indivíduo a ser ensaiado.

Os compostos de acordo com o presente invento ou os medicamentos que os compreendem, com o intuito de serem administrados intracorporalmente/intracelularmente podem ser administrados utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos 54 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ na especialidade. Por exemplo tais agentes podem ser encapsulados em lipossomas e seguidamente administrados tal como anteriormente descrito. Os lipossomas são bicamadas lipidicas esféricas com interiores aquosos. Todas as moléculas presentes numa solução aquosa na altura da formação do lipossoma são incorporadas no interior aquoso. 0 conteúdo do lipossoma está protegido do microambiente externo e devido aos lipossomas fundirem com as membranas celulares são entregues eficazmente perto da superfície celular. São divulgados sistemas de entrega envolvendo lipossomas na patente U.S. n° 4 880 635 de Janoff et al. As publicações e patentes proporcionam descrições úteis de técnicas para entrega de fármacos por lipossomas.

As composições farmacêuticas compreendendo um composto de acordo com o presente invento para utilização em administração parentérica e/ou subcutânea incluem soluções aquosas do(s) composto(s) activo(s) em forma solúvel em água. Adicionalmente podem preparar-se suspensões dos compostos activos como suspensões de injecção oleosas apropriadas. Os solventes lipofílicos ou veículos adequados incluem óleos gordos tais como óleo de sésamo ou óleo de rícino ou ésteres de ácidos gordos sintéticos tais como oleato de etilo ou triglicéridos ou lipossomas. As suspensões de injecções aquosas podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano ou semelhantes. Opcionalmente a suspensão pode também conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas e para permitir uma libertação lenta e constante da substância no organismo. É claro para o perito na especialidade que de acordo com o presente invento, a composição farmacêutica ou péptido cíclico divulgados podem ser administrados numa dose farmacêutica/terapeuticamente eficaz o que significa que se atinge uma quantidade farmacêutica/terapeuticamente eficaz do composto administrado. Preferentemente uma dose farmacêutica/terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade do 55 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ composto administrado (ingrediente activo) que produz melhoria dos sintomas ou um prolongamento da sobrevivência de um indivíduo que pode ser determinada pelo perito na especialidade efectuando ensaios de rotina.

Deve notar-se que o regime de dosagem dos compostos a ser administrados de acordo com o presente invento será determinado pelo médico assistente e por factores clínicos. Tal como é bem conhecido na especialidade médica as dosagens para qualquer doente individual dependem de muito factores incluindo o tamanho do doente, área superficial corporal, idade, o composto especifico a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral e outros fármacos que estejam a ser administrados concomitantemente. 0 perito na especialidade está ciente e é capaz de ensaiar as doses relevantes às quais os compostos a ser medicamente aplicados de acordo com o presente invento devem ser administrados.

Tal como aqui apresentado o efeito dos péptidos cíclicos aqui proporcionados, nomeadamente o bloqueamento de anticorpos anti-pi-AR pode obter-se de uma forma dependente da dose. Desse modo, a eficácia dos ciclo-péptidos mutados Cys->Ser tal como aqui divulgados depende de uma concentração limiar (figuras 14, 15 e 16 B,C).

Assim, a composição farmacêutica ou péptido cíclico divulgados podem ser especialmente administrados de um modo que está presente numa concentração, i.e. atinge uma concentração limiar de pelo menos 0,05 mg por kg de peso corporal preferentemente numa concentração de pelo menos 0,1 mg por kg de peso corporal, com maior preferência na gama de 0,1 mg por kg de peso corporal (100 pg/kg) a 100 mg por kg de peso corporal, com maior preferência numa gama de 1 mg por kg de peso corporal a 100 mg por kg de peso corporal e com maior preferência numa gama de 1 mg por kg de peso corporal a 10 mg por kg de peso corporal. Nomeadamente, a dose eficaz da composição farmacêutica ou péptido cíclico divulgados pode ser cerca de 1 mg por kg de peso corporal. Também se considera geralmente atingir concentrações mais elevadas da composição 56

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT farmacêutica ou péptido cíclico divulgados com esquemas de administração correspondentemente aplicados. Por exemplo, tais concentrações mais elevadas podem ser de pelo menos 2, 3, 4 ou 5 mg por kg de peso corporal. Preferem-se concentrações de pelo menos 1 mg por kg de peso corporal ou de pelo menos 2 mg por kg de peso corporal.

Um esquema de administração especialmente preferido e não limitativo a ser aplicado no contexto deste invento é uma aplicação s.c. ou i.v. cada duas ou quatro semanas.

Neste contexto deve notar-se que no modelo de rato aqui utilizado foi suficiente uma dose de 1 a 4 mg/kg i.v. em meses alternados para obter níveis terapêuticos dos compostos de acordo com o presente invento, sendo a respectiva dosagem para humanos preferentemente cerca de 0,3-10 mg/kg i.v. ou s.c, sendo com maior preferência cerca de 1-10 mg/kg i.v. ou s.c. e sendo ainda com maior preferência cerca de 1-5 mg/kg i.v. ou s.c.

Tal como aqui demonstrado a administração dos péptidos cíclicos divulgados pode desencadear inicialmente uma resposta imunitária contrária transitória, em particular quando aplicados em doses mais elevadas. Tais respostas imunitárias transitórias a longo prazo são compensadas pela actividade de inactivação de anticorpo dos péptidos cíclicos administrados. Tal pode levar a um efeito desacelerado dos péptidos cíclicos administrados, i.e. uma eliminação desacelerada de anticorpos anti-Pi-AR e portanto uma redução desacelerada de actividade (aberrante) βι-AR. O presente invento também se refere a um péptido cíclico ou uma composição farmacêutica tal como aqui revelada e opcionalmente um transportador farmaceuticamente aceitável, para utilização a) no tratamento, melhoria ou prevenção de uma doença em que a actividade de β-AR, de preferência βι-AR, é melhorada; 57 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ b) no tratamento de um doente apresentando anticorpos contra um β—AR, de preferência contra βι-AR, ou que sofre ou que se encontra em risco de desenvolver uma doença tal como aqui divulgada; ou c) na indução de tolerância imunitária.

As doenças que sofrerão intervenção médica (tratadas, melhoradas, prevenidas ou diagnosticadas) de acordo com este invento ou as doenças das quais o doente, tal como aqui definido e descrito, sofre são de preferência aquelas em que o βι-AR é activado de uma forma não fisiológica, com maior preferência é activado por anticorpos, com maior preferência por auto-anticorpos que são dirigidos contra o βι-AR.

Como exemplo e de preferência, as doenças que terão intervenção médica, de acordo com este invento ou as doenças das quais o doente, tal como aqui definido e descrito, sofre compreendem, no entanto, o grupo das doenças cardíacas, sem limitações a este grupo.

Em particular, as doenças cardíacas que terão intervenção médica, de acordo com este invento, ou as doenças cardíacas das quais o doente, tal como aqui definido e descrito, sofre podem compreender, entre outras, doença cardíaca infecciosa e não infecciosa, doença cardíaca isquémica e não isquémica, doença cardíaca inflamatória e miocardite, dilatação cardíaca, cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia dilatada (idiopática) (DCM), cardiomiopatia imunitária, insuficiência cardíaca e qualquer arritmia cardíaca incluindo sístoles ventriculares e/ou supraventriculares prematuras, bem como qualquer arritmia auricular incluindo fibrilação auricular e ou "flutter" auricular.

Por outras palavras, a doença cardíaca tal como referida nas descrições e definições aqui proporcionadas relativamente aos métodos ou ao péptido cíclico ou à composição farmacêutica do invento podem ser doenças cardíacas seleccionados do grupo compreendendo doença cardíaca infecciosa e não infecciosa, 58 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ doença cardíaca isquémica e não isquémica, doença cardíaca inflamatória e miocardite, dilatação cardíaca, cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia dilatada (idiopática) (DCM), cardiomiopatia imunitária, insuficiência cardíaca e qualquer arritmia cardíaca incluindo sístoles ventriculares e/ou supraventriculares prematuras, bem como qualquer arritmia auricular incluindo fibrilação auricular e ou "flutter" auricular.

Deve salientar-se que a doença mais preferida que deve ter intervenção médica (tratada, melhorada, prevenida ou diagnosticada) de acordo com este invento ou a doença mais preferida da qual o doente, tal como aqui definido e descrito, sofre é DCM, de preferência DCM idiopática.

Um subgrupo particular de "doentes" para o objectivo do presente invento são os doentes que sofrem de qualquer das doenças aqui descritas, mais particularmente o grupo de doenças cardíacas aqui descritas e que simultaneamente contêm anticorpos dirigidos contra β-AR, com maior preferência anticorpos contra o βι-AR, em que os anticorpos são de preferência auto-anticorpos.

Pretende-se que uma doença que terá intervenção médica (tratada, melhorada, prevenida ou diagnosticada) de acordo com este invento ou uma doença da qual o doente, tal como aqui definido e descrito, sofre, seja induzida por anticorpos contra um β-AR, de preferência por anticorpos contra βι-AR. De preferência, estes anticorpos são auto-anticorpos.

Os meios e métodos aqui proporcionados são particularmente úteis quando proporcionados na profilaxia/prevenção de uma doença, tal como aqui definida. Tal significa que um doente pode ser tratado com o péptido cíclico e/ou composição farmacêutica do invento antes do início (de sintomas) de uma doença, tal como aqui definida. Por exemplo, este tratamento preventivo pode seguir-se a uma aplicação de diagnóstico precedente que, e.g., beneficie dos meios e métodos de diagnóstico aqui proporcionados. Assim, é preferível que se 59 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ aplique um tratamento preventivo que beneficia dos meios e métodos terapêuticos deste invento, quando se diagnostica o risco de desenvolver uma doença tal como aqui definida, e.g. quando se detectam (auto-)anticorpos anti-3-AR.

Neste contexto, um "doente" preferido é aquele que se encontra em risco de desenvolver uma doença, tal como aqui definida. Em particular, tal doente é aquele contendo (auto-)anticorpos anti-p-AR, de preferência (auto-)anticorpos anti-pi-AR, mas que (ainda) não sofre de uma doença, tal como aqui definida, ou seus sintomas.

Pensa-se que a tolerância imunitária a ser induzida no contexto deste invento seja particularmente obtida por supressão da produção de anticorpos contra segmentos imunogénicos da molécula β-AR que, sem limitações teóricas, pode ser devida a um bloqueamento dos locais de reconhecimento de antigénio das células B precoces (maduras) e células B de memória produtoras de anticorpos.

Encontra-se abrangido pelo presente invento que a composição farmacêutica ou péptido cíclico proporcionado é particularmente para a utilização no tratamento, prevenção e/ou melhoria de qualquer das doenças e grupos de doentes ou doentes, tal como aqui definidos, incluindo a detecção de anticorpos anti-p-AR nestes doentes por utilização dos compostos supramencionados.

Um "doente" para os objectivos do presente invento, i. e. a quem se irá administrar um composto de acordo com o presente invento ou que sofre da doença tal como aqui definida e descrita ou que se pretende que seja diagnosticado de acordo com este invento, inclui humanos e outros animais e organismos. Assim, os compostos e métodos deste invento são aplicáveis ou relacionados com terapia humana e aplicações veterinárias incluindo diagnóstico(s), procedimentos e métodos de diagnóstico, bem como procedimentos e métodos de encenação. Na concretização preferida, o doente é um mamífero e na concretização mais preferida o doente é humano. 60 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Os péptidos cíclicos mutantes de acordo com o presente invento também podem ser utilizados para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de qualquer das doenças e grupos de doentes/doentes, tal como aqui definidos. 0 que aqui foi referido para a composição farmacêutica aplica-se também para o fabrico de um medicamento para o qual se podem utilizar os péptidos do presente invento.

Ainda num aspecto adicional, revela-se aqui um agente de diagnóstico compreendendo ou sendo um péptido cíclico ou uma composição de acordo com este invento e opcionalmente pelo menos um composto activo biologicamente adicional.

De preferência, o agente de diagnóstico aqui divulgado consiste ou compreende um péptido mutante do presente invento, em que o péptido mutante compreende um marcador. Tal marcador pode ser seleccionado do grupo compreendendo marcadores radioactivos e marcadores fluorescentes. Os peritos na especialidade conhecem os marcadores respectivos. As definições e descrições dos marcadores tal como aqui apresentadas anteriormente, aplicam-se aqui, com as respectivas alterações. Tipicamente, o péptido é a parte do agente de diagnóstico que confere características de ligação específica ao agente de diagnóstico, de preferência ligação a anticorpos anti-βι-ΑΚ, enquanto o marcador confere as características de sinalização ao agente de diagnóstico. O agente de diagnóstico, tal como aqui divulgado, pode compreender, além de (um) péptido(s) mutante(s) marcado(s) ou não marcado(s) do presente invento, um composto activo biologicamente adicional. Tal composto activo biologicamente adicional pode ser um meio para conferir características de sinalização ao agente de diagnóstico, em particular no caso dos péptidos mutantes do presente invento não estarem marcados. Por exemplo, o composto biologicamente activo adicional pode ser um anticorpo, de preferência um anticorpo monoclonal e com maior preferência um anticorpo marcado que se liga especificamente a um péptido mutante do presente invento 61

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT ou a um complexo que consiste de um péptido mutante do presente invento e um anticorpo anti-p-AR, de preferência um anticorpo anti-pi-AR.

Num aspecto adicional, divulga-se aqui um método para diagnóstico de uma doença tal como aqui definida e descrita compreendendo as etapas de a) detectar anticorpos contra um β-AR (por exemplo numa amostra) utilizando o péptido cíclico ou a composição ou o agente de diagnóstico do presente invento; e b) diagnosticar a referida doença, quando o título dos referidos anticorpos estar aumentado.

Num aspecto adicional, divulgam-se aqui péptido mutantes, composições farmacêuticas e medicamentos de acordo com o presente invento para utilização num método para diagnosticar um doente que pode ser tratado utilizando os referidos compostos de acordo com o presente invento. No contexto deste método particular pode também ser utilizada uma etapa de detectar anticorpos contra um β-AR (por exemplo numa amostra) utilizando os compostos do presente invento e/ou uma etapa em que se considera que o resultado da referida etapa de detecção indica uma doença tal como aqui definida. Tal como mencionado, há indicação de uma doença, tal como aqui definida, ou de risco de desenvolver uma doença, tal como aqui definida, quando há um aumento do título dos referidos anticorpos antί-β-AR.

Noutro aspecto, divulga-se aqui um péptido cíclico, uma composição ou um agente de diagnóstico tal como aqui proporcionado e descrito para utilização em diagnóstico (por exemplo numa amostra) de uma doença tal como aqui definida. Uma vez mais, uma doença tal como aqui definida ou o risco de desenvolver uma doença tal como aqui definida é indicado pelo aumento do título de anticorpos anti^-AR.

No contexto do presente invento, a expressão "titulo aumentado de anticorpos anti^-AR" significa que o título de 62 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ anticorpos anti-p-AR (por exemplo numa amostra derivada de um doente a ser diagnosticado de acordo com este invento) é maior do que o de um doente de controlo saudável, i.e. um doente que não sofre de uma doença tal como aqui definida e/ou um doente isento de anticorpos anti-β-ΑΚ.

Tal como mencionado, em doentes saudáveis, é usualmente difícil encontrar anticorpos anti-p-AR ou não se encontram presentes ou detectáveis. Assim, um "título aumentado de anticorpos anti-p-AR" de acordo com o presente invento de preferência refere-se a qualquer ocorrência de anticorpos anti-3~AR, i.e. qualquer ocorrência de uma quantidade detectável de anticorpos anti^-AR.

Uma "amostra" adequada de acordo com o presente invento inclui, entre outras, amostra(s) biológica(s) ou médica(s), tais como, e.g. (uma) amostra(s) compreendendo célula(s) ou tecido(s). Por exemplo, tal(is) amostra(s) pode(m) compreender material biológico de biópsias. 0 significado de "biópsias" é conhecido na especialidade. Por exemplo, as biópsias compreendem célula(s) ou tecido(s) obtidos, e.g. pelo médico assistente, de um doente/indivíduo tal como aqui descrito. A título exemplificativo, sem limitações, a amostra biológica ou médica a ser analisada no contexto do presente invento é ou é derivada de sangue, plasma, glóbulos brancos, urina, sémen, expectoração, fluido cefalorraquidiano, linfa ou tecidos ou células linfáticas, células musculares, células cardíacas, células de veias ou artérias, células dos nervos, células da espinal-medula, células cerebrais, células hepáticas, células renais, células do tracto intestinal, células dos testículos, células do tracto urogenital, células do cólon, pele, osso, medula óssea, placenta, fluido amniótico, cabelo, cabelo e/ou folículos, células estaminais (embrionárias, neuronais e/ou outras) ou linhas celulares primárias ou imortalizadas (linfócitos, macrófagos ou linhas celulares). As "amostras" preferidas, de acordo com o presente invento, são as derivadas de sangue ou plasma. A amostra biológica ou médica tal como aqui definida pode também ser ou ser derivada de biópsias, por 63 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT exemplo biópsias derivadas de tecido cardíaco, veias ou artérias.

Num aspecto adicional, divulga-se aqui um kit de diagnóstico, por exemplo um kit de diagnóstico para a detecção de anticorpos contra um β-AR, compreendendo o péptido cíclico, composição ou agente de diagnóstico aqui divulgados. 0 kit divulgado compreende pelo menos um dos compostos, tal como divulgado de acordo com o invento, tal como por exemplo, um péptido cíclico ou linear, uma molécula de ácido nucleico, vector ou célula hospedeira ou uma composição ou agente de diagnóstico.

Num aspecto particular, o kit compreende adicionalmente um folheto de instruções e/ou um tampão para utilização na aplicação do kit e/ou pelo menos um vaso reaccional para efectuar a reacção de detecção para a qual é utilizado o kit. Num aspecto adicional, pelo menos um, alguns ou todos os reagentes utilizados em conexão com a aplicação do referido kit encontram-se presentes como partes úteis para efectuar a(s) reacção(ões) para a(s) qual(is) se utilizará o kit.

Os péptidos cíclicos, agentes de diagnóstico ou kits, tal como aqui divulgados, podem também ser aplicados para a detecção de βι-AR. Assim, estes péptido cíclicos, agentes de diagnóstico ou kits podem ser particularmente úteis para identificar/detectar anticorpos anti^i-AR ligados às superfícies celulares e/ou de tecidos. Por exemplo, os péptidos cíclicos, agentes de diagnóstico ou kits, tal como aqui divulgados, podem ser utilizados para objectivos de imagem, tal como tomografia computorizada de emissão de fotão único (SPECT), MiBi, PET, tomografia por ressonância magnética (MRT) ou outras técnicas de imagiologia de diagnóstico utilizadas em medicina. Devido ao padrão de distribuição in vivo de CP marcado com 1311 (figura 30), os péptidos cíclicos, agentes de diagnóstico divulgados podem, por exemplo, ser particularmente úteis como marcadores específicos de órgãos. 64

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Uma abordagem particular para utilizar os compostos de acordo com o presente invento como um diagnóstico e num método de diagnóstico, respectivamente, é um procedimento de rastreio em três etapas. Por exemplo, este método compreende efectuar uma ELISA com os péptidos cíclicos de acordo com o presente invento, bem como determinar a imunofluorescência e as respostas cAMP em células que expressam β-AR humano nativo. Deve reconhecer-se que cada uma e qualquer das etapas supramencionadas pode ser efectuada para a detecção dos referidos anticorpos, utilizando os péptidos cíclicos de acordo com o presente invento. Pode então rastrear-se um elevado número de doentes, por exemplo doentes de insuficiência cardíaca, para anticorpos anti-βι-ΑΚ activos funcionalmente. Em conexão com tais métodos de diagnóstico (mas também com outros aqui divulgados), a definição de anticorpos anti-βι-ΑΚ activos funcionalmente é de preferência baseada nos seus efeitos na sinalização mediada por receptor, ou seja, nos seus efeitos nos níveis celulares de cAMP e na actividade da proteína quinase dependente de cAMP (PKA). 0 AMP cíclico é um mensageiro secundário universal de muitos receptores acoplados a proteína G, incluindo a família β-AR. Exerce os seus efeitos através de PKA, canais iónicos dependentes de cAMP, fosfodiesterases e proteínas de permuta directamente activadas por cAMP, conhecidas como Epacl e Epac2. A especialidade prévia descreve vários métodos de fluorescência para medir cAMP em células intactas que podem ser todos utilizados em conexão com o método de diagnóstico aqui divulgado. Descreveu-se transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) entre variantes de proteína fluorescente verde (GFP) fundidas com subunidades de regulação e catalíticas de PKA para estudar a dinâmica espacio-temporal de cAMP em neurónios (Hernpel CM, Vincent P, Adams SR, Tsien RY, Selverston AI. Nature. 1996; 384:113-114) ou miócitos cardíacos. (Zaccolo M, Pozzan T., Science. 2002; 295:1711-1715) .

Mais recentemente, foram descritos na especialidade indicadores de fluorescência em cadeia simples que são caracterizados por terem uma proteína fluorescente ciano (CFP) 65 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ ou amarela melhorada (YFP) directamente fundida ao domínio de ligação de cAMP de proteínas Epac, o que permitiu atingir uma maior sensibilidade e melhor resolução temporal das medições de cAMP. Tal sistema é descrito, entre outros, em W02005/052186. Tal sistema pode ser utilizado em conexão com qualquer procedimento de diagnóstico utilizando os péptidos cíclicos ou outros compostos correspondentes de acordo com o presente invento. Igualmente, tal sistema pode ser utilizado, entre outras utilizações, na análise da prevalência de anticorpos anti-pi-AR activos funcionalmente. De preferência, tal método de diagnóstico aplica-se a um conjunto de doentes de DCM com tipagem prévia de anticorpo ou a qualquer indivíduo para ser assim avaliado ou a qualquer indivíduo suspeito de sofrer de qualquer das doenças aqui descritas ou que está em risco de sofrer delas. Numa etapa adicional do método de diagnóstico e do método de rastreio, pode avaliar-se e determinar-se a capacidade de bloqueadores β inibirem a activação de receptor induzida por anticorpos anti-Pi-AR, respectivamente. 0 ensaio descrito anteriormente é um método baseado em FRET tal como descrito em WO 2005/052186, que utiliza os péptidos de acordo com o presente invento, é vantajoso dado que é mais simples, mais rápido e ao mesmo tempo revela ou identifica todos os doentes de DCM que anteriormente foram considerados positivos para anticorpo anti^i-ECu. Esta concretização de um método de diagnóstico baseado em FRET que utiliza um ou vários péptidos de acordo com o presente invento baseia-se na detecção do aumento de cAMP induzido por anticorpo.

Conjuntamente, o rastreio por Epac-FRET parece representar uma abordagem muito sensível numa única etapa, permitindo detectar anticorpos activadores dirigidos contra o βι-AR humano. Assim, também se divulga aqui a utilização de um ou vários péptidos de acordo com o presente invento para utilização num ensaio Epac-FRET. Com maior preferência, tal ensaio Epac-FRET é para utilização em diagnóstico, ainda com 66 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ maior preferência no diagnóstico de doentes que sofrem ou que se suspeita que sofrem de qualquer das doenças aqui descritas.

Em vista do exposto anteriormente, é particularmente preferível utilizar ou aplicar a tecnologia FRET, em particular um sistema de detecção baseado em FRET, de acordo com este invento.

Num aspecto adicional, o presente invento refere-se a um método para detecção de anticorpos contra um β-AR (por exemplo numa amostra tal como aqui definida) compreendendo a etapa de pôr em contacto o péptido cíclico do invento com os referidos anticorpos a serem detectados.

Num aspecto adicional, o presente invento refere-se ao péptido cíclico, composição ou agente de diagnóstico, tal como aqui divulgado, para detectar (por exemplo numa amostra tal como aqui definida) anticorpos contra um β-AR. 0 método anterior para detectar anticorpos ou péptido cíclico, composição ou agente de diagnóstico é particularmente útil para ser utilizado no contexto de aplicações de diagnóstico, tal como aqui descritas.

Ao longo do presente pedido, as seguintes abreviaturas terão os seguintes significados: Ab ou ab: anticorpo, Abs ou abs: anticorpos, AR: receptor adrenérgico, EC domínio extracelular de um β-AR, ECn domínio II extracelular de um β-AR e AA aminoácido. 0 presente invento descreve-se adicionalmente por referência às seguintes figuras e exemplos não limitativos.

As figuras apresentam: A figura 1 é um diagrama apresentando o esquema do ciclo-péptido βι-Ε0ιι-25 aminoácidos (AA) e dos ciclo-péptidos βι-ECn-25AA mutados (anéis pretos com os resíduos Cys originais (bolas brancas) ou as cisteínas mutadas para Ser (bolas 67 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ pretas; Cys/Ser ou Ser/Cys, respectivamente) e os correspondentes perfis de eluição de cromatografia liquida de alta resolução detectados ao comprimento de onda de 210 nm ou 220 nm, respectivamente.

Para o ciclo-péptido contendo 3 Cys βι-Ε(3ιι-25ΑΑ Cys/Cys, efectuou-se HPLC num Waters Separation Modul 2690 conjuntamente com um detector de absorvância Waters Dual Lambda; a absorvância foi lida a 220 nm. Após síntese e ciclização do péptido, as amostras foram dissolvidas em H20/acetonitrilo (ACN) a 5% e carregadas numa coluna Nuclosil 100-5/C18 (Macherey-Nagel Inc., Alemanha; comprimento da coluna 250 mm, lúmen 4 mm) com um caudal de 1 ml/min; seguidamente aplicou-se um gradiente de separação de ACN de 5% a 60% na presença de TFA a 0,2%. A pequena quantidade restante de péptido linear β1-Ε^Ι-25ΑΑ deu um pequeno pico, tipicamente entre 14 e 16 min, enquanto as fracções contendo o ciclo-péptido βι-ECn—25AA Cys/Cys apareceram numa gama de 18 a 22 min.

Efectuou-se HPLC dos ciclo-péptidos mutantes de 25AA com uma coluna de sílica C18 (15 pm, 120A, comprimento 250 mm, lúmen 4 mm) com um caudal de 1 ml/min seguido por um gradiente de separação de ACN de 5% a 60% na presença de TFA a 0,1%. As fracções contendo os mutantes cíclicos βι-Εΰιι-25ΑΑ foram monitorizadas por absorção de UV (210 nm) e apresentaram um único pico de eluição estreito que aparece a -10,5 min (mutante de 25AA Cys/Ser, painel esquerdo) ou -16,5 min (mutante de 25AA Ser/Cys, painel direito). A figura 2 é um diagrama que apresenta o esquema dos ciclo-péptidos mutados βι-ECn de 25AA ou de 18AA (anéis pretos com os resíduos Cys originais (bolas brancas) ou as cisteínas mutadas para Ser (bolas pretas; Cys/Ser ou Ser/Cys, respectivamente), conjuntamente com os aminoácidos envolvidos na formação da estrutura primária em anel após fecho cabeça-cauda (local de fecho Ala-DGlu ou Pro-Lys). 68 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Para a síntese de péptidos cíclicos Pi-ECn-18AA (ou βι-ECn-25AA) na fase sólida, incorpora-se Fmoc-Glu-ODmab, ou outro aminoácido Fmoc com um grupo protector na cadeia lateral que possa ser clivado selectivamente de uma forma ortogonal, na extremidade C-terminal do péptido linear. A clivagem do péptido cíclico da resina de síntese gera um amido péptido (no caso de D-Glu->Gln) e a remoção dos grupos protectores da cadeia lateral é efectuada por tratamento da resina com ácido trifluoroacético/triisopropilsilano/etanoditiole/água durante várias horas. A figura 3 apresenta seis painéis demonstrando os perfis de eluição de HPLC de dois ciclo-péptidos lineares (painéis da esquerda, de 18AA Cys/Ser e de 25AA Cys/Cys, respectivamente) e quatro dos ciclo-péptidos mutantes do presente invento, todos eles sendo ciclo-péptidos contendo Gin com um local de fecho Pro-Lys. Efectuou-se HPLC dos ciclo-péptidos mutantes de 25AA ou de 18AA num Waters Separation Modul conjuntamente com um detector de absorvância de UV; a absorvância foi lida a 210 nm. Após síntese e ciclização do péptido, as amostras foram dissolvidas em H20/acetonitrilo (ACN) a 5% e carregaram-se numa coluna de sílica C18 (15 pm, 120 A, comprimento da coluna 250 mm, lúmen 4 mm) com um caudal de 1 ml/min; seguidamente aplicou-se um gradiente de separação de ACN de 5% a 60% na presença de TFA a 0,1%. Tal como apresentado para os seus homólogos lineares, as fracções contendo os mutantes cíclicos Pi-ECn-18AA (linha superior, painel central (Cys/Ser, -14 min), painel da direita (Ser/Cys, -16,5 min); ou mutantes βι-Εΰι::-25ΑΑ (linha inferior, painel central (Cys/Ser, -10,6), painel da direita (Ser/Cys, -16,5 )) apresentaram picos de eluição únicos estreitos que aparecem aos pontos temporais indicados. A figura 4 é um diagrama que apresenta a capacidade de bloqueamento de ciclo-péptidos mutantes com um anel de fecho D-Glu (mutação Cys/Ser, colunas brancas; mutação Ser/Cys, colunas com riscas diagonais para a direita) comparativamente com o ciclo-péptido de 18AA contendo 3 Cys (colunas pretas) num ensaio de competição de ELISA utilizando o péptido linear 69 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ de 25ΑΑ Cys/Cys contendo 3 Cys como antigénio. Apresentam-se resultados representativos obtidos com fracções IgG isoladas dos soros de 12 ratos diferentes imunizados positivos para anticorpo. 0 eixo dos y representa a eficácia de bloqueamento dos vários péptidos utilizados apresentada em % de actividade de ELISA de bloqueado relativamente a não bloqueado dos soros após pré-incubação (12 h durante a noite, 4 °C, incubador com rotação) com os ciclo-péptidos indicados. A figura 5 é um diagrama que representa a capacidade de bloqueamento de ciclo-péptidos mutantes Pi-ECn-18AA com um fecho de anel D-Glu (mutação Cys/Ser, losangos brancos; mutação Ser/Cys, losangos pretos) comparativamente com o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys (quadrados pretos) num ensaio de competição de ELISA utilizando o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys como antigénio. Utilizou-se um único soro representativo de um rato cardiomiopático positivo para anticorpo (figura 4, rato número 4) . 0 eixo dos y representa a concentração de anticorpos IgG anti-3i-ECn específicos tal como determinado por ELISA, o eixo dos x corresponde ao excesso molar de péptidos lineares ou cíclicos utilizados para pré-incubar as fracções IgG (12 h, 4 °C, incubador de rotação) assumindo uma estequiometria 1:1 (assumiu-se que um péptido cíclico (massa molecular (MM) de 2,1 kDa) ou linear (MM 3,0 kDa) bloqueia um anticorpo IgG (MM 150 kDa)). A figura 6 é um diagrama que representa a capacidade de bloqueamento de ciclo-péptidos mutantes βι-Ε^ι-18ΑΑ com um fecho de ciclo D-Glu na sinalização mediada por receptor βι (ensaio cAMP funcional) utilizando uma abordagem por transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) . O efeito da pré-incubação (12 h, 4 °C, incubador de rotação) de anticorpos IgG anti^i-ECu de um rato

representativo (soro) (figura 4, rato número 4) com ciclo-péptidos mutantes βι-ΕΟιι-18ΑΑ (mutação Cys/Ser, azul escuro (3); mutação Ser/Cys, azul claro (4)) foi comparado com o efeito de um ciclo-péptido de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys (vermelho (2)) ou com o resultado obtido com anticorpos IgG 70

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT anti-3i-ECn na ausência de péptidos de bloqueamento

(preto (1)) . O eixo dos y representa a razão YFP/CFP normalizada dos sinais de emissão de FRET registados, o eixo dos x corresponde ao tempo do registo apresentado em segundos (s). A figura 7 é um diagrama que resume o efeito de bloqueamento dos ciclo-péptidos mutantes com um fecho de anel D-Glu após pré-incubação (12 h, 4 °C, incubador de rotação) com IgG isolado de 78 soros de ratos imunizados positivos para anticorpo num ensaio de competição de ELISA utilizando o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys como um antigénio. As colunas representam os resultados obtidos com ciclo-péptidos mutantes Pi-ECn-18AA (mutação Cys/Ser coluna preta; mutação Ser/Cys, coluna branca) comparativamente com o ciclo-péptido de 18AA contendo 3 Cys (colunas com riscas verticais), o ciclo-péptido de 25AA contendo 3 Cys (coluna com riscas horizontais) ou o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys (coluna com riscas diagonais para a direita). As barras de erro indicam o erro padrão da média (± EPM) . O eixo dos y representa a eficácia de bloqueamento dos vários péptidos utilizados apresentada em % reactividade de ELISA dos soros bloqueados relativamente a não bloqueados. A figura 8 é um diagrama que resume a capacidade de bloqueamento de ciclo-péptidos mutantes βι-Ε^ι-18ΑΑ (com um fecho de anel D-Glu) num ensaio de competição de ELISA efectuado com soros de n=82 ratos imunizados positivos para anticorpo. Cerca de 95% dos soros foram bloqueados eficazmente com o ciclo-péptido mutado Pi-ECn-18AA Cys/Ser sozinho (representado esquematicamente no topo da coluna branca da esquerda), enquanto cerca de 5% dos soros foram bloqueados por ambos os mutantes de 18AA Cys/Ser e de 18AA Ser/Cys (este último é representado esquematicamente no topo da coluna preta à direita). A figura 9 é um diagrama composto por dois painéis principais (superior e inferior) que resumem o efeito de bloqueamento de ambos os ciclo-péptidos mutantes de 25AA e de 71 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ 18ΑΑ com um local de fecho Gin, bem como o de ciclo-péptidos mutantes de 18AA com um local de fecho D-Glu após pré-incubação (12 h, 4 °C, incubação com rotação) com soros isolados de 69 ratos imunizados diferentes positivos para anticorpo num ensaio de competição de ELISA utilizando o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys como um antigénio. 0 painel superior representa soros de rato que reagem preferencialmente com os ciclo-péptidos mutados Cys/Ser (reacção do tipo 1, n=64), separados em péptidos cic25AA (Gin) (esquerda) e péptidos cic-18AA (Gin e D-Glu) (direita). 0 painel inferior apresenta os soros de ratos que reagem com ambos os ciclo-péptidos mutados Cys/Ser e Ser/Cys (reacção de tipo 2, n=5), uma vez mais separados em resultados obtidos com péptidos cic-25AA (Gin) (esquerda) e péptidos cic-18AA (Gin e D-Glu) (direita).

As três primeiras colunas do lado esquerdo dos dois painéis representam os resultados obtidos com o ciclo-péptido de 25AA contendo 3 Cys (Gin) (não mutado) (colunas pretas) e os ciclo-péptidos mutantes Pi-ECn-25AA (Gin) (mutação Cys/Ser, colunas brancas; mutação Ser/Cys, colunas com riscas horizontais).

As cinco colunas do lado direito dos dois painéis representam os resultados obtidos com o ciclo-péptido de 18AA contendo 3 Cys (Gin) (não mutado) (colunas pretas) comparativamente com os ciclo-péptidos de 18AA contendo 2 Cys diferentes (mutante de 18AA Cys/Ser com um local de fecho Gin, colunas brancas; mutante de 18AA Cys/Ser com um local de fecho D-Glu, colunas com riscas diagonais para a esquerda; mutante de 18AA Ser/Cys com um local de fecho Gin, colunas com riscas diagonais para a direita; mutante de 18AA Ser/Cys com um local de fecho D-Glu, colunas com riscas verticais).

As barras de erro representam o erro padrão da média (± EPM) . 0 eixo dos y representa a eficácia de bloqueamento dos vários péptidos utilizados apresentada em % de reactividade de ELISA dos soros bloqueados relativamente a não bloqueados. 72

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT A figura 10 é um diagrama que resume a capacidade de bloqueamento de ciclo-péptidos mutantes pi-ECn-18AA (Gin) num ensaio de competição de ELISA efectuado com soros de n=69 ratos imunizados positivos para anticorpo. Cerca de 93% (n=64) dos soros foram bloqueados eficazmente pelo ciclo-péptido mutado βι-ΕΟιι-18ΑΑ Cys/Ser sozinho (representado esquematicamente no topo da coluna branca à esquerda), enquanto cerca de 7% (n=5) dos soros foram bloqueados por ambos os mutantes de 18AA Cys/Ser e de 18AA Ser/Cys (o último representado esquematicamente no topo da coluna preta à direita). A figura 11 é um diagrama que resume a capacidade de bloqueamento dependente da dose (eixo dos x, abcissa: vezes de excesso molar de péptidos específicos) de vários péptidos lineares e cíclicos betal-ECII apresentados em % do título de anticorpo não bloqueado (eixo dos y, ordenada), incluindo péptidos lineares de 25AA Cys/Cys (quadrados pretos), ciclo-péptido mutantes de 25AA Cys/Ser (quadrados brancos), ciclo-péptidos de 18AA Cys/Cys (losangos pretos), ciclo-péptidos mutantes de 18AA Cys/Ser (losangos brancos) e péptido lineares mutantes de 18AA Cys/Ser (losangos com riscas verticais) num ensaio de competição de ELISA efectuado com soros de n=6 ratos imunizados positivos para anticorpo, seleccionados aleatoriamente. Todos os soros foram bloqueados mais eficazmente pelo ciclo-péptido mutante betal-ECII-18AA Cys/Ser seguido pelo ciclo-péptido não mutante de 18AA Cys/Cys e o ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser. Todos os ciclo-péptidos foram muito superiores aos seus homólogos lineares (com ou sem mutação) em termos das suas capacidades de bloqueamento de anticorpo (P<0,005). A figura 12 é um diagrama que resume a capacidade de bloqueamento in vivo de um total de cinco aplicações (profilácticas) de vários péptidos lineares e cíclicos betal-ECII, iniciadas 3 meses após a primeira imunização (e dois reforços subsequentes de antigénio betal-ECII/GST, correspondentes a um protocolo de prevenção). Determinaram-se os títulos de soro dos anticorpos de receptor betai antes e 73 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ 18-20 h após cada injecção de péptido (abcissa, tempo em meses) e são apresentados em % dos títulos de anticorpo correspondentes de ratos não tratados imunizados (eixo dos y, ordenada). Os péptidos injectados foram: péptido linear de 25AA Cys/Cys (quadrados pretos), ciclo-péptido de 25AA Cys/Cys (quadrados brancos), ciclo-péptido de 18AA Cys/Cys (losangos preto), ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (losangos brancos) e o péptido linear mutante de 18AA Cys/Ser (losangos com riscas verticais) . De igual modo, a eficácia in vivo dos péptidos cíclicos foi muito superior aos seus homólogos lineares. A maior eficácia em termos de neutralização de anticorpo foi conseguida com 1,0 mg/kg de peso corporal de ciclo-péptidos não mutantes de 25AA Cys/Cys ou de 18AA Cys/Cys (diminuição de 87,7±2% ou 89,9±3% após 5 injecções de ciclo-péptido, comparativamente com animais imunizados não tratados; ambos P< 0,005), seguido pelo ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (diminuição de 54,5±2% após 5 injecções de ciclo-péptido; P<0,05), enquanto o péptido linear de 25AA Cys/Cys ou o mutante linear de 18AA Cys/Ser à mesma concentração não apresentou quaisquer efeitos de bloqueamento significativos (diminuição de 25,8±3% ou 4,5±11% após 5 injecções, P=0,16 ou P=0,8, respectivamente). Os círculos pretos indicam os títulos de anticorpo de animais não tratados imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) que serviram como referência, ajustados a 100%. A figura 13 apresenta os resultados de ensaios ELISPOT efectuados em células B preparadas a partir de medula óssea (colunas da esquerda) ou de baço (colunas da direita) de animais cardiomiopáticos não tratados imunizados positivos para anti-betal (não tratados Betai, colunas pretas) comparativamente aos isolados de animais cardiomiopáticos imunizados positivos para anti-betal tratados profilacticamente com os ciclo-péptidos de 25AA-ECII Cys/Cys (25cic Cys/Cys, colunas com riscas vertical), o ciclo-péptido mutante de 18AA-ECII Cys/Ser (18cic. Cys/Ser, colunas com riscas diagonal para a direita) ou o péptido mutante linear de 18AA-ECII Cys/Ser (181in. Cys/Ser, colunas com riscas horizontal). Para os ensaios, revestiram-se placas ELIspot 74 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT durante a noite com o antigénio específico (GST/betal-ECII-FP) em tampão Tris 0,05 mol/1, pH 9,4; seguidamente lavaram-se as placas 3 vezes e bloquearam-se com BSA durante 3 horas a 37°C. Subsequentemente, as placas foram incubadas durante a noite a 37°C com células B de baço ou de medula óssea (cultivadas em meio RPMI 1640/X-VIVO-15 suplementado com soro bovino fetal (FCS) a 10%) com lxlO6 a lxlO3 células por poço. Após 12 horas rejeitaram-se as células B e lavaram-se as placas, com as células B com IgG ligado excretado, várias vezes (PBS/Tween a 0,5%) antes da adição de IgG anti-rato secundário conjugado a fosfatase alcalina (0,3 pg/ml) para detectar IgG de rato ligado. Seguidamente as placas foram incubadas durante mais 3 horas a 37 °C, lavadas várias vezes com PBS/Tween a 0,5% e revelaram-se utilizando LMP/BICP 5:1 (1 ml por poço; "LMP" significa agarose de baixo ponto de fusão e "BICP" significa sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato p-toluidina, um corante de cor azul) que permite uma quantificação das manchas azuis obtidas, em que cada mancha representa uma célula de baço ou de medula óssea que excreta IgG específico de antigénio. A figura 14 é um diagrama que resume o efeito de bloqueamento in vivo de ambos os ciclo-péptidos mutantes de 25AA e de 18AA com um local de fecho Gin, determinado após a primeira injecção intravenosa (i.v.) de 1,0 mg/kg de peso corporal em ratos imunizados positivos para anticorpo. Os soros foram retirados 18-20 horas após injecção i.v. de 1,0 ou 0,25 mg/kg de peso corporal dos péptidos indicados e ensaiados para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear Cys/Cys de 25AA contendo 3 Cys como antigénio. A primeira linha no painel representa o grupo de ratos (n=5) tratados com o ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser (Gin) contendo 2 Cys (representado esquematicamente no topo da primeira linha, ciclos sombreados), a segunda e terceira linhas representam grupos de ratos tratados com o ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) a duas concentrações diferentes (n=40, 1 mg/kg de peso corporal; n=9; 0,25 mg/kg de peso corporal, o esquema do péptido cíclico apresenta-se no 75 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ topo da segunda linha, círculos brancos), a quarta linha representa n=4 animais tratados com o ciclo-péptido mutante de 18AA Ser/Cys (Gin) (1 mg/kg de peso corporal, o esquema do péptido cíclico apresenta-se no topo da quarta linha, losangos pretos) e a quinta linha representa os resultados obtidos com péptidos linear de 18AA Cys/Ser (Gin) contendo 2 Cys (mutante) (o esquema do péptido cíclico apresenta-se no topo da quinta linha, círculos pretos) injectado i.v..

As barras e números (nas caixas) de cada linha representam os valores médios da capacidade de bloqueamento do péptido indicado respectivamente apresentados em % da imuno-reactividade de ELISA dos soros antes e 18-20 horas após injecção i.v. do péptido (eixo dos y). A figura 15 é um diagrama que resume o efeito de bloqueamento in vivo de ambos os ciclo-péptidos mutantes de 25AA e de 18AA com um local de fecho Gin, determinado após a primeira injecção intravenosa (i.v.) de 1 mg/kg de peso corporal ou 0,25 mg/kg de peso corporal em ratos imunizados positivos para anticorpo. Os soros foram retirados 18-20 horas após injecção i.v. dos vários péptidos e ensaiados para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys como antigénio. O gráfico representa a diminuição relativa (ou aumento) nos títulos de anticorpo específico anti-receptor βι em soros de ratos imunizados positivos para anticorpo após injecção dos vários péptidos e apresenta o respectivo valor médio da capacidade de bloqueamento do péptido indicado apresentado como % da imuno-reactividade de ELISA dos soros antes e 18-20 horas após injecção i.v. (eixo dos y). Os símbolos do lado direito do painel representam: quadrado branco, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1 mg/kg de peso corporal); losango branco, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (0,25 mg/kg de peso corporal); losango preto, ciclo-péptido mutante de 18AA Ser/Cys (Gin) (1 mg/kg de peso corporal); quadrado com riscas horizontais, péptido mutante linear de 18AA Cys/Ser (Gin) (1 mg/kg de peso corporal); quadrado preto, 76 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser (Gin) (1 mg/kg de peso corporal). Por razões de clareza, não se apresentam as barras de erro no gráfico. A figura 16A é um diagrama que resume o efeito de bloqueamento in vivo de ambos os ciclo-péptidos mutantes de 25AA e de 18AA com um local de fecho Gin, determinado após um total de nove injecções intravenosas (i.v.) de 1,0 mg/kg de peso corporal dos péptidos indicados em ratos imunizados positivos para anticorpo. Retiraram-se soros antes e 18-20 horas após injecção i.v. dos vários péptidos de 4 em 4 semanas (abcissa: tempo em meses de tratamento) e ensaiaram-se para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys como antigénio. O gráfico representa a diminuição (ou aumento) relativo do titulo de anticorpo especifico anti-receptor betai em soros de ratos imunizados positivos para anticorpo após injecção dos péptidos indicados e apresenta o respectivo valor médio de uma capacidade de bloqueamento do péptido apresentada em % da imuno-reactividade de ELISA inicial, antes de iniciar o tratamento (eixos dos y, ordenada).

Os símbolos indicam: círculos pretos, animais não tratados imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (n=9); losangos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=20); quadrados pretos, ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=5). A figura 16B é um diagrama que resume o efeito de bloqueamento in vivo de várias concentrações de ciclo-péptidos mutantes de 18AA com um local de fecho Gin, determinado após um total de nove injecções intravenosas (i.v.) de 0,25, 1,0, 2,0 e 4,0 mg/kg de peso corporal em ratos imunizados positivos para anticorpo, independentemente do "estado de resposta" a ciclo-péptido dos animais individuais. Os soros foram retirados antes e 18-20 horas após injecção i.v. dos vários péptidos de 4 em 4 semanas (abcissa: tempo em meses) e 77 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ ensaiados para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys como antigénio. 0 gráfico representa a diminuição (ou aumento) relativa em titulos de anticorpo especifico anti-receptor betai em soros de ratos imunizados positivos para anticorpo após injecção dos péptidos indicados e apresenta os respectivos valores médios da capacidade de bloqueamento dos péptidos apresentados em % de imuno-reactividade de ELISA inicial, antes de iniciar o tratamento (eixo dos y, ordenada).

Os símbolos indicam: círculos pretos, animais não tratados imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (n=9); círculos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (0,25 mg/kg de peso corporal, n=4); losangos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=20); losangos com riscas verticais, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (2,0 mg/kg de peso corporal, n=5); losangos pretos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (4,0 mg/kg de peso corporal, n=9). A figura 16C é um diagrama que resume o efeito de bloqueamento in vivo de várias concentrações de ciclo-péptidos mutantes de 18AA com um local de fecho Gin, determinado após um total de nove injecções intravenosas (i.v.) de 0,25, 1,0, 2,0 e 4,0 mg/kg de peso corporal em ratos imunizados positivos para anticorpo, relativamente a "respostas" sensíveis apenas a ciclo-péptido, definidas como animais que, após 7 injecções de ciclo-péptido, apresentam um máximo do nível remanescente de anticorpo de receptor igual ou inferior a 80% do respectivo título no início da terapia (comparar as curvas entre figura 16c e figura 16b, em que a última representa a resposta não homogénea de ocorrência natural de animais não seleccionados). Os soros foram retirados tal como descrito anteriormente e ensaiados para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys como antigénio. O gráfico representa a diminuição relativa em títulos de anticorpo específico anti-receptor betai em soros dos sujeitos 78 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ com resposta imunizados positivos para anticorpo após, injecção dos péptidos indicados, apresentando a capacidade de bloqueamento em % da imuno-reactividade de ELISA inicial (eixo dos y, ordenada).

Os símbolos indicam (número de sujeitos com resposta em negrito): círculos pretos, animais não tratados, imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (n=9); círculos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (0,25 mg/kg de peso corporal, n=3/4); losangos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=16/20); losangos com riscas verticais, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (2,0 mg/kg de peso corporal, n=2/5); losangos pretos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (4,0 mg/kg de peso corporal, n=6/9). A figura 17. A é um diagrama que apresenta o decurso temporal (meses 0 a 20) dos diâmetros ventriculares esquerdos internos de fim de sístole e fim de diástole (LVES, LVED) de animais imunizados com GST/Pi-ECu não tratados (círculos pretos) relativamente a animais imunizados com GST/Pi-ECu tratados com os vários ciclo-péptidos indicados (consultar legenda), tal como determinado por ecocardiografia (sistema de ecocardiografia: Visual Sonics, Vevo 770 (versão V2.2.3), equipado com um transdutor 15-17,5 MHz), em que LVES/LVED é o diâmetro ventricular esquerdo de fim de sístole/diâmetro ventricular esquerdo de fim de diástole.

Os símbolos indicam: círculos brancos, animais de controlos não imunizados não tratados, injectados com NaCl a 0,9% (n=10); círculos pretos, animais não tratados, imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (n=9); losangos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=20); quadrados pretos, ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=5); quadrados brancos, péptido 79 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ linear mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=5) . A figura 17.B é um diagrama similar apresentando o decurso temporal (meses 0 a 20) dos diâmetros ventriculares esquerdos internos de fim de sistole e fim de diástole (LVES, LVED) de animais imunizados com GST/^i-ECII não tratados (círculos pretos) relativamente a animais imunizados com GST/pi-ECII, tratados com diferentes concentrações do ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (consultar legenda).

Os símbolos indicam: círculos brancos, animais de controlos não imunizados não tratados, injectados com NaCl a 0,9% (n=10); círculos pretos, animais não tratados, imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (n=9): quadrados brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (0,25 mg/kg de peso corporal, n=4); losangos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=20); losangos com riscas verticais, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (2,0 mg/kg de peso corporal, n=5); losangos pretos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (4,0 mg/kg de peso corporal, n=9 ) . A figura 18 é um diagrama que indica a evolução do título (mês 0 a 9) de anticorpos específicos anti-pi-ECu em ratos imunizados com GST/pi-ECu relativamente a injectados com NaCl 0,9%, em que "Betai" significa animais imunizados (antes de iniciar o tratamento com péptidos de acordo com o presente invento) e "controlos de NaCl" significa os correspondentes animais de controlo injectados com NaCl. A figura 19A é um diagrama que apresenta o decurso temporal (meses 0 a 20) do "índice cardíaco" (Cl) em ml/min/g (de peso corporal) tal como determinado por ecocardiografia (sistema de ecocardiografia, consultar a legenda da figura 17a.).

Os símbolos indicam: 80 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT círculos brancos, animais de controlos não imunizados não tratados, injectados com NaCl a 0,9% (n=10); círculos pretos, animais não tratados, imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (n=9); losangos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=20); quadrados pretos, ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=5); quadrados brancos, péptido linear mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=5) . A figura 19B é um diagrama similar que apresenta o decurso temporal (mês 0 a 20) do "índice cardíaco" (Cl) em ml/min/g (de peso corporal) tal como determinado por ecocardiografia (sistema de ecocardiografia: consultar a legenda da figura 17a.).

Os símbolos indicam: círculos brancos, animais de controlos não imunizados não tratados, injectados com NaCl a 0,9% (n=10); círculos pretos, animais não tratados, imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (n=9); quadrados brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (0,25 mg/kg de peso corporal, n=4); losangos brancos, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=20); losangos com riscas verticais, ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (Gin) (2,0 mg/kg de peso corporal, n=5). A figura 20 apresenta três linhas de painéis (a, b, c) com parâmetros hemodinâmicos obtidos no estudo de terapia após 10 meses de tratamento, detalhadamente na primeira linha apresenta-se em cada painel da primeira linha (a) no lado esquerdo, a frequência cardíaca (HF) apresentada em pulsações por minuto (=ppm) e do lado direito a pressão arterial sistólica LV (LV press.) apresentado em mmHg; em cada painel da segunda linha (b) no lado esquerdo, a contractilidade (+dP/dt) em mmHg/s, e do lado direito a relaxação (-dP/dt) em -mmHg/s; a terceira linha (c) apresenta a pressão ventricular esquerda do fim de diástole (LVEDP) tal como determinada por cateterização cardíaca em mmHg. 81

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Os painéis esquerdo e direito em cada linha separam os dados obtidos com (painel esquerdo, constantemente 1,0 mg/kg de peso corporal dos diferentes péptidos) mutante cíclico de 18AA Cys/Ser (colunas com riscas diagonais para a direita, n=20 animais), mutante linear Cys/Ser (colunas com riscas horizontais, n= 5 animais) e mutante cíclico de 25AA Cys/Ser (colunas com riscas verticais, n= 5 animais). As colunas nos painéis direitos representam os dados obtidos com várias concentrações do mutante cíclico de 18AA Cys/Ser; com colunas brancas com pintas pretas correspondentes a 0,25 mg/kg de peso corporal (n= 4 animais), colunas com riscas diagonais para a direita para 1, 0 mg/kg de peso corporal (n= 10 animais), colunas com riscas diagonais para a esquerda para 2,0 mg/kg de peso corporal (n= 5 animais) e colunas estruturadas pretas para 4,0 mg/kg de peso corporal (n= 9 animais) . As colunas pretas e brancas de cada painel servem como uma referência e correspondem a animais não tratados imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas) (controlo positivo, preto, n= 9) ou para animais de controlo não imunizados injectados com NaCl a 0,9% (controlo negativo, branco, n=10).

Nas legendas "Betai não tratado" significa animais não tratados cardiomiopáticos imunizados, positivos para anticorpo anti-betal (n=9, colunas pretas), "controlos" significa o grupo de controlo injectado com NaCl a 0,9% (n=10, colunas brancas), "18cic Cys/Ser." significa animais cardiomiopáticos imunizados, positivos para anti-betal, tratados terapeuticamente com o mutante linear 181in Cys/Ser (n=5 [1,0 mg/kg de peso corporal] ou cíclico 18cic Cys/Ser (n=10 [1,0 mg/kg de peso corporal] ou péptidos mutantes cíclicos de 25AA Cys/Ser (n=4 [1,0 mg/kg de peso corporal) indicados após 9 meses de imunização. Os painéis do lado direito apresentam os efeitos de diferentes doses de ciclo-péptidos mutantes betal-ECII de 18AA Cys/Ser injectados intravenosamente (n=4 [0,25 mg/kg de peso corporal]; n=20 [1,0 mg/kg de peso corporal], n=5 [2,0 mg/kg de peso corporal] e n=9 [4,0 mg/kg de peso corporal], respectivamente). As diferenças entre os 82

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT grupos foram avaliados por ANOVA de uma via; n.s. = não significativo, *P< 0,05, **p< 0,005. A figura 21 apresenta dois painéis (a e b) com parâmetros macro-anatómicos dos animais do estudo de terapia, como colunas:

Os painéis superiores (a.) apresentam os pesos secos relativos dos órgãos indicados (da esquerda para a direita: coração, baço, rim direito, rim esquerdo, pulmão e fígado) apresentados em g/kg de peso corporal, em que "Betai não tratado" significa animais cardiomiopáticos não tratados, imunizados, positivos para anticorpo anti-betal (n= 9, colunas pretas), "controlos" significa o grupo de controlo injectado com NaCl a 0,9% (n=10, colunas brancas), "18cic Cys/Ser" significa animais cardiomiopáticos imunizados, positivos para anti-betal tratados terapeuticamente com o mutante linear 181in Cys/Ser (n=5 [1,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas horizontais), ou mutante cíclico 18cic Cys/Ser (n=20 [1,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas diagonais para a direita) ou péptidos mutantes cíclicos de 25AA Cys/Ser (n=4 [1,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas verticais) indicados, após 9 meses de imunização.

Os painéis inferiores (b.) apresentam os pesos secos relativo dos órgãos indicados (da esquerda para a direita: coração, baço, rim direito, rim esquerdo, pulmão e fígado) apresentados em g/kg de peso corporal de animais cardiomiopáticos imunizados, positivos para anti-betal, tratados terapeuticamente com as doses indicadas de ciclo-péptidos mutantes betal-ECII de 18AA Cys/Ser (n=4 [0,25 mg/kg de peso corporal], colunas brancas com pintas pretas; n=20 [1,0 mg/kg de peso corporal] colunas com riscas diagonais para a direita, n=5 [2,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas diagonais para a esquerda; n=9 [4,0 mg/kg de peso corporal], colunas pretas estruturadas) após 9 meses de imunização, em que "Betai não tratado" significa animais cardiomiopáticos, não tratados, imunizados, positivos para anti-betal (n= 9, colunas pretas) e "controlos" significa o 83 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ grupo de controlo injectado com NaCl a 0,9% (n=10, colunas brancas).

Rim D significa direito e rim E significa esquerdo. As diferenças entre os grupos foram avaliadas por ANOVA de uma via; n.s. = não significativo, *P< 0,05, **p< 0,005. A figura 22 apresenta dois painéis (a e b) com diferentes parâmetros laboratoriais determinados no soro de animais após 10 meses de tratamento. Em ambos os painéis, "Betai não tratado" e "controlos" significa animais cardiomiopáticos, não tratados, imunizados, positivos para anti-betal (n=5, colunas pretas, controlo positivo) e controlos injectados com NaCl a 0,9% (n=6, colunas brancas, controlo negativo), respectivamente.

Os painéis superiores (a) apresentam os parâmetros de animais cardiomiopáticos, imunizados, positivos para anti-betal, tratados terapeuticamente com o péptido mutante linear 181in Cys/Ser (n=5 [1,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas horizontais) ou cíclico 18cic Cys/Ser (n=20 [1,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas diagonais para a direita) ou péptido mutante cíclico de 25AA Cys/Ser (n=4 [1,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas verticais) indicados, após 9 meses de imunização.

Os painéis inferiores (b) apresentam os parâmetros de animais cardiomiopáticos imunizados, positivos para anti-betal, tratados terapeuticamente com as doses indicadas de ciclo-péptido mutante betal-ECII de 18AA Cys/Ser (n=4 [0,25 mg/kg de peso corporal], colunas brancas com pintas pretas; n=20 [1,0 mg/kg de peso corporal] colunas com riscas diagonais para a direita, n=5 [2,0 mg/kg de peso corporal], colunas com riscas diagonais para a esquerda; n=9 [4,0 mg/kg de peso corporal], colunas pretas estruturadas) após 9 meses de imunização; Crea significa creatinina; GOT significa glutâmico oxaloacético transaminase; GPT significa glutâmico piruvato transaminase; LDH significa lactato desidrogenase. 84 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ A figura 23 apresenta ο padrão de distribuição de ciclo-péptido mutante de 18AA-ECII Cys/Ser ("CP-1") marcado com vermelho do texas (fluorocromo) após injecção i.v. de 1,0 mg/kg de peso corporal do ciclo-péptido marcado em animais de controlo não imunizados, tratados com NaCl a 0,9% (painel esquerdo) ou ratos Lewis cardiomiopáticos, imunizados, positivos para anticorpo (550 g de peso corporal). As fotografias apresentam a distribuição subcelular de ciclo-péptidos mutantes de 18AA Cys/Ser marcados com vermelho do texas no rim (secções de 2 pm da região cortical do rim) . As imagens demonstram que não foi exercida qualquer toxicidade no rim pelos péptidos cíclicos do invento e não se verificou qualquer obstrução mecânica de membranas glomerulares. A figura 24 é um diagrama que apresenta o esquema de ciclo-péptidos mutados contendo cisteína, homólogos de betal-ECII (os aminoácidos (AA) são representados como bolas brancas com o código de letra de AA correspondente escrito em cada bola) . As moléculas de cisteína e os seus substitutos são representadas como bolas pretas. A localização assumida da ponte de dissulfureto é representada por uma linha preta grossa.

Lado esquerdo: esquema que representa a sequência original da ansa ECII do receptor adrenérgico de beta 1 humano; centro: péptido cíclico de 22AA homólogo de ECII com a mutação de glicina no local assumido de fecho de anel (posição 222). O painel direito apresenta um exemplo de um péptido-mutante cíclico de 22AA contendo apenas duas cisteínas (i.e., posições 209 e 215). Apresenta-se o mutante Cys/Ser da cisteína na posição 216 (péptido cíclico de 22AA betal-ECII Cys216^Ser216).

Os números indicam a numeração dos aminoácidos na sequência primária original de acordo com Frielle et al. 1987, PNAS 84, páginas 7920-7924. 85

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT A figura 25 apresenta dois painéis demonstrando os perfis de eluição de cromatografia liquida de elevada resolução (HPLC) de dois péptidos ciclicos (22+1)=22 AA; o primeiro painel corresponde à construção cic22AA Cys/Cys (25A) contendo 3 cisternas e o segundo ao mutante cic22AA Cys/Ser (25B) contendo 2 cisternas do presente invento, todos estes ciclo-péptidos com um local de fecho Gly. Efectuou-se HPLC num sistema de HPLC analitico Hewlett Packard Série 1050 (Agilent Technologies Alemanha GmbH, Bõblingen) equipado com um detector de absorvância de UV duplo; a absorvância foi lida a 216 nm. Após síntese e ciclização de péptido, as amostras foram dissolvidas em H20/ácido trifluoro (TFA) a 0,1% e carregadas numa coluna de HPLC analítica (Waters GmbH, Eschborn) XBridge BEH130, C18, 3,5 pm (comprimento de coluna 50 mm, lúmen 4,6 mm) com um caudal de 2 ml/min; seguidamente efectuou-se um gradiente de separação de 0% a 75% de acetonitrilo (ACN) na presença de TFA a 0,1% durante 5 minutos.

As fracções contendo o péptido cíclico betal-ECII-22AA Cys/Cys com três moléculas de cisterna livremente acessíveis apresentam o padrão de eluição tipo montanha típico indicando a presença de racematos de cisterna (25A, eluição entre 2,6 e 3,8 minutos). Contrariamente, o péptido mutante cíclico de 22AA contendo apenas duas cisternas (ligado por uma segunda ponte de dissulfureto reforçada) deu um pico de eluição único estreito que aparece a 2,63 (cic22AA Cys/Ser, 25B). A figura 26 apresenta dois painéis representativos apresentando a caracterização dos péptidos cíclicos 22AA-ECII por espectroscopia de massa (MALDI). O primeiro painel corresponde à construção cic22AA Cys/Cys (26A) contendo 3 cisternas e o segundo ao mutante cic22AA Cys/Ser (26B) contendo 2 cisternas do presente invento, todos estes ciclo-péptidos com um local de fecho Gly. Os painéis apresentam os traçados de MALDI representativos dos péptidos ciclicos betal-ECII 22AA indicados. 86 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ A ordenada de cada gráfico apresenta as intensidades de sinal medidas ("a.u." significa unidades arbitrárias), a abcissa indica a massa molecular (apresentada em m/z). 26A corresponde ao péptido cic22AA Cys/Cys (2518,28 m/z) e 26B ao mutante cic22AA Cys/Ser (2502,31 m/z). A análise MALDI foi efectuada utilizando um espectroscópio de massa reflex II (Bruker Daltonic GmbH, Bremen), equipado com um transportador de amostras Scout-26. Em cada caso, a molécula simplesmente protonada foi analisada a 2200 m/z.

As figuras 27A e B apresentam a capacidade de bloqueamento (=neutralização) in vitro de várias variantes de ciclo-péptido contendo cisteina da segunda ansa extracelular (ECII) do receptor adrenérgico betai humano, determinada por ensaio de n=6 soros individuais (27A) de ratos imunizados, positivos para anticorpo betal-ECII, após incubação durante a noite com os ciclo-péptidos indicados (12-14 h, 4 °C) por ELISA. As colunas em 27A representam a eficácia de bloqueamento de receptor-anticorpo dos ciclo-péptidos indicados em % dos sinais de anticorpo (ELISA) obtidos com soros de rato positivos para anticorpo, não bloqueados. As colunas em 27B representam a eficácia de bloqueamento média para cada ciclo-péptido, as barras de erro indicam ± EPM. colunas brancas: mutante cicl8AA Cys/Ser (eficácia de bloqueamento 60,0±8,3%, P=0,0014 quando ensaiado para significância contra soros não bloqueados por teste t de dois ramos); colunas com riscas verticais: cicl8AA Cys/Cys (eficácia de bloqueamento 66,1 ±7,0%, P=0,00025); colunas pretas: cic22AA Cys/Cys (eficácia de bloqueamento 82,0±5,0%, P=0,000046); colunas com riscas diagonais (para a direita): mutante cic22AA Cys/Ser (eficácia de bloqueamento 74,9±5,0%, P=0,00026); colunas com riscas horizontais: cic25AA Cys/Cys (eficácia de bloqueamento 73,4±5,0%, P=0,00011).

As figuras 28A e B apresentam a capacidade de bloqueamento (^neutralização) in vivo dos dois mutantes de ciclo-péptido 18AA ou 22AA contendo duas cisteinas da segunda ansa extracelular (ECII) do receptor adrenérgico betai humano por 87

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT injecção terapêutica das diferentes construções em ratos imunizados regularmente há 8 meses (primeiro = imunização básica seguida por 7 reforços de antigénio de 4 em 4 semanas). Apresentam-se os efeitos de quatro a cinco injecções subsequentes de ciclo-péptido de 4 em 4 semanas. A figura 28A apresenta os valores médios ± EPM de cada um dos grupos tratados de ratos cardiomiopáticos, imunizados, positivos para anticorpo betal-ECII (o número de animais por grupo apresenta-se na legenda). 28A apresenta o efeito médio de 4 injecções subsequentes de ciclo-péptido, determinado 20-22 horas após aplicação das construções indicadas. Apresentam-se os títulos remanescentes de anticorpo para receptor após cada injecção em % dos títulos de anticorpo no inicio da terapia (mês 8) (colunas). As barras de erro indicam ± EPM. Os números nas colunas indicam o número de injecções mensais (subsequentes).

Colunas pretas: animais não tratados, positivos para anticorpo (título de referência após um total de 8+4 (=12) reforços de antigénio (comparativamente ao título no início da terapia) 110,7±5,6%; n= 5, controlo positivo).

Colunas brancas: mutante cicl8AA Cys/Ser, n= 5 animais (título de anticorpo remanescente após 4 injecções em percentagem do título no início da terapia: 76,0 ±23,0%, P= 0,44 quando ensaiado para significância relativamente ao título de anticorpo dos animais não tratados, positivos para anticorpo pelo teste t de dois ramos).

Colunas com riscas diagonais (para a direita): mutante cic 22AA Cys/Ser, n=8 animais (título de anticorpo remanescente após 4 injecções em percentagem do título no início da terapia: 9,0±2,2%, P= 3,0 xlO-7) . A figura 28B apresenta o decurso temporal de título de anticorpos após 4 injecções subsequentes de ciclo-péptido, determinado antes e 20-22 horas após aplicação das construções indicadas. Os valores apresentam-se em percentagem de aumento 88 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ ou diminuição do respectivo titulo de anticorpos após cada injecção de ciclo-péptido comparativamente ao titulo de anticorpo determinado no inicio da terapia (mês 8). círculos pretos: animais não tratados, positivos para anticorpo (n=5, controlo positivo); quadrados brancos: mutante cic 18AA Cys/Ser, 4 injecções, n= 5 animais; losangos pretos: mutante cic 22AA Cys/Ser, 4 injecções, n=8 animais. A figura 29A é um diagrama apresentando o decurso temporal (mês 0 a 12) dos diâmetros ventriculares esquerdos internos de fim de sístole e fim de diástole (LVES, LVED) de animais não tratados, imunizados com GST/betal-ECII (círculos pretos) relativamente a animais imunizados com GST/betal-ECII, tratados com os vários ciclo-péptidos indicados (consultar legenda) tal como determinado por ecocardiografia 2D e em modo M (sistema de ecocardiografia: Visual Sonics, Vevo 770 (versão V2.2.3), equipado com um transdutor de 15-17,5 MHz), em que LVES/LVED é o diâmetro ventricular esquerdo de fim de sistole/diâmetro ventricular esquerdo de fim de diástole. círculos brancos, animais de controlo não tratados, não imunizados, injectados com NaCl a 0,9% (n=5); círculos pretos, animais não tratados, imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas), positivos para anticorpo (n=6); quadrados brancos, mutante cic 18AA Cys/Ser (1,0 mg/kg de peso corporal, n=5) ; losangos pretos, péptido mutante cic 22AA Cys/Ser (Gly) (1,0 mg/kg de peso corporal, n=8). A figura 29B é um diagrama apresentando o decurso temporal (mês 0 a 12) do "índice cardíaco" (Cl) em ml/min/g (de peso corporal) tal como determinado por ecocardiografia 2D e ecocardiografia Doppler (sistema de ecocardiografia: consultar anteriormente). círculos brancos, animais de controlo não tratados, não imunizados, injectados com NaCl a 0,9% (n=5) círculos pretos, animais não tratados, imunizados regularmente (de 4 em 4 semanas), positivos para anticorpo (n=6) 89 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT quadrados brancos, mutante cic 18AA Cys/Ser (1,0 mg/kg de peso corporal, n=5); losangos pretos, péptido mutante cic22AA Cys/Ser (Gly) (1,0mg/kg de peso corporal, n=8) A figura 30 apresenta o padrão de radioactividade acumulada nos órgãos indicados 20 min após injecção i.v. em animais de controlo, não imunizados, tratados com NaCl a 0,9% (painel esquerdo) ou ratos Lewis imunizados, positivos para anticorpo (350-400 g de peso corporal) com 0,5-1,0 MBq de ciclo-péptidos mutantes 18AA-ECII Cys/Ser marcados com iodo-131. Os valores são apresentados em % actividade da radioactividade inicialmente injectada (ID) por g de peso húmido de órgão.

Os seguintes exemplos, não limitativos, ilustram o invento.

Exemplo 1: Síntese de ciclo-péptidos mutantes

Três exemplos particulares dos ciclo-péptidos aqui divulgados que podem formar apenas uma ponte de dissulfureto simples individual são compostos por 18, 22 ou 25 aminoácidos (AA) : ciclo-péptido mutante ECn-18AA Cys/Ser (Gin), ciclo-péptido mutante ECn-22AA Cys/Ser (Gly) e ciclo-péptido mutante ECn-25AA Cys/Ser (Gin), respectivamente. A sequência primária é parcialmente homóloga à sequência humana do βι-AR (posições de aminoácidos 204 a 219, 200 a 220 e 200 a 222, respectivamente). Por restrição da flexibilidade conformacional através de ciclização cabeça-cauda do péptido linear seguido por um segundo procedimento de ciclização de estabilização de ponte de dissulfureto (única), o ciclo-péptido mutante 18AA, 22 ou 25AA adopta uma conformação que mimetiza mais proximamente a do epítopo tal como apresentado na superfície da ansa da proteína βι-ECn nativa. Além disso, a ciclização foi frequentemente utilizada como uma ferramenta para prolongar a duração de acção do péptido, dado que em 90 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ geral os péptido cíclicos sao mais estáveis a proteólise do que os seus homólogos lineares.

Detalhadamente, a sequência de péptido do mutante Ciclo(K-18-P) cíclico S-S, Cys/Ser é: Ciclo-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-

Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln; A ciclização pode ocorrer entre CyS7 e Cysi3 (ponte de dissulfureto) e Alai e Glnig (fecho de anel) .

Detalhadamente, a sequência de péptido do mutante Ciclo(K-22-P) cíclico S-S, Cys/Ser é: Ciclo-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-

Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly; A ciclização pode ocorrer entre Cysio e Cysi6 (ponte de dissulf ureto) e Argi e Gly22 (fecho de anel) .

Detalhadamente, a sequência de péptido do mutante Ciclo(K-25-P) cíclico S-S, Cys/Ser é: Ciclo-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-

Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln; A ciclização pode ocorrer entre Cysn e Cysi7 (ponte de dissulfureto) e Alai e Gln2s (fecho de anel).

Os ciclo-péptidos mutantes do presente invento são primeiramente sintetizados como péptidos lineares e são seguidamente ciclizados covalentemente no esqueleto por condensação do grupo carboxilo C-terminal com o grupo amino do aminoácido N-terminal. Subsequentemente, estabelece-se uma ponte de dissulfureto entre os resíduos de cisteína 7 e 13 (ciclo-péptido de 18-mero), resíduos de cisteina 10 e 16 (ciclo-péptido de 22-mero) e resíduos de cisteína 11 e 17 (ciclo-péptido de 25-mero). O péptido linear é montado por síntese de péptidos em

etapas em fase sólida utilizando uma estratégia Fmoc/terc-butilo. Utiliza-se clorotritilo como resina iniciadora. O primeiro aminoácido (Fmoc-Pro-OH) é acoplado com DIEA em DMF, o segundo com PYBOP/HOBT/DIEA em DMF e os aminoácidos seguintes com di-isopropilcarboimida, HOBT em DMF. A qualidade do péptido é monitorizada em tempo real por detecção UV. O 91 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ procedimento de desprotecçao/acoplamento (excesso de duas vezes) descreve-se seguidamente:

Tabela 1: Procedimento de desprotecção/acoplamento (excesso de duas vezes)

Etapa Solventes Ciclo 1 Acoplamento/DMF (*) min Acoplamento 2 DMF 3x1 min Lavagem 3 Piperidina a 25%/DMF 1 min Desprotecção 4 Piperidina a 25%/DMF 2 x 15 min Desprotecções 5 DMF 7x1 min Lavagem * o tempo de acoplamento é determinado pelo ensaio de Kaiser

Para a montagem utilizaram-se os seguintes aminoácidos (apresentados a titulo de exemplo para o péptido mutante de 18-mero cíclico Cys/Ser):

Tabela 2: Aminoácidos utilizados para síntese F-moc do péptido mutante de 18-mero cíclico Cys/Ser

Aminoácido Fmoc-ASP (OtBu)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Cyc(Trt)-OH Fmoc-Arg(Pbf)-OH Fmoc-Ala-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Val-OH Fmoc-Phe-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH 0 péptido completamente protegido com os grupos amino N-terminal e carboxilo C-terminal reactivos é clivado da resina por tratamento com hexafluoroisopropanol/diclorometano. A ciclização é efectuada seguidamente em solução de acordo com o seguinte protocolo: A ciclização "cabeça-cauda" do péptido protegido é efectuada com PyB0P/NaHCC>3 em DMF a elevada diluição (10 mmol do péptido linear/1 L de DMF) . A ciclização completa-se após 3 dias. Após evaporação da DMF, lava-se o péptido com NaHC03 a 92 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT 5%, Η20 e Η20 pura. Arrefece-se a mistura reaccional e desprotege-se o péptido excepto os grupos cisteína. Seguidamente, isola-se o péptido parcialmente protegido por precipitação com metil-t-butiléter.

Pré-purifica-se o péptido impuro por cromatografia liquida:

Fase estacionária Eluente: Detecção: sílica C 18, 15 pm, 120 A H20 acetonitrilo + TFA a 0,1% UV (210 nm) A ciclização de dissulfureto é efectuada em H20 (2 mg/mL) com a presença de dimetilsulfóxido (3%). A reacção de ciclização completa-se após 3 dias. O péptido é purificado por HPLC, utilizando as condiçoes descritas anteriormente.

As fracções com uma pureza superior a 95% foram recolhidas conjuntamente. O péptido é permutado numa resina permutadora iónica (Dowex 1X2) e liofiliza-se a solução final. O teor de péptido é determinado por análise de aminoácidos (sequenciação de Edman).

Os perfis de eluição de HPLC nas figuras 1, 3, 25 e 26 demonstram claramente os picos de eluição estreitos e bem definidos obtidos com ciclo-péptidos mutantes, todos contendo a mesma ligação dissulfureto simples, em comparação com o perfil de eluição relativamente largo (do tipo montanha) obtido com um ciclo-péptido de 18AA Cysi3-Cys14, de 22AA Cys16-Cysi7 e de 25AA Cysi7-Cysi8 contendo 3 Cys.

Todos os estudos seguintes in vitro e in vivo foram efectuados com estes ciclo-péptidos mutantes. 93

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Exemplo 2: Ensaio de competição de ELISA in vitro A capacidade de bloqueamento de ciclo-péptidos mutantes βι-Ε0ιι-18ΑΑ (mutação Cysi3-Seri4 ou Ser13-Cysi4 com uma permuta adicional D-Glu^Gln, e.g. no local de fecho do anel) foi comparada com a dos ciclo-péptidos de 25AA ou de 18AA Cys/Cys contendo 3 Cys, após pré-incubação (12 h, 4 °C, incubação com rotação durante a noite) de diferentes números de soros de ratos imunizados positivos para anticorpo num ensaio de competição de ELISA, utilizando o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys como um antigénio. As figuras 4, 5 e 7-10 apresentam os resultados de medições efectuadas com soros de n=12 até n=82 ratos imunizados positivos para anticorpo utilizando diferentes ciclo-péptidos do presente invento.

Os resultados obtidos com fracções IgG isoladas dos soros de 12 ratos diferentes, imunizados, positivos para anticorpo revelaram que, surpreendentemente, apenas os ciclo-péptidos mutantes Cys/Ser, mas não os Ser/Cys, foram capazes de bloquear significativamente a ligação de anticorpo ao antigénio βι-ECn. O efeito de bloqueamento do ciclo-péptido mutante 18AS Cys/Ser foi comparável ou (em mais de metade dos soros analisados n=8/12) foi ainda mais eficaz do que a capacidade de bloqueamento do ciclo-péptido βι-ΕΟϋ-ΙδΑΑ Cys/Cys contendo 3 Cys (figura 4). Esta observação foi confirmada por estudos de titulação de dose que demonstram um efeito de bloqueamento claramente dependente da dose do ciclo-péptido mutante βι-ECn-lSAA Cys/Ser, que a um excesso molar de duas a oito vezes (assumindo uma estequiometria 1:1 para ambos o péptido ciclico (massa molecular (MM) de 2,1 kDa) ou linear (MM 3,0 kDa), considerando um peso molecular de 150 kDa para uma molécula de IgG) foi consistentemente largamente superior no bloqueamento de anticorpos para receptor do que o seu homólogo mutado Ser/Cys ou um péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys (figura 5). A figura 7 resume o efeito de bloqueamento de diferentes ciclo-péptidos mutantes após pré-incubação com IgG isolada de n=78 ratos imunizados, positivos para anticorpo, num ensaio de 94

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT competição de ELISA com o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys como antigénio. A capacidade de bloqueamento de mutantes de 18AA Cys/Ser foi a maior (69±2%) , seguido pelo ciclo-péptido de 25AA Cys/Cys (67±2%), ciclo-péptido de 18AA Cys/Cys (60±4%) e péptido linear de 25AA contendo 3 Cys (55±4%) comparativamente com os mutantes cíclicos totalmente ineficazes de 25AA ou de 18AA Ser/Cys (6±2% ou 1±2%, respectivamente; P< 5x IO”30 ou P< 3, 7xl0~33) . Apenas menos do que 5% dos soros de rato ensaiados (n=4) foram também parcialmente bloqueados pelos mutantes cíclicos ECII-18AA Ser/Cys, enquanto a larga maioria (>95%; n=78) foram bloqueados eficazmente pelo mutante ECn-18AA Cys/Ser (figura 8).

Analisou-se o efeito de bloqueamento in vitro de ciclo-péptido mutantes com um local de fecho Gln-Ala ou um local de fecho D-Glu-Ala por ensaio de competição de ELISA (com o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys como antigénio) após pré-incubação com soros isolados de 69 ratos diferentes, imunizados, positivos para anticorpo. Os resultados apresentam-se na figura 9.

Uma vez mais, existem dois padrões de reacção dos soros de rato ensaiados (tipo 1/tipo 2) . A maior fracção dos soros (93%, figura 9, painel superior, tipo 1 e figura 10) foi bloqueada muito eficazmente pelos ciclo-péptidos mutantes de 25AA ou de 18AA Cys/Ser (69±2% ou 68±3% (fecho Gin)/ 69±2% (fecho D-Glu), respectivamente) que foram ainda superiores aos ciclo-péptidos correspondentes de 25AA ou de 18AA Cys/Cys contendo 3-Cys (65±2% ou 59±2%, respectivamente), enquanto os mutantes de 25AA ou de 18AA Ser/Cys não apresentaram quase nenhum efeito de inibição, independentemente do aminoácido no local de fecho (6 + 2%, 25AA Ser/Cys, P< 5x 1(Γ30; 1±2%, 18AA

Ser/Cys com fecho Gin (P< 3, 7x10~3j) ou 1±2% com fecho D-Glu, (P< 6xl0~55) .

Uma pequena fracção dos soros (7%, figura 9, painel inferior, tipo 2 e figura 10) foi bloqueada de forma similar por péptidos mutados Cys/Ser ou Ser/Cys, embora em menor 95

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT extensão em termos de capacidade de inibição; além disso, para ambos os ciclo-péptidos de 25AA e de 18AA, os mutantes foram menos eficazes dos que os seus homólogos de 25AA ou de 18AA Cys/Cys contendo 3 Cys. A capacidade de bloqueamento dos ciclo-péptidos mutantes de 25AA ou de 18AA Cys/Ser foi de 48±6% ou de 50±8% (fecho Gin)/47±5% (fecho D-Glu), respectivamente, que foi constantemente inferior à dos correspondentes ciclo-péptidos de 25AA ou de 18AA Cys/Cys contendo 3-Cys (72±5% ou 67±6%, respectivamente); no entanto, nestes animais, os mutantes de 25AA ou de 18AA Ser/Cys revelaram capacidades de bloqueamento que foram praticamente comparáveis com as dos mutantes Cys/Ser (37±7% 25AA Ser/Cys, P=0,22 n.s.; 47±3% 18AA Ser/Cys com fecho Gin ou 33±5% com fecho D-Glu, P=0,7 n.s. ou P =0,08 n.s., respectivamente).

Subsequentemente, analisou-se a capacidade de bloqueamento dependente da dose de vários péptidos lineares e cíclicos betal-ECII in vitro utilizando o mesmo ensaio de competição de ELISA (figura 11):

As experiências incluindo péptidos lineares de 25AA Cys/Cys, péptidos mutantes cíclicos de 25AA Cys/Ser, péptidos cíclicos de 18AA Cys/Cys, péptidos mutantes cíclicos de 18AA Cys/Ser e um péptido mutante linear de 18AA Cys/Ser revelaram que todos os soros de n=6 ratos seleccionados aleatoriamente, imunizados, positivos para anticorpo, foram melhor bloqueados de uma forma dependente da dose por ciclo-péptidos mutantes betal-ECII-18AA Cys/Ser, seguido pelos ciclo-péptidos não mutantes de 18AA Cys/Cys e pelo ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser. Todos os ciclo-péptidos foram largamente superiores aos seus homólogos lineares (com ou sem mutação) em termos de capacidade de neutralização de anticorpo (P<0,005; figura 11), proporcionando uma diminuição dependente da dose em anticorpos anti-betal-ECII livres em circulação de 53% com um excesso de 8 vezes, 66% com um excesso de 20 vezes e cerca de 85% com um excesso de 80 vezes dos ciclo-péptidos mutantes de 18AA Cys/Ser. Os resultados correspondentes para o péptido cíclico de 18AA Cys/Cys ou péptido cíclico de 25AA Cys/Ser foram: 46/30% [excesso de 8 vezes], 56/49% [excesso de 20 vezes] e 96 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ 71/83% a um excesso de 80 vezes. Os péptidos lineares foram claramente menos eficazes, proporcionando uma diminuição dependente da dose no titulo de anticorpos para receptor de apenas 24% [excesso de 8 vezes], 35% [excesso de 20 vezes] e cerca de 50% a um excesso de 80 vezes para ambos os péptidos lineares de 25AA Cys/Cys e lineares de 18AA Cys/Ser.

Adicionalmente, ensaiou-se a capacidade de bloqueamento (=neutralização) in vitro de várias variantes de ciclo-péptido da segunda ansa extracelular (ECII) do receptor adrenérgico betai humano com soros de ratos imunizados, positivos para anticorpo betal-ECII após incubação durante 12-14 h a 4 °C. A eficácia de bloqueamento in vitro do ciclo-péptido de 22AA cic2 2AA Cys/Cys (eficácia de bloqueamento 82,0±5,0% relativamente a soros não bloqueados, P=0,000046) e de ciclo-péptidos mutantes de 22AA cic22AA Cys/Ser (eficácia de bloqueamento 74,9± 5,0%, P=0,00026) foi ainda superior à capacidade de bloqueamento dos ciclo-péptidos contendo 3 Cys previamente descritos, i.e., cic25AA Cys/Cys (eficácia de bloqueamento 73,4±5,0%, P=0,00011) ou cicl8AA Cys/Cys (eficácia de bloqueamento 66,1± 7,0% relativamente a soros não bloqueados, P=0,00025; consultar figuras 27A/B)

Exemplo 3: Ensaio FRET funcional in vitro A capacidade de bloqueamento de βι-ECn de ciclo-péptidos mutantes de 25AA ou de 18AA (com ou sem D-Glu/Gln no local de fecho de anel) na sinalização mediada por receptor βι (ensaio de cAMP funcional) foi ensaiada utilizando uma abordagem por transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) (figura 6). O efeito da pré-incubação (12 h, 4 °C, incubador com rotação) de anticorpos IgG anti^i-ECu de um rato representativo com ciclo-péptidos mutantes βι-Ε^ι-18ΑΑ (mutações Cys/Ser ou Ser/Cys, respectivamente) foi comparado com o efeito de inibição de ciclo-péptido de 25AA Cys/Cys

contendo 3 Cys ou com o efeito de anticorpos IgG anti^i-ECn não incubados com péptidos de bloqueamento. A razão YFP/CFP 97 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ normalizada dos sinais de emissão FRET registados serviu para quantificar o efeito dos ciclo-péptidos mutantes do presente invento em termos de bloqueamento (em percentagem) da produção de cAMP celular induzida por anticorpo de células de rim embrionário humano transfectadas transitoriamente com Epacl, que expressam estavelmente βι-AR (células HEK 293-βι) . 0 eixo dos x na figura 6 corresponde ao tempo de registo apresentado em segundos (s). 0 efeito de inibição dos ciclo-péptidos mutantes βι-ECn-18AA na estimulação de sinalização transmembranar adrenérgica βι induzida por anticorpo foi analisada utilizando uma abordagem por transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET). Uma vez mais, também em termos de inibição de efeitos de anticorpo funcional mensuráveis (bloqueamento de aumento de cAMP intracelular) o mutante ciclico 3i-ECn-18AA Cys/Ser foi largamente superior ao seu homólogo Ser/Cys e mesmo ligeiramente mais eficaz do que um ciclo-péptido de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys (figura 6).

Conjuntamente, os resultados dos ensaios aqui efectuados demonstram que a capacidade de bloqueamento de anticorpo dos ciclo-péptidos mutados não foi afectada pela redução do número de aminoácidos de um péptido de 25-mero para um de 18-mero. Os resultados também demonstram uma excelente comparabilidade dos ciclo-péptidos de 25AA Cys/Cys e de 18AA Cys/Cys com os mutantes cíclicos de 25AA ou de 18AA Cys/Ser, mas não com os mutantes cíclicos de 25AA ou de 18AA Ser/Cys. Surpreendentemente, a natureza exacta da permuta de um único resíduo de cisteína por um resíduo de serina determina acentuadamente a potência de neutralização dos péptidos mutados: a permuta Cys/Ser na posição 18 (ciclo-péptido de 25-AA) ou na posição 14 (ciclo-péptido de 18-AA) , respectivamente, proporcionou péptidos cíclicos com excelentes efeitos de neutralização de anticorpo e farmacológicos in vitro (figuras 6-10), enquanto os mutantes Cysi7->Seri7 ou Cysi3->Seri3 (péptido de 25-AA ou 18-AA, respectivamente) não apresentaram praticamente nenhum efeito de inibição, nem relativamente às suas propriedades de remoção de anticorpo, 98 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ nem em termos da sua capacidade de inibir efeitos de anticorpos funcionais (neutralização de estimulação de receptor in vitro; figuras 6-10 e exemplo 3) . A permuta D-Glu/Gln na posição 25 (mutantes de ciclo-péptido de 25AA) ou 18 (mutantes de ciclo-péptido de 18AA) não influenciou significativamente a capacidade de bloqueamento dos ciclo-péptidos, independentemente do seu comprimento (i.e., 25 relativamente a 18 aminoácidos; figuras 7-10).

Exemplo 4: Modelo animal, bloqueamento "in vivo" de anticorpos de receptor O modelo animal utilizado neste exemplo e qualquer outro exemplo aqui descrito, salvo indicação em contrário, é o modelo de rato análogo de humano. Antes de avaliação e ensaio, respectivamente, este modelo de rato análogo de humano foi tratado tal como aqui descrito seguidamente utilizando os vários compostos do presente invento, mais particularmente compostos de fórmula VI, VII, VIII e IX e, como controlos, um péptido linear mutado ECn-18AA Cys/Ser (Glni8) (com a seguinte sequência de aminoácidos: Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln) e um péptido linear não mutado ECn-25AA Cys/Cys (Gln2s) contendo 3 Cys (com a seguinte sequência de aminoácidos: Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln.

Os efeitos de bloqueamento in vivo de ambos os ciclo-péptidos mutantes de 25AA e de 18AA Cys/Ser (com um local de fecho Gin), do ciclo-péptido mutante de 18AA Ser/Cys e um péptido linear mutado de 18AA Cys/Ser foram analisados após injecção intravenosa (i.v.) de 1,0 mg/kg de peso corporal de cada construção em ratos imunizados recentemente, positivos para anticorpo (i.e., utilização de ciclo-péptidos num estudo do tipo "prevenção"), com uma primeira aplicação de ciclo-péptido 3 meses após a imunização inicial (e dos reforços subsequentes aos meses 2 e 3). No total, administraram-se cinco aplicações profilácticas das várias construções a intervalos de 4 semanas, sempre duas semanas após o reforço de 99 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ antigénio continuado mensal. Os soros foram retirados 18-20 horas após injecção i.v. e ensaiaram-se para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys como antigénio (figura 12).

Estas primeiras aplicações (profilácticas) in vivo de ciclo-péptido demonstraram que a eficácia mais elevada em termos de neutralização de anticorpo foi conseguida com 1.0 mg/kg de peso corporal de ciclo-péptidos não mutantes de 25AA Cys/Cys ou de 18AA Cys/Cys (87,7±2% ou 89,9±3% de diminuição após 5 injecções de ciclo-péptido, comparativamente com animais imunizados, não tratados; ambos P< 0,005), seguido pelo ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (54,5±2% de diminuição após 5 injecções de ciclo-péptido; P<0,05), enquanto os péptidos lineares de 25AA Cys/Cys ou os mutantes lineares de 18AA Cys/Ser à mesma concentração não tiveram quaisquer efeitos de bloqueamento significativos (25,8±3% ou 4,5±11% de diminuição de título de anticorpo após 5 injecções, P=0,16 ou P=0,8; figura 12).

Esta observação foi confirmada por análise ELIspot de preparações de células de medula óssea e baço de ratos seleccionados tratados com ciclo-péptido relativamente a ratos não tratados, imunizados (n=3). A figura 13 apresenta uma diminuição significativa do número de células que excretam anticorpo específico anti-betal-ECII (ASC), tanto no baço como, em menor extensão, na medula óssea apenas em ratos tratados com o ciclo-péptido de 25AA Cys/Cys ou com o ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser (n=3 ou 4, respectivamente), enquanto o péptido mutante linear de 18AA Cys/Ser (n=3) não teve qualquer efeito em ASC (nem de baço, nem de medula óssea).

Adicionalmente, os efeitos de bloqueamento in vivo de ciclo-péptidos mutantes de 25AA e de 18AA Cys/Ser, do ciclo-péptido mutante de 18AA Ser/Cys (Gin) e de um péptido linear mutado de 18AA Cys/Ser utilizados terapeuticamente foram avaliados após uma primeira dose intravenosa (i.v.) (i.e., 1.0 mg/kg de peso corporal) de cada construção injectada em 100 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ ratos imunizados a longo prazo, positivos para anticorpo anti-betal-ECII, mas que apresentam um fenótipo cardiomiopático (após nove meses de imunização lx mês com o antigénio betal-ECII/GST; figuras 14-16 e 17). Os soros foram retirados 18-20 horas após a primeira injecção i.v. das várias construções e ensaiados para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys como antigénio. A aplicação "terapêutica" de vários ciclo-péptidos em ratos cardiomiopáticos, positivos para anticorpo, revelou uma maior capacidade de bloqueamento in vivo dos ciclo-péptidos mutantes de 18AA Cys/Ser (1 mg/kg/de peso corporal) comparativamente com o ciclo-péptido mutante de 25AA Cys/Ser ou o ciclo-péptido mutante de 18AA Ser/Cys, evidentemente menos eficiente, à mesma concentração (figuras 14 e 15). Uma vez mais, a eficácia in vivo do ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser foi largamente superior à do péptido mutante linear de 18AA Cys/Ser. No entanto, quando se diminuiu a dose aplicada do mutante cíclico de 18AA Cys/Ser para 0,25 mg/kg de peso corporal, não se conseguiu uma diminuição relevante de anticorpos para receptor, sugerindo uma relação dose-efeito para os ciclo-péptidos mutantes.

As injecções terapêuticas repetidas de ciclo-péptidos mutantes com uma única S-S de 4 em 4 semanas em ratos imunizados a longo prazo com cardiomiopátia imunitária induzida por anticorpo confirmou um tipo de relação "crítica mínima de dose"-efeito para ciclo-péptidos mutantes com uma única S-S: uma dose de 0,25 mg/kg de peso corporal do ciclo-péptido de 18AA Cys/Ser, embora capaz de remover anticorpos para receptor em alguma extensão, foi obviamente menos eficaz em termos de (1) a diminuição conseguida nos anticorpos para receptor em circulação (mesmo quando relativa apenas a "respostas" sensíveis a ciclo-péptido, definidas como animais que, após 7 injecções de ciclo-péptido, têm um nível de anticorpo remanescente máximo igual ou inferior a 80% do titulo no início da terapia (figuras 16b e c), e (2) no efeito cardioprotector conseguido (figuras 17b, 19b, 20 e 21b) comparativamente a uma dose de 1,0 ou 2,0 mg/kg de peso corporal de ciclo-péptido de 18AA Cys/Ser. Estas últimas doses 101 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ foram quase igualmente eficazes em termos tanto de neutralização de anticorpos para receptor em circulação (figuras 16b e c) , como para reversão das caracteristicas cardiomiopáticas induzidas por anticorpo (figuras 17b, 19b, 20 e 21 b) . No entanto, um aumento adicional da dose aplicada para 4,0 mg/kg de peso corporal não resultou em maior eficácia, nem relativamente à capacidade de remoção de anticorpo (figuras 16b e c) , nem relativamente aos efeitos cardioprotectores (figuras 17b, 19b, 20 e 21b).

Por injecção dos péptidos não se verificaram efeitos secundários locais ou sistémicos graves. Além disso, após injecção dos vários ciclo-péptidos mutantes, nem o ritmo cardíaco, nem a pressão arterial dos animais foram afectados (figura 20a) . Além disso, não ocorreram quaisquer alterações evidentes dos parâmetros laboratoriais de rotina associados à aplicação dos mutantes de ciclo-péptido (figura 22a e b).

De modo a gerar anticorpos anti-receptor βι, os animais foram imunizados com uma proteína de fusão contendo glutationa-S-transferase bacteriana e a sequência da segunda ansa extracelular do receptor adrenérgico βι humano (GST/βι-ECu) . Antes do tratamento dos animais com ciclo-péptidos mutados de acordo com o presente invento, verificou-se cardiomiopatia imunitária dilatada progressiva após 6 a 8 meses de imunização regular de quatro em quatro semanas (figura 17). Todos os animais imunizados desenvolveram elevados títulos de anticorpos anti^i-ECu de estimulação. O título de anti^i-ECu específico atingiu um máximo entre 6 e 8 meses de reforço contínuo dos animais de 4 em 4 semanas, enquanto os animais de controlo injectados com NaCl não desenvolveram anticorpos específicos para receptor (figura 18).

Tais animais imunizados foram utilizados para a aplicação de ciclo-péptidos mutantes de acordo com o presente invento. O efeito de bloqueamento in vivo de ambos os ciclo-péptidos mutantes de 25AA e de 18AA Cys/Ser (com um local de fecho Gin) foi determinado após uma primeira injecção intravenosa (i.v.) 102 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ de 1,0 mg/kg de peso corporal (para os ciclo-péptidos de 18AA Cys/Ser também 0,25 mg/kg/de peso corporal) em ratos imunizados, positivos para anticorpo. Os soros foram retirados 18-20 horas após injecção i.v. dos diferentes péptidos e ensaiaram-se para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA contendo 3 Cys como antigénio.

Tal como mencionado, os efeitos de bloqueamento in vivo de ambos os ciclo-péptidos mutados de 25AA e de 18AA Cys/Ser (como um local de fecho Gin), do ciclo-péptido mutante de 18AA Ser/Cys (Gin) e de um péptido linear mutado de 18AA Cys/Ser foram analisados após uma primeira injecção intravenosa (i.v.) de 1 mg/kg de peso corporal de cada construção em ratos imunizados, positivos para anticorpo. Os soros foram retirados 18-20 horas após injecção i.v. e ensaiaram-se para reactividade por ELISA utilizando o péptido linear de 25AA Cys/Cys contendo 3 Cys como antigénio.

Os dados in vivo confirmaram uma maior capacidade de bloqueamento dos ciclo-péptidos mutados de 18AA Cys/Ser (1 mg/kg/de peso corporal) comparativamente com os mutantes de 2 5AA Cys/Ser ou ciclo-péptidos mutados de 18AA Ser/Cys, nitidamente menos eficazes, à mesma concentração (figuras 14 e 15) . A eficácia in vivo do ciclo-péptido de 18AA Cys/Ser também foi largamente superior à do péptido linear de 18AA Cys/Ser.

Por injecção dos péptidos, não se verificaram quaisquer efeitos secundários locais ou sistémicos graves. Além disso, após injecção dos vários ciclo-péptidos mutantes, tanto o ritmo cardíaco, como a pressão arterial dos animais não foram afectados.

No entanto, os dados in vivo também indicam que a eficácia do ciclo-péptido mutado de 18AA Cys/Ser (Gin) parece depender da dose aplicada; uma injecção de 0,25 mg/kg/de peso corporal foi menos eficaz em termos de neutralização de anticorpo do que a mesma contracção administrada a uma concentração de 1 mg/kg/de peso corporal (figuras 14 e 15). 103

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

As observações in vitro descritas nos exemplos 2 e 3 foram confirmadas na generalidade in vivo (e.g. figuras 14-16). Curiosamente, a diferença na eficácia de bloqueamento dos ciclo-péptidos mutados Cys/Ser comparativamente com a dos péptidos lineares foi ainda mais pronunciada in vivo (figuras 5, 7 e 14-16).

No entanto, os dados in vivo também indicam que a eficácia do ciclo-péptido mutado de 18AA Cys/Ser pode igualmente depender da dose aplicada (figuras 14-16). Os resultados obtidos são compatíveis com uma relação (mínima) de dose-efeito para ciclo-péptidos mutantes com uma única S-S: uma dose de 0,25 mg/kg do ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser foi largamente menos eficaz em termos da diminuição atingida nos anticorpos para receptor em circulação e no efeito cardioprotector obtido comparativamente com uma dose de 1,0 ou 2,0 mg/kg de peso corporal (figuras 14-16). Estas doses foram quase igualmente eficazes em termos de neutralização dos anticorpos para receptor em circulação e reversão das características cardiomiopáticas induzidas por anticorpo (figuras 16-20) . No entanto, um aumento adicional na dose aplicada para 4,0 mg/kg de peso corporal não resultou em maior eficácia, nem relativamente à capacidade de remoção de anticorpo (figura 16), nem relativamente aos efeitos cardioprotectores in vivo (figuras 17-21).

Uma elevada dose (=4,0 mg/kg de peso corporal) de mutantes cicl8AA Cys/Ser não aumentou a eficácia; em vez disso, levou a um aumento transitório no título de anticorpos, permitindo reduções significativas dos títulos de anticorpo para receptor apenas após a terceira ou quarta injecção de ciclo-péptido. Mais notavelmente, o efeito na capacidade de neutralização de anticorpo das diferentes concentrações injectadas de ciclo-péptidos mutantes cicl8AA Cys/Ser foi também confirmado em termos da reversão das características cardiomiopáticas induzidas por anticorpo no decurso do estudo, com a melhor cardioprotecção atingida por 1,0 ou 2,0 mg/kg de peso corporal 104 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ de ciclo-péptidos mutantes de 18AA Cys/Ser (figuras 17B, 19B, 20 e 21B).

Tal como mencionado, tanto 1,0 mg/kg de peso corporal de mutante de 25AA-mero Cys/Ser, bem como uma dose elevada (=4,0 mg/kg de peso corporal) de mutante 18AA-mero Cys/Ser levou a um aumento transitório no titulo de anticorpos, compatível com uma reacção imunitária inicial, permitindo reduções significativas dos títulos de anticorpo para receptor apenas após a terceira ou quarta injecção de ciclo-péptido (terceiro ou quarto mês de terapia; consultar figuras 16a e b). Este fenómeno não ocorreu com doses de 1,0 nem de 2.0 mg/kg dos ciclo-péptido mutantes de 18AA Cys/Ser, resultando em maiores diminuições absolutas no título de anticorpos após 9 meses de tratamento (1,0 mg/kg: - 59±14% ou 2.0 mg/kg: -59±12%, respectivamente, P<0,0005 relativamente a animais imunizados, não tratados) comparativamente a apenas -37±13% (1,0 mg/kg de 25AA Cys/Ser-CP; P=0,36 relativamente a animais imunizados, não tratados) ou -39±14% (4,0 mg/kg de 18AA Cys/Ser-CP, P=0,24 relativamente a animais imunizados, não tratados) do respectivo título de anticorpos no início da terapia. Assim, doses de 1,0 ou 2,0 mg/kg de peso corporal de péptidos cicl8AA Cys/Ser foram quase igualmente eficazes em termos de termos de neutralização de anticorpos para receptor em circulação (figuras 16b e c) e no decurso do estudo também em termos da reversão das características cardiomiopáticas induzidas por anticorpo (figuras 17b, 19b, 20 e 21 b).

Além disso, as experiências in vivo demonstraram que a capacidade de bloqueamento de anticorpo de ciclo-péptidos mutantes não é aparentemente afectada por uma redução no número de aminoácidos de um ciclo-péptido 25-mero para 18-mero; os dados tanto in vitro, como in vivo demonstram uma excelente comparabilidade dos dois ciclo-péptidos mutantes contendo uma única ligação dissulfureto com 2 cisteínas de 25AA Cys/Ser ou de 18AA Cys/Ser (figura 17a) . Deve salientar-se, contudo, que 1,0 mg/kg de 25AA-mero Cys/Ser, bem como uma dose elevada (i.e., 4,0 mg/kg de peso corporal) de mutantes de 18AA-mero Cys/Ser levou a um aumento transitório 105

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT inicial no titulo de anticorpos (figura 16a e b) e assim adiaram uma redução significativa nos títulos de anticorpo para receptor até à terceira ou quarta aplicação de ciclo-péptido (terceiro ou quarto mês de terapia). Este fenómeno não ocorreu com uma dose de 1,0, nem de 2,0 mg/kg de peso corporal de ciclo-péptido mutante de 18AA Cys/Ser. A capacidade de bloqueamento (=neutralização) in vivo dos mutantes cic22AA Cys/Ser da segunda ansa extracelular (ECII) do receptor adrenérgico betai humano foi também ensaiada por injecção "terapêutica" em ratos que tinham sido imunizados regularmente ao longo de 8 meses (imunização básica e sete reforços subsequentes de antigénio de 4 em 4 semanas, consultar figuras 28A/B) e comparada com os efeitos do mutante cicl8AA Cys/Ser descrito.

Após quatro a cinco injecções regulares de ciclo-péptido de 4 em 4 semanas, os títulos em animais não tratados, positivos para anticorpo aumentaram para 110,7±5,6% dos valores no inicio da terapia (n=5, controlos positivos; titulo de referência após um total de 8 + 4 ( = 12) aplicações de antigénio comparativamente com o título de anticorpos no mês 8). Contrariamente, 4 injecções do mutante cic22AA Cys/Ser (n=8 animais) diminuíram os títulos de anticorpo para 9,0 ± 2,2% do título de anticorpos no início da terapia (P= 3,0 x 10-7, quando ensaiado para significância contra o título de anticorpos de animais não tratados, positivos para anticorpo pelo teste t de dois ramos) . A eficácia in vivo dos mutantes cic22AA é assim aumentada adicionalmente comparativamente ao ciclo-péptido mutante Cys/Ser descrito com um comprimento de 18 aminoácidos (cicl8AA Cys/Ser; n=5 animais), que após 4 injecções diminuiu o título de anticorpos para 76,0±23,0% do título no início da terapia (P= 0,44 relativamente a animais não tratados, positivos para anticorpo, n.s.; consultar figura 28A).

Além disso, os dados de ecocardiografias de seguimento após 4 meses de tratamento também demonstram uma superioridade do mutante cic22AA comparativamente com o mutante cicl8AA 106

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Cys/Ser relativamente aos seus efeitos cardioprotectores in vivo, tal como avaliado pela diminuição de ambos os diâmetros ventriculares esquerdos de fim de diástole (LVED) e fim de sístole (LVES) (figura 29A) e um aumento do "índice cardíaco" (Cl, apresentado em ml/min/g de peso corporal; consultar figura 29B), tal como determinado por ecocardiografia bidimensional e ecocardiografia Doppler utilizando um sistema de ecocardiografia Visual Sonics (Vevo 770, versão V2.2.3), equipado com um transdutor 17,5 MHz).

Conjuntamente, dado que a actividade cardioprotectora e de imuno-modulação dos péptidos cíclicos homólogos de ECII parece depender fortemente da sua conformação, uma ponte de dissulfureto intramolecular localizada é essencial para estabilizar e manter a estrutura tridimensional da construção. No péptido cíclico de 21+1 (=22) AA, as restantes cisteínas (i.e. nas posições 209 e 215, no caso da 216 ter sido mutada para Ser) mantêm uma distância intramolecular definida, fortalecida adicionalmente pela introdução do menor aminoácido de ocorrência natural, glicina, no local de fecho de anel (previsto) , de modo a permitir a formação de uma ponte de dissulfureto intramolecular que define a estrutura. O presente invento refere-se às seguintes sequências de nucleótidos e de aminoácidos: SEQ ID No.1:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (18AA; Cysi4-^Ser14) ; A ciclização pode ocorrer entre Ala4 o Gln48

Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-

Phe-Val-Gln SEQ ID No. 2:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cysi8->Seri8) ; A ciclização pode ocorrer entre Ala4 θ Gln25 107

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Ala Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln SEQ ID No. 3:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cysn^Sern; Glnig^DGluis) ; A ciclização pode ocorrer entre Alai e DGluis

Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-

Phe-Val-DGlu SEQ ID No.4:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cysis^Sern; Gln25^DGlu2s) ; A ciclização pode ocorrer entre Alai e DGIU25

Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-

Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu SEQ ID No. 5:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (18AA; CySi3->Ser13) ; A ciclização pode ocorrer entre

Ala3 e Ginis

Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-

Phe-Val-Gln SEQ ID No. 6:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cysi7^Ser17) ; A ciclização pode ocorrer entre

Alai c Gln25

Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-

Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln SEQ ID No. 7:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cysi3->Seri3; Glnig-dDGluis) ; A ciclização pode ocorrer entre Alai e DGlun 108 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-

Phe-Val-DGlu SEQ ID No. 8:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βχ-AR humano (25AA; CySi7->Ser17; Gln25->DGlu25) ; A ciclização pode ocorrer entre Alai e DGIU25

Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-

Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu SEQ ID No. 9:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (18AA; Cysi4->Ser14) gcngacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgcSERgacttcgtccar SEQ ID No. 10:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (25AA; Cys18^Ser18) gcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgcSERgacttcgt caccaaccggcar SEQ ID No. 11:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (18AA; Cy s 14—>S e r 14; Glngg—>DGlui8) gcngacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgeSERgacttcgtcgar SEQ ID No. 12:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (25AA; Cys18^Seri8; Gln25^DGlu25) gcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgeSERgacttcgt caccaaccgggar 109

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT SEQ ID Νο. 13:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cysi3^Seri3) gcngacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagSERtgcgacttcgtccar SEQ ID No. 14:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cysi7->Seri7) gcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagSERtgcgacttcgt caccaaccggcar SEQ ID No. 15:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (18AA;

Cysi3^Seri3; Glnn^DGluis) gcngacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagSERtgcgacttcgtcgar SEQ ID No. 16:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cysi7->Seri7; Gln2s^DGlu25) gcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagSERtgcgacttcgt caccaaccgggar SEQ ID No. 17:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cys3^Ser3); A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Pron

Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 110 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ SEQ ID Νο. 18:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (25AA; Cys3->Ser3) ; A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Pro25

Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-

Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 19:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (18AA; Cys3->Ser3; Gln7->DGlu7) ; A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Proi8

Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-DGlu-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-

Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 20:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (25AA; Cys3->Ser3; Glnio->DGluio) ; A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Pro25

Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-

Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 21:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (18AA; Cys2-*-Ser2) ; A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Proi8

Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-

Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 22:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (25AA; Cys2^Ser2); A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Pro25

Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-

Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro 111 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ SEQ ID Νο. 23:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cys2->Ser2,· Gln7->DGlu7) ; A ciclização pode ocorrer entre Lysl e Proi8

Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-DGlu-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-

Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 24:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cys2->Ser2; Glnio-DGluio) ; A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Pro25

Lys-Ser-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-

Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 25:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cys3-Ser3) aagtgcSERgacttcgtccargcngacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 26:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cys3^Ser3) aagtgcSERgacttcgtcaccaaccggcargcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctg ctacaacgacccc SEQ ID No. 27:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cys3^Ser3; Gln7^DGlu7) aagtgcSERgacttcgtcgargcngacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc 112 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ SEQ ID Νο. 28:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cys3->Ser3; Gln10-DGlui0) aagtgcSERgacttcgtcaccaaccgggargcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctg ctacaacgacccc SEQ ID No. 29:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cys2^Ser2) aagSERtgcgacttcgtccargcngacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 30:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (25AA;

Cys2^Ser2) aagSERtgcgacttcgtcaccaaccggcargcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctg ctacaacgacccc SEQ ID No. 31:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (18AA; Cys2->Ser2; Gln7->DGlu7) aagSERtgcgacttcgtcgargcngacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 32:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (25AA; Cys2->Ser2; Gln3o—DGluio) aagSERtgcgacttcgtcaccaaccgggargcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctg ctacaacgacccc 113 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ SEQ ID Νο. 33:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn contendo parte de βι-AR humano (16AA; posições AA 204 a 219) DEARRCYNDPKCCDFV SEQ ID No. 34:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn contendo parte de βι-AR humano (23AA; posições AA 200 a 222) RAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR SEQ ID No. 35:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn de βι-AR humano DEARR SEQ ID No. 36:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn (contendo parte) de βι-AR humano RAESDEARR SEQ ID No. 37:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn de βι-AR humano DFV SEQ ID No. 38:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn de βι-AR humano DFVTNR SEQ ID No. 39:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (16AA; Cysn->Sern; AA N-terminal: Glnn ou DGlun) ; A ciclização pode ocorrer entre Alai e Gln16/DGlu16

Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Tyr-

Gln/DGlu 114

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT SEQ ID Νο. 40:

Sequência de aminoácidos de βι-AR humano 1 mgagvlvlga sepgnlssaa plpdgaataa rllvpasppa sllppasesp eplsqgwtag 61 mgllmalivl livagnvlvi vaiaktprlq tltnlfimsl asadlvmgll wpfgatiw 121 wgrweygsff celwtsvdvl cvtasietlc vialdrylai tspfryqsll trararglvc 181 tvwaisalvs flpilmhwwr aesdearrcy ndpkccdfvt nrayaiassv vsfyvplcim 241 afvylrvfre aqkqvkkids cerrflggpa rppspspspv papapppgpp rpaaaaatap 301 langragkrr psrlvalreq kalktlgiira gvftlcwlpf flanwkafh relvpdrlfv 361 ffnwlgyans afnpiiycrs pdfrkafqgl lccarraarr rhathgdrpr asgclarpgp 421 ppspgaasdd ddddwgatp parllepwag tnggaaadsd ssldepcrpg faseskv SEQ ID No. 41:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (22AA; Cysi7->Seri7) ; A ciclização pode ocorrer entre Argi e Gly22

Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-

Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly SEQ ID No. 42:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (22AA; Cysi7^Seri7) cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgcSERgacttcgtcac

cGLY SEQ ID No. 43:

Sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (22AA; CyS3->Ser3) ; A ciclização pode ocorrer entre Lysi e Pro22

Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-

Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 44:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECu de βι-AR humano (22AA; Cys3^Ser3) 115 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT aagtgcSERgacttcgtcaccGLYcgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacga cccc SEQ ID No. 45:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn (contendo parte) de βι-AR humano DEARRCYNDPK SEQ ID No. 46:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn (contendo parte) de βι-AR humano ESDEARRCYNDPK SEQ ID No. 47:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn de βι-AR humano AESDEARR SEQ ID No. 48:

Sequência de aminoácidos de um epítopo ECn de βι-AR humano DFVT SEQ ID No. 49:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; CySis^Seris (18AA; Cysi4->-Seri4) ) gcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgcSERgacttcgtccar SEQ ID No. 50:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; Cysi5->Ser15 (18AA; Cys14^Seri4) ; Glni8->D)Glui8) gcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgcSERgacttcgtcgar 116 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ SEQ ID Νο. 51:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; Cysi4^Seri4 (18AA; Cys13^Seri3) ) gcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagSERtgcgacttcgtccar SEQ ID No. 52:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; Cysi4->Seri4 (18AA; Cysi3^Seri3) ; Glnn-^DGluis) gcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagSERtgcgacttcgtcgar SEQ ID No. 53:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; Cys3->Ser3 (18AA; Cys3->Ser3) ) aagtgcSERgacttcgtccargcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 54:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; Cys3^Ser3 (18AA; Cys3->Ser3) ; Gln7->DGlu7) aagtgcSERgacttcgtcgargcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 55:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; Cys2->Ser2; (18AA; Cys2^Ser2) ) aagSERtgcgacttcgtccargcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 56:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECn de βι-AR humano (19AA; Cys2^Ser2; (18AA; Cys2^Ser2) ; Gln7->DGlu7) 117 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT aagSERtgcgacttcgtcgargcnagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgacccc

Nas sequências de nucleótidos, "SER" significa qualquer tripleto de nucleótidos que codifica Ser (serina), i.e. tcn ou agy; e "GLY" significa qualquer tripleto de nucleótidos que codifica Gly (glicina), i.e. ggn. n significa qualquer nucleótido, em particular a, c, g ou t, y significa t ou c e r significa a ou g.

Tal como aqui utilizado, as sequências dos vários péptidos são indicadas do terminal N para o terminal C, em que o terminal N está no lado esquerdo e o terminal C está no lado direito da respectiva sequência de aminoácidos representada.

Utilizam-se aqui as seguintes abreviaturas adicionais:

Aminoácido : Código de 3 letras: Código de 1 letra: Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Cisterna Cys C Ácido glutâmico Glu E Glutamina Gin Q Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W 118

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Tirosina Tyr Y Valina Vai V Asparagina ou ácido aspártico Asx B Glutamina ou ácido glutâmico Glx Z Leucina ou Isoleucina Xle J Aminoácido nao especificado ou Xaa X desconhecido

Referências citadas adicionais

American, Heart, Association: 2007. Dallas; Heart disease and stroke statistics - 2007 update. Circulation 115: e69-el71

Anderton 2001 Immunology 104: 367-376

Baba 2004 Eur. Heart J. 25: 1108-1115

Boivin 2005 Eur. J. Heart Fail. 4, supl.1: 24 (104)

Caforio 2002 Eur. J. Heart Fail. 4: 411-417

Chiale 2001 Circulation 103: 1765-1771

Chien 2000 Oncol. 27: 9-17

Christ 2001 J. Mol. Cell. Cardiol. 33: 1515-1525 Christ 2006 J. Mol. Cell Cardiol. 41: 716-723 Elies 1996 J. Immunol. 157: 4203-4211

Engelhardt 1999 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 7059-7064 Eriksson 2003 Nat. Med. 9: 1484-1490

Fabrizio 1994 Drugs Ther. 8: 89-94 119 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ

Felix 2000 J. Am. Coll. Cardiol. 35: 1590-1598 Ferrari 1995 J. Exp. Med. 182: 59-65 Freedman 2004 J. Clin. Invest. 113: 1379-1382 Fu 1993 J. Clin. Invest. 91: 1964-1968 Gõser 2006 Circulation 114: 1693-1702

Hershko 2005 Ann. N.Y. Acad. Sei. 1051: 635-646 Hoebeke 1996 Int. J. Cardiol. 54: 103-111

Iwata 2001 a J. Am. Coll. Cardiol. 37: 418-424

Iwata 2001 b Circ. Res. 88: 578-586

Jahns 1996 Eur. J. Pharmacol. 316: 111-121

Jahns 1999a J. Am. Coll. Cardiol. 34: 1545-1551

Jahns 1999b Circulation 99: 649-654

Jahns 2000 J. Am. Coll. Cardiol. 36: 1280-1287

Jahns 2004 J. Clin. Invest. 113: 1419-1429

Jahns 2006 Trends Cardiovasc Med 16: 20-24

Khoynezhad 2007 Eur. J. Heart Fail. 9: 120-123

Kuhl 2005 Circulation 112: 1965-1970

Li 2006 177: 8234-8240

Limas 1992 Am. Heart J. 123: 967-970

Limas 1996 Int. J. Cardiol. 54: 113-116 120

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Limas 1997 Circulation 95: 1979-1980 Limas 2004 Am. J. Cardiol. 93: 1189-1191 Lohse 2003 Circ. Res. 93: 896-906 Luppi 1998 Circulation 98: 777-785 MacLellan 2003 Nat. Med. 9: 1455-1456 Maekawa 2007 Circulation 115: 5-8 Magnusson 1994 Circulation 89: 2760-2767 Magnusson 1996 Int. J. Cardiol. 54: 137-141 Mahrholdt 2006 Circulation 114: 1581-1590 Matsui 1995 Autoimmunity 21: 85-88 Matsui 2001 Autoimmunity 43: 217-220 Mobini 2004 Autoimmunity Rev. 3: 277-284 Morita 2005 J. Clin. Invest. 115: 518-526 Neumann 1990 J. Am. Coll. Cardiol. 16: 839-846 Nikolaev 2007 J. Am. Coll. Cardiol. 50: 423-431 Okazaki 2003 Nat. Med. 9: 1477-1483 Okazaki 2005 Trends Mol Med 11: 322-326 Pohlner 1997 Am. J. Cardiol. 80: 1040-1045

Rose 1993 Immunol. Today 14: 426-430 121

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Rose 2001 J. Clin. Invest .. 107 : 943-944 Schultheiss 1985 J. Mol. Cell Cardiol. 17: 603-617 Schultheiss 1988 J. Exp. Med. 168: 2102-2109 Schulze 1999 Cardiovasc. Res. 44: 91-100

Sewald 2002 Peptides: Chemistry and Biology, Willey-VCH.

Smulski 2006 FASEB J. 20: 1396-1406

Stõrk 2006 Am. Heart J. 152: 697-704

Wallukat 1995 J. Mol. Cell Cardiol. 27: 397-406

Wallukat 2002 N. Engl. J. Med. 347: 1806

Wang 1996 Blood Pressure 3: 25-27

Witebsky 1957 J. Am. Med. Assoe. 164: 1439-1447

Woodiwiss 2001 Circulation 103: 155-160 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Julius-Maximilians-Universitát Wurzburg <120> Péptidos receptores duplamente cíclicos mutados que inibem anticorpos anti-receptor adrenérgico betai <130> M3119 PCT S3 <160> 56 <170> Patentln versão 3.4 <210 > 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial 122 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <2 2 Ο > <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano <400> 1

Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Ser Asp Phe 15 10 15

Vai Gin <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano <400> 2

Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys 15 10 15

Cys Ser Asp Phe Vai Thr Asn Arg Gin 20 25 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano <220> <221> VARIANTE <222> (18)..(18) <223> /replace = "DGlu" <400> 3

Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Ser Asp Phe 15 10 15

Vai Glu <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano 123 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <221> VARIANTE <222> (25)..(25) <223> /replace = "DGlu" <400> 4

Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys 15 10 15

Cys Ser Asp Phe Vai Thr Asn Arg Glu 20 25 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 5

Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Ser Cys Asp Phe 1 5 10 15

Vai Gin <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 6

Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys 15 10 15

Ser Cys Asp Phe Vai Thr Asn Arg Gin 20 25 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano 124 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <2 2 Ο > <221> VARIANTE <222> (18)..(18) <223> /replace ="DGlu" <400> 7

Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Ser Cys Asp Phe 1 5 10 15

Vai Glu <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> VARIANTE <222> (25)..(25) <223> /replace ="DGlu" <400> 8

Ala Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys 1.5 10 15

Ser Cys Asp Phe Vai Thr Asn Arg Glu 20 25 <210> 9 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u <220> <221> misc_feature <222> (40).. (42) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" 125 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> r é a ou g <400> 9 gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtgct ctgacttcgt ccar 54 <210> 10 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <2 21 > misc_feature <222> (3) . . (3) <223> n é a, c, g, t ou <220> <221> misc_feat ure <222> (52).. (54) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (75) .. (75 ) <223> r é a ou g <400> 10 gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtg ctctgacttc 60 gtcaccaacc ggcar 75 <210 > 11 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u 126 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> r é a ou g <400> 11 gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtgct ctgacttcgt cgar 54 <210> 12 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_ feature <222> (3) . . (3) <223> n é a f C f g, t <220> <221> misc_ feature <222> (52) . . (54 ) <223> /repl ace ="tcc' /repl ace ="agc /repl ace ="tca /repl ace ="tcg /repl ace ="agt <220> <221> misc_ feature <222> (75) . . (75 ) <223> r é a ou g <400> 12 gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtg ctctgacttc 60 gtcaecaacc gggar 75 <210> 13 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial 127 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> r é a ou g <400> 13 gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtctt gcgacttcgt ccar 54 <210> 14 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (75). . (75) <223> r é a ou g 128 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <400> 14 gcncgggcgg agagcgacgà ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtc ttgcgacttc 60 gtcaccaacc ggcar 75 <210> 15 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <2 Λ O CM <221> misc_ feature <2 22> (3) . . (3) <2 23> n é a f c f g, t <2 ISO o V <2 21> misc_ feature <2 22> (37) . . (39 ) <2 23> /repl ace ="tcc' /repl ace ="agc /repl ace ="tca /repl ace ="tcg /repl ace ="agt <2 ISO o V <2 Λ \—1 CM misc_ feature <2 22> (54) . . (54 ) <2 23> r é a ou g <4 A O O 15 gcngacgagg cgcgccgctg ctacaacgac cccaagtctt gcgacttcgt cgar 54 <210> 16 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> SEQ ID No. 16:

Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u 129 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> /replace ="tcc' /replace ="agc /replace ="tca /replace ="tcg /replace ="agt <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> r é a ou g <400> 16 gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc tgctacaacg accccaagtc ttgcgacttc 60 gtcaccaacc gggar 75 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano <400> 17

Lys Cys Ser Asp Phe Vai Gin Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn 15 10 15

Asp Pro <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 18

Lys Cys 5er Asp Phe Vai Thr Asn Arg Gin Ala Arg Ala Glu Ser Asp 1 5 10 15

Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro 20 25 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial 130 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano <220> <221> VARIANTE <222> (7)..(7) <223> /replace ="DGlu" <400> 19

Lys Cys Ser Asp Phe Vai Glu Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn 15 10 15

Asp Pro <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /replace ="DGlu" <400> 20

Lys Cys Ser Asp Phe Vai Thr Asn Arg Glu Ala Arg Ala Glu Ser Asp 15 10 15

Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro 20 25 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano <400> 21

Lys Ser Cys Asp Phe Vai Gin Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn 15 10 15

Asp Pro 131 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <2 2 Ο > <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano

Asp Phe Vai Thr Asn Arg Gin Ala Arg Ala Glu Ser Asp 5 10 15 <400> 22 Lys Ser Cys 1

Arg Cys Tyr Asn Asp Pro 20 25

Glu Ala Arg <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (7)..(7) <223> /replace ="DGlu" <400> 23

Lys Ser Cys Asp Phe Vai Glu Ala Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn 1 5 10 15

Asp Pro <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /replace ="DGlu" 132 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <400> 24

Lys Ser Cys Asp Phe Vai Thr Asn Arg Glu Ala Arg Ala Glu Ser Asp 15 10 15

Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro 20 25 <210> 25 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <2 21 > misc_ feature <222> (7) · · (9) <223> /repl ace = "tcc' /repl ace = "age /repl ace = "tea /repl ace = "teg /repl ace = "agt <2 2 0 > <221> misc_ feature <222> (21) . • (21) <223> r é a ou g <2 2 0 > <221> misc_ feature <222> (24) . . (24) <223> n é a / C / g, t <400> 25 aagtgctctg acttcgtcca rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc 54 <210> 26 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (7) .. (9) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" 133

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> r é a ou g <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n é a, c, g, t ou u <400> 26 aagtgctctg acttcgtcaç caaccggcar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc 60 tgctacaacg acccc 75 <210> 27 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> r é a ou g <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n é a, c, g, t ou u <400> 27 aagtgctctg acttcgtcga rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc 54 <210> 28 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial 134 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> r é a ou g <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n é a, c, g, t ou u <400> 28 aagtgctctg acttcgtcac caaccgggar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc 60 tgctacaacg acccc 75 <210> 29 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> r é a ou g 135 ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> η é a, c, g, t ou u <400> 29 aagtcttgcg acttcgtcca rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc 54 <210> 30 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> mi sc _feature <222> (4) . - (6) <223> /replace ="tcc' /replace ="agc /replace ="tca /replace ="tcg /replace ="agt <220> <2 21 > mi sc. _feature <222> (30) .. (30) <223> r é a ou g <220> <2 21 > misc. _feature <222> (33) .. (33) <223> n é a, c, g, t <400> 30 ou u aagtcttgcg acttcgtcac caaccggcar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc 60 .tgctacaacg acccc 75 <210> 31 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano 136 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <221> misc_ feature <222> (4) . . (6) <223> /repl ace =" tcc' /repl ace =" age /repl ace =" tea /repl ace =" teg /repl ace =" agt <220> <221> misc_ feature <222> (21) . - (21) <223> r é a ou g <220> <221> misc_ feature <222> (24) . . (24) <223> n é a r g- / t <400> 31 aagtcttgcg acttcgtcga rgcngacgag gcgcgccgct gctacaacga cccc 54 <210> 32 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_ f eat ure <222> (4) . . (6) <223> /repl ace ="tcc' /repl ace ="agc /repl ace ="tca /repl ace ="tcg /repl ace ="agt <220> <2 21 > misc_ feature <222> (30) . . (30 ) <223> r é a ou g <220> — <2 21 > misc_ feature <222> (33) . . (33 ) <223> n é a f C r g, t <400> 32 aagtcttgcg acttcgtcac caaccgggar gcncgggcgg agagcgacga ggcgcgccgc 60 75 tgctacaacg acccc 137

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <2 2 Ο > <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 33

Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Vai 1 5 .10 15 · <210> 34 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 34

Arg Ala .Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys 15 10 15

Cys Asp Phe Vai Thr Asn Arg 20 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 35

Asp Glu Ala Arg Arg 1 -5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 36

Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg 1 5 138

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <210> 37 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <2 2 Ο > <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 37 Asp Phe Vai 1 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 38

Asp Phe Vai Thr Asn Arg 1 5 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> (16)..(16) <223> /replace ="DGlu" /replace ="Glu" <400> 39

Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Ser Asp Phe Vai Tyr Glx 15 10 15 <210 > 40 <211 > 477 <212> PRT <213> Homo 139 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <400> 40

Met Gly Ala Gly Vai Leu Vai Leu 1 5

Gly Ala Ser Glu Pro Gly Asn Leu 10 15

Ser Ser Ala Ala Pro Leu Pro Asp 20

Gly Ala Ala Thr Ala Ala Arg Leu 25 30

Leu Vai Pro Ala Ser Pro Pro Ala 35 40

Ser Leu Leu Pro Pro Ala Ser Glu 45

Ser Pro Glu Pro Leu Ser Gin Gin 50 55

Trp Thr Ala Gly Met Gly Leu Leu 60

Met Ala Leu Ile Vai Leu Leu Ile 65. 70

Vai Ala Gly Asn Vai Leu Vai Ile 75 80

Vai Ala Ile Ala Lys Thr Pro Arg 85

Leu Gin Thr Leu Thr Asn Leu Phe 90 95

Ile Met Ser Leu Ala Ser Ala Asp 100

Leu Vai Met Gly Leu Leu Vai Vai 105 110

Pro Phe Gly Ala Thr Ile Vai Vai 115 120

Trp Gly Arg Trp Glu tyr Gly Ser 125

Phe Phe Cys Glu Leu Trp Thr Ser 130 ‘ 135

Vai Asp Vai Leu Cys Vai Thr Ala 140

Ser Ile Glu Thr Leu Cys Vai Ile 145 150

Ala Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile 155 160

Thr Ser Pro Phe Arg Tyr Gin Ser 165

Leu Leu Thr Arg Ala Arg Ala Arg 170 175

Gly Leu Vai Cys Thr Vai Trp Ala 180

Ile Ser Ala Leu Vai Ser Phe Leu 185 190

Pro Ile Leu Met His Trp Trp Arg 195 200

Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg 205

Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys 210 215

Asp Phe Vai Thr Asn Arg Ala Tyr 220

Ala Ile Ala Ser Ser Vai Vai Ser 225 230

Phe Tyr Vai Pro Leu Cys Ile Met 235 240

Ala Phe Vai Tyr Leu Arg Vai Phe 245

Arg Glu Ala Gin Lys Gin Vai Lys 250 255

Lys Ile Asp Ser Cys Glu Arg Arg 260 ..... ....

Phe Leu Gly Gly Pro Ala Arg Pro 265 270 140

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT

Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Vai Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Gly 275 280 285

Pro Pro Arg Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Pro Leu Ala Asn Gly 290 295 300

Arg Ala Gly Lys Arg Arg Pro Ser Arg Leu Vai Ala Leu Arg Glu Gin 305 310 315 320

Lys Ala Leu Lys Thr Leu Gly lie Ile Met Gly Vai Phe Thr Leu Cys 325 330 335

Trp Leu Pro Phe Phe Leu Ala Asn Vai Vai Lys Ala Phe His Arg Glu 340 345 350

Leu Vai Pro Asp Arg Leu Phe Vai Phe Phe Asn Trp Leu Gly Tyr Ala 355 360 365

Asn Ser Ala Phe Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg 370 375 380

Lys Ala Phe Gin Gly Leu Leu Cys Cys Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg 385 390 395 400

Arg His Ala Thr His Gly Asp Arg Pro Arg Ala Ser Gly Cys Leu Ala 405 410 415

Arg Pro Gly Pro Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ala Ser Asp Asp Asp Asp 420 425 430

Asp Asp Vai Vai Gly Ala Thr Pro Pro Ala Arg Leu Leu Glu Pro Trp 435 440 445

Ala Gly Cys Asn Gly Gly Ala Ala Ala Asp Ser Asp Ser Ser Leu Asp 450 455 460

Glu. Pro Cys Arg Pro Gly Phe Ala Ser Glu Ser Lys Vai 465 470 475 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epítopo ECII de betal-AR humano 141 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <400> 41

Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys 15 10 15

Ser Asp Phe Vai Thr Gly 20 <210> 42 <211> 66 <212> ADN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n é a, c, g, t ou u <400> 42 cgggcggaga gcgacgaggc gcgccgctgc tacaacgacc ccaaçtgctc tgacttcgtc 60 accggn 66 <210> 43 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homólogo de sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 43

Lys Cys Ser Asp Phe Vai Thr Gly Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg 15 10 15

Arg Cys Tyr Asn Asp Pro 20 <210> 44 <211> 66 <212> ADN <213> Artificial 142 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n é a, c, g, t ou u <400> 44 aagtgctctg acttcgtcac cggncgggcg gagagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac 60 gacccc 66 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII (contendo parte) de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 45

Asp Xaa Xaa Arg Arg Cys Xaa Asn Asp Pro lys 1 5 10 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII (contendo parte) de betal-AR humano 143 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 46

Glu Ser Asp Xaa Xaa Arg Arg Cys Xaa Asn Asp Pro Lys 1 . 5 10 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 47

Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg 1 5 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos de um epitopo ECII de betal-AR humano <400> 48 Asp Phe Vai Thr 1 <210> 49 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u 144 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> r é a ou g <400> 49 gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt gctctgactt cgtccar 57 <210> 50 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> r é a ou g <400> 50 gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt gctctgactt cgtcgar 57 <210> 51 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial 145 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epítopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g, t ou u <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> r é a ou g <400> 51 gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt cttgcgactt cgtccar 57 <210> 52 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <2 21 > misc_feature <222> (3) . . (3) <223> n é a, c, g, t ou <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42 ) <223> /replace =" t c c " /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <220> <2 21 > misc_feature <222> (57) .. (57 ) <223> r é a ou g 146 ΕΡ 2 197 900/ΡΤ <400> 52 gcnagcgacg aggcgcgccg ctgctacaac gaccccaagt cttgcgactt cgtcgar 57 <210> 53 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> r é a ou g <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n é a, c, g, t ou u <400> 53 aagtgctctg acttcgtcca rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc 57 <210> 54 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" 147

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <2 20 > <2 21 > misc _feature <2 22 > (21) . . (21) <2 23 > r é a ou g <2 20 > <2 21 > misc _feature <2 22 > (24) . . (24) <2 23 > n é a, c, g, <4 00 > 54 aagtgctctg acttcgtcga rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc 57 <210> 55 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano <220> <221> misc_ feature <222> (4) . . (6) <223> /repl ace ="tcc' /repl ace ="agc /repl ace ="tca /repl ace ="tcg /repl ace ="agt <220> <221> misc_ feature <222> (21) . . (21 ) <223> r é a ou g <220> <221> misc_ feature <222> (24) . . (24 ) <223> n é a r g, t <400> 55 aagtcttgcg acttcgtcca rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc 57 <210> 56 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos homóloga a um epitopo ECII de betal-AR humano 148

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> /replace ="tcc" /replace ="agc" /replace ="tca" /replace ="tcg" /replace ="agt" <2 20 > <2 21 > mi s c_feature <2 22 > (2 1 ) · · (21) <2 23 > r é a ou g <2 20 > <2 21 > mi s c_feature <2 22 > (2 4 )··(24) <2 23 > n é a, c, g, <4 00 > 56 t ou u 57 aagtcttgcg acttcgtcga rgcnagcgac gaggcgcgcc gctgctacaa cgacccc

Lisboa, 2012-10-16

Claims

ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido cíclico de fórmula I: ciclo(x-Xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-x) (I), em que a) x é um aminoácido diferente de Cys; b) h é qualquer número inteiro de 1 a 15; c) i é qualquer número inteiro de 0 a 14; d) xc é Pro; e) y é um aminoácido diferente de Cys e em que o referido péptido cíclico consiste de pelo menos 16 e no máximo de 25 aminoácidos e compreende a parte de aminoácidos Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 45); ou Glu-Ser-Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 46), em que Χχχι, ΧΧΧ3 e Xxx4 é um aminoácido diferente de Cys e em que o referido péptido cíclico i) é capaz de reduzir uma activação mediada por anticorpo de receptor adrenérgico β4 (βι-AR) ii) é capaz de ligar (auto)anticorpos contra extracelular (ECn) de βι-AR; e/ou a segunda ansa iii) é capaz de inibir (auto)anticorpos contra a interacçao entre βι-AR e ECn de βι-AR.
2. Péptido cíclico da reivindicação 1, em que y é seleccionado individual e independentemente consiste de aminoácidos polares. do grupo que
3. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que y é Ser ou um análogo de Ser. ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT 2/7
4. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que h é 5, 8 ou 9 e/ou em que i é 3, 4 ou 6.
5. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo um péptido cíclico de fórmula I' ou I'' ciclo (xi-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-x1-x) (I') ciclo (xm-Xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-X1-x) (I" ) , em que Xi é Ala, Gly, Vai, Thr ou Ser e xm é Arg.
6. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo um péptido cíclico de fórmula I''' ou 1'''': ciclo (xi-Xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xII) (I' ' ' ) ciclo (xni-Xh_Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xIV) em que Xn é Gin, Glu, Asp ou Asn e χϊν é Gly ou um análogo de Gly.
7. Péptido cíclico da reivindicação 5 ou 6, em que Xi é Ala.
8. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que Xu é Gin ou Glu.
9. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que y não é Pro e/ou x excepto xc não é Pro.
10. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 sendo um péptido cíclico de fórmula II, III ou III' : ciclo (Xi-x-Xi-x-x-x-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xII) (II) ; ciclo (xi-X2~x-xi-x-x-Xi-x-x-x-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-Xi-xn) (III); ciclo (xin-x-xi-x-x_xi-x-x-x-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-Xi-Xiv) (III' ) , em que ΕΡ 2 197 900/ΡΤ 3/7 a) χι ou Χχχι é seleccionado individual e independentemente do grupo que consiste de aminoácidos ácidos; e/ou b) X2 é seleccionado individual e independentemente do grupo que consiste de aminoácidos básicos.
11. Péptido ciclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 sendo um péptido ciclico de fórmula IV, V ou V': ciclo (xi-x-Xi-X4-x-x-Cys-X3-x-x-xc-x-Cys-y-x1-x3-x3-xII) (IV) ; ciclo (xi-X2-X4-Xi-X4-x-Xi-X4-x-x-Cys-x3-x-x-xc-x-Cys-y-xi-x3-x3- X4-X5-X2-X11) (V) ; ciclo (xni-x4-xi-x4-x-xi-x4-x-x-cys-x3-x-x-xc-x-cys-y-xi-x3-x3-x4- Χιν (V' ) , em que a) xi ou Xxxi é seleccionado individual e independentemente do grupo que consiste de aminoácidos ácidos; b) X2 é seleccionado individual e independentemente do grupo que consiste de aminoácidos básicos; c) x3 ou Xxx3 é seleccionado individual e independentemente do grupo que consiste de Leu, Ile, Vai, Met, Trp, Tyr e Phe; e/ou d) X4 ou Xxx4 é seleccionado individual e independentemente do grupo que consiste de Ser, Thr, Ala e Gly.
12. Péptido ciclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, compreendendo a parte de aminoácidos Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys; ou Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys.
13. Péptido ciclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 sendo um péptido ciclico seleccionado do grupo que consiste de: a) péptido ciclico formável ou formado pela sequência de aminoácidos tal como representada por qualquer uma de SEQ ID NO. 41, 43, 1 a 4 e 17 a 20; ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT 4/7 b) péptido cíclico formável ou formado por uma sequência de aminoácidos tal como codificada por uma sequência de nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 42, 44, 9 a 12, 25 a 28, 49, 50, 53 e 54; c) péptido cíclico formável ou formado por uma sequência de aminoácidos tal como codificada por uma sequência de nucleótidos que difere da sequência de nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 42, 44, 9 a 12, 25 a 28, 49, 50, 53 e 54 devido à degenerescência do código genético; e d) péptido cíclico de qualquer uma das fórmula VI a IX': cicio(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe- Val-Thr-Gly) (IX') ciclo(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe- Val-Gln) (VI); ciclo (Ala- Arg-Ala-GIu-Ser-Asp-Glu-Ala- Arg- Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp- Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln) (VII); ciclo(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe- Val-DGlu) (VIII); ciclo )(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp- Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu) (IX).
14. Péptido cíclico da reivindicação 13, em que pelo menos um dos aminoácidos ácidos é substituído por um aminoácido diferente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos ácidos.
15. Péptido cíclico da reivindicação 13 ou 14, em que pelo menos um dos aminoácidos básicos é substituído por um aminoácido diferente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos básicos.
16. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos ΕΡ 2 197 900/ΡΤ 5/7 alifáticos é substituído por um aminoácido diferente seleccionado do grupo que consiste de aminoácidos alifáticos.
17. Método para produzir um péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 16, compreendendo as etapas de a) (i) cultura de uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica o esqueleto de aminoácidos do péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou um vector compreendendo a referida molécula de ácido nucleico, em condições tais que o esqueleto de aminoácidos do polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 seja expresso e recuperação do referido esqueleto de aminoácido; ou (ii) síntese química do esqueleto de aminoácidos do polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 16; e b) ciclização do referido esqueleto de aminoácidos para formar o péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Método da reivindicação 17, em que a referida sequência de nucleótidos é uma sequência de nucleótidos tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO. 9 a 12, 25 a 28, 42 e 44 ou uma sequência de nucleótidos que difere destas devido à degenerescência do código genético.
19. Composição compreendendo um péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e opcionalmente um transportador.
20. Composição da reivindicação 19, em que a referida composição é uma composição farmacêutica e o referido transportador é um transportador farmaceuticamente aceitável.
21. Péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 20 e opcionalmente um transportador farmaceuticamente aceitável, para utilização em ΕΡ 2 197 900/ΡΤ 6/7 a) tratamento, melhoria ou prevenção de uma doença em que a actividade de um β-AR é melhorada; b) tratamento de um doente que tem anticorpos contra um β-AR; ou c) indução de tolerância imunitária.
22. Péptido cíclico ou composição farmacêutica da reivindicação 21, em que a referida doença em que a actividade de um receptor adrenérgico β é melhorada é uma doença cardíaca ou em que o referido doente sofre de uma doença cardíaca.
23. Péptido cíclico ou composição farmacêutica da reivindicação 22, em que a referida doença cardíaca é seleccionada do grupo que consiste de doença cardíaca infecciosa e não infecciosa, doença cardíaca isquémica e não isquémica, doença cardíaca inflamatória e miocardite, dilatação cardíaca, cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia dilatada (idiopática) (DCM), cardiomiopatia imunitária, insuficiência cardíaca e qualquer arritmia cardíaca incluindo sístoles ventriculares e/ou supraventriculares prematuras, bem como qualquer arritmia auricular incluindo fibrilação auricular e ou "flutter" auricular.
24. Péptido cíclico ou composição farmacêutica da reivindicação 22 ou 23, em que a referida doença cardíaca é DCM (idiopática).
25. Péptido cíclico ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 21 a 24, em que a referida doença é induzida por anticorpos contra um β-AR.
26. Péptido cíclico ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 21 a 25, em que o referido péptido cíclico ou a referida composição farmacêutica é administrada de modo a atingir pelo menos 0,05 mg do referido péptido cíclico por kg de peso corporal.
27. Método para detectar anticorpos contra um β-AR (numa amostra) compreendendo a etapa de pôr em contacto o péptido cíclico de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 com os referidos anticorpos a detectar. ΕΡ 2 197 9 Ο Ο/PT 7/7
28. Péptido cíclico, composição farmacêutica ou método de qualquer uma das reivindicações 21 a 27, em que o referida β-AR é βι-AR. Lisboa, 2012-10-16