PT2201376E - Um novo biomarcador para monitorizar o desenvolvimento de doenças e avaliar a eficácia de tratamentos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UM NOVO BIOMARCADOR PARA MONITORIZAR O DESENVOLVIMENTO DE DOENÇAS E AVALIAR A EFICÁCIA DE TRATAMENTOS"

ÂMBITO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com o uso de CD73 em fluidos teciduais como um biomarcador para monitorizar o desenvolvimento de doenças. Também são descritos métodos para determinar a proteína CD73 num fluido tecidual.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As publicações e outros materiais aqui usados para ilustrar os antecedentes da invenção, e em particular, casos para fornecer pormenores adicionais no que respeita à prática, são incorporados como referência. A CD73 é uma enzima da superfície de células que tem atividade de 5'-ectonucleotidase. Deste modo, medeia a conversão de nucleótidos de purina monofosforilados em nucleósidos correspondentes. Por exemplo, a desfosforilação de AMP em adenosina é catalisada pela CD73. A CD73 está também presente como uma forma solúvel no plasma e a enzima solúvel tem a mesma atividade enzimática que a forma ligada à membrana. A adenosina é um dos reguladores fisiológicos da permeabilidade das células endoteliais [1, 2], e pode portanto estar envolvida na patogénese de muitos distúrbios como lesão pulmonar aguda, síndrome da resposta inflamatória sistémica, síndrome de insuficiência respiratória, enjoo a alta altitude. Alterações na permeabilidade endotelial também ocorrem em inflamação, em traumas e cancro. A CD73 controla a permeabilidade 2 endotelial por via de um mecanismo mediado por adenosina em condições normais, hipoxia e lesão pulmonar induzida por ventilador [3-7]. A CD73 é induzida por certas citoquinas. De modo mais importante, foi relatado que o interferão alfa e beta aumentam a expressão e atividade da CD73 em humanos (8, WO 2004/084933, 11). Estas citoquinas são também usadas clinicamente para tratar doenças diferentes. O interferão alfa, por exemplo, é usado para tratar certas infeções e malignidades tais como hepatite e tricoleucemia. O interferão beta, por outro lado, é amplamente usado para diminuir a inflamação na esclerose múltipla. No entanto, em muitos casos a resposta benéfica ao tratamento com interferão só é vista numa subpopulação de doentes, e também os doentes que inicialmente respondem podem mais tarde tornar-se refratários ao tratamento. Assim, há a necessidade de desenvolver biomarcadores facilmente mensuráveis que refletem a responsividade biológica do organismo ao tratamento. A publicação da patente WO 2004/084933 divulga o uso de citoquinas para induzir a expressão endotelial de CD73 e elevando subsequentemente o nivel de adenosina num indivíduo. É descrito o uso de interferão beta em combinação com adenosina monofosfato (AMP) no tratamento da falência de múltiplos órgãos em ratazanas. A publicação da patente WO 2007/042602 descreve o uso de interferão beta simples para tratamento ou prevenção da lesão de isquémia e reperfusão ou falência de múltiplos órgãos. 3

Estatinas, agentes hipolipidémicos usados para baixar o nível de colesterol, são conhecidas por induzirem a expressão de CD73 nos doentes.

Também conhecido é o uso de CD7 3 como um marcador de inflamação geral e local em artrite reumatoide [12].

No entanto, não há divulgação na técnica anterior em relação à medição da proteína CD73 no soro ou qualquer outro fluido tecidual para uso como um biomarcador para monitorizar o desenvolvimento de doenças ou para avaliação da eficácia dos tratamentos.

RESUMO DA INVENÇÃO Nós mostrámos que a medição da atividade da CD73 solúvel pode ser usada para monitorizar a gravidade da doença e responsividade ao tratamento. Portanto, acreditamos que a análise do nível de expressão da CD73 ou atividade por qualquer técnica pode fornecer informação valiosa acerca do curso de uma doença ou resposta a tratamento. A presente invenção relaciona-se com um método para monitorizar o desenvolvimento de uma doença num doente, em que a referida doença é selecionada a partir do grupo que consiste em a) trauma tecidual, b) uma lesão de reperfusão resultante de enfarte do miocárdio ou ataque cardíaco, transplantes de órgãos ou outra operação cirúrgica, c) cancro ou metástases de cancro, e d) uma doença inflamatória, e em que a CD73 num fluido tecidual recolhido do referido doente é usada como um biomarcador, em que o método é repetido em dois ou mais pontos de tempo e um nível alterado de CD73 na amostra, comparado com um ensaio 4 anterior, é usado para indicar a progressão da doença, ou para indicar regressão da doença, em que um nivel crescente de CD73 indica regressão da doença e um nivel decrescente de CD73 indica progressão da doença.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. A lesão de isquémia e reperfusão do intestino induz danos teciduais primários e secundários. A artéria mesentérica foi oclodida durante 30 minutos e depois deixada para reperfusão durante 4 h. Micrografias representativas do intestino (A) e pulmões (B) de ratos de tipo selvagem após operação simulada (apenas laparotomia) e após indução da lesão IR.

Figura 2. A atividade de CD73/5'NT no pulmão relaciona-se inversamente com a atividade da doença. Ratos CD73/5'NT_/“ e os animais da mesma ninhada de tipo selvagem (WT) foram submetidos a uma operação simulada (simulação) ou 30 minutos de isquémia intestinal seguido de 240 minutos de reperfusão (ALI). Em grupos adicionais, os animais expostos a ALI foram pré-tratados com IFN-β. (A) Atividade de CD73/5'NT no pulmão (média+EPM, nmL de AMP hidrolisada por miligrama de proteína por hora) medida a partir de lisados de tecido por TLC. (B) Análises semiquantitativas de fuga vascular (exsudação de dextrano conjugado com FITC) nos pulmões como medido a partir de secções histológicas usando análise de imagem (% de área de secção exibindo fluorescência acima de um valor escolhido arbitrariamente, médiaiEPM). Micrografias representativas dos grupos indicados são também mostradas. Bar, 50 μπι. * p<0,05, ** p<0,01.

Figura 3. A atividade de CD73/5'NT em doentes de SIRS que sofrem de pancreatite. A figura mostra a atividade de 5 CD73/5'NT versus ο grau de gravidade da pancreatite: 0 = pancreatite ligeira; 1 = pancreatite grave sem falência de órgãos; 2 = pancreatite grave com falência de órgãos; 3 = controlo saudável.

Figura 4. Atividade de CD73/5'NT versus estadia total na unidade de cuidados intensivos (UCI) para doentes com todos os graus de pancreatite.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Definições e formas de realização preferíveis: 0 termo "doente" ou "indivíduo" refere-se a um indivíduo humano ou animal. 0 termo "monitorizar o desenvolvimento de uma doença" significa que a progressão da doença (i.e. agravamento da doença) ou a regressão da doença (i.e. a recuperação de um doente) pode ser feita comparando um nível mensurável do biomarcador em relação a um controlo ou a uma ou mais medições anteriores, realizado em diferentes pontos no tempo, do nivel do biomarcador no mesmo doente. Por exemplo, um nivel decrescente do biomarcador, comparado com o resultado de uma medição anterior ou com um controlo, pode ser usado para indicar a progressão da doença, enquanto que um aumento no nível do biomarcador, comparado com o resultado de uma medição anterior ou com um controlo é usado para indicar a regressão da doença. No entanto, há provavelmente certas doenças que afetam o nível do biomarcador de modo contrário. 0 termo "fluido tecidual" deve ser entendido para incluir qualquer fluido que banha e rodeia as células. 0 termo 6 inclui, por exemplo, plasma sanguíneo, soro, linfa, urina, exsudados (pleural, peritoneal) e fluido cérebro-espinal. 0 termo "doença inflamatória" pretende-se que inclua qualquer resposta inflamatória prejudicial ou indesejada num tecido num individuo, em que a referida doença inflamatória possa resultar numa condição aguda tal como trauma tecidual, uma lesão de reperfusão resultante de enfarte do miocárdio ou ataque cardiaco, transplantes de órgãos ou outra operação cirúrgica, ou de uma doença crónica incluindo doenças alérgicas, doenças autoimunes, e doenças inflamatórias.

Doenças cujo desenvolvimento pode ser monitorizado usando a proteína CD73 no fluido tecidual são tipicamente selecionadas a partir do grupo que consiste em a) trauma tecidual b) uma lesão de reperfusão resultante de enfarte do miocárdio ou ataque cardíaco, transplantes de órgãos ou qualquer outra operação cirúrgica, c) cancro ou metástases de cancro, e d) uma doença inflamatória.

Doenças típicas que conduzem a uma alteração dos níveis de CD73 dos doentes nos fluidos teciduais, especialmente no soro são: trauma tecidual, lesões de reperfusão resultantes de enfarte do miocárdio ou ataque cardíaco, transplantes de órgãos ou outras operações cirúrgicas; cancro ou metástases de cancro; ou doenças inflamatórias resultantes dos traumas mencionados acima ou de lesões de reperfusão ou de doenças crónicas incluindo doenças alérgicas, doenças autoimunes, e doenças inflamatórias. Como exemplos de tais doenças crónicas podem ser mencionadas artrite, doenças alérgicas tais como asma, doenças inflamatórias tais como doença inflamatória intestinal ou uma doença inflamatória da pele, 7 psoríase, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doenças autoimunes, diabetes de tipo I ou de tipo II, aterosclerose, esclerose múltipla, doença de Crohn, ou reações de rejeição devidas a transplantes de órgãos. Particularmente, as doenças inflamatórias como sindrome da resposta inflamatória sistémica (SIRS), lesão pulmonar aguda (ALI), falência de múltiplos órgãos (MOF), lesão de isquémia e reperfusão (IRI) e reação adversa a medicamentos (ADRS) vão conduzir a alterações da proteína CD73 no fluido tecidual. 0 termo "citoquina" inclui qualquer proteína ou péptido usado em organismos como compostos de sinalização. Em particular, este termo refere-se a um interferão ou a uma interleucina, mas não está restrito a isso. No caso de a citoquina ser um interferão, o interferão pode ser alfa, beta, gama, ómega, ou qualquer outro interferão e pode ser de qualquer subtipo dos interferões mencionados acima. Os interferões são usados no tratamento das doenças mencionadas anteriormente. Como exemplos de interleucinas podem ser mencionadas a IL-4, IL-10, IL-13 e IL-20.

As "estatinas" formam uma classe de agentes hipolipidémicos usados para baixar os níveis de colesterol em indivíduos, particularmente para reduzir o risco de doenças cardiovasculares. Também doenças inflamatórias, demência, cancro, catarata nuclear e hipertensão pulmonar podem responder ao tratamento com estatinas. A determinação da proteína CD73 numa amostra recolhida do fluido tecidual de um indivíduo pode ser realizada por imunodeteção para quantificar o nível da proteína CD73 na referida amostra sujeitando a amostra a um ligante que reconhece a proteína CD73, e quantificando esse ligante. 8

Alternativamente, a deteção pode ser realizada detetando a atividade da proteina CD73 na referida amostra usando cromatografia de camada fina ou sujeitando a referida amostra a um substrato de CD73, e monitorizando a alteração no referido substrato. 0 termo "ligante" deve ser entendido como incluindo anticorpos, que podem ser monoclonais ou policlonais ou geneticamente modificados; quaisquer fragmentos de anticorpo; aptâmeros e "affibodies", e qualquer outro ligante capaz de se ligar a um epitopo na proteína CD73. Anticorpos de CD73 são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, http;//www.biocompare.eom/matrixsc/3194/6/67151/CD73.html. "Affibodies" representam um novo tipo de ligantes, proteínas pequenas e especialmente estáveis, desenvolvidas por Affibody Ab. 0 ensaio de ligação pode ser competitivo ou não-competitivo. Um ensaio preferível é um ensaio de sandwich em que um anticorpo de captura (ou outro tipo de ligante) imobilizado num suporte sólido, é sujeito a uma amostra compreendendo o antigénio, que se liga a um primeiro epitopo do anticorpo de captura e adicionando um anticorpo marcado (ou outro tipo de ligantes), direcionado para outro epitopo do antigénio. 0 anticorpo marcado é quantificado diretamente (ensaio homogéneo) ou após separação de anticorpos marcados não imobilizados. 0 marcador pode ser um isótopo radioativo, um corante fluorescente, uma enzima ou qualquer outro marcador detetável.

Por exemplo, para fins de imunodeteção, qualquer anticorpo específico anti-CD73 pode ser usado para capturar CD73 solúvel da amostra, e depois a quantidade de proteína ligada pode ser quantificada usando uma variedade de 9 técnicas. Por exemplo, um ELISA de sandwich pode ser empregue no qual um anticorpo anti-CD73 é imobilizado no fundo das placas de multi-poços, a amostra é adicionada, e a CD73 ligada é detetada usando outro anticorpo anti-CD73. 0 anticorpo anti-CD73 é depois detetado usando qualquer uma das múltiplas técnicas adequadas para deteção de anticorpos, tais como anticorpos de segundo estádio marcados. A especificidade da CF73 da reação é controlada incluindo um anticorpo irrelevante como anticorpo de captura ou deteção e comparando os sinais entre estes controlos negativos e os anticorpos anti-CD73.

Determinação da atividade da CD73: A atividade da CD73 pode ser medida usando cromatografia de camada fina de acordo com protocolos publicados. A atividade da CD73 pode também ser medida usando qualquer ensaio enzimático que meça a conversão de AMP, ou outro mononucleótido de purina que possa ser usado como um substrato de CD73, no nucleósido correspondente. Por exemplo, o ensaio pode também ser baseado na conversão de substratos marcados radioativamente ou com fluorescência. Métodos de deteção podem depender da quantificação da diminuição da concentração de um substrato, ou um aumento na concentração do produto ou da libertação do grupo fosfato. A dependência da CD73 da reação pode ser determinada realizando um ensaio na presença e na ausência de um inibidor conhecido da CD73, tal como AMPCP.

Substratos adequados para CD73 são, por exemplo, nucleósido-5'-monofosfatos incluindo adenosina-5'- monofosfato (AMP) inosina-5'-monofosfato (IMP) e semelhantes. A invenção será ilustrada pela seguinte Secção Experimental não restritiva. 10

SECÇÃO EXPERIMENTAL

Materiais e métodos Modelo ALI e fuga vascular

Foram usados ratos CF73_/~, que foram retrocruzados com antecedentes C57BL/6 durante 8 gerações, e ratos C57BL/6 de tipo selvagem (WT) . Eles não possuem mARN, proteína e atividade enzimática de CD73 [3]. Os animais tinham peso, sexo e idade correspondentes. Todos os ratos tiveram acesso a ração de rato padrão e água até à experiência.

Os ratos foram anestesiados com hidrocloreto de ketamina (100 mg/kg de peso corporal, i.p) e xilazina (10 mg/kg de peso corporal, i.p). Durante a anestesia, os ratos foram ventilados espontaneamente com ar normal. Antes da cirurgia, os animais receberam 1 mL de soro fisiológico estéril por via subcutânea para compensar as perdas de fluidos per-operatórias. A artéria mesentérica superior foi dissecada por via de laparotomia da linha média e ocludida por pinça microvascular durante 30 minutos. Animais de simulação foram submetidos a disseção da artéria mesentérica superior sem oclusão vascular. A ferida foi suturada numa camada. A temperatura corporal dos animais foi mantida ao longo da fase de isquémia com uma lâmpada de aquecimento. Depois da isquémia, a pinça microvascular foi libertada, a ferida suturada e os animais receberam 1 mL adicional de soro por via subcutânea. Após 235 minutos de reperfusão, os ratos receberam dextrano conjugado com FITC (25 mg/kg de peso corporal em 0,2 mL de soro fisiológico estéril; p.m. 70 000 D, Molecular Probes) . Os ratos foram sacrificados após 240 minutos de reperfusão e as amostras de tecido foram recolhidas. 11 0 protocolo de 30 min de isquémia-240 min de reperfusão é um modelo ALI estabelecido e reprodutível [9]. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética Animal da Universidade de Turku (permissão n° 1597/05 para Sirpa Jalkanen). O efeito do INF-β na atividade de CD73 e permeabilidade foi estudado usando protocolos pré e pós-tratamento. Subgrupos de ratos foram pré-tratados com INF-β de rato recombinante (6000 UI s.c. uma vez por dia durante 3 dias antes da isquémia). No grupo pós-tratamento, os animais receberam um único bolus de INF-β (20 000 UI) por via intravenosa depois da fase de isquémia no início do período de reperfusão.

Todos os ratos foram injetados i.v. com dextrano conjugado com FITC (70 kDa) 5 minutos antes da eutanásia. A fuga vascular foi determinada a partir de três imagens a cores tiradas de campos escolhidos aleatoriamente dos pulmões criosseccionados usando análise de imagem computacional (Imagem J).

Análises da atividade da CD73 A atividade da ecto-5'-nucleotidase foi analisada por TLC, como descrito anteriormente [10]. Em resumo, o ensaio de enzima padrão contida num volume final de 120 μύ de RPMI 1640, lisado de pulmão, 5 mmol/L de β-glicerofosfato, e as concentrações indicadas de AMP com um marcador [2-3H]AMP (sp. act., 18,6 Ci/mmol; Amersham, Little Chalfont, Reino Unido). Os tempos de incubação foram escolhidos para assegurar a linearidade da reação ao longo do tempo, de modo a que a quantidade de AMP convertido não excedeu 7-10% do substrato introduzido inicialmente. Alíquotas da mistura foram aplicadas a folhas de TLC G/UV254 SIL Alugram (Macharey-Nagel, Diiren, Alemanha) e separadas com isobutano1/álcool isoamílico/2-etoxietanol/amónia/H20 12 (9:6:18:9:15) como solvente. AMP marcado com 3H e os seus nucleósidos desfosforilados derivados foram visualizados em luz UV e quantificados usando um espetrofotómetro 1490β Wallac. A atividade da CD73 foi expressa em nM de AMP hidrolisado por miligrama de proteina por hora. A concentração de proteina nos lisados foi determinada por Kit de Ensaio de Proteina BCA (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaios estatísticos

Foi usada ANOVA não paramétrica com um fator (Kruskall-Wallis e testes U de Mann-Whitney).

Resultados

Atividade de CD73 relaciona-se com a atividade da doença

Isquémia-reperfusão (IR) intestinal causou acentuada lesão tecidual tanto nos intestinos como nos pulmões (Fig. 1) . Nos pulmões dos ratos de tipo selvagem com operação de simulação, a atividade da CD73 foi baixa (Fig. 2A) . As análises de microscópio de FITC-dextrano nos pulmões mostraram que só ocorreram fugas mínimas nos ratos de tipo selvagem submetidos à operação de simulação (Fig. 2B).

Quando ALI foi induzido nos animais de tipo selvagem, a atividade da CD73 foi reduzida em 25%. Ao mesmo tempo, as fugas vasculares aumentaram significativamente. Alterações na permeabilidade vascular relacionam-se diretamente com a gravidade da doença, uma vez que a fuga dos fluidos intravasculares para o parênquima pulmonar e depois para os alvéolos é a principal causa para deterioração da função pulmonar e comprometimento das trocas gasosas. 13

Como esperado, a atividade da CD73 foi indetetável ou a níveis extremamente baixos em ratos deficientes em CD73 tanto após a operação de simulação como após IR intestinal. Nos ratos deficientes em CD73, a fuga nos animais com a operação de simulação foi ligeiramente aumentada quando comparada com os ratos de tipo selvagem com a operação de simulação. Notavelmente, quando ALI foi induzido, ratos deficientes em CD73 mostraram cerca de 80% mais de fugas nos pulmões do que os seus equivalentes de tipo selvagem (p=0,03).

Estes dados mostram que existe uma correlação inversa entre a atividade de CD73 e a permeabilidade vascular, uma medida da gravidade da doença. A atividade de CD73 está relacionada com a resposta ao tratamento O pré-tratamento com INF-β durante 3 dias (numa dose usada clinicamente no tratamento de esclerose múltipla) conduziu a um aumento de 230% na atividade da CD73 em pulmões de tipo selvagem durante ALI (p=0,002, Fig. 2A) . Mais notavelmente, a área de fuga nos ratos de tipo selvagem após a indução de ALI foi reduzida em mais de 90% após o pré-tratamento com INF-β quando comparado com os ratos equivalentes não tratados (p=0, 0001, Fig. 2B) . De facto, não foi diferente dos animais submetidos apenas à operação de simulação. Notavelmente, o INF-β também não teve efeitos protetores em ALI em ratos deficientes em CD73. Estes dados mostram que o tratamento com interferão beta diminui as fugas vasculares de um modo estritamente dependente de CD73. Para além disso, o aumento da atividade da CD73 em ratos de tipo selvagem pode ser usado para prever o resultado benéfico em resposta ao tratamento com INF-β. 14

Testámos depois se o tratamento com INF-β poderia reverter uma lesão capilar já estabelecida. Para esse fim, tratámos ratos com INF-β só depois do período de isquémia na altura da reperfusão. Notavelmente, a dose única de INF-β melhorou muito significativamente a função da barreira vascular durante o período seguinte de 4 h de reperfusão. A fuga de dextrano FITC foi reduzida em 90±9 % no grupo de pós-tratamento quando comparado com os controlos (n=8-13 ratos/grupo, p<0,001). Ao mesmo tempo, a medição da atividade da CD73 em amostras de soro aumentou em mais de 30% (desde 427122 no grupo ALI sem tratamento até 561148 no grupo ALI tratado com INF-β; p=0,04, n=4/grupo). Assim, a indução da atividade da CD73 está positivamente relacionada com uma resposta ao tratamento. Para além disso, medir a atividade da CD73 numa amostra de sangue pode produzir informação útil sobre a responsividade de INF-β. 15

REFERÊNCIAS 1 Hasko, G. e Cronstein, B. N. , Adenosine: an endogenous regulator of innate immunity. Trends Immunol. 2004. 25: 33-39. 2 Ohta, A. e Sitkovsky, M. , Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature 2001. 414: 916-920. 3 Thompson, L. F., Eltzschig, Η. K., Ibla, J. C, Van De

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Lisboa, 10 de Agosto de 2012

Claims (3)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para monitorizar o desenvolvimento de uma doença num doente, em que a referida doença é selecionada a partir do grupo que consiste em a) trauma tecidual b) uma lesão de reperfusão resultante de enfarte do miocárdio ou ataque cardíaco, transplantes de órgãos ou outra operação cirúrgica, c) cancro ou metástases de cancro, e d) uma doença inflamatória, e em que CD73 num fluido tecidual recolhido do referido doente é usada como um biomarcador, em que o método é repetido em dois ou mais pontos no tempo e o nível alterado de CD73 na amostra, comparado com um ensaio anterior, é usado para indicar a progressão da doença, ou para indicar a regressão da doença, em que um nível crescente de CD73 indica regressão da doença e um nível decrescente de CD73 indica progressão da doença.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a doença é uma doença inflamatória.

3. 0 método de acordo com a reivindicação 2 em que a doença inflamatória é síndrome da resposta inflamatória sistémica (SIRS), lesão pulmonar aguda (ALI), falência de múltiplos órgãos (MOF), lesão de isquémia e reperfusão (IRI) ou reação adversa a medicamentos (ADRS). Lisboa, 10 de Agosto de 2012