PT2247205E - Composição para a estabilização de um líquido aquoso alimentar sensível à oxidação - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO PARA A ESTABILIZAÇÃO DE UM LÍQUIDO AQUOSO ALIMENTAR SENSÍVEL À OXIDAÇÃO

Campo da invenção A presente invenção refere-se ao domínio da conservação dos líquido que podem ser alterados por fenómenos de oxidação. Técnica anterior

De modo geral, existe uma necessidade constante para a optimização de novos processos que permitem estabilizar os líquidos aquosos alimentares sensíveis à oxidação, com o objectivo de melhorar as suas condições de conservação ou para aumentar a sua duração de armazenamento.

Os inconvenientes associados à alteração das propriedades físico-químicas ou das propriedades organolépticas dos líquidos aquosos para a alimentação humana ou animal são conhecidos desde há muito tempo. Foram já descritas soluções que permitem ultrapassar tais inconvenientes no estado da técnica.

Os métodos conhecidos para reduzir ou bloquear a oxidação dos líquidos aquosos alimentares ao longo do tempo de conservação englobam: (i) os meios físicos, (ii) os meios que utilizam agentes químicos com propriedades antioxidantes e (iii) os meios que utilizam agentes biológicos, por exemplo microrganismos. 1

Entre os diferentes meios mecânicos, podem ser citados aqueles que permite a eliminação do oxigénio dissolvido em liquidos, tais como: - um processo de pressurização do liquido, de preferência um sumo de fruta, através da utilização de azoto gasoso, tal como descrito na patente JP2006141319; - um filme que absorve o oxigénio que é colocado à superfície do liquido a proteger, tal como descrito no pedido de patente JP6100044; - uma camada dupla de filmes para isolar o líquido a proteger, sendo a camada externa impermeável ao oxigénio e podendo a camada interna absorver o oxigénio, tal como descrito no pedido de patente JP5319459; - um processo de aplicação de uma camada de gás inerte mais denso que o ar compatível com alimentos à superfície de líquidos, especialmente de bebidas expostas ao oxigénio num recipiente aberto, tal como descrito no pedido de patente EP0134687.

Entre os métodos de tratamento químico utilizados para estabilizar contra a oxidação dos líquidos para destino alimentar, especialmente as bebidas fermentadas, mais particularmente os vinhos, a utilização de PVP (polivinilpirrolidona), de ácido ascórbico e/ou de sulfito (SO2) é praticada. Mas tais processos de estabilização química contra a oxidação são susceptíveis de serem fortemente regulamentados no futuro, e mesmo para alguns destes processos, proibidos.

Entre os meios biológicos, conhece-se a utilização de microrganismos tais como as bactérias de grãos de quefir como 2 aditivos antioxidantes, especialmente para bebidas, como descrito no pedido de patente EP1607476.

Consoante os tipos de líquidos aquosos alimentares, as reacções de oxidação das substâncias que estes líquidos contêm, ao longo do tempo de conservação, envolvem alterações de grau variável das suas propriedades físico-químicas ou organolépticas.

Entre os líquidos aquosos alimentares para os quais uma oxidação envolve alterações tornando-os impróprios para consumo, cita-se primeiramente os vinhos, e por ordem de importância o vinho branco.

As reacções de oxidação que ocorrem nos vinhos, em particular os vinhos brancos, os vinhos rosés e certos vinhos tintos, provocam uma perda de aromas varietais, um perfil organoléptico modificado e uma coloração castanha dos vinhos. Estas modificações indesejáveis são provocadas, pelo menos em parte, por reacções de oxidação.

Em particular, atribui-se o acastanhar dos vinhos brancos a reacções de polimerização oxidativas de certos polifenóis. Certos polifenóis, através da reacção com o oxigénio, são transformados em quinonas e semi-quinonas. Estes compostos muito reactivos complexam-se com outros compostos com função sulfanilo, tais como os tióis voláteis, para formar pigmentos castanhos. Esta complexação com as quinonas e as semi-quinonas destrói das propriedades aromáticas dos tióis voláteis. 3

Os vinhos brancos são elaborados com o objectivo de obter vinhos frutados, frescos, para consumir rapidamente, ou ainda vinhos de grau tipo "premium" envelhecidos durante vários anos . E essencial proteger os vinhos, em particular os vinhos brancos, da oxidação e do aparecimento da cor castanha que podem deteriorar o seu perfil organoléptico. Especialmente, a deterioração dos aromas e o aparecimento da cor castanha conferem um impacto organoléptico negativo que causa uma forte depreciação na venda, e em consequência uma perda económica significativa.

Desde o momento em que os vinhos brancos são acondicionados em diferentes recipientes, após a etapa de filtração que é realizada no final da fermentação, são expostos de modo continuo ao oxigénio do ar. Com efeito, o oxigénio é sequestrado com o vinho branco no momento do acondicionamento. Além disso, como os recipientes não são normalmente totalmente herméticos aos gases, o oxigénio penetra no recipiente na totalidade do período de conservação do vinho e do seu envelhecimento.

Foram consideradas várias soluções para prevenir o aparecimento da cor castanha e as alterações organolépticas que lhe estão associadas, devidas ao contacto do vinho com o oxigénio ao longo do tempo de conservação, tais como: - limitar a exposição ao oxigénio, - utilizar antioxidantes naturais ou de síntese, ou, - eliminar os polifenóis responsáveis pelo aparecimento da cor castanha. 4

No entanto, com as técnicas actuais utilizadas para acondicionar os líquidos aquosos para utilização alimentar, incluindo os vinhos, é muito difícil excluir totalmente qualquer contacto dos referidos vinhos com o oxigénio do ar durante o seu transporte até à unidade de acondicionamento.

Além disso, após o acondicionamento em garrafa de vidro, o oxigénio pode difundir-se através de uma rolha de cortiça ou provir do espaço de livre do topo da garrafa sob a rolha após o engarrafamento.

No caso do vinho, o contacto com o oxigénio do ar ocorre também para outros tipos de acondicionamento, tais como entre outros para vinho ou BIB® (para "Bag-In-Box"). Nos BIB®, o vinho é acondicionado sob vácuo numa bolsa de matéria plástica, sendo a referida bolsa em matéria plástica colocada no interior de uma embalagem de cartão. A bolsa de matéria plástica é fabricada num material que constitui uma barreira ao oxigénio na sua face externa, mas não é totalmente hermética ao oxigénio.

Para limitar ou bloquear as reacções de oxidação no vinho ao longo da sua conservação, a adição de agentes químicos antioxidantes tais como sulfito (SO2) para impedir a oxidação dos compostos sensíveis do vinho é muito limitada uma vez que está sujeita à regulamentação relativa aos géneros alimentícios. 0 dióxido de enxofre adicionado em excesso pode igualmente alterar a qualidade organoléptica do vinho.

Para eliminar os polifenóis de modo a corrigir o surgimento da cor castanha nos vinhos brancos, são normalmente empregues agentes do colagem, como o carvão activado ou a PVPP 5 (polivinilpirrolidona) (Fialdes, E., Rev. des oenologues, 1989, 54, 19-22; Baron, R. et al. , Z. Lebensm. Unters Forsch, 1997, 205, 474-78). No entanto, estas substâncias apresentam o inconveniente de alterar os sabores e os aromas dos vinhos (Sims, C. A., et al., Am. J. Enol. Vitic ; 1995, 46 (2), 155-158). Por outro lado, certos polifenóis tais como o resveratrol, com propriedades físico-químicas e organolépticas, muito interessantes do ponto de vista alimentar e na saúde, devendo a sua eliminação se possível ser evitada.

Trabalhos de investigação académica mostraram que a adição no engarrafamento de 10 mg/L de glutationa a um vinho branco, limita o seu amarelecimento, a erosão do seu aroma e a sua tendência a não bem envelhecer. A glutationa poderia reagir aquando da maturação ou após o engarrafamento, com as quinonas para formar um complexo incolor, impedindo a reacção destas mesmas quinonas com um numerosos compostos de função sulfanilo incluindo os tióis do vinho (moléculas aromáticas), o que provoca habitualmente um complexo castanho, e que impede a expressão aromática.

Estes resultados não são no entanto susceptíveis de serem transpostos na prática dos viticultores, dado que a adição de glutationa num vinho produzido acabado não é autorizada nas práticas enológicas. Por outro lado, a introdução de glutationa no mosto coloca o problema do seu consumo durante a fermentação alcoólica por leveduras activas inoculadas.

Assim, se estes estudos apresentam um interesse para a compreensão dos fenómenos dos fenómenos em jogo na deterioração dos aromas e o aparecimento da coloração 6 castanha nos vinhos brancos, não é proposta nenhuma solução técnica para permitir na prática ultrapassar estes problemas.

Como já foi mencionado, considera-se ainda utilizar agentes biológicos para limitar os fenómenos de oxidação devidos à presença e oxigénio, especialmente através da utilização de leveduras consumidoras de oxigénio. 0 pedido de patente europeia n° EP 0 305 005 Bl descreve a utilização de leveduras que consomem oxigénio para limitar os fenómenos de oxidação nos produtos que contêm água ao longo da sua conservação. Este pedido de patente descreve em particular uma levedura e um processo mais particularmente adaptados à conservação da cerveja. As leveduras utilizadas consistem em leveduras desidratadas que são posteriormente re-hidratadas pela água contida na cerveja. Após a sua re-hidratação, estas leveduras são viáveis e reproduzem-se. Para evitar a geração de turbidez na cerveja de vido à multiplicação das leveduras consumidoras de oxigénio, estas células de levedura são imobilizadas em suportes sólidos compatíveis com as normas alimentares, tais como ceras ou gomas. Estes suportes são permeáveis à água e ao oxigénio. Aquando da etapa de pasteurização, realizada para o acondicionamento de cerveja, as células de levedura permanecem viáveis, capazes de consumir oxigénio. Este consumo do oxigénio não se realiza por uma reacção de fermentação. O pedido EP 1236 795 descreve a utilização de levedura enológica activa após a fase de fermentação num processo de vinificação para obter vinhos de qualidade superior.

Com o objectivo de remediar os fenómenos de oxidação durante 7 o envelhecimento ou a conservação do vinho, foi sugerido tratar o vinho com células de levedura de padaria (Bonilla et al. , J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1928-1933). Com efeito, as membranas das leveduras têm a propriedade de reter certos compostos, e especialmente substâncias corantes tais como os antocianos. Os vinhos foram tratados por doses de levedura que vão de 0,5 g/L a 5 g/L durante 24 horas, e depois foram filtradas. Foi observado um efeito na coloração, enquanto que as propriedades gustativas foram preservadas. Esta técnica que pertence ás "tecnologias verdes" tem no entanto o inconveniente de necessitar de uma esterilização microbiológica subsequente de modo a evitar que as células de levedura residuais se multipliquem e alterem a transparência assim como as propriedades organolépticas do vinho tratado. 0 pedido PCT n° WO 2005/080543 descreve um processo de preparação de um vinho que permite prevenir os problemas de oxidação encontrados aquando do envelhecimento do vinho, de preferência do vinho branco, graças à introdução de levedura enriquecida em glutationa no mosto antes do inicio da fermentação, de preferência no início ou ao longo da fermentação. Graças a este processo, é possível obter, utilizando unicamente ingredientes naturais, vinhos brancos de qualidade, respondendo aos seguintes critérios: um vinho redondo, fresco e frutado, aromas estáveis no tempo, cor estável no tempo. Não é requerida nenhuma adição de substâncias estranhas tais como antioxidantes químicos, não é necessária nenhuma manipulação complexa.

Segundo o pedido PCT n° WO 2005/080543, é recomendado introduzir a levedura enriquecida em glutationa no mosto em inicio de fermentação. 8

Os tratamentos após fermentação do vinho para obter um produto apto ao envelhecimento ou ao consumo, especialmente as etapas de filtração, permitindo a eliminação das leveduras enriquecidas em glutationa. Aquando da conservação do vinho branco num recipiente, os problemas de oxidação, de aparecimento da cor castanha, de alteração das propriedades gustativas e odorantes permanecem então não resolvidas.

Existe então uma necessidade de novos processos de estabilização dos líquidos aquosos alimentares, aptos a proteger os referidos líquidos da oxidação provocada pelo oxigénio durante o seu período de conservação.

Resumo da invenção A invenção tem como objecto uma composição para proteger da oxidação um líquido alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação ao longo da sua conservação compreendendo uma combinação de dois tipos de células de leveduras: (i) células de leveduras não viáveis e seleccionadas pela sua aptidão de consumir rapidamente oxigénio e (ii) células de leveduras inactivadas produzidas de modo a serem ricas em glutationa, tal como definido na reivindicação 1.

Um outro objecto da invenção é um processo de estabilização, de um líquido aquoso alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação ao longo da sua conservação, compreendendo uma etapa em que se coloca em contacto o referido líquido com a referida composição de células de levedura. A invenção refere-se também a um tratamento realizado de modo a baixar o potencial de óxido-redução de um líquido aquoso 9 alimentar de modo a favorecer a expressão óptima de certos compostos em equilíbrio de óxido-redução no referido líquido, e que têm um interesse organolépticos sob forma reduzida. A presente invenção tem igualmente como objecto uma utilização da composição de células de leveduras acima referidas para estabilizar, ao longo da sua conservação, os líquidos aquosos alimentares definidos anteriormente em relação à oxidação.

Descrição das figuras

De modo que a invenção possa ser mais compreensível, serão agora realizadas referências às figuras aqui anexas nas quais: A figura 1 representa a evolução do teor em oxigénio dissolvido ao longo do tempo para um vinho na presença seja de borras de vinho (Borras), seja de leveduras Optiwhite® (OW), seja da composição segundo a invenção (aqui na presença de borras e de leveduras OptiWhite® (L+OW)). A curva AI representa a curva da evolução em oxigénio para o vinho controlo (ou seja sem borras e sem leveduras Optiwhite®). A curva Temp/2 representa a evolução da temperatura no decorrer do tempo. A abcissa representa os dias e a ordenada representa o teor em O2 (mg/L) para as curvas A2, Borras, OW e L+W onde a temperatura em °C é dividida por dois para a curva Temp/2. A figura 2a representa a evolução média do parâmetro "L" por modalidade para as borras, as leveduras Optiwhite® e a composição segundo a invenção, sendo o parâmetro "L" 10 CIE 1976. A abcissa o valor do parâmetro média do parâmetro "a" leveduras OptiWhite® e sendo o parâmetro "a" CIE 1976. A abcissa o valor do parâmetro média do parâmetro "b" leveduras OptiWhite® e sendo o parâmetro "b" CIE 1976. A abcissa o valor do parâmetro um dos parâmetros cromáticos da representa os dias e a ordenada " L " . A figura 2b representa a evolução por modalidade para as borras, as a composição segundo a invenção, um dos parâmetros cromáticos da representa os dias e a ordenada "a" . A figura 2c representa a evolução por modalidade para as borras, as a composição segundo a invenção, um dos parâmetros cromáticos da representa os dias e a ordenada "b" . A figura 3a representa a evolução do teor em oxigénio dissolvido residual de um vinho conservado numa garrafa de vidro controlo com rolha e a evolução do teor em oxigénio dissolvido residual de um vinho conservado numa garrafa de vidro com rolha colocado em contacto com a composição segundo a invenção. A abcissa representa o tempo em dias e a ordenada representa o teor em oxigénio dissolvido (mg/L). A figura 3b representa a evolução do poder de óxido- redução de um vinho conservado numa garrafa de vidro controlo com rolha e a evolução do poder de óxido- redução de um vinho conservado numa garrafa de vidro com rolha colocado em contacto com a composição segundo a invenção. A abcissa representa o tempo em dias e a ordenada representa o poder de óxido-redução (mV). A figura 3c representa a evolução do teor em glutationa de um vinho conservado numa garrafa de vidro controlo 11 com rolha e a evolução do teor em glutationa de um vinho conservado numa garrafa de vidro com rolha colocado em contacto com a composição segundo a invenção. A abcissa representa o tempo em dias e a ordenada representa o teor em glutationa (mg/L).

As figuras 4a, 4b e 4c representam a evolução das caracteristicas cromáticas, os parâmetros "L", "b" e "a", respectivamente, de um vinho conservado numa garrafa de vidro controlo com uma rolha e a evolução das caracteristicas cromáticas de um vinho conservado numa garrafa de vidro com rolha colocado em contacto com a composição segundo a invenção. A abcissa representa os dias a 30°C e a ordenada representa o valor dos parâmetros "L", "a" e "b".

Descrição detalhada A presente invenção fornece composições e processos destinados a estabilizar os líquidos aquosos alimentares contra a oxidação durante a sua conservação A invenção tem como objecto uma composição para proteger da oxidação um liquido alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação ao longo da sua conservação compreendendo uma combinação de dois tipos de células de leveduras: i. células de leveduras não viáveis e aptas a consumir rapidamente o oxigénio, e ii. células de leveduras inactivadas enriquecidas em glutationa tal como definido na reivindicação 1. A composição aqui acima oferece uma solução simples e pouco 12 onerosa para a estabilização contra a oxidação de um liquido aquoso alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação, muito particularmente durante o seu periodo de conservação. 0 efeito de estabilização contra a oxidação da composição segundo a invenção é ilustrado especialmente por um a estabilização da cor, dos aromas varietais sensíveis à oxidação, e mais geralmente das propriedades organolépticas do líquido aquoso alimentar que é tratado com esta composição.

De preferência, entende-se por "líquido aquoso alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação", bebidas destinadas ao consumo humano.

As bebidas destinadas ao consumo humano englobam as bebidas do grupo (i) dos sumos de frutos ou de legumes, (ii) das bebidas fermentadas, (iii) do leite, (iv) das composições líquidas ou semilíquidas preparadas à base de leite, fermentadas ou não fermentadas, e (v) chá.

As bebidas fermentadas englobam o vinho, a cerveja, a cidra, o saqué e o iogurte líquido, dito "iogurte para beber".

Segundo a invenção, entende-se por "vinho" o produto obtido pela fermentação alcoólica, total ou parcial, de bebidas de uva fresca, pisadas ou não pisadas, ou de mostos de uva.

De preferência, as referidas substâncias sensíveis à oxidação são polifenóis.

De preferência, entende-se por líquido aquoso alimentar 13 contendo substâncias sensíveis à oxidação, bebidas destinadas ao consumo humano contendo pelo menos 1 mg de polifenóis por litro do referido líquido. 0 referido líquido contendo substâncias sensíveis à oxidação é de preferência escolhido no grupo das cervejas, dos sumos de fruta, vinhos muito sensíveis ao oxigénio e outras bebidas muito sensíveis ao oxigénio.

Os vinhos englobam os vinhos brancos, os vinhos rosés e os vinhos tintos.

Ainda mais particularmente, os vinhos englobam de modo geral todos os vinhos brancos, que são conhecidos por serem muito sensíveis à oxidação, assim como certos vinhos rosés e tintos.

Assim, de modo particularmente preferido, o líquido aquoso alimentar consiste em vinho branco.

Entende-se por protecção contra a oxidação, ou ainda estabilização, de um líquido aquoso alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação, uma redução ou um bloqueio das reacções de oxidação de certos compostos tais como os polifenóis contidos no referido líquido e das referidas reacções de oxidação nas qualidades físico-químicas e organolépticas que tornam o referido líquido próprio ao consumo humano.

Ao longo da sua conservação, os vinhos brancos podem sofrer uma perda dos aromas varietais, uma modificação do seu perfil organoléptico, assim como um aparecimento da coloração 14 castanha. Entende-se por estabilização de um vinho branco, especialmente uma protecção contra as evoluções aromáticas e cromáticas indesejáveis provocadas pela oxidação.

Segundo a invenção, células de leveduras não viáveis ou inactivadas possuem em comum a perda da sua capacidade de se multiplicarem e fermentar.

Por células de leveduras nao viáveis aptas a consumir rapidamente o oxigénio, entendem· -se células de levedura que perderam a sua capacidade de multiplicar e possuem uma velocidade de reacção com o oxigénio e uma afinidade para o oxigénio superiores às referidas substâncias sensíveis à oxidação, como ilustrado nos exemplos 1. Num modo de realização privilegiado, estas células de leveduras foram previamente seleccionadas para a sua aptidão em consumir rapidamente oxigénio. A aptidão das células de levedura não viáveis em consumir rapidamente o oxigénio é ilustrada em particular pela sua velocidade de consumir oxigénio. A velocidade de consumo de oxigénio por células de levedura introduzidas num dado meio pode ser determinada a partir da cinética de evolução da quantidade de oxigénio no referido meio ao longo do tempo. A quantidade de oxigénio presente no meio ao longo do tempo pode ser determinada pelos métodos de doseamento do oxigénio bem conhecidos pelo perito na técnica. Em particular, o perito na técnica pode utilizar um oxímetro adaptado à medição do oxigénio num meio líquido. EM certos modos de realização, a quantidade de oxigénio é medida ao longo do tempo graças a um oxímetro munido de uma sonda 15 polarográfica ou de uma sonda galvânica tal como ilustrado no exemplo 1. Em todos os casos de medição, a concentração em leveduras no meio deve ser da ordem de 108 células por mL para permitir uma medição precisa do seu consumo em oxigénio. De preferência, o meio utilizado para determinar a velocidade de consumo do oxigénio das leveduras é um meio hidroalcoólico compreendendo eventualmente substâncias sensíveis à oxidação.

Entende-se por meio hidroalcoólico um meio proveniente da mistura de uma solução aquosa e do etanol, sendo a percentagem de etanol preferencialmente compreendida entre 5% e 20% em volume em relação ao volume total do meio.

Os inventores mostraram que células de leveduras não viáveis que apresentam uma velocidade de consumo de oxigénio pelo menos 5 ng O2 s_1 para IO10 células de leveduras no tampão CMP (meio hidroalcoólico descrito no exemplo 1) a uma concentração celular da ordem de 108 células/mL são suficientemente aptas a consumir rapidamente o oxigénio no sentido da invenção.

Em certos modos de realização preferidos, as leveduras não viáveis aptas a consumir rapidamente oxigénio consistem em células de leveduras que possuem uma velocidade de consumo de oxigénio de pelo menos 5 ng O2 s-1 para IO10 células de levedura enquanto as referidas células de levedura estão presentes numa concentração da ordem de 108 células/mL num tampão hidroalcoólico.

Entende-se por velocidade de consumo de oxigénio de pelo menos 5 ng O2 s_1 para IO10 células de levedura, de preferência uma velocidade de consumo de oxigénio de pelo menos 5, 10, 16 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ng 02 s 1 para IO10 células de levedura.

De modo preferido, as células de leveduras não viáveis aptas a consumir rapidamente oxigénio apresentam uma velocidade de consumo de oxigénio que vai de 5 ng O2 s-1 a 40 ng 02 s-1 para IO10 células de levedura.

Entende-se por uma concentração da ordem de 108 células/mL, uma concentração que vai de 107 a 109 células/mL.

Em certos modos de realização da composição, as células de leveduras não viáveis aptas a consumir rapidamente o oxigénio podem ser escolhidas entre o grupo constituído pelas borras de levedura e as células de levedura inactivadas.

Entende-se por células de levedura inactivadas células de levedura que sofreram um tratamento que as tornam inaptas para se multiplicarem e para fermentar. Um tal tratamento pode ser por exemplo um tratamento térmico, químico e/ou por exposição a radiação. A titulo ilustrativo e não limitativo, pode citar-se como células de levedura inactivadas apropriadas a estirpe EC1118 inactivada termicamente tal como ilustrado no exemplo 8 do presente pedido.

Em certos modos de realização, escolhem-se borras de leveduras provenientes da fermentação do vinho como células de leveduras não viáveis e aptas a consumir rapidamente oxigénio. Com efeito, as borras representam grandes quantidades de células de levedura não viáveis no final da 17 fermentação no processo de vinificação. Estas células não viáveis de levedura possuem grandes quantidades de moléculas-substratos de reacção de oxidação mascaradas quando estas células estão vivas, especialmente ao longo da multiplicação celular (ver por exemplo Fornairon et al., 2000, Food Chemistry, Ed Elsevier, pp. 519-528).

Ao longo do processo de fermentação, por exemplo durante a vinificação, demonstrou-se que o consumo de oxigénio pelas borras poderia contrariar os fenómenos de oxigenação prejudiciais às qualidades organolépticas do vinho após às adições de oxigénio no meio (ver por exemplo Salmon et al., 2003, Journal of Bioscience and Bioengineering, pp. 496-503). De modo surpreendente, a utilização da composição segundo a invenção demonstra que estas propriedades das borras são úteis para proteger os vinhos finos ao longo da conservação dos fenómenos de oxidação que se tornaram indesejáveis.

Em certos modos de realização, as células de levedura não viáveis são borras de levedura obtidas a partir de uma cultura de leveduras num meio de fermentação que reproduz as condições dos mostos naturais. A titulo de ilustração e não limitativo, pode citar-se como meio de fermentação que reproduz as condições dos mostos naturais um meio sintético rico em azoto assimilável tal como o meio MS300. A título de ilustração e não limitativo, pode citar-se como células de leveduras não viáveis possuindo um consumo de oxigénio de pelo menos 5 ng.02 s_1 para 1010 células de leveduras, a borra de leveduras de Saccharomyces cerevisiae 18

Kl obtida por cultura das referidas leveduras no meio sintético MS300. A obtenção da referida borra e a determinação da sua velocidade de consumo de oxigénio são descritas no exemplo 1.

Pode-se pensar que as borras de leveduras que consomem o oxigénio presente em todo o tipo de liquido contendo substâncias reactivas com o oxigénio. A capacidade de consumo de oxigénio destas células de leveduras não viáveis pode ser superior àquela das células desidratadas e viáveis e àquela de células inactivadas, como é ilustrado no exemplo 2.

Em certos modos de realização da composição segundo a invenção, as células de levedura não viáveis aptas a consumir rapidamente o oxigénio consistem em células de leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae.

De modo geral, as células de levedura inactivadas enriquecidas com glutationa consistem em células de levedura que foram produzidas especificamente para conter uma grande quantidade de glutationa e libertar uma grande quantidade de glutationa no meio exterior.

Em certos modos de realização da composição, as referidas leveduras inactivadas enriquecidas em glutationa são leveduras tais como descritas no pedido PCT n° WP2005/080543. São caracterizadas pela dosagem do seu teor em glutationa segundo o método do exemplo 1, página 9, do pedido W02005/080543 .

Sem pretender estar ligado a uma qualquer teoria, o requerente pensa que a glutationa, que é libertada pelas 19 células de levedura enriquecidas neste composto, reage aquando da maturação ou após o engarrafamento, com as quinonas para formar um complexo incolor, que impede então essas mesmas quinonas de reagir: (i) com os compostos químicos com função sulfanilo dos quais os tióis de vinho (moléculas aromáticas), o que conduz a uma redução da expressão aromática, (ii) com outros compostos fenólicos para formar pigmentos complexos de cor amarela a castanho que alteram a cor do produto.

As células de leveduras contêm naturalmente uma certa quantidade de glutationa, geralmente de 0,2 % em peso a 0,5 % em peso, em relação ao peso total de matéria seca, ou seja de 0,2 g a 0,5 g de glutationa para 100 g de matéria seca de levedura. A produção de células de leveduras enriquecidas em glutationa é bem conhecida pelo perito na técnica que sabe prepará-la por uma das técnicas à sua disposição (Catalino et al. , 1992, Applied Microbiology and Biotechnology, Ed Springer-Verlag, pp. 141-146).

Pode-se enriquecer uma levedura em glutationa colocando-a na presença de cisteína, em condições óptimas de cultura, podendo a referida levedura difundir no meio até 154,54 mg/L de glutationa após 72 horas de fermentação (ver Santos et al., 2007, Applied Microbiology and Biotechnology, Ed. Springer, pp. 1211-1216).

As leveduras enriquecidas em glutationa, utilizadas para fabricar a composição segundo a invenção, contêm mais de 0,5 % em peso de glutationa, em peso em relação ao peso total de 20 a levedura matéria seca da levedura. De modo vantajoso, enriquecida em glutationa contém pelo menos 1 % em peso de glutationa, e de preferência pelo menos 1,5 % em peso de glutationa, em relação ao peso total de matéria seca da levedura. Por exemplo, para uma eficácia óptima, utiliza-se uma levedura enriquecida a 1,8 % em peso de glutationa, em relação ao peso total das células de levedura.

Pode-se inactivar as referidas leveduras enriquecidas em glutationa por qualquer método conhecido pelo perito na técnica, como por exemplo por tratamento térmico, químico e eventualmente por exposição a uma radiação, incluindo uma radiação radioactiva ou uma radiação ultravioleta. As referidas leveduras inactivadas são não viáveis e não se podem multiplicar nem fermentar.

Em certos modos de realização vantajosos, as células de leveduras enriquecidas em glutationa segundo a invenção pertencem a espécies de leveduras do tipo enológico, das quais a espécie Saccharomyces cerevisiae.

As espécies de leveduras do tipo enológico englobam as Saccharomyces cerevisiae. A combinação (i) das células de leveduras não viáveis e aptas a consumir rapidamente oxigénio e (ii) das células de leveduras inactivadas enriquecidas em glutationa, numa composição estabilizadores da invenção, conduz a uma protecção eficaz do vinho contra os fenómenos de oxidação, quer seja ao nivel da cor, da preservação de aromas varietais sensíveis à oxidação, e mais geralmente ao nível da qualidade 21 organoléptica. Esta sinergia é ilustrada nos exemplos aqui abaixo. A expressão "ao longo da sua conservação" é utilizada para designar o momento no qual a composição segundo a invenção é utilizada. Considera-se que um liquido aquoso alimentar está "ao longo de conservação" a partir do momento do seu acondicionamento num recipiente de armazenamento e do seu armazenamento num local onde a sua estabilização é favorecida. A temperatura de conservação de um liquido aquoso alimentar varia consoante o tipo de liquido aquoso considerado. Por exemplo, um sumo de fruta pasteurizado e conservado de forma estéril pode ser conservado à temperatura ambiente, ou seja, a uma temperatura à volta de 20°C, ou seja a uma temperatura de 20°C. A temperatura de conservação de um sumo de fruta fresco não pasteurizado deve ser baixa de modo a evitar a eventual proliferação de microrganismos que o referido sumo é susceptível de conter, sendo a referida temperatura classicamente compreendida entre 1°C e 7°C, de preferência entre 3°C e 5°C. A temperatura de conservação a longo prazo de um vinho está classicamente compreendida entre 10°C e 17°C, com vantagem entre 11°C e 15°C e preferencialmente a cerca de 12°C. No entanto, qualquer que seja o liquido aquoso alimentar considerado, as condições de temperatura óptima de conservação não são sempre respeitadas durante o periodo de tempo de transporte, podendo este período de tempo ser de vários dias, até mesmo mais de uma semana, por exemplo para um transporte intercontinental de muito elevada distância realizado por via marítima.

No caso de um transporte de um líquido aquoso alimentar em condições de temperatura significativamente superior à 22 temperatura óptima predefinida. Estas condições de temperatura não controladas podem envolver uma alteração das qualidades do referido liquido aquoso alimentar, por exemplo, envolver uma aceleração das reacções de oxidação.

Ora, o requerente mostrou que a composição da invenção conserva a sua actividade de protecção de um liquido aquoso alimentar contra a oxidação até temperaturas elevadas de pelo menos 30°C. Consequentemente, a composição segundo a invenção é activa na estabilização dos líquidos aquosos alimentares contra a oxidação durante a totalidade do período de conservação do referido liquido, incluindo durante o periodo de tempo de transporte onde as condições óptimas de conservação não podem ser sempre respeitadas. Além disso, a composição segundo a invenção é igualmente activa em situações nas quais a temperatura de conservação deixou de ser óptima, por exemplo no caso de uma desregulação dos dispositivos de regulação da temperatura, ou ainda no caso de um período climático de forte calor.

Num modo de realização preferido de uma composição estabilizante segundo a invenção, as células de levedura são incluídas conjuntamente num sistema de imobilização permeável aos líquidos. O referido sistema de imobilização é realizado em materiais compatíveis com as normas alimentares. Os referidos materiais podem ser, de modo não limitativo, capilares membranares, tubos em silicone ou aditivos do tipo texturantes ou gelificantes. 0 conjunto das referidas células de leveduras e do sistema de imobilização no qual estão incluídas, de preferência 23 imobilizadas, constitui uma composição segundo a invenção do tipo "Biossistema Antioxidante Imobilizado".

Num modo de realização de uma composição segundo a invenção, os dois tipos de células de leveduras são imobilizados em conjunto num suporte à base de alginato, que é em simultâneo um aditivo alimentar texturante e uma macromolécula alimentar com poder reticulante. A titulo ilustrativo, imobilizam-se as referidas células num gel preparado a partir de polissacáridos como o alginato de cálcio (formação ionotrópica do gel) ou carragenato de potássio (gel termorreversivel). São descritas técnicas de imobilização de células de levedura numa matriz de alginato de cálcio especialmente por Kawaguti et al. , 2006, Biochemical Engineering Journal 29, 270-277; Lu & Wilkins, 1996 Journal of Hazardous Materials 49, 165-179; Podrazky & Kuncova, 2005, Sensors and Actuators B: Chemical 107, 126-134; Riordan et al. , 1996, Bioresource Technology 55, 171-173) .

Por exemplo, para preparar uma composição estabilizante segundo a invenção, pode-se imobilizar células de levedura num suporte de alginato realizando uma mistura de uma solução de alginato de sódio a 3 % (p/v) e de uma solução contendo as células a imobilizar. Depois, a referida mistura é vertida gota a gota numa solução de cloreto de cálcio (0,15 M) de modo a gerar esferas de alginato nas quais estão inclusas células de levedura.

Os ensaios semi-industriais em vinho branco descritos no exemplo 5 ilustram a eficácia da combinação de células de levedura da invenção quando são imobilizadas sobre um suporte em alginato.

De modo vantajoso, este modo de realização preferido de uma composição segundo a invenção permite controlar a repartição das leveduras inactivas no recipiente de modo que estejam situadas o mais próximo possivel de uma zona de oxidação. Permite por outro lado eliminar facilmente, por qualquer meio mecânico apropriado, as células de levedura do liquido aquoso alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação num momento escolhido pelo perito na técnica como sendo o mais apropriado, por exemplo, no momento no qual o efeito reivindicado atingiu o seu óptimo de eficácia ao encontro da oxidação do referido líquido aquoso alimentar.

Um vinho branco é considerado em curso de conservação a partir do momento em que a fermentação não tem mais lugar e em que se eliminaram todos os microrganismos presentes no vinho, por exemplo por filtração. 0 vinho branco encontra-se então armazenado em recipientes que podem ser, de forma não limitada: - outros odres para vinho, ou BIB® do anglicismo bag-in-box, que são uma bolsa para vinho no interior de uma caixa de cartão que se retrai à medida que se esvazia sem que o ar nela penetre; - garrafas de vidro tapadas por uma rolha que podem ser de 75 cl, garrafas empalhadas, garrafões empalhados, garrafas magnum, jeroboam, garrafões reobão, 25 matusalém, salmanazar, baltazar, nabucodonosor, salomão, soberano ou primaz; - cubas fechadas (em inox, betão, plástico, cerâmica, etc...); - "cubitainers"; - garrafas de plástico ou pacotes (ou Tetra-brik®)); - recipientes em madeira de carvalho que podem ser tonéis, quartolas, pipas, barricas ou barris.

De preferência, os recipientes nas quais é conservado o vinho banco são BIB® ou garrafas de vidro rolhadas. A invenção tem também como objecto um processo de estabilização, ao longo da sua conservação, de um líquido, contendo substâncias sensíveis à oxidação, compreendendo uma etapa em que se coloca em contacto do meio constituído pelo referido líquido a estabilizar com uma composição de estabilização tal como definida na presente invenção. 0 referido processo de estabilização tem como objectivo lutar contra a oxidação progressiva do líquido a estabilizar, com a duração de conservação.

Podem-se distinguir dois tipos de contacto com a referida composição de células de leveduras. A escolha entre os referidos dois tipos de contacto efectua-se em função do teor de oxigénio dissolvido do referido líquido contendo substâncias sensíveis ao oxigénio.

Se o teor em oxigénio do referido liquido for de pelo menos 0,1 mg/L, por exemplo num vinho jovem antes do 26 acondicionamento, é importante desviar o oxigénio em direcção às células de leveduras não viáveis capazes do o consumir rapidamente de modo a preservar as substâncias sensíveis ao oxigénio, por exemplo, os polifenóis. É então necessário colocar em contacto a totalidade do referido líquido com a referida composição de células de leveduras. Neste modo de realização, os dois tipos de células de levedura, (i) as células capazes de consumir rapidamente o oxigénio e <ii) as células ricas em glutationa devem ser repartidas de modo homogéneo no referido líquido, sendo então máxima a superfície de contacto entre o referido líquido e as referidas levaduras.

Se o teor em oxigénio dissolvido da bebida for muito baixo, por exemplo no máximo de 99 pg/L, por exemplo o caso de um vinho em decurso de conservação durante um longo período de tempo, por exemplo vários meses ou mesmo vários anos, em cuba ou garrafa ou outro recipiente, é necessário impedir a dissolução do oxigénio nos locais onde o líquido está em contacto com o oxigénio que conseguiu penetrar após o seu fecho, e como tal impedir os fenómenos de oxidação na interface entre o líquido e os locais de penetração do oxigénio no interior do recipiente. Para tal, o máximo de superfície de contacto entre o oxigénio e as referidas leveduras deve encontrar-se na referida interface. Assim, a repartição das referidas leveduras no referido líquido deve ter como alvo as referidas interfaces, por exemplo a interface entre o líquido e o ar encerrado á sua superfície numa cuba, ou ainda a interface entre um vinho e a superfície interna de um odre de vinho. Pode-se então considerar formas de suporte de imobilização das referidas leveduras num filme no caso das cubas ou dos filamentos de alginato que se 27 repartem de modo adequado sobre a superfície interna no caso dos odres de vinho ou BIB®.

Os referidos dois modos preferidos de realização do referido processo são ilustrados por exemplos de ensaios semi-industriais no vinho branco que são descritos no exemplo 5.

De modo vantajoso, o referido processo de estabilização é uma alternativa à adição de sulfito (S02) nos vinhos.

Com efeito, o contacto de um vinho com uma composição compreendendo células de leveduras segundo o processo da invenção apresenta a vantagem, contrariamente à adição de sulfito, de evitar o risco acrescido de alergia e não envolve a perda das qualidades organolépticas. Além disso, sabe-se que a presença de borras de leveduras pode induzir, por influência de fenómenos de lise celular, a introdução de colóides de modo a melhorar a estrutura aromática do vinho.

Por outro lado, certas substâncias provenientes da lise das células de leveduras protegem o vinho contra as precipitações de hidrogeno-tartarato de potássio e de proteínas. Entre outros, as paredes celulares das leveduras podem absorver diferentes substâncias indesejáveis, como os produtos de fermentação e os metais pesados ou toxinas (ocratoxina A). É necessário igualmente sublinhar a vantagem técnica que confere a utilização de células de levedura inactivadas ou não viáveis ao processo segundo a invenção. 0 exemplo 8 descreve que mesmo no caso da sua inclusão num sistema de imobilização, as leveduras viáveis se multiplicam e são libertadas no vinho provocando um aumento considerável da 28 turbidez do vinho e como consequência, uma alteração considerável da sua qualidade final. Pelo contrário, as células inactivadas não são libertadas para o meio e conservam a sua capacidade de consumir oxigénio e de preservar os compostos responsáveis pelas qualidades organolépticas do vinho.

As caracteristicas cromáticas e as propriedades organolépticas do referido vinho branco acabado são ilustradas nos exemplos abaixo. 0 referido vinho branco acabado não é oxidado ao longo da sua conservação graças ao seu contacto com os dois tipos de células de levedura em combinação da invenção. Com efeito, as referidas células de levedura são capazes de consumir rapidamente oxigénio do referido vinho branco que impede num primeiro tempo o oxigénio de reagir com compostos sensíveis ao oxigénio, dos quais alguns são garantes das qualidades organolépticas do vinho acabado, depois num segundo tempo pela sua libertação de glutationa -um antioxidante natural-de impedir a formação de cascatas de reacções de oxidação a longo prazo, evitando assim a formação de compostos prejudiciais às referidas qualidades organolépticas que são por exemplo, a leveza, o frutado, o sabor, os aromas e o aspecto. A oxidação dos vinhos brancos traduz-se a prazo por uma formação de uma cor castanha visível ao olho nu mensurável no espaço CIE 1976. 0 espaço CIE 1976 é bem conhecido pelo perito na técnica. (Segundo a Wikipedia) CIE Lab é um modelo de representação 29 das cores desenvolvido pela comissão Internacional da Iluminação (CIE), em 1976. A combinação L é a luminância, que vai de 0 (preto) a 100% (branco). A componente a representa a gama do eixo vermelho (valor positivo) -> verde (negativo) passando pelo branco (0) se a luminância vale 100%. A componente b representa a gama do eixo amarelo (valor positivo) -> azul (negativo) passando pelo branco (0) se a luminância vale 100%. O modelo de cor Lab foi criado como um modelo absoluto, independentemente do material, utilizável como referência teórica. Algo importante a recordar neste modelo é o facto de ser por definição correctamente parametrizado. Não existe então necessidade de espaços colorimétricos específicos baseados num modelo. No entanto, na prática este modelo é adaptado em função dos periféricos e dos suportes de impressão (adobe 1998, sRGB, ColorMatch, Pantone, etc.). CIE 1976 L*a*b é directamente baseado no diagrama CIE XYZ e visa a uniformizar a percepção das diferenças de cores. As relações não lineares para L*, a* e b* têm como objectivo imitar a resposta logarítmica do olho (no espaço L*a*b o olho detecta 1 ponto de variação de a ou b para 5 pontos de L) . As informações de cores referem-se à cromaticidade necessária comparada ao ponto branco do sistema.

Observa-se um aumento do parâmetro "a", que faz passar a dominante verde para o domínio vermelho para os vinhos brancos oxidados, veja-se o exemplo b nos ensaios semi-industriais. Não se observa este aumento do parâmetro "a" para o vinho branco acabado segundo a invenção.

Finalmente, a invenção refere-se igualmente à utilização da composição compreendendo dois tipos de células de levedura 30 segundo a invenção para proteger um líquido aquoso alimentar contendo substâncias sensíveis ao oxigénio contra os efeitos da oxidação das referidas substâncias ao longo da sua conservação.

No caso dos vinhos finos conservados em odre de vinho, ou BIB®, é bem conhecido que mesmo se o BIB® estiver provido de uma rolha estanque, o acondicionamento é realizado na presença de um espaço de cúpula significativo cheio de ar e o filme exterior do envelope de vinho é um filme parcialmente permeável ao oxigénio. 0 BIB® apresenta assim propriedades de estanquicidade aos gases inferiores em comparação com a garrafa de vidro (ver relatório do ICV, Institut coopératif du vin et du Conseil interprof essionnel des vins du Languedoc, "Conditionnement en caisses-outres (BIB®)", ed 2006). Em tempo normal, adiciona-se ao vinho sulfito (SO2) composto químico redutor de oxigénio. Os sulfitos apresentam o inconveniente de serem potencialmente alergénicos, de utilização limitada em quantidade, e de comunicar em doses fortes um odor "negativo" sulfuroso. A utilização da composição segundo a invenção apresenta numerosas vantagens em relação á utilização de sulfito (SO2) para proteger um vinho branco contra os fenómenos de oxidação. Com efeito, as leveduras da referida composição são não viáveis ou inactivadas, ou seja são incapazes de se reproduzir e de fermentar. Não há qualquer risco de contaminação ou de perturbação do vinho ao longo da sua conservação. Elas respondem às normas alimentares uma vez que provêm da fermentação do referido vinho. A eficácia da combinação de células de levedura aptas a consumir o oxigénio rapidamente e de células de leveduras enriquecidas em 31 glutationa na conservação das qualidades do referido vinho branco em BIB® é ilustrada nos exemplos abaixo. A composição, o processo e a utilização segundo a invenção são ilustradas por exemplos no domínio da conservação dos vinhos brancos. Pode-se no entanto extrapolar estes exemplos para outros tipos de líquidos aquosos alimentares contendo substâncias sensíveis ao oxigénio. Por exemplo, as borras de leveduras provenientes das fermentações de vinhos rosés e de vinhos tintos particularmente sensíveis à oxidação podem também ser utilizadas para proteger da oxidação os referidos vinhos rosé e tintos. Leveduras de fermentação da cerveja tornadas não viáveis e aptas a consumir oxigénio ou inactivadas e enriquecidas em glutationa podem proteger a cerveja contra a oxidação ao longo da sua conservação. 0 facto de qualquer espécie de células de leveduras autorizadas ao consumo humano poder ser tornada não viável e apta a consumir rapidamente oxigénio ou poder ser inactivada e enriquecida em glutationa, torna a composição, o processo e a utilização segundo a invenção aplicáveis à estabilização de qualquer tipo de líquido aquoso alimentar, contendo substâncias sensíveis à oxidação, ao longo da sua conservação.

Os exemplos que se seguem descrevem de forma detalhada diferentes aspectos da presente invenção.

Exemplo 1 : medição do consumo de oxigénio pelas borras de levedura: A. Material e métodos 32 A.l. Material biológico 1. Levedura Saccharomyces cerevisiae Kl marcada A estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae Kl foi seleccionada pelo ICV e o INRA Montpellier e é produzida, seca e embalada pela sociedade Lallemand. Esta estirpe foi utilizada para o conjunto das experiências.

Elas apresentam-se sob a forma de leveduras secas activas (LSA). Não necessitam de pré-cultura antes da sua utilização, estas LSA são previamente re-hidratadas: 1 g de leveduras secas activas são colocadas em suspensão em 10 mL de água com glucose a 50 g/L, aquecida a 37°C. Esta suspensão é colocada a banho-maria a 37°C durante 30 minutos com uma homogeneização a cada 10 minutos. 0 meio de cultura é de seguida inoculado com a preparação de leveduras re- hidratadas. A taxa de inoculação é de 5 gramas por hectolitro, ou seja 500 pL da suspensão de leveduras re-hidratadas em 1 L de meio de cultura. 2. Levedura OptiWHITE®

OptiWHITE® é uma levedura enológica inactivada, seleccionada e preparada especificamente para garantir uma libertação progressiva dos compostos das paredes de leveduras assim que um elevado potencial antioxidante (riqueza em glutationa). Estas leveduras inactivadas foram utilizadas de dois modos: - em condições enológicas: seja 30 g/hL no início ou no final da fermentação alcoólic 33 - em solução num meio hidroalcoólico (tampao CMP descrito abaixo) A. 2. Meio de Cultura 0 meio de fermentação utilizado é um meio sintético dito MS300, que simula a composição média de um mosto de uva. Permite assim trabalhar em condições padrão e de evitar variações de composição observadas nos mostos naturais. 0 meio MS 300 contém todos os aminoácidos, vitaminas e factores de crescimento necessários ao bom desenvolvimento da estirpe Kl em anaerobiose (Bely, 1990; Salmon et al., 2003). A quantidade de azoto assimilável é de cerca de 312 mg ΙΓ1. A.3. Meio de análises 34 1

Tampão CMP

Este meio é um meio hidroalcoólico cujo pH corresponde àquele do vinho. Compreende:

- Ácido Cítrico: 31 mM

- Ácido D,L-Málico: 45 mM

- KH2P04: 10 mM - Etanol: 11,8 % (v/v) O pH é ajustado a 3,3 com potassa KOH (10N) ii. Tampão ftalato

Este meio tinha sido considerado por (Fornairon-Bonnefond, 2000) como o meio óptimo para análise das velocidades de consumo de oxigénio. É uma solução a 0,1 M de ftalato ajustado a pH 4,5. iii. Vinho branco Villaray

Este vinho é um vinho branco seco acondicionado em Vinobag®. O seu pH é de 3,3 e contém 11 % de etanol (v/v) . É proveniente de BIB® de 3 litros ou de 5 litros, reacondicionado no laboratório em garrafas de vidro colocadas sob atmosfera de árgon. A.4. Utilização tecnológica das borras

Foram propostas soluções diferentes: as borras podem ser encerradas ("armadilhadas") em capilares membranares e tubos ou esferas de alginatos. 1. Capilares e tubos

As membranas utilizadas são as seguintes: - Membrana de microfiltração CAPFIL MF02 M2 (X-Flow, Enschede, Holanda) - Membrana de microfiltração MD200 CV2N (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Alemanha) - Tubo de silicone Tygon® R-3603 (Saint-Gobain, Akron,

Estados Unidos) 35

Tabela 1 : características dos capilares e dos tubos MF02 M2 MD200 CV2N R-3606 Composição Polieterssulfona & polivinil-pirrolidona Polipropileno Silicone Carácter hidrofilico Moderadamente hidrofilico Hidrofóbico Hidrofilico Diâmetro exterior (m) 2,5.10_J 2,5.10_J 2,38.10^J Diâmetro interior (m) 1,5.1CT1 1,6 .10~J 3,97.10“1 Diâmetro máximo dos poros (m) 0,2.10~b Diâmetro médio dos poros (m) 0,09.10~b Tamanho absoluto dos poros (m) 0,2. 10'b RhO (10_±±m_±) 0,98 ± 0, 14 1,16 ± 0,21 Superfície específica (m2/g) 10,63 15, 54 36 1

Uma mistura de solução de alginato de sódio a 3 % (p/v) e da solução contendo as células a imobilizar é deixada cair gota a gota com auxílio de uma bomba peristáltica numa solução de cloreto de cálcio (0,15 M) . A quantidade de células imobilizadas será precisada a cada experiência. 2

Esferas de alginatos

Oxigenação das amostras

Na maioria dos casos, as amostras foram oxigenadas até à saturação com o oxigénio do ar. As amostras são agitadas manualmente durante um minuto. A.5. Métodos analíticos 1. Contagem celular A avaliação da biomassa de levedura é realizada por enumeração com auxilio de um contador electrónico de partículas Multisizer™ 3 Coulter Counter® (Beckman-Coulter, Roissy, França). A amostra a testar é previamente diluída graças a um equipamento para diluição automática Microlab 500 (Hamilton, Bonaduz, Suíça) com uma solução isotónica de contagem Isoton (Beckman-Coulter, Roissy, França) de modo a ter entre 4000 e 80000 células por mL na amostra diluída que será finalmente contada. A amostra diluída é passada por ultrassons durante 30 segundos no gerador Sonifier® S250A (Branson, Danbury, Estados Unidos) de modo a separar os agregados eventualmente formados. Finalmente, a enumeração celular é realizada no contador de partículas. 2. Massa seca

Filtram-se sob vácuo três vezes 10 mL de amostra através de um filtro de porosidade 0,22 μτη previamente seco e tarado. O bolo de filtração de células recuperado com a membrana é seco numa estufa a 108°C durante 24 horas. As amostras são de seguida pesadas. 37 A.6. Velocidade de consumo de oxigénio 1. Oroboros® 0xygraph-2k

Para medir as velocidades de consumo de oxigénio das nossas amostras, utilizou-se o 0xygraph-2k (Oroboros® Instruments, Innsbruck, Áustria). Trata-se de um aparelho de elevada resolução que possui duas câmaras em paralelo que permitem uma análise de duas amostras em condições idênticas.

As caracteristicas do dispositivo são as seguintes: Á Exterior das câmaras em aço inoxidável e regulação de temperatura por efeito Peltier -> regulação muito precisa da temperatura. ^ Volume de reacção : 2 mL ^ Registo dos dados a cada 2 segundos ^ Câmaras de vidro, tampas e cânulas em titânio -> minimização das fugas e da difusão de oxigénio > Controlo da agitação

Sondas de oxigénio polarográficas: elevada sensibilidade da sonda Orbisphère®

As sondas de oxigénio são inseridas lateralmente, de forma obliqua em relação à célula de vidro. 0 oxigénio difunde-se da amostra em direcção à superfície do cátodo através de uma camada não agitada da amostra situada no nível exterior da membrana, e depois através da membrana e finalmente através da camada de electrólito. Para minimizar esta camada de 38 amostra nao agitada, é necessária uma agitaçao constante e forte da amostra : 750 rpm nas nossas condições.

As caracteristicas da sonda Orbisphère modelo 2120 são: ^ Um cátodo de ouro com uma superfície relativamente grande (diâmetro de 2 mm) para possuir uma elevada sensibilidade e um zero constante ^ Um ânodo em prata/cloreto de prata cuja superfície é superior à do cátodo ^ Um electrólito de cloreto de potássio (KC1 a 1 M)

^ Uma membrana FEP ("fluorinated ethylene-propylene") com 0,25 pm de espessura ^ Uma tensão de polarização de 0,8 V

2. Oxi 197S

De modo a determinar a evolução da concentração em oxigénio ao longo do tempo e a quantidade máxima total de consumo de oxigénio, o oximetro 0X1 197S (WTW, Wilheim, Alemanha) com um eléctrodo de Clark permite medir a concentração de oxigénio das nossas amostras. A sonda utilizada é uma CellOx 325 (WTW, Wilheim, Alemanha) cujas caracteristicas são as seguintes: > Um eléctrodo de trabalho de ouro > Um contra-eléctrodo de chumbo Um electrólito > Uma membrana FEP ("fluorinated ethylene-propylene") com 13 pm de espessura 39 A medição do consumo de oxigénio pelas borras de levedura é realizada numa garrafa regulada termicamente por circulação de água na sua camisa dupla. Um agitador magnético assegura a homogeneização do meio reaccional ao longo da medição. Os dados são registados todos os 3 segundos. Após saturação em oxigénio do ar por agitação manual (vigorosa) da solução a medir, a medição da concentração de oxigénio é iniciada no frasco hermeticamente fechado até que se atinja um patamar. Depois, a solução é novamente oxigenada com ar, o frasco é de novo fechado e a medição é reiniciada. E assim sucessivamente. A quantidade total de oxigénio consumida é determinada a partir dos dados recuperados e analisados em conjunto. A. 7 Medição da concentração de oxigénio ao longo do tempo

Cada amostra (vinho isoladamente e vinho contendo borras ressuspendidas) é levada à saturação em oxigénio do ar por agitação e repartido em frascos estanques de 70 mL. Os frascos são todos mantidos a 30°C e as amostras contendo as borras são ou homogeneizadas por agitação magnética ou não são agitados. As curvas obtidas a partir de diferentes medições são de seguida ajustadas pelo programa informático Sigmaplot® (SPSS Inc., Richmond, Estados Unidos). A velocidade de consumo de oxigénio é obtida pelo cálculo da derivada da curva ajustada. B. Resultados

Os resultados da Tabela 2 abaixo representa o acompanhamento da evolução da velocidade de consumo de oxigénio medida a 30°C em função da titulação celular das borras de leveduras 40 ressuspendidas no tampão CMP (meio hidroalcoólico de pH 3,3 a 11,8 % (v/v) etanol) . As médias e os desvios-padrão de 4 medições são representados na Tabela 2

Tabela 2

Concent ração celular (106 células mLT1) Velocidade de consumo de oxigénio (ng 02 s_1 mL”1) Desvio padrão (ng 02 s”1 mL-1) O O 0,15 0, 015 33,6 0,08 0, 010 115, 2 0,18 0, 026 374, 0 0,37 0, 005

Quando se mede o consumo de oxigénio pelas borras de levedura, verifica-se que num primeiro tempo a velocidade de consumo para uma baixa concentração celular é menos elevada do que aquela do tampão isoladamente. Uma hipótese é que a medição obtida com o meio hidroalcoólico (CMP) sem leveduras corresponde ao consumo próprio eléctrodo e quando se adicionam as borras, este consumo torna-se desprezável devido à significativa afinidade das borras para o oxigénio.

Exemplo 2 : Comparação do consumo de oxigénio de diferentes tipos de leveduras A. Material e métodos : 0 material e os métodos são os mesmos que para o exemplo 1. B. Resultados 41

As velocidades de consumo do oxigénio pelas borras (ou seja, pelas leveduras Kl cultivadas no meio de fermentação MS300 que reproduzem as condições do mosto natural) foram medidas com auxilio de um oximetro de elevada resolução 0xygraph-2k (Oroboros® Instruments, Innsbruck, Áustria) e foram comparadas àquelas da levedura seca activa Kl re-hidratada seguindo o protocolo do fabricante (Lallemand SAS; Blagnac, França) e àquela da levedura inactivada OptiWhite que contém glutationa (e/ou outros péptidos com cisteina). Os resultados obtidos são ilustrados na tabela 3 e confirmam o interesse das borras para consumir oxigénio dissolvido no vinho.

Os resultados da Tabela 3 mostram o consumo de oxigénio medido a 30°C em função da massa seca de borras, LSA e leveduras inactivadas OptiWhite@ no tampão CMP (meio hidroalcoólico de pH 3,3 a 11,8 % (v/v) de etanol).

Tabela 3

Massa Velocidade Massa Velocidade Massa de Velocidade de de consumo de LSA de consumo Optiwhite de consumo borras de de de oxigénio oxigénio oxigénio (g) (ng O2 s_1 (ng 02 s_1 (ng 02 s"1 mL-1) mL-1) mlb1) 0,0000 0,2590 0,0000 0,2590 0,0000 0,2590 0,0045 0,7636 0,0050 0,3192 0,00018 0,3199 0,0089 0,8946 0,0100 0,5713 0,0016 0,2842 0,0083 0,2572 0,0142 0,3316 42

As leveduras inactivas Optiwhite® não parecem consumir oxigénio. Isto poderá ser devido ao processo utilizado para a sua inactivação que afectaria a membrana (ou os esteróis da membrana) e então as células já não poderiam consumir oxigénio. No entanto, estas leveduras contêm efectivamente glutationa (3 a 4 vezes mais que as borras) e permanecem assim interessantes do ponto de vista da protecção dos aromas (particularmente os tióis voláteis). Com efeito, na literatura, o efeito protector das borras relativamente à evolução dos vinhos foi explicada de modo distinto (Dubourdieu et al., 2002; Lavigne-Cruége & Dubourdieu, 2004). A glutationa (ou outros aminoácidos ou péptidos sulfurosos) poderiam proteger os aromas sulfurosos na sua deterioração formando pontes dissulfureto.

Exemplo 3 : Cinética de libertação de glutationa a partir de leveduras inactivadas ricas em glutationa. A. Material e métodos A.l. Produtos estudados.

Foram estudados dois produtos correspondentes a leveduras ricas em glutationa: • Produto SI (produto Lesaffre) • Produto OW (produto Lallemand) A. 2. Cinética de libertação.

Solubilizaram-se 0,5 g de peso seco de cada um dos produtos testados em 30 mL de meio que simula um vinho e contendo (por 43 litro) : ácido cítrico : 6 g ; ácido DL-málico : 6 g ; KH2P04: 750 mg ; K2S04: 500 mg ; MgS04.7H20 : 250 mg ; CaCl2.2H20 155 mg ; NaCl : 200 mg ; e etanol, 120 mL. 0 meio é tamponizado a pH 3,3 por adição de KOH a 10N. A cinética de libertação foi medida durante 10 horas a 28°C sob agitação. As amostras (1 mL) foram recolhidas, depois centrifugadas a 14000xg durante 5 minutos. O sobrenadante foi desproteinizado pro tratamento volume a volume com ácido sulfossalicílico a 5% e centrifugação a 14000xg durante 5 minutos. Isto conduz a uma diluição da amostra por 2. A. 3. Análise da glutationa libertada A dose de glutationa libertada foi efectuada com o kit de doseamento da glutationa vendida pela firma Sigma (ref. CS0260-1KT). Este kit doseia o conjunto das formas reduzidas e oxidadas da glutationa. Utiliza-se uma gama de padrões de glutationa reduzida entre 0 e 25 pM para a calibração do kit. B. Resultados

Os resultados correspondentes às amostras doseadas são os seguintes: 44

Tabela 4 : cinética de libertação da glutationa

Amostras Tempo de recolha [GSH] em 10 pL de (horas) amostra pura (μΜ) SI 0 O CM SI 1 242,0 SI 3 228,0 SI 5 234, 0 SI 5 216,0 SI 10 230,0 OW 0 2,0 OW 1 284, 0 OW 3 298,0 OW 5 256,0 OW 5 240,0 OW 10 242,0

Os dois produtos SI e OW libertam glutationa no meio de forma rápida e quase idêntica para atingir uma concentração de cerca de 250 pM quando são res suspendi dos a uma concentração de 16,7 g (p.s.) L_1.

Em termos de teor em glutationa dos produtos testados, podem-se deduzir os valores seguintes:

Tabela 5 : Teor em glutationa

Produto Teor em GSH (mg/g.(p.s.)) SI 4,5 OW 5,5 45 de dois tipos de células de leveduras, respectivamente (i) células de levedura não viáveis e aptas a consumir rapidamente oxigénio e (ii) células de levedura inactivadas enriquecidas em glutationa, na conservação de vim liquido aquoso alimentar sensivel à oxidação, aqui vim vinho branco. A. Material e métodos

Foram definidas quatro modalidades (ver tabela 6 abaixo) com 5 repetições, ou seja 5 frascos de 50 mL por modalidade.

Tabela 6 : Modalidades comparadas

Modalidade Código Controlo T Borras frescas isoladas L Optiwhite® isolado OW Borras frescas + Optiwhite® L+OW A.l. Preparação : 3 em 2x5=10 mL ou 8,6.1011 )0 mg/frasco ou , ou seja 300 outros frascos * borras : total de células = 4,3.1011 divididaí frascos, ou seja 4,3.1010 células para cada 50 células / litro. * OW: 250 mg dividido por 5 frascos, ou seja 1 g/L. * Alginato : 1500 mg dividido por 5 frascos mg/frasco ou 6 g/L. Para além dos frascos Controlo, todos os continham 6 g de esferas de alginato. 46 A.2. Vinho utilizado

Utilizámos um vinho de Sauvignon branco da região do Gers, vinificado pelos cuidados da cave experimental do INRA-Pech Rouge. Este vinho muito sensivel à oxidação apresente notas aromáticas muito fortes devidas a uma quantidade significativa de tióis sulfurosos varietais. Este vinho comporta no inicio da experimentação uma concentração em SO2 livres de 15 mg/L. A.3. Medições de oxigénio dissolvido

Utilizámos o sistema PRESENS modelo Fibox3 Trace-V3 baseado em fluorescência. São coladas duas pastilhas de referência SB3 de cerca de 5 mm de diâmetro no interior de 2 frascos por modalidade (ou seja um total de 8 frascos e 16 pastilhas) . Duas outras pastilhas são colocadas numa garrafa cheia de água. A medição de oxigénio é realizada directamente com auxílio de uma fibra óptica através do vidro. Não se calibrou previamente o aparelho, alternativamente, registou-se quotidianamente o valor de oxigénio dissolvido na garrafa de água em condições de saturação e verificou-se que correspondia aos valores teóricos fornecidos por tabelas. A.4. Medições de luminosidade e cor A cor é medida com um colorímetro MINOLTA equipado com uma sonda SPR200 para objectos sólidos, que nos fornece directamente L, a e b (CIE 1976) . A sonda é aplicada no frasco, dispõe-se uma placa branca do outro lado em contacto com o vidro e realiza-se a medição. 0 aparelho não é previamente calibrado, mas toma-se uma referência numa placa 47 branca antes e depois de cada série de medições e verifica-se que é estável ao longo do tempo. A. 5. Compostos aromáticos A análise foi realizada por Laurent DAGAN (sociedade NYSEOS SARL, Montpellier, França). B. Resultados B.l. Oxigénio dissolvido

Os resultados das medições de quantidade de oxigénio dissolvido ao longo do tempo de conservação são representados na Figura 1.

Durante os dois meses de armazenamento à temperatura ambiente, o frasco Controlo (sem tratamento) apresenta um nivel de oxigénio dissolvido claramente mais elevado do que as três outras modalidades. Uma perturbação que afecta todos os frascos tratados surge entre os 15 e os 20 dias de tratamento, mas a partir desta altura e até ao final do ensaio os teores em oxigénio das modalidades Borras, OW e borras+OW diminuem lentamente e de modo contínuo sem cessar.

Relativamente à perturbação observada nos frascos com tratamento, pode-se avançar a seguinte explicação : durante os 14 primeiros dias, as borras e o OW contidos nas três modalidades Borras, OW e Borras+OW consomem rapidamente o oxigénio presente do vinho, dai a rápida diminuição da tensão de oxigénio observada. Esta capacidade de consumo rápido do oxigénio parece abrandar ao fim de 14 dias, e o oxigénio 48 dissolvido volta a subir nestas três modalidades. Estabelece-se então um novo equilíbrio entre o oxigénio consumido e o oxigénio que penetra nos frascos ao nível das tampas de rosca.

Com mais de 4 mg/L, os níveis de oxigénio dissolvido após 50 dias são muito elevados e atestam a manutenção no vinho de uma forte capacidade de oxidação para todas as modalidades. B.2. Luminosidade e cor.

Os resultados das medições de cada um dos parâmetros "L", "a" e "b" são representados na Tabela 6 abaixo. 49

Tabela 7 : Medição dos parâmetros L, a e b durante o tempo de conservação 5 Ο

Tempo Controlo Borras OH Borras + OH (dias) 1 ã b 1 a b L a b L a b 0 35,40 -0,37 5,10 35,39 -0,39 5,07 35,45 -0,44 5,11 34,80 -0,31 5,01 5 35,47 0,26 5,46 33,60 0,23 4,02 36,45 0,18 5,27 35,55 0,23 4,93 8 35,94 0,50 5,30 36,31 0,24 4,65 36,55 0,21 4,90 35,25 0,33 4,60 12 35,51 0,67 5,03 37,10 -0,23 4,41 35,67 -0,05 4,43 36,26 0,15 4,65 15 35,67 0,75 5,19 36,64 -0,51 4,16 36,20 -0,18 4,61 36,84 -0,30 4,73 19 35,41 0,79 5,27 36,85 -0,70 4,03 36,27 -0,20 4,65 37,02 -0,70 4,22 22 35,46 0,93 5,21 37,59 -0,75 4,06 36,51 -0,19 4,61 37,41 -0,78 4,21 26 34,77 0,91 4,97 37,57 -0,82 3,94 36,46 -0,22 4,56 37,55 -0,83 4,21 29 35,07 1,03 5,32 37,36 -0,62 4,16 35,67 -0,01 4,42 36f 46 -0,60 4,01 33 35,25 1,12 5,22 37,07 -0,59 3,92 36,10 0,02 4,57 37,60 -0,70 4,20 37 35,05 1,18 5,19 37,55 -0,57 4,29 36,23 0,01 4,88 36,70 -0,52 4,13 41 35,42 1,19 5,65 37,03 -0,49 4,19 35,61 0,10 4,64 37,20 -0,53 4,32 44 34,96 1,16 5,45 36,73 -0,49 4,46 35,66 0,12 4,82 36,55 -0,49 4,27 47 35,43 1,15 5,89 37,17 -0,50 4,40 36,5 0,11 5,02 36,72 -0,48 4,28 50 34,92 1(19 5,69 37,38 -0,42 4,57 35,37 0,25 4,84 37,20 -0,41 4,56 54 34,64 1,17 5,84 36,49 -0,40 4,36 36,07 0,12 5,34 36,23 -0,36 4,39 • Evolução do parâmetro cromático "L" 50

Os resultados são igualmente representados na Figura 2a. A luminosidade corresponde à taxa de luz branca na cor do vinho. Quanto mais aumenta "L", menos a amostra é escura. "L" varia entre 0 e 100. A evolução ao longo da conservação é primeiramente caótica, depois a luminosidade das amostras estabiliza-se ao fim de 2 semanas e as modalidades são sempre classificadas na mesma ordem de luminosidade crescente:

Controlo < OW < Borras = Borras+OW • Evolução do parâmetro cromático "a". Os resultados são igualmente representados na Figura 2b. "a" evolui do verde ao vermelho. Nos vinhos, o aumento de "a" traduz uma evolução oxidativa da cor. O parâmetro "a" aumento desde a primeira semana de armazenamento. De seguida ocorre uma separação muito nitida entre os frascos "Controlo" para os quais o parâmetro "a" continua a aumentar, e as três outras modalidades para as quais este parâmetro diminui nitidamente entre 7 e 20-25 dias antes de voltar a aumentar lentamente, à mesma velocidade que o Controlo.

No final dos ensaios, as 4 modalidades são nitidamente diferenciadas.

Segundo "a" crescente: Borras = Borras+OW < OW < Controlo • Evolução do parâmetro cromático "b" . Os resultados são igualmente representados na Figura 2c. O parâmetro "b" mede as proporções de azul (valores negativos) ou de amarelo (valores positivos) da cor do vinho. 51 0 parâmetro cromático "b" evolui pouco ao longo do tempo, mas significativamente. A partir de 2 a 3 semanas, as 4 modalidades são assim discriminadas, segundo um parâmetro "b" crescente:

Borras = Borras+OW < OW < Controlo B.3. Compostos aromáticos 0 3-Mercapto-Hexanol (3MH) e o seu acetato (3MHA) são duas moléculas típicas dos aromas específicos da casta Sauvignon branca. Estas duas moléculas compreendem uma função tiol e são então particularmente sensíveis à oxidação. Os resultados das medições do teor destes dois compostos após uma duração de conservação de 60 dias são representados na Tabela 8 abaixo.

Tabela 8 3-Mercapto-Hexanol (ng/L) Acetato de 3-Mercapto-Hexanol (ng/L) Borras 403 221 OW 892 256 Borras+OW 945 379 Limiar de percepção 60 8 olfactiva humana A perda em tióis varietais é mais importante para a modalidade Borras, e menos importante para as modalidades Borras+OW e OW. 52 A evolução das concentrações é coerente para as três modalidades tendo contidas esferas de alginato. 0 OW seria mais eficaz do que as Borras isoladas, havendo uma adição dos efeitos de protecção dos tióis na modalidade Borras+OW.

Padrão < Borras < OW < Borras+OW B.4 . Análise sensorial.

As amostras foram degustadas no final do ensaio, a 24 de Maio de 2007, por dois enólogos : os enólogos 01 e 02. • Comentários enólogo 01.

Os vinhos mais intensos em aroma são as modalidades Borras e Borras+OW de modo equivalente, OW é o menos intenso. • Comentários enólogo 02.

Cores muito diferentes :

Controlo = amarelo a puxar para o acastanhado / rosado Borras = amarelo / muito pouco rosado OW = amarelo / um pouco rosado Borras+OW = amarelo franco

Aromas :

Controlo = potente, metade componente "tiol", metade aromas de oxidação

Borras+OW = o mais fino : aromas "tióis" discretos mais presentes, ausência de aromas de oxidação 53

Borras e OW : intermédios

Boca :

Controlo = muito mais pesado, oxidado

Borras+OW = o mais agradável e com melhor equilíbrio em boca

Borras e OW = intermédios Balanço :

Controlo < Borras = OW < Borras+OW Não é perceptível nenhum sabor de levedura.

Finalmente, a modalidade Borras+OW confere ao vinho a vantagem qualitativa nos 3 descritores sensoriais: cor, aroma no nariz, percepção em boca. 0 controlo é inegavelmente o pior classificado pelas suas propriedades sensoriais.

Conclusões

Todos os frascos foram conservados a mais de 20°C com teores em oxigénio dissolvido superiores a 4 mg/L. Estas condições são muito favoráveis às oxidações. • DO a D5.

As 4 modalidades têm o mesmo comportamento : diminuição do oxigénio dissolvido associado ao vinho ou aos seus aditivos (SO2), aumento do parâmetro cromático "a" nas mesmas proporções. 54 D5 a Dl4.

Para as 3 modalidades Borras, OW e Borras+OW, existe uma diminuição do parâmetro cromático "a". Como tem ainda muito oxigénio dissolvido em todos os frascos, esta evolução diferente mostra que existe de facto uma interacção proveniente das esferas de alginatos, uma vez que a oxidação dos polifenóis permanece limitada. Pelo contrário, os tióis foram oxidados como mostram as análises de aromas.

Pelo contrário, no Controlo, o parâmetro "a" aumenta, logo a oxidação dos polifenóis continua. Tal envolve o aparecimento de uma certa cor castanha no vinho.

Um abaixamento mais significativo do oxigénio dissolvido é bem observado nas modalidades Borras, OW e Borras+OW. 0 próprio alginato poderia ter sequestrado uma parte do oxigénio, mas então seria este oxigénio a ser consumido pelas borras ou OW; não seria de novo difundido de seguida para o vinho. E mais provável que a capacidade de consumo em 02 das borras e de OW se tenha tornado nula ao fim de 14 dias por saturação dos sistemas implicados. • Dl4 a D20. 0 oxigénio dissolvido volta a aumentar nas 3 modalidades : Borras, OW, Borras+OW. É verosímil que tal traduza a diferença entre a penetração do oxigénio pela tampa de rosca, e o seu consumo pelo vinho, as borras e/ou OW. Esta hipótese é reforçada pelos resultados da modalidade Controlo, que atinge um nivel estável de oxigénio dissolvido bem superior a 55 todos os outros frascos, à falta de um sistema consumidor de oxigénio. • D20 a D25. 0 oxigénio dissolvido estabiliza e recomeça a decrescer regularmente e à mesma velocidade para todas as modalidades. Desde D5 até D25, o parâmetro cromático "a" continua a baixar e atinge o seu valor mínimo para as modalidades Borras, OW e Borras+OW. • D25 a D54.

Todas as modalidades seguem a mesma evolução : aumento moderado do parâmetro cromático "a" e diminuição moderada do oxigénio dissolvido.

Em conclusão, mesmo com um efeito negativo nas concentrações em 3MH e o seu éster, as modalidades com borras, OW e sobretudo Borras+OW proporcionam um vinho qualitativamente melhor que o Controlo. Tal ilustra todo o interesse desta abordagem, as possibilidades que oferece para proteger em simultâneo a cor e os aromas do tipo tióis voláteis.

Relativamente aos aspectos sinérgicos ou antagonistas dos dois sistemas antioxidantes colocados em presença, utilizando uma escala de notação de 1 (menos eficaz) a 3 (muito eficaz), pode ser construída a tabela 9 recapitulativa seguinte: 56

Tabela 9

Caracteristicas testadas Controlo Borras OW Borras + OW Consumo de oxigénio 1 3 2 2 Aumento do parâmetro "L" 1 3 2 3 Diminuição do parâmetro "a" 1 3 2 3 Diminuição do parâmetro "b" 1 3 2 3 Manutenção dos tióis varietais 1 2 3 3 Nota organoléptica 1 2 2 3 Nota total = soma das notas 6/18 6/18 13/18 17/18 0 efeito antioxidante resultante dos dois sistemas antioxidantes utilizados não é então a simples justaposição dos efeitos antioxidantes dos dois sistemas tomados separadamente. Eles complementam-se nas suas respectivas acçoes e conduzem a uma protecção eficaz do vinho em conservação contra os fenómenos de oxidaçao, quer seja ao nível da cor, da preservação de aromas varietais sensíveis à oxidação, e mais geralmente ao nível a qualidade organoléptica. 57

Exemplo 5 : Ensaios semi industriais em vinho branco : ensaios em garrafão em vinho A. Material e Métodos

Acondicionou-se vinho branco de Villaray, previamente saturado em oxigénio, num garrafão de vidro fechado de forma estangue sob árgon por uma rolha Sovirel com junção de Teflon.

Introduziram-se esferas de alginato contendo ou leveduras Kl (leveduras que apresentam um consumo rápido de oxigénio) a uma concentração final equivalente a 2,3 106 células/mL e leveduras inactivadas Optiwhite® (leveduras mortas que libertam glutationa) a uma concentração final equivalente de 0,35 mg/mL em lotes de garrafões "ensaios", sendo os restantes garrafões "controlos" conservados na ausência de esferas.

Os garrafões foram conservados 15 dias à temperatura ambiente (simulação da conservação de vinho), depois sacrificados ao longo do tempo para medir : 1) o teor em oxigénio dissolvido residual, 2) o potencial de oxidorredução do vinho, 3) o teor em glutationa do vinho, e 4) as caracteristicas cromáticas do vinho. B. Resultados

Realizaram-se as medições (i) do teor em oxigénio dissolvido, (ii) do potencial de oxidorredução e (iii) do teor em glutationa do vinho. Os resultados são apresentados na Tabela 10 abaixo. 58

Tabela 10 : medição do oxigénio dissolvido

Controlo Ensaio Oxigénio Poten- Oxigénio Poten- dissol- ciai Gluta- dissol- ciai Gluta- Tempo vido Redox tiona vido Redox tiona (Dias) (mg/L) (mV) (mg/L) (mg/L) (mV) (mg/L) 0 7, 1 191 0,39 7, 1 191 0,39 1,8 3,7 185 - 2,4 155 2,8 2,53 177 0,39 1,5 130 20, 8 3, 8 2,2 185 0,38 0,98 129 20, 1 4,8 1, 87 187 0,47 0,21 105 17, 0 5, 8 2 186 0,48 0,24 91 16,3 11, 7 0 168 0,49 0 68 14, 1 5.1 Teor em oxigénio dissolvido residual

Os resultados das medições do oxigénio dissolvido residual são representadas na Tabela 10 abaixo, assim como na Figura 3a. 5.2 Potencial de oxidorredução

Os resultados das medições do potencial de óxido-reduçao são representados na Tabela 10 abaixo, assim como na Figura 3b 5.3 Teor em glutationa do vinho

Os resultados do teor em glutationa sao representados na Tabela 10 abaixo assim como na figura 3c. 59 5.4 Características cromáticas do vinho

Os resultados das medições das características cromáticas do vinho são apresentadas na Tabela 11 abaixo assim como nas figuras 4a (parâmetro "L"), 4b (parâmetro "a") e 4c (parâmetro "b").

Tabela 11

Tempo (Dias) Controlo Ensaio L A b L a 0 98,75 -0,66 4, 29 98, 75 -0,66 4, 29 2,8 98, 75 -0,66 4, 29 98,34 -0,74 3,98 3,8 98,05 -0,63 5, 15 98, 8 -0,79 4,1 4,8 97, 75 -0,65 5, 26 99, 13 -0,79 3,93 5, 8 97, 78 -0,62 5, 06 99,111 -0,77 3,72 11, 7 97, 78 -0,71 6,15 99,12 -0,83 3, 85 A presença de esferas de alginato contendo as borras e o Optiwhite permite uma diminuição mais precoce e rápida do oxigénio dissolvido no vinho. Tendo em vista as características cromáticas dos vinhos, este consumo de oxigénio pelas borras permitiu preservar os constituintes polifenólicos do vinho de uma oxidação prejudicial pelo oxigénio (mantém parâmetros L e b*, correspondentes respectivamente à clareza, e à coloração amarela do vinho). A libertação da glutationa pelas esferas permitiu baixar sensivelmente o potencial de oxidorredução do vinho, garantia de uma manutenção potencial de compostos voláteis sensíveis à oxidação (por exemplo, tióis varietais). 60

Exemplo 6 : Ensaios semi industriais em vinho branco :

Ensaios em BIB® em vinho A. Material e Métodos

Numa linha de engarrafamento em BIB® de vinho branco de Sauvignon (sociedade Skalli SARL Fortant de France, Sète), adicionaram-se filamentos de alginato contendo borras de leveduras Kl antes de se engarrafar numa linha a uma concentração equivalente de 2,3 105 células/mL.

Acondicionaram-se 30 BIB® de 3 litros, dos quais 15 lotes "controlo" e 15 lotes "ensaio". Os BIB® são conservados depois do seu enchimento (5/10/2006) a 21°C. Estão previstas recolhas regulares num período que cobre 6 meses a um ano. B. Resultados

Os resultados apresentados apenas se referem às primeiras amostras recolhidas e analisadas. Não obstante os valores iniciais muito diferentes entre os lotos controlo e de ensaio (devidos às manipulações iniciais dos recipientes: abertura, introdução manual dos filamentos), pode-se constatar uma queda muito visível do teor em oxigénio do vinho na presença das borras.

Os resultados das medições do teor em oxigénio dissolvido são apresentados na Tabela 12 abaixo. A Tabela 12 representa a evolução do teor em oxigénio dissolvido de um vinho conservado em BIB® controlo sem se colocar em contacto com a composição segundo a invenção. 61

Tabela 12

Tempo (dias) Oxigénio dissolvido (mg/L) Controlo 1 Controlo 2 Ensaio 1 Ensaio 2 0,00 19,00 0,66 0,89 2, 78 3,44 36,00 0,70 1,28 2, 19 2,80 O o LO 0,86 1,12 1,58 1,67

Os resultados de medição das características cromáticas do vinho são representados na Tabela 13 abaixo. A Tabela 13 representa a evolução das caracteristicas cromatográficas "L" e "b" da CIE 1976 de um vinho conservado em BIB® controlo ("Controlo" e a evolução das caracteristicas cromatográficas "L" e "b" da CIE 1976 de um vinho conservado em BIB® colocado em contacto com a composição segundo a invenção ("Ensaio"). Os resultados são representados em função do número de dias de conservação a 30°C.

Tabela 13

Tempo Controlo Ensaio (Dias) L b L b L b L b 36,00 49,61 9,69 50,5 9, 48 51,46 10,04 49, 77 10,01 54, 00 50,35 10, 43 52, 08 10,81 49,8 11,64 49,68 11,06

Os parâmetros cromáticos do vinho evoluem para uma diminuição (ou manutenção) do parâmetro L na presença das borras imobilizadas (enquanto que apresenta uma tendência de aumento nos lotes controlo). Verifica-se, tal como no ensaio precedente, um aumento mais significativo do parâmetro b* nos 62 lotes dos ensaios, o que significa um aumento mais forte do carácter amarelo dos vinhos.

Exemplo 7 : Superfícies de contacto entre as leveduras enriquecidas em glutationa e o oxigénio dissolvido São fornecidos abaixo a titulo indicativo exemplos de superfície de contacto entre as células de leveduras e o oxigénio dissolvido:

Exemplo : 2,3 109 leveduras / L e 350 mg/L de Opti-White (1,17 IO10 células/L)

Exemplo : 8,6 1011 leveduras /Lei g/L de Opti-White (3,33 IO10 células/L)

Uma levedura de vinificação apresenta uma superfície equivalente média à volte de 80 μια2 (SALMON, 1997 - Enological fermentation kinetics of an isogenic ploidy series derived from an industrial Saccharomyces cerevisiae strain. Journal of Fermentation and Bioengineering, 83 (3), 253-260). A superfície de contacto entre leveduras e vinho foi então compreendida entre 1,4 IO10 * 80 e 8,9 1011 * 80 ou seja entre 1 1012 e 7 1013 pm2 /L, nos presentes ensaios ilustrativos. consumir rapidamente o oxigénio para além das borras e comparação da utilização de leveduras não viáveis (inactivadas por tratamento químico) ou de leveduras viáveis 63 A. Material e métodos A.l. Preparação :

Um mesmo lote de leveduras secas activas (estirpe EC1118, Lallemand, Blagnac) está incorporado em alginato sob formas viáveis ou não viáveis (inactivação térmica de 5 minutos a 74°C, ou seja um log UP de 2,48) e revestido à volta de esferas de látex natural. Estas esferas de látex são depositadas em garrafas brancas de 1 litro, cheias a meio com vinho. 0 vinho branco utilizado é um vinho de Sauvignon não sulfitado. A concentração em células de levedura por garrafa é de cerca de 2xl010 células, repartidas à superfície de uma vintena de esferas de látex. As garrafas são fechadas por rolhas estanques de polietileno e incubadas a 20°C durante 500 horas. A.2. Medições de oxigénio dissolvido:

Utilizámos o sistema PRESENS modelo 5 Fibox3 Trace-V3 baseado em fluorescência. São coladas duas pastilhas de referência SB3 com cerca 5 mm de diâmetro no interior de cada garrafa utilizada (uma na fase gasosa, a outra na fase líquida) . A medição de oxigénio é realizada directamente com auxílio de uma fibra óptica através do vidro. O valor de oxigénio dissolvido numa garrafa de água à saturação é utilizado para a calibração diária. A.3. Medições de turbidez : A turbidez final dos vinhos é medida graças a um turbidimetro HACH (modelo 58357-00). B. Resultados B.l. Consumo de oxigénio e turbidez:

Se bem que as leveduras viáveis apresentam actividades de consumo de oxigénio sensivelmente iguais àquelas observadas com as células inactivadas termicamente, parece nitidamente (Tabela 1) que a encapsulação no alginato de leveduras viáveis conduz a uma libertação não negligenciável de leveduras no meio (aumento significativo da turbidez do vinho), o que não sucede com leveduras inactivadas. Esta libertação no meio corresponde a um fraco crescimento das leveduras viáveis no sei das camadas de alginato e a uma disseminação destas estirpes no vinho. Este fenómeno é prejudicial para a qualidade final do produto acabado. 65

Tabela 14 : Valores das populações iniciais inoculadas por garrafa e finais, da turbidez do meio e do oxigénio dissolvido consumido após 500 horas de incubação a 20aC.

População inicial (células/mL) População final (células/mL) Turbidez (NTU) Oxigénio dissolvido total consumido (mg/L) Leveduras viáveis 3,4x10' 10,54x10' 18 1,24 Leveduras inactivadas termicamente 5,8x10' 5,0x10' 7 1,61 Vinho isoladamente 0 0 5 0,86 02-11-2011 6 6

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição para proteger da oxidação um liquido alimentar contendo substâncias sensíveis à oxidação ao longo da sua conservação compreendendo uma combinação de dois tipos de células de leveduras: (i) células de leveduras não viáveis e aptas a consumir rapidamente o oxigénio, apresentando as referidas células de levedura uma velocidade de consumo de oxigénio de pelo menos 5 ng 02.s_1 para IO10 células de levedura quando estão presentes a uma concentração da ordem de 108 células/mL num tampão hidroalcoólico, e (ii) células de levedura inactivadas enriquecidas em glutationa.
2. 2. Composição segundo a reivindicação 1 caracterizada pelo referido líquido aquoso alimentar ser uma bebida fermentada.
3. 3. Composição segundo as reivindicações 1 e 2 caracterizada pelo referido líquido aquoso alimentar ser um vinho.
4. 4. Composição segundo as reivindicações 1 a 3 caracterizada pelo referido líquido aquoso alimentar ser um vinho branco.
5. 5. Composição segundo a reivindicação 1 caracterizada pelas referidas células de levedura não viáveis e aptas a consumir rapidamente o oxigénio consistirem em borras de levedura provenientes da fermentação.
6. 6. Composição segundo as reivindicações 1 e 5 caracterizada pelas referidas células de levedura não viáveis e aptas a consumir rapidamente oxigénio serem da espécie Saccharomyces cerevisiae.
7. 7. Composição segundo a reivindicação 1 caracterizada pelas 1 células de levedura inactivadas ricas em glutationa serem leveduras de tipo enológico.
8. 8. Composição segundo as reivindicações 1 e 7 caracterizada pelas células de levedura inactivadas enriquecidas em glutationa serem leveduras da família das Saccharomyces.
9. 9. Composição segundo as reivindicações 1, 7 ou 8 caracterizada pelas células de levedura inactivadas ricas em glutationa serem capazes de libertar no meio onde se encontram uma quantidade de glutationa de pelo menos 1% de glutationa em peso em relação ao peso total de matéria seca da levedura.
10. 10. Composição segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizada pelas referidas células de levedura serem incluídas num sistema de imobilização permeável ao referido líquido realizado num material compatível com as normas alimentares.
11. 11. Composição segundo a reivindicação 10 caracterizada pelo referido sistema de contenção ser escolhido entre o grupo dos capilares membranares, dos tubos de silicone ou de alginato sob a forma de esferas ou de filamentos.
12. 12. Composição segundo as reivindicações 10 e 11 caracterizada pelo referido sistema de imobilização ser alginato sob a forma de esferas ou de filamentos.
13. 13. Processo de estabilização, durante a sua conservação, de um líquido aquoso alimentar, contendo substâncias sensíveis à oxidação, durante a conservação compreendendo colocar em contacto o meio constituído pelo referido líquido com uma composição segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
14. 14. Composição segundo a reivindicação 13 caracterizada pela superfície de contacto entre as leveduras postas em jogo no 2 sistema de imobilização e o referido liquido aquoso alimentar ser de pelo menos 1012 pm2/L e seja repartida de modo homogéneo na totalidade do referido liquido, enquanto que o teor de oxigénio dissolvido no referido liquido aquoso alimentar é de pelo menos 0,1 mg/L do referido liquido.
15. 15. Processo segundo a reivindicação 13 caracterizado pela superfície de contacto entre as leveduras postas em jogo no sistema de imobilização e o referido líquido aquoso alimentar ser de pelo menos 1012 pm2/L e seja mais importante nos pontos de contacto entre o referido líquido e os pontos de penetração do oxigénio no recipiente, repartida de modo homogéneo na totalidade do referido líquido, enquanto que o teor de oxigénio dissolvido no referido líquido aquoso alimentar é no máximo 99 pg/L do referido líquido.
16. 16. Utilização da composição da reivindicação 1 para a preservação contra os efeitos da oxidação de líquidos contendo substâncias sensíveis ao oxigénio ao longo da sua conservação. 02-11-2011 3