PT2274005E - Tratamento de doenças tumorais pela enzima conversora de angiotensina 2 (ace2) - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"TRATAMENTO DE DOENÇAS TUMORAIS PELA ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA 2 (ACE)" A invenção refere-se ao tratamento de doenças tumorais.

Segundo indicações da sociedade americana do cancro (American Câncer Society), nos países industrializados, 5,4 milhões de pessoas, por ano, irão adoecer com cancro, nos países menos industrializados um total de 6,7 milhões, o que eleva o número de novos casos de cancro para mais de doze milhões por ano. Actualmente um total de 7,7 milhões de pessoas morre anualmente em todo o mundo devido a um tumor. As três doenças cancerígenas mais frequentes nos países industrializados são os tumores na próstata, pulmão e intestinos, em que as mulheres sofrem mais frequentemente de cancro da mama, intestino e pulmão. Dado que as doenças infecciosas se tornaram domináveis e as pessoas ficam cada vez mais velhas, as doenças cancerígenas ocupam uma posição cada vez mais relevante nas estatísticas de mortalidade dos países industrializados.

Nos países em desenvolvimento o panorama é diferente: aqui as doenças cancerígenas mais frequentes dos homens são o cancro do pulmão, estômago e fígado. As mulheres sofrem mais frequentemente de cancro da mama, colo do útero e estômago. Neste caso, o cancro do estômago e do colo do útero são, em regra, a consequência de uma infecção. 1

No total, atribuíveis a frequentemente desenvolvimento. consequência de seis porcento. 15 porcento de agentes pat as pessoas Entre estes, infecções, em todos os cas génicos que que vivem 26 porcento países indust >s de cancro sao afectam mais em países em dos tumores são rializados apenas

Na Áustria, bem como em outros estados industrializados, as doenças cancerígenas são a segunda causa de morte mais frequente, apenas superada pelas doenças do sistema cardiovascular. Na Alemanha, aproximadamente 395000 pessoas adoecem anualmente com cancro, destes, por volta de 195000 são mulheres e 200000 homens. A maioria dos casos ocorre em idades acima dos 60 anos. Aqueles com idades abaixo dos 60 anos, aproximadamente 107000 casos, contabilizam apenas por volta de um quarto dos novos casos de doentes com cancro.

Muitas terapias de tumores, tais como, p. ex., radioterapia, quimioterapia ou a remoção cirúrgica de tumores, estão estabelecidas há anos e são continuamente refinadas e melhoradas. As novas terapias compreendem imunoterapias, terapias que estão orientadas para a angiogénese ou então para marcadores específicos de células tumorais, que utilizam, p. ex., anticorpos monoclonais.

Apesar da melhoria das possibilidades terapêuticas para muitos tumores que foram desenvolvidas nos últimos 30 anos, a luta contra o cancro ainda não está ganha como, ainda no início da década de setenta, se esperava que acontecesse num futuro próximo. 2 A taxa actual de cura para o cancro, mesmo nos países industrializados situa-se em cerca de 30 a 65 porcento (EUA: 65 porcento), quando se reúne todas as diferentes doenças cancerígenas em ambos os sexos. No caso individual, contudo, as hipóteses de cura são muito diferentes: as hipóteses são frequentemente boas, desde de que a doença cancerígena permaneça localizada; se o tumor já se estiver disseminado para vários órgãos do corpo, as hipóteses são substancialmente mais reduzidas. De um modo geral, a detecção precoce de uma doença cancerígena é de extrema importância. Ademais, a resposta dos doentes a uma quimioterapia pode ser diferente, certas classes de substância activa são completa ou quase completamente ineficazes para alguns doentes.

Tanto o documento US 6194556 como o documento US 7482171 (ambos aqui incorporados por referência) descrevem sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da ACE2, variantes funcionais, bem como ensaios para determinar a actividade da ACE2.

Zhou et al. (Tohoku J. Exp. Med. 217 (2009): 123-131; aqui incorporado por referência) descrevem alterações da concentração de ang II e valores de expressão da ACE2 em tecido de adenocarcinoma do pâncreas (Pancreatic Ductal Adenocarcinoma -PDAC) . Descobriu-se que a ang II se acumula em linhas celulares do PDAC e regula negativamente a expressão da proteína ACE2. Apontou-se para o facto de a relação de ACE/ACE2 ser particularmente importante e de um desequilíbrio nesta poder conduzir a diversas doenças e de estar envolvido na patogénese do PDAC. O ACE2 foi, por conseguinte, proposto como alvo molecular para o tratamento do PDAC. 3

Um problema particular em muitos métodos de tratamento sao os efeitos secundários severos. Os doentes de cancro morrem frequentemente não devido à doença tumoral, mas devido aos produtos e métodos empregues para lutar contra o tumor.

Existe ainda, por conseguinte, uma grande necessidade de melhorias inovadoras para a terapia de tumores, em particular, de terapias que sejam efectuadas à base de produtos endógenos e que não tenham quaisquer efeitos secundários ou efeitos secundários apenas reduzidos. 0 objectivo da presente invenção é, por conseguinte, disponibilizar terapias para doenças tumorais que sejam eficientes e não apresentem quaisquer efeitos secundários ou, pelo menos, quaisquer efeitos secundários severos.

Em conformidade com isto, a presente invenção refere-se à utilização de um polipéptido com actividade de enzima conversora de angiotensina 2 (angiotensin converting enzyme 2; ACE2) para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças tumorais, com excepção do cancro de pulmão.

De acordo com a presente invenção, tratam-se doenças tumorais com actividade da ACE2. Neste caso, verificou-se que a actividade da ACE2 tem a capacidade de reprimir eficientemente o crescimento de células tumorais, sem que seja necessário temer efeitos secundários devidos a esta actividade.

Durante décadas, foram atribuídas predominantemente funções de homeostasia e sobretudo de regulação da pressão sanguínea ao sistema de renina angiotensina (SRA). Durante os últimos anos detectaram-se contudo propriedades adicionais do SRA e alargou- se o seu raio de acção para funções essenciais, tais como a 4 proliferação celular, a angiogénese, a inflamação e a transformação patológica de tecidos. A angiotensina II (ang II) representa, neste caso, um péptido chave do SRA "activado" que, na qualidade de regulador positivo do SRA, apresenta propriedades vasoconstritoras, hipertensivas, pró-inflamatórias, proliferativas e pró-angiogénicas. A ang II contribui ainda para a formação de superóxidos reactivos. Todas estas propriedades favorecem a degeneração celular e contribuem para a formação de células filhas malignas. A célula degenerada serve-se assim da vascularização para crescer para um tumor primário. Constatou-se que a ang II está presente em quantidades aumentadas em diversas doenças tumorais sólidas. A "enzima conversora de angiotensina" (ACE), que converte o decapéptido angiotensina I em ang II é a enzima com uma responsabilidade determinante para a produção de ang II. Como parte de uma cascata reguladora da pressão sanguínea (novamente do SRA), a ACE detém uma posição central na regulação da pressão sanguínea, em particular. Uma elevada actividade da ACE aumenta a tonicidade dos vasos sanguíneos e, deste modo, a pressão sanguínea. A inibição da ACE é, por conseguinte, um princípio terapêutico bem-sucedido para o tratamento da hipertensão (hipertonia). Os inibidores da ACE, tais como o captopril, enalapril, lisinopril e ramipril, contam-se entre as substâncias farmacêuticas mais transaccionadas. Com base nas considerações acima, os inibidores da ACE foram, por conseguinte, também propostos e utilizados, desde há bastante tempo, no domínio da terapia de tumores.

Neste contexto, foi também possível mostrar que em muitas doenças tumorais sólidas, para além de uma concentração aumentada de ang II, constata-se também uma sobrexpressão 5 significativa dos seus receptores ATI e AT2 (AT1R e AT2R). A ang II contribui, neste caso, substancialmente para a neovascularização tumoral e a partir dai para a invasão tumoral. Esta promove ainda a fosforilação por proteínas quinases activadas por mitógeno (MAP), bem como a secreção do VEGF. Ambos os mecanismos foram reconhecidos como sendo relevantes na formação e sustento de tumores sólidos. Clinicamente, uma expressão aumentada de AT1R está correlacionada com títulos aumentados de VEGF e um prognóstico de vida consideravelmente encurtado.

Por conseguinte, no seguimento dos inibidores da ACE, foi também proposto o número crescente de antagonistas do AT1R (portanto inibidores específicos no subtipo 1 do receptor de angiotensina II, cuja estimulação por ang II conduz ao efeito hipertensor), tais como, p. ex., losartan, valsartan, candesartan, eprosartan, irbesartan, telmisartan ou olmesartan, no domínio do tratamento de tumores.

Apesar do seu sucesso (comercial) no domínio da diminuição da pressão sanguínea, a utilização de inibidores de ACE ou de antagonistas do AT1R está todavia também associada a desvantagens, tais como, p. ex., os efeitos secundários parcialmente severos.

Os conceitos dos tratamentos de tumores à base de inibidores da ACE ou de antagonistas do AT1R, propostos até à data, também ainda não se afirmaram, ainda que tenham sido feitas propostas desse género muito pouco tempo após os primeiros inibidores da ACE (captopril 1974; desde 1981 no mercado) ou antagonistas do AT1R (losartan desde 1996 no mercado). Em qualquer caso, este mecanismo parede de facto ser 6 interessante do ponto de vista cientifico, mas não foi possível, até à data, concretizar uma utilização prática bem-sucedida no tratamento clínico de tumores numa base alargada.

Um péptido efector essencial adicional do SRA é a angiotensina 1-7 (ang 1-7). Este péptido é o antagonista perfeito para a ang II: Enquanto a ang II é um regulador positivo do SRA, a ang 1-7 pode ser considerada um modulador negativo do SRA. A ang 1-7 atenua os efeitos da ang II e apresenta propriedades anti-hipertensivas, anti-inflamatórias, anti-proliferativas, anti-angiogénicas e vasodilatadoras. Esta activa a NO sintetase e reduz também a expressão do receptor ATI. A ang 1-7 inibe igualmente a fosforilação por MAP-quinases induzida por ang II. A ang 1-7 impede ainda, in vitro, o crescimento de linhas celulares de cancro de pulmão e o crescimento de tumores em modelos experimentais de tumores do murganho. Interessantemente, a ACE, a enzima que tem uma responsabilidade determinante para a produção de ang II, é inibida por ang 1-7. A ang 1-7 impede consequentemente a síntese do seu antagonista ang II. Foi também proposto empregar a ang 1-7 para o tratamento de tumores, contudo, em virtude do curto tempo de semi-vida deste péptido, é necessária uma perfusão contínua, que é muito inconveniente e na prática está associada a grandes restrições para o doente.

Interessantemente existe uma enzima chave do SRA que regula a relação entre a ang II activa e a ang 1-7 inactiva: esta enzima, a ACE2, foi descoberta em 1997, contudo a sua função mais importante como modulador do SRA foi apenas detectada no ano 2000. Esta, na qualidade de glicoproteína ancorada à membrana em diversos órgãos, tais como coração, rins, fígado e pulmão, mas também em vasos sanguíneos, converte ang II em 7 ang 1-7. A expressão da ACE2 é controlada por diversos estímulos, em que os mecanismos que lhe estão na base ainda não foram completamente esclarecido até à data. Foram já descritas diversas vias reaccionais adicionais que estão envolvidas na cooperação/regulação da ACE2. Possivelmente estão também por conhecer muitas vias reaccionais para além da conversão de ang II em ang 1-7. A ACE2 é regulada negativamente na presença de citocinas inflamatórias, o que pode conduzir, como consequência adicional, a uma acumulação patológica de ang II nos compartimentos afectados e a um dano no órgão.

Os processos inflamatórios em consequência de um dano num órgão ou após infecções virais ou bacterianas dão lugar a uma secreção de citocinas inflamatórias que reduzem a expressão endógena de ACE2 e, deste modo, a formação de ang 1-7 protectora. A ang II reactiva acumula-se, como consequência adicional, e potência o processo inflamatório emergente. Aumenta igualmente a concentração de espécies reactivas de oxigénio no tecido. Em combinação com as propriedades proliferativas e vascularizantes origina-se um clima crescentemente proliferativo, que promove, amplifica, a acumulação adicional de ang II. Para escapar deste círculo vicioso, o emprego de actividade da ACE2, de acordo com a invenção, demostrou ser surpreendentemente bem- sucedido na inibição do crescimento de células tumorais. Deste modo, uma administração terapêutica desta actividade permite reprimir, ou mesmo prevenir, com sucesso uma acumulação de ang II e enfraquecer assim também a inflamação e um meio proliferativo: através do aumento ou do restabelecimento da actividade da ACE2 são imediatamente captadas as concentrações ang II patologicamente aumentadas. Forma-se mais ang 1-7 que enfraquece igualmente a inflamação através do seu efeito anti-inflamatório. A ang 1-7 limita ainda a produção posterior de ang II através da sua propriedade inibidora da ACE. A ang 1-7 inibe a proliferação celular e diminui, como consequência adicional, a expressão do AT1R. 0 emprego de actividade da ACE2 é consequentemente uma estratégia terapêutica eficiente para o tratamento de diversas doenças tumorais, dado que esta permite reprimir a degeneração celular, a neovascularização de tumores em crescimento e a metastazição de tumores sólidos. 0 emprego, de acordo com a invenção, da actividade enzimática da ACE2 permite levar os sistemas moleculares de regulação, que foram desequilibrados pela doença tumoral, novamente para a direcção de um estado de partida estável através de uma actividade enzimática que o corpo conhece e que não apresenta, por conseguinte, qualquer propriedade estranha. Ao contrário das "pequenas moléculas" mais artificiais, cuja especificidade de acção, na maioria dos casos, é limitada e cujos produtos de degradação podem representar problemas para o metabolismo do doente, a actividade enzimática da ACE2 está de tal maneira envolvida nos processos de equilíbrio e de regulação do corpo, que são muito improváveis reacções secundárias inesperadas. Constatou-se também surpreendentemente que a ACE2 tem de facto a capacidade de levar os processos desequilibrados novamente para a direcção do estado e partida estável, mas não é possível chegar a um efeito contínuo que ultrapasse este equilíbrio para a outra direcção, apesar de uma elevada dosagem da actividade da ACE2. A excepção formal do cancro de pulmão do tipo de tumores a tratar de acordo com a invenção, prende-se com o documento WO 2004/000367 onde está descrita a utilização de ACE2 para o tratamento de doenças do pulmão. Neste caso, observaram-se danos 9 pulmonares severos em murganhos knockout para ACE2, que foi possível impedir ou reduzir através da toma de ACE2. Confirmou-se, com isto, um conceito terapêutico para o tratamento sintomático de danos pulmonares desse género, sobretudo no caso da síndrome de dificuldade respiratória aguda (SDRA), porque na SDRA observam-se danos pulmonares análogos. Eram também conhecidos danos pulmonares análogos no caso de outras doenças do pulmão, de modo que no documento WO 2004/000367 foi também proposta a utilização de actividade da ACE2 para outras doenças do pulmão à base do modelo animal aí divulgado, entre estas, também o tratamento de cancro de pulmão. É contudo claro que a divulgação do documento WO 2004/000367 não fornece quaisquer indicações, para o especialista, de alargar a utilização proposta para o tratamento de cancro de pulmão também para outras doenças tumorais. A divulgação do documento WO 2004/000367 esgota-se, para o especialista, na sugestão de empregar a actividade da ACE2 para o tratamento ou impedimento de danos pulmonares concretos que podem ser observados em diversas doenças do pulmão. O documento WO 2004/000367 não contém contudo qualquer divulgação dirigida para o tratamento específico e causal de cancro de pulmão ou para a redução do crescimento do tumor no pulmão ou das células degeneradas deste tumor. A proposta no documento WO 2004/000367 de alcançar uma melhoria da função pulmonar no cancro do pulmão através da ACE2 não oferece, por conseguinte, qualquer ensinamento técnico para a presente invenção, mas representa meramente uma sobreposição, formal, casual, pontual para o caso do cancro de pulmão. A presente invenção é aplicável num largo espectro de doenças tumorais, fundamentalmente em todos os casos onde o tumor é acompanhado por uma neovascularização por via da ang II, o que é o caso em todos os tumores sólidos e em muitas doenças 10 cancerígenas hematopoiéticas (pelo menos em alguns estádios de tais doenças malignas do sangue). A classificação estatística internacional de doenças e problemas relacionados com a saúde (ICD-10) classifica os tumores malignos segundo a sua localização. Os grupos de tumores a tratar, de um modo preferido, de acordo com a invenção, são classificados similarmente em concordância com tais grupos locais.

Em conformidade com isto, a doença tumoral a tratar de acordo com a invenção é seleccionada, de um modo preferido, de doenças tumorais do tracto reprodutivo, em particular cancro do ovário, cancro dos testículos, cancro da próstata ou cancro da mama, doenças tumorais do tracto digestivo, em particular, cancro do estômago, cancro do intestino, carcinoma rectal, cancro do pâncreas, cancro do esófago e cancro do fígado, cancro dos rins, melanomas ou neuroblastomas (em que, aqui, as expressões "cancro", "tumor", "carcinoma", etc. são sempre utilizadas como sinónimos e referem-se a doenças malignas. A presente invenção é particularmente adequada para impedir ou reduzir o crescimento das células tumorais. Este efeito pode ser utilizado vantajosamente em combinação com conceitos terapêuticos conhecidos. De um modo preferido, o tratamento com ACE2, de acordo com a invenção, é empregue, por conseguinte, em combinação com uma terapia de tumores convencional, em particular, em combinação com uma radioterapia, uma quimioterapia, uma hormonoterapia, uma terapia com anticorpos, uma "terapia dirigida" tal como, p. ex., inibidores da tirosina quinase, e/ou uma remoção cirúrgica do tumor. 0 tratamento de acordo com a invenção também pode ser empregue num estádio muito 11 precoce das doenças tumorais, o que aumenta consideravelmente as hipóteses de cura.

As terapias de tumores convencionais compreendem a cirurgia, portanto a remoção cirúrgica do tumor e gânglios linfáticos adjacentes, a radioterapia (através de substâncias radioactivas (p. ex. iodo radioactivo, o qual é absorvido activamente pela tiróide), através de raios-X, através de terapia de protões ou irradiação iónica (irradiação com protões ou iões, que poupa o tecido na área circundante ao tumor) , por microondas (aquecimento do tecido afectado)), e o tratamento medicamentoso (através de agentes citoestáticos ("quimioterapia"; através do qual é impedida ou travada a multiplicação das células cancerígenas), através de hormonoterapia (p. ex. por privação de testosterona no caso do carcinoma da próstata), através do bloqueio da transdução de sinais induzida por factores de crescimento, através da inibição do crescimento de vasos sanguíneos (agentes antiangiogénicos) ou através de imunoterapia (para aumentar a resposta imunitária contra células tumorais ou com o emprego de anticorpos específicos (monoclonais) contra antigénios tumorais ou a radioimunoterapia)).

De acordo com a invenção, o tratamento com ACE2 também pode ser empregue no âmbito do tratamento paliativo ou da melhoria da qualidade de vida de doentes com tumor, em particular no estádio terminal desta doença. 0 tratamento paliativo pode compreender a toma de analgésicos, o assegurar de uma alimentação suficiente, a inibição da degradação óssea, o aumento da hemoplastia na medula óssea, os tratamentos sintomáticos (p. ex., dilatação de estenoses por balonização ou introdução de endopróteses) e fisioterapia de tais doentes. 12 A actividade da ACE2, de acordo com a invenção, é empregue de um modo particularmente preferido para o tratamento das sequelas ou efeitos secundários da terapia de tumores, em particular para o tratamento das sequelas da radioterapia, da quimioterapia ou da cirurgia de tumores. Neste caso, é sobretudo decisiva a capacidade da actividade da ACE2 de "acalmar" novamente os sistemas reguladores endógenos que ficaram descontrolados. A presente invenção é particularmente bem adequada para impedir a metastização dos tumores, em virtude de a actividade da ACE2 ser tomada, de um modo preferido, por via sistémica e do seu efeito sobre a redução do crescimento das células tumorais,

De um modo preferido, de acordo com a invenção, são tratadas doenças tumorais que são caracterizadas por uma concentração aumentada de angiotensina II no tumor, na área circundante do tumor ou no doente com tumor. Ao contrário dos inibidores da ACE ou dos antagonistas do AT1R, a ACE2 permite reduzir concentrações aumentadas de ang II sem quaisquer efeitos secundários e reprimindo assim os efeitos negativos da ang II na doença tumoral, aumentando simultaneamente a concentração da ang 1-7 com efeito antiproliferativo e anti-inflamatório.

De acordo com a presente invenção são tratados, de um modo preferido, efusões malignas, diversos edemas ou a permeabilidade vascular aumentada no âmbito das doenças tumorais.

Tal como mencionado, a actividade da ACE2 é administrada, de um modo preferido, numa forma aplicável por via sistémica, de um modo particularmente preferido numa forma aplicável por via intravenosa ou na forma de um spray nasal, em particular, na 13 forma lipossómica. A actividade da ACE2 também pode ser contudo administrada numa forma aplicável localmente, em particular numa forma intratumoral ou intradérmica. É particularmente preferida a utilização de uma forma solúvel de ACE2 na administração a doentes. "Polipéptido com actividade de ACE2", "polipéptido ACE2", "ACE2" ou "actividade da ACE2" são aqui entendidos como sinónimo e como sendo uma actividade enzimática que corresponde, no sentido quimico, à actividade da ACE2 natural humana. A ACE2 natural humana é uma carboxipeptidase ancorada à membrana, que é expressa como receptor, sobretudo em células de pulmão, rins e coração, mas também em células do endotélio. A ACE2 dissocia diversos substratos peptídicos, tais como apelina, bradicinina, mas igualmente angiotensina-I, que é dissociada a angiotensina 1-9, mas, em particular, a ang-II, que é dissociada a ang 1-7. A ang II e ang 1-7 são, tal como mencionado, antagonistas do SRA. A ACE2 tem, por via do controlo das proporções entre péptidos, uma responsabilidade determinante para a regulação da espessura dos vasos, bem como a permeabilidade do endotélio e influencia com isto a homeostasia do organismo. A expressão de ACE2 é controlada por citocinas e é diminuída em diversas doenças inflamatórias, o que, como consequência adicional, conduz a um enriquecimento patológico de ang II, um dos substratos mais importantes da ACE2. Uma "actividade da ACE2" de acordo com a presente invenção refere-se, por conseguinte, a um polipéptido ("polipéptido ACE2"), que tem igualmente a capacidade de transformar especificamente a ang II em ang 1-7. São polipéptidos ACE2 particularmente preferidos os fragmentos da ACE2 natural humana, que apresentam a actividade 14 da ACE2, isto é, que é capaz de transformar ang II em ang 1-7, e isto, em relação à ACE2 natural humana, numa extensão de, pelo menos, 10%, de um modo preferido, de, pelo menos, 50%, de um modo ainda mais preferido, de, pelo menos, 100%, em particular, de, pelo menos, 150%, respectivamente relativamente à actividade molar.

Verificou-se de acordo com a invenção que aumentando a actividade da ACE2, é possivel regular negativamente a ang II que está aumentada no caso de tumores, o que disponibiliza também ang 1-7 in situ. Por conseguinte, de acordo com a invenção, com a ACE2 é possivel alcançar tanto o efeito positivo dos inibidores da ACE e dos antagonistas do AT1R, como também aproveitar o efeito positivo da ang 1-7 no doente. O aumento da actividade da ACE2 em doentes com tumor é, por conseguinte, excepcionalmente adequado para a terapia de diversas doenças tumorais. A ACE2 exógena pode, para o efeito, ser administrada, p. ex., como proteína solúvel por via sistémica ou a sua actividade endógena pode ser aumentada através de activadores ou agonistas adequados. Exemplos de activadores da ACE2 ou agonistas da ACE2 adequados são descritos, p. ex., no documento WO 2004/000365 e no documento US 6194556 Bl. A expressão de ACE2 e com isso a actividade da ACE2 pode ser ainda igualmente aumentada através de um princípio terapêutico adequado. Por exemplo, a introdução, no paciente com tumor, de ácidos nucleicos, que codifiquem para uma enzima ACE2 funcional, (um polipéptido ACE2), permite estabelecer actividades da ACE2 aumentadas no doente.

De um modo preferido, de acordo com a invenção, é contudo administrada a própria actividade enzimática, em particular na forma de um produto ACE2 recombinante. O produto ACE2 de acordo 15 com a invenção é, neste caso, tal como mencionado, de um modo preferido, uma forma solúvel da enzima ACE2 humana (que está presente no corpo na forma ligada à membrana). 0 tipo selvagem humano (wt) da molécula de ACE2 tem 805 residuos de aminoácidos. Os aminoácidos 1-17 representam, neste caso, uma sequência de sinal; na extremidade C-terminal a proteína é hidrofóbica e está também ancorada com esta extremidade na membrana. Na forma solúvel de ACE2 são eliminadas, por conseguinte, de um modo preferido, as regiões C-terminais hidrofóbicas, o polipéptido ACE2 empregue de um modo preferido, de acordo com a invenção, não apresenta, por conseguinte, qualquer domínio transmembranar na extremidade C-terminal. As variantes preferidas da actividade da ACE2 de acordo com a invenção, que são empregues para o tratamento de tumores, apresentam, por conseguinte, uma deleção dos aminoácidos 60 a 200 C-terminais. As formas de realização particularmente preferidas compreendem, neste caso, polipéptidos ACE2 solúveis, cuja cadeia polipeptídica é constituída pelos aminoácidos 18-740 ou por fragmentos destes com actividade enzimática. Um outro polipéptido preferido é constituído pelos aminoácidos 18-615 da sequência ACE2 ou por fragmentos destes com actividade enzimática.

Uma forma da actividade da ACE2 preferida de acordo com a invenção é a forma dimérica tal como descrita no documento EP 08450052.9. A forma dimérica, ao contrário da forma monomérica de resto descrita no estado da técnica, é mais facilmente solúvel em soluções com carga similar (p. ex. soluções fisiológicas para perfusão, soro, soluções salinas,...), não apresenta qualquer formação de agregados, está sujeita a um ataque por proteases reduzido, apresenta um tempo de semivida aumentado e é mais fácil de purificar. 16 A secção solúvel de ACE2 contém 7 locais de N-glicolisação. A ACE2 incompletamente glicosilada é mais dificilmente solúvel, tende para a agregação, é potencialmente imunogénica e apresenta um tempo de semivida mais curto. Por conseguinte, de um modo preferido, o polipéptido ACE2 dimérico recombinante, em particular, apresenta, pelo menos, 80%, das posições de N-glicolisação possíveis glicosiladas e apresenta uma fracção em açúcar superior a 10% (% em massa do ACE2 total) ou 11%, 12%, 13%, 14%, de um modo preferido, superior a 15% ou 16%, 17%, 18%, 19%, em particular, superior a 20% ou 21%, 22%, 23%, 24% ou 25%.

De acordo com o documento EP 08450052.9 foi descrito um processo de produção que permite preparar, de forma reprodutível, ACE2 dimérica altamente pura e activa, completamente glicosilada do tipo complexo. Este produto distingue-se em virtude da sua elevada fracção em açúcar (>20% em massa) e do tipo complexo, fortemente ramificado das estruturas de açúcar parcialmente carregadas com carga negativa. Estas têm um efeito positivo sobre a solubilidade, a biodisponibilidade, a pureza, a actividade, bem como a farmacologia do produto. A selecção de uma estrutura de expressão adequada, um hospedeiro de expressão adequado, uma estratégia de selecção optimizada, um meio ajustado ao metabolismo celular, bem como o acompanhamento por análise e selecção minuciosas de clones, permitiu preparar uma linha celular que conduz ao produto.

De um modo preferido, de acordo com a invenção, utiliza-se um polipéptido ACE2 recombinante, que é glicosilado, em que os grupos glico de um monómero de polipéptido ACE2 apresentam, em soma, pelo menos, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou, pelo menos, 16 resíduos de ácido siálico e o polipéptido ACE2 está presente 17 como dímero. 0 dímero contém, de um modo preferido, dois iões de zinco. Por resíduos de ácido siálico entende-se, neste caso, em particular, resíduos do tipo ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), em especial em N ou O-glicolisações (tal como descrito no pedido austríaco A 913/2007 ou no pedido europeu EP 08450052.9.

Os polipéptidos ACE2 preferidos apresentam, em conformidade com isto, ácido siálico em, pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 80%, em particular, pelo menos, 90%, de um modo o mais preferido, 100% das posições de N-glicolisação glicosiladas, de um modo preferido, as posições de N-glicolisação da sequência ACE2 sializadas são as que correspondem a Asn53, Asn90, Asnl03, Asn322, Asn432, Asn546,

Asn690. Em formas de realização especiais, uma asparagina correspondente a esta sequência ACE2 Asn53 Asn90, Asnl03, Asn322, Asn432, Asn546 e/ou Asn690 está, mono, di, tri ou tetrassializada individualmente sinalizada ou em conjunto. Numa preparação de ACE2 preferida, de um modo preferido, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% deste aminoácido estão mono, di, tri ou tetrassializados.

Utiliza-se, de um modo preferido, de acordo com a invenção, uma preparação de polipéptidos ACE2 recombinantes, que compreendam um polipéptido ACE2 dimérico, em que a fracção em polipéptidos ACE2 com um peso molecular abaixo de 100 kDa, de um modo preferido, abaixo de 104 kDa, de um modo especialmente preferido, abaixo de 108 kDa, em particular, abaixo de 112 kDa, de um modo particularmente preferido, abaixo de 117 kDa, de um modo o mais preferido, abaixo de 119 kDa, esteja presente abaixo dos 20%, de um modo preferido, abaixo dos 10%, de um modo particularmente preferido, abaixo dos 5%, de um modo o mais preferido, abaixo de 1%, em especial em 0%. Para o efeito, a 18 proporção é determinada, p. ex., por electroforese em gel em condições nativas. A fracção em polipéptidos ACE2 com domínios transmembranares situa-se, de um modo preferido, abaixo dos 20%, de um modo preferido, abaixo dos 10%, de um modo particularmente preferido, abaixo dos 5%, de um modo o mais preferido, abaixo de 1%, em especial em 0%. A fracção em multímeros de ACE2 situa-se, de um modo preferido, abaixo dos 20%, de um modo preferido, abaixo dos 10%, de um modo particularmente preferido, abaixo dos 5%, de um modo o mais preferido, abaixo de 1%, em especial em 0%. Por multímeros de ACE2 entende-se complexos com 3 ou mais polipéptidos ACE2. A fracção em dímeros de ACE2 nas moléculas de ACE2 perfaz, de um modo preferido, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou, pelo menos, 99%. Em combinação com estes ou independentemente destes, em formas de realização adicionais, a fracção em monómeros de ACE2 nas moléculas de ACE2 pode ser, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou, pelo menos, 99%.

Os polipéptidos ACE2 utilizados, de acordo com a invenção, apresentam, de um modo preferido, uma actividade catalítica do polipéptido ACE2 ou da preparação (kkat) de, pelo menos, 4/s, de um modo preferido, pelo menos 5/s, de um modo particularmente preferido, pelo menos, 6/s, de um modo especialmente preferido, pelo menos 7/s, de um modo o mais preferido, pelo menos, 7,6 /s, relativamente à transformação de ang II em ang 1-7 (angiotensina 1-7). A transformação pode ser testada de forma simples de modo em si conhecido, em particular contudo, tal como descrito nos exemplos do documento A 913/2000. 19

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção são tratados com actividade da ACE2, de acordo com a invenção, sobretudo doentes com tumor com um prognóstico desfavorável para o doente. A presente invenção é explicada em maior detalhe com base nos exemplos seguintes aos quais esta não está, obviamente, restringida. EXEMPLOS:

Exemplo 1: Expressão de ACE2 altamente glicosilada

Clonou-se a secção solúvel da sequência ACE2 humana num vector de expressão, no qual foi inserido anteriormente o marcador de selecção amplificável DHFR, de modo a conduzir a uma expressão aumentada do gene de ACE2. Para o efeito, introduziu-se um local interno para a entrada ribossomal atenuado entre os genes codificadores para ACE2 e para DFHR, que possibilita a leitura bicistrónica de ACE2 e DHFR no mesmo ARNm. Depois de as duas proteínas serem expressas sob o controlo do mesmo promotor, é possível aumentar objectivamente a expressão de ACE2 por via da selecção por DHFR utilizando-se o antagonista MTX. Esta estratégia permite obter linhas celulares expressoras particularmente estáveis, que fornecem elevados rendimentos de um produto de qualidade constante. Isto possibilita também alcançar títulos de produto razoáveis em linhas celulares que sejam possivelmente menos adequadas para a expressão recombinante de uma determinada proteína alvo. 20

Este vector foi transfectado em CHOdhfr e o número de cópias dos genes ACE2 foi amplificado sob aumento continuo da pressão de MTX. Através de várias rondas de selecção e de subclonagem, seleccionaram-se os melhores produtores por meio de análises intracelulares no FACS, bem como por análises de química proteica e enzimáticas, relativamente às propriedades óptimas do produto: para a selecção do clone mais bem adequado consideraram-se sobretudo a actividade enzimática específica, a qual foi medida com 3 substratos diferentes, a homogeneidade do produto, a produtividade celular, contudo também a complexidade dos açúcares. As propriedades do produto foram melhoradas por selecção específica de clones altamente glicosilados, de modo a exprimir-se ACE2 N-glicosilada, do tipo complexo, com elevada actividade enzimática.

Enquanto a ACE2 solúvel apresenta um peso molecular de 83 kDa, seleccionam-se clones que surgiram na gama de até 120 kDa na SDS-PAGE devido à sua estrutura de açúcar. Os clones preliminares foram em seguida adaptados a meio de crescimento isento de proteína. Este meio está quimicamente definido e foi ajustado para a expressão recombinante de glicoproteínas CHO. Mantiveram-se todos os clones em cultura e testaram-se quanto à sua aptidão para o processo de produção. Registaram-se, em especial, as taxas de crescimento e analisaram-se também os sobrenadantes quanto ao desenvolvimento do produto e aos metabolitos. Os produtos da expressão e os clones foram novamente cuidadosamente analisados.

Todos os clones exprimiram ACE2 altamente activo e apresentaram produtividades por volta de 20-30 pg/célula/dia. Adicionalmente analisou-se igualmente as estruturas de açúcar e a sua heterogeneidade. Seleccionaram-se clones nos quais na ACE2 21 todos os 7 locais de N-glicolisação estavam processados, em que estes apresentavam, pelo menos, uma glicolisação do tipo complexo com estrutura bi-antenária, alguns contudo também com estrutura tri-antenária com ácidos siálicos terminais. Preparou-se um banco de células mestre à base do clone seleccionado por último e testou-se, e implementou-se um processo seguindo as boas práticas apto para purificação e subsequentemente um processo seguindo as boas práticas para a produção. A ACE2 preparada de acordo com este exemplo é obtida como dimero. Devido à dimerização da ACE2, todas as unidades hidrofóbicas da proteína estão orientadas para o interior do complexo, em que os resíduos carregados, tais como as cadeias de açúcar ligados ao N, sobressaem para o exterior e a estrutura é solvatada no meio fisiológico, igualmente carregado.

Esta dimerização de uma ACE2 completamente N-glicolisada foi verificada na expressão na presença de Zn2+. 0 complexo dimérico é constituído, neste caso, por 2 subunidades idênticas, que estão ligadas uma à outra por via electroestática e que já não se separam em soluções fisiológicas. Ocorre, neste caso, a secreção de uma glicoproteína com, respectivamente, 14 estruturas de ácido siálico fortemente carregadas em cada molécula de ACE2, bem como 28 estruturas de ácido siálico no dimero. Em cada caso são incorporados 2 átomos de Zn2+ no complexo e estabilizam a sua estrutura. A forte carga das cadeias de açúcar solvatiza a molécula em soluções aquosas fisiológicas e obriga os domínios proteicos afins, carregados, para o exterior. 0 processo de produção foi implementado de modo a que, no produto final, ocorram exclusivamente dímeros de ACE2. Isto torna-se possível pelo facto de a regeneração da rACE2 ter lugar na presença de iões Zn suficientes (de um modo preferido, 22 aplicam-se 1,5-5 micromolar de Zn2+, a fermentação pode ser conduzida, em particular, perante 2,5-3,5 μΜ de Zn2+) e por, subsequentemente, os passos de tratamento adicionais serem efectuados na presença de iões Zn2+.

Exemplo 2: Propriedades farmacológicas do produto A preparação de ACE2 dimérica preparada de acordo com o exemplo 1 está presente como solução proteica estável, altamente purificada e concentrada, em tampão fisiológico e pode ser armazenada e administrada sem estabilização adicional.

Esta ACE2 nao revela qualquer agregaçao com formação de multimeros em virtude da sua elevada fracção em açúcar. A preparação de ACE2 apresenta ainda a actividade enzimática completa.

Em virtude da sua solubilidade, a ACE2 pode ser administrada como bolus i.v., mas também por via subcutânea. Pelas mesmas razões, a biodisponibilidade está garantida imediatamente após a toma por via sistémica.

Em virtude da elevada fracção em açúcar, complexa, fortemente ramificada, a ACE2 é apenas lentamente degradada. Daí resulta um longo tempo de semivida terminal de, pelo menos, 10,5 horas, que foi medido em diversas espécies, entre outras, também no macaco rhésus. A elevada fracção em ácido siálico condiciona ainda que, no ser humano, não se implementa qualquer resposta imunitária neutralizante contra ACE2. Esta seria não só contraproducente 23 para a toma exógena de ACE2, como poderia também neutralizar ACE autólogo intracelular. A formulação de ACE2 descrita, em conjunto com todas as propriedades do produto que a acompanham, possibilita, por conseguinte, pela primeira vez, uma terapia eficiente com rhACE2.

Exemplo 3: Determinação da actividade especifica da ACE2

Determinou-se a actividade especifica de preparações de ACE2 por medição da transformação de ang II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Todas as medições foram realizadas como determinações em triplicado em lotes com 100 pL. Iniciou-se a reacção enzimática mediante adição de 250 ng/mL de ACE2 a numa solução 80 μΜ de ang II em MES 50 mM, NaCl 300 mM, ZnCl2 10 μΜ e 0,01% de Brij-30 a pH 6,5. Misturaram-se cuidadosamente as amostras e incubaram-se durante exactamente 18 minutos a 37 °C. Travou-se a reacção enzimática mediante a adição de EDTA 100 mM. Para a análise, separaram-se as soluções por meio de RP-HPLC (Waters C18 pBondapak, 2,1 x 300 mm, 10 pm, 125 Á) utilizando-se um gradiente linear de 10 a 60% de CH3CN em 0,08% de H3P04 ao longo de 20 minutos, a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Detectaram-se ainda os picos tanto de ang II como de ang 1-7 nos cromatogramas e calcularam-se os integrais. Determinaram-se as concentrações de péptidos com base em curvas de calibração. Determinou-se ainda a transformação enzimática, bem como a actividade enzimática específica. A preparação de ACE2 preparada de acordo com o exemplo 1 apresenta uma actividade catalítica kkat de 8,0 ± 0,3/s medida com base na transformação da ang II e 8,8 ± 0,2/s em relação à transformação da ang 1-7. Os dois valores estão em concordância 24 e são nitidamente superiores às indicações de Vickers et al. (J Biol Chem. 2002 277(17): 14838-43), que publicou uma actividade catalítica de ACE2 de 3,5/s. As condições reaccionais eram idênticas. A causa para a actividade 240% mais elevada de acordo com a presente preparação poderão ser as modificações pós-traducionais e aqui, sobretudo, a N-glicolisação que estava nitidamente menos pronunciada no material que Vickers utilizou. O material aí descrito foi expresso em células de insecto e apesar de apresentar a mesma sequência de aminoácidos, estava glicolisado numa fracção e com um grau de ramificação contudo nitidamente mais reduzidos. Estudou-se também uma preparação de ACE2 obtenível no comércio na R&D systems (cat. 933-ZN), que apresentou igualmente uma actividade kkat nitidamente mais reduzida de 2,0 ± 0,1/s. Uma vantagem essencial da preparação dimérica a utilizar, de um modo preferido, de acordo com a invenção, é portanto a actividade surpreendentemente elevada que é sobretudo proporcionada pelas modificações pós-traducionais.

Exemplo 4: Repressão do crescimento de células tumorais

Semeou-se uma linha celular tumoral humana numa densidade celular de 2,5xl04 de células/mL em 200 pL de RPMI 1640 em 10% de FCS, em placas de 96 poços e incubou-se a 37 °C e 5% de CO2. Avaliou-se a influência de diversos componentes activos do SRA com base nos seguintes princípios de ensaio. Realizaram-se todas as análises como determinações em triplicado (sACE2 = ACE2 solúvel sem domínios membranares C-terminais): 25

Condição A. Meio de cultura RPMI 1640 com 10% de FCS como controlo

Condição B. Meio de cultura suplementado com ang II 100 nM

Condição C. Meio de cultura suplementado com ang 1-7 100 nM

Condição D. Meio de cultura suplementado com 20 pg/mL de sACE2

Condição E. Meio de cultura suplementado com 20 pg/mL de sACE2 e

ang II 100 mM

Retiraram-se diariamente 100 pL de meio e substituiu-se pelo mesmo volume de meio especifico fresco. Determinou-se o número de células nos dias 2, 3, 6, 8, 10, 13, 15 e 17 por meio de contagem múltipla no hemacitómetro. Utilizou-se uma placa de teste preparada em separado para cada determinação. A partir do quarto dia de cultura tornaram-se visíveis diferenças significativas na determinação do número de células devidas às diferentes condições de crescimento. A adição de ang II provocou um crescimento celular nitidamente aumentado. A ang 1-7, pelo contrário, reduziu o crescimento celular. Enquanto a ACE2 isoladamente (compreensivelmente devido à carência em substrato) induziu um crescimento marginalmente aumentado, a adição de ACE2 na presença de ang II reduziu o crescimento celular, de modo similar ao da adição de ang 1-7 isoladamente. A ACE2 neutralizou consequentemente não apenas o crescimento celular aumentado induzido pela ang II, mas inibiu este por efeitos do péptido ang 1-7. Este apenas foi formado, evidentemente, quando se adicionou também ang II, para além da ACE2, ao meio de crescimento.

Em conformidade com isto, este exemplo permitiu também mostrar que a ACE2 é capaz de enfraquecer a rota "act ivadora" ang II e implementar o lado "atenuante" ang 1-7. Tal como 26 um comprovado experimentalmente, os dois efeitos provocam retardamento do crescimento de células tumorais.

Lisboa, 13 de Agosto de 2013 27

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polipéptido com uma actividade de enzima conversora de angiotensina 2 (angiotensin converting enzyme 2; ACE2) para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças tumorais, com excepção do cancro de pulmão.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a doença tumoral ser seleccionada de doenças tumorais do tracto reprodutivo, em particular cancro do ovário, cancro dos testículos, cancro da próstata ou cancro da mama, doenças tumorais do tracto digestivo, em particular cancro do estômago, cancro do intestino, carcinoma rectal, cancro do pâncreas, cancro do esófago e cancro do fígado, cancro dos rins, melanomas ou neuroblastomas.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por ser empregue ACE2 para o tratamento das sequelas ou efeitos secundários da terapia de tumores, em particular para o tratamento das sequelas da radioterapia, da quimioterapia ou da cirurgia de tumores.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 3, caracterizada por ser empregue um polipéptido com actividade de ACE2 para impedir a metastização dos tumores.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 4, caracterizada por as doenças tumorais serem caracterizadas por uma concentração aumentada em 1 angiotensina II no tumor, na área circundante do tumor ou no doente com tumor.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por o polipéptido com actividade de ACE2 ser empregue para o tratamento de efusões malignas, edemas ou de permeabilidade vascular aumentada no âmbito das doenças tumorais.
7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o polipéptido com actividade de ACE2 estar presente numa forma aplicável por via sistémica, de um modo preferido, numa forma aplicável por via intravenosa ou na forma de um spray nasal, em particular, na forma lipossómica.
8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o polipéptido com actividade de ACE2 estar presente numa forma aplicável localmente, em particular, numa forma intratumoral, subcutânea ou intradérmica.
9. 9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por ser utilizada uma forma solúvel de ACE2 .
10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser utilizada uma forma dimérica de ACE2. 2
11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por o polipéptido com actividade de ACE2 ser empregue em combinação com uma terapia de tumores convencional, em particular em combinação com uma radioterapia, uma quimioterapia, uma terapia com anticorpos e/ou uma remoção cirúrgica de tumor.
12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por a doença tumoral ser caracterizada por um prognóstico desfavorável para o doente.
13. 13. Polipéptido com uma actividade de enzima conversora de angiotensina 2 (angiotensin converting enzyme 2; ACE2) para a aplicação no tratamento de doenças tumorais, com excepção do cancro de pulmão.
14. 14. Polipéptido para a aplicação de acordo com a reivindicação 13, definido de resto de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 12. Lisboa, 13 de Agosto de 2013 3