PT2552959T - Anticorpos para muc16 e métodos de utilização dos mesmos - Google Patents

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Thapi Dharmarao
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Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS PARA MUC16 E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente a um polipéptido, ou porção antigénica do mesmo, em que o polipéptido é selecionado a partir de a) polipéptido de ectodomínio MUC16, b) polipéptido de domínio citoplasmático MUC16 e c) polipéptido de domínio extracelular MUC16 que contém um polipéptido de ansa de cisteína. Os anticorpos e composições da invenção que contêm os mesmos são úteis em aplicações diagnósticas e terapêuticas para doenças nas quais MUC16 é sobre-expressa, como no cancro.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Marcadores de superfície celular e antigénios libertados são utilizados no diagnóstico de vários cancros. Por exemplo, o antigénio CA125, reconhecido pelo anticorpo 0C125, é um antigénio circulante, específico de tecido que é expresso no cancro do ovário. 0 antigénio CAI25 é codificado pelo gene MUC16, clonado por Lloyd e Yin. 0 gene de comprimento completo descreve uma proteína de mucina fixada complexa presente primariamente numa variedade de tecidos ginecológicos, especialmente neoplasmas. OC125 e outros anticorpos relacionados reagem com antigénios dependentes da glicosilação presentes exclusivamente na porção clivada da molécula.
Um ensaio de soro pode detetar níveis elevados do antigénio CA125 circulante em muitos pacientes com cancro ovárico epitelial, e este antigénio, derivado utilizando a linha celular ovárica OVCA433, é reconhecido pelo anticorpo OC125 (1-2) . A deteção de CA125 circulante no soro provou ser uma ferramenta útil para a gestão dos pacientes com cancro ovárico e ensaios clínicos (3-4). No entanto, CAI25 não é suficientemente sensível ou específico para o rastreio de cancro geral (5-6). Uma variedade de anticorpos ligados a CAI25 incluindo VK8 e Mil foram subsequentemente definidos como estando presentes nas células de cancro ovárico (7-9) . Embora estes anticorpos tenham sido utilizados para desenvolver ensaios de soro e vários outros estudos no cancro ovárico, têm desvantagens significativas para a utilização clínica no rastreio ou administração aos tecidos. Estes anticorpos não são úteis como ferramentas de rastreio, nem podem detetar o fragmento de proteína MUC16 residual proximal depois da clivagem. Isto limitou as suas aplicações diagnósticas e terapêuticas.
Por exemplo, OC125, Mil e maioria dos outros anticorpos preparados contra extratos de células de cancro ovárico são direcionados a antigénios dependentes da glicosilação, complexos. Estes antigénios estão exclusivamente presentes na porção libertada de MUC16 e não podem ser empregues para seguir a biologia da porção proximal de MUC16 e podem não refletir de forma precisa a distribuição tecidual uma vez que os padrões de glicosilação podem variar substancialmente entres os tecidos. Dado que a vasta maioria dos anticorpos reativos com MUC16, incluindo OC125, reagem com o antigénio dependente da glicosilação presente exclusivamente na porção clivada da molécula, a verdadeira distribuição da expressão de MUC16 não é conhecida (21). Não existe, atualmente, qualquer anticorpo disponível para rastrear o destino do fragmento proteico MUC16 restante depois da clivagem e libertação de CAI25. 0 documento US 2004/057952 divulga anticorpos anti-MUC16 que se ligam à região não libertada, extracelular, C-terminal de MUC16.
Consequentemente, existe uma necessidade para a identificação de anticorpos que são dirigidos contra sequências na cadeia principal peptídica de MUC16 que são úteis para o diagnóstico e tratamento de cancros nos quais MUC16 é expressa e/ou sobre-expressa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antigénio do mesmo, que se ligam especificamente a um polipéptido, ou porção antigénica do mesmo, em que o polipéptido é TLDRSSVLVDGYSPNRNE (SEQ ID NO:02). Numa forma de realização, o anticorpo internaliza-se numa célula. Noutra forma de realização, o anticorpo carece de ligação específica a um domínio extracelular MUC16 glicosilado. O anticorpo liga-se especificamente ao Polipéptido 2 (SEQ ID NO:02) do polipéptido de ectodomínio MUC16, e em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada variável (VH) codificada pela SEQ ID NO: 06 e uma cadeia leve variável (VL) codificada pela SEQ ID NO: 07. Numa forma de realização alternativa, o anticorpo é selecionado a partir do grupo de um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um fragmento de ligação a antigénio de um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado e um anticorpo exibido na superfície de um fago. Noutra forma de realização, o fragmento de ligação a antigénio é selecionado a partir do grupo de um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 e um fragmento Fv. Numa forma de realização alternativa, o anticorpo, ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo, está covalentemente ligado a um agente citotóxico ou um profármaco de um agente citotóxico. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, produzido por uma linha celular de hibridoma. A invenção também proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou um fragmento de ligação a antigénio do mesmo, produzido por uma linha celular de hibridoma, em que o anticorpo se liga especificamente a um polipéptido, ou a uma porção antigénica do mesmo. 0 polipéptido de ectodomínio MUC16 compreende o Polipéptido 2 (SEQ ID NO:02) e em que o anticorpo pode ser 4H11.2.5. A invenção proporciona adicionalmente uma composição que compreende (a) qualquer um dos anticorpos, ou fragmento de ligação a antigénio dos mesmos, que são descritos no presente documento, e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
Também é proporcionada pela invenção uma linha celular de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se ligam especificamente a um polipéptido, ou porção antigénica do mesmo, conforme definido no presente documento. A invenção ensina adicionalmente um método para detetar uma doença que compreende a sobre-expressão de MUC16 num indivíduo, compreendendo a) proporcionar i) uma amostra a partir de um indivíduo e ii) qualquer um ou mais dos anticorpos, ou fragmento de ligação a antigénio dos mesmos, que são descritos no presente documento, b) colocar a amostra em contacto com o anticorpo sob condições para a ligação específica do anticorpo com o seu antigénio, e c) detetar um nível aumentado de ligação do anticorpo com a amostra em comparação com uma amostra de controlo que carece da doença, detetando, desta forma, a doença no indivíduo. Numa forma de realização, a doença é cancro. Numa forma de realização preferida, o cancro é selecionado a partir do grupo de cancro ovárico e cancro da mama. Embora não tencionando limitar o método de deteção, numa forma de realização, a deteção da ligação do anticorpo à amostra é através de imunohistoquímica, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), classificação de células ativada por fluorescência (FACS), Western blot, imunoprecipitação e/ou obtenção de imagens radiogrãficas.
Também é proporcionado no presente documento um método para o tratamento de uma doença que compreende a sobre-expressão de MUC16, que compreende administrar, a um indivíduo que tem a doença, uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais dos anticorpos, ou fragmento de ligação a antigénio dos mesmos, que são descritos no presente documento. Numa forma de realização, a doença é cancro, conforme exemplificado por cancro ovárico e cancro da mama.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1: Três péptidos de terminal carboxi de MUC16 foram sintetizados na Instalação Nuclear de Microquímica (Microchemistry Core Facility) do MSKCC. 0 Polipéptido 1 está próximo do sítio de clivagem putativo, o Polipéptido 2 está antes da transmembrana e o Polipéptido 3 é o péptido interno, que está dentro da t ransmembrana.
Figura 2: Coloração de comparação de carcinomas ováricos serosos de grau elevado utilizando OC125 (painel esquerdo) e 4H11 (painel direito).
Figura 3: Pontuação imunohistoquímica de OC125 e 4H11 em microarranjos teciduais de carcinoma ovárico seroso de grau elevado. Apenas uma coloração membranosa e/ou citoplasmática foi considerada positiva. Pontuação 0: Sem coloração; Pontuação 1: <5 % forte ou fraca,· Pontuação 2: 5-50 % forte ou fraca; Pontuação 3: 51-75 % forte ou 51-100 % fraca; Pontuação 4: 76-99 % forte; Pontuação 5: 100 % forte. Figura 3A: OC125 (Pontuação 0); Figura 3B: OC125 (Pontuação 1); Figura 3C: OC125 (Pontuação 2); Figura 3D: QC125 (Pontuação 3); Figura 3E: OC125 (Pontuação 4); Figura 3F: OC125 (Pontuação 5); Figura 3G: 4H11 (Pontuação 0) ; Figura 3H: 4H11 (Pontuação 1); Figura 3H: 4H11 (Pontuação 2); Figura 3J: 4H11 (Pontuação 3); Figura 3K: 4H11 (Pontuação 4); Figura 3L: 4H11 (Pontuação 5).
Figura 4: Análise de Western blot. Figura 4A: Análise de Western blot da proteína de fusão GST-AMUC16c114 com anticorpos monoclonals 9C9.21.5.13 e 4H11.2.5. Figura 4B: Análise de Western blot de SK0V3-phrGFP-AMUC16cli4 e extrato proteico de SKOV3-phrGFP-AMUC16c334 e sondagem com os anticorpos monoclonais 9C9.21.5.13 e 4H11.2.5. Figura 5Ά: Ligação de afinidade de anticorpos monoclonais de terminal carboxi de MUC16 em células 0VCAR3 (Painéis A-D). Figura 5B: Internalização de anticorpos monoclonais 4H11 e OC125 radiomarcados em células transfetadas estáveis com SK0V3-phrGFP-AMUC16c334 .
Figura 6A-D: Intensidade de coloração de comparação dos anticorpos monoclonais OC125 e 4H11 em microarranj os teciduais contendo cancros da próstata (2A, concordante), pulmão (2B, discordante), mama (2C, discordante) e pâncreas (2D, discordante).
Figura 7: A análise de FACS como descrita na secção de Material e Métodos foi realizada com anticorpos comerciais e anticorpos monoclonais de terminal carboxi de MUC16 em 0VCAR3 de tipo selvagem (wt) , e linhas celulares transfetadas estáveis SKOV3-phrGFP-AMUC16ci14 e SK0V3 -phrGFP-AMUC16c334 .
Figura 8: Sequência de nucleótidos que codifica a cadeia pesada variável (VH) de anticorpo e a cadeia leve variável (VL) de anticorpo. (A) 4A5 VH (SEQ ID NO: 04) , (B) 4A5 VL (SEQ ID NO: 05) , (C) 4H11 VH (SEQ ID NO:06) , (D) 4H11 VL (SEQ ID NO:07), (E) 9B11 VH (SEQ ID NO:08), (F) 9B11 VL.A (SEQ ID NO:09), (G) 9B11 VL.B (SEQ ID N0:10), (H) 24B3 VH (SEQ ID N0:11) , (I) 24B3 VL (SEQ ID NO:12) .
Figura 9: (A) MUC16 de Homo sapiens (GenBankNP_078966) (SEQ ID NO :13), (B) Polipéptido 1 (SEQ ID NO: 01), (C)
Polipéptido 2 (SEQ ID NO: 02) , (D) Polipéptido 3 (SEQ ID NO:03), (E) Domínio transmembrana (SEQ ID NO:14), (F)
Polipéptido 4 (SEQ ID NO:15) contendo um polipéptido de ansa de cisteína (SEQ ID NO:19).
Figura 10: Esquema da estrutura de MUC16.
Figura 11. Desenho e análise in vitro de CARs dirigidos a MUC-CD. (A) Diagrama esquemático dos vetores retrovirais 4Hllz de primeira geração e 4Hll-28z de segunda geração. 4HllscFv: scFv específico de MUC16 derivado a partir das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e leve (VL) do anticorpo monoclonal 4H11; CD8: domínios transmembrana e de dobradiça de CD8; CD28: domínios de sinalização citoplasmáticos e transmembrana de CD28; cadeia ζ: domínio de sinalização citoplasmãtico de cadeia ζ de recetor de células T; LTR: repetição terminal longa; caixa preta: sequência líder de CD8; caixa cinzenta: ligante (Gly4Ser)3; as setas indicam o início da transcrição. (B) Análise de FACS de células T humanas transduzidas de forma retroviral para expressa o CAR de 4Hllz ou 19zl. (C) Células T 4Hllz + - mas não 19zl+ expandem-se em AAPC de 3T3 (MUC-CD/B7.1) . CAR+ foram cocultivadas em monocamadas AAPC de 3T3(MUC-CD/B7.1) a 3 x 106 células T CAR+/poço de uma placa de 6 poços. Proliferação de células CAR+ T, normalizadas para a fração de célula T CAR+ conforme avaliada por FACS para a fração CAR+ em combinação com contagens de células T viáveis obtidas nos dias 2, 4 e 7, conforme avaliado por ensaios de exclusão com azul de tripano. Figura 12. Comparação in vitro de células T modificadas para expressar o CAR de 4Hllz de primeira geração para células T modificadas para expressar o CAR de 4Hll-28z coestimulatório de segunda geração. (A) Células T CAR+ foram cocultivadas em monocamadas de MUC-CD com (painel direito) ou sem B7.1 (painel esquerdo). 3 x 106 células T CAR+ foram cocultivadas em monocamadas AAPC em placas de cultura de tecidos de 6 poços em meio isento de citoquinas. As contagens de células T viáveis totais foram avaliadas nos dias 2, 4 e 7, por ensaios de exclusão com azul de tripano. Células T 4Hll-28z+ expandiram-se marcadamente quando comparadas com células T 4Hllz+ depois da cocultura com AAPCs de 3T3(MUC-CD), ™™p=0,0023 (4Hllz em comparação com 4Hll-28z) . Em contraste, ambas as células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ se expandiram de forma semelhante em AAPCs de 3T3(MUC-CD/B7.1), p=0,09, (4Hllz em comparação com 4Hll-28z). As células T 19-28z+ não proliferaram em 3T3(MUC-CD), ™™p=0,0056 (19-28z em comparação com 4Hllz), ™™p=0,0011 (19-28z em comparação com 4Hll-28z), ou em 3T3(MUC-CD/B7.1), ™™p=0,0026 (19-28z em comparação com 4Hllz), ™™p=0,0087 (19-28z em comparação com 4Hll-28z). (B) Células T 4Hll-28z+ mas não 4Hllz+ secretam IL-2 após cocultura com AAPCs de 3T3(MUC-CD). Os sobrenadantes de cultura tecidual ao dia 2 depois da ativação em AAPCs de 3T3(MUC-CD) foram analisador quanto à secreção de citoquinas. Células T 4Hll-2Szf, em contraste com células T 4Hll-28z+, demonstraram uma secreção melhorada de IL-2 consistente com a coestimulação de células T mediada através do CAR de 4Hll-28z. ™™™p=0,0008 (19zl ou 19-28z em comparação com 4Hllz), ™™p=0,0026 (19zl ou 19-28z em comparação com 4Hll-28z), ™™p=0,0046 (4Hllz em comparação com 4Hll-28z). Adicionalmente, ambas células T 4Hll-2 8z'f e 4Hllz+ secretaram IFNy. ™p=0,011 (4Hllz em comparação com 4Hll-28z). Células T transduzidas com 1928z e 19zl de controlo não foram capazes de secretar IL-2 ou IFNy. ™™p=0,0034 (19zl em comparação com 4Hllz) , ™™p=0,036 (19-28z em comparação com 4Hllz), ™™™p=0,0008 (19-28z em comparação com 4Hll-28z). (C) Expansão de células T CAR+ depois de 3 ciclos de estimulação em 3T3(MUC-CD/B7.1). Células T humanas transduzidas para expressar CARs de 4Hllz ou 4Hll-28z demonstraram uma expansão log >2 ao longo de 2 ciclos de estimulação em AAPCs de 3T3 (MUC-CD/B7.1) . As setas indicam os Io e 2 ° ciclos de re-estimulação em AAPCs. (D) A análise por FACS da fração de células T CAR+ de células T 4Hll-28z+ aumentou depois de cada ciclo semanal de estimulação.
(I) FACS depois da transdução inicial, (II) FACS aos 7 dias depois da primeira estimulação em AAPCs, (III) FACS aos 7 dias depois da segunda estimulação em AAPCs. Estes dados são representativos de uma de três experiências diferentes utilizando três populações de células T de dadores saudáveis diferentes, todas as quais demonstraram padrões de proliferação e secreção de citoquinas semelhantes.
Figura 13. Células T direcionadas para MUC-CD especificamente expandem e lisam células tumorais MUC-CD'1' . (A) 0 ensaio de citotoxicidade de células T 4Hlz+ e 4Hll-28z+ direcionadas a células tumorais OV-CAR(MUC-CD) demonstra uma citotoxicidade eficaz mediada por células T a partir de dadores saudáveis modificadas para expressar a primeira e segunda geração de CARs direcionados a MUC-CD. As células T de controlo modificadas para expressar a primeira e segunda geração de CARs de 19zl e 19-28z direcionados a CD19 não foram capazes de demonstrar uma lise significativa de células tumorais alvo. (B) Células T de dadores saudáveis modificadas para expressar o CAR de 4Hll-28z lisam de igual forma células tumorais MUC-CD+ derivadas de ascites de pacientes primários em comparação com células T modificadas para expressar o CAR de 19-28z de controlo. Estes dados representam 1 ou 3 experiências que têm como alvo células tumorais primárias a partir de 3 pacientes de carcinoma ovãrico com resultados semelhantes. (C) Células T autõlogas isoladas a partir do sangue periférico, quando modificadas com o CAR de 4H11-28Z, exibem uma lise significativa de células tumorais derivadas de ascite MUC-CD+ autólogas quando comparadas com células T autõlogas 19-28z+ de controlo. Estes dados representam 1 de 3 experiências utilizando células T e células tumorais autõlogas a partir de 3 pacientes com carcinoma ovárico diferentes com resultados semelhantes. (D) Proliferação específica de antigénios de células T marcadas com CFSE direcionadas a MUC-CD depois de cocultura com células tumorais 0V-CAR3 (MUC-CD) , Células T CAR+ marcadas com CFSE foram cocultivadas com células tumorais 0V-CAR3 que expressam MUC-CD numa razão de 1:1 durante 5 dias. A proliferação de células T marcadas com CFSE foi avaliadas por FACS demonstrando uma proliferação eficaz de ambas as células T 4Hllz+ e 4H11 -2Bz+ mas não das células T 19-28z+ de controlo. (E) Os resultados de CFSE foram adicionalmente confirmados pelos números de células T absolutos avaliados nos dias 2, 4 e 7 depois da cocultura com
células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD). (F) Análise por FACS da expressão de 4-1BBL em células 0VCAR3(MUC-CD). Células 0V-CAR3 (MUC-CD) foram coradas com anticorpo anti-4-lBBL humano (linha espessa) ou com controlo de isotipo (linha fina). A análise por FACS demonstrou expressão de 4-1BBL em células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD). Análises por FACS adicionais não foram capazes de revelar expressão dos ligandos coestimuladores B7.1, B7.2 ou OX-40L.
Figura 14. Erradicação de tumores 0V-CAR3(MUC-CD) depois de tratamento intraperitoneal com primeira e segunda gerações de células T direcionadas a MUC-CD. (A) A injeção intraperitoneal de tumores 0V-CAR3(MUC-CD) em ratinhos bege-SCID não tratados resulta em distensão abdominal e tumores peritoneais nodulares. Ratinhos bege-SCID foram injetados por via intraperitoneal com 3xl06 células 0V-CAR3 (MUC-CD) . Às 5 semanas após a injeção peritoneal de células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD), os ratinhos desenvolveram ascites como evidenciado por um abdómen distendido (painel central) quando em comparação com um ratinho isento de tumor (painel esquerdo). A visualização post mortem do peritoneu demonstra massas tumorais nodulares (setas) dentro da cavidade abdominal (painel direito). (B) A injeção intraperitoneal de células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ atrasou a progressão do tumor ou erradicou a doença por completo. Curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratinhos bege-SCID tratados com primeira ou segunda geração de célula T direcionadas para MUC-CD. Os ratinhos bege-SCID foram submetidos a infusão ip com 3xl06 células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD) no dia 1 seguidas por 3xl07células T 4Hllz+ ou 4Hll-28z+ no dia 2. Todos os ratinhos não tratados ou ratinhos tratados com células T 19zl+ de controlo desenvolveram tumores estabelecidos e foram sacrificados no dia 50. Em contraste, 27 % dos ratinhos tratados com células T 4Hllz+ ou 4Hll-28z+ permaneceram sem evidências clínicas de doença até ao dia 120. ™p=0,01 (4Hllz em comparação com 19zl), ™™p=0,0023 (4Hll-28z em comparação com 19zl), p=0,63 (4Hllz em comparação com 4Hll-28z).
Figura 15. Células T 4Hll-28z+ direcionadas a MUC-CD viajam de forma bem-sucedida até tumores 0V-CAR3(MUC-CD/ GFP-FFLuc) ip depois da infusão intravenosa sistémica, resultando numa eficácia antitumoral igualmente eficiente quando em comparação com ratinhos portadores de tumores tratados com 4Hll-28z+ ip. (A) Curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratinhos bege-SCID tratados por via ip ou iv com células T 4Hll-28z+. Ratinhos bege-SCID foram injetados por via intraperitoneal com 3xl06 células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD/ GFP-FFLuc) seguidas por infusão iv ou ip de 3xl07 células T 4Hll-28z+. A erradicação do tumor é melhorada depois de infusão ip ou iv de células T 4Hll-28z+ quando em comparação com ratinhos tratados com controlo. Ambos os ratinhos tratados com células T 4Hll-28z+ por via ip e iv exibiram uma sobrevivência estatisticamente melhorada (™™!Mp<0,0001 e ™™p=0,0038, respetivamente) em comparação com as coortes de controlo tratadas com células T 19-28z+. Pelo contrário, a diferença na sobrevivência entre as coortes de células T 4Hll-28z+ ip e iv não foi estatisticamente significativa (p=0,22) . (B) BLI da progressão tumoral de ratinhos tratados com células T 4Hll-28z+ ip e iv representativos com doença progressiva em última análise depois de tratamento em comparação com BLI da progressão tumoral num ratinho tratado com células T 19-28z+ de controlo representativo. (C) As células T 4Hll-2Bz+ coradas com CFSE injetadas por via sistémica viajam para tumores 0V-CAR(MUC-CD) ip avançados. A presença de células T de controlo 19-28z+ marcadas com CFSE (painel esquerdo) e células T 4Hll-28z+ (painel direito) 1 dia depois da infusão em ratinhos bege-SCID com tumores OV-CAR(MUC-CD) avançados (injetados 7 dias antes), conforme avaliada por análise por FACS de suspensões tumorais de OV-CAR (MUC-CD) de célula única, revela uma população marcada de células T 4Hll-28z+ mas não de 19-28zf de controlo dentro de tumores 0V-CAR3(MUC-CD) peritoneais. Figura 16. Erradicação de tumores 0V-CAR3(MUC-CD) avançados em ratinhos bege-SCID através de infusão ip de células T 4Hll-28z+. Ratinhos bege-SCID foram injetados por via ip com 3xl06 células tumorais OV-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc) 7 dias antes do tratamento ip com 3xl07 células T 4Hll-28z+. (A) BLI de ratinhos tratados com células T 4Hll-28z+ com doença recidivante (fila do meio) ou doença erradicada (fila inferior) em comparação com um ratinho de controlo tratado com células T 19-28z+ representativo. (B) Curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratinhos bege-SCID com tumores 0V-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc) avançados tratados por via ip com células T 4Hll-28z+. Todos os ratinhos tratados com células T 4Hll-28z+ demonstraram uma sobrevivência melhorada quando em comparação com ratinhos tratados com células T 19-28z+ de controlo (™™p=0,0011), com uma sobrevivência global a longo prazo de 25 % no dia 120.
Figura 17: sequência líder de CD8, sequência de domínio intracelular de cadeia zeta de CD3, sequência ligante de serina-glicina (G4S)3, sequência de domínio transmembrana de CD8 e sequência de domínios intracelular + transmembrana (-STOP).
Figura 18: sequência de SFG_4Hllz.
Figura 19: sequência de SFG-4Hll-28z.
Figura 20: (A) Péptido 1 de MUC16-CD de ratinho (SEQ ID NO:21), Péptido 2 de primeira ansa de cisteína de ratinho (SEQ ID NO:22) e Péptido 3 de segunda ansa de cisteína de ratinho (SEQ ID NO:23). (B) Alinhamento de sequências de aminoãcidos de MUC16 de ratinho (SEQ ID NO:24) e MUC16 de ser humano (SEQ ID NO:25). Uma cisteína foi adicionada à sequência peptídica no terminal N do Péptido 1 e Péptido 3 para melhor conjugação com KLH.
Figura 21: Extrato de ID8 com diluição de 1:10 de sobrenadantes primários monoclonais de MUC16 de ratinho. Figura 22: Extrato de BR5-FVB1 com diluição de 1:10 de sobrenadantes primários monoclonais de MUC16 de ratinho Figura 23: Western Blot mostrando 38 sobrenadantes de anticorpo monoclonal de hamster em extratos celulares de ID8 .
Figura 24 (A) sequência nucleotídica que codifica 12B10-3G10-VH (SEQ ID NO:25), (B) sequência de aminoácidos de 12B10-3G10-VH (SEQ ID NO:27), (C) sequência nucleotídica que codifica 12B10-3G10-VL (SEQ ID NO:28) (note-se que o VL tem um sítio Notl opcional adicionado pelo iniciador para clonagem e (D) sequência de aminoácidos de 12B10-3G10-VL (SEQ ID NO:29) .
Figura 25: Análise por FACS com mAb 12B10-3G10 purificado nas linhas celulares ID8 (ratinho), OVCAR-3 (humano) e BR5-FVB1 (ratinho).
DEFINIÇÕES
Para facilitar a compreensão da invenção, um série de termos é definida abaixo.
Os termos "purificado", "isolado" e equivalentes gramaticais dos mesmos conforme utilizados no presente documento, referem-se à redução na quantidade de pelo menos um componente desejável (como uma célula, proteína, de sequência de ácidos nucleicos, de hidrato de carbono, etc.) a partir de uma amostra, incluindo uma redução em qualquer percentagem numérica de desde 5 % até 100 %, como, mas não limitada a, desde 10 % até 100 %, desde 20 % até 100 %, desde 30 % até 100 %, desde 40 % até 100 %, desde 50 % até 100 %, desde 60 % até 100 %, desde 70 % até 100 %, desde 80 % até 100 % e desde 90 % até 100 %. Portanto, purificação resulta num "enriquecimento", ou seja, um aumento da quantidade de um componente celular, de proteína, de sequência de ácidos nucleicos, de hidrato de carbono, etc.). 0 termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc.). A unidade funcional básica de cada anticorpo é um monómero de imunoglobulina (Ig) (contendo apenas uma unidade de imunoglobulina ("Ig")). Incluídos dentro desta definição estão anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal e anticorpo quimérico. A parte variável de um anticorpo é o seu "domínio V" (também referido como "região variável") e a parte constante é o seu "domínio C" (também referido como "região constante") como as regiões constantes capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu. 0 "domínio variável" também é referido como a "região Fv" e é a região mais importante para a ligação a antigénios. Mais especificamente, ansas variáveis, três cada nas cadeias leve (VL) e pesada (VH) são responsáveis pela ligação ao antigénio. Estas ansas são referidas como as "regiões de determinação de complementaridade" ("CDRs" e "idiotipos"). 0 monómero de imunoglobulina (Ig) de um anticorpo é uma molécula em forma de "Y" que contém quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, unidas por pontes de dissulfureto.
As cadeias leves são classificadas como (λ) ou capa (k) . Uma cadeia leve tem dois domínios sucessivos: um domínio constante ("CL") e um domínio variável ("VL") . 0 domínio variável, VL, é diferente em cada tipo de anticorpo e é a porção ativa da molécula que se liga com o antigénio específico. 0 comprimento aproximado de uma cadeia leve é de 211 a 217 aminoácidos.
Cada cadeia pesada tem duas regiões, a região constante e a região variável. Existem cinco tipos de cadeias pesadas de Ig mamíferas denominadas ο:, δ, ε, yep. 0 tipo de cadeia pesada presente define a classe do anticorpo; estas cadeias são encontradas em anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respetivamente. Cadeias pesadas diferentes diferem no tamanho e composição, α e y contêm aproximadamente 450 aminoácidos, enquanto as μ e ε têm aproximadamente 550 aminoácidos. Cada cadeia pesada tem duas regiões, a região constante ("CH") e a região variável ("VH") . A região constante (CH) é idêntica em todos os anticorpos do mesmo isotipo, mas difere nos anticorpos de isotipos diferentes. As cadeias pesadas γ, α e δ têm uma região constante composta por três domínios de Ig em tandem (numa linha) e uma região de dobradiça para flexibilidade adicional. As cadeias pesadas μ e ε têm uma região constante composta por quatro domínios de imunoglobulina. A região variável (VH) da cadeia pesada difere nos anticorpos produzidos por diferentes células B, mas é a mesma para todos os anticorpos produzidos por uma única célula B ou clone de célula B. A região variável de cada cadeia pesada tem aproximadamente 110 aminoácidos de comprimento. 0 termo '’liga-se especif icamente" e "ligação específica" quando feitos em referência à ligação de duas moléculas (por exemplo, anticorpo a um antigénio, etc.), refere-se a uma interação das duas moléculas que é dependente da presença de uma estrutura particular em uma ou ambas as moléculas. Por exemplo, se um anticorpo é específico para um epítopo "A" na molécula, então a presença de uma proteína contendo e epítopo A (ou A livre, não marcado) numa reação que contém "A" marcado" e o anticorpo, irá reduzir a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo. 0 termo "capaz de se ligar" quando feito em referência a uma interação entre uma primeira molécula (como um anticorpo, polipéptido, glicoproteína, sequência de ácidos nucleicos, etc.) e uma segunda molécula (como um antigénio, polipéptido, glicoproteína, sequência de ácidos nucleicos, etc.) significa que a primeira molécula se liga à segunda molécula na presença de uma concentração adequada de sais e uma temperatura e pH adequados. As condições para as moléculas de ligação podem ser determinadas utilizando métodos de rotina e/ou comercialmente disponíveis.
Os termos "antigénio", "imunogénio", "antigénico", "imunogénico", "antigenicamente ativo", "imunológico" e "imunologicamente ativo" quando usados em referência a uma molécula, referem-se a qualquer substância que é capaz de induzir uma resposta imunitária humoral específica (incluindo desencadear uma resposta de anticorpos solúveis) e/ou resposta imunitária mediada por células (incluindo desencadear uma resposta de CTL) . Os péptidos antigénicos contêm, preferentemente, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 e mais preferentemente pelo menos 10 aminoácidos. Para desencadear a produção de anticorpos, numa forma de realização, os antigénios podem ser conjugados com hemocianina de lapa californiana (KLH) ou fusionados com glutationa-S-transferase (GST).
Um "antigénio cognato" quando em referência a um antigénio que se liga a um anticorpo, refere-se a um antigénio que é capaz de se ligar especificamente ao anticorpo.
Numa forma de realização, o antigénio compreende um epítopo. Os termos "epítopo" e "determinante antigénico" referem-se a uma estrutura num antigénio, que interage com o sítio de ligação de um anticorpo ou recetor de células T como um resultado da complementaridade molecular. Um epítopo pode competir com o antigénio intacto, a partir do qual é derivado, pela competição a um anticorpo.
Conforme utilizados no presente documento, os termos "porção" e "fragmento", quando feitos em referência a uma sequência de ácidos nucleicos ou sequência proteica, referem-se a um pedaço dessa sequência que pode variar em tamanho desde 2 nucleótidos e aminoácidos contíguos, respetivamente, até à totalidade da sequência menos um nucleótido e aminoácido, respetivamente.
Um "indivíduo" que poderá beneficiar-se dos métodos da invenção inclui qualquer animal multicelular, preferentemente um mamífero. Indivíduos mamíferos incluem seres humanos, primatas não humanos, murinos, ovinos, bovinos, ruminantes, lagomorfos, porcinos, caprinos, equinos, caninos, felinos, aves, etc.). Assim, os indivíduos mamíferos são exemplificados pelo ratinho, rato, porquinho da índia, hámster, furão e chinchila. As composições e métodos da invenção também são úteis para um indivíduo "em necessidade de reduzir um ou mais sintomas de uma doença, por exemplo, em necessidade de reduzir metástases de cancro e/ou em necessidade de reduzir um ou mais sintomas de cancro, inclui um indivíduo que exibe e/ou está em risco de exibir um ou mais sintomas da doença. Por exemplo, indivíduos que podem estar em risco com base no historial familiar, fatores genéticos, fatores ambientais, etc. Este termo inclui modelos animais da doença. Assim, a administração de uma composição (que reduz uma doença e/ou que reduz um ou mais sintomas de uma doença) a um indivíduo em necessidade de reduzir a doença e/ou de reduzir um ou mais sintomas da doença, inclui a administração profilática da composição (ou seja, antes da doença e/ou um ou mais do sintomas da doença serem detetáveis) e/ou a administração terapêutica da composição (ou seja, depois da doença e/ou um ou mais do sintomas da doença serem detetáveis) . As composições e métodos da invenção também são úteis para um indivíduo "em risco" de ter a doença (como cancro) que se refere a um indivíduo que é predisposto a contrair e/ou expressar um ou mais sintomas da doença. Esta predisposição pode ser genética (por exemplo, uma tendência genética particular a expressar um ou mais sintomas da doença, como distúrbios hereditários, etc.) ou devido a outros fatores (por exemplo, condições ambientais, exposições a compostos prejudiciais, incluindo carcinogéneos, presentes no ambiente, etc.). 0 termo indivíduo "em risco" inclui indivíduos "que padecem da doença", ou seja, um indivíduo que está a experimentar um ou mais sintomas da doença. Não se pretende que a presente invenção esteja limitada a quaisquer sinais ou sintomas particulares. Assim, pretende-se que a presente invenção englobe indivíduos que estão a experimentar qualquer gama de doença, desde sintomas subclínicos até doença totalmente desenvolvida, em que o indivíduo exibe pelo menos um dos indícios (por exemplo, sinais e sintomas) associados com a doença. "Célula cancerosa" refere-se a uma célula que está a passar por estádios precoces, intermédios ou avançados de progressão neoplásica multietapas como anteriormente descrito (Pitot et al., Fundamentals of Oncology, 15-28 (1978)). Isto inclui células em estádios precoces, intermédios e avançados de progressão celular incluindo "células prê-neoplásicas" (ou seja, células hiperplásicas e células displásicas) e células neoplãsicas em estádios avançados de progressão neoplásica de uma células displásica. Célula cancerosa "metastática" refere-se a uma célula cancerosa que é translocada a partir de um sítio de cancro primário (ou seja, uma localização onde a célula de cancro inicialmente se formou a partir de uma célula normal, hiperplásica ou displãsica) até um sítio diferente do sítio primário, onde a célula cancerosa translocada se aloja e prolifera. "Cancro" refere-se a uma pluralidade de célula cancerosas que podem ou não ser metastáticas, como cancro ovárico, cancro da mama, cancro de pulmão, cancro de próstata, cancro do colo do útero, cancro pancreático, cancro do cólon, cancro do estômago, cancro do esófago, cancro da boca, cancro da língua, cancro das gengivas, cancro de pele (por exemplo, melanoma, carcinoma de células basais, sarcoma de Kaposi, etc.), cancro muscular, cancro de coração, cancro do fígado, cancro bronquial, cancro da cartilagem, cancro ósseo, cancro testicular, cancro renal, cancro do endométrio, cancro de útero, cancro da bexiga, cancro da medula óssea, cancro linfoma, cancro de baço, cancro de timo, cancro de tiroide, cancro cerebral, cancro de neurónios, mesotelioma, cancro da vesícula biliar, cancro ocular (por exemplo, cancro da córnea, cancro da úvea, cancro da coroide, cancro da mácula, cancro do humor vítreo, etc.), cancro das articulações (como cancro sinovial, glioblastoma, linfoma e leucemia. "Amostra" e "espécime" conforme utilizados no presente documento, são utilizados no seu sentido mais lato como incluindo qualquer composição que é obtida e/ou derivada a partir de uma fonte biológica, bem como de dispositivos de amostragem (por exemplo, zaragatoas), que são colocados em contacto com as amostras biológicas ou ambientais. "Amostras biológicas" incluem aquelas obtidas a partir de um indivíduo, incluindo fluidos corporais (como urina, sangue, plasma, matéria fecal, líquido cefalorraquidiano (CSF), sémen, expetoração e saliva), bem como tecido sólido. As amostras biológicas também incluem uma célula (como linhas celulares, células isoladas a partir de tecidos quer as células isoladas sejam ou não cultivadas depois do isolamento a partir do tecido, células fixadas como células fixadas para análise histológica e/ou imunohistoquímica), tecido (como material de biópsia), extrato celular, extrato tecidual e ácidos nucleicos (por exemplo, ADN e ARN) isolados a partir de uma célula e/ou tecido, e semelhantes. Estes exemplos são ilustrativos e não devem ser considerados como limitando os tipos de amostra aplicáveis à presente invenção. "Sobre-expressão de MUC16" por uma célula de interesse (como uma célula cancerosa) refere-se a um nível superior de proteína e/ou ARNm de MUC16 que é expresso pela célula de interesse em comparação com uma célula de controlo (como uma célula não cancerosa, célula normal, etc.). "Internalizar" quando em referência a uma célula, refere-se à entrada a partir do meio extracelular para dentro da membrana celular e/ou citoplasma. "Glicosidada" quando em referência a uma sequência (por exemplo, uma sequência de aminoácidos ou sequência de nucleótidos) refere-se a uma sequência que está covalentemente ligada a um ou mais sacáridos.
Composição "farmacêutica" e "fisiologicamente tolerável" refere-se a uma composição que contém moléculas farmacêuticas, isto é, moléculas que são capazes de administração a, ou sobre, um indivíduo e que não produzem substancialmente um efeito indesejável como, por exemplo, reações adversas ou alérgicas, tonturas, transtornos gástricos, toxicidade e semelhantes, quando administradas a um indivíduo. Preferentemente, da mesma forma, a molécula farmacêutica não reduz substancialmente a atividade das composições da invenção. Moléculas farmacêuticas incluem moléculas e excipientes "diluentes" (ou seja, "veículos").
Quantidade "imunologicamente eficaz" e "antigenicamente eficaz" de uma molécula referem-se indistintamente a uma quantidade da molécula que é capaz de induzir uma resposta imunitária humoral específica (incluindo desencadear uma resposta de anticorpos solúveis) e/ou resposta imunitária mediada por células (incluindo desencadear uma resposta de linfõcitos T citotõxicos (CTL)) . "Tratar" uma doença refere-se a reduzir um ou mais sintomas (como objetivos, subjetivos, patológicos, clínicos, subclínicos, etc.) da doença.
Os termos "reduzir", "inibir", "diminuir", "suprimir", "diminuição" e equivalente gramaticais (incluindo "inferior", "menor", etc.) quando em referência ao nível de qualquer molécula (por exemplo, sequência de aminoácidos e sequência de ácidos nucleicos, anticorpo, etc.), célula, e/ou fenómeno (por exemplo, sintoma de doença, ligação a uma molécula, especificidade de ligação de duas moléculas, afinidade de ligação de duas moléculas, especificidade para cancro, sensibilidade a cancro, afinidade de ligação, atividade enzimática, etc.) numa primeira amostra (ou num primeiro indivíduo) em relação a uma segunda amostra (ou em relação a um segundo indivíduo), significam que a quantidade de molécula, célula e/ou fenómeno na primeira amostra (ou no primeiro indivíduo) é inferior do que na segunda amostra (ou no segundo indivíduo) em qualquer quantidade que seja estatisticamente significativa utilizando qualquer método estatístico de análise aceite na técnica. Numa forma de realização, a quantidade de molécula, célula e/ou fenómeno na primeira amostra (ou no primeiro indivíduo) é pelo menos 10 % inferior, pelo menos 25 % inferior, pelo menos 50 % inferior, pelo menos 75 % inferior e/ou pelo menos 90 % inferior do que a quantidade da mesma molécula, célula e/ou fenómeno na segunda amostra (ou no segundo indivíduo). Noutra forma de realização, a quantidade de molécula, célula e/ou fenómeno na primeira amostra (ou no primeiro indivíduo) é inferior em qualquer percentagem numérica desde 5 % até 100 %, como, mas não limitada a, desde 10 % até 100 %, desde 20 % até 100 %, desde 30 % até 100 %, desde 40 % até 100 %, desde 50 % até 100 %, desde 60 % até 100 %, desde 70 % até 100 %, desde 80 % até 100 % e desde 90 % até 100 % inferior do que a quantidade da mesma molécula, célula e/ou fenómeno na segunda amostra (ou no segundo indivíduo). Numa forma de realização, o primeiro indivíduo é exemplificado por, mas não limitado, a um indivíduo que foi manipulado utilizando as composições e/ou métodos da invenção. Numa forma de realização adicional, o segundo indivíduo é exemplificado por, mas não limitado a, um indivíduo que não foi manipulado utilizando as composições e/ou métodos da invenção. Numa forma de realização alternativa, o segundo indivíduo é exemplificado por, mas não limitado a, um indivíduo que foi manipulado, utilizando as composições e/ou métodos da invenção, numa dosagem diferente e/ou durante um período de tempo diferente e/ou através de uma via de administração diferente em comparação com o primeiro indivíduo. Numa forma de realização, o primeiro e segundo indivíduos podem ser o mesmo indivíduo, tal como quando o efeito de diferentes regimes (por exemplo, de dosagens, duração, via de administração, etc.) das composições e/ou métodos da invenção é procurado como sendo determinado num indivíduo. Noutra forma de realização, o primeiro e segundo indivíduos podem ser indivíduos diferentes, como quando se compara o efeito das composições e/ou métodos da invenção num indivíduo que participa num ensaio clínico e noutro indivíduo num hospital.
Os termos "aumentar", "elevar", "subir" e equivalente gramaticais (incluindo "superior", "maior," etc.) quando em referência ao nível de qualquer molécula (por exemplo, sequência de aminoácidos e sequência de ácidos nucleicos, anticorpo, etc.), célula, e/ou fenómeno (por exemplo, sintoma de doença, ligação a uma molécula, especificidade de ligação de duas moléculas, especificidade de ligação de duas moléculas, especificidade para cancro, sensibilidade a cancro, afinidade de ligação, atividade enzimática, etc.) numa primeira amostra (ou num primeiro indivíduo) em relação a uma segunda amostra (ou em relação a um segundo indivíduo), significam que a quantidade da molécula, célula e/ou fenómeno na primeira amostra (ou no primeiro indivíduo) é superior do que na segunda amostra (ou no segundo indivíduo) em qualquer quantidade que seja estatisticamente significativa utilizando qualquer método estatístico de análise aceite na técnica. Numa forma de realização, a quantidade da molécula, célula e/ou fenómeno na primeira amostra (ou no primeiro indivíduo) é pelo menos 10 % superior, pelo menos 25 % superior, pelo menos 50 % superior, pelo menos 75 % superior e/ou pelo menos 90 % superior do que a quantidade da mesma molécula, célula e/ou fenómeno na segunda amostra (ou no segundo indivíduo). Isto inclui, sem limitação, uma quantidade de molécula, célula e/ou fenómeno na primeira amostra (ou no primeiro indivíduo) que é pelo menos 10 % superior, pelo menos 15 % superior, pelo menos 20 % superior, pelo menos 25 % superior, pelo menos 30 % superior, pelo menos 35 % superior, pelo menos 40 % superior, pelo menos 45 % superior, pelo menos 50 % superior, pelo menos 55 % superior, pelo menos 60 % superior, pelo menos 65 % superior, pelo menos 70 % superior, pelo menos 75 % superior, pelo menos 80 % superior, pelo menos 85 % superior, pelo menos 90 % superior e/ou pelo menos 95 % superior do que a quantidade da mesma molécula, célula e/ou fenómeno na segunda amostra (ou no segundo indivíduo). Numa forma de realização, o primeiro indivíduo é exemplificado por, mas não limitado a, um indivíduo que foi manipulado utilizando as composições e/ou métodos da invenção. Numa forma de realização adicional, o segundo indivíduo é exemplificado por, mas não limitado a, um indivíduo que não foi manipulado utilizando as composições e/ou métodos da invenção. Numa forma de realização alternativa, o segundo indivíduo é exemplificado por, mas não limitado a, um indivíduo que foi manipulado, utilizando as composições e/ou métodos da invenção, numa dosagem diferente e/ou durante um período de tempo diferente e/ou através de uma via de administração diferente em comparação com o primeiro indivíduo. Numa forma de realização, o primeiro e segundo indivíduos podem ser o mesmo indivíduo, tal como quando o efeito de diferentes regimes (por exemplo, de dosagens, duração, via de administração, etc.) das composições e/ou métodos da invenção é procurado como sendo determinado num indivíduo. Noutra forma de realização, o primeiro e segundo indivíduos podem ser indivíduos diferentes, como quando se compara o efeito das composições e/ou métodos da invenção num indivíduo que participa num ensaio clínico e noutro indivíduo num hospital.
Os termos "alterar" e "modificar" quando em referência ao nível de qualquer molécula e/ou fenómeno referem-se a um aumento ou diminuição.
No presente documento, a referência a qualquer intervalo numérico inclui expressamente cada valor numérico (incluindo número fracionãrios e números inteiros) englobados por esse intervalo. Para ilustrar, e sem limitação, a referência, no presente documento, a um intervalo de "pelo menos 50" inclui números inteiros de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, etc. e número fracionãrios 50,1, 50,2, 50,3, 50,4, 50,5, 50,6, 50,7, 50,8, 50,9, etc. Numa ilustração adicional, a referência, no presente documento, a um intervalo de "pelo menos 50" inclui números inteiros de 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, etc. e número fracionários 49,9, 49,8, 49,7, 49,6, 49,5, 49,4, 49,3, 49,2, 49,1, 49,0, etc. Ainda noutra ilustração, a referência, no presente documento a um intervalo de desde "5 até 10" inclui cada número inteiro de 5, 6, 7, 8, 9 e 10, e cada número fracionário como 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, etc.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A invenção proporciona anticorpos, e fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente a um polipéptido, ou porção antigénica do mesmo, em que o polipéptido é TLDRSSVLVDGYSPNRNE (SEQ ID NO:02).
Os anticorpos e composições da invenção que contêm os mesmos são úteis em aplicações diagnósticas e terapêuticas para doenças nas quais MUC16 é sobre-expressa, como no cancro.
Utilizando péptidos sintéticos, os inventores produziram novos anticorpos específicos para a porção terminal carboxi de MUC16, retida pela célula, proximal ao sítio de clivagem putativo. Estes anticorpos foram caracterizados utilizando análise de classificação de células ativada por fluorescência, imunoensaio enzimãtico, análise de Western blot e imunohistoquímica. Cada um dos anticorpos monoclonais selecionados foi reativo contra proteína GST-AMUC16c114 recombinante e a linha celular SK0V3 transfetada com MUC16. Três anticorpos, 4H11, 9C9 e 4A5 demonstraram altas afinidades por análise de Western blot e estudos de ligação de saturação de células SK0V3 transfetadas e exibiram internaiização de anticorpos. A positividade imunohistoquímica com o novo anticorpo 4H11 foi semelhante a OC125, mas com diferenças importantes, incluindo positividade difusa no cancro de mama lobular e uma pequena percentagem de carcinomas ováricos negativos para OC125 que mostraram uma ligação do anticorpo 4H11 intensa e difusa.
As composições e métodos da invenção são úteis para aplicações de diagnóstico e terapêuticas, bem como para estudos biológicos como tráfego de recetores de membrana e eventos intracelulares. Aplicações diagnósticas incluem, por exemplo, deteção de cancro utilizando imunohistoquímica, obtenção de imagens radiogrãficas, ensaio de imunoabsorção enzimãtica (ELISA), classificação de células ativada por fluorescência (FACS), Western blot e/ou deteção por imunoprecipitação. A invenção é adicionalmente descrita sob (A) MUC16, (B) Anticorpos da técnica anterior, (C) Anticorpos da invenção, (D) Linhas celulares de hibridomas, (E) Conjugados dos anticorpos da invenção ligados a agentes citotóxicos e/ou profármacos, (F) Deteção de porções de Mucl6 e aplicações de diagnóstico, e (G) Aplicações terapêuticas. A. MUC16 "MUC16", "MUC-16" e "Mucina 16" referem-se indistintamente a uma proteína de membrana de tipo I que faz parte de uma família de mucinas fixadas. Na Figura 10 encontra-se um esquema de Mucl6 e uma sequência de aminoãcidos de MuclS humana exemplificativa (SEQ ID NO:13) é mostrada na Figura 9A. Um alinhamento de sequências de aminoãcidos de MUC16 de ratinho (SEQ ID NO:24) e MUC16 de ser humano (SEQ ID NO:25) é mostrado na Figura 20B. 0 termo "proteína de tipo 1" refere-se a uma "proteína de membrana" que está pelo menos parcialmente incorporada na bicamada lipídica de uma célula, vírus e semelhantes e que contém uma sequência de domínio transmembrana (TM) incorporada na bicamada lipídica da célula, vírus e semelhante. A porção da proteína no lado do terminal NH2 do domínio TM é exposta no lado exterior da membrana e a porção do terminal COOH é exposta no lado citoplasmático.
Recentemente, a sequência de MUC16/CA125 que codifica para ADNc foi descrita por Yin e Lloyd em 2001 e completa por 0'Brien em 2002 (10-12). A proteína MUC16 completa tem vários componentes que consistem numa cauda citoplasmática com sítios de fosforilação potenciais, um domínio transmembrana e um domínio externo proximal a um sítio de clivagem aparente. Distai ao sítio de clivagem, o domínio externo libertado contém 16-20 repetições em tandem de 156 aminoácidos, cada uma com muitos sítios de glicosilação potenciais (11) . A estrutura de repetição global (Figura 10) está bem conservada entre os mamíferos, mas as repetições não são completamente idênticas na composição de aminoácidos exata. A proteína MUC16 faz parte da família de mucinas fixadas que inclui ambas MUC1 e MUC4 (13) . MUC1 está presente numa variedade de tecidos e parece sinalizar através de uma via de beta catenina, interagir com um recetor de EGF, medeia a resistência a fármacos e pode atuar como um oncogene (14-17) . A proteína MUC4 também é expressa numa variedade de tecidos mas é comum em neoplasmas do trato gastrointestinal (18-20). Em contraste, o antigénio CAI25 foi mais restrito na sua distribuição e está presente primariamente em tecidos ginecológicos e é sobre-expresso nos neoplasmas Mullerianos (21). No entanto, o antigénio CA125, reconhecido pelo anticorpo OC125, é um antigénio fortemente glicosilado expresso na região de repetições em tandem da proteína MUC16 maior. Esta glicoproteína é tipicamente libertada a partir de um sítio de clivagem putativo no domínio extracelular da cadeia principal do péptido MUC16.
Assim, a proteína "MUC16" contém (a) um "domínio citoplasmático", (b) um "domínio transmembrana" e (c) um "domínio extracelular". O domínio extracelular de MUC16 contém um sítio de clivagem entre um ectodomínio não glicosilado e um ectodomínio glicosilado grande de repetições em tandem.
Os termos "domínio citoplasmático", "cauda citoplasmática" e "CT" são utilizados indistintamente para referir-se a uma sequência proteica, e a porções da mesma, que se encontram no lado citoplasmático da bicamada lipídica de uma célula, vírus e semelhantes. Métodos para determinar a CT de uma proteína são conhecidos na técnica (Elofsson et al. (2007) Annu. Rev. Biochem. 76:125-140,·
Bernsel et al. (2005) Protein Science 14:1723-1728).
Os termos "domínio t ransmembrana" e "TM" são utilizados indistintamente para referir-se a uma sequência proteica, e a porções da mesma, que abrange a bicamada lipídica de uma célula, vírus e semelhantes. Métodos para determinar o TM de uma proteína são conhecidos na técnica (Elofsson et al. (2007) Annu. Rev. Biochem. 76:125-140;
Bernsel et al. (2005) Protein Science 14:1723-1728).
Os termos "ectodomínio" e "domínio extracelular" são utilizados indistintamente quando em referência a uma proteína de membrana para referir-se à porção da proteína que está exposta no lado extracelular de uma bicamada lipídica de uma célula, vírus e semelhantes. Métodos para determinar o ectodomínio de uma proteína são conhecidos na técnica (Singer (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-296 e High et al. (1993) J. Cell Biol. 121:743-750 e software McVector, Oxford Molecular). A Mucl6 exemplificativa da Figura 9 contém (a) um "domínio citoplasmãtico de MUC16" desde o aminoãcido 14476 até 14507, vttrr rkkegeynvq qqcpgyyqsh ldledlq (SEQ ID NO:16), que interage com a maquinaria de transdução de sinal intracelular; (b) um "domínio transmembrana de MUC16" desde o aminoácido 14452 até 14475, fwaviligl agllgvitcl icgvl (SEQ ID NO:14) que abrange a membrana plasmática e (c) um "domínio extracelular de MUC16" desde o aminoãcido 1 a 14392 (SEQ ID NO:13) que contém um sítio de clivagem entre um ectodomínio não glicosilado e um ectodomínio glicosilado grande de repetições em tandem. 0 "ectodomínio de MUC16" é exemplificado por nfsplar rvdrvaiyee flrmtrngtq lqnftldrss vlvdgyspnr nepltgnsdl p (SEQ ID NO:17) desde o aminoãcido 14394 até 14451 da SEQ ID NO:13 da Figura 9A. 0 ectodomínio de MUC16 exemplificativo contém ambos o Polipéptido 1 (nfsplar rvdrvaiyee (SEQ ID NO:01), que vai desde o aminoácido 14394 até 14410 da SEQ ID NO: 13) e o
Polipéptido 2 (tldrss vlvdgyspnr ne (SEQ ID NO:02), que vai desde o aminoãcido 14425 até 14442 da SEQ ID NO:13), contra os quais os anticorpos de comparação e exemplificativos da invenção foram produzidos. O Polipéptido 3, cgvlvttrr rkkegeynvq qq (SEQ ID NO:03) vai desde o aminoãcido 14472 até 144 92 da SEQ ID NO: 13, e contém ambas uma porção de domínio t ransmembrana (cgvl) e uma porção de domínio citoplasmático (vttrr rkkegeynvq qq (SEQ ID NO:18)). Assim, a CGVL é opcional na SEQ ID NO:03, uma vez que faz parte do domínio transmembrana. O Polipéptido 4 (ksyf sdcqvstfrs vpnrhhtgvd slcnfspl (SEQ ID NO:15), está localizado numa porção não glicosilada do domínio extracelular de Mucl6, vai desde o aminoãcido 14367 até 14398 da SEQ ID NO:13 e contém um polipéptido de ansa de cisteína cqvstfrsvpnrhhtgvdslc (SEQ ID NO:13). B. Anticorpos da técnica anterior A expressão do antigénio MUC16/CA125 tem sido associada há muito tempo com tecidos ginecológicos. "CAI25", "CA-125", "CA125 glicosilado" e "CA-125 clivado", referem-se indistintamente ao domínio externo glicosilado da mucina fixada MUC16, que está distai ao sítio de clivagem (Payne et al., documento de patente U.S. N.° 7.202.346). Este domínio externo libertado contém 16-20 repetições em tandem de 156 aminoãcidos, cada uma com sítios de glicosilação potenciais. Uma ansa de dissulfureto à base de cisteína aparente de 19 aminoãcidos está presente em todas as repetições e a extremidade N-terminal contém uma estrutura de escova que é fortemente 0-glicosilada (11). 0 tamanho deduzido seria 2,5 MD para a parte proteica e com hidratos de carbono adicionados, isto poderia aumentar para 5 MD (10, 26). CAI2 5, embora não se j a suficientemente sensível ou específico para ser utilizados como uma ferramenta de rastreio geral, é rotineiramente utilizado para monitorizar pacientes com carcinoma ovárico. Os testes utilizados para medir CA125 são métodos de deteção baseados em anticorpos, tal como o são as colorações imunohistoquímicas realizadas rotineiramente para finalidades de diagnóstico. A especificidade de epítopo de 26 anticorpos para MUC16 foi estudada no primeiro relatório da International Society of Oncodeve1opmenta1 Biology and Medicine (ISOBM) TD-1 Workshop e a aplicação de 22 anticorpos a imunohistoquímica foi relatada no segundo relatório do TD-1 workshop (7, 21). Os anticorpos existentes foram agrupados como semelhantes a OC125, semelhantes a Mil ou semelhantes a OV197 e todos os anticorpos conhecidos reconheceram os epítopos de CA125 nos elementos de repetição, glicosilados no domínio externo da mucina fixada MUC16, distai ao sítio de clivagem putativo. A vasta maioria dos anticorpos reativos com MUC16, incluindo OC125, reagem com o antigénio dependente da glicosilação presente exclusivamente na porção clivada da molécula de modo que a distribuição verdadeira da expressão de MUC16 não é conhecida (21) . Não existe, atualmente, qualquer anticorpo disponível para rastrear o destino do fragmento proteico MUC16 restante depois da clivagem e libertação de CAI25. C. Anticorpos da xnvençao
De modo a melhor explorar a biologia de MUC16 humana, os inventores derivaram anticorpos monoclonais contra a porção extracelular do terminal carboxi de MUC16, proximal ao sítio de clivagem putativo, bem como um anticorpo monoclonal contra o domínio citoplasmãtico interno. Em contraste com anticorpos anteriores, estes são derivados contra a cadeia principal do péptido MUC16 e não estão direcionados a epítopos glicoproteicos complexos. Uma vez que estes epítopos são proximais ao sítio de clivagem, é pouco provável que sejam encontrados na circulação e proporcionam novos alvos para métodos de diagnóstico e intervenções terapêuticas. Os dados do presente documento demonstram a identificação e caracterização de anticorpos exemplificativos desenvolvidos contra a cadeia principal do péptido MUC16.
Os inventores desenvolveram novos anticorpos que estão dirigidos à cadeia principal não glicosilada, não clivada de MUC16. Estes são exemplificados por ambos os anticorpos 4H11 e 9C9, que reagem com sequências peptídicas no ectodomínio não clivado de MUC16 e são detetáveis na superfície de linhas celulares de cancro ovãrico e em tecidos fixados com parafina a partir de espécimes cirúrgicos de cancro ovárico humano. Os anticorpos mostram uma alta afinidade e são prontamente internaiizados por células de cancro ovãrico quando ligados ao ectodomínio de MUC16. Isto sugere que a porção proximal de MUC16 tem uma biologia independente da porção da mucina mais distai e clivada. Também sugere que as porções proximais de MUC16 poderia proporcionar alvos convenientes para intervenções de diagnóstico e terapêuticas. Ter como alvo a cadeia principal de MUC16 proporciona uma administração tecidual altamente específica para células geneticamente manipuladas, lipossomas, ou conjugados de anticorpos, incluindo conjugados com os anticorpos da invenção.
Os anticorpos da invenção, exemplificados pelo anticorpo 4H11, são úteis como ferramentas em imunohistoquímica. Os dados no presente documento mostram que ο 4H11 é relativamente específico para o carcinoma seroso ovãrico de grau elevado. 0 carcinoma de mama lobular invasivo é a principal exceção e mostra proteína MUC16 extensiva conforme detetado por 4H11. 0 carcinoma lobular da mama tem uma biologia única que é caracterizada por uma propensão para metastizar em superfícies serosas (27). Uma vez que MUC16 é o parceiro de ligação cognato da mesotelina, isto pode ter implicações importantes para o cancro lobular (28). As taxas de discordância para OC125 e 4H11 também sugerem que ο 4H11 pode proporcionar informações independentes, adicionais a partir de OC125 num subconjunto de carcinomas ovãricos. Alguns tumores que são negativos com OC125 retêm as porções citoplasmática e extracelular da glicoproteína MUC16, porções da molécula que estão provavelmente envolvidas na transdução de sinais potencialmente importantes no fenótipo maligno. A divulgação ensina um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente a um polipéptido, ou porção antigénica do mesmo, em que o polipéptido é exemplificado por a) polipéptido de ectodomínio de MUC16 (exemplificado por NFSPLAR RVDRVAIYEE FLRMTRNGTQ LQNFTLDRSS VLVDGYSPNR NEPLTGNSDL P (SEQ ID N0:17)), b) polipéptido de domínio citoplasmático de MUC16 (exemplificado por VTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO: 18) , que está contido em cada de CGVLVTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO:03) e LVTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO:20)) e c) polipéptido de domínio extracelular de MUC16 que contém um polipéptido de ansa de cisteína CQVST-FRSVPNRHHTGVDSLC (SEQ ID NO:19).
Uma vantagem dos anticorpos da invenção é que o anticorpo é internalizado dentro de uma célula, desta forma, sendo útil em aplicações para administração dentro de uma célula, como terapêutica de doenças. "Internalizado” quando em referência a uma molécula que é internal!zada por uma célula refere-se à passagem da molécula que está em contacto com a superfície extracelular de uma membrana celular através da membrana celular para a superfície intracelular da membrana celular e/ou para dentro do citoplasma da célula. São divulgados no presente documento métodos para determinar a internalização, incluindo a deteção de uma molécula radiomarcada dentro da célula (Figura 5B).
De acordo com a invenção, os anticorpos da invenção ligam-se especificamente ao polipéptido de ectodomínio de MUC16 que compreende o polipéptido TLDRSSVLVDGYSPNRNE (SEQ ID NO :02) . Os dados do presente documento mostram que os anticorpos da invenção e comparativos ligam-se especificamente a GST-AMUC16c114 (Exemplo 2, Quadro IA) . A especificidade dos anticorpos da invenção está em contraste com os anticorpos da técnica anterior (por exemplo, anticorpos VK8, Mil e OC125) que não se ligaram a proteína purificada de GST-AMUC16c114 ou lisados celulares da linha celular SKOV3-phrGFP-AMUC6c114 (Exemplo 2, Figura 2).
Numa forma de realização adicional, os anticorpos da invenção carecem de ligação específica a um domínio extracelular MUC16 glicosilado, exemplificado por CA-125 clivado descrito em Payne et al., documento de patente U.S. N.° 7.202.346.
As regiões VL e VH dos anticorpos da invenção, compreendem uma cadeia pesada variável (VH) codificada pela SEQ ID NO:06 (ou seja, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 4H11 da Figura 8) e uma cadeia leve variável (VJ codificada pela SEQ ID NO: 07 (ou seja, a sequência de aminoácidos da cadeia leve variável (VL) do anticorpo 4H11 da Figura 8). Numa forma de realização particular, o anticorpo é quimérico, em que pelo menos uma das cadeias VH e VL está fusionada com uma região constante de imunog1obu1ina humana. A divulgação ensina um anticorpo que se liga especif icamente ao Polipéptido 2 (SEQ ID NO: 02) do polipéptido de ectodomínio de MUC16, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada variável (VH) codificada pela SEQ ID NO:04 (ou seja, a sequência de nucleótidos da cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 4A5 da Figura 8) e uma cadeia leve variável (VL) codificada pela SEQ ID NO: 05 (ou seja, a sequência de nucleótidos da cadeia leve variável (VL) do anticorpo 4A5 da Figura 8) . 0 anticorpo pode ser quimérico em que pelo menos uma das cadeias VH e VL está covalentemente ligada a uma região constante de imunog1obulina humana. A divulgação ensina um anticorpo que se liga especif icamente ao Polipéptido 1 (SEQ ID NO: 01) do polipéptido de ectodomínio de MUC16, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada variável (VH) codificada pela SEQ ID NO:08 (ou seja, a sequência de nucleótidos da cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 9B11 da Figura 8) e uma cadeia leve variável (VL) codificada pelo menos por uma de SEQ ID NO:09 (ou seja, sequência de nucleótidos da cadeia leve variável (VL.A) do anticorpo 9B11 da Figura 8) e SEQ ID NO: 10 (ou seja, a sequência de nucleótidos da cadeia leve variável (VL.B) do anticorpo 9B11 da Figura 8) . O anticorpo pode ser quimérico em que pelo menos uma das cadeias VH e VL está covalentemente ligada a uma região constante de imunoglobulina humana.
Embora não se pretenda restringir a fonte do antigénio ao qual os anticorpos da invenção se ligam, numa forma de realização, o polipéptido de ectodomínio MUC16 é expresso por uma célula. Dados do presente documento mostram que os anticorpos exemplificativos da invenção se ligam a células SK0V3 transduzidas com phrGFP-AMUC16c114 (Exemplo 2) . A divulgação ensina anticorpos que se ligam especificamente ao polipéptido de domínio citoplasmático de MUC16 que compreende VTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO:18). Numa forma de realização particular, o polipéptido de domínio citoplasmático de MUC16 compreende o Polipéptido 3 CGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQ (SEQ ID NO :03) . 0 polipéptido de domínio citoplasmático de MUC16 pode ser expresso por uma célula. Por exemplo, os dados do presente documento mostram que um anticorpo exemplificativo se liga a células SK0V3 transduzidas com phrGFP-AMUC16c114 (Exemplo 2) . A célula pode ser permeabilizada para facilitar a internalização do anticorpo na célula de modo que entre em contacto com o seu antigénio citoplasmático.
A divulgação ensina anticorpos que se ligam ao polipéptido de domínio extracelular de MUC16 que contém um polipéptido de ansa de cisteína CQVSTFRSVPNRHHTGVDSLC (SEQ ID N0:19). 0 polipéptido de domínio extracelular de MUC16 pode compreender o Polipéptido 4 KSYF SDCQVSTFRS VPNRHHTGVD SLCNFSPL (SEQ ID NO:15). A divulgação ensina um anticorpo que se liga especif icamente ao Polipéptido 4 (SEQ ID NO: 15) do polipéptido de domínio extracelular de MUC16, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada variável (VH) codificada pela SEQ ID NO: 11 (ou seja, a sequência de aminoãcidos da cadeia pesada variável (VH) do anticorpo 24B3 da Figura 8) e uma cadeia leve variável (VL) codificada pela SEQ ID NO: 12 (ou seja, a sequência de aminoãcidos da cadeia leve variável (VL) do anticorpo 24B3 da Figura 8). A invenção contempla anticorpos quiméricos (veja-se o documento de patente U.S. N.0 7.662.387), anticorpos monoclonais, anticorpos recombinantes, um fragmento de ligação a antigénio de um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado e um anticorpo exibido na superfície de um fago (documento de patente U.S. N. 0 7.202.346) . Em particular, a invenção contempla fragmentos de anticorpos que contêm o idiotipo ("região de ligação a antigénio" ou "fragmento de ligação a antigénio") da molécula de anticorpo. Por exemplo, tais fragmentos de ligação a antigénio incluem, mas não estão limitados, à região Fab, fragmento F(ab')2, fragmento pFc' e fragmentos Fab'. A "região Fab" e "região de ligação a antigénio de fragmento", referem-se indistintamente à porção dos braços do anticorpo da imunoglobulina "Y que funcionam na ligação ao antigénio. A região Fab está composta por um domínio constante e um variável a partir de cada cadeia pesada e leve do anticorpo. São conhecidos na técnica métodos para a construção de bibliotecas de expressão de Fab (Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)) para permitir uma identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada. Noutra forma de realização, os fragmentos Fc e Fab podem ser gerados utilizando a enzima papaina para clivar um monómero de imunoglobulina em dois fragmentos Fab e um fragmento Fc. A enzima pepsina cliva abaixo da região de dobradiça, de modo que se formam um "fragmento F(ab')2" e um "fragmento pFc'". 0 fragmento F (ab') 2 pode ser dividido em dois "fragmentos Fab' " por redução moderada. A invenção também contempla um fragmento de "anticorpo de cadeia simples", ou seja, uma sequência de aminoãcidos tendo pelo menos uma das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) ou variáveis do anticorpo completo e que carece de alguns ou todos os domínios constantes do anticorpo. Estes domínios constantes não são necessariamente para a ligação a antigénios, mas constituem uma porção principal da estrutura de anticorpos completos. Fragmentos de anticorpo de cadeia simples são mais pequenos que os anticorpos completos e podem, portanto, ter uma permeabilidade capilar maior do que os anticorpos completos, permitindo que os fragmentos de anticorpo de cadeia simples se localizem e se liguem a sítios de ligação a antigénio alvo de forma mais eficaz. Igualmente, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos numa escala relativamente grande em células procarióticas, facilitando assim a sua produção. Adicionalmente, o tamanho relativamente pequeno dos fragmentos de anticorpo de cadeia simples torna-os menos propensos a provocar uma resposta imunitária num recetor do que os anticorpos completos. São conhecidas técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples (documento U.S. 4.946.778). As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves podem ser fusionadas em conjunto para formar um "fragmento variável de cadeia simples" ("fragmento scFv"), que tem apenas metade do tamanho do fragmento Fab, no entanto, retém a especificidade original da imunoglobulina parental. A "região Fc" e "região cristalizável de fragmento" referem-se indistintamente à porção da base da i munog1obu1ina "Y" que funciona no papel de modular a atividade de células imunitárias. A região Fc está composta por duas cadeias pesadas que contribuem com dois ou três domínios constantes dependendo da classe do anticorpo. Ao ligar-se a proteínas específicas, a região Fc assegura que cada anticorpo gera uma resposta imunitária apropriada para um dado antigénio. A região Fc também se liga a vários recetores celulares, como recetores Fc e outras moléculas imunitárias, como proteínas complementares. Ao fazer isto, medeia diferentes efeitos fisiológicos incluindo opsonização, lise celular e desgranulação de mastócitos, basófilos e eosinófilos. Numa configuração experimental, os fragmentos Fc e Fab podem ser gerados no laboratório clivando um monómero de imunog1obulina com a enzima papaína em dois fragmentos Fab e um fragmento Fc. A invenção contempla anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais. "Anticorpo policlonal" refere-se a uma i munog 1 obu li na produzida a partir de mais do que um clone único de células plasmáticas; em contraste "anticorpo monoclonal" refere-se a uma imunog1obulina produzida a partir de um clone único de células plasmáticas. Métodos genéricos estão disponíveis para produzir anticorpos monoclonais e policlonais que são específicos para um polipéptido desejável. Para a produção de anticorpos monoclonais e policlonais, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com o péptido correspondente a qualquer molécula de interesse na presente invenção, incluindo, mas não limitados a, hámsteres, coelhos, ratinhos, ratos, ovelhas, cabras, etc. Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares contínuas em cultura pode ser utilizada (veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI) . Estes incluem, mas não estão limitados, à técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kôhler e Milstein (Kôhler e Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), a técnicas utilizando animais isentos de germes e utilizando tecnologia como aquela descrita no documento PCT/US90/02545, bem como a técnica de trioma, a técnica do hibridoma de células B humanas (veja-se, por exemplo, Kozbor et ai., Immunol. Today, 4:72 (1983)), e a técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et ai., em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc ., pp. 77-96 (1985)) . Em algumas formas de realização particularmente preferidas da presente invenção, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais.
Também estão contemplados anticorpos quiméricos. Como utilizado no presente documento, o termo "anticorpo quimérico" contém porções de dois anticorpos diferentes, tipicamente de duas espécies diferentes. Veja-se, por exemplo: o documento de Patente U.S. N.° 4.816.567 para Cabilly et ai./ o documento de Patente U.S. N. ° 4.978.745 para Shoemaker et ai.; o documento de Patente U.S. N. ° 4.975.369 para Beavers et ai. e o documento de patente U.S. N.° 4.816.397 para Boss et ai. Os anticorpos quiméricos incluem imunoglobulinas monovalentes, divalentes ou polivalentes. Um anticorpo quimérico monovalente é um dímero (HL) formado por uma cadeia H quimérica associada através de pontes de dissulfureto com uma cadeia L quimérica. Um anticorpo quimérico divalente é um tetrâmero (H2L2) formado por dois dímeros HL associados através de pelo menos uma ponte de dissulfureto. Um anticorpo quimérico polivalente também pode ser produzido, por exemplo, empregando uma região Hc que agrega (por exemplo, cadeia H de IgM). A invenção também contempla "anticorpos humanizados", isto é, anticorpos quiméricos que têm regiões constantes derivadas substancial ou exclusivamente a partir de regiões constantes de anticorpo humano e regiões variáveis derivadas substancial ou exclusivamente a partir da sequência da região variável a partir de um mamífero diferente de um ser humano. Os anticorpos humanizados têm preferentemente regiões constantes e regiões variáveis diferentes das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) derivadas substancial ou exclusivamente a partir das regiões de anticorpo humano correspondentes e CDRs derivadas substancial ou exclusivamente a partir de um mamífero diferente de um ser humano. Assim, numa forma de realização, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nas quais resíduos a partir de uma região hipervariável do recetor são substituídas por resíduos a partir de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) como um ratinho, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de região estrutural(FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recetor ou no anticorpo dador. Estas modificações são geralmente feitas para refinar adicionalmente o desempenho dos anticorpos. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todos os resíduos FR são os de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Os anticorpos humanizados podem ser gerados utilizando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, documento de Patente U.S. N.0 5.225.539 para Winter et al., incluindo utilizando hibridomas humanos (Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A.80:2026-2030 (1983)) ou transformando células B humanas com vírus EBV in vitro (Cole et al., em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96 (1985)). Métodos adicionais incluem, por exemplo, geração de animais não humanos transgénicos que contém genes de cadeia de imunoglobulina humana e que são capazes de expressar estes genes para produzir um repertório de anticorpos de vários isotipos codificados pelos genes de imunoglobulina humana (documentos de patente U.S. N.°s 5.545.806; 5.569.825 e 5.625.126). Os anticorpos humanizados também podem ser feitos por substituição das regiões de determinação de complementaridade de, por exemplo, um anticorpo de ratinho, num domínio de região estrutural (Pub. PCT N.° W092/22653).
De forma importante, os métodos iniciais para humanizar anticorpos resultaram frequentemente em anticorpos com menor afinidade do que o material de partida de anticorpo não humano. Abordagens mais recentes para humanizar anticorpos resolvem este problema fazendo alterações às CDRs. Veja-se a Publicação de Pedido de Patente U.S. N.0 20040162413. Em algumas formas de realização, os anticorpos humanizados da invenção contêm uma região variável heteronaérica otimizada (por exemplo, que pode ou não fazer parte de outra molécula de um anticorpo completo) tendo uma afinidade de ligação a antigénio igual ou superior do que uma região variável heteromérica dadora, em que a região variável heteromérica dadora compreende três CDRs dadoras de cadeia leve e em que a região variável heteromérica otimizada compreende: a) uma região variável alterada de cadeia leve que compreende; i) quatro regiões estruturais de cadeia leve de linha germinal humana, e ii) três CDRs de região variável alterada de cadeia leve, em que pelo menos uma das três CDRs de região variável alterada de cadeia leve é uma variante de CDR dadora de cadeia leve e em que a variante de CDR dadora de cadeia leve compreende um aminoácido diferente em apenas uma, duas, três ou quatro posições em comparação com uma das três CDRs de cadeia leve (por exemplo, a pelo menos uma variante de CDR dadora de cadeia leve é idêntica a uma das CDRs dadoras de cadeia leve exceto uma, duas, três ou quatro diferenças de aminoãcidos).
Os anticorpos quiméricos contendo sequências de aminoãcidos que estão fusionadas a regiões constantes a partir de anticorpos humanos, ou a toxinas ou a moléculas com efeito citotóxico, são conhecidos na técnica (por exemplo, documentos de patente U.S. N. 0 7.585.952; 7.227.002; 7.632.925; 7.501.123; 7.202.346; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 7.202.346; 6.340.701; 6.372.738; 7.202.346; 5.846.545; 5.585.499; 5.475.092; 7.202.346; 7.662.387; 6.429.295; 7.666.425 e 5.057.313).
Os anticorpos que são específicos para um antigénio particular podem ser rastreados utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, documento de patente U.S. N.0 7.202.346) e os divulgados no presente documento. Por exemplo, na produção de anticorpos, o rastreio por um anticorpo desejado pode ser alcançado por radioimunoensaio, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimãtica), imunoensaios tipo "sandwich", ensaios imunoradiométricos, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (por exemplo, utilizando ouro coloidal, marcadores enzimáticos ou radioisótopos), Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (por exemplo, ensaios de agutinação em gel, ensaios de hemaglutinação, etc.), ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A e ensaios de imunoeletroforese, etc.
Numa forma de realização, a deteção da ligação a anticorpos é feita detetando um marcador no anticorpo primário. Noutra forma de realização, a deteção do anticorpo primário é feita detetando a ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário. Numa forma de realização adicional, o anticorpo secundário é marcado. São conhecidos muitos meios na técnica para detetar a ligação num imunoensaio e estão dentro do âmbito da presente invenção. Tal como é bem conhecido na técnica, o péptido imunogénico deveria ser proporcionado livre da molécula portadora utilizada em qualquer protocolo de imunização. Por exemplo, se o péptido estivesse conjugado com KLH, ele pode ser conjugado com BSA, ou utilizado diretamente, num ensaio de rastreio. A divulgação ensina anticorpos que são anticorpos monoclonais produzidos por uma linha celular de hibridoma. 0 anticorpo monoclonal pode ligar-se especificamente a um polipéptido de ectodomínio de MUC16 que compreende o Polipéptido 1 (SEQ ID NO:01), como exemplificado pelo anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 9B11.20.16, 10A2, 2F4, 23D3, 30B1 e 31B2 (Quadros 1 e 2) . Numa forma de realização preferida, o anticorpo é 9B11.
Num ensinamento, o anticorpo monoclonal liga-se especificamente a um polipéptido de ectodomínio de MUC16 que compreende o Polipéptido 2 (SEQ ID NO: 02), em que o anticorpo é exemplificado por 4H11.2.5, 13H1, 29G9, 9C9.21.5.13, 28F8, 23G12, 9C7.6, 11B6, 25G4, 5C2.17, 4C7, 26B2, 4A5.37, 4A2, 25H3 e 28F7.18.10 (Quadros 1 e 2). Numa forma de realização preferida, o anticorpo é exemplificado por 4H11.2.5, 4A5.37, 9C9.21.5.13, 28F7.18.10, 9C7.6 e 5C2.17. A divulgação ensina um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipéptido de domínio citoplasmático de MUC16 que compreende o Polipéptido 3 CGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQ (SEQ ID NO :03), em que o anticorpo é exemplificado por 31A3.5.1, 19D1, 10F6, 22E10, 22F1,3H8, 22F11,4D7, 24G12, 19G4, 9A5, 4C2, 31C8, 27G4 e 6H2 (Quadros 1 e 2). 0 anticorpo pode ser 31A3.5.1. A divulgação ensina um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipéptido de domínio extracelular de MUC16 que compreende o Polipéptido 4 KSYF SDCQVSTFRS VPNRHHTGVD SLCNFSPL (SEQ ID NO:15), em que o anticorpo é exemplificado por 24B3 e 9C7 (Quadro 2).
Os anticorpos e métodos da invenção para a sua utilização (tanto diagnóstica como terapêutica) são específicos de doença. "Especificidade" de um método e/ou molécula para uma doença, como "especificidade para cancro" que é indistintamente utilizada com "especificidade de cancro", refere-se à proporção (por exemplo, percentagem, fração, etc.) de negativos (ou seja, indivíduos saudáveis que não têm a doença) que são corretamente identificados, isto é, a percentagem de indivíduos saudáveis que são corretamente identificados como não tendo a doença. A especificidade pode ser calculada de acordo com a seguinte equação:
Especificidade = número de negativos verdadeiros / (número de negativos verdadeiros + número de falsos positivos).
Assim, em algumas formas de realização, as composições e/ou métodos da invenção têm uma "especificidade para cancro" superior a 50 %, incluindo qualquer valor numérico desde 51 % até 100 %, como 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % e 99 %. Embora uma especificidade de 100 % seja mais desejável, isto é, não prever alguém a partir do grupo saudável como tendo cancro, ela não é necessária. Os dados no presente documento demonstram a especificidade para o cancro da invenção (Quadro 3).
Em formas de realização alternativas, a especificidade (juntamente com a sensibilidade) é expressa como uma medida estatística do desempenho de um teste de classificação binária, como utilizando uma curva de característica de operação do recetor (Receiver Operator Characteristic, ROC). Para qualquer teste, existe normalmente uma troca entre a especificidade e a sensibilidade. Por exemplo: nos testes de rastreio de cancro de indivíduos humanos, é indesejável arriscar identificar falsamente pessoas saudáveis como tendo cancro (baixa especificidade), devido aos custos elevados. Estes custos são tanto físicos (procedimentos de risco desnecessários) como financeiros. Esta troca pode ser representada graficamente utilizando uma curva ROC. "Curva de característica de operação do recetor" e "curva ROC" referem-se a um gráfico da taxa positiva verdadeira (ou seja, sensibilidade) frente à taxa negativa (ou seja, 1-especificidade). 0 resultado medido do teste é representado no eixo do x enquanto o eixo do y representa o número de indivíduos de controlo (por exemplo, saudáveis) ou de caso (por exemplo, cancro) . Para qualquer ponto de corte dado (cada ponto ao longo do eixo x) pode ser medida uma sensibilidade e especificidade do ensaio. 0 intervalo de sensibilidade e especificidade para qualquer dado ensaio pode variar desde 0 % até 100 %, dependendo do ponto de corte selecionado. Por este motivo, em algumas formas de realização preferidas, a AUC é utilizada como a medida padrão da especificidade e/ou sensibilidade de um ensaio. A "área sob a curva" ("AUC") para o gráfico de curva ROC é igual à probabilidade de um classificador classificar uma instância positiva escolhida aleatoriamente de forma mais alta do que uma negativa escolhida aleatoriamente. Assim, a AUC é uma medida geral da capacidade de um teste para discriminar com sucesso entre indivíduos de caso (por exemplo, cancro) e controlo (por exemplo, saudáveis). O acaso aleatório poderia gerar uma AUC de 0,5. Como tal, numa forma de realização, testes úteis têm preferentemente AUCs superiores a 0,50, incluindo qualquer valor desde 0,51 até 1,00, tal como desde 0,55 até 1,00, desde 0,60 até 1,00, desde 0,65 até 1,00, desde 0,70 até 1,00, desde 0,75 até 1,00, desde 0,80 até 1,00, desde 0,85 até 1,00, desde 0,90 até 1,00, desde 0,95 até 1,00 e mais preferentemente 1,00. Valores de AUC superiores a 0,50, incluem 0,51, 0,52, 0,52, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,60, 0,61, 0,62, 0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87, 0,88, 0,89, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 e 0,99.
Os anticorpos e métodos da invenção para a sua utilização (tanto diagnóstica como terapêutica) são sensíveis para doenças. "Sensibilidade" de um método e/ou molécula para uma doença, como "sensibilidade para cancro" que é indistintamente utilizada com "sensibilidade de cancro", refere-se à proporção (por exemplo, percentagem, fração, etc.) de positivos (ou seja, indivíduos que têm cancro) que são corretamente identificados como tal (por exemplo, a percentagem de pessoas com cancro que são identificados como tendo a condição). A sensibilidade pode ser calculada de acordo com a seguinte equação,· Sensibilidade = número de positivos verdadeiros / (número de positivos verdadeiros + número de falsos negativos).
Assim, em algumas formas de realização, as composições e/ou métodos da invenção têm uma "sensibilidade para doença", como uma "sensibilidade para cancro", superior a 50 %, incluindo qualquer valor numérico desde 51 % até 100 %, como 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % e 99 %. Embora uma sensibilidade de 100 % seja mais desejável (ou seja, prever todos os indivíduos do grupo de cancro como tendo cancro), ela não é necessária.
Em formas de realização alternativas, as composições e/ου métodos da invenção têm uma "sensibilidade para doença", como uma "sensibilidade para cancro", igual ou inferior a 50 %, incluindo qualquer valor numérico desde 0 % até 50 %, como 1%, 2%, 3%, 4%, 6%, 6%, 7 %, 8%, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 % e 49 %.
Em algumas formas de realização, a sensibilidade (juntamente com a especificidade) é expressa como uma medida estatística do desempenho de um teste de classificação binária, como utilizando a AUC de uma curva ROC, como discutido anteriormente em relação à especificidade. D. Linhas celulares de hibridomas
Além dos novos anticorpos da invenção, a invenção também proporciona linhas celulares de hibridoma que produzem estes anticorpos. "Célula de hibridoma" refere-se a uma linha celular produzida pela fusão de uma célula B produtora de anticorpo específico com uma célula de mieloma (cancro de células B) que é selecionada pela sua capacidade de crescer em cultura de tecidos e por uma ausência de síntese de cadeias de anticorpo. Os anticorpos produzidos pela célula de hibridoma são todos de uma única especificidade e são, portanto, anticorpos monoclonais (em contraste com os anticorpos policlonais). A divulgação ensina linhas celulares de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipéptido, ou porção antigénica do mesmo, selecionado a partir do grupo que consiste em a) polipéptido de ectodomínio de MUC16 (por exemplo, NFSPLAR RVDRVAIYEE FLRMTRNGTQ LQNFTLDRSS VLVDGYSPNR NEPLTGNSDL P (SEQ ID NO:17)), b) polipéptido de domínio citoplasmático de MUC16 (por exemplo, VTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO:18)) e c) polipéptido de domínio extracelular de MUC16 que contém um polipéptido de ansa de cisteína CQVSTFRSVPNRHHTGVDSLC (SEQ ID NO :19) . A SEQ ID NO: 18 do polipéptido de MUC16 está contida dentro de LVTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO:20) . Assim, a SEQ ID NO:20 contém ambos um aminoácido de domínio transmembrana (L) e uma porção de domínio citoplasmático VTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO: 18) , ou seja, o L é opcional, uma vez que faz parte do domínio transmembrana. A SEQ ID NO:18 do polipéptido de MUC16 está também contida dentro de CGVLVTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO :03) . Assim, a SEQ ID NO: 03 contém ambos uma porção de domínio transmembrana (CGVL) e uma porção de domínio citoplasmático VTTRR RKKEGEYNVQ QQ (SEQ ID NO:18), ou seja, o CGVL é opcional, uma vez que faz parte do domínio transmembrana. E. Conjugados dos anticorpos da invenção ligados a agentes citotóxicos e/ou profármacos A invenção contempla anticorpos conjugados. Um anticorpo "conjugado" refere-se a um anticorpo da presente invenção covalentemente ligado a um agente citotóxico e/ou a um profármaco de um agente citotóxico. "Agente citotóxico" refere-se a qualquer agente que seja capaz de reduzir o crescimento de, e/ou matar, uma célula alvo. Um "profármaco" representa um análogo de um agente citotóxico que carece substancialmente de atividade citotóxica até ser submetido a uma etapa de ativação. As etapas de ativação podem incluir clivagem enzimática, uma etapa de ativação química como exposição a uma etapa redundante ou de ativação física como fotólise. A ligação covalente entre os anticorpos da invenção e o agente citotóxico ou profármaco pode incluir ligações cliváveis como ligações dissulfureto, que podem resultar vantajosamente na clivagem da ligação covalente dentro do ambiente redutor da célula alvo. Tais conjugados são úteis como agentes terapêuticos específicos para células tumorais.
Numa forma de realização, o agente citotõxico é uma molécula farmacológica pequena (Payne et al., documento de patente U.S. N. 0 7.202.346). Noutra forma de realização, o agente citotóxico é um maitansinoide, um análogo de um maitansinoide, um profármaco de um maitansinoide ou um profãrmaco de um análogo de um maitansinoide (documentos de patente U.S. 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 7.202.346). Noutra forma de realização, o agente citotóxico pode ser um taxano (vejam-se os documentos de patente U.S. N. °s 6.340.701 e 6.372.738 e 7.202.346) ou análogo de CC-1065 (vejam-se os documentos de patente U.S. N.°s 5.846.545; 5.585.499; 5.475.092 e 7.202.346).
Noutra forma de realização, o agente citotóxico é exemplificado por uma auristatina, um agente de ligação ao sulco menor de ADN, um agente alquilante de sulco menor de ADN, uma enediína, uma duocarmicina, um maitansinoide e um alcaloide da vinca (documento de patente U.S. N.0 7.662.387) .
Numa forma de realização adicional, o agente citotóxico é um agente anti-1ubu1ina (documento de patente U.S. N. ° 7.662.387). Ainda noutra forma de realização, o agente citotóxico é exemplificado por dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina-p-fenilenodiamina (AFP), dovalina-valina-dolaisoleunina-dolaproina- fenilalanina (MMAF) e monometil auristatina E (MAE) (documento de patente U.S. N.° 7.662.387).
Numa forma de realização adicional, o agente tóxico é exemplificado por radiação de emissão de radioisótopo, imunomodulador, lectina e toxina (documento de patente U.S. N.° 6.429.295). Em particular, a radiação de emissão de radioisótopo é um emissor alfa selecionado a partir do grupo que consiste em 212Bi, 2“Bi e 211At, ou um emissor beta selecionado a partir do grupo que consiste em 186Re e 90Y, ou um emissor gama 131I (documento de patente U.S. N.0 7.666.425) .
Numa forma de realização alternativa, a toxina é exemplificada por ricina, a cadeia A da ricina e proteína antiviral de tintureira (documento de patente U.S. N. 0 5.057.313) .
Ainda noutra forma de realização, o agente citotóxico é um fármaco anti-cancro selecionado a partir do grupo que consiste em metotrexato, 5-fluorourac ilo, cicloheximida, daunomicina, doxorrubicina, clorambucilo, trenimon, mostarda de fenilenodiamina, adriamicina, bleomicina, citosina arabinõsido ou ciclofosfamida (documento de patente U.S. N.° 5.057.13). F. Deteção de porções de Mucl6 e aplicações de diagnóstico A invenção proporciona um método para detetar uma doença que compreende a sobre-expressão de MUC16 num indivíduo, em que o método compreende a) proporcionar i) uma amostra a partir de um indivíduo e ii) qualquer um ou mais dos anticorpos da invenção, b) colocar a amostra em contacto com o anticorpo sob condições para a ligação específica do anticorpo com o seu antigénio cognato, e c) detetar um nível aumentado de ligação do anticorpo com a amostra em comparação com uma amostra de controlo que carece da doença, detetando, desta forma, a doença no indivíduo. Métodos genéricos para detetar doenças utilizando anticorpos são conhecidos na técnica (Payne et al. , documento de patente U.S. N. 0 7.202.346) . Os métodos da invenção são particularmente úteis na deteção de cancro, como cancro ovárico e cancro da mama.
Os métodos da invenção não estão limitados a uma abordagem particular para detetar a ligação dos anticorpos da invenção aos seus antigénios. Numa forma de realização, a deteção da ligação aos anticorpos da invenção envolve, tipicamente, a utilização de anticorpos que são marcados com uma fração detetável, como um radioisótopo (por exemplo, 3H, 14C, 32P, 35S e/ou i25I) , um composto fluorescente ou quimioluminescente (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina e/ou luciferina) e/ou uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina, beta-galactosidase e/ou peroxidase de rábano). Métodos para conjugar anticorpos com uma fração detetável são conhecidos na técnica (por exemplo, Hunter, et al. , Nature 144:945 (1962); David, e at., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981) ; e Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982) .
Assim, os anticorpos da invenção podem ser empregues em imunoensaios, como ensaios de ligação competitivos, ensaios tipo sandwich diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação, incluindo imunohistoquímica, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), classificação de células ativada por fluorescência (FACS) e Western blots.
Por exemplo, em relação à deteção imunohistoquímica, os dados do presente documento demonstram que o anticorpo 4H11 é útil na deteção de carcinoma seroso ovárico de grau elevado, cancro lobular (28) e um subconjunto de carcinomas ováricos que são negativos com OC125 e que retêm as porções citoplasmáticas e extracelulares da glicoproteína MUC16.
Os anticorpos da invenção também são úteis para a obtenção de imagens radiográficas in vivo, em que um anticorpo marcado com uma fração detetável como um radioisótopo ou agente radiopaco é administrado ao indivíduo, preferentemente na corrente sanguínea, e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro é avaliada. Esta técnica de obtenção de imagens é útil no estadiamento e tratamento de neoplasias malignas.
Os anticorpos da invenção são adicionalmente adequados como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados num suporte adequado, como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica, para capturar e purificar moléculas que contêm antigénios que se ligam especificamente aos anticorpos da invenção. G. Aplicações terapêuticas A invenção proporciona métodos para o tratamento de uma doença que compreende a sobre-expressão de MUC16, que compreendem administrar a um indivíduo que tem a doença, uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais dos anticorpos da invenção. Métodos genéricos para tratar doenças com anticorpos são conhecidos na técnica (Payne et al., documento de patente U.S. N.° 7.202.346). Os métodos da invenção são particularmente úteis no tratamento de cancro, como cancro ovárico e cancro da mama. Estes métodos também são aplicáveis a cancro primário, cancro metastãtico e cancro recorrente. 0 termo "administrar" a um indivíduo significa proporcionar uma molécula a um indivíduo. Isto pode ser feito utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Erickson et al., documento de Patente U.S. N.° 6.632.979; Furuta et al., documento de Patente U.S. N.0 6.905.839; Jackobsen et al., documento de Patente U.S. N.0 6.238.878; Simon et al., documento de Patente U.S. N. ° 5.851.789). As composições da invenção podem ser administradas profilaticamente (ou seja, antes da observação dos sintomas de doença) e./ou terapeut icamente (ou seja, depois da observação dos sintomas de doença). A administração também pode ser concomitante com (ou seja, ao mesmo tempo que, ou durante) a manifestação de um ou mais sintomas de doença. Igualmente, as composições da invenção podem ser administradas antes, concomitantemente com, e/ou depois da administração de outro tipo de fármaco ou procedimento terapêutico (por exemplo, cirurgia). Métodos de administração das composições da invenção incluem, sem limitação, administração em formas parentéricas, orais, intraperitoneais, intranasais, tópicas e sublinguais. As vias de administração parentéricas incluem, por exemplo, injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraesternal e vias de infusão.
Numa forma de realização, as composições da invenção compreendem um lípido para administração como lipossomas. Métodos para gerar tais composições são conhecidos na técnica (Borghouts et al. (2005). J Pept Sei 11, 713-726; Chang et al. (2009) PLoS One 4, e4171; Faisal et al. (2009) Vaccine 27, 6537-6545; Huwyler et al. (2008) Int J Nanomedicine 3, 21-29; Song et al. (2008) Int J Pharm 363, 155-161; Voinea et al. J Cell Mol Med 6, 465-474) . 0 tratamento com anticorpos de seres humanos com cancro é conhecido na técnica, por exemplo, nos documentos de patente U.S. N.°s 5.736.137; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 7.202.346; 6.340.701; 6.372.738; 7.202.346; 5.846.545; 5.585.499; 5.475.092; 7.202.346; 7.662.387; 7.662.387; 6.429.295; 7.666.425; 5.057.313.
Os anticorpos da invenção podem ser administrados com veículos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes e/ou excipientes. Exemplos de veículos, diluentes e/ou excipientes adequados incluem: (1) solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, pH cerca de 7,4, contendo cerca de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albumina sérica humana, (2) solução salina a 0,9 % (NaCl 0,9 % p/v) e (3) dextrose a 5 % (p/v).
Os anticorpos da invenção são tipicamente administrados numa quantidade terapêutica. Os termos "quantidade terapêutica", "quantidade f armac eut i c ament e eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quantidade biologicamente eficaz", são utilizados indistintamente no presente documento para referir-se a uma quantidade que é suficiente para alcançar um resultado desejado, seja quantitativo ou qualitativo. Em particular, uma quantidade farmaceuticamente eficaz é aquela quantidade que resulta na redução, atraso e/ou eliminação de efeitos indesejáveis (como patológicos, clínicos, bioquímicos e semelhantes) que estão associados com doença. Por exemplo, uma "quantidade terapêutica que reduz o cancro" é uma quantidade que reduz, atrasa e/ou elimina um ou mais sintomas de cancro.
Por exemplo, "dosagens" específicas de uma "quantidade terapêutica" dependerão da via de administração, do tipo de indivíduo a ser tratado e das características físicas do indivíduo específico sob consideração. Estes fatores e a sua relação com a determinação desta quantidade são bem conhecidos para os peritos nas técnicas médica, veterinária e outras relacionadas. Esta quantidade e o método de administração podem ser personalizados para alcançar a eficácia ótima, mas dependerão de tais fatores como o peso, dieta, medicação concorrente e outros fatores, que os peritos na especialidade reconhecerão. A quantidade e frequência de dosagem são selecionadas para criar um nível eficaz do composto sem efeitos substancialmente prejudiciais.
Quando presente numa forma farmacêutica aquosa, em vez de ser liofilizado, o anticorpo será tipicamente formulado a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml até 100 mg/ml.
Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 0,015 a 15 mg de anticorpo/kg de peso do paciente é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações, ou por infusão contínua. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas de doença.
Os métodos da presente invenção podem ser praticados in vitro, in vivo ou ex vivo.
PARTE EXPERIMENTAL
Os seguintes exemplos servem para ilustrar determinadas formas de realização e aspetos preferidos da presente invenção e não se destinam a ser interpretados como limitando o âmbito da mesma. EXEMPLO 1
Materiais e métodos 0 que se segue é uma breve descrição dos materiais e métodos exemplificativos utilizados nos Exemplos subsequentes. Alguns anticorpos descritos são proporcionados por meio de antecedentes e/ou para propósitos comparativos.
Culturas celulares:
As linhas celulares 0VCAR3, SK0V3 e A2780 foram obtidas através da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, e mantidas em cultura de acordo com a literatura da ATCC. Para a criação de linhas celulares transfetadas MUC16 + , a porção do terminal carboxi do ADNc de MUC16 foi introduzida como proteínas de fusão de proteína fluorescente verde utilizando o sistema de expressão de vetor phrGFP Vitality (Stratagene, La Jolla, CA) . Linhas celulares estáveis foram selecionadas utilizando geneticina (G418, Invitrogen, Grand Island, NI) nos seus meios de cultura respetivos e isoladas por expressão de proteína fluorescente verde. Os transfetantes estáveis foram rotineiramente mantidos em G418 nos seus meios de cultura, respetivamente. Os transfetantes AMUC16c114 têm expressão de superfície celular de proteína MUC16 a partir do sítio de clivagem putativo até ao terminal carboxi (AA 1776 até 1890) (12).
Preparação monoclonal:
Utilizando a sequência de MUC16, foram sintetizados elementos de codificação de sequências peptídicas da sequência de aminoácidos de AMUC16c114 na Instalação Nuclear de Microquímica do Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC). Os inventores sintetizaram 3 polipéptidos (Figura 1) e modificaram o Polipéptido 1 e Polipéptido 2 com uma cisteína no terminal N para uma melhor conjugação com KLH. Concentrações iguais do péptido conjugado com KLH foram misturadas e depois utilizadas como o imunogénio para 5 ratinhos BALB/c. Os inventores selecionaram 1 dos 5 ratinhos cujo soro mostrou a reatividade mais elevada frente a péptidos individuais por ELISA, e a Instalação Nuclear de Anticorpos Monoclonais do MSKCC realizou a fusão e selecionou os anticorpos utilizando protocolos padrão. Depois de 10 dias de fusão, os sobrenadantes foram selecionados e rastreados quanto à reatividade por ELISA contra os péptidos sintéticos individuais. ELISA: 0 ELISA de tipo sandwich foi realizado para ver a positividade dos anticorpos frente a péptidos individuais e proteína de fusão GST-AMUC16c114 seguindo o protocolo de rotina da instalação nuclear para o ensaio de ELISA.
Análise de FACS: Células alvo aderentes foram removidas por tripsina a 0,05 % e EDTA a 0,1 %, lavadas e contadas por um hemocitómetro. As células foram distribuídas em múltiplos tubo Eppendorf com pelo menos 0,5-1 x 106 células por tubo. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo FCS a 1 % e azida de sódio a 0,025 % (tampão de FACS) . Para a coloração de FACS interna, as células nos tubos Eppendorf foram pe rmeab i1i z adas com Solução de Permeabilização de FACS 2 diluída a 1:10 (BD BioSciences, San Jose, CA) durante 10 minutos à temperatura ambiente e depois lavadas duas vezes com tampão de FACS gelado. Posteriormente, foram incubadas sem (para o controlo do segundo anticorpo) ou com 1 pg/tubo de sobrenadantes biorreativos de monoclonais de MUC16 de ratinho durante 30 minutos em gelo. Para a coloração de FACS de superfície, as células foram incubadas sem (para o controlo do segundo anticorpo) ou com 1 pg/tubo de sobrenadantes biorreativos de monoclonais de MUC16 (9B11.20.16, 9C9.21.5.13 e 4H11.2.5), de ratinho anti-OC125 humano (M3519), de ratinho anti-Mll humano (M3520) (DakoCytornation, Dako North America Inc., Carpinteria, CA) ou VK8 (gentilmente proporcionado pelos Dr. Beatrice Yin e Dr. Ken Lloyd, MSKCC, Nova Iorque, NI) durante 30 minutos em gelo. As células nos tubo Eppendorf foram também coradas na superfície com 1 pg/tubo de anticorpos de ratinho de controlo coincidentes por isotipo, não específicos (monoclonais 13C4 para IgGl e 4E11 para IgG2b obtidos a partir da Instalação Nuclear Monoclonal do MSKCC) e incubados em gelo durante 30 minutos. Todas as células foram lavadas três vezes com tampão de FACS. As células foram incubadas com 1 pg/tubo de segundo anticorpo de cabra anti-IgGl-PE ou IgG2b-PE de ratinho durante 30 minutos em gelo e depois lavadas três vezes com tampão de FACS. As células foram analisadas por uma máquina FACS Calibur na Instalação Nuclear de Citometria de Fluxo do MSKCC.
Análise de Western blot:
Linhas celulares estáveis foram cultivadas em placas de 10 cm nos seus respetivos meios de cultura e incubadas com 5 % de C02 a 3 7 °C durante 3 dias. Elas foram lavadas duas vezes com PBS gelado para remover os meios contendo soro. As células aderidas foram raspadas com 1-2 ml de PBS gelado e foram depositadas por centrifugação num tubo Eppendorf a 4 °C numa centrífuga de Eppendorf. O sobrenadante foi descartado e as células foram lisadas com 0,2 ml de tampão de lise Ripa modificado (Tris-HCl a 20 mM; pH 7,4; NaCl a 150 mM; NP-40 a 1 %; Na3V04 a 1 mM; PMSF a 1 mM; DTT a 1 mM; leupeptina a 10 pg/ml e aprotinina a 10 pg/ml) durante 30 minutos em gelo e centrifugadas a 4 °C durante 10 minutos. A solução solúvel foi separada num tubo e o sedimento de detritos foi descartado. A concentração proteica foi medida utilizando o Ensaio de Proteína Bio-Rad (BioRaD Laboratories, Hercules, CA) . Quantidades iguais de proteínas (proteína de fusão GST-MUC16-CD ou extratos de linha celular estável) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose utilizando um aparelho de transferência BioRad num quarto frio a 4 °C. As membranas foram bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 3 % em PBS com Tween-20 (PBST) a 0,1 % a 4 °C durante a noite. As membranas foram sondadas com anticorpo primário (diluição de 1:1000) durante 1 h à temperatura ambiente e depois lavadas três vezes com PBST. Posteriormente, as membranas foram coradas com segundo anticorpo correspondente, anticorpo completo de ovelha ligado a peroxidase de rábano (HRP) anti-IgG de ratinho (GE Healthcare, RU) (diluição de 1:5000), durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas três vezes com PBST e reveladas com reagente quimioluminiscente Western Lightning® (ECL, Perkin Elmer, Waltham, MA) durante 1-5 minutos à temperatura ambiente e os sinais foram revelados em BioMax Film da Kodak.
Estudos de ligação e internalização com anticorpos monoclonais e transfetantes estáveis de 0VCAR3 e SK0V3: Anticorpos monoclonais foram marcados com 131I utilizando o método de iodogéneo e purificados por cromatografia por exclusão de tamanho (22). Os estudos de ligação por saturação foram realizados com anticorpos radiomarcados utilizando substratos de células OVCAR-3 intactas.
Resumidamente, 10 soluções de teste foram preparadas (em triplicado) e continham quantidades crescentes dos anticorpos radiomarcados, 3-500 000 células num volume total de 500 μΐ de PBS (BSA a 0,2 %; pH 7,4). As células foram isoladas por filtração rápida através de uma membrana de fibra de vidro e lavada com solução salina tamponada com tris gelado. As células foram contadas num contador gama com padrões de atividade total adicionados. Para cada concentração de anticorpo radiomarcado, a ligação não específica foi determinada na presença de 100 mM do anticorpo não modificado. Os dados foram analisados com um método de regressão de mínimos quadrados (Origin, Microcal, Software Inc., Northampton, MA) para determinar os valores de Kd e BmÁX e foi realizada uma transformação de Scatchard.
Estudos de internalização celular de anticorpos foram realizados com anticorpos monoclonais iJiI-4Hll e 131I-OC125 e células transfetadas estáveis SK0V3-phrGFP-AMUC16c334 . Resumidamente, anticorpo radiomarcado (370 MBq/mg, 100 kcpm) em 2 ml de meio foi adicionado a células SKOV3 colocadas em placas de 6 poços. As placas foram incubadas a 37 °C durante até 24 horas. Em vários pontos de tempo, o meio foi removido a partir de três poços e as células foram lavadas com 2 x 2 ml de PBS. A atividade ligada à superfície celular foi depois extraída e recolhida com 2 x 2 ml de uma lavagem ácida gelada (ácido acético a 100 mM, glicina a 100 mM; pH 3,0). As células foram depois dissolvidas com 2 x 1 ml de NaOH a 1 M e recolhidas. No final do estudo, todas as amostras foram contadas com um contador gama juntamente com os padrões, representando a quantidade inicial de radioatividade adicionada. Todas as amostras dos meios foram analisadas por ITLC-SG com fases móveis de TCA a 5 % para determinar 131I não ligado. Microarranjo tecidual (TMA):
Os microarranjos teciduais foram construídos dentro da instituição dos inventores ou compradas a partir de um laboratório comercial se não estivessem disponíveis internamente. Resumidamente, biópsias com agulha de tecido incorporado em parafina preexistente foram obtidas a partir dos denominados blocos dadores e depois relocalizadas num bloco "mestre" recetor acondicionado com parafina através da utilização de técnicas por Kononen et ai. e subsequentemente modificadas por Hedvat et al. (23-24). Um
Arranjador Tecidual MTA-1 operado manualmente de Beecher Instruments Inc. (Sun Prairie, WI) foi utilizado para produzir pontos (núcleos) circulares de amostra que mediam 0,6 a 1,0 mm de diâmetro. Os núcleos foram dispostos 0,3 a 0,4 mm afastados uns dos outros. Uma camada de tecidos de controlo foi estrategicamente disposta em torno dos microarranjos reais do tecido de modo a evitar efeitos de bordo. A composição específica de cada microarranjo tecidual é delineada abaixo. Lâminas de microarranjos teciduais para cancro ovãrico, cancro de próstata, adenocarcinoma do pulmão, neoplasmas mucinosos do pâncreas e carcinoma da mama lobular invasivo e ductal invasivo foram preparadas cortando secções de 4 um a partir de tecido incorporado em parafina fixado em formalina. Microarranjos de tecido fetal e adulto normal foram obtidos a partir de uma fonte comercial (Biomax, US) . Células 0VCAR3 foram utilizadas como controlos positivos. Xmunohistoquímica: A imunohistoquímica foi realizada nos microarranjos teciduais com ambos OC125 padrão (Ventana, Tuscon, AZ) e os novos anticorpos monoclonais. Secções dos microarranjos teciduais foram cortadas a 4 micrómetros, colocadas sobre lâminas de microscópio Super-frost/Plus (marca Fisher) e cozidas numa estufa a 60° durante pelo menos 60 minutos. As lâminas foram desparafinadas e hidratadas com água destilada, embebidas em tampão de citrato a pH 6,00 durante 3 0 minutos a 97 °C, lavadas em água corrente durante 2-5
minutos, incubadas durante 5 minutos em peróxido de hidrogénio a 3 % diluído em água destilada. As lâminas foram lavadas em água destilada durante 1 minuto, transferidas para um banho de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, para duas mudanças de 5 minutos cada e colocadas em BSA a 0,05 % diluída em PBS durante um mínimo de 1 minuto. Depois de se secar em torno das secções de tecido, soro normal foi aplicado a uma diluição de 1:20 em BSA a 2 %/PBS e incubou-se durante um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente numa câmara de humidade. 0 soro foi depois extraído por sucção sem deixar que as secções sequem e aproximadamente 150 lambda de anticorpos novos a uma diluição de 1:1000 foram colocados no tecido. A lâmina foi incubada durante a noite (aproximadamente 15-18 horas) a 4 °C numa câmara de humidade. 0 anticorpo primário foi separado por lavagem utilizando três mudanças de PBS durante 10 minutos cada. Anticorpo secundário, a-ratinho biotilinado dos laboratórios Vector (Burlingame, Ca) , foi aplicado a uma diluição de 1:500 em BSA a 1 %/PBS e incubado durante 45-60 minutos à temperatura ambiente numa câmara de humidade. 0 anticorpo foi separado por lavagem novamente utilizando três mudanças de PBS como acima. As lâminas foram depois transferidas para um banho de diaminobenzidina (DAB), diluídas com PBS durante 5-15 minutos. As lâminas foram depois lavadas em água da torneira durante 1 minuto, contracoradas utilizando hematoxilina modificada de Harris (Fisher), descoloridas com álcool ácido a 1 % e azul em água amoniacal, desidratada com 3 mudanças cada de etanol a 95 %, etanol a 100 % e xileno durante 2 minutos cada e cobertas com uma lamela com meio de montagem permanente.
Pontuação de imunohistoquímica:
Anticorpos comercialmente disponíveis, como OC125 e Mil, são direcionados a epítopos dependentes de glicosilação complexos. A hipótese dos inventores consiste em que a glicosilação pode ser específica de tecido; portanto, foi importante examinar a utilidade dos anticorpos direcionados a péptidos nos tecidos fixados com parafina e avaliar a prevalência da expressão de MUC16. Os três anticorpos candidatos, 4H11, 9C9 e 4A5, foram caracterizados utilizando sedimentos da linha celular OVCAR3. Dos três, o anticorpo 4H11 mostrou o padrão de coloração mais forte, mais difuso e consistente em múltiplas diluições, com a menos quantidade de coloração de fundo e, portanto, foi otimizado para utilização nos tecidos humanos na instalação nuclear de patologia.
Utilizando 4H11, os inventores coraram e pontuaram a positividade utilizando microarranjos teciduais a partir de carcinomas serosos ovários de grau elevado e estádio alto (Figura 2), estes tumores sendo o tipo mais comum de cancro ovárico, representando aproximadamente 80-85 % de todos os carcinomas ováricos em nações industrializadas ocidentais (25) . Para testar a especificidade do novo anticorpo, os inventores também coraram microarranjos teciduais de cancros da próstata, pulmão, mama e pâncreas e compararam as suas intensidades de coloração com aquelas do anticorpo monoclonal OC125 (Figura 6A-D). Para determinar se existiria alguma reatividade cruzada com tecidos humanos normais, os anticorpos também foram testados em TMAs fetais e adultos humanos normais.
Todas as secções coradas foram revistas por um patologista de referência (KJP). Um subconjunto de núcleos para os quais houve uma coloração equívoca foi também pontuado independentemente por um segundo patologista (RAS) para assegurar a consistência nos métodos de pontuação. Apenas uma coloração membranosa e/ou citoplasmática foi considerada positiva. Se uma porção da célula mostrou coloração membranosa, foi considerada como coloração parcial. Foi concebido um sistema de pontuação para proporcionar uma avaliação semiquantitativa da distribuição e intensidade de coloração em núcleos individuais. Ao mesmo tempo, foi concebido para ser útil para a comparação da distribuição e intensidade de coloração entre 0C125 e os novos anticorpos. A pontuação incorporava a percentagem de células, a intensidade e padrão da coloração de acordo com os seguintes padrões: pontuação 0: sem coloração; pontuação 1: <5 % forte ou fraca,* pontuação 2: 5-50 % forte ou fraca,· pontuação 3: 51-75 % forte ou 51-100 % fraca; pontuação 4: 76-99 % forte e pontuação 5: 100 % coloração forte (Figura 3) . 0 patologista avaliou primeiro todos os microarranjos teciduais corados com OC125 e pontuou cada núcleo. Posteriormente, os mesmos núcleos corados com os novos anticorpos foram pontuados 1 até vários dias depois de OC125 sem referência aos resultados anteriores. A comparação direta da pontuação entre as colorações para cada núcleo foi feita apenas depois de toda a pontuação estar completa. 0 mesmo processo foi utilizado para todos os microarranjos de tecido não ovárico. Depois da comparação, a coloração dos núcleos foi determinada como sendo concordante, equívoca ou discordante com base nos diferenciais pontuais. Os núcleos concordantes diferiram em 0 a 1 ponto, os núcleos equívocos diferiram em 2 pontos e os núcleos discordantes diferiam em 3 a 5 pontos. A única exceção a esta regra foi quando a diferença de 1 ponto estava entre uma pontuação de 0 e 1, em cujo caso, as diferenças foram consideradas equívocas. Isto foi para separar verdadeiramente os casos negativos mesmo dos focalmente positivos. EXEMPLO 2
Geração e caracterização de anticorpos monoclonals anti- MUC16
Anticorpos monoclonais direcionados a MUC16 foram isolados por rastreio baseado em ELISA utilizando ambos os péptidos individuais e proteína GST-AMUC16c114 recombinante seguido por subclonagem sequencial para clones de célula única.
Quadros IA e 1B: Anticorpos monoclonais de terminal carboxi de MUC16 mostrando a sua reatividade para western de GST-AMUC16c114, análise de FACS em células de tipo selvagem 0VCAR3
Quadro ΙΑ Péptido I Péptido 2 Péptido 3 EL,ISA Western (1:1) ' de Western (1:1) rhlSA wester {1;í) HP q? n OP-
de GST- FACS sobren de GST- FACS , „„ : FACS
KueCD de . MucCD de “b i de -ii^red-j (1.10) 0VCAR3 hibrid < 1:10> 0VCAR3 hybrid. áu- .£. | ovcjUt3 , +/- +/- o-:ui +/- +/- n<1, +/_ | +/“ I so tipo (1:1) Isotipo u " ' ' Isotipo Ϊ0Α2 ” + -...........IgGÍTlgM ..........Fraca -.....................IgGl 22ΕΪ0.............+ ] - ÍgG2b’ 2 3D4 - - ausente 28F8 + + IgGl, IgM 22F11 Fraca; - IgGl,Ig
__________i__M 2F4 Fraca__IgGl, IgM 1ÍB6__=__=__IgM__19G4 Fraca i__ 9B11 Fraca +/~ IgGl 4C7 + - IgGl .31 A3 Fraca : - IgGl
23D3 Fraca + IgGl,;.gG 2gF7 + + IgGl 4C2 + ~ M
____^_________IgGM 30B1__:__IgGl 9C7__+__+___27G4 + ;__ 31B2 + - IgM 9C9 + + 1901 + - IgG2b
IÇfCjéD
4H11 + + IqG2b, IqM 22F1 + - igG^' I
gM ...................................................................................4A2.................-........................-....................IgGl...................4D7 + I -.............l""lgG3"
____4A5__+__+__IgGl__SA5__;__IgM _____29G9__+__-__IgGl__31 C8 - i - IgG2b 5C2 -i- a IgGl 6H2 Fraca í - ^í'Ig
M I 2 3G12 j - - I IgGl f lgG2a[ 1GI'6 ~- IgGl
2 5G4 - - 1gGI,IgM 2 632 + + "‘‘^Yg g ϊ"ΐ g G2 b “ _:______ . IqM__ _ 25H3 - IgGL, IgM ~_ _Quadro IB__ j__ Péptido 1 Péptido 2
FACS f FACS de ,T, , . de
ISOtUDO iSOtj'OO OVCAR3 0VCAP.3 * ___-r / "____+' / "___ 9B11.20.16 +/- IgGI 9C9.21.5.13 + IgG2b_ 4H11^5 j “ lgG2b
FACS FACS OVCAR3 ]:SOtip° 0VCAR3 ]:SOtlp° _:__+ /-___ +/-__ ----- J IgGl 5C2TI7 j + _!___ 4A5.37 + IgGl _ _I___ 26F7.18.10 + IgGl _
Quadro 2: Anticorpos específicos para porções exemplificativas de MUC16 1. Polipéptido 1 de Mucl6: (sequência de 14394 14410 MUC13) NFSPLARRVDRVAIYEE (SEQ ID NO:01) 17 aa
Monoclonais de ratinho que são específicos para este péptido são: 9B11.20.16 (IgGl) 10A2 (IgGl,IgM) 2F4 (IgGl,IgM) 23D3 (IgGl,IgG2b) 3 0B1(IgGl) 3 0B2(IgM) 2. Polipéptido 2 de Mucl6: (sequência de 14425 14442 MUC16) TLDRSSVLVDGYSPNRNE (SEQ ID NO:02) 18 aa
Monoclonais de ratinho que são específicos para este péptido são: 4H11.2.5 (IgG2b) 13H1 (IgGl) 29G9(IgGl) 9C9.21.5.13 (IgG2b) 28F8 (IgGl,IgM) 23G12 (IgGl,IgG2a) 9C7.6 (IgGl) 11B6 (IgM) 25G4 (IgGl, IgM) 5C2.17 (IgGl) 4C7 (IgGl) 26B2 (IgGl,IgG2b,IgM) 4A5.37 (IgGl) 4A2 (IgGl) 25H3 (IgGl,IgM) 28F7.18.10 (IgGl)
Os anticorpos monoclonais identificados estão listados no Quadro IA e Quadro 2. Cada um dos anticorpos monoclonais foi reativo contra GST-AMUC16c114. Os anticorpos dirigidos a MUC16 comerciais (OC125, Mil ou VK8) não se ligaram a GST-AMUC16c114 em ELISA ou Western blotting. Os clones foram testados em FACS contra células de cancro ovárico 0VCAR3 e em análise de Western blot contra GST-AMUC16c114 (Quadro 1B) e anticorpos monoclonais purificados, selecionados foram isolados.
Os inventores utilizaram o tipo selvagem de 0VCAR3 e as células SK0V3 transduzidas com phrGFP-4MUC16c114 para caracterizar os anticorpos selecionados por análise por FACS. Todos os anticorpos monoclonais selecionados ligaram-se a ambas as linhas celulares, enquanto os anticorpos comerciais VK8, Mil e OC125 ligaram-se às células 0VCAR3 mas não à linha celular SK0V3-phrGFP-AMUC16c114. Os anticorpos contra o Polipéptido 3 exigiram permeabilização uma vez que é um epítopo interno (Figura 7). A análise de Western blot utilizando a proteína purificada GST-AMUC16CJ·14 mostrou uma ligação forte com os anticorpos 4H11 e 9C9 (Figura 4A) , enquanto os outros anticorpos selecionados mostraram menos ligação. 0 transfetante SKOV3-phrGFP-AMUC16c114 foi também positivo por análise de Western blot utilizando os anticorpos 4H11 e 9C9 (Figura 4B) . Tal como anteriormente, os anticorpos comerciais não interagiram com a proteína purificada GST-AMUC16c114 ou lisados celulares da linha celular SK0V3-phrGFP-AMUC16c114. A ligação de seis anticorpos monoclonais contra MUC16 de 0VCAR3 foi examinada em estudos de ligação por afinidade. Três anticorpos: 9C7, 5C2 e 28F7, mostraram apenas níveis modestos de ligação em comparação com a ligação não específica destes anticorpos a células 0VCAR3, que transportam grandes números de sítios de ligação a MUC16. Em contraste, os anticorpos monoclonais 4H11, 9C9 e 4A5 mostraram uma afinidade de ligação altamente específica, como mostrado na Figura 5A, com afinidades de ligação de 6,8-8,6 nM contra os epítopos de superfície celular das células 0VCAR3. Os inventores também examinaram a internaiização de anticorpo ligado à proteína MUC16 de superfície celular. Os inventores examinaram a internalização na linha celular SKOV3-phrGFP-4MUC16c334 transfetada que porta o terminal carboxi de MUC16, incluindo o epítopo 4H11 e uma única sequência de repetição em tandem degenerada para interagir com o anticorpo OC125. Os anticorpos comerciais OC125, Mil e VK8 ligam-se todos à superfície celular desta linha celular transduzida. 0 4H11 marcado com L31I mostrou uma rápida internalização a um nível elevado, enquanto o anticorpo OC125 marcado com 1311 foi internalizado numa taxa muito mais baixa (Figura 5B). EXEMPLO 3
Resultados de imunohistoquímica:
Dadas as suas afinidades de ligação altamente específicas, os anticorpos 9C9, 4A5 e 4H11 foram caracterizados quanto à utilidade em imunohistoquímica utilizando linhas celulares 0VCAR3. Dos três, o anticorpo 4H11 foi selecionado como sendo otimizado para utilização em tecidos humanos com base no seu padrão de coloração robusto, sensível e específico em comparação com os outros dois anticorpos. A. Ovário
Duas lâminas de microarranjos teciduais de carcinoma seroso ovãrico de grau elevado e estádio alto compostas por 419 núcleos, representando tumores recorrentes e metastáticos, primários a partir de 40 pacientes foram coradas com ambos anticorpos monoclonais OC125 e 4H11 (Figura 2) . Os microarranjos teciduais de OC125 mostraram 279 (66 %) núcleos com coloração 3-5, 99 (24 %) com coloração 1-2 e 41 (10 %) sem coloração. Os microarranjos teciduais de 4H11 mostraram 236 (56 %) com coloração 3-5, 91 (22 %) com coloração 1-2 e 92 (22 %) sem coloração. Os dois anticorpos foram concordantes em 233 (56 %) núcleos, equívocos em 161 (38 %) e discordantes em 25 (6 %) . Dos 25 núcleos discordantes, 12 (48 % dos casos discordantes, 3 % de todos os casos) mostraram maior positividade de 4H11 que OC125. Nove foram discordantes por uma diferença de 4 pontos e 3 foram discordantes por uma diferença de 5 pontos. Existiu um total de 186 núcleos discordantes e equívocos em conjunto, 48 (26 %) dos quais mostraram uma coloração maior com 4H11 do que com OC125. 0 padrão de coloração de ambos 4H11 e OC125 foi citoplasmãtico e membranoso, embora o padrão membranoso de OC125 tenha sido mais forte e melhor definido que de 4H11 na maioria dos casos. Os casos discordantes mostraram níveis mais elevados de 4H11 do que noutros casos. B. Cancro da mama
Uma variedade de outros tecidos foi também examinada quanto à coloração de 4H11 para testar a especificidade do anticorpo. Dos 50 núcleos de carcinomas da mama ductais invasivos (número de pacientes não disponível), apenas 2 (4 %) mostraram uma pontuação de 4 ou superior de coloração de 4H11 e nenhum teve pontuações de 3-5 para coloração de OC125. O padrão de coloração com OC125 foi principalmente apical/luminal com alguma coloração citoplasmática granular. Alguns tumores com lúmenes intracitoplasmáticos também captaram a coloração de OC125. 4H11 mostrou um rubor citoplasmãtico mais difuso sem acentuação membranosa.
Em contraste, o microarranjo de tecido de carcinoma da mama lobular invasivo (composto por 179 núcleos com tumor viável, número de pacientes não disponível) teve uma coloração de MUC16 com 4H11 frequente. Neste microarranjo tecidual, 168 núcleos (94 %) não mostraram coloração para OC125, 5 (3%) mostraram coloração 1-2 e apenas 6 (3 %) mostraram uma intensidade de coloração de 3. A coloração de 4H11 foi diferente neste padrão de distribuição, com 49 (27 %) não mostrando coloração, 81 (45 %) mostrando coloração 1-2 e 49 (27 %) mostrando coloração 3-4. Nem OC125 ou 4H11 tiveram núcleos com uma intensidade de coloração de 5. 0 padrão de coloração foi citoplasmático, luminal/membranoso ou intraluminal para ambos OC125 e 4H11. 0 padrão intraluminal foi forte e intenso para ambas as colorações e realçou o lúmen intracitoplasmático que está comummente presente nos carcinomas lobulares. As taxas de concordância foram de 34 % concordante, 43 % equívoco e 23 % discordante. Dos casos equívocos e discordantes, não existiu nenhum no qual o 0C125 fosse superior do que o 4H11. Todos os 42 casos discordantes e 76 dos 77 casos discordantes tiveram 4H11 superior a OC125. Também existiu coloração luminal focal com 4H11 em dutos da mama benignos e carcinoma lobular in situ. C. Adenocarcinomas de pulmão, pancreãtico e prostático
Tumores a partir de outros órgãos não foram reativos com qualquer anticorpo. 0 TMA de adenocarcinoma pulmonar teve 237 núcleos a partir de 86 pacientes contendo tumor viável. No TMA pancreático existiram 92 núcleos a partir de 21 pacientes contendo tumores mucinosos pancreãticos, incluindo neoplasmas mucinosos papilares intraductais (IPMN) e carcinomas ductais invasivos. No TMA de cancro da próstata existiram 169 núcleos (número de pacientes não disponível). Nenhum destes microarranjos de tecido canceroso teve uma ligação significativa a OC125 ou 4H11. Esta informação está resumida no Quadro 3.
Quadro 3. Intensidade de coloração de OC125 em comparação _com 4H11 em microarranjos teciduais_
D. Tecidos normais Não existiu qualquer coloração com OC125 ou 4H11 no cólon adulto normal, reto, ectocérvix, intestino delgado, ovário, fígado, duetos pancreáticos, baço, rim e pele. OC125 e 4H11 coraram ambos glândulas endocervicais (0C125 luminal, 4H11 fraco citoplasmãtico), glândulas esofágicas (luminal), epitélio brônquico (OC125 luminal, 4H11 grânulos intracitoplasmáticos) e corpúsculos tímicos (citoplasmãtico). 4H11 demostra uma coloração fraca a moderada das glândulas gástricas, particularmente nas criptas, com um padrão granular intracitoplasmático. Outros órgãos que mostraram coloração intracitoplasmãtica pontual com 4H11 apenas foram a próstata, túbulos seminíferos dos testículos e as células das ilhotas do pâncreas. A coloração das células das ilhotas pancreáticas foi particularmente forte e consistente. Também houve uma coloração não específica do fígado, rim e cérebro com 4H11. Não existiram casos que coraram com OC125 e não com 4H11.
De forma semelhante, não existiu qualquer coloração com OC125 ou 4H11 no coração fetal, vesícula biliar, cólon, intestino delgado, fígado, reto, adrenais, tiroide, baço, pele, osso, epidídimo, cérebro, pulmão, músculo, músculo liso, rim, olho, cordão umbilical e placenta. OC125 apenas corou corpúsculos tímicos num padrão semelhante aquele no tecido adulto. 4H11 corou ambas células endócrinas pancreáticas e glândulas endocervicais fetais num padrão semelhante aquele dos seus homólogos adultos. As células das ilhotas mostraram um padrão citoplasmãtico granular e as glândulas endocervicais mostraram um padrão luminar linear, que foi mais semelhante ao padrão OC125 no tecido adulto. EXEMPLO 4
Erradicação bem-sucedida de tumores ováricos peritoneais estabelecidos em ratinhos bege-SCID depois de transferência adotiva de células T geneticamente direcionadas ao antigénio MUC16.
Finalidade: a maioria dos pacientes diagnosticados com cancro ovárico acabará por morrer da sua doença. Por este motivo, são necessárias novas abordagens ao tratamento desta neoplasia maligna. A transferência adotiva das células T do próprio paciente, geneticamente modificadas ex vivo através da introdução de um gene que codifica um recetor de antigénio quimérico (CAR), um recetor de células T artificial, direcionado a um antigénio associado a tumor, é uma abordagem nova e promissora para a terapêutica contra o cancro aplicável ao tratamento do cancro ovárico.
Desenho experimental: geraram-se vários CARs direcionados ao domínio extracelular retido de MUC16, designado MUC-CD, um antigénio altamente expresso numa maioria de carcinomas ováricos. Investigou-se a biologia in vitro de células T humanas retroviralmente transduzidas para expressar estes CARs por ensaios de cocultura em células apresentadoras de antigénio artificiais (AAPCs) geradas a partir de fibroblastos NIH3T3 geneticamente modificados para expressar o antigénio MUC-CD alvo, bem como através de ensaios citotõxicos utilizando a linha celular de tumor ovárico 0V-CAR3(MUC-CD) humano e células tumorais de paciente primário. Finalmente, avaliou-se a eficácia antitumoral in vivo de células T direcionadas a MUC-CD num modelo tumoral murino de 0V-CAR3(MUC-CD) xenogeneico, ortotópico, bege-SCID.
Sequências exemplificativas utilizadas neste trabalho apresenta-se nas Figuras 17-19.
Resultados: células T direcionadas a MUC-CD de CAR modificado derivadas a partir de ambos dadores saudáveis e pacientes de cancro ovárico exibiram uma atividade citolítica in vitro eficaz contra ambas as linhas celulares ováricas humanas, bem como contra células de carcinoma ovárico primário. Células T direcionadas a MUC-CD podem ser adicionalmente expandidas ex vivo através de múltiplos ciclos de cocultura em AAPCs 3T3(MUC-CD/B7.1). Células T direcionadas a MUC-CD expandidas infundidas em ratinhos bege-SCID portando tumores 0VCAR3(MUC-CD) humanos intraperitoneais atrasaram a progressão ou erradicaram completamente o tumor no contexto de doença avançada.
Conclusão: estes estudos pré-clínicos promissores justificam uma investigação adicional de células T direcionadas a MUC-CD como uma potencial abordagem terapêutica no contexto clínico do tratamento de pacientes com carcinomas ováricos MUC-16+ de alto risco.
INTRODUÇÃO O cancro ovárico é o sexto cancro mais comum em todo o mundo e a sétima causa principal de mortes relacionadas com cancro em mulheres (1, 2). Apesar da terapêutica multimodal com cirurgia e quimioterapia, a maioria dos pacientes com carcinomas ováricos têm um mau prognóstico. Por este motivo, abordagens alternativas para o tratamento desta doença são urgentemente necessárias. A infusão das células T do próprio paciente direcionadas ex vivo a antigénios expressos na superfície das células tumorais é uma nova abordagem promissora para a imunoterapia adotiva de cancro, e uma que apenas recentemente foi explorada com seriedade no contexto clínico. As células T podem ser geneticamente modificadas para terem como alvo antigénios associados a tumores através da introdução retroviral de genes que codificam recetores de células T designados recetores antigénicos quiméricos (CARs). A manipulação genética das células T para expressarem recetores de células T artificiais que direcionam a toxicidade em direção a uma célula tumoral, apresenta um meio para melhorar o reconhecimento imunitário e eliminação de células cancerosas. Os CARs são mais comummente compostos por um anticorpo de comprimento de fragmento de cadeia simples (scFv), derivado a partir de um anticorpo monoclonal direcionado a um dado antigénio associado a tumor, fusionado a um domínio transmembrana (tipicamente CD8, CD28, OX-40 e 4-1BB), fusionado ao domínio de sinalização citoplasmático de cadeia ζ de TCR (3-13). Quando utilizados para reprogramar a especificidade das células T, estes recetores de fusão permitem o reconhecimento do antigénio nativo. Quando expressa pelas células T, a construção resultante, depois de acoplamento com o antigénio alvo, induz a ativação, proliferação das células T e lise das células alvo. Estes recetores de fusão transduzem um sinal coestimulador dependente de antigénio funcional em células T primárias, permitindo uma proliferação de células T sustentada quando ambos TCR endógeno e um recetor quimérico para a sinalização estimuladora sejam acionados. Até à data, estudos pré-clínicos utilizando células T de CAR modificado demonstraram resultados promissores numa ampla variedade de neoplasias malignas (3, 4, 11, 14-18). Mais recentemente, esta abordagem foi investigada clinicamente sob a forma de ensaios de fase I (6, 19-21). Estas abordagens genéticas oferecem um meio para melhorar o reconhecimento imunitário e eliminação de células cancerosas.
Os carcinomas ováricos parecem ser tumores relativamente imunogénicos capazes de induzir uma resposta imunitária com base no facto de que o prognóstico da longo prazo dos pacientes é marcadamente influenciado pelo grau e qualidade da resposta imunitária endógena frente ao tumor. Especificamente, foi bem documentado que a presença de células T efetoras endógenas dentro do microambiente do tumor de cancro ovárico está diretamente correlacionado com uma sobrevivência prolongada dos pacientes (22-25) . Em contraste, números crescentes de células T reguladoras (Tregs) CD4+ CD2 5hl dentro do tumor, que por sua vez, presumivelmente, anulam a atividade antitumoral de células T efetoras infiltrantes, correlaciona-se com uma sobrevivência mais curta dos pacientes (26-29). De facto, parece que é a razão de Tregs para células T efetoras dentro do microambiente tumoral que, em última instância, determina se a resposta imunitária endógena frente ao cancro é benéfica ou prejudicial para o paciente (24, 28). Neste contexto, a capacidade de gerar e subsequentemente expandir uma população de células T efetoras direcionadas a tumor ex vivo que são subsequentemente infundidas de volta ao paciente pode, por sua vez, enviesar a razão de células Treg para T efetoras para uma mais favorável para erradicar a doença.
As mucinas são biomoléculas importantes para a homeostasia e proteção de superfícies epiteliais. Alterações à expressão de mucinas em cancro ovãrico podem ser exploradas em diagnóstico, prognóstico e tratamento (1). MUC16 é uma mucina que é sobre-expressa na maioria dos carcinomas ovãricos e é um marcador sêrico substituto estabelecido (CA-125) para a deteção e progressão de cancros ovãricos (30-33). MUC16 é uma mucina altamente glicosilada composta por um grande domínio clivado e libertado, designado CA-125, que consiste em múltiplas sequências de repetições múltiplas e um domínio retido (MUC-CD) que inclui um fragmento extracelular de não repetição residual, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática (34) . Uma vez que o antigénio é, de outra forma, apenas expresso em baixos níveis no útero, endométrio, trombas de Falópio, ovários e serosa das cavidades abdominal e torácica, MUC16 é um alvo potencialmente atrativo para terapêuticas imunológicas.
No entanto, o facto de que a maioria do domínio extracelular de MUC16 seja clivado e secretado limita a utilidade de MUC16 como um antigénio alvo em carcinomas ováricos. De facto, até à data, todos os MAbs relatados para MUC16 ligam-se a epítopos presentes na fração grande secretada CA-125 da glicoproteína, não sendo nenhum conhecido como ligando-se à fração extracelular (MUC-CD) do antigénio (35-37) . Uma vez que a fração MUC-CD do antigénio é retida na superfície celular, a geração de células T específicas para esta porção de MUC16 pode superar grandemente a limitação de MUC16 como um alvo para imunoterapia celular adotiva. Para esta finalidade, os inventores geraram previamente uma série de MAbs murinos específicos para o domínio extracelular MUC-CD retido (38). Utilizando um hibridoma que expressa um tal MAb, 4H11, os inventores construíram com sucesso vários CARs específicos para o antigénio MUC-CD. Esta invenção proporciona um ácido nucleico que codifica um recetor de células T quimérico, composto por, pelo menos uma cadeia zeta, uma região de sinalização e um elemento de ligação que interage especificamente com um alvo selecionado bem como o recetor de células T quimérico que compreende uma porção de cadeia zeta, uma região de sinalização e um elemento de ligação.
Neste relatório, demonstra-se a transdução retroviral altamente eficaz destes CARs dirigidos a MUC-CD em células T humanas com as células T resultantes sendo capazes de especificamente alvejar e lisar células tumorais MUC-CD+ in vitro. Adicionalmente, demonstrou-se uma expansão de células T direcionadas a MUC-CD eficaz in vitro através de cocultura repetida em fibroblastos NIH (3T3) geneticamente modificados para expressar MUC-CD e o ligando coestimulador B7.1 (CD80). A expansão modificada de células T modificadas permitiu aos inventores gerar subsequentemente números suficientes de células T para levar a cabo estudos in vivo em ratinhos bege-SCID imunocomprometidos que portam tumores ováricos humanos intraperitoneais estabelecidos. De forma significativa, demonstrou-se nestes estudos uma eficácia antitumoral marcada de células T dirigidas a MUC-CD, tanto depois de injeção intraperitoneal direta como injeção intravenosa quando comparadas com ratinhos não tratados, ou ratinhos tratados com células T portando um CAR direcionado a um antigénio irrelevante. Adicionalmente, os inventores demonstraram uma citotoxicidade significativa de células T 4Hll-28z+ dos pacientes e células T de dadores saudáveis direcionadas a células de carcinoma ovárico derivadas de ascites primárias a partir de pacientes com cancro.
Para o conhecimento dos inventores, este é o primeiro relatório em que células T geneticamente direcionadas para o antigénio MUC16 demonstram uma eficácia antitumoral marcada contra tumores MUC164 tanto in vitro como in vivo. Estes dados servem como um raciocínio para propor futuros ensaios clínicos utilizando esta abordagem em pacientes com carcinomas de ovário de alto risco.
MATERIAIS E MÉTODOS
Linhas celulares e células T A linha celular tumoral 0V-CAR3 foi cultivada em RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, NI) suplementado com FBS a 10 % inativado por calor, aminoácidos não essenciais, tampão HEPES, piruvato e BME (Invitrogen). As linhas celulares produtoras retrovirais de PG13 e gpg29 foram cultivadas em DMEM (Invitrogen) suplementado com FCS a 10 % e células apresentadoras de antigénio artificiais NIH-3T3 (AAPC), descritas anteriormente (3) , foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10 % inativado por calor. Células T foram obtidas a partir de sangue periférico de dadores saudáveis sob o protocolo n.° 95-054 aprovado pelo IRB, em tubos BD Vacutainer CPT (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os meios foram suplementados com L-glutamina a 2 mmol/1 (Invitrogen) , penicilina a 100 unidades/ml e estreptomicina a 100 pg/ml (Invitrogen). As células T foram cultivadas em meio RPMI 1640 como acima e suplementadas com IL-2 a 20 Ul/ml (Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ) e onde indicado, o meio foi suplementado com interleucina 15 a 10 ng/ml (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN).
Isolamento células cancerosas derivadas de ascites de pacientes Células cancerosas derivadas de ascites humanas primárias foram obtidas a partir de pacientes de cancro ovárico submetidos a cirurgia para carcinoma seroso avançado recém-diagnosticado sob o protocolo n.° 97-134 aprovado pelo IRB. As células tumorais foram isoladas a partir de fluidos ascíticos de pacientes por centrifugação a 600g durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas com lx PBS e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10 % para análise posterior.
Geração de CARs de 4Hllz e 4Hll-28z direcionados a MUC-CD
As regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo monoclonal 4H11 foram derivadas a partir da linha celular de hibridoma 4H11. Utilizando ADNc gerado a partir de ARN de 4H11, os inventores isolaram a região de codificação VH por RACE PCR utilizando iniciadores modificados como descrito noutro lugar (39, 40). A região variável de cadeia VL foi clonada por PCR padrão utilizando iniciadores modificados como descrito por Orlandi et al. (41, 42) . Os fragmentos VH e VL resultantes foram subclonados
NO VETOR DE CLONAGEM TOPOTA PCR 2.1 (INVITROGEN) E SEQUENCIADOS . OS fragmentos VH e VL foram subsequentemente ligados ao domínio espaçador (Gly4Ser)3, gerando o scFv de 4H11 e fusionados ao péptido líder CD8 humano (CD8L) por PCR de sobreposição (9, 41) . De modo a construir os CARs de 4H11 direcionados a MUC-CD, a região de codificação do scFv de CD8L-4H11 foi fusionada com os domínios de dobradiça e trasmembrana de CD8 humano (para gerar o CAR de 4Hllz), ou alternativamente aos domínios de sinalização transmembrana e citoplasmáticos (para gerar o CAR 4Hll-28z), fusionado ao domínio de sinalização CD3- ζ de recetor de células T (3, 9, 43) . As construções de CAR resultantes foram subsequentemente subclonadas no vetor retroviral SFG de MMLV modificado (44) . Sobrenadantes retrovirais pseudotipados VSV-G a partir de fibroblastos gpg29 transduzidos foram utilizados para construir linhas celulares produtoras retrovirais pseudotipadas de envelope de vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV) estáveis PG13 (41) .
Transferência génica retroviral Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas de dadores saudáveis foram ativadas com fitohemaglutinina (PHA) a 2 pg/ml (SIgMa. St. Louis, MO) e retroviralmente transduzidas em placas de cultura de não tecido revestidas retronectina (45) . Resumidamente, placas de cultura de não tecido de seis poços (BD Biosciences, San Jose, CA) foram revestidas com retronectina (RN) (Takara Biomedicals, Otsu, Japão) conforme as instruções do fabricante. Quarenta e oito horas depois da ativação de PHA, alíquotas de lxlO6 células T em 1 ml de meio RPMI suplementado foram colocadas em cada poço das placas revestidas com RN, juntamente com 1 ml de sobrenadante retroviral SFG. As células T foram centrifugadas diariamente durante 3 dias consecutivos com sobrenadante retroviral novo adicionado diariamente a 2000g a 30 °C durante 1 h (45) . A transferência génica foi avaliada no dia 7 por FACS.
De modo a gerar as células apresentadoras de antigénio artificiais de fibroblastos murinos NIH-3T3 relevantes, uma construção de MUC-CD que codifica os domínios transmembrana e citoplasmáticos extracelulares retidos do antigénio ΜΙΤΟΙ 6 foi inicialmente subclonada no vetor retroviral SFG, SFG(MUC-CD). AAPCs de 3T3(MUC-CD) foram geradas por transdução retroviral de SFG(MUC-CD) em fibroblastos NIH-3T3 de tipo selvagem, enquanto AAPCs de 3T3(MUC-CD/B7.1) foram geradas por transdução retroviral de fibroblastos 3T3(B7.1) previamente estabelecidos (41, 46) . Linhas celulares altamente enriquecidas foram isoladas por FACS.
Para gerar as linhas celulares OV-CAR3(MUC-CD) e OV-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc), os inventores transduziram retroviralmente a linha celular de cancro ovárico OV-CAR3 WT com SFG(GFP-FFLuc) como anteriormente descrito (47) e/ou sobrenadantes retrovirais subtipados de VSV-G SFG(GFP-FFLuc) derivados a partir de fibroblastos gpg29 conforme descrito noutro sítio (44). As células tumorais resultantes foram classificadas por FACS quanto à expressão de MUC-CD isoladamente para a linha celular OVCAR3(MUC-CD), ou expressão dupla de MUC-CD e GFP para a linha celular OVCAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc). A expressão de MUC-CD por FACS foi avaliada utilizando o MAb 4H11.
Análises in vitro de células T humanas CAR+
Para avaliação in vitro da expansão e libertação de citoquinas após estimulação, células T transduzidas foram cocultivadas durante 7 dias depois de transdução retroviral em placas de cultura de tecidos de 6 poços (BD Biosciences) em AAPCs NIH 3T3 confluentes em meio RPMI suplementado com FBS a 10 % na ausência de citoquinas suplementadas. De modo a gerar números suficientes de células T de CAR modificado para estudos in vivo, células T transduzidas foram cocultivadas em AAPCs B7.1+ (3T3(MUC-CD/B7.1)) em meio RPMI suplementado com 20 UI IL-2/ml e 10 ng/ml IL-15 como anteriormente descrito (3, 43). As células T dos pacientes foram ativadas e expandidas com esferas de CD3/CD28 humano (DYNAL®, Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as recomendações do fabricante.
Análise de Western blot da expressão de CAR A análise de Western blot de lisados de células T sob condições redutoras com DTT a 0,1 mol/1 (SIgMa) foi realizada como anteriormente descrito (46) . Resumidamente, as células T transduzidas foram lavadas em PBS e ressuspendidas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (Boston BioProducts, Worcester, MA) com inibidor de protease completo mino de acordo com as instruções do fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . Proteínas resultantes foram separadas com mini géis de SDS-PAGE a 12 % (Bio-Rad, Hercules, CA) depois da adição de tampão de carga redutor 6X (Boston BioProducts, Worcester, MA) e aquecimento a 100 °C durante 10 min. As proteínas separadas foram subsequentemente transferidas para membranas Immobilon e sondadas utilizando um anticorpo monoclonal de cadeia ζ anti-CD3 humano (BD Biosciences). A ligação do anticorpo foi detetada sondando a transferência cm anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano seguindo por deteção de luminescência utilizando Western Lighting Chemiluminescence
Reagent Plus (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA) de acordo com as instruções do fabricante.
Ensaios de citotoxicidade A citotoxicidade de células T modificadas in vitro foi avaliada utilizando o ensaio DELFIA® EuTDA (PerkinElmer LAS, Inc, Boston, MA) seguindo as recomendações do fabricante. A citotoxicidade foi avaliada às 2 horas nas células T efetoras para alvejar células 0V-CAR3(MUC-CD) ou células tumorais primárias (E:T) em razões indicadas. As células T efetoras nestes ensaios representam o número de células T CD8+ CAR+.
Ensaios de deteção de citoquinas
Os ensaios de citoquinas foram realizados de acordo com as especificações do fabricante utilizando um ensaio de deteção de citoquinas humanas multiplex para detetar IL-2 e IFNy (Millipore Corporation, Billerica, MA) utilizando o sistema Luminex IS 100. As concentrações de citoquinas foram avaliadas utilizando o software IS 2.3 (Luminex Corp., Austin, TX).
Modelos tumorais em ratinhos bege-SCID in vivo
Em todos os estudos in vivo, FOX CHASE C.B.-17 (ratinhos bege-SCID) de 8-12 semanas de idade (Taconic, Hudson, NI) foram inicialmente injetados por via ip com 3 x 106 OV-CAR3(MUC-CD), ou para estudos de obtenção de imagens bioluminescente (BLI) 3 x 106células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc). Subsequentemente, 3xl07 células T CAR+ foram injetadas por via ip ou iv no dia 1 ou 7 depois da injeção de tumor, conforme indicado. Os ratinhos foram monitorizados quanto ao desconforto mediante avaliação do perímetro abdominal, pelo eriçado e resposta diminuída aos estímulos. Os ratinhos com desconforto foram submetidos a eutanásia. Todos os estudos murinos foram realizados no contexto de um protocolo (n.° 00-05-065) aprovado pelo
Comité Institucional de Cuidado e Utilização de Animais (Institutional Animal Care and Use Committee).
Obtenção de imagens bioluminescente (BLI) de células tumorais 0VCAR3 (MUC-CD/GFP-FFLuc) em ratinhos bege-SCID BLI foi realizada utilizando o sistema IVIS Xenogen com o software Living Image (Xenogen; Alameda, CA) . Resumidamente, ratinhos portadores de tumores 0VCAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc) foram injetados por via ip com D-luciferina (150 mg/kg; Xenogen) suspendida em 200 μΐ de PBS e submetidos a obtenção de imagens sob anestesia com isoflurano a 2 % depois de 10 min. A obtenção das imagens foi feita num campo de visão de 25 cm a um nível de discretização médio para um tempo de exposição de 0,5 min (3, 43) .
Citometria de fluxo
Todas as análises de citometria de fluxo das células T e células tumorais foram realizadas utilizando um citómetro FACScan com o software Cellquest (BD Biosciences). As células T foram analisadas utilizando anticorpo Alexa Fluor 647 de cabra policlonal específico de CAR (Molecular Probes, Eugene, OR) anticorpos anti-CD4, CD8, B7.1 (Caltag
Laboratories, Burlingame, CA), B7.2 (Invitrogen, Camarillo, CA), 4-1BBL e 0X40 humanos marcados com ficoeritrina (Ancell Corporation, Bayport, MN). Células 3T3(MUC-CD) e 0V-CAR3(MUC-CD) foram coradas com anticorpo 4H11 marcado com Alexa Fluor 647 (gerado e marcado na instalação nuclear de anticorpos monoclonais do MSKCC).
Marcação com CFSE de células T CARP Células T CAR+ foram coradas com CFSE utilizando o kit de proliferação celular CellTrace™ CFSE seguindo as recomendações do fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). A proliferação de células T marcadas com CFSE foi analisada por FACS. Para a deteção de células T marcadas com CFSE in vivo, tumores ováricos foram macerados através de um filtro celular de 40 um (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) e lavados duas vezes com FBS a 2 %/PBS antes da coloração dos anticorpos e análise por FACS.
Estatística
Os dados de sobrevivência foram avaliados por análise log-rank utilizando o software Graphpad Prism (Graphpad Prism software, San Diego, CA) . Os dados de citoquinas foram analisados por teste-t de Student unilateral. RESULTADOS
Os inventores construíram vetores retrovirais SFG codificando CARs de primeira (4Hllz) e segunda (4Hll-28z) geração direcionados ao antigénio MUC-CD utilizando o hibridoma 4H11 que gera um MAb específico para o antigénio MUC-CD (Figura 11A) . Confirmaram a expressão de proteínas CAR de tamanho apropriado através de análise de Western blot das células produtoras retrovirais PG-13 resultantes (SFG-4Hllz e SFG-4Hll-28z) sondadas com um anticorpo específico para a cadeia ζ (dados não mostrados).
De modo a avaliar a função do CAR 4Hllz de primeira geração, células T de dadores saudáveis, isoladas a partir do sangue periférico foram retroviralmente transduzidas para expressar os CARs 4Hllz e 19zl de controlo (Figura IIB) . A função do CAR 4Hllz foi avaliada por proliferação de células T transduzidas com 4Hllz após cocultura em AAPCs 3T3(MUC-CD/B7.1). Os resultados demonstram proliferação específica de células T transduzidas com 4Hllz, quando comparadas com células T modificadas para 19zl (Figura IIC) . Estes dados são consistentes com ligação específica mediada por CAR 4Hllz ao antigénio MUC-CD e subsequente ativação de células T.
Uma vez que a maior parte das neoplasias malignas não é capaz de expressar ligando coestimuladores, os inventores modificaram adicionalmente o CAR 4Hllz para expressar domínios de sinalização coestimuladores transmembrana e citoplasmáticos CD28, construindo o CAR 4Hll-28z de segunda geração (Figura 11A) . Para avaliar se o CAR 4Hll-28z, quando expresso por células T humanas, era capaz de gerar ambos um sinal de ativação primário (designado "sinal 1") através da cadeia ζ, bem como um sinal coestimulador (designado "sinal 2”) através do domínio citoplasmático CD28, que por sua vez permite uma proliferação eficaz de células T na ausência de ligandos coestimuladores exógenos, os inventores compararam a proliferação de células T após cocultura em AAPCs 3T3(MUC-CD) ou 3T3(MUC-CD/B7.1) na ausência de citoquinas exógenas. Conforme esperado, as células T 4Hll-28z+ de segunda geração expandiram-se marcadamente quando comparadas com células T 4Hllz+ após cocultura com AAPCs 3T3(MUC-CD). Em contraste, ambas as células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ se expandiram de forma semelhante em AAPCs 3T3(MUC-CD/B7.1) (Figura 12A) . A coestimulação mediada pelo CAR 4Hll-28z foi adicionalmente verificada por análise dos sobrenadantes de cultura tecidual aos 2 dias a partir de experiências de cocultura em AAPCs 3T3(MUC-CD) demonstrando uma secreção potenciada de IL-2, uma citoquina tipicamente secretada no contexto da coestimulação de células T, em comparação com células T 19zl+ e 19-28z+ de controlo e células T 4Hllz+ de primeira geração (Figura 12B). A secreção de IFNy foi comparável entre células T ativadas 4Hllz+ e 4Hll-28z+.
Em seguida, os inventores avaliaram a capacidade de células T direcionadas a MUC-CD para se expandirem depois de restimulaçóes semanais através de cocultura em AAPCs 3T3(MUC-CD/B7.1) no contexto de IL-2 e IL-15 exógenas (3). Ambas as células T 4Hllzf e 4Hll-28z+ se expandiram mais de 2 logs ao longo de 3 semanas (Figura 12C) . As células T transduzidas com o 4Hll-28z foram adicionalmente analisadas por FACS quanto à expressão de CAR, 7 dias depois da ativação inicial em AAPCs e após duas coestimulações subsequentes em AAPCs demonstrando um enriquecimento inesperado da fração de células T CAR+ (Figura 12D) . Dados semelhantes foram gerados com células T 4Hllz+ expandidas (dados não mostrados).
Citotoxicidade in vitro e proliferação de células T direcionadas a MUC-CD após cocultura com 4Hllz+ e células de tumor ovárico derivadas de ascites recém-isoladas.
De modo a avaliar a capacidade de células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ para alvejar e lisar tumores de carcinoma ovárico humano, os inventores utilizaram a linha celular 0V-CAR3 humana que foi geneticamente modificada para expressar o antigénio MUC-CD, desta maneira, refletindo melhor a maioria de amostras clínicas de tumor ovárico que expressam o antigénio MUC-CD alvejado por 4H11 (48) . Os inventores verificaram inicialmente lise específica por células T direcionadas a MUC-CD demonstrando uma atividade de citotoxicidade significativa de células T modificadas para CAR 4Hllz e 4Hll-28z direcionadas a células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD) em comparação com células T de controlo que expressam CARs 19zl e 1928z direcionados a CD 19 de primeira e segunda geração irrelevantes (Figura 13A) . Células T de dados saudáveis modificadas para expressar CAR 4Hll-28z exibiram, de forma semelhante, lise células de carcinoma ovárico MUC-CD+ derivadas de ascites recém-isoladas, em comparação com células T transduzidas com 19-28z (Figura 13B) . Além disso, células T de sangue periférico de pacientes modificadas para expressar CAR 4H11-28Z lisaram, de forma semelhante, células tumorais MUC-CD+ primárias autólogas derivadas a partir da mesma amostra de ascites, em comparação com células T modificadas para expressar o CAR 19-28z de controlo (Figura 13C).
Os inventores avaliaram adicionalmente a capacidade das células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ a partir de dadores saudáveis para proliferar após cocultura em 0V-CAR3(MUC-CD) conforme avaliado por FACS de células T marcadas com CFSE, bem como números de células T absolutos ao longo de 7 dias após cocultura com tumor (Figuras 13D e E) . Surpreendentemente, os inventores verificaram que ambas as células T 4Hllz+ e 4Hll-28z se expandiram de forma igualmente boa após cocultura com células tumorais 0V- CAR3(MUC-CD) sugerindo a capacidade desta linha celular tumoral para coestimular células T através da expressão de um ligando coestimulador. Para avaliar esta possibilidade, os inventores levaram a cabo análises por FACS adicionais de células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD) demonstrando a expressão do ligando 4-1BBL coestimulador (Figura 13F), mas não dos ligandos coestimuladores B7.1, B7.2 ou OX-40L (dados não mostrados).
Atividade antitumoral in vivo de células T direcionadas a MUC-CD em ratinhos bege -SCID.
Para avaliar a atividade antitumoral in vivo de células T 4Hllz+ and 4Hll-28z+, os inventores geraram em seguida um modelo tumoral de cancro ovãrico de xenotransplante ortotópico por injeção ip de células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD) em ratinhos bege-SCID. Deixados sem tratamento, estes ratinhos desenvolveram ascites marcadas e múltiplos tumores peritoneal nodulares às 3 semanas após a injeção de células tumorais (Figura 14A) . Todos os ratinhos portadores de tumor não tratados tiveram de ser submetidos a eutanásia às 7 semanas depois da injeção de células tumorais devido à evidência de desconforto.
Para avaliar a eficácia antitumoral de células T direcionadas a MUC-CD, ratinhos bege-SCID foram injetados por via ip com células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc) no dia 1 seguido por injeção ip de células T 4Hllz+ ou 4Hll-2Bz+ no dia 2. Para os controlos negativos, ratinhos portadores de tumor não foram tratados ou foram tratados com células T modificadas para expressar o CAR direcionado a CD19 irrelevante. Coletivamente, os inventores verificaram que 27 % de todos os ratinhos tratados com células T direcionadas a MUC-CD (3/11 ratinhos) permaneceram vivos sem evidência clínica de doença, 120 dias fora da injeção de tumor sem diferenças estatisticamente significativas na sobrevivência quando em comparação com as coortes tratadas com células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ (Figura 14B) . Em contraste, ambas as coortes tratadas com células T direcionadas a MUC-CD demonstraram uma sobrevivência estatisticamente significativa quando em comparação com coortes de controlo tratadas com células T 19 z 1+.
Para avaliar se células T direcionadas a MUC-CD infundidas sistemicamente se deslocaram com sucesso para os tumores ip, os inventores compararam, em seguida, a infusão ip com a iv de células T 4Hll-28z+ em ratinhos bege-SCID portadores de tumores 0V-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc) ip. Ambos os ratinhos tratados com células T 4Hll-28z+ por via ip e iv exibiram uma sobrevivência estatisticamente melhorada quando em comparação com coortes de controlo tratadas com células T 19-28z+ ou não tratadas, conforme avaliado pela sobrevivência global (Figura 15A) bem como por BLI da progressão tumoral (Figura 15B). Adicionalmente, os inventores verificaram que a sobrevivência global entre os grupos tratados por via ip e iv eram estatisticamente equivalente por análise log-rank. Estes dados implicam o tráfego bem-sucedido de células T 4Hll-28z+ infundidas por via iv para os tumores peritoneais. Os inventores confirmaram adicionalmente o tráfego de células T 4Hll-28z+ marcadas com CFSE infundidas por via iv para o peritoneu por análise por FACS de suspensões de célula única de tumores 0V-CAR3(MUC-CD) macerados (Figura 15C).
Atividade anti tumoral in vivo de células T direcionadas a MUC-CD em ratinhos bege-SCID que portam tumores 0V-CAR3 (MUC-CD/GFP-FFLuc) bem estabelecidos.
Para avaliar adicionalmente se as células T 4Hll-28z' eram capazes de erradicar cargas tumorais mais clinicamente relevantes, os inventores trataram, em seguida, ratinhos bege-SCID portadores de tumores 0V-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc) ip bem estabelecidos, injetados 7 dias antes da terapêutica com células T adotivas. Uma vez mais, os inventores verificaram que a terapêutica com células T direcionadas a MUC-CD erradicou marcadamente a doença evidenciada por BLI em todos os ratinhos tratados (Figura ISA), com 5 de 8 ratinhos tratados eventualmente desenvolvendo doença progressiva recidivante, e 3 ratinhos permanecendo livres de doença conforme avaliado por obtenção de imagens por BLI (não mostrado) até 120 dias após a infusão de células tumorais (Figura 16B) . Estes dados demonstram uma potente atividade antitumoral in vivo, mediada por células T direcionadas a MUC-CD, mesmo no contexto de doença avançada,
DISCUSSÃO
Com base em análises extensas de amostras tumorais de pacientes, os carcinomas ováricos parecem ser tumores relativamente imunogénicos. Especificamente, os investigadores verificaram que existe uma correlação direta entre o prognóstico depois da cirurgia e quimioterapia e a quantidade de células T efetoras infiltrantes de tumor (Tiles) em amostras tumorais pré-tratamento (25, 49, 50). Adicionalmente, outros descreveram uma correlação inversa entre o prognóstico depois da terapêutica e os níveis pré-tratamento de Tregs dentro do tumor, que por sua vez ibibem a função antitumoral de Tiles efetoras específicas de tumor (26, 28, 51). Ambas estas descobertas implicam um papel para uma resposta de células T efetoras endógenas frente ao tumor no controlo da progressão de doença tanto antes como depois da terapêutica inicial e suportam fortemente a afirmação de que os carcinomas ováricos podem ser suscetíveis à morte por infusão adotiva de células T autõlogas direcionadas a antigénios de células de tumor ovárico.
Embora as Tiles efetoras endógenas sejam uma fonte de células T presumivelmente específicas de tumor, uma abordagem alternativa à terapêutica com células T adotivas consiste em isolar células T do sangue periférico autólogas que, por sua vez, podem ser geneticamente modificadas ex vivo para alvejar antigénios celulares tumorais. Tal abordagem genética consiste em transluzir retroviralmente células T de pacientes com CARs direcionados a antigénios expostos na superfície que sejam únicos ao tumor ou sobre-expressos pelo mesmo. Para esta finalidade, estudos pré-clínicos promissores utilizando esta abordagem noutras neoplasias malignas foram recentemente traduzidos no contexto clínico (6, 16, 19, 52). De forma semelhante, os inventores geraram anteriormente CARs direcionados ao antigénio CD 19 expresso em células B normais bem como na maior parte de neoplasias malignas de células B e estão atualmente a levar a cabo ensaios clínicos tratando pacientes com leucemia linfoblãstica agudas e leucemia linfocítica crónica de células B recidivante com células T autõlogas modificadas para expressar um CAR específico para CD 19 (53) . A aplicação desta abordagem aos carcinomas ovãricos requer a identificação de antigénios alvo adequados expressos na superfície das células tumorais. De forma significativa, outros investigadores estudaram esta abordagem em ambos os contextos pré-clínico e clínico (4, 11, 54-57). Especificamente, vários grupos demonstraram respostas antitumorais específicas para tumores de linhas celulares de carcinoma ovárico humano subcutâneo em ratinhos imunocomprometidos após infusão intravenosa e/ou intratumoral de células T que expressam CARs específicos para a mesotelina e antigénios Lewis-Y sobre-expressos nestas linhas celulares tumorais (56, 58, 59). Adicionalmente, Kershaw et al. publicaram recentemente os resultados de um ensaio clínico de fase I tratando pacientes com carcinomas ováricos recidivantes com células T autólogas modificadas para expressar um CAR específico para o recetor alfa de folato (6). Os autores deste estudo verificaram que a terapêutica com células T direcionadas foi bem tolerada, mas notaram uma falta de resposta antitumoral nestes estudos, relacionada com uma fraca persistência de células T modificadas ao longo do tempo, bem como um fator inibidor de células T ainda indefinido no soro de vários pacientes tratados.
Nos estudos dos investigadores, escolheu-se alvejar a glicoproteína MUC-16 que é sobre-expressa numa maioria de carcinomas ovãricos (1, 30, 32, 33). A utilidade de MUC-16 como um antigénio alvo para a terapêutica com células T adotivas é comprometida pelo facto de que a maioria da porção extracelular desta molécula é clivada pela célula tumoral, secretada e pode ser detetada no soro como o marcador tumoral CA-125. Contudo, depois da clivagem desta fração secretada de MUC-16, permanece uma fração extracelular residual da glicoproteína, designada MUC-CD, que é retida na superfície do tumor e é, portanto, um alvo atrativo para terapêuticas imunitárias. Para esta finalidade, os inventores utilizaram uma série de hibridomas murinos gerados para o antigénio MUC-CD para construir CARs específicos para MUC-CD. Destes CARs, identificou-se um CAR gerado a partir do hibridome murino 4H11 designado 4Hllz, que, quando expresso por células T humanas, após cocultura em AAPCs 3T3(MUC-CD/B7.1), resultou na rápida destruição de monocamadas de AAPCs bem como numa marcada expansão de células T modificadas. De forma significativa, o antigénio para o anticorpo 4H11 é altamente expresso numa maioria de amostras tumorais cirúrgicas de carcinoma ovãrico pré-tratamento obtidas a partir de pacientes tratados na instituição dos inventores conforme avaliado por imunohistoquímica (48). A ativação ótima de células T requer ambos um sinal mediado por recetor de células T primário, "sinal 1" juntamente com um "sinal 2" coestimulador. De forma clássica, este sinal coestimulador pode ser proporcionado por ligação em B7.1 (CD80) ou B7.2 (CD86) na célula alvo com o recetor coestimulador de células T CD28. Alternativamente, a coestimulação pode ser gerada pela ligação de 4-1BBL ou OX-40L na célula alvo com os respetivos recetores coestimuladores 4-1BB ou 0X40 na célula T (12, 60, 61) . Uma vez que a maior parte das células tumorais nâo é capaz de expressar ligando coestimuladores, os investigadores e outros, demonstraram previamente que CARs de segunda geração que incorporam adicionalmente os domínios de sinalização citoplasmãticos dos recetores coestimuladores CD28, 4-1BB e/ou 0X40 resultaram em CARs capazes de proporcionar ambos o sinal 1 e o sinal 2 para a célula T aquando da ligação ao antigénio cognato na ausência de ligandos coestimuladores exógenos (7-10, 12, 13, 15, 16, 62-65), Para esta finalidade, os inventores construíram um CAR de segunda geração a partir do CAR 4Hllz incorporando o domínio de sinalização transmembrana e citoplasmãtico de CD28 como descrito noutro lugar (3, 9, 43) . De forma consistente com outros estudos, os inventores descobriram que as células T transduzidas para expressar o CAR 4Hll-28z resultante, mas não o CAR 4Hllz de primeira geração, se expandiram de forma eficaz após cocultura com fibroblastos 3T3(MUC-CD) na ausência de coestimulação exógena, de forma consistente com a capacidade do CAR 4Hll-28z para proporcionar ambos o sinal 1 e o sinal 2 à célula T. Esta conclusão é adicionalmente apoiada pelo descobrimento de que as células T 4Hll-28z+ secretaram níveis significativamente mais elevados de IL-2, uma citoquina indicativa de coestimulação de células T, após cocultura em fibroblastos 3T3(MUC-CD) em comparação com células T transduzidas para expressar o CAR 4Hllz de primeira geração.
Em seguida, os inventores avaliaram a capacidade de células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ para alvejar e lisar células tumorais de carcinoma ovárico humano. Para esta finalidade, utilizaram inicialmente a linha celular de cancro ovárico humano 0V-CAR3. Uma vez que a linha celular tumoral 0V-CAR3 se liga fracamente ao anticorpo 4H11, modificaram geneticamente ainda mais a linha celular para expressar MUC-CD (0V-CAR3 (MUC-CD)) para imitar de melhor forma o contexto clínico em que uma maioria de espécimes de tumores de carcinoma ovárico clínico expressam altamente o antigénio MUC-CD 4H11(48). Demonstraram que as células T humanas modificadas para expressar 4Hllz ou 4Hll-28z erradicaram células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD) in vitro e observaram, surpreendentemente, que as células T 4Hllz+ e 4Hll-28z+ se expandiram após cocultura com tumor in vitro. Para definir a etiologia desta expansão de células T 4Hllz+ não antecipada, os inventores avaliaram adicionalmente se as células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD) expressaram ligandos coestimuladores e verificaram que esta linha celular tumoral expressava 4-1BBL, de forma consistente com as suas descobertas experimentais bem como com relatórios previamente publicados demonstrando a expressão de 4-1BBL por uma variedade de linhas celulares de carcinoma (66-68). De modo a validar adicionalmente a relevância clínica destas descobertas, os inventores demonstraram subsequentemente a lise específica in vitro de células tumorais derivadas de ascites primárias isoladas a partir de pacientes com carcinoma ovárico não tratado por parte de ambas células T 4Hll-28z+ alogénicas de dadores saudáveis, bem como, mais significativamente, por parte de células T autólogas do sangue periférico de pacientes 4Hll-28z+. Estes dados apoiam fortemente a afirmação de que o tratamento com células T CAR+ baseadas em 4H11 autólogas é promissor em futuras aplicações clínicas.
De modo a avaliar a relevância in vivo das suas descobertas in vitro, os inventores geraram depois um modelo de tumor 0V-CAR3(MUC-CD) ortotópico murino em ratinhos bege-SCID. Injetaram ratinhos por via i.p. com células tumorais 0V-CAR3(MUC-CD) e no dia seguinte realizaram a infusão i.p. de células T 4Hllz+, 4Hll-28z+ e 19zl+ de controlo. Esta abordagem de tratamento resultou num atraso significativo, mas semelhante, na progressão tumoral e sobrevivência a longo prazo em ambas as coortes tratadas com células 4Hllz+ e 4Hll-28z+ em comparação com as células T de controlo direcionadas ao antigénio CD19 irrelevante. Os inventores compararam depois o tratamento ip com o iv com células T 4Hll-28z+ de ratinhos portando 0V-CAR3(MUC-CD/GFP-FFLuc) ortotópico, e encontraram sobrevivências estatisticamente significativas semelhantes dos ratinhos ao longo do tempo, tanto com a infusão ip direta de células T como com a infusão iv sistémica de células T direcionadas. De forma significativa, no dia 1 após o tratamento, os ratinhos tratados por via iv, exibiram um tráfego bem-sucedido para o peritoneu de células T direcionadas. Estes dados sugerem que a terapêutica adotiva com células T direcionadas pode ser igualmente eficaz depois de uma infusão direta no peritoneu ou através de infusão iv sistémica. Estas descobertas apoiam adicionalmente o futuro potencial clínico desta abordagem no tratamento de pacientes tanto como recidiva local da doença como com recidiva metastática em locais fora do peritoneu.
Finalmente, os inventores avaliaram a capacidade das células T 4Hll-28z+ para erradicar doença mais estabelecida, atrasando a infusão ip de células T modificadas em 7 dias, quando os ratinhos tinham cargas tumorais melhor estabelecidas, conforme avaliado por obtenção de imagens bioluminescente. Esta configuração experimental reflete melhor o contexto clínico inicial em que esta abordagem com células T adotivas poderia ser utilizada. De forma significativa, apenas do contexto da doença marcadamente estabelecida, as células T 4Hll-28z+ retiveram a capacidade de lisar cargas tumorais maiores, atrasar a recidiva do tumor e, numa percentagem significativa de ratinhos, erradicar a doença por completo.
Nos estudos aqui apresentados, os inventores utilizaram consistentemente populações mistas de células T CD4+ e CDS+CAR+ para avaliar ambas as atividades antitumorais in vitro e in vivo. Para esta finalidade, estudos em curso abordarão o papel de subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ CAR+ isoladas na erradicação bem-sucedida de doença neste modelo de tumor 0V-CAR3(MUC-CD) em ratinhos bege-SCID. Os resultados destes estudos podem ter implicações na tradução desta abordagem terapêutica para o contexto clínico. Adicionalmente, os inventores reconhecem as limitações associadas com o modelo de tumor bege-SCID apresentado. Nomeadamente, este é um modelo de xenotransplante num ratinho imunocomprometido. Para esta finalidade, os estudos em curso em laboratório estão focados na geração de um modelo tumoral imunocompetente singénico mais clinicamente relevante para melhor definir a biologia e eficácia antitumoral de células T de CAR modificado direcionadas a MUC-CD no contexto de um sistema imunitário intacto.
Em conclusão, os inventores apresentam no presente documento dados que demonstram a viabilidade do alvejamento de MUC-16, um antigénio sobre-expresso numa maioria de carcinomas ovãricos, através de terapêutica adotiva com células T geneticamente modificadas, direcionadas à porção MUC-CD retida do antigénio MUC-16. Adicionalmente, este relatório é o primeiro em demonstrar o alvejamento eficaz de células T num modelo murino ortotópico, clinicamente relevante de cancro ovárico, demonstrando a eficácia tanto por infusão ip e iv de células T modificadas. Finalmente, estes dados apoiam a tradução adicional desta abordagem para o contexto clínico na forma de um ensaio clínico de fase I em pacientes com carcinomas ováricos persistentes ou recidivados, depois da terapêutica inicial com cirurgia e quimioterapia. [j f1] EXEMPLO 5
Produção de anticorpos monoclonals para MUC16 em ratinhos e hamsteres.
Selecionaram-se 3 regiões diferentes do genoma de MUC16 de ratinho para as quais os anticorpos monoclonais foram gerados em ratinhos e hámsteres. As regiões selecionadas do MUC16 de ratinho são Péptido 1 (SEQ ID NO:21, ectoregião do domínio citoplasmãtico) , Péptido 2 (SEQ ID NO:22, primeira ansa de cisteína) e Péptido 3 (SEQ ID NO: 23, segunda ansa de cisteína) (Figura 20A) e a sua comparação com MUC16 humana é mostrada na Figura 20B. Uma cisteína foi adicionada à sequência peptídica no terminal N do Péptido 1 (SEQ ID NO:21) e do Péptido 3 (SEQ ID NO: 23) para uma melhor conjugação com KLH. Os péptidos individuais foram conjugados com KLH utilizando o kit Promega. Estes 3 péptidos conjugados foram agrupados e imunizados em 5 ratinhos e 4 hámsteres. Foram administradas 5 imunizações com um intervalo de 3 semanas para cada imunização. Os soros destes animais foram testados por ELISA quanto à sua reatividade específica com péptidos individuais (SEQ ID NO:21, 22 e 23) . Os animais selecionados como positivos foram deixados repousar durante um mês e depois reforçados por via i.v. com imunogénio de péptidos agrupados (SEQ ID NO: 21, 22 e 23) e os baços foram recolhidos depois de 4 dias. Os esplenocitos foram misturados com parceiros de hibridoma e colocados em placas de microtitulação em várias densidades clonais. As placas foram cultivadas a 37 °C com 5 % de CO2 durante 10 dias e depois os clones foram selecionados. Os sobrenadantes destes clones selecionados foram testados por ELISA quanto à sua reatividade específica com péptidos individuais (SEQ ID NO:21, 22 e 23). Os sobrenadantes clonais positivos foram testados por FACS, Western blot e obtenção de imagens utilizando 2 linhas celulares de ratinho (ID8 e BR5-FVB1) e uma linha celular humano (OVCAR-3). 0 Quadro 4 mostra o resumo dos anticorpos de ratinho e hámster contra antigénios de péptido MUC16, Péptido 1 (SEQ ID NO: 21) , Péptido 2 (SEQ ID NO :22) e Péptido 3 (SEQ ID NO:23). Uma resposta antigénica muito forte foi observada com o Péptido 1 (SEQ ID NO:21).
Quadro 4_
Animais não reforçados iv com péptido 2
Detalhes dos mAbs de ratinho e hámster contra o Péptido 1 (SEQ ID NO: 21) , Péptido 2 (SEQ ID NO: 22) e Péptido 3 (SEQ ID NO: 23) estão listados no Quadro 5 e no Quadro 6 respetivamente.
Quadro 5
Quadro 6
0 anticorpo de hámster 22B05 reconhece a sequência de ratinho (SEQ ID NO:22) e também a correspondente humana (SEQ ID NO:15).
As análises de Western blot utilizando extratos celulares de BR5-FVB1 e IDS de ratinho também foram realizadas para todos os anticorpos monoclonais selecinados conforme mostrado na Figura 21 e Figura 22 respetivamente.
Entre os anticorpos monoclonais de MUC16 de ratinho, selecionaram-se o mAb de ratinho subclone 12B10-3G10 para rastreio adicional. De forma semelhante, os anticorpos monoclonais de hámster, subclones 15A8-2E10, 22B5-2G8 e 4H1-2E1 foram selecionados para rastreio adicional. A análise imunohistoquímica foi realizada com parafina e criosecções de linhas celulares ID8 (ratinho), OVCAR-3 (humano), BR5-FVB1 (ratinho) e 13,5 dias de embrião. Parafina ou crisecções foram sondadas com mAb 12B10 de ratinho, mAbs 15A8 de hámster, 22B5 de hámster e 4E1 de hámster para ver o desenvolvimento precoce de MUC16 de ratinho (Figura 23).
Subclones 12B1Q-3G10 foram adicionalmente analisados quanto aos fragmentos Fv de cadeia simples. A Figura 24 mostra o ADN e sequências de aminoácidos de VH and VL de 12B10-3G10. Os sobrenadantes biorreativos e 12B10-3G10 purificado foram gerados para estudos animais e outros estudos de caracterização. A análise por FACS foi realizada com 12B10-3G10 purificado em células 0VCAR3 e BR5-FVB1 mostrando mais de 90 % de positividade para o fragmento de ectodomínio de MUC16 de ambos ratinho e ser humano (Figura 25) . REFERENCIAS CITADAS NA MEMÓRIA DESCRITIVA E EXEMPLOS 1-3 1. Bast RC, Jr., Feeney M, Lazarus H, Nadler LM, Colvin RB, Knapp RC. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J Clin Invest 1981,-68(5):1331-7. 2. Bast RC, Jr. , Klug TL, St John E, Jenison E, Niloff JM, Lazarus H, et al. A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer. N Engl J Med 1983,-309(15) :883-7. 3. Rustin GJ, Bast RC, Jr., Kelloff GJ, Barrett JC, Carter SK, Nisen PD, et al. Use of CA-12 5 in clinical trial evaluation of new therapeutic drugs for ovarian cancer. Clin Cancer Res 2004,-10(11):3919-26. 4. Rosen DG, Wang L, Atkinson JN, Yu Y, Lu KH, Diamandis EP, et al. Potential markers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 2005;99(2) :267-77. 5. Bast. RC, Jr., Badgwell D, Lu Z, Marquez R, Rosen D, Liu J, et al. New tumor markers: CA125 and beyond. Int J Gynecol Cancer 2005,-15 Suppl 3:274-81. 6. Moore RG, Maclaughlan S, Bast RC, Jr. Current state of biomarker development for clinical application in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 2009. 7. Nustad K, Lebedin Y, Lloyd KO, Shigemasa K, de Bruijn HW, Jansson B, et al. Epitopes on CA 125 from cervical mucus and ascites fluid and characterization of six new antibodies. Third report from the ISOBM TD-1 workshop. Tumour Biol 2002,-23 (5) :303-14. 8. Fendrick JL, Konishi I, Geary SM, Parmley TH, Quirk JG, Jr., O'Brien TJ. CA125 phosphorylation is associated with its secretion from the WISH human amnion cell line. Tumour Biol 1997,-18 (5):278-89. 9. Fendrick JL, Staley KA, Gee MK, McDougald SR, Quirk JG, Jr. , O'Brien TJ. Characterization of CA 125 synthesized by the human epithelial amnion WISH cell line . Tumour Biol 1993;14(5) :310-8. 10. O'Brien TJ, Beard JB, Underwood LJ, Shigemasa K. The CA 125 gene: a newly discovered extension of the glycosylated N-terminal domain doubles the size of this extracellular superstructure. Tumour Biol 2 002,-23(3) : 154-69. 11. Yin BW, Dnistrian A, Lloyd KO. Ovarian cancer antigen CAI25 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int J Cancer 2002,-98(5) :737-40. 12. Yin BW, Lloyd KO. Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16 . J Biol Chem 2001,-276(29):27371-5. 13. Hollingsworth M, Swanson B. Mucins in Cancer: protection and control of the cell surface. Nature Rviews : Cancer 2004 ,-4(1) :45-60. 14. Huang L, Ren J, Chen D, Li Y, Kharbanda S, Kufe D. MUC1 cytoplasmic domain coactivates Wnt target gene transcription and confers transformation. Cancer Biol
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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
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Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especif icamente a um polipéptido MUC16 ou a uma porção antigénica do mesmo, em que o polipéptido MUC16 é TLDRSSVLVDGYSPNRNE (SEQ ID NO :02) em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada variável ("VH") codificada pela SEQ ID NO: 06 e uma cadeia leve variável ("VL") codificada pela SEQ ID NO: 07.
2. O anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
3. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico.
4. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo feito por substituição das regiões de determinação de complementaridade do anticorpo de acordo com a reivindicação 1 num domínio de região estrutural humano, em que o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo se liga especificamente ao polipéptido MUC16 da SEQ ID NO:02 ou a uma porção antigénica do mesmo.
5. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 4, em que os resíduos de domínio de região estrutural são substituídos por resíduos não humanos correspondentes.
6. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o fragmento de ligação a antigénio é selecionado a partir do grupo que consiste num fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 e um fragmento Fv.
7. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo, está covalentemente ligado a um agente citotóxico ou a um profármaco de um agente citotóxico.
8. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o anticorpo se internaliza numa célula.
9. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio de acordo com as reivindicações 1 a 8, em que o anticorpo carece de ligação específica a um domínio extracelular de MUC16 glicosilado.
10. Uma composição que compreende (a) o anticorpo, ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
11. Uma célula de hibridoma que produz um anticorpo ou um fragmento de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 1.
12. Uma sequência nucleotídica isolada que compreende um polinucleótido que codifica a sequência de cadeia pesada variável (VH) e a sequência de cadeia leve variável (VL) de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1.
13. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para utilização num método de identificação de um indivíduo como tendo um cancro no qual MUC16 é expressa, em que o dito método compreende administrar o anticorpo ao indivíduo e determinar a presença e localização do anticorpo no indivíduo, em que o anticorpo é radiomarcado.
14. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o cancro é selecionado a partir do grupo que consiste em cancro ovárico e cancro da mama.
15. Um método ex vivo para identificar um indivíduo como tendo um cancro no qual MUC16 é expressa, em que o dito método compreende (a) colocar uma primeira amostra a partir de um indivíduo em contacto com o anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 sob condições para ligação específica do anticorpo com o seu antigénio cognato e (b) determinar se o anticorpo tem um nível aumentado de ligação à primeira amostra em comparação com uma amostra de controlo que carece do cancro no qual MUC16 é expressa.
16. 0 método ex vivo de acordo com a reivindicação 15, em que o cancro é selecionado a partir do grupo que consiste em cancro ovárico e cancro da mama.
17. 0 método ex vivo de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a determinação é realizada utilizando um procedimento selecionado a partir do grupo que consiste em imunohistoquímica, ensaio de imunoabsorção enzimãtica (ELISA), classificação de células ativada por fluorescência (FACS), Western blot, imunoprecipitação e obtenção de imagens radiogrãficas.
18. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 para utilização no tratamento de um cancro no qual MUC16 é expressa.
19. 0 anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo para utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o cancro é selecionado a partir do grupo que consiste em cancro ovãrico e cancro da mama.
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