PT2766471T

PT2766471T - Processo de produção de celulases sem interrupção por um fungo filamentoso que utiliza um substrato de carbono derivado de um pré-tratamento ácido

Info

Publication number: PT2766471T
Application number: PT127757383T
Authority: PT
Inventors: Ben Chaabane Fadhel; Chaussepied Bernard
Original assignee: Ifp Energies Now
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2017-10-03
Also published as: US20140295524A1; IN2014CN03513A; AU2012322594B2; HUE037331T2; US9249402B2; CN104024399A; FR2981364B1; CN104024399B; EP2766471A1; PL2766471T3; EP2766471B1; DK2766471T3; CA2850609A1; AU2012322594A1; ES2641254T3; BR112014008847A2; CA2850609C; FR2981364A1; BR112014008847B1; WO2013054005A1

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CELULASES SEM INTERRUPÇÃO POR UM FUNGO FILAMENTOSO QUE UTILIZA UM SUBSTRATO DE CARBONO DERIVADO DE UM PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à produção de celulases e de hemicelulases, especialmente no quadro da produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos. Em particular, a presente invenção refere-se a um processo de produção de celulase sem interrupção a partir de um fungo filamentoso.

ESTADO DA TÉCNICA 0 desenvolvimento de processos economicamente viáveis de produção de biocarburantes de 2a geração é hoje um vasto assunto da atualidade. Estes últimos são produzidos a partir de biomassa lignocelulósica e colocam menos problemas de concorrência de uso das terras agrícolas com alimentos, em relação aos biocarburantes chamados de primeira geração que são produzidos a partir da cana-de-açúcar, milho, trigo ou beterraba. A biomassa lignocelulósica é caracterizada por uma estrutura complexa constituída por três frações principais: a celulose, as hemiceluloses e as ligninas. De modo convencional, o processo de transformação em etanol compreende várias etapas. 0 pré-tratamento torna a celulose acessível para as enzimas que são celulases. A etapa de hidrólise enzimática permite a transformação da celulose em glicose que é em seguida transformada em etanol no momento da etapa de fermentação, em geral, pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Finalmente, a etapa de destilação permitirá separar e recuperar o etanol do mosto de fermentação.

Os diferentes estudos técnico-económicos demonstram que a redução do custo das celulases é um dos pontos-chave dos processos de produção biológica de etanol a partir das matérias-primas lignocelulósicas. Atualmente, as celulases industriais são produzidas principalmente por um fungo filamentoso, Trichoderma reesei, devido ao seu forte poder de secreção. Trichoderma reesei é o microrganismo mais utilizado para a produção de celulases. As estirpes selvagens têm a faculdade de excretar, na presença de um substrato indutor, a celulose por exemplo, o cocktail enzimático considerado como o mais adequado para a hidrólise da celulose. As enzimas do cocktail enzimático contêm três grandes tipos de atividades: as endoglucanases, as exoglucanases e as celobiases. Outras proteínas que possuem propriedades indispensáveis para a hidrólise dos materiais lignocelulósicos são também produzidas por Trichoderma reesei, as xilanases por exemplo. A presença de um substrato indutor é indispensável para a expressão das enzimas celulóticas e/ou hemicelulóticas. A regulação dos genes de celulases em diferentes fontes de carbono foi estudada em detalhe. São induzidas na presença de celulose, dos seus produtos de hidrólise (exemplo: celobiose) ou de alguns oligossacáridos, como a lactose ou a soforose (limén e al, 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306).

As técnicas de genética convencional por mutação permitiram a seleção de estirpes de Trichoderma reesei híper-produtoras de celulases tais como as estirpes MCG77 (Gallo - patente US 4275 167), MCG 80 (Allen, A.L. e Andreotti, R.E. Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S. e Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) e CL847 (Durand e al, 1984, Proc.Colloque SFM "Génétique des micro-organismos industrieis". Paris. H. HESLOT Ed. pp 39-50). O processo de produção de celulases por Trichoderma reesei foi objeto de melhoramentos significativos para extrapolação à escala industrial. A estratégia que se aplica industrialmente é fazer um rápido crescimento do fungo até a uma dada concentração numa etapa chamada fase de crescimento do referido fungo, depois induzir a produção de celulases a partir do referido fungo para maximizar a produtividade e o rendimento numa etapa chamada fase e produção. A referida fase de crescimento realiza-se em geral num reator fechado, isto é, no modo "batch" de acordo com a terminologia anglo-saxónica. A referida fase de produção realiza-se em geral num reator de alimentação continua durante a qual nenhuma extração do conteúdo do reator é efetuada, isto é, no modo "fed batch" de acordo com a terminologia anglo-saxónica. Para obter boas produtividades de enzimas, é necessário fornecer uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei na fase de crescimento e um substrato indutor para a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura na fase de produção. A celulose pode desempenhar estes dois papéis; no entanto, é de dificil utilização na fase industrial e foi substituída por fontes de carbono solúveis como a lactose, para a expressão das celulases.

Outros açúcares solúveis como a celobiose e a soforose foram descritos como substratos indutores, mas são demasiado caros para serem usados na fase industrial. No entanto, as produções de celulases por Trichoderma reesei, com substratos solúveis, são muito inferiores às obtidas em celulose no modo "batch". Isso deve-se ao efeito repressivo dos açúcares facilmente assimiláveis, com alta concentração. A alimentação sem interrupção no modo "fed batch" dos substratos de carbono indutores solúveis aumentou a repressão catabólica limitando a concentração residual de substrato de carbono nas culturas e otimizando a quantidade de açúcar para obter um rendimento melhor e uma melhor produtividade enzimática. Por exemplo, a patente FR-B-2 881 753 descreve um processo de produção de celulases que compreende duas etapas: - Uma fase de crescimento no modo "batch" onde é necessário fornecer uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei depois - Uma fase de produção no modo "fed-batch" que utiliza um substrato indutor tal como por exemplo a lactose que permite a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. A alimentação de substrato de carbono solúvel é contínua, a um débito especifico ótimo aplicado, expresso em mg de substrato por grama em peso seco de fungo filamentoso e por hora, compreendido entre 35 e 45 mg.g-1.h_1.

Nesta patente, a etapa de produção das proteínas não é implementada para além de 170 h. Este protocolo conduz a uma concentração de proteínas da ordem de 35 a 40 g/L com uma produtividade da ordem de 0,2 g.L_1.h_1.

No entanto, o reator deve ser limpo e deve realizar-se uma nova cadeia de inoculação. A desvantagem deste modo de funcionamento é uma produtividade demasiado baixa que faz aumentar o investimento inicial em número de fermentadores de produção de enzimas. A concentração de proteínas obtida também é pouco elevada e precisa muitas vezes de uma etapa de concentração após filtração do micélio. Tudo isso contribui para tornar o processo de produção de etanol de segunda geração pouco competitivo. W02009/026716 descreve uma cultura contínua de Trichoderma para a produção de celulase e de hemicelulase. A fonte de carbono é uma mistura de açúcares derivados de hemicelulose e de açúcares indutores de celulase. A taxa de diluição da cultura contínua é de 0.025 h_1.

Um objetivo da presente invenção é fornecer um processo de produção de celulases e de hemicelulases que utiliza pelo menos um substrato de carbono indutor específico resultante do pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico para aumentar até mesmo para duplicar a produtividade e a concentração de celulases e de hemicelulases produzidas em relação aos processos do estado da técnica, e produzir estas celulases sem interrupção durante um período maior. O processo de acordo com a presente invenção permite aumentar ou até mesmo duplicar a produtividade e a concentração de celulases e de hemicelulases produzidas mantendo o rendimento de produção de celulases em relação ao substrato de carbono constante usado em relação aos processos do estado da técnica.

RESUMO E INTERESSE DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo de produção de celulases e de hemicelulases por uma estirpe pertencente a um fungo filamentoso, em biorreator agitado e arejado que compreende pelo menos duas fases:

- uma fase a) de crescimento da referida estirpe na presença de pelo menos um substrato de carbono de crescimento em reator fechado, a referida fase de crescimento sendo realizada com uma concentração de substrato de carbono de crescimento compreendida entre 10 e 90 g/L - uma fase b) contínua de produção de celulases em que pelo menos um substrato de carbono indutor é alimentado a um débito de alimentação pelo menos constante durante um período pelo menos superior a 200 h, o referido substrato de carbono indutor sendo pelo menos uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico, a referida solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico não sofrendo esterilização prévia e sem retificação de pH, o referido pH da solução aquosa sendo compreendido entre 0,5 e 3, a massa de volume reacional sendo mantida constante por extração de uma fração do referido volume reacional, a referida fase b) funcionando a uma taxa de diluição compreendida entre 0,001 e 0,008 h-1, em que o substrato de carbono indutor usado na fase b) é uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico em mistura com pelo menos um outro substrato de carbono escolhido entre açúcares indutores ou não indutores, em que o débito de alimentação do referido substrato de carbono indutor é compreendido entre 35 e 140 mg de substrato de carbono indutor por grama em peso seco de estirpe e por hora.

Vantagem da invenção

Uma vantagem da presente invenção é a de melhorar a produtividade e a concentração de proteínas produzidas num período de funcionamento maior. Em particular, o processo de acordo com a invenção permite a obtenção de uma concentração de proteínas superior a 100 g.L-1. Estes desempenhos foram mantidos experimentalmente no modo contínuo durante mais de 400 h. A alta produtividade obtida permite reduzir os custos de investimentos no biorreator. A duração prolongada reduz o tempo consagrado à limpeza dos biorreatores e às cadeias de inoculação. A grande concentração de celulases reduz os custos de pós-tratamento.

Uma outra vantagem do processo contínuo de acordo com a invenção é que precisa de um baixo K.La devido, ao mesmo tempo à aplicação de uma baixa taxa de diluição na fase b) contínua de produção e à utilização de uma solução de substrato de carbono indutor específico na referida fase b) , o que torna possível manter uma baixa viscosidade no meio reacional.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 processo de acordo com a invenção funciona de preferência a um pH compreendido entre 3 e 6, a uma temperatura compreendida entre 20 e 35°C, a um vvm, isto é a uma taxa de arejamento expressa em volume de ar, nas condições normais de temperatura e de pressão, por volume de meio reacional e por minuto compreendida ente 0,3 e 1,5 min-1, de preferência entre 0,3 e 1 min-1 e com uma agitação que permite obter uma pressão parcial de oxigénio no meio reacional compreendida entre 20% e 60% e de preferência compreendida entre 20% e 40%.

De preferência, o processo de acordo com a invenção funciona a um vvm de 0.5 min-1 e com uma agitação que permite regular a pressão parcial de oxigénio a 30%.

De acordo com a invenção, o referido processo compreende uma fase a) de crescimento da estirpe pertencente a um fungo filamentoso, de preferência o fungo Trichoderma reesei, na presença de pelo menos de um substrato de carbono de crescimento em reator fechado, a referida fase de crescimento realizando-se com uma concentração de substrato de carbono de crescimento compreendida entre 10 e 90 g/L. A referida estirpe implementada no processo de acordo com a invenção é uma estirpe de um fungo filamentoso pertencente de preferência aos géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, e de modo preferido a referida estirpe pertence à espécie Trichoderma reesei. A estirpe usada que pertence de preferência à espécie Trichoderma reesei, pode ser vantajosamente modificada para melhorar as enzimas celulóticas e/ou hemicelulóticas por processos de mutação-seleção, com por exemplo a estirpe IFP CL847. Uma estirpe melhorada pelas técnicas de recombinação genética pode também ser utilizada. A referida estirpe é cultivada em reatores agitados e arejados em condições compativeis com o seu crescimento e a produção de celulases. Outras estirpes de microrganismos que produzem celulases de acordo com processos semelhantes aos utilizados para Trichoderma podem ser utilizadas.

De modo muito preferido, a estirpe utilizada é uma estirpe de Trichoderma reesei modificada por mutação, seleção ou recombinação genética. A estirpe pode vantajosamente ser escolhida entre as estirpes CL847, RutC30, MCG77 ou MCG80. 0 substrato de carbono de crescimento utilizado na referida fase de crescimento é vantajosamente escolhido entre os açúcares solúveis industriais, e de preferência entre a glicose, a lactose, a xilose, os resíduos obtidos após fermentação etanólica dos açúcares de monómeros dos hidrolisados enzimáticos de substrato lignocelulósico e os extratos da fração hemicelulósica na forma de monómeros provenientes de substrato pré-tratado lignocelulósico usado sozinho ou em mistura.

De acordo com a sua natureza, o referido substrato de carbono é vantajosamente introduzido no reator antes de esterilização do referido reator ou é esterilizado separadamente e introduzido no reator previamente esterilizado.

De preferência, a concentração de substrato de carbono de crescimento é compreendida entre 30 e 70 g/L.

De preferência, a fase a) de crescimento é realizada num período compreendido entre 30 e 70 h e de preferência entre 40 e 60 h.

De preferência, a fase a) de crescimento funciona a um pH de 4,8 e a uma temperatura de 27°C.

De acordo com a invenção, o referido processo compreende uma fase b) contínua de produção de celulases em que pelo menos um substrato de carbono indutor é alimentado a um débito de alimentação constante pelo menos, durante um período pelo menos superior a 200 h, o respetivo substrato de carbono sendo pelo menos uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico, a referida solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico não sofrendo esterilização prévia e sem retificação de pH, o referido pH da solução aquosa sendo compreendido entre 0,5 e 3, a massa do volume reacional sendo mantida constante por extração de uma fração do referido volume reacional, a referida fase b) funcionando a uma taxa de diluição compreendida entre 0,001 e 0,008 h-1. A referida fase contínua realiza-se vantajosamente num reator de alimentação contínua durante a qual uma fração de volume reacional é extraída de modo a manter constante a massa do volume reacional. A referida fase contínua chama- se modo "chemostat" de acordo com a terminologia anglo- saxónica. 0 substrato lignocelulósico que permite obter a solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico usada na fase b) do processo de acordo com a invenção é uma fonte de hidratos de carbono composta por três constituintes principais: a celulose (35 a 50%) , as hemiceluloses (20 a 30%) que são polissacarídeos essencialmente constituídos por pentoses e por hexoses e a lignina (15 a 25%) que é uma macromolécula de estrutura complexa e de elevado peso molecular, composto de álcoois aromáticos ligados por ligações éter. O referido substrato é vantajosamente escolhido entre as palhas, a madeira, as culturas florestais, os resíduos de plantas alcoolígenas, açucareiras, cerealíferas, os resíduos da indústria de papel e os produtos de transformação dos materiais lignocelulósicos. O pré-tratamento ácido suportado pelo referido substrato lignocelulósico é implementado de acordo com os pré-tratamentos ácidos conhecidos do perito na técnica. De preferência, o pré-tratamento ácido é uma hidrólise ácida, uma cozedura ácida ou uma explosão de vapor com impregnação prévia do referido substrato lignocelulósico com uma solução aquosa de ácido sulfúrico. A solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico assim obtida tem um pH compreendido entre 0,5 e 2 e é usada sem etapa de esterilização nem retificação do pH.

De preferência, a referida solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico tem um pH compreendido entre 0,5 e 2. 0 substrato de carbono indutor utilizado na fase b) do processo de acordo com a invenção é vantajosamente uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico sozinho ou em mistura com pelo menos um outro substrato de carbono que não sofreu esterilização.

De preferência, os referidos substratos de carbono são escolhidos entre açúcares indutores ou não indutores, de modo preferido escolhidos entre a lactose, a glicose, a celobiose e a xilose, tomadas sozinhas ou em mistura.

Os referidos substratos estão dissolvidos na referida solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico.

Se o substrato de carbono indutor é uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico em mistura com pelo menos um outro substrato de carbono que não sofreu esterilização, o referido substrato de carbono indutor tem uma concentração compreendida entre 200 e 600 g/L de acordo com o grau de solubilidade dos substratos de carbono usados.

Se o substrato de carbono indutor é uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico sozinho, o referido substrato de carbono indutor tem uma concentração compreendida entre 40 e 400 g/L eventualmente depois de ter sido concentrada. A utilização do referido substrato de carbono indutor especifico resultante do pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico permite a implementação da fase b) de produção de celulases num período maior, de preferência superior a 200 h, em relação aos processos do estado da técnica.

De acordo com a invenção, o referido substrato de carbono indutor é alimentado a um débito de alimentação pelo menos constante. De preferência, o débito de alimentação do referido substrato de carbono indutor é compreendido entre 35 e 140 e de preferência entre 35 e 60 mg de substrato de carbono indutor por grama em peso seco de estirpe e por hora.

De modo preferido, o débito de alimentação é aumentado gradualmente na fase b) , de modo mais preferido gradualmente aumentado até ser duplicado nas primeiras horas de implementação da fase b) , de preferência pelo menos após 24 h e de modo preferido pelo menos após 48 h de implementação da fase b).

De acordo com a invenção, a duração da fase b) contínua de produção de celulases é pelo menos superior a 200 h de preferência pelo menos superior a 300 h e de modo preferido pelo menos superior a 400 h.

Na fase b), a massa do volume reacional é mantida constante por extração de uma fração do referido volume reacional.

De preferência, a extração é feita de acordo com os métodos de extração conhecidos do perito na técnica como por exemplo através de um sistema de regulação e de uma bomba de extração controlável.

De preferência, o débito de extração é pelo menos igual ao débito de alimentação na fase b).

De acordo com a invenção, a taxa de diluição, definida como a razão do débito de extração sobre o volume do reator no momento da fase b) continua de produção é vantajosamente compreendida entre 0,001 h-1 e 0,008 h-1 e de modo preferido entre 0,002 e 0,008 h-1. A taxa de diluição mais preferida é de 0,004 h-1. De preferência, a fase b) funciona a um pH compreendido entre 3 e 5,5 e a uma temperatura compreendida entre 20 e 30°C.

Uma fase opcional a' ) de produção realizada num reator de alimentação continua com pelo menos um substrato de carbono indutor, durante a qual nenhuma extração do conteúdo do fermentador é efetuada, isto é, no modo" fed batch" é vantajosamente implementada entre a fase a) e a fase b). A implementação da referida fase a' ) permite não extrair a fração do volume racional que contém a estirpe de fungo filamentoso enquanto as concentrações de proteínas produzidas são ainda baixas. O referido substrato de carbono indutor utilizado na fase a') é idêntico ao substrato de carbono indutor utilizado na fase b) de produção.

De preferência, o débito de alimentação do referido substrato de carbono indutor é compreendido entre 35 e 140 e de preferência entre 35 e 60 mg de substrato de carbono indutor por grama em peso seco de estirpe e por hora. O referido débito de alimentação é mantido constante durante toda a duração da fase a').

De preferência, a fase a' ) é implementada durante um periodo compreendido entre 50 e 150 h e de preferência entre 70 e 130 h.

De preferência, a fase a' ) funciona a um pH compreendido entre 3 e 5,5 e a uma temperatura compreendida entre 20 e 30°C. 0 processo de acordo com a presente invenção permite aumentar ou mesmo duplicar a produtividade assim como a concentração de celulases e de hemicelulases produzidas em relação aos processos do estado da técnica, e produzir essas celulases sem interrupção durante um periodo maior.

EXEMPLOS

Exemplo 1: não conforme O exemplo 1 tem uma cultura que utiliza as condições de referência da patente FR-B-2 881 753. O exemplo 1 ilustra um processo de produção de celuloses e de hemiceluloses que inclui uma fase de crescimento e uma fase de produção no modo "fed batch" implementada durante 167 h. A produção de celulases e de hemicelulases é efetuada em reator agitado mecanicamente de 3 L. 0 meio mineral tem a seguinte composição: KOH 1,66 g/L, H3PO4 85% 2 ml/L, (NH4)2S04 2,8 g/L, MgS04, 7H20 0, 6 g/L, CaCL2 0,6 g/L, MnSCq 3,2 mg/L, ZnS04, 7H20 2,8 mg/L, C0CI2 10 4,0 mg/L, FeS04, 7 H20 10 mg/L, Corn Steep 1,2 g/L, anti espuma 0,5 mL/L. É realizada uma pré-cultura liquida da estirpe de Trichoderma reesei CL847. 0 meio mineral da pré-cultura, é idêntico ao do reator exceto a adição de ftalato de potássio a 5 g/L para tapar o pH. 0 crescimento do fungo em pré-cultura é feito usando a glicose como substrato de carbono, na concentração de 30 g.L-1. O crescimento do inoculo dura 2 a 3 dias e é efetuado a 28°C numa incubadora agitada à pressão atmosférica. O reator que contém o meio mineral é esterilizado a 120°C durante 20 minutos, a glicose da fonte de carbono é esterilizada à parte a 120°C durante 20 minutos depois adicionada esterilmente ao reator de modo a ter uma concentração final de 30 g/L. O reator é inoculado com 10% (v/v) com a referida pré-cultura liquida da estirpe de Trichoderma reesei CL847 desde que a concentração residual de glicose na pré-cultura seja inferior a 15 g/L. A experiência efetuada no biorreator compreende duas fases: - Uma fase de crescimento sobre a glicose do substrato de carbono (concentração inicial = 30 g/L) a uma temperatura de 27°C e um pH de 4,8 (regulado por amoniaco 5,5 M) . o arejamento é de 0,5 vvm e a agitação é aumentada entre 200 e 800 rpm em função da pC>2 (pressão de oxigénio dissolvido) que é regulada para 30%. - Uma fase de produção de proteínas no modo "fed batch". Após 30 horas, uma solução de lactose do substrato de carbono a 250 g.L-1 é injetada sem interrupção ao débito de 4 mL/h, ou seja, com 35 mg de lactose por g da estirpe de Trichoderma reesei CL847 e por hora até 167 horas. A temperatura é reduzida para 25°C e o pH para 4 até ao fim da cultura. O pH é regulado por adição de uma solução de amoniaco a 5,5 N que fornece o azoto necessário para a síntese das celulases e das hemicelulases excretadas. 0 teor de oxigénio dissolvido é mantido a 30% por ação da agitação. A produção de celulases é seguida pela dosagem das proteinas extracelulares através do método de Lowry e padrão BSA, após separação do micélio por filtração ou por centrifugação. As atividades celulóticas determinadas são: - A atividade do papel de filtro (UPF: unidade do papel de filtro) que doseia a atividade global do fornecimento enzimático de endoglucanases e de exoglucanases A atividade β-glicosidade para as atividades especificas. A atividade UPF é medida em papel Whatman n°l de acordo com o procedimento recomendado pela comissão biotecnológica IUPAC, para a concentração inicial de 50 g.L-1; determina-se a amostra para ensaio da solução enzimática a ser analisada que liberta o equivalente de 2 g.l-1 de glicose (dosagem colorimétrica) em 60 minutos. O principio da atividade do papel de filtro é determinar por dosagem com ácido dinitrossalicilico (DNS) a quantidade de açúcares reduzidos resultante de um papel Whatman N°l. O substrato usado para determinar a atividade β-glicosidade é o p-nitrofenil-p-D-glucopiranósido (PNPG). É clivado pela β-glicosidade que liberta o p-nitrofenol. Uma unidade de atividade β-glicosidade é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 pmol de nitrofenol a partir de PNPG por minuto e é expressa em IU/ml. As atividades especificas são obtidas dividindo as atividades expressas em IU/ml pela concentração de celulases. São expressas em IU.mg-1. A produtividade final é calculada tendo em conta toda a massa das celulases e das hemicelulases produzidas durante a fase de produção (incluindo as amostras) e dividindo-a pela duração da fase de produção e o volume útil do reator. 0 termo "Biomassa" caracteriza a estirpe de Trichoderma reesei CL847. 0 termo "Proteina" é definido como o cocktail enzimático obtido que compreende as celulases e hemicelulases produzidas.

As determinações analíticas sobre o mosto final do exemplo 1 dão os seguintes resultados:

Biomassa g/1: 14,4 Proteínas g/1: 35,7 Produtividade = 0,21 g/L/h UPF 22,1 IU/mL β-Glicosidade específica: 0,8 IU/mg Exemplo 2: não conforme 0 exemplo 2 tem uma cultura análoga ao exemplo 1 exceto que o modo "fed batch" é continuado para além de 200 h com o mesmo substrato de alimentação. Constata-se que há uma paragem da produção de celulases e de hemicelulases após 200 h. Estas começam mesmo a degradar-se visto que a concentração diminui de 37 g/L para 35 g/L. A biomassa aumenta por sua vez durante esse período até atingir uma concentração de 20,9 g/L. As dosagens mostram que houve uma carência de enxofre. A evolução da concentração de biomassa e de proteínas (g/L) é representada na figura 1.

As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados:

Biomassa g/L: 20,9 Proteínas g/L: 35,1

Produtividade = 0,13 g/L/h (era de 0,17 g/L/h após 216 h)

UPF 16,1 IU/mL β-Glicosidade especifica 0,7 IU/mg

Exemplo 3: conforme a invenção O exemplo 3 é lançado nas mesmas condições que o exemplo 1, mas compreende 3 fases: - Uma fase a) no modo "batch" nas mesmas condições que o exemplo 1, mas com uma concentração de glicose de 60 g/L. Esta fase dura 50 h. - Uma segunda fase a') no modo "fed-batch". O fedbatch é lançado num momento do esgotamento da glicose do substrato de carbono com uma solução de hidrolisado hemicelulósico resultante de uma palha pré-tratada por explosão de vapor com impregnação prévia de H2SO4 em que se dissolveu glicose e lactose para alcançar uma concentração global de substrato de carbono de 500 g/L. Esta solução não é esterilizada e o seu pH não aumentou e é de 1. Um débito de 4 mL/h (ou um fluxo de 35 mg de açúcares por g de estirpe de Trichoderma reesei CL8477 e por hora é aplicado) . Esta fase dura 100 h. - Uma fase b) de produção continua de celulases e de hemicelulases é lançada depois disso. O débito de alimentação é mantido constante a 4 mL/h durante toda a experiência. O reator é mantido a um peso constante que extrai continuamente o mosto através de um sistema de regulação e de uma bomba de extração controlável. A taxa de diluição é de 0,002 h-1.

Produzimos sem interrupção a partir de 400 h uma solução enzimática com uma concentração superior a 100 g/L e com uma produtividade superior a 0,2 g/L/h. Isso permite, pois, triplicar a concentração de proteínas e ter uma produtividade superior à do exemplo 1 (+ 20%). A evolução da concentração de biomassa e de proteínas (g/L) ao longo do tempo para o exemplo 3 em que a fase contínua é lançada após 150 h com um débito de 4 mL/h é representada na figura 2.

Biomassa g/L: 36,7 Proteínas g/L: 107,2 Produtividade final = 0,26 g/L/h UPF 76,8 IU/mL β-Glicosidades específica 1,2 IU/mg Exemplo 4: conforme 0 exemplo 4 é análogo ao exemplo 3 exceto que a fase b) contínua de produção é lançada diretamente após a fase a) de crescimento no modo "batch" e que o débito de alimentação de substrato de carbono indutor na fase b) contínua de produção é aumentado gradualmente de 4 mL/h para 8 mL/h, isto é aumentado 1 mL a cada 12 h depois do lançamento da referida fase b) . 0 substrato de carbono indutor usado é o mesmo que o do exemplo 3, isto é uma solução de hidrolisado hemicelulósico resultante de uma palha pré-tratada por explosão de vapor com impregnação prévia de H2SO4 em que se dissolveu glicose e lactose. Esta solução não é esterilizada e o seu pH não aumentou e é 1. As condições de funcionamento utilizadas nas fases a) e b) são idênticas às utilizadas no exemplo 3. No fim do aumento do débito de alimentação de substrato de carbono indutor, a taxa de diluição é de 0,004 h_1. A massa do volume reacional é mantida constante. A produtividade final da experiência é de 0,39 g.L_1.h_1. Ela quase duplicou em relação ao exemplo 1. Isso permite reduzir os custos de investimentos. A concentração final de proteínas quase triplicou. Isso reduz os custos de pós-tratamento especialmente, se for o caso, a concentração das proteínas produzidas. A cultura não precisa de um KLa elevado (cerca de 75 h_1) graças à baixa taxa de diluição aplicada que permite assim ter baixos custos de funcionamento ligados à agitação e ao arejamento. A evolução da produtividade (rp) de celulases e concentrações de estirpes de T. reesei e de celulases para o exemplo 4 em que a fase contínua é lançada após 150 h e o débito de fed-batch é aumentado de 4 para 8 mL/h é representado na figura 3.

Biomassa g/L: 58,1 Proteínas g/L: 102,9 Produtividade final = 0,39 g/L/h UPF 77,6 IU/mL β-Glicosidade específica: 1,3 IU/mg A produtividade quase duplicou em relação ao exemplo 1 e a concentração de proteínas quase triplicou. A referida concentração é mantida durante mais de 300 h.

Exemplo 5: não conforme O exemplo 5 mostra o efeito da não esterilização da solução de hidrolisado hemicelulósico resultante de uma palha pré-tratada por explosão de vapor com impregnação prévia de H2SO4 nos desempenhos do processo. O exemplo 5 é lançado nas mesmas condições que o exemplo 4 exceto que a solução de hidrolisado é esterilizada antes da utilização. A concentração da referida solução é de 250 g/L. A cultura conduz a uma alta acumulação da estirpe T. reesei e a uma baixa produção de celulases. A procura de oxigénio é muito grande no final de cultura com um KLa necessário superior a 170 h_1. O rendimento de produção de proteína em relação ao substrato de carbono é inferior a 0,1 g/g embora seja de 0,3 g/g para os exemplos de 1 a 4.

Biomassa: g/L: 99,8

Proteínas: g/L: 24,2

UPF: 14,5 IU/mL β-Glicosidade específica: 1,1 IU/mg Exemplo 6: não conforme 0 exemplo 6 mostra a desvantagem da implementação de fase contínua com alta taxa de diluição que conduzem a um meio viscoso e a problemas de entupimento da bomba de extração por causa da morfologia do fungo quando está na fase de crescimento. 0 KLa e, portanto, o custo de funcionamento ligado à agitação e ao arejamento é elevado. 0 exemplo 6 é conduzido nas mesmas condições que o exemplo 4 com uma primeira fase a) de crescimento no modo "batch" que dura 50 h e uma fase b) contínua de produção de celulases e de hemicelulases. A solução que alimenta a fase de produção é uma solução de hidrolisado hemicelulósico que não é esterilizado em que é dissolvida lactose a 250 g/L. O débito de alimentação de substrato de carbono indutor é de 13 ml/h o que corresponde a 54 mg de açúcares por g de estirpe de Trichoderma reesei CL847 e por hora. A massa do volume reacional é mantida constante e a taxa de diluição aplicada é de 0,025 h_1. O encaminhamento da experiência foi muito difícil com um entupimento repetitivo da bomba de extração, o meio sendo muito viscoso quando o fungo está em crescimento. Houve uma grande produção de fungo e a instrução de pC>2 não pôde ser mantida acima de 0%. O estado estacionário não pôde ser atingido. O KLa do biorreator não era suficiente para levar o oxigénio necessário para consumir todo o fluxo de açúcar da alimentação. KLa de 700 h_1 foram, no entanto, medidos em água com este reator.

Exemplo 7: não conforme O exemplo 7 é conduzido sob as mesmas condições que o exemplo 3 com a diferença de que a fase no modo "batch" é realizada com uma concentração de glicose de 65 g/L. A fase a' ) no modo "fed-batch" e a fase b) de produção continua são realizadas nas mesmas condições com a diferença de que a solução que alimenta as fases a' ) e b) é uma solução de lactose a 250 g/L acidificada por adição de ácido sulfúrico H2SO4 para que a referida solução tenha um pH de 1,5. As evoluções das concentrações de biomassa celular estão presentes na figura 4. Também se mostra na figura 4 a evolução das concentrações em sulfatos e em iões de amónio que não são limitativas. A experiência não permite obter uma concentração de proteínas superior a 50 g/L. a concentração de proteínas estabiliza a 50 g/L após 400 h.

Os resultados obtidos mostram a importância da utilização de uma solução de hidrolisados hemicelulósico na fase continua de produção e os desempenhos obtidos não são devidos à remoção da carência de enxofre e de azoto.

Biomassa: g/L: 23 Proteínas: g/L: 48,3 UPF: 31,2 β-Glicosidade específica: 1,1

Exemplo 8: não conforme 0 exemplo 8 é conduzido sob as mesmas condições que o exemplo 3 com a diferença de que a solução de hidrolisado hemicelulósico resultante de uma palha pré-tratada por explosão de vapor com impregnação prévia de H2SO4 em que se dissolveu glicose e lactose não é esterilizada, mas sofreu uma retificação do seu pH por adição de NaOH. 0 seu pH é aumentado para 4. A produção de proteínas para após 160 h e permanece estável a uma concentração próxima de 20 g/L.

Biomassa: g/L: 25,1 Proteínas: g/L: 19,8 UPF: 15,8 IU/mL β-Glicosidade específica: 1,2 IU/mg Lisboa, 25 de setembro de 2017

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de celulases e de hemicelulases por uma estirpe pertencente a um fungo filamentoso, em biorreator agitado e arejado que compreende pelo menos duas fases: - uma fase a) de crescimento da referida estirpe na presença de pelo menos um substrato de carbono de crescimento em reator fechado, a referida fase de crescimento sendo realizada com uma concentração de substrato de carbono compreendida entre 10 e 90 g/L - uma fase b) continua de produção de celulases em que pelo menos um substrato de carbono indutor é alimentado a um débito de alimentação pelo menos constante durante um periodo pelo menos superior a 200 h, o referido substrato de carbono indutor sendo pelo menos uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico, a referida solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico não sofrendo esterilização prévia e sem retificação de pH, o referido pH da solução aquosa sendo compreendido entre 0,5 e 3, a massa de volume reacional sendo mantida constante por extração de uma fração do respetivo volume reacional, a referida fase b) funcionando a uma taxa de diluição compreendida entre 0,001 e 0,008 h_1, em que o substrato de carbono indutor utilizado na fase b) é uma solução aquosa de hidrolisado hemicelulósico resultante de um pré-tratamento ácido de um substrato lignocelulósico em mistura com pelo menos um outro substrato de carbono escolhido entre açúcares indutores ou não indutores, em que o débito de alimentação do referido substrato de carbono indutor é compreendido entre 35 e 140 mg de substrato de carbono indutor por grama em peso seco de estirpe e por hora.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida estirpe é uma estirpe de Trichoderma reesei modificada por mutação, seleção ou recombinação genética.
3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em que o substrato de carbono de crescimento utilizado na referida fase de crescimento escolhe a glicose, a lactose, a xilose, os resíduos obtidos após fermentação etanólica dos açúcares de monómeros dos hidrolisados enzimáticos de substrato lignocelulósicos e os extratos da fração hemicelulósica na forma de monómeros provenientes de substrato lignocelulósico pré-tratado, usado sozinho ou em mistura.
4. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 3, em que o pré-tratamento ácido é uma hidrólise ácida, uma cozedura ácida ou uma explosão de vapor com impregnação prévia do referido substrato lignocelulósico com uma solução aquosa de ácido sulfúrico.
5. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4, em que a duração da fase b) contínua de produção de celulases é pelo menos superior a 300 h.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a duração da fase b) continua de produção de celulases é pelo menos superior a 400 h.
7. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 6, em que o débito de alimentação é gradualmente aumentado na fase b).
8. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7, em que a referida fase b) funciona a uma taxa de diluição compreendida entre 0,002 e 0,008 h-1.
9. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 8, em que uma fase opcional a') de crescimento e de produção efetuada num reator de alimentação continua com pelo menos um substrato de carbono indutor, durante a qual nenhuma extração do conteúdo do fermentador é efetuada, é implementada entre a fase a) e a fase b).
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o referido substrato de carbono indutor usado na fase a' ) é idêntico ao substrato de carbono indutor usado na fase b) de produção.
11. Processo de acordo com uma das reivindicações 9 ou 10, em que a fase a') é implementada durante um período compreendido entre 50 e 150 h. Lisboa, 25 de setembro de 2017