PT2968471T - Peptídeos para uso no tratamento tópico de doenças neurodegenerativas da retina, em particular em fases precoces da retinopatia diabética e outras doenças da retina em que a neurodegeneração desempenha um papel essencial - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PEPTÍDEOS PARA USO NO TRATAMENTO TÓPICO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS DA RETINA, EM PARTICULAR EM FASES PRECOCES DA RETINOPATIA DIABÉTICA E OUTRAS DOENÇAS DA RETINA EM QUE A NEURODEGENERAÇÃO DESEMPENHA UM PAPEL

ESSENCIAL

[0001] A presente invenção refere-se ao campo das abordagens médicas para doenças oculares que pode levar a cegueira parcial ou total. A invenção provê ferramentas úteis para serem aplicadas topicamente nos olhos, incluindo peptideos e análogos desses peptideos.

Antecedentes [0002] As doenças neurodegenerativas da retina referem-se a condições da retina caracterizadas por perda neuronal progressiva. A retinopatia diabética, a degeneração macular relacionada com a idade, o glaucoma e a retinite pigmentosa são consideradas doenças da retina em que a neurodegeneração desempenha um papel essencial.

[0003] Uma análise aprofundada destas doenças, seus locais críticos, assim como de formas possíveis de protecção e formas que levam à recuperação podem ser extraídas de Schmidt et al., "Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for the Protection and Recovery", Current Neuropharmacology - 2008, Vol. No. 6, pp.: 164-178.

[0004] A retinopatia diabética (DR) é a complicação mais comum do diabetes e permanece a principal causa de cegueira entre indivíduos em idade de trabalhar em países desenvolvidos. Os tratamentos atuais para DR, tal como fotocoagulação a laser, injeções intravitreas de corticosteróides ou agentes anti-VEGF estão indicados em fases muito avançadas da doença e estão associados a efeitos adversos significativos.

[0005] A retinopatia diabética (RD) foi classicamente considerada como uma doença microcirculatória da retina. Contudo, há alguns dados que sugerem que a neurodegeneração da retina é um evento inicial na patogênese da DR que participa nas anormalidades microcirculatórias que ocorrem na DR, como pode ser deduzido de Simó et al. em nome do Consórcio Europeu para o Tratamento Precoce da Retinopatia Diabética (EUROCONDOR). "Neurodegeneration is an early event in diabetic retinopathy: therapeutic implications", Br. J. Ophthalmol. - 2012, vol. 96, pp.1285-1290.

[0006] No caso de DR a neurodegeneração (perda de neurónios eficazes) ocorre nas fases precoces da doença e produz anormalidades funcionais tal como a perda de ambas a discriminação cromática e sensibilidade ao contraste. Estas alterações podem ser detetadas por meio de estudos eletrofisiológicos em pacientes diabéticos mesmo com menos de dois anos da duração do diabetes, ou seja, antes que as lesões microvasculares possam ser detetadas sob exame oftalmológico. Além disso, um tempo implícito ERG (eletronicetinografia) multifocal retardado (mfERG-IT) prevê o desenvolvimento de anormalidades microvasculares precoces. Além disso, a degeneração neuroretinal inicia e/ou ativa várias vias metabólicas e sinalizadoras que participarão no processo micro-angiopático, assim como na disrupção da barreira hemato-retiniana (um elemento crucial na patogênese da DR).

[0007] As fases precoces das doenças neurodegenerativas da retina ou neurodegeneração associadas com estas patologias não são tratadas atualmente, embora evitem lesões avançadas, tal como problemas microcirculatórios levando a neovascularização da retina. Assim em fases precoces, em particular de DR, nenhum tratamento é aplicado e o acompanhamento padrão dos pacientes é conduzido.

[0008] Por outro lado, quando as fases precoces desta doença neurodegenerativa da retina, em particular DR, são os alvos terapêuticos, seria inconcebível recomendar um tratamento agressivo tal como fotocoagulação a laser ou injeções intravitreas. Até à data, o uso de colírios não foi considerado uma boa rota para a administração de fármacos dirigidos à prevenção ou à detenção de DR. Isto é porque é geralmente assumido que eles não alcançam o segmento posterior do olho (isto é, o vítreo e a retina) , como declarado em Urtti A et al., "Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery". Adv. Drug. Deliv. Rev. 2006, vol. 58, pp. 1131-1135. Embora exista uma pequena evidência de que os compostos administrados na córnea possam atingir a retina, representam casos isolados e correspondem a compostos de baixo peso molecular, tais como os referidos em Aiello et al., "Targeting Intraocular Neovascularization and Edema - One Drop at a Time", N. Eng. J Med - 2008, vol. 359, pp. 967-969. Aiello et al. mostra que em dois ensaios diferentes, um composto derivado de pirrolidina (denominado TG100572, 4-cloro-3-(5-metil-3-{[4-(2-pirrolidin-l-iletoxi)fenil]amino}-1,2,4-benzotriaz in-7-il)fenol)) com a capacidade de atuar como um inibidor de cinases envolvidas na geração neovascular e edema da retina, conseguiu atingir o alvo na retina uma vez administrado na forma de colírios. No entanto, este pequeno composto não pode ser comparado a compostos de outra natureza, tais como peptídeos ou proteínas com pesos moleculares elevados.

[0009] O diabetes é um grupo de doenças crónicas caracterizadas por hiperglicemia. Para prevenir complicações diabéticas é essencial reduzir a hiperglicemia usando agentes de redução sanguíneos de glicose. Portanto, qualquer fármaco de redução de glicose poderia ser teoricamente benéfico para prevenir ou deter complicações diabéticas, incluindo DR. No entanto, há uma falta de informação em relação a um efeito direto de agentes antidiabéticos em DR independentemente de sua ação em reduzir os níveis de glicose no sangue. Como forma de exemplo, os agonistas de peptídeo 1 semelhante a glucagon conhecidos como exenatida (Byeta, Amylin Pharmaceuticals) e liraglutida (Victoza, Novo Nordisk) são usados para tratar diabetes tipo 2 promovendo a redução dos níveis de glicose no sangue. Além disso, é conhecido que estes agonistas dão origem a uma melhoria nas doenças associadas da síndrome metabólica, tais como obesidade e hipertensão arterial. Também o documento do pedido de patente W02007062434 divulga uma composição farmacêutica para ser administrada por via intranasal, no qual o mesmo peptídeo semelhante a glucagon -1 (GLP-1) humano é administrado para tratamento da síndrome metabólica e complicações diabéticas, incluindo DR.

[0010] A partir do de acima, portanto, sabe-se que a administração de tais agonistas de peptídeo semelhante a glucagon -1 também melhora ou atenua os sintomas de DR, desde que a principal causa ou a origem da doença, em particular os níveis elevados de glicose no sangue, é melhorada na última instância. No entanto, estes tratamentos não são privados de efeitos adversos sistémicos. Se, além disso, estas substâncias têm que atingir a retina em concentrações terapêuticas, elevadas doses são necessárias aumentando assim os efeitos adversos.

[0011] Um estudo mostrando a neuroproteção mediada pela ativação de GLP-1 R num modelo in vivo é divulgado em Zhang et al., "Intravitreal injection of exendin-4 analogue protects retinal cells in early diabetic rats ", Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011, vol.52(l), pp.278-85. Os autores relataram que a administração intravitrea de exendina-4 (exenatida) impediu anormalidades de eletroretinografia (ERG) e caracteristicas morfológicas relacionadas com a neurodegeneração em ratos com diabetes induzida por estreptozotocina (STZ). No entanto, os resultados no estudo de Zhang et al. não podem ser facilmente extrapolados para DR humana (ou a outras doenças com neurodegeneração da retina). Em primeiro lugar, porque no modelo STZ-DM a interpretação dos resultados pode ser dificultada pelo efeito neurotóxico da STZ. Em segundo lugar, embora a expressão de GLP-1 R tenha sido encontrada em retinas de ratos não foi relatada anteriormente em retinas humanas. Finalmente, e como mencionado acima, as injeções intravitreas são inapropriadamente invasivas em pacientes com muito poucas se algumas anormalidades microvasculares no exame fundoscópico.

[0012] Atualmente, não existem tratamentos específicos para doenças neurodegenerativas da retina. No caso particular de DR, isso significa que não existem tratamentos específicos para a retinopatia de fundo ou DR não proliferativo, assim como para a proteção da neuroretina dos danos (levando à perda de neurônios). Portanto, novos tratamentos farmacológicos para as fases precoces da doença, quando a neurodegeneração parece estar a começar são necessários. 0 tratamento precoce da DR será eficaz na redução da progressão para fases avançadas que necessitem de terapias agressivas tais como a intervenção cirúrgica.

Sumário da invenção [0013] Os inventores descobriram que alguns peptídeos, todos tendo em comum uma sequência especifica na região N-terminal, assim como composições compreendendo os referidos peptídeos, quando aplicados topicamente no olho (isto é, na córnea ou fórnix conjuntival) foram capazes de alcançar a retina, apesar do seu alto peso molecular e também foram capazes de proteger e prevenir a retina da degeneração. Estes compostos atuaram como neuroprotetores tópicos da retina (em particular a neuroretina, que é a parte da retina, incluindo os neurônios mas sem o epitélio do pigmento da retina).

[0014] Deve ser enfatizado que a administração tópica de peptídeos para uso de acordo com a invenção, não só alcança a retina, mas também atinge concentrações efetivas para derrogar a evolução da retinopatia diabética.

[0015] Assim, num primeiro aspeto a invenção refere-se a peptídeos com um comprimento de sequência de 13 a 50 aminoácidos, a região N-terminal dos referidos peptídeos consistindo na sequência: HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4 (SEQ ID NO: 1) em que:

Xaa1 é um aminoácido selecionado de alanina e glicina;

Xaa2 é um aminoácido selecionado de valina e leucina;

Xaa3 é um aminoácido selecionado de serina e lisina;

Xaa4 é um aminoácido selecionado de tirosina e glutamina; e

Histidina é o resíduo N-terminal; para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina.

[0016] O tratamento e/ou prevenção tópico é um tratamento e/ou prevenção tópico ocular, assim na superfície do olho (isto é, na córnea ou fórnix conjuntival), devido ao facto que os peptídeos podem alcançar a retina quando aplicado topicamente aos olhos. Isto aplica-se a qualquer uma das formas de realização e combinação de formas de realização divulgadas na presente invenção.

[0017] Os inventores descobriram surpreendentemente que o recetor do peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1 Rc) estava presente na retina humana, e contrariamente a todas as suposições prévias, conseguiram demonstrar que substâncias de natureza peptídica com um peso molecular variando de 3,35 kDa a 4,18 kDa poderiam alcançar a retina quando aplicado topicamente aos olhos (isto é, na córnea). Assim, os inventores propõem o uso tópico (uso tópico ocular) de peptídeos compreendendo de 30 a 40 aminoácidos e incluindo SEQ ID NO: 1, cuja sequência é considerada responsável pela ativação do GLP-1 Rc, e também está presente no mamífero GLP-1.

[0018] Considerando o estado da técnica, foi inesperado que moléculas com um peso molecular superior a 1 kDa fossem capazes de alcançar a retina uma vez administradas topicamente na superfície da córnea.

[0019] GLP-1 (peptídeo-1 semelhante a glucagon) é um peptídeo insulinotrópico endógeno que é segregado a partir das células L do trato gastrointestinal em resposta aos alimentos ("resposta incretina"). GLP-1 por atuação através do seu receptor (GLP-1 Rc) , tem efeitos potentes sobre a secreção de insulina dependente da glicose, a expressão do gene da insulina, a neogênese da célula beta do ilhéu, a motilidade gastrointestinal, a homeostase energética e ingestão alimentar. O recetor GLP-1 (GLP-1 Rc) é um membro do classe de ligação peptídeo hormona BI (recetores semelhantes a secretinas) família de recetores acoplados a proteína-G (GPCRs) heterotriméricos que abrange sete transmembranas, . GLP-1 Rs têm uma ampla distribuição e sao encontrados no pâncreas, tecido adiposo, músculo, coração, trato gastrointestinal e fígado. Além disso, GLP-1 Rs são encontrados em todo o sistema nervoso central (isto é, hipotálamo, estriado, tronco cerebral, substância nicra e zona subventricular) , e há algumas evidências que a estimulação GLP-1 R pelo GLP-1 exerce efeitos neuroprotetores em ambos os sistemas nervoso central e periférico.

[0020] O GLP-1 humano é um peptídeo de 37 resíduos de aminoácidos originado a partir de preproglucagon que é sintetizado i.a. nas células L no íleo distal, no pâncreas e no cérebro. 0 preproglucagon humano é identificado com a base de dados UniProt Número de Acessos P01275, 6 de fevereiro de 2007; Versão 3. O processamento de preproglucagon para originar amida GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-37) e GLP-2 ocorre principalmente nas células L. Um sistema simples é usado para descrever fragmentos e análogos deste peptideo. Assim, por exemplo, Gly8-GLP-1(7-37) designa um fragmento (análogo) de GLP-1 formalmente derivado de GLP-1 por exclusão dos resíduos de aminoácidos Nos 1 a 6 e substituindo o resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente na posição 8 (Ala) por Gly. Similarmente, Lys34 (N£-tetradecanoil)-GLP-1 (7-37) designa GLP-1 (7-37) em que o grupo ε-amino do resíduo Lys na posição 34 foi tetradecanoilado.

[0021] Assim, contrariamente a todos os preconceitos, os inventores resolveram uma necessidade há muito sentida no campo da oftalmologia fornecendo peptídeos que, por meio de administração tópica ou como ingredientes de composições tópicas (assim, o composições tópicas oculares)) podem atingir a retina e exercer nela um efeito de neuroproteção. Além disso, a administração tópica destes peptídeos limita as suas ações ao olho e minimiza os efeitos adversos sistémicos associados.

[0022] Este aspeto da invenção também pode ser formulado como o uso de um peptideo com um comprimento de sequência de 13 a 50 aminoácidos e compreendendo na região N-terminal do referido peptideo a sequência de aminoácidos consistindo em HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4 (SEQ ID NO: 1) como definido acima para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina (o que significa tratamento tópico ocular e/ou prevenção), em particular para o tratamento e/ou prevenção da retina em fases precoces de doenças neurodegenerativas da retina, em fases precoces particulares de DR, devido ao efeito neuroprotetor dos peptideos. A presente invenção também se refere a um método para o tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, em particular para neuroproteção em fases precoces das doenças neurodegenerativas da retina, em particular fases precoces da DR, compreendendo a administração (significando a administração tópica no olho) quantidades terapeuticamente eficazes de um peptideo com um comprimento de sequência de 13 a 50 aminoácidos e compreendendo na região N-terminal do referido peptideo a sequência de aminoácidos consistindo em HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4 (SEQ ID NO: 1) como definido acima, em conjunto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis e/ou transportadores, num assunto de sua necessidade, incluindo um humano.

Breve descrição das figuras [0023] FIG. 1 representa uma visão esquemática da progressão da particular doença neurodegenerativa da retina, retinopatia diabética (DR) (fases precoces e fases tardias) e das abordagens terapêuticas empregadas em cada um das fases de acordo com o estado da técnica. A seta horizontal representa o tempo (em unidades arbitrárias), ao longo do qual os niveis aumentados de glicose no sangue são detetáveis (diabetes ou niveis elevados de glicose no sangue). "Nenhum DR" significa inspeção ocular normal (sem microaneurismas, micro-hemorragias ou exsudatos); "NPDR" significa retinopatia diabética não proliferativa; "DMO" significa edema macular diabético; "CapOc" significa Oclusão capilar, "PDR" significa retinopatia diabética proliferativa; "PHC" significa fotocoagulação; "IVTR" significa injeção intravítrea; e "VTR" significa vitrectomia. 0 termo neovasos refere-se aos novos vasos vasculares formados. FIG. 2 apresenta a expressão do recetor GLP-1 em amostras de tecido humano. 0 painel A é um diagrama de barras no qual a quantidade relativa de mRNA do recetor GLP-1 foi analisada por PCR quantitativo em tempo real. No painel B uma imagem do microscópio ótico (20x) de uma seção de uma neuroretina humana expõe claramente (referenciada com a seta em negrito) a presença do recetor nos segmentos fotorrecetores (PR) . "ONL" significa camada nuclear externa; "INL" significa camada nuclear interna; e "GCL" significa camada de células ganglionares, sendo todas partes constitutivas da neuroretina. FIG. 3 relacionada com retinopatia diabética (DD), é uma imagem microscópica (microscópio Olympus) de secções da retina (slides) , em que a presença de proteína ácida fibrilar Glial (GFAP) é avaliada como um indicador de ativação glial. Mostra uma comparação da imunorreatividade do GFAP (seta) na retina entre amostras representativas de um rato diabético tratado com um análogo GLP-1 (7-37), que é um agonista GLP-1 R (painel esquerdo, Teste, T) e um rato diabético tratado com o transportador (painel direito, Controlo, C) . Os núcleos foram rotulados com DAPI. ONL: camada nuclear externa; INL: camada nuclear interna; GCL: camada de células ganglionares. FIG. 4 também relacionada com retinopatia diabética (DR) , é um diagrama de barras apresentando os resultados de um ensaio TUNEL. Painel A apresenta a percentagem de células positivas TUNEL(%) na camada de células ganglionares (GCL) em ratos diabéticos tratados com um análogo GLP-1 (7-37), que é um agonista de GLP-1 R (Teste, T, n=10) e ratos diabéticos tratados com transportador (Controlo, C, n=10). 0 painel B mostra a imunofluorescência positiva de TUNEL em toda a neuroretina a partir de ratos diabéticos tratados com agonista de GLP-1 R (T) e ratos diabéticos tratados com veiculo (Controlo, C) . A.U.: unidades arbitrárias. Os resultados são a média de±SD. *p<0,05. FIG. 5 também relacionada com retinopatia diabética (DR), é um diagrama de barras apresentando os resultados da imunofluorescência de glutamato (Painel A) e imunofluorescência GLAST (Painel B) em toda a neuroretina a partir de ratos diabéticos tratados com agonista de GLP-1 R (T) e ratos diabéticos tratados com transportador (Controle, C) . A.U.: unidades arbitrárias. Os resultados são a média de ± SD. * p <0,05.

Descrição detalhada da invenção [0024] Por razões de compreensão, as seguintes definições estão incluídas.

[0025] No sentido da invenção, o termo "neuroproteção" significa qualquer tipo de tratamento ou método profilático que pode ser usado de forma que os neurônios constituindo a neuroretina permaneçam preservados e num estado fisiológico correspondendo a um de um sujeito animal saudável (incluindo seres humanos). A "neuroretina" é a parte da retina, incluindo os neurônios e sem o epitélio de pigmento da retina. A neuroretina é a responsável pelo ciclo visual.

[0026] A expressão "neuroprotecção nas fases precoces da retinopatia diabética" refere-se a qualquer tratamento ou método profilático realizado antes das fases avançadas de DR (DR pré-proliferativa ou proliferativa) estarem estabelecidas.

[0027] Para "fases precoces da retinopatia diabética" deve ser entendido como o tempo em que, devido à presença de diabetes, anormalidades funcionais podem ser detetadas no olho (isto é, discriminação cromática, sensibilidade ao contraste e anormalidades de eletrorretinografia), mas o padrão de alterações microvasculares de DR ainda não foi totalmente estabelecido, isto é, não podem ser observadas as lesões típicas da DR pré-proliferativa ou proliferativa.

[0028] A " (GLP-1 (7-36)amida) da amida do peptídeo (7-36) semelhante ao glucagon -1 humano)" e "(GLP-1 (7-37)) peptídeo-1 (7-37) semelhante ao glucagon humano" referem-se aos fragmentos derivados de proglucagon humano e compreendendo do aminoácido 7 ao 3 6 ou do aminoácido 7 ao 37, respetivamente, da sequência de aminoácidos do referido proglucagon humano.

[0029] Como "análogo de GLP-1 (7-37) humano" deve ser entendido um peptídeo em que um ou mais resíduos de aminoácidos do GLP-1 (7-37) foram substituídos por outro resíduo de aminoácido e/ou em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos do GLP-1 (7-37) foram eliminados e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram adicionados ao GLP-1 (7-37).

[0030] A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" tal como aqui usada, refere-se à quantidade de um composto que, quando administrado, é suficiente para prevenir o desenvolvimento de, ou aliviar em certa medida, um ou mais dos sintomas da doença que é abordada. A dose particular do composto administrado de acordo com esta invenção será com certeza determinada pelas circunstâncias particulares envolvendo o caso, incluindo o composto administrado, a via de administração, a condição particular a ser tratada, e as considerações semelhantes.

[0031] O termo "farmaceuticamente aceitável" tal como aqui usado refere-se a compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do âmbito de uma avaliação médica sensata, adequadas para uso em contato com os tecidos de um sujeito (por exemplo, humano) sem toxicidade significativa, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional com um rácio benefício/risco razoável. Cada transportador, excipiente, etc., também deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição farmacêutica. Também tem de ser adequado para uso em contato com tecido ou órgão de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, imunogenicidade ou outros problemas ou complicações proporcionais com um rácio beneficio/risco razoável. Transportadores adequados, excipientes, etc. podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão, e incluem, como forma de exemplo conservantes, aglutinantes, humectantes, emolientes, e antioxidantes.

[0032] A "região N-terminal" ou "o N-terminal" (também conhecido como amino-terminal, NH2-terminal, extremidade N-terminal ou amina-terminal, todos eles usados como expressões intercambiáveis) refere-se ao inicio de uma proteína ou polipeptídeo terminado por um aminoácido com um grupo amina livre (-NH2) · A convenção para escrever sequências de peptídeos é colocar o N-terminal na esquerda e escrever a sequência de N- para C-terminal. Quando a proteína é traduzida do ARN mensageiro, é criado de N-terminal para C-terminal.

[0033] Por "resíduo N-terminal" é para ser entendido o resíduo num peptídeo que tem um grupo amino que é livre, ou pelo menos não acilado por outro resíduo de aminoácido (pode, por exemplo, ser acilado ou formilado), é denominado de N-terminal; está no N-terminal. O resíduo que tem um grupo carboxilo livre, ou pelo menos não acila outro resíduo aminoácido, (pode, por exemplo, acilar amónia para originar -NH-CHR-CO-NH2) , é chamado de C-terminal.

[0034] Como exposto acima, os inventores propõem pela primeira vez uma abordagem terapêutica para as doenças neurodegenerativas da retina (doenças da retina em que a neurodegeneração desempenha um papel essencial) que, além de ser não-agressivo, é útil no tratamento das fases precoces destas doenças, e em particular no tratamento das fases precoces da DR.

[0035] Numa forma de realização particular, o peptídeo para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de acordo com a invenção tem um comprimento de sequência de 30 a 50 aminoácidos.

[0036] Outra forma de realização particular é um peptídeo com um comprimento de sequência de 30 a 40 aminoácidos, a região do N-terminal do referido peptídeo consistindo na sequência: HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4 (SEQ ID NO: 1) em que:

Xaa1 é um aminoácido selecionado de alanina e glicina;

Xaa2 é um aminoácido selecionado de valina e leucina;

Xaa3 é um aminoácido selecionado de serina e lisina;

Xaa4 é um aminoácido selecionado de tirosina e glutamina; e histidina é o resíduo N-terminal; para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa da retina.

[0037] Ainda noutra forma de realização particular, o peptídeo tem uma sequência com um comprimento de 13 a 40 aminoácidos.

[0038] Isto significa que qualquer um dos peptídeos com qualquer comprimento de sequência especificado pode ser usado no fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina (o que significa tratamento tópico ocular e/ou prevenção), em particular para o tratamento e/ou prevenção da retina nas fases precoces de doenças neurodegenerativas da retina, em particular fases precoces da DR. Assim, a invenção também se refere em formas de realização particulares a métodos para o tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, em particular para a neuroproteção nas fases precoces das doenças neurodegenerativas da retina, em particular fases precoces da DR, compreendendo administrar (significando a administração tópica no olho) quantidades terapeuticamente eficazes de um peptídeo com qualquer dos comprimentos de sequência especificados acima.

[0039] Em particular, o peptideo para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de acordo com a invenção, que significa para uso no tratamento tópico do olho e/ou prevenção, é para o tratamento e/ou prevenção de doença neurodegenerativa da retina selecionada do grupo consistindo de DR, degeneração macular relacionada com a idade, glaucoma e retinite pigmentosa.

[0040] Em uma forma de realização preferida, o peptideo para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de acordo com a invenção, é para o tratamento e/ou prevenção de DR.

[0041] Além disso, noutra forma de realização preferida, o peptideo para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de acordo com a invenção, é para o tratamento e/ou prevenção das fases precoces da DR.

[0042] Em particular, nestes fases precoces quando DR ainda não está estabelecida, os peptídeos da invenção aplicados topicamente atuam como agentes neuroprotetores da neuroretina, exercendo assim um efeito de neuroproteção. Isso significa que os neurônios são preservados contra danos e perda de função, e são mantidos num estado fisiológico saudável. 0 mesmo raciocínio aplica-se com outras doenças neurodegenerativas da retina. De facto, os peptídeos podem ser usados devido às suas propriedades neuroprotetoras.

[0043] Uma representação esquemática do desenvolvimento da retinopatia diabética pode ser vista na FIG. 1. Resumidamente, as vias metabólicas desencadeadas por hiperglicemia e a própria hiperglicemia, levam à DR mas um período de pelo menos cinco anos é necessário antes da DR possa ser diagnosticada sob exame oftalmoscópico. A primeira fase que pode ser vista é retinopatia de fundo ou retinopatia diabética não-proliferativa (NPDR) (que é constituída por microaneurismas, micro-hemorragias e exsudatos rígidos). Nesta fase não há tratamento específico mas o acompanhamento padrão do sujeito diabético. A partir desta fase a história natural da doença pode seguir duas direções que não excluem a outra. Uma delas é o desenvolvimento de edema macular diabético clinicamente significativo (DMO) em que o elemento patogênico mais importante é a quebra da barreira hemato-retiniana (BRB). Esta forma é mais frequente nos pacientes diabéticos do tipo 2. A outra direção é para a retinopatia diabética proliferativa (PDR), que é mais frequente no diabetes do tipo 1. Nesta última, a configuração da oclusão capilar desempenha um papel essencial gerando um desequilíbrio entre fatores angiogénicos e antiangiogénicos, que finalmente estimula a neovascularização (a marca registrada da PDR). No entanto, mesmo antes do NPDR poder ser detetado no exame oftalmológico, a neurodegeneração da retina existe. Como indicado na FIG. 1, tratamentos agressivos são realizados quando DMO e PDR estão estabelecidos. Os referidos tratamentos incluem fotocoagulação (PGC), injeções intravitreas de corticosteroides e/ou fatores de crescimento endotelial anti vascular (IVTR), e vitrectomia (VTR).

[0044] Com os peptideos para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de DR de acordo com a invenção, alguns destes tratamentos agressivos podem ser evitados se nas fases precoces da doença, quando anormalidades funcionais podem ser detetadas (isto é, discriminação cromática, sensibilidade ao contraste e anormalidades de eletrorretinografia), o sujeito recebe compostos ajudando a neuroproteção da retina. Para que, se a retina está protegida das consequências de niveis crónicos de glucose no sangue, complicações maiores podem ser minimizadas, ou mesmo nunca aparecerem com a melhoria real da qualidade de vida dos pacientes diabéticos. A administração tópica para o olho dos peptideos representa uma vantagem real, evitando tratamentos agressivos adicionais.

[0045] Numa forma de realização, o peptideo para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, em particular de DR, tem um comprimento de sequência selecionado do grupo consistindo em 31, 32, 33, 34, 37, 36, 37, 38 e 39 aminoácidos. Noutra forma de realização o comprimento da sequência é selecionado de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 37, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 42, 44, 45, 46, 47, 48 e 49 aminoácidos.

[0046] Numa forma de realização da invenção, os peptídeos para uso no tratamento tópico (ocular) e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, são aqueles compreendendo na extremidade N-terminal a sequência de aminoácidos consistindo em SEQ ID NO: 1 em que Xaa1 é alanina, Xaa2 é valina, Xaa3 é serina e Xaa4 é tirosina. Ou seja, eles compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 (HAEGTFTSDVSSY). Estes peptídeos são, em particular, para o tratamento tópico e /ou prevenção de DR, que é para tratamento tópico de olho e/ou prevenção de DR.

[0047] Noutra forma de realização o peptídeo para uso de acordo com a invenção é um peptídeo-1 semelhante a glucagon de mamífero. Este peptídeo inclui na sua extremidade N-terminal (região N-terminal) a sequência identificada como SEQ ID NO: 5, que é mantida na maioria dos mamíferos, tais como seres humanos, porcos e macacos. Além disso, esta é a sequência que é principalmente reconhecida pelo GLP-1 Rc.

[0048] Assim, numa forma de realização preferida, o peptídeo para uso no tratamento tópico (ocular) e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina (isto é, DR) consiste no peptídeo-1 semelhante a glucagon humano da sequência de aminoácidos SEQ ID NO:2, correspondendo a HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG, e variações deste peptídeo humano. As variações referem-se a mutações entre indivíduos, enquanto estas mutações não afetam a interação com o GLP-1 Rc, e não privam o peptídeo de atuar através deste recetor (em particular como agonista ou ativador da subsequente via de sinalização levando à neuroprotecção ou à redução dos níveis de glicose no sangue). Por "mutações" deve ser entendido qualquer eliminação de um ou dois aminoácidos, e uma substituição ou adição de um aminoácido conservador.

[0049] Noutra forma de realização, o peptídeo para uso de acordo com a invenção é um com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (ΗAEGT FT S DVS SYLEGQAAKE FIAWLVRGRG), em que a lisina (K) compreende o substituinte lipofílico Νε-(γ-glutamil (N^-hexadecanoílo)) ligado por uma ligação amida ao grupo amino da cadeia lateral de lisina. Isto é, o peptídeo consiste na SEQ ID NO: 3.

[0050] SEQ ID NO: 3 corresponde ao princípio ativo conhecido como liraglutida (também denominado Arg34Lys26 (Νε-(γ-glutamil (Na-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37)), que é considerado um análogo do GLP-1 (7-37) daqueles que compreendem um substituinte lipofílico em pelo menos um aminoácido, o referido substituinte lipofílico sendo um grupo acilo de cadeia linear ou alcano ramificado ácido a,ω-dicarboxílico. Os grupos acilo preferidos nestes análogos de GLP-1 (7-37) são selecionados do grupo compreendendo HOOC (CH2) mCO-, em que m é de 4 a 38, preferencialmente de 4 a 24, o mais preferido sendo selecionado do grupo compreendendo HOOC(CH2) 14CO-, HOOC (CH2) leCO-, HOOC (CH2) isCO-, HOOC (CH2) 20CO- e HOOC (CH2) 22CO- [0051] Assim, a presente invenção também engloba glucagon mamífero semelhante a peptídeo-1 (7-37) ou seus análogos para uso no tratamento tópico (ocular) de doenças neurodegenerativas da retina, em particular de DR, em que o análogo de peptídeo-1 semelhante a glucagon (7-37) é um peptídeo que compreende pelo menos uma das seguintes modificações: a) uma eliminação de pelo menos um resíduo de aminoácido do peptídeo-1 semelhante a glucagon (7-37); b) pelo menos a substituição de um resíduo de aminoácido do peptídeo-1 semelhante a glucagon (7-37) por outro resíduo aminoácido; e c) a adição de pelo menos um resíduo de aminoácido na extremidade C-terminal do peptídeo-1 semelhante a glucagon (7-37), entretanto incluem na região N-terminal a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1. Os referidos análogos são, em adição agonistas de peptídeos de adição do receptor de peptídeo-1 semelhante a glucagon humano, sendo capaz de estimular a formação de AMPc quando testado na frente do recetor.

[0052] Em particular, o peptídeo-1 semelhante a glucagon (7-37) mamífero ou seus análogos são utilizáveis no tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, em particular de DR, numa fase precoce da doença. Os peptídeos, quando aplicados topicamente no olho, atuam como agentes neuroprotetores nas fases precoces (evitando a neurodegeneração no caso de tratamento preventivo).

[0053] Exemplos de análogos de GLP-1 (7-37) também para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, em particular de DR, incluem uma parte de liraglutida, Lys26 (Νε-(tetradecanoil)-GLP-1 (7-37); Lys34 (Νε-(tetradecanoil)-GLP-1 (7-37); Lys26- 34bis (Νε-(tetradecanoil) -GLP-1 (7-37); Lys26 (Νε- (tetradecanoil) Arg34-GLP-1 (7 — 37) ; Gly8Arg26'34Lys35 (Νε- (tetradecanoil) -GLP-1 (7-37) ;

Arg26'34Lys36Ne-(tetradecanoil)-GLP-1 (7-37); Lys26'34bis (Νε-(ω-carboxinonadecanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg34Lys26 (Νε- (ω- carboxinonadecanoil) ) -GLP-1 (7-37); Arg34Lys26 (Νε-(ω- carboxi-heptadecanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg26'34Lys36Ne-(ω-carboxi-heptadecanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg26'34Lys36 (Νε- (ω-carboxiundecanoil) )-GLP-1 (7-37); Lys26'34bis (Νε-(ω- carboxiundecanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg34Lys26 (Νε- (ω- carboxiundecanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg34Lys26 (Νε- (ω-carboxi-heptanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg26'34Lys36 (Νε- (co-carboxi- heptanoil) )-GLP-1 (7-37); Lys26'34bis (Νε- (ω-carboxi- heptanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg34Lys26 (Νε- (ω- carboxipentadecanoil) )-GLP-1 (7-37); Arg34Lys26 (Νε- litocolil)-GLP-1 (7-37); Lys26'34bis (Ne-co-carboxi- tridecanoil) )-GLP-1 (7-37); Lys26'34bis (Νε- (γ-glutamil (Να-tetradecanoil) )-GLP-1 (7-37); Lys26'34bis (Νε- (γ-glutamil (Να-hexadecanoil) ) )-GLP-1 (7-37);; Arg34Lys26 (Νε- (γ-glutamil (Να-tetradecanoil)))-GLP-1 (7-37).

[0054] Todos estes análogos estão amplamente divulgados no documento de patente EP0944648 (Novo Nordisk) , em que exemplos da sua síntese também estão incluídos. A maioria é obtida por tecnologia recombinante realizada em microorganismos, assim como por síntese química.

[0055] Noutra forma de realização, os peptídeos para uso no tratamento tópico (ocular) e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, são aqueles compreendendo na região N-terminal a sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 1 em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é leucina, Xaa3 é lisina e Xaa4 é glutamina. Os peptídeos são, em particular, para o tratamento tópico e/ou prevenção de DR.

[0056] Noutra forma de realização o peptídeo para uso no tratamento e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa da retina, em particular DR, consiste em, ou é aquela com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4 (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPXaa5) , em que Xaa5 é um resíduo de serina no qual o terminal -COOH foi substituído por um qrupo -NH2. Esta SEQ ID NO: 4 corresponde ao princípio ativo conhecido como exenatida (Amylin Pharmaceuticals) . 0 composto pode ser obtido por síntese química sólida ou usando a tecnoloqia de DNA recombinante em microorganismos, como exposto no documento de patente US5424286.

[0057] Noutra forma de realização o peptídeo para uso no tratamento e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa da retina, em particular DR, consiste em, ou é aquela com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKXaa6) , em que Xaa6 é um resíduo de lisina em que o terminal -COOH foi substituído por um grupo -NH2. Esta SEQ ID NO: 8 corresponde ao princípio ativo conhecido como lixisenatida (Sanofi-Aventis). O composto pode ser obtido por síntese química sólida (metodologia de fase sólida de Merifield). O produto é amplamente divulgado no documento de patente US6528486.

[0058] Todos estes peptídeos da invenção com um comprimento de 13 a 50 aminoácidos, particularmente de 30 a 50, ou de 30 a 40 e compreendendo na extremidade N-terminal (região N-terminal) a sequência de aminoácidos consistindo em SEQ ID NO:l, assim como qualquer peptídeo definido como análogo do GLP-1 (7-37), são agonistas do GLP-1 Rc. De facto é considerado que esta SEQ ID NO: 1 é pelo menos parte da sequência de aminoácidos que interage com o GLP-1 Rc. Como exemplificado abaixo, todos podem ser usados topicamente no tratamento e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa da retina, em particular de DR.

[0059] Assim, numa forma de realização particular, os peptideos para uso de acordo com a invenção são agonistas do GLP-1 Rc.

[0060] A determinação da atividade agonista para um peptideo particular pode ser testada por meio de um ensaio em que a estimulação da formação de AMPc numa linha celular que está expressando o clonado Rc GLP-1 humano. Um exemplo de tal ensaio é derivável do documento de patente EP0944648 (Novo Nordisk).

[0061] Resumidamente, a EC50 de um peptideo particular é calculada a partir de uma curva dose-resposta determinada usando células de rim de hamster bébé (BHK) que expressam o GLP-1 Rc humano pancreático. As membranas plasmáticas das células são preparadas por homogeneização em tampão (10 mmol/1 de Tris-HCl e 30 mmol/1 de NaCl pH 7,4, contendo, além disso, 1 mmol/1 de ditiotreitol, 5 mg/1 de leupeptina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 5 mg/1 de pepstatina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 100 mg/1 de bacitracina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e 16 mg/1 de aprotinina (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca)). O homogeneizado é então centrifugado no topo de uma camada de 41% p/v de sacarose. A banda branca entre as duas camadas é diluída em tampão e centrifugada. O ensaio pode ser realizado em placas de microtitulação de 96 poços num volume total de 140 μΐ. O tampão usado pode ser de 50 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,4 com a adição de 1 mmol/1 de EGTA, 1,5 mmol/1 de MgSCN 1,7 mmol/1 de ATP, 20 mM de GTP, 2 mmol/1 de 3-isobutil-l-metilxantina, 0,01% de Tween-20 e 0,1% de albumina de soro humano (Reinst, Behringwerke AG, Marburg, Alemanha). Os compostos a serem testados para atividade agonista são dissolvidos e diluídos em tampão, adicionados à preparação da membrana e a mistura é incubada durante 2h a 37°C. A reação é interrompida pela adição de 25 μΐ de 0,05 mol/1 HC1. As amostras são diluídas 10 vezes antes da análise para cAMP por um ensaio de proximidade de cintilação (RPA 538, Amersham, Reino Unido).

[0062] Um peptídeo é então considerado um agonista se sob estas condições a EC50 (pM) é pelo menos a de GLP-1 (7-37), isto é de pelo menos 55 pM ou, preferencialmente, de pelo menos 60 pM.

[0063] A proteção da neurodegeneração da retina detetada através de vários exames oftalmológicos representa uma boa abordagem para tratar DR antes das anormalidades vasculares serem desenvolvidas. Nas fases precoces da DR a neurodegeneração existe (que pode ser detetado pela perda de ambos discriminação cromática e sensibilidade ao contraste, ativação glial e apoptose de células neurais). Os peptídeos para administração tópica (administração tópica para o olho) da invenção são úteis nestas fases precoces quando nenhum tratamento está indicado e apenas o acompanhamento é recomendado até fases mais avançadas de DR estarem estabelecidas (edema macular diabético clinicamente significativo e/ou retinopatia diabética proliferativa).

[0064] O tratamento nas fases precoces de DR tem a vantagem real que complicações adicionais são evitadas, nomeadamente microaneurismas, micro-hemorragias, exsudados duros, neovascularização, oclusão capilar e quebra da barreira hemato-retiniana (BRB).

[0065] Noutra forma de realização, o peptídeo para uso de acordo com a invenção, é um ingrediente (componente) de uma composição tópica farmacêutica, a referida composição compreendendo pelo menos um peptideo como descrito acima e quaisquer transportadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Assim, a invenção refere-se também a uma composição tópica farmacêutica para uso no tratamento tópico e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas da retina, em particular de retinopatia diabética, que compreende pelo menos o peptideo como definido acima. Particular e/ou excipientes referem-se a água, tampões salinos e misturas de água em óleo ou óleo em água. Os excipientes particulares são selecionados de conservantes, aglutinantes, humectantes, emolientes e antioxidantes.

[0066] As composições tópicas farmacêuticas preferidas são selecionadas do grupo que consiste em soluções (por exemplo colírios) , cremes, loções, unguentos, emulsões, aerossóis e pulverizações não-aerossóis, géis, pomadas e suspensões. Como exposto acima, as composições farmacêuticas tópicas são para serem entendidas como composições oculares tópicas.

[0067] Adicionalmente, as composições da presente invenção podem conter outros ingredientes, tais como fragrâncias, corantes e outros componentes conhecidos no estado da técnica para uso em formulações tópicas.

[0068] As composições tópicas da presente invenção podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica. Os excipientes e/ou transportadores apropriados, e as suas quantidades, podem ser facilmente determinados pelos especialistas na técnica de acordo com o tipo de formulação que está sendo preparado.

[0069] Numa forma de realização preferida, a composição tópica da invenção é uma solução na forma de gotas oculares, também denominada de solução de colírio. A administração dos peptídeos na forma de colírios implica a grande vantagem de ser fácil de ser usado pelo sujeito com necessidade disso, e não-desconfortável.

[0070] Os seguintes exemplos e desenhos são fornecidos a título ilustrativo, e não se destinam a ser limitativos da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1. O GLP-l-Rc é expresso em retinas humanas [0071] É conhecido que as principais características da neurodegeneração da retina (apoptose e ativação glial) já estão presentes nas retinas de dadores diabéticos sem anormalidades microcirculatórias nos exames oftalmoscópicos realizados durante o ano anterior à morte (Carrasco et al., "Lower Somatostatin Expression Is an Early Event in Diabetic Retinopathy and Is Associated With Retinal Neurodegeneration", Diabetes Care-2007, Vol. No. 30, pp.:2902-2908). Assim, um exame oftalmoscópico normal não exclui a possibilidade que a neurodegeneração da retina já está presente no olho diabético.

[0072] No presente estudo, os inventores queriam detetar se no receptor GLP-1 da retina humana (GLP-1 Rc) era expresso.

[0073] Oito olhos postmortem humanos foram obtidos de oito doadores diabéticos e oito não-diabéticos (idade: 66.9 ± 5,4 anos). O tempo decorrido da morte à enucleação olho foi inferior a 4 h. Após a enucleação, um olho de cada doador foi congelado a -80 °C e armazenado até ser ensaiado para mRNA. O outro olho foi fixado em paraformaldeido a 4% e incorporado em parafina para o estudo imuno-histoquimico.

[0074] Todos os tecidos oculares foram usados de acordo com as leis aplicáveis e com a Declaração de Helsínquia para pesquisa envolvendo tecido humano. Além disso este estudo foi aprovado pelo comité de ética do Hospital Vali d'Hebron (Barcelona, Espanha).

[0075] A neuroretina e epitélio de pigmento da retina (RPE) foram colhidos sob a dissecção microscópica de copos de olhos isolados de doadores. A neuroretina e RPE de cada olho foram moídas a pó em nitrogénio líquido usando uma argamassa. O tecido foi homogeneizado pela coluna de rotação QIAshredder (Quiagen, Hilden, Alemanha) e o mRNA foi extraído de tecido usando RNeasy Micro Kit (Quiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e a integridade de ARNm foi determinada pelo RNA nano Lab Chip Kit Bioanalyzer (Agilent, Paio Alto, CA, EUA) . Um yg de ARNm total foi transcrito de forma reversa usando Reagentes de Transcrição Reversa TaqMan® (Applied Biosystems, Roche, New Jersey, EUA) seguindo o protocolo do fabricante para a iniciação aleatória de hexanonucleótido. PCR quantitativo em tempo real (Q-RT-PCR) foi realizado usando um Sistema de Deteção de Sequência ABI Prism 7000 (Perkin-Elmer Applied Biosystems; Madrid, Espanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de GLP-1 Rc foram avaliados com os Ensaios TaqMan.

[0076] Para um ensaio de imunofluorescência, os olhos parafinizados foram cortados em série a 7 ym de espessura. As secções foram desparafinizadas com xileno e reidratadas em etanol. As secções foram então fixadas e colocadas na solução de recuperação de antígenos (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) durante 20 min a 95°C. As secções foram então incubadas durante 1 h com 1% de BSA em 0,3% de Triton X-100 em PBS para bloquear a ligação inespecífica dos anticorpos e depois incubada durante a noite a 4°C com um anticorpo primário específico para GLP-1 Rc humano (Abeam, Cambridge, Reino Unido). As secções foram lavadas antes de serem incubadas com Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 h. As lâminas foram cobertas com uma gota de meio de montagem contendo DAPI para visualização de núcleos celulares (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

[0077] Os resultados do ensaio PCR Quantitativo em tempo real (Q-RT-PCR) estão representados na FIG. 2A, em que a quantidade relativa do ARNm correspondendo ao recetor GLP-1 em vários tecidos humanos estão representados. Em particular os tecidos analisados foram amostras de epitélio de pigmento da retina de doadores de diabéticos (RPE DBT) , neuroretina de doadores diabéticos (NR DBT), epitélio de pigmento da retina de doadores não-diabéticos (RPE), neuroretina de doadores não diabéticos (NR). Como um ensaio comparativo, a expressão do recetor de GLP-1 em outros tecidos foi analisada, nomeadamente na linha celular de pâncreas humano (HP), intestino (BW), fígado (LV) e gordura

visceral (F). A beta-actina humana foi usada como controlo interno de Q-RT-PCR

[0078] Os dados na FIG. 2A demonstraram que a expressão de GLP-1 Rc ARNm poderia ser detetada na retina de ambos doadores diabéticos e não diabéticos (RPE/DBT; NR/DBT; RPE, NR) .

[0079] Os resultados do ensaio de imunofluorescência estão representados na FIG. 2B, no qual uma imagem de microscópio ótico 20X de uma das seções parafinizadas é apresentada. A seta em negrito refere-se à coloração verde, correspondendo assim ao recetor GLP-1. Núcleos da camada nuclear externa (ONL) estão apresentados por meio de uma seta tracejada. Esta FIG. 2B serve para provar novamente que o recetor GLP-1 também foi detetado na retina por imuno-histoquimica.

[0080] Exemplo 2. A administração tópica de um agonista de GLP-1 Rc previne a neurodegeneração da retina em ratos diabéticos.

Animais e tratamentos [0081] Um total de 20 ratos C57BL/KSJ-db/db obtidos de Harlan Laboratories, Inc. foi incluído. Dez C57BL/KsJ ratos não diabéticos serviram como grupo de controlo. Todas as experiências foram realizadas de acordo com o protocolo aprovado pelo Comité de Cuidados e Uso de Animais do Vali d'Hebron Institut de Recerca (VHIR, Barcelona - Espanha) e os princípios de CEE (86/609/CEE) e ARVO (Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia) . Os ratos foram alojados sob condições controladas de temperatura (20°C) e humidade (60%) com um ciclo de luz/escuridão de 12 horas e tinham acesso livre a comida e água.

[0082] Os ratos C57BL/KSJ-db/db representam um bom modelo para estudar as características neurodegenerativas observadas em pacientes com DR. Os ratos C57BL/KsJ-db/db carregam uma mutação no gene recetor de leptina e são um modelo para a indução de diabetes tipo 2 por obesidade. Eles desenvolvem hiperglicemia a partir de ~4-6 semanas de idade como resultado do consumo excessivo de alimentos.

[0083] Antes da análise dos efeitos de um agonista do recetor GLP-1, os inventores avaliaram a sequência cronológica de anormalidades da retina associadas à diabetes. Electrorretinografias e várias medidas de neurodegeneração incluindo morfometria da retina, ativação glial e avaliação da apoptose foram realizadas. Foi concluído que a espessura total da retina foi significativamente diminuída em ratos diabéticos em comparação com ratos não-diabéticos a 16 e 24 semanas. Além disso, um fenótipo diabético "reativo" caracterizado por hiperplasia e sobregulação da proteína ácida fibrilar Glial (indicação de ativação glial) foi observada em ratos diabéticos. Um aumento significativo no número das células ganglionares apoptóticas em ratos diabéticos em comparação com ratos não-diabéticos às 8, 16 e 24 semanas também foi observado. Assim, este modelo animal foi realmente um bom modelo para testar qualquer composto direcionado para tratar ou prevenir DR, e foi mesmo um modelo melhor do que o usado para estudar a neurodegeneração da retina em DR conhecido como diabetes induzido estreptozotocina (STZ-DM), em que os efeitos neurotóxicos da STZ podem prejudicar os resultados.

[0084] Um agonista de GLP-1 Rc, liraglutida, que é um análogo de GLP-1 (7-37) foi administrado na forma de colírios (Liraglutida, concentração: 6 mg/ml em solução de água destilada com cloreto de sódio a 0,9%) diretamente na superfície superior da córnea de cada olho usando uma seringa em ratos com 8 semanas de idade. Como controlo, o transportador (0,9% de cloreto de sódio em água) com colírios foi administrado. Dez ratos foram tratados com liraglutida e 10 ratos foram tratados com o transportador. O tratamento (liraglutida ou transportador) foi administrado uma vez por dia durante 14 dias. No dia 15, os olhos dos animais foram instilados com uma gota de liraglutida ou transportador aproximadamente uma hora antes da necropsia. Os ratos foram sacrificados por luxação cervical. Os olhos foram imediatamente enucleados e a neuroretina foi separada. A neuroretina de um dos olhos foi congelada em nitrogénio liquido e armazenada a -80 °C para avaliações de ARNm e proteína. 0 outro olho foi congelado rapidamente em Meio de Congelação de Tecido; TFM ™ (Ciências da Microscopia Eletrónica), por imersão em nitrogénio líquido e crioseccionado a 8 mm através do plano dorsal/ventral. As secções foram montadas em lâminas e armazenadas a -80 °C. Estas seções foram preparadas para a avaliação da morfologia da retina, avaliação da presença de GLP-1 Rc, presença de proteína ácida fibrilar Glial (GFAP) e a imunoreatividade de rotulação de endereços de Nick-End de transferência terminal Terminal TransferdUTP Nick-End Labeling (TUNEL) .

[0085] A avaliação da presença de GLP-1 Rc nas neuroretinas dos ratos foi realizada determinando a expressão de ARNm por PCR em tempo real, assim como por análise imuno-histoquímica e análise Western Blot da expressão de ARNm de GLP-1 Rc.

[0086] A expressão GLP-1 Rc foi analisada por PCR em tempo real. Os seguintes iniciadores foram usados: GGGTCTCTGGCTACATAAGGACAAC (dianteiro, SEQ ID NO: 6) e AAGGATGGCTGAAGCGATGAC (reverso, SEQ ID NO: 7).

Análise imuno-histoquímica [0087] O GLP-1 Rc foi avaliado por microscopia de fluorescência usando anticorpo específico contra GLP-1 Rc. As secções foram fixas em metanol ácido (-20 °C) durante 2 minutos, seguido de três lavagens em PBS, 5 min cada. As secções foram permeabilizadas com TBS-Triton X-100 0,1% e foram incubadas num bloqueador (10% de BSA e 10% de soro de cabra em PBS) durante 30 min à temperatura ambiente. As secções foram então incubadas com GLP-1 Rc (Abeam Ltd, Cambridge, Reino Unido) (diluição 1: 500 preparada em solução de bloqueio) durante a noite a 4 °C numa atmosfera húmida. Após três lavagens em PBS, 5 min cada, as secções foram incubadas com anticorpo secundário Alexa 594 cabra-anti-coelho (Invitrogen, Reino Unido) (diluição 1: 200 em solução de bloqueio preparada). As secções foram lavadas três vezes em PBS, contrastadas com Hoechst e montadas com o Meio de Montagem de Fluorescência (Prolong, Invitrogen) e montadas com uma lamela. As imagens foram gravadas com um microscópio Olympus usando configurações de brilho e contraste idênticas.

Análise Western Blot: [0088] As neuroretinas foram transferidas para um tampão de lise (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,1 mM; Triton, 1%; NaCl, 150 mM; NaF, 20 mM; Νβ3Ρ04, 2 mM) e inibidores de protease IX da Sigma (Sigma-Aldrich, Reino Unido) e depois homogeneizadas por seringa. Os homogeneizados foram incubados em gelo durante 30 minutos e foram centrifugados a 10000 rpm a 4 °C durante 15 minutos. A concentração de proteína do sobrenadante foi determinada usando o ensaio BCA (Pierce, Thermo Scientific USA). As amostras foram misturadas com carga de tampão 6x (Tris-HCl, 1 M, pH, 6,8; dodecil sulfato de sódio (SDS), 20%; 10% de Glicerol; Mercaptoetanol; e 0,01 g de azul de bromofenol) e fervido por dez minutos. As amostras de proteínas foram resolvidas por 10% de SDS-PAGE. Após a separação eletroforética, as proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (Bio-Rad Laboratories, Reino Unido). As membranas foram bloqueadas 1 hora à temperatura ambiente em 5% de leite em pó não gordo, 0,1% de Tween em solução salina tamponada com Tris (TBS), e depois incubada com o anticorpo primário contra GLP-1R (diluição 1: 1000, Abeam Ltd, Cambridge, Reino Unido) durante a noite a 4 °C. As membranas foram lavadas extensivamente com TBS-T (Tween 0,1%) e incubadas com anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano por uma hora à temperatura ambiente (diluição 1:5000, Dako, Dinamarca). As bandas foram visualizadas usando sistema de deteção de chemioluminiscência (Millipore, EUA) . A expressão protéica relativa foi quantificada usando ImageJ.

Medidas de neurodegeneração: [0089] Para determinar a análise imuno-histoquímica de neurodegeneração para avaliação de ativação glial, assim como imuno-histoquímica análises para avaliação da apoptose foram realizadas. Além disso, o metabolismo do glutamato foi avaliado.

[0090] A ativação glial foi avaliada por microscopia de fluorescência usando anticorpos específicos contra GFAP (proteína ácida fibrilar Glial). As secções foram fixadas em metanol ácido (-20 °C) durante 2 minutos, seguidas de três lavagens com PBS, 5 minutos cada. As secções foram permeabilizadas com TBS-Triton X-100 0,025% e foram incubadas num bloqueador (1% de BSA e 10% de soro de cabra em PBS) durante 2 horas à temperatura ambiente. As secções foram então incubadas com coelho anti-GFAP (Abeam Ltd, Cambridge, Reino Unido) (diluição 1: 500 preparada em solução de bloqueio) durante a noite a 4 °C numa atmosfera húmida. Após três lavagens em PBS, 5 minutos cada, as secções foram incubadas com anticorpo secundário Alexa 488 cabra-anti-coelho (Invitrogen) (diluição 1:200 preparada em solução de bloqueio). As seções foram lavadas três vezes em PBS, contrastadas com Hoescht e montadas com Meio de Montagem de Fluorescência (Prolong, Invitrogen) e montado com uma lamela. As imagens digitais comparativas de amostras diabéticas e de controlo foram gravadas com um microscópio Olympus usando configurações de contraste e brilho idênticas.

[0091] Para avaliar o grau de ativação glial um sistema de pontuação baseado na extensão da coloração GFAP previamente relatada (Anderson et al. "Glial and endothelial blood-retinal barrier responses to amyloid-beta in the neural retina of the rat". Clin Ophthalmol - 2008, Vol. No.:2, pp.:801-816) foi usado. O sistema de pontuação foi o seguinte: região de extremidade da célula Muller/GCL apenas (pontuação 1); região de extremidade da célula Muller/GCL mais alguns processos proximais (pontuação 2) ; região de extremidade da célula Muller mais muitos processos, mas não estendendo para ONL (pontuação 3); região de extremidade da célula Muller mais processos em toda a parte com alguns no ONL (pontuação 4); região de extremidade da célula Muller mais muitos processos escuros da GCL à margem externa do ONL (pontuação 5).

[0092] A apoptose foi avaliada usando o método TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick-End Labeling) acoplado com fluoresceina (kit DeadEnd Fluorometric TUNEL System, PROMEGA, EUA) com coloração DAPI (4',6-diamino-2-fenilindole). As criosecções de retina foram permeabilizadas por incubação durante 2 minutos em gelo com 0,1% de Triton X-100 em 0,1% citrato de sódio, recém-preparado. O anticorpo secundário foi Alexa 594 cabra-anti-coelho (Invitrogen) (diluição 1: 200 preparado em solução de bloqueio com 5% de BSA). Para avaliação por microscopia de fluorescência um comprimento de onda de excitação na gama de 450-500 nm (por exemplo, 488 nm) e deteção na gama de 515-565 nm (verde) foi usada.

[0093] A acumulação de glutamato no espaço extracelular e a sobreativação de recetores de glutamato ("excitotoxicidade") desempenha um papel importante na neurodegeneração da retina. Os transportadores de glutamato são essenciais para manter a concentração de glutamato extracelular abaixo dos níveis neurotóxicos. 0 transportador de glutamato/aspartato (GLAST) é o transportador de glutamato mais dominante, representando pelo menos 50% da captação de glutamato na retina de mamífero. GLAST e glutamato foram avaliados por microscopia de fluorescência usando anticorpos específicos [coelho anti-GLAST (EAATl) (1:100, Abeam ab416, Cambridge, Reino Unido) ou glutamato anti-L de coelho (1: 100, Abeam ab9440, Cambridge, Reino Unido)].

[0094] A análise estatística dos dados recuperados foi feita. A distribuição normal das variáveis foi avaliada usando o teste de Kolmogorov-Smirnov. Os dados foram apresentados como média ± SD. Comparações de variáveis contínuas entre ratos diabéticos e não-diabéticos foram realizados utilizando o teste t de Student não emparelhado. As comparações entre variáveis categóricas foram realizadas pelo teste exato de Fisher. Os níveis de significância estatística foram fixados em p <0,05.

Resultados:

Expressão de GLP-1 Rc na retina de ratos: [0095] Embora os dados não sejam apresentados, a expressão de ARNm de GLP-1 Rc foi detetada na neuroretina de ratos diabéticos (db/db) assim como em ratos não diabéticos (db/ + ) por PCR em tempo real. A expressão de GLP-1 Rc observada na retina estava no mesmo intervalo que o observado no pâncreas, um tecido alvo reconhecido para GLP- 1. A proteína GLP-1 Rc também foi detectada por imuno-histoquímica e pela análise Western Blot.

[0096] Os dados da ativação glial estão representados na FIG. 3. Como pode ser visto na FIG. 3, na retina de ratos diabéticos tratados com placebo (C) , a expressão de GFAP foi proeminente ao longo da membrana limitante interna (INL), na extremidade da célula de Muller e nas fibras radiais de células de Muller estendendo-se através de ambas a retina interna (INL) e externa (ONL). Os ratos diabéticos tratados com colírios de liraglutida (T) apresentaram pontuação de imunofluorescência GFAP significativamente menor do que os ratos diabéticos tratados com transportador (p <0,05), e semelhante aos ratos não diabéticos (p=n.s) (Tabela 1).

[0097] Em seguida, a Tabela 1 apresenta a quantificação da ativação glial (em percentagem, %) com base no sistema de pontuação (Anderson et al. Clin Ophthalmol 2008, supra)

Tabela 1.

Pontuação de db/db ratos db/db ratos ativação glial tratados com tratados com GLP- placebo (n=10) lRc agonista liraglutida (n=10) 1 4,9% 58,5% 2 17,1% 39,1% 3 46, 3% 2,4% 4 26, 8% 0% 5 0% 0% [0098] Os dados da apoptose da retina avaliados pelo ensaio TUNEL aparecem na FIG. 4. em que no painel A a percentagem de células positivas TUNEL na camada de células ganglionares (GCL) em ratos diabéticos tratados com GLP-1 (7-37) analógo de liraglutida, (T, n=10) e em ratos diabéticos tratados com transportador (Control, C, n=10) é apresentado. Os dados também estão retratados no painel B para a imunofluorescência positiva TUNEL em neuroretina a partir de ratos diabéticos tratados com o agonista GLP-1 R (T) e para ratos diabéticos tratados com transportador (Controlo, C) . Neste painel B é representado em unidades arbitrárias a quantificação da fluorescência TUNEL em toda a retina (neuroretina) A.U.: unidades arbitrárias. Os resultados são média ± SD. * p<0,05.

[0099] Como pode ser visto na FIG. 4, a percentagem total de células apoptóticas da retina em toda a retina, assim como a percentagem de células apoptóticas em camadas da retina (camada nuclear externa, camada nuclear interna e camada de células ganglionares) foi significativamente maior em comparação ao observado em retinas de controlos não-diabéticos correspondendo à idade (p <0,01). Em todos os grupos a apoptose dos grupos foi maior na camada de células ganglionares. Os ratos diabéticos tratados com agonista GLP-1 Rc (liraglutida) apresentaram um rácio significativamente menor de apoptose na camada de células ganglionares do que os ratos diabéticos tratados com placebo (p <0,05). Além disso, os ratos diabéticos tratados com colírios de agonista de GLP-1 Rc apresentaram intensidade de TUNEL + imunofluorescência significativamente menor do que os ratos diabéticos tratados com transportador, e similares a ratos não-diabéticos (p=n.s). Assim, em ratos tratados houve níveis mais baixos de células apoptóticas, o que é uma medida indireta de menor dano na retina.

[0100] O aumento dos niveis de glutamato causados pela diabetes (C) foi derrogado em ratos diabéticos tratados com agonista GLP-1 Rc (T). Este efeito benéfico foi associado a um aumento significativo no conteúdo de GLAST em ratos diabéticos tratados com o agonista GLP-1 Rc (T) (FIGURA 5).

[0101] Todos estes dados considerados em conjunto fornecem a primeira evidência de que a administração tópica ocular (colirios) de agonistas GLP-1 Rc têm um efeito potente na prevenção do processo neurodegenerativo da retina que ocorre nas fases precoces da retinopatia diabética. Os dados também fornecem evidências de que outras doenças da retina em que a neurodegeneração desempenha um papel essencial pode ser tratado e/ou prevenido com a administração tópica ocular (colirios) de agonistas de GLP-1 Rc, em particular com a administração tópica dos peptídeos como descrito acima.

Referências citadas no pedido [0102]

Schmidt et al., "Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for the Protection and Recovery", Current Neurofarmacology - 2008, Vol. No. 6, pp.: 164-178 .

Simo et al., "Neurodegeneration is an early event in diabetic retinopathy: therapeutic implications", Br. J. Ophthalmol. - 2012, vol. 96, pp.1285-1290Aiello et al., "Targeting Intraocular Neovascularization and Edema -One Drop at a time", N. Eng. J Med - 2008, vol. 359, pp. 967-969.

Urtti A et al., "Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery". Adv. Drug. Deliv. Rev. 2006, vol. 58, pp. 1131-1135. W02007062434

Zhang et al., "Intravitreal injection of exendin-4 analogue protects retinal cells in early diabetic rats", Invest Ophthalmol Vis Sci.-2011, vol.52(l), pp.:2 7 8-8 5. EP0944648. US5424286

Carrasco et al., "Lower Somatostatin Expression Is an Early Event in Diabetic Retinopathy and Is Associated With Retinal Neurodegeneration", Diabetes Care-2007, Vol. No. 30, pp.:2902-2908.

Anderson et al. "Glial and endothelial blood-retinal barrier responses to amyloid-beta in the neural retina of the rat". Clin Ophthalmol - 2008, Vol. No.: 2, pp.:801-816.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Um peptídeo com um comprimento de sequência de 13 a 50 aminoácidos, a região N-terminal do referido peptideo consistindo na sequência: HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4 (SEQ ID NO: 1) em que: Xaa1 é um aminoácido selecionado de alanina e glicina; Xaa2 é um aminoácido selecionado de valina e leucina; Xaa3 é um aminoácido selecionado de serina e lisina; Xaa4 é um aminoácido selecionado de tirosina e glutamina; e a histidina é o resíduo N-terminal; para uso no tratamento tópico do olho e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa da retina.

2. O peptídeo para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o comprimento da sequência é de 30 a 40 aminoácidos.

3. O peptídeo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, em que a doença neurodegenerativa da retina é selecionada do grupo consistindo em retinopatia diabética (DR), degeneração macular relacionada com a idade, glaucoma e retinite pigmentosa.

4. 0 peptídeo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a doença neurodegenerativa da retina é retinopatia diabética.

5. 0 peptídeo para uso de acordo com a reivindicação 4, que é usado no tratamento tópico de fases precoces da retinopatia diabética.

6. 0 peptídeo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que Xaa1 é alanina, Xaa2 é valina, Xaa3 é serina, e Xaa4 é tirosina.

7. 0 peptídeo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, que é um peptídeo-1 semelhante a glucagon de mamífero.

8. 0 peptídeo para uso de acordo com a reivindicação 7, que é o peptídeo-1 semelhante a glucagon humano (7-37) da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

9. 0 peptídeo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, que é um com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3: HAE GT FT S DVS SYLEGQAAKEFIAWLVRGRG, em que o resíduo de lisina (K) compreende o substituinte lipofílico Νε-(γ-glutamil (Να- hexadecanoílo) unido por uma ligação amida ao grupo amino da cadeia lateral da lisina.

10. O peptídeo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é leucina, Xaa3 é lisina, e Xaa4 é glutamina.

11. o peptídeo para uso de acordo com a reivindicação 10, que é um com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPXaa5, em que Xaa5 é um resíduo serina em que o terminal -COOH foi substituído por um grupo -NH2.

12. O peptídeo para uso de acordo com a reivindicação 10, que é um com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKXaa6, em que Xaa6 é um resíduo de lisina no qual o terminal -COOH foi substituído por um grupo -NH2.

13. Uma composição tópica farmacêutica para uso no tratamento tópico do olho e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa da retina, que compreende o peptídeo como definido em qualquer das reivindicações 1-12.

14. A composição tópica farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 13, que é selecionada do grupo consistindo em soluções, cremes, loções, unguentos, emulsões e suspensões.

15. A composição tópica farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-14, que é uma solução de colírio.

16. A composição tópica farmacêutica para uso de acordo com qualquer das reivindicações 13-15, em que a doença neurodegenerativa da retina é selecionada do grupo consistindo em retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade, glaucoma e retinite pigmentosa.

17. A composição farmacêutica tópica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-16, em que a doença neurodegenerativa da retina é a retinopatia diabética. Listagem de sequências <110> Fundació Hospital Universitari Vail d'Hebron -Instituto de Recerca <120> Peptideos para uso no tratamento tópico de doenças neurodegenerativas da retina, em particular em fases precoces de retinopatia diabética e outras doenças da retina em que a neurodegeneração desempenha um papel essencial. <130> P2588PC00 <150> EP13382063 <151> 2013-03-01 <160> 8 <170> Patentln versão 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> região N-terminal de um peptídeo capaz de interagir com o recetor de peptídeo-1 semelhante a glucagon mamífero <22 0> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X é um aminoácido selecionado de alanina e glicina <22 0> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> X é um aminoácido selecionado de valina e leucina <22 0> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> X é um aminoácido selecionado de serina e lisina <22 0> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> X é um aminoácido selecionado de tirosina e glutamina <4 0 0> 1 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Liraglutida; análogo do peptideo-1 (7-37) semelhante a glucagon (GLP-1 (7-37)). <220> <221> LIPID <222> (20)..(20) <223> O resíduo de lisina (K, Lys) compreende o substituinte lipofilico N epsilon-(gama-glutamil(N-alfa-hexadecanoil)) ligado por uma ligação amida ao grupo amino da cadeia lateral de lisina <400> 3 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Exenatida; agonista de peptideo-1 semelhante a glucagon; versão sintética da hormona exendina-4 encontrada na saliva do monstro Gila. <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> X é um resíduo serina em que o terminal -COOH foi substituído por um grupo -NH2 <400> 4 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> iniciador dianteiro <400> 6 gggtctctgg ctacataagg acaac 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Primário reverso <400> 7 aaggatggct gaagcgatga c 21 <210> 8 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Lixisenatida; agonista de peptídeo-1 semelhante a glucagon; derivado da exenatida <22 0> <221> MOD_RES <222> (44)..(44) <223> X é um resíduo de lisina no qual o terminal -COOH foi substituído por um grupo -NH2 <400> 8