PT670677E - Potenciador da actividade pesticida de bacillus - Google Patents

Description

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ DESCRICÃO "Potenciador da actividade pesticida de Bacittus"

1. CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a um factor que potência a actividade pesticida de um pesticida relacionado com Bacillus, um pesticida químico e/ou um vírus com propriedades pesticidas, bem como a métodos para a obtenção do factor. O presente invento refere-se também a composições pesticidas que compreendem o factor e um transportador pesticida, ou o factor e um pesticida relacionado com Bacillus, um pesticida químico e/ou um vírus com propriedades pesticidas, bem como a métodos para utilização destas composições. O invento refere-se ainda a uma estirpe mutante, ou variante de Bacillus, em que este factor se obtém em maior quantidade ou tem uma actividade potenciadora maior, em comparação com a estirpe progenitora, e a métodos para a produção destas estirpes mutantes ou variantes.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

Todos os anos, perde-se uma porção significativa das colheitas agrícolas comercialmente importantes a nível mundial, incluindo alimentos, têxteis e várias plantas domésticas, devido a infestação por pragas, o que resulta na perda de milhões de dólares. Têm sido utilizadas várias estratégias na tentativa de controlar estas pragas.

Uma das estratégias consiste na utilização de pesticidas de largo espectro, pesticidas químicos com uma gama de actividades alargada. No entanto, existem várias desvantagens na utilização destes pesticidas químicos. Devido ao seu largo espectro de actividade, estes pesticidas poderão destruir organismos não alvo, como insectos e parasitas benéficos de pragas destruidoras. Para além disso, estes pesticidas químicos são frequentemente tóxicos para animais e humanos, e as pragas alvo desenvolvem muitas vezes resistência, quando são repetidamente expostas a estas substâncias.

Uma outra estratégia envolveu a utilização de biopesticidas, que utilizam

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ agentes patogénicos que ocorrem naturalmente, para o controlo das infestações das colheitas por insectos, fungos e ervas daninhas. Os biopesticidas compreendem uma bactéria que produz uma toxina, uma substância tóxica para a praga. Os biopesticidas são geralmente menos prejudiciais aos organismos não-alvo e ao meio ambiente como um todo, do que os pesticidas químicos. O biopesticida mais amplamente utilizado é o BaciHus thuringiensis (B.t.). O B.t. é um microorganismo em forma de bastonete, aeróbio, que forma esporos, amplamente distribuído. Durante o seu ciclo de esporulação, o B.t. produz uma proteína(s) na forma de cristal, conhecida como delta-endotoxina(s) cristalina(s), que mata as larvas de insectos. O B.t. é, portanto, muito útil como pesticida agrícola.

Verificou-se que algumas estirpes, e.g. BaciHus thuringiensis subesp. kurstaki e o BaciHus thuringiensis subesp. aizawai são específicas para Lepidoptera. Verificou-se que o BaciHus thuringiensis subesp. israeiensis é específico para Diptera (Goldberg, patente U.S. No. 4 166 112). Verificou-se que outras estirpes, e.g. BaciHus thuringiensis subesp. tenebrionis {Krieg et al., 1988, Patente U.S. No. 4 766 203) são específicas para Co/eoptera. Em 1986 (Hernnstadt et al. Bio/Technology vol. 4 305-308, 1986, patente U.S. 4 764 372, 1988), foi referido o isolamento de outra estirpe de BaciHus thuringiensis tóxica para Coieoptera. Esta estirpe, designada por "BaciHus thuringiensis subesp. san diego", M-7, foi depositada no Northern Regional Research Laboratory, USA, com o número de depósito NRRL B-15939. No entanto, o cessionário da patente '372, Mycogen, Corp, admitiu publicamente que o BaciHus thuringiensis subesp. san diego é o BaciHus thuringiensis subesp. tenebrionis. Para além disso, a patente '372 foi cedida à Novo Nordisk A/S. Foi também descrita uma estirpe de B.t. que é tóxica contra Lepidoptera e Coieoptera (Pedido PCT No. WO 90/13651). A toxina descrita no pedido PCT No. WO 90/13651 tem um peso molecular de 81 kd.

Durante o seu ciclo de esporulação, o B.t. produz uma proteína(s) na forma de cristal conhecida como delta-endotoxina(s) cristalina(s), com um peso molecular entre 27-140 kd, que por ingestão mata as larvas dos insectos. Para uma dada estirpe de B.t., a actividade tóxica poderá residir numa ou mais destas proteínas cristalina. A maior parte das delta-endotoxinas são protoxinas que são convertidas proteoliticamente em polipéptidos tóxicos 3 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ menores(truncados), no intestino médio do insecto alvo (Hõfte e Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255). As delta-endotoxinas são codificadas pelos genes cry (proteína cristalina). Os genes cry foram divididos em seis classes e várias subclasses, com base nas semelhanças estruturais e especificidade pesticida. As classes principais são específicas para Lepidoptera (ctyl); específicas para Lepidoptera e Diptera (cry/i); específicas para Coleoptera (cryllD; específicas para Diptera (crylV) (Hòfte e Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255); específicas para Coleoptera e Lepidoptera (referidos como cryV por Tailor et al., 1992, Mol. Microbiol. 6:1211-1217); e específicas para Nematoda (designados por cryV e cryVi por Feitelson et al., 1992 Bio/Technology 10:271-275). Já se produziram delta-endotoxinas por métodos de ADN recombinante. As delta-endotoxinas produzidas por métodos de ADN recombinante podem ser, ou não, na forma de cristal.

A delta-endotoxina de B.t. é insolúvel em água, excepto a pH alcalino, e é quase sempre codificada por plasmídeos. Verificou-se que algumas estirpes de Bacil/us thuringiensis produzem um análogo do nucleótido adenina, pesticida, estável ao calor, conhecido como β-exotoxina ou turingiensina, que é por si só um pesticida (Sebesta et al., em H.D. Burges (ed.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York, p. 249-281, 1981). A β-exotoxina foi detectada no sobrenadante de algumas culturas de Bacii/us thuringiensis. Tem um peso molecular de 789 e é constituída por adenosina, glucose e ácido alárico (Liithy et al., in Kurstak (ed.), Microbial and Virai Pesticides, Mareei Dekker, New York, 1982, pp. 35-72). A sua gama de hospedeiros inclui, mas não se lhes limita, Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophhila me/anogaster, e Tetranychus cinnabarinus. Pensa-se que a toxicidade da β-exotoxina é devida à inibição da ARN-polimerase dirigida por ADN, por competição com o ATP. Foi demonstrado que a β-exotoxina é codificada por um plasmídeo Cry em cinco estirpes de Baci/lus thuringiensis (B.t.) e que a β-exotoxina pode ser classificada como β-exotoxina de tipo I ou tipo II (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Verificou-se que a β-exotoxina do tipo I é produzida pelo B.t. subesp. thuringiensis do serótipo 1, B.t. subesp. tolworthi do serótipo 9, e B.t. subesp. darmstadiensis do serótipo 10. Verificou-se que a β-exotoxina do tipo II

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 4 é produzida pelo B.t. subesp. momsoni, do serótipo 8ab e que é activa contra a Leptinotarsa texana. Exemplos de outros factores solúveis em água isolados a partir de B.t. incluem a alfa-exotoxina (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7); gama-exotoxinas, que são várias enzimas proteolíticas incluindo lecitinases, citinases e proteases (Forsberg et al1976, Baci/íus thuringiensis: Its Effects on environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcomittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxina (Argauer et al., 1991, J. Entomol. Sei. 26:206-213) e anidroturingiensina (Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 40, 1775, 1975). Têm sido desenvolvidos esforços na arte para se alcançar uma mortalidade aumentada com as formulações de B.t.. Os meios utilizados incluem a pesquisa de novas estirpes com uma mortalidade aumentada, a tentativa de manipular as estirpes actuais, tentativas de conceber formulações mais eficazes através da combinação de esporos e/ou cristais de B.t. com novos transportadores pesticidas, pesticidas químicos, ou agentes potenciadores (veja-se, por exemplo patente U.S. No. 5 250 515, um inibidor de tripsina). Constitui, portanto, um objectivo do presente invento potenciar a actividade pesticida de pesticidas.

3. SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a um novo factor que, ao contrário dos factores conhecidos na arte, potência a actividade pesticida de um pesticida relacionado com Bacillus. Especificamente, o factor de acordo com o presente invento é um potenciador. Tal como aqui definido, o termo "potenciador" é uma substância que não tem actividade pesticida significativa, e.g. tem uma LC50 (LC50 é a concentração de substância necessária para matar 50% da praga) superior a cerca de 3000 pg/g, testado por um bioensaio (veja-se secção 6), mas que actua aumentando a actividade pesticida de um pesticida relacionado com Bacillus, em pelo menos 50% e não impede o crescimento das larvas. Tal como referido na secção 2, outras substâncias conhecidas na arte, capazes de aumentar a actividade pesticida, tais como as delta-toxinas, inibidores de tripsina e exotoxinas, têm actividade pesticida. 5 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ

Numa concretização particular, o factor é solúvel em água. Tal como aqui definido, uma substância, ou composto, é "solúvel em água" se for possível dissolver pelo menos cerca de 1 mg da substância em 1 ml de água. O factor poderá também potenciar a actividade pesticida de um pesticida químico e/ou de um vírus com propriedades pesticidas.

Tal como aqui definido, um "pesticida relacionado com Baci/lus" é uma estirpe, um esporo, ou uma substância, e.g. proteína ou seu fragmento, de um Bacillus (e.g. Bacillus thuringiensis ou Bacillus subtilis), que possui actividade contra, ou que mata, pragas; uma substância que proporciona protecção às plantas, e.g., uma substância anti-alimento; ou um microorganismo capaz de expressar um gene de Bacillus que codifica para uma proteína de Bacillus ou fragmento seu derivado, com actividade contra, ou que mata, pragas (e.g. a delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis) e um transportador aceitável (veja-se Secção 5.2, infra, para exemplos destes transportadores). A praga poderá ser, por exemplo, um insecto, um nemátodo, um acarino, ou um caracol. Um microorganismo capaz de expressar um gene de Bacillus que codifica para uma proteína de Bacillus, ou seu fragmento com actividade contra, ou que mata, pragas que habitam no filoplano (a superfície das folhas das plantas) e/ou na rizosfera (o solo que envolve as raízes das plantas) e/ou em meios aquáticos e é capaz de competir com sucesso, no meio ambiente particular (colheitas ou outros habitats de insectos), com microorganismos do tipo selvagem, e proporcionando a manutenção e expressão de forma estável de um gene de Bacillus que codifica para uma proteína de Bacillus, ou um seu fragmento, com actividade contra, ou que mata, pragas. Exemplos destes microorganismos incluem, mas não se lhes limitam, bactérias, e.g. do género Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serra tia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alca/igenes e Clostridium; algas, e.g. das famílias Cyanophyceae, Proch/orophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae,

Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae,

Cryptophyceae, Eug/enophyceae, Prasinophyceae e Ch/orophyceae; e fungos, em particular leveduras, e.g. dos géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobo/omyces, Rhodotorula e Aureobasidium.

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Tal como aqui definido, "actividade pesticida" mede a quantidade de actividade contra uma praga, através da morte ou impedimento do crescimento de uma praga, ou através da protecção da planta contra a infestação pela praga. O invento refere-se também a uma estirpe mutante ou variante de Bacillus, a partir da qual se obtém um factor em grandes quantidades, comparado com a estirpe progenitora, bem como a métodos para a obtenção deste mutante ou variante. O invento refere-se igualmente a composições pesticidas que compreendem o factor e um transportador pesticida, bem como o factor e um pesticida relacionado com Bacillus, um pesticida químico e/ou um vírus com propriedades pesticidas. O invento refere-se também a métodos para a utilização das composições pesticidas de acordo com o presente invento. Numa concretização, o invento refere-se a um método para controlar uma praga, que compreende a exposição da praga a uma quantidade da composição, controladora da praga. Noutra concretização, o invento refere-se a um método para diminuir a resistência de uma praga a um pesticida relacionado com Bacillus, que compreende a exposição da praga a uma composição que compreende o factor e um transportador pesticida. O invento refere-se ainda a um método para potenciar a actividade pesticida de um pesticida relacionado com Bacillus que compreende a administração a uma praga exposta a um pesticida relacionado com Bacillus de uma composição que compreende o factor e o transportador numa quantidade eficaz para potenciar a actividade pesticida de um pesticida relacionado com Bacillus. O invento refere-se ainda a um método para a obtenção de um factor "substancialmente puro" de acordo com o presente invento, que compreende os passos de: (a) fermentação de uma estirpe de Bacillus·, (b) recuperação do sobrenadante de (a); e (c) isolamento do factor a partir do sobrenadante

Tal como aqui definido, um factor "substancialmente puro" significa um

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 7 factor que contém menos que 10% de contaminantes, por exemplo, a proteína delta-endotoxina. O invento refere-se também a um método para a identificação do factor de acordo com o presente invento, que compreende (a) fermentação de uma estirpe de BaciHus (b) recuperação do sobrenadante da fermentação de (a); e (c) ensaio do sobrenadante de (b) quanto a potenciação de um pesticida relacionado com BaciHus

4. DESCRICÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS A Figura 1 mostra de forma esquemática o procedimento geral utilizado para purificar la. A Figura 2 mostra o espectro de 13C RMN de la. A Figura 3 mostra o espectro de RMN de protões de la. A Figura 4 mostra a estrutura de la deduzida. Os desvios de protões (1H) e de 13C são apresentados em ppm, registados em D20. A Figura 5 mostra um esquema de síntese para a obtenção da estrutura la.

5. DESCRICÃO PORMENORIZADA DO INVENTO O presente invento refere-se a um factor que potência a actividade pesticida de um pesticida relacionado com BaciHus. O factor pode ter um peso molecular de cerca de 350 a cerca de 1200 ou, numa concretização específica, de cerca de 350 a cerca de 700. O factor de acordo com o presente invento potência a actividade pesticida de um pesticida relacionado com BaciHus, em pelo menos 1,5 vezes, a opcionalmente cerca de 1000 vezes, de preferência em cerca de 100 vezes a 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 8

cerca de 400 vezes. Numa concretização específica, o factor de acordo com o presente invento potência a actividade pesticida de uma delta-enterotoxina de Baci/lus thuringiensis, incluindo, mas não se limitando a uma proteína Cryl (incluindo proteína CrylA, CrylB, e CrylC), CrylI, CrylII, CrylV, CryV ou CryVI, na forma de comprimento total, ou numa forma truncada, processada por proteólise, em cerca de 1,5 vezes a cerca de 1000 vezes. Numa concretização mais particular, o factor de acordo com o presente invento potência uma delta-endotoxina de B.t. em cerca de 100 vezes, a cerca de 400 vezes. O factor poderá também potenciar a actividade pesticida de um pesticida químico e/ou um vírus com propriedades pesticidas. O factor poderá ser também solúvel em água, estável em água até cerca de 100°C, durante 5 minutos, estável quando submetido à luz solar directa durante cerca de 10 horas e/ou estável a um pH de cerca de 2, durante cerca de 10 dias.

Numa concretização específica, o factor tem de 13 a 24 átomos de carbono.

Numa concretização mais específica, o factor tem de 13a 19 átomos de carbono. Numa concretização ainda mais específica, o factor tem 13 átomos de carbono.

Numa concretização específica, o factor tem a estrutura (I)

0 O em que R1 é amino, hidroxi, alquilo benzamida, 3,5-dinitrobenzamida, p-nitrobenzamida, halobenzamida, alquilbenzamida, tiofenamida, furanamida, pirrolamida, imidazolámida, pirazolamida, alquilamino C^io* dialquilamino C^q, 9 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ éster de alquilo C^o ou de benzilo, halogéneo ou alcoxi (^_10; R2 é (CH2)n, em que n é um número inteiro de 0-10; R3 e R4 são independentemente (NH)p, em que p é 0 ou 1;

CH2X1 O R5 é CH-CHX2-CH2-CHX3-CHX4-CHX5-CHX6-CX7 ou (CHOH)qCH2OH em que X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 são independentemente NH2, OH, acetilo, halogéneo ou alcoxi Ο·,_ι0 e q é um número inteiro de 1-10; R6 é hidroxilo, amino, alcoxi ou benzoxi, éster benzflico, éster 3,5-dinitrobenzílico, éster p-nitrobenzílico, éster halobenzílico, éster alquilbenzílico, éster de tiofeno, éster de furano, éster de pirrolo, éster de imidazolo; ou um sal seu derivado aceitável para pesticidas, incluindo, mas não se lhes limitando, fosfato, sulfato, acetato, carbonato e nitrato.

Numa concretização mais específica, o referido factor tem a estrutura (la)

NH2 H

OH OH OH O

nh2 '·

5.1. - OBTENÇÃO DO FACTOR O factor de acordo com o presente invento pode ser obtido a partir da fermentação de um Bacillus (e.g. Baci/lus subtilis, Bacillus cereus e Bacillus thuringiensis). Numa concretização específica, obtém-se o factor de acordo com o presente invento a partir do sobrenadante da fermentação de um Bacillus thuringiensis, incluindo Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subesp. aizawai, Bacillus thuringiensis subesp. galleriae, Bacillus 10 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ thuríngiensis subesp. entomocidus, Bacillus thuríngiensis subesp. tenebrionis, BaciUus thuríngiensis subesp. thuríngiensis, Bacillus thuríngiensis subesp. alesti, Bacillus thuríngiensis subesp. canadiensis, Bacillus thuríngiensis subesp. darmstadiensis, Bacillus thuríngiensis subesp. dendrolimus, Bacillus thuríngiensis subesp. finitimus, Bacillus thuríngiensis subesp. kenyae, Bacillus thuríngiensis subesp. morrísoni, Bacillus thuríngiensis subesp. subtoxicus, Bacillus thuríngiensis subesp. toumanoffi e Bacillus thuríngiensis subesp. israe/ensis. Numa concretização preferida, obtém-se o factor a partir do sobrenadante de Bacillus thuríngiensis subesp. kurstaki, Bacillus thuríngiensis subesp. aizawai, ou Bacillus thuríngiensis subesp. galleríae, ou de mutantes seus derivados, que possuem substancialmente a mesma actividade de potenciação. Numa concretização específica, o factor é recuperado a partir de um mutante cryspo" de Bacillus thuríngiensis subesp. kurstaki.

Numa concretização, obtém-se o factor a partir de um mutante de Bacillus, particularmente um Bacillus thuríngiensis, em que o factor é produzido em maiores quantidades, ou de um mutante de Bacillus thuríngiensis em que a actividade potenciadora do factor que se obtém a partir do mutante é maior, em comparação com a estirpe progenitora. "Estirpe progenitora" tal como aqui definido, refere-se à estirpe de Bacillus original, antes da mutagénese. A fim de obter estes mutantes, a estirpe progenitora pode ser, por exemplo, tratada com um agente mutagénico por meios químicos, como por exemplo, com N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etilo, radiação gama, raios-X ou radiação UV. Mais concretamente, num método para efectuar a mutação de estirpes de Bacillus e seleccionar os mutantes, a estirpe progenitora é: i) tratada com um mutagénio; ii) os mutantes assim tratados são crescidos num meio adequado para a selecção de uma estirpe mutante iii) selecção de uma estirpe mutante

De acordo com uma concretização preferida deste método, as colónias seleccionadas são crescidas num meio de produção normal e faz-se uma selecção final das estirpes capazes de produção aumentada do factor. A cultura de Bacillus pode ser efectuada utilizando meios e técnicas de 11 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ fermentação conhecidos na arte (veja-se por exemplo, Rogoff et al., 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129; Dulmage et al., 1971, J. Invertebrate Path. 18:353-358; Dulmage et al., em Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges ed., Academic Press, N.Y. 1980). No final do ciclo de fermentação, pode-se recuperar o sobrenadante através da separação de esporos e cristais de B.t. do caldo de fermentação, utilizando meios conhecidos na arte, e.g. centrifugação e/ou ultrafiltração. O factor de acordo com o presente invento está contido no sobrenadante, que pode ser recuperado utilizando meios bem conhecidos na arte, e.g. ultrafiltração, evaporação e secagem por pulverização. Este procedimento é descrito em maior pormenor nas secções seguintes.

Alternativamente, o factor de acordo com o presente invento pode ser obtido através de síntese química, utilizando procedimentos conhecidos na arte. Como referido acima, numa concretização específica, o factor tem a estrutura (la)

Na Figura 5 apresenta-se um esquema de síntese. O ácido 2,3-diaminopropiónico (DAP) é protegido utilizando Boc (carbamato de t-butilo). O DAP totalmente protegido em N pode ser convertido no imidazoílo por tratamento com carbonato diimidazóico, para originar o composto A (veja-se Figura 5). O composto B (veja-se Figura 5) pode ser preparado a partir de ácido 3-amino-3-desoxialdónico por substituição selectiva do álcool primário terminal, utilizando um grupo rejeitado de benzenossulfonilo. Consegue-se a condensação de A e B sob condições Julia (NaH, THF), seguido de dessulfurização com níquel de Raney. O grupo ceto no composto C (veja-se Figura 5), pode ser estereosselectivamente reduzido por controlo da quelação, utilizando tris-acetoxiboro-hidreto de sódio. O C desprotegido pode ser tratado com isocianato D derivado de DAP, a fim de originar o derivado ureido correspondente, que será desprotegido por hidrogenólise, para originar o composto (la).

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Numa concretização, os grupos amino de (la), obtido de forma sintética, ou a partir do sobrenadante de um Baci/lus, podem ser acilados, ou com cloreto ácido, ou anidrido ácido na presença de hidróxido de sódio aquoso, a fim de se obterem triacetamidas, tribenzamidas e trioctamidas de (la). Alternativamente, os grupos amino e hidroxi podem ser per-acilados, formando inicialmente os ésteres de metilo utilizando um excesso de diazometano, seguindo-se a per-acilação nos grupos amino e hidroxilo, por tratamento com um anidrido de acilo (e.g. anidrido acético, anidrido de ácido benzóico, anidrido de ácido n-octanóico) em piridina. Noutra concretização, partindo de um derivado acilado, pode-se preparar um éster de amida misto, por metilação selectiva do carboxilo, seguida de tratamento com um anidrido de acilo em piridina. Noutra concretização, o ácido carboxílico pode ser derivatizado para formar ésteres de alquilo ou arilo ou amida. Ainda noutra concretização, poderão ocorrer oxidações selectivas dos substituintes hidroxi em cetona e análogos de ácido carboxílico de cadeia encurtada.

Noutra concretização, os grupos amino de (la) podem ser protegidos como carbamatos de t-butilo, por tratamento com anidrido de Boc, na presença de carbonato de sódio aquoso, seguido de protecção selectiva dos grupos hidroxilo utilizando brometo de benzilo em hidreto de sódio para originar (X), apresentado a seguir.

Este derivado totalmente protegido pode ser hidrolisado na ligação ureido utilizando hidróxido de sódio aquoso. Isto pode ser seguido de acilação selectiva com, por exemplo, aminoácidos, ácidos hidroxicarboxílicos ou ácido dicarboxílico, incluindo, mas não se lhes limitando, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido málico, ácido adípico, na presença de Ν,Ν-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC). Os grupos N-Boc e O-benzilo podem ser 13 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ removidos por clivagem com ácido moderado e hidrogenólise sobre paládio em carvão activado, para se obter a estrutura (II) a seguir apresentada

Ainda noutra concretização, o composto (X) totalmente protegido pode ser tratado com vários isocianatos derivados a partir de aminoácidos, incluindo mas não se lhes limitando, glicina, alanina, valina, fenilalanina, fenilglicina, metionina, normetionina, para se obterem derivados 9-ureido. Os grupos protectores podem ser removidos, como acima descrito, para se obter a estrutura (III)

em que R é um aminoácido que ocorre naturalmente.

Ainda noutra concretização, o ácido 2,3-diaminopropiónico é protegido na posição 2, utilizando Boc na presença de carbonato de sódio aquoso, para originar ácido N-2-Boc-2,3-diaminopropiónico. Este derivado pode ser acilado com ácidos per-acetilaldónico, incluindo, mas não se lhes limitando, ácido penta-O-acetil-D-glucónico, ácido penta-O-acetil-D-manóico, ácido penta-O-acetil-D-galactónico, ácido hepta-O-acetil-D-eritro-L-manoactoanóico, na presença de DCC, séguido de solvólise dos grupos acetilo e grupos Boc na presença de amónia metanólica (Chem. Pharm. Buli., 1985, 33:509-514). Os 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 14

análogos de poli-hidroxiamida com a estrutura (IV) podem ser obtidos por tratamento com ácido moderado NH2

0 em que n é 1-10. Pode-se aplicar a mesma sequência utilizando ácidos aldáricos per-acetilados, por exemplo, D-glucaro-6,3-lactona, para originar o poli-hidroxi com grupos carboxamida terminais primários.

Ainda noutra concretização, faz-se o acoplamento de um derivado de ácido 2,3-diamonopropiónico protegido com um isocianato derivado a partir de um derivado de açúcar aminado com um equivalente de fosgénio. O açúcar aminado, numa concretização, poderá ser uma 1- ou 2-amino-hexose (e.g., 1-amino-1-desoxisorbitol, glucosamina, manosamina) e tem a estrutura (V) NHj

0 em que n é 1 -10. A purificação do factor de acordo com o presente invento pode ser realizada por vários procedimentos conhecidos na arte, incluindo, mas não se lhes limitando, cromatografia (e.g. cromatografia em coluna de permuta iónica, de afinidade e de exclusão por tamanhos), procedimentos electroforéticos, solubilidade diferencial, extracção ou qualquer outra técnica convencional conhecida na arte. A actividade potenciadora do factor de acordo com o presente invento,

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 15 da actividade pesticida do pesticida relacionado com BaciHus, vírus com actividade pesticida ou pesticida químico, contra diversas pragas, pode ser determinada utilizando procedimentos conhecidos na arte, como a incorporação numa dieta artificial para insectos, revestimento de uma dieta artificial, pincelagem de folhas, imersão das folhas e pulverização foliar. Na secção 6, infra são fornecidos exemplos específicos destes ensaios.

5.2. COMPOSIÇÕES QUE COMPREENDEM Q FACTOR O factor do presente invento descrito supra pode ser formulado juntamente com um pesticida relacionado com Bacillus e um transportador aceitável numa composição(s) pesticida que é, por exemplo, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó pulverulento, grânulos dispersáveis, um pó molhável, um concentrado emulsionável, um aerossol ou grânulos impregnados. Exemplos destes pesticidas relacionados com Bacillus incluem, mas não se lhes limitam, pesticidas produzidos por Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki (B.t.k.) (comercializado como DIPEL™ da Abbott Laboratories, Inc. JAVELIN™ da Sandoz, BIOBIT™ da Novo Nordisk A/S, FORAY™ da Novo Nordisk A/S, MVP™ da Mycogen, BACTOSPEINE™ da Novo Nordisk A/S e THURICIDE™ da Sandoz) e Bacillus thuringiensis subesp. aizawai (B.t.a.) (comercializado como FLORBAC™ da Novo Nordisk A/S e XENTAIR™ da Abbott Laboratories, Inc.). Outros exemplos incluem, mas não se lhes limitam, Bacillus thuringiensis subesp. israelensis (B.t.i.) (comercializado como BACTIMOS™ pela Novo Nordisk A/S e VECTOBAC™ da Abbott Laboratories, Inc.); BaciHus sphaericus (B. sphr.) (comercializado como SPHERIMOS™ de Novo Nordisk A/S); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (comercializado como FOIL™ da Ecogen); BaciHus thuringiensis aizawai/kurstaki (B.t.a./B.t.k.) (comercializado como CONDOR™ da Ecogen e AGREE™ da Ciba-Geigy); e BaciHus thuringiensis kurstaki/kurstaki (B.t.k./B.t.k.) (comercializado como CUTLASS™ da Ecogen). O vírus com actividade contra pragas pode ser um baculovírus, e.g. o vírus de poli-hedrose nuclear (NPV) de Autographa californica, NPV de Syngrapha falcifera, GV (vírus de granulose) de Cydia pomonella, NPV de Heliothis zea, NPV de Lymantria dispar, NPV de Orgyia pseudotsugata, NPV de Spodoptera exigua, NPV de Neodiprion lecontei, NPV de Neodiprion sertifer, NPV de Harrisina brillians e NPV de Endopiza viteana Clemens.

Em composições que compreendem o factor e um pesticida relacionado 16 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ com BaciHus, ο factor poderá estar presente numa quantidade de pelo menos cerca de 0,002 g/BIU. Numa concretização, o factor pode ter a estrutura la e/ou pode estar presente numa quantidade de pelo menos cerca de 0,1 g/BIU ou 0,05 g de factor por g de delta-endotoxina e esporos de Bacillus, opcionalmente de cerca de 300 g/BIU ou 150 g de factor por g de delta-endotoxina e esporos de Bacillus, de preferência 2 g/BIU ou 1g de factor por g de delta-endotoxina e esporos de BaciHus. Tal como aqui definido, "BIU" é a unidade internacional de biliões, determinada por bioensaio. 0 bioensaio compara a amostra com um material de referência padrão de Bacillus, utilizando a Ttrichoplusia ni ou outra praga como insecto padrão do teste. A potência é determinada dividindo a LC50 padrão de referência e multiplicando pela potência padrão de referência.

Noutra concretização, a composição poderá compreender o factor de acordo com o presente invento numa forma substancialmente pura, ou um sobrenadante de Bacillus na forma seca, concentrada, ou líquida, e um transportador adequado para pesticida, cujos exemplos estão descritos infra. Esta composição pode ser aplicada separadamente a uma planta, e.g. plantas transgénicas. Especificamente, a composição pode ser aplicada a uma planta que contém previamente um gene de Bacillus, e.g. um gene de B.t. Noutra concretização, a composição pode ser aplicada a uma planta previamente exposta a uma composição de Bacillus, e.g. B.t., presente numa quantidade de pelo menos cerca de 0,01 % até cerca de 60%. A composição que compreende o factor e o transportador aceitável para pesticidas para além de controlar a praga, pode também ser utilizada para diminuir a resistência de uma praga a um pesticida. Alternativamente, a composição pode ser utilizada para potenciar um pesticida relacionado com BaciHus. Numa concretização, a composição pode ser aplicada ao mesmo tempo que o pesticida numa quantidade de pelo menos cerca de 2 g de factor/BIU até, opcionalmente, cerca de 300 g de factor/BIU. Noutra concretização, a composição pode ser aplicada até cerca de 24 horas após o pesticida, como um adjuvante, para aumentar a eficácia do pesticida residual.

As composições acima descritas podem ser obtidas pela adição de um agente tensioactivo, um transportador inerte, um conservante, um humectante, um estimulante de apetite, um agente de atracção, um agente de encapsulação,

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 17 um aglutinante, um emulsionante, um corante, um protector de U.V., um tampão, um agente de fluidez, ou outro componente para facilitar o manuseamento e a aplicação do produto a pragas alvo particulares.

Os agentes tensioactivos adequados incluem, mas não se limitam lhes, compostos aniónicos como um carboxilato, por exemplo um carboxilato de um metal de um ácido gordo de cadeia longa; um N-acilsarcosinato; mono ou di-ésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcoois gordos ou sais destes ésteres; sulfatos de álcoois gordos, como dodecilsulfato de sódio, octadecilsulfato de sódio ou cetilsulfato de sódio; sulfatos de álcoois gordos etoxilados, sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lenhina; sulfonatos de petróleo; alquilarilsulfonatos, como alquilbenzenossulfonatos ou (alquil inferior)naftalenossulfonatos, e.g. butilnaftalenossulfonato; sais de condensados sulfonados de naftaleno-formaldeído, sais de condensados sulfonados de fenol-formaldeído; ou sulfonatos mais complexos como sulfonatos de amida, e.g. o produto de condensação sulfonado de ácido oleico e N-metiltaurino ou os sulfossuccinatos de dialquilo, e.g. o sulfonato de sódio ou succinato de dioctilo. Os agentes não iónicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos, amidas de ácidos gordos ou fenóis gordos substituídos com alquilo ou alcenilo com óxido de etileno, ésteres gordos de éteres de álcool poli-hídrico, e.g. ésteres de ácidos gordos de sorbitano, produtos de condensação destes ésteres com óxido de etileno, e.g. ésteres de ácidos gordos de sorbitano-polioxietileno, copolímeros de blocos de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilénicos como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol, ou glicóis acetilénicos etoxilados. Exemplos de um agente tensioactivo catiónico incluem, por exemplo, uma mono-, di- ou poliamina alifática como um acetato, naftenato ou oleato; uma amina contendo oxigénio, como óxido de amina ou polioxietileno-alquilamina; uma amina ligada a amida, preparada por condensação de um ácido carboxílico com uma di- ou poliamina; ou um sal de amónio quaternário.

Exemplos de materiais inertes incluem, mas não se lhes limitam, minerais inorgânicos como o caulino, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos ou materiais botânicos como a cortiça, a espiga do milho em pó, casca de amendoim, casca de arroz e cascas de noz.

As composições de acordo com o presente invento podem estar numa 18 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ forma adequada para aplicação directa ou como um concentrado ou composição primária que requer diluição com uma quantidade adequada de água, ou outro diluente, antes de aplicação. A concentração de pesticida varia, dependendo da natureza da formulação particular, especificamente se é um concentrado ou se é para utilização directa. A composição contém 1 a 98% de um transportador inerte sólido ou líquido, e 0 a 50%, de preferência 0,1 a 50%, de um tensioactivo. Estas composições serão administradas à taxa indicada no rótulo para o produto comercial, de preferência cerca de 0,009-4,5 kg/hectare, quando na forma seca, e cerca de 0,012-11,68 litros/hectare, quando na forma líquida.

Numa outra concretização, o Bacillus, e.g., a delta-endotoxina cristalina de B.t., e o factor potenciador, podem ser tratados antes da formulação para prolongar a actividade pesticida, quando aplicados num meio ambiente de uma praga alvo, desde que o pré-tratamento não seja prejudicial à delta-endotoxina cristalina ou ao factor. Este tratamento pode ser realizado por meios químicos e/ou físicos, desde que o tratamento não afecte de forma prejudicial as propriedades da(s) composição(ões). Exemplos de reagentes químicos incluem, mas não se lhes limitam, agentes de halogenação; aldeídos como o formaldeído e gluteraldeído; anti-infectantes, como o cloreto de zefiran, álcoois como o isopropanol e etanol; e fixantes histológicos, como o fixante de Bouin e o fixante de Helly (veja-se, por exemplo, Humason, Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman e Co., 1967)

As composições de acordo com o invento podem ser aplicadas directamente à planta por, por exemplo, pulverização de líquido ou pulverização de pó, na altura em que a praga começa a aparecer na planta, ou antes do aparecimento de pragas, como medida preventiva. As plantas a ser protegidas no âmbito do presente invento incluem, mas não se lhes limitam, cereais (trigo, cevada, centeio, aveia, arroz, sorgo e colheitas relacionadas), beterraba (beterraba sacarina e beterraba de forragem) drupa, pomos e fruta tenra (maçãs, pêras, ameixa, pêssegos, amêndoas, cerejas, morangos, framboesas e amoras), plantas leguminosas (alfafa, feijão, lentilhas, ervilhas, soja), plantas oleosas (colza, mostarda, papoila, azeitonas, girassóis, cocos, plantas com óleo de rícino, sementes de cacau, amendoins), plantas pepinosas (pepino, ervilha de grão, melões), plantas fibrosas (algodão, linho, cânhamo, juta), frutos citrinos (laranjas, limões, toranja, tangerina), vegetais (espinafres, alface, espargos,

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 19 couves e outras brássicas, cenouras, cebolas, tomates, batatas, pimentão doce), lauráceas (abacates, canela, cânfora), árvores de folha caduca e coníferas (e.g. tílias, teixos, carvalhos, amieiros, álamos, vidoeiros, abetos, lariços, pinheiros) ou plantas como o milho, turfa, tabaco, noz, café, cana de açúcar, chá, videira, lúpulo, bananas e plantas de borracha natural, bem como plantas ornamentais. Em todos os casos, o modo preferido de aplicação é por pulverização das folhas. É geralmente importante obter um bom controlo das pragas nas fases iniciais do crescimento da planta, uma vez que esta é a altura em que a planta pode ser danificada de forma mais grave. O líquido ou o pó de pulverização podem conter de forma conveniente, outro pesticida, se for considerado necessário. Numa concretização preferida, a composição de acordo com o invento é aplicada directamente na planta.

As composições de acordo com o presente invento podem ser eficazes contra pragas que incluem, mas não se lhes limitam, pragas da ordem Lepidoptera, e.g. Achroia griselia, Aderis g/overana, Aderis variaria, Adoxophyes oraria, Agrotis ipsilon, Alabama argiiiacea, Aisophiia pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehnieiia, Anarsia lineatella, Anisota senatoría, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Buccufatrix thurberieiia, Cadra cauteila, Choristoneura sp., Cochy/ls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephaionica, Cydia iatiferreanus, Cydia pomonelia, Datana integerrima, Dendro/imus sibericus, Desmia funeraiis, Diaphania hyaiinata, Diaphania nitidaiis, Diatraea grandiosel/a, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma ioftini, Ephestia e/uteifa, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoeiiia ambigueiia, Eupoed/ia ambigueiia, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Gaiieria mellonella, Graphofíta molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Heiicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemi/euca oiiviae, Homoeosoma eiecteiium, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fisceiiaria fisceiiaria, Lambdina fisceiiaria iugubrosa, Leucoma sa/icis, Lobesia botrana, Loxostege stictica/is, Lymantria dispar, Maca/la thyrsisaiis, Ma/acosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemacuiata, Manduca sexta, Maruca testula/is, Meianchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubiiaiis, Paieacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiei/a, Phryganidia californica, Phyllonorycter b/ancarde/ia, Pieris napi, Pieris rapae, Piathypena scabra, Platynota f/ouendana, Platynota

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 20 stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia indudens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerea/ella, SpUonota ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bosselliella, Tríchoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Diptera e.g. Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anophe/es quadrimacu/atus, Armigeres subalbatus, Cal/iphora stygia, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia mace/laria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes coro/lae, Giossina austeni, G/ossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina moristans morsitans, Glossina moristans submorsitans, G/ossina paUidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hydoderma Hneatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetio/a destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobelleria sp., Nephrotoma suturaiis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Ph/ebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa; Coleoptera, e.g. Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, EpUachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cy/as formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subesp.inosus, Popilla japonica, Rhizotrogus majalis, Aplphitoblus diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor; Acari, e.g. Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; Hymenoptera, e.g. Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera, e.g. Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angustico/lis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, fncisitermes immigrans; Siphonaptera, e.g. Ceratophyllus ga/linae, Ceratophyllus niger, Nosopsy/lus fasciatus, Leptopsylla segnis, Cfenocephalldes canis, Ctenocephalldes fe/is, Echicnophaga gaf/inacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsy/la vexabUis, Tunga penetrans; Tylenchida, e.g. Me/odidogyne incógnita, Pratylenchus penetrans.

Os exemplos seguintes são apresentados a título ilustrativo

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 21 6. EXEMPLO: CARACTERIZAÇÃO DE la

Tal como aqui descrito em pormenor la é recuperado e purificado. A caracterização de la é descrita em pormenor infra. 6.1. RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE la

Faz-se a fermentação de B. thuringiensis subesp. kurstaki estirpe EMCC0086 (depositada no NRRL como B-21147) durante 72 horas, a 30°C, num meio constituído por uma fonte de carbono, como amido, amido hidrolisado ou glucose, e uma fonte de azoto, como uma proteína, proteína hidrolisada ou extracto solúvel de maceração do milho. A produção de la é detectada a 13 horas de fermentação. Verifica-se um pico de actividade a aproximadamente 30 horas.

Recupera-se o sobrenadante da fermentação de B. thuringiensis subesp. kurstaki por centrifugação e em seguida clarifica-se por ultrafiltração através de uma membrana de MW-CO (limite de exclusão de peso molecular) de 30 kDa, utilizando um sistema UF Rhone Poulenc. A filtração de 30 kDa removeu quaisquer restos celulares, delta-endotoxina cristalina, esporos, e proteínas solúveis com uma massa molecular superior a 30 kDa, remanescentes. O permeato é concentrado 10 vezes por evaporação. O permeato é centrifugado e em seguida filtrado através de 0,2 μ para remoção adicional de material insolúvel do caldo, resultando um caldo límpido que contém la. A purificação de la até à homogeneidade é conseguida utilizando um processo de purificação de múltiplos passos, apresentado de forma esquemática na Figura 1. Juntamente com o protocolo de recuperação acima descrito, a purificação prosseguiu com um passo de ultrafiltração a 5 kDa. O permeato da ultrafiltração a 5 kDa é adsorvido numa resina de permuta catiónica Sulfopryl (SP) e eluído com uma solução de acetato de amónio. O composto é em seguida concentrado aproximadamente 30x por liofilização, e o sal e outros contaminantes são removidos com uma coluna de exclusão por tamanhos P2 da BioRad. O conjunto reunido da coluna P2 é corrido numa coluna de permuta catiónica SP de HPLC de alta resolução, o que originou um composto

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 22 homogéneo. Ο sal contaminante é removido por liofilização repetida. A actividade é monitorizada por um mícro-bioensaio de Spodoptera exígua e a pureza é determinada por electroforese capilar. A amostra que consistia em 50 μΙ de la e 50 μΙ de proteína CrylA(c) (15 pg/ml) purificada a partir de BIOBIT™ FC (100 μΙ) é aplicada a poços individuais de um tabuleiro gelatinoso que contém 500 μΙ de dieta de insecto artificial solidificada. Os tabuleiros que contêm as várias amostras são secos ao ar. Adicionam-se dois a quatro Spodoptera exígua da 2a ou início da 3a instar aos poços que contêm a amostra seca. Os poços são selados com uma cobertura de "myíar" perfurada e são incubados 2-3 dias a 30°C. O nível de atraso do crescimento e a percentagem de mortalidade são então registados. Tipicamente, correm-se 5 poços réplica para cada amostra.

6.2. ELUCIDAÇÃO DA ESTRUTURA

Verificou-se que o composto activo é solúvel em água mas não é solúvel em solventes orgânicos. É carregado positivamente e reagiu com ninidrina, como evidenciado por cromatografia em camada fina de sílica. 0 RMN de 13C e de protões do composto são apresentados na Figura 2 e 3, respectivamente. As experiências de RMN de 13C revelaram a presença de 13 carbonos. Uma experiência DEPT determinou que existem três carbonos quaternários(C), sete metinos (CH), três metilenos (CH2) e nenhum grupo metilo (CH3). Utilizando experiências de acoplamento de protões como o desacoplamento 1-D e COSY, identifica-se um sistema de spin largo contendo oito carbonos. Para além disso, está presente um sistema de spin menor que consiste em dois carbonos. Uma experiência de correlação bidimensional de carbono-protão (HETCOR) permitiu atribuir a ressonância de cada protão na molécula ao seu carbono ligado (veja-se Figura 4). O tratamento do composto activo (13 mg) com anidrido acético em piridina resultou na formação de um derivado acetilado que é muito menos polar. Este derivado é purificado por HPLC para originar 3 mg de derivado acetilado puro. A análise de espectroscopia de massa revelou que o derivado tem 7 acetatos e um peso molecular de 690, o que origina um peso molecular de 396 e indica que está presente um número par de azotos. Além disso,

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 23 também são detectados fragmentos de 6 acetatos e 5 acetatos. Os dados de alta resolução para os iões filhos dos 5 e 6 acetatos são 645,2594 (6 acetatos) e 607,2519 (5 acetatos), o que indica a seguinte fórmula molecular para la, 3^28^6^8- O tratamento do composto activo (13 mg) com HCI 6N originou um derivado que é positivo para ninidrina. Estes resultados indicam a presença de ligações peptídicas. O derivado tinha o mesmo valor de Rf, tal como determinado por cromatografia em camada fina, que o ácido 2,3-diaminopropiónico. Estes resultados juntamente com os dados de RMN, sugerem a presença de ácido 2,3,-diaminopropiónico.

Foi elucidada a seguinte estrutura para la:

Esta pode ser classificada como uma ureidoamida. Os constituintes incluem 2 carboxilos (1 amidado), uma ureia, três grupos amino, e quatro hidroxilo. Contém sete centros quirais. 6.3. PROPRIEDADES DE la

Verificou-se que o la isolado potência a actividade das proteínas pesticidas delta-endotoxinas cristalinas de BaciHus thuríngiensis subesp. kurstaki e BaciHus thuríngiensis subesp. aizawai contra Spodoptera exigua, independentemente da forma das proteínas pesticidas. A actividade pesticida dos cristais isolados, formulados, de proteínas CrylA de comprimento total (130 kDa de massa molecular) ou truncadas (-65 kDa de massa molecular), de B.t.k. são todos potenciados. A actividade de inclusões de Cryll e CrylC também, é potenciada. Também se verifica que potência a actividade das proteínas individuais truncadas CrylA(a), (b) e (c). Verifica-se que o tempo de incubação de la com a proteína Cry não é crítico para a bioactividade. No entanto, o la é 24 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ inactivo sozinho. Verifica-se que o nível de potenciação é de 100-200 vezes para as proteínas Cryla truncadas, inclusões Cryll e CrylC e aproximadamente de 320 vezes para Cryla(c) de comprimento total (vejam-se as tabelas I e II, respectivamente). Especificamente, para a proteína de comprimento total, 0,75 pg/ml de CrylA(c) produziram a mesma pontuação de mortalidade/atraso do crescimento do insecto quando o la está incluso, que 240 pg/ml de CrylA(c) sozinho. No caso de CrylA(c) truncado, uma DO280 de 0,0006 resultou na mesma pontuação para o atraso do crescimento em combinação com la, do que a mesma amostra de CrylA(c) testada sozinha com uma D0280 de 0,075. As inclusões de Cryll, numa concentração de 0,6 pg/ml originaram a mesma pontuação para o atraso do crescimento e uma mortalidade semelhante em combinação com la, do que a proteína Cryll sozinha a 75 pg/ml, uma potenciação de 125 vezes. As inclusões de CrylC, a 0,3 pg/ml com a adição de la originaram uma mortalidade e uma pontuação para o atraso do crescimento semelhantes a 75 pg/ml da proteína CrylC sozinha, o que reflecte um nível de potenciação de 250 vezes. A concentração da proteína CrylA que atrasou o crescimento, conduziu à morte por adição de la.

Verificou-se que o la é estável após fervura durante 5 minutos, mós perde toda a actividade na autoclavagem (> 190°C). Além disso, é estável quando submetido à luz solar directa durante pelo menos 10 horas. O la é estável a pH 2 durante 3 dias, mas instável a pH 12. Verifica-se que perde toda a actividade quando exposto a ácido periódico ou HCI concentrado.

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 25 TABELA I EFEITOS POTENCIADORES DE la COM A PROTEÍNA DE Bt TRUNCADA PURIFICADA Proteína de Bt SoodoDtera Exiaua Tipo D0280 la Mortalidade* Pontuação do atraso do crescimentot Cryla(a) 0,055 - 0/5 2,2 0,040 - 0/5 2,2 0,020 - 0/5 2,0 0,020 + 2/5 0,0 0,010 + 0/5 0,2 0,005 + 0/5 0,0 0,0025 + 0/5 0,4 0,0012 + 0/5 1,8 0,0006 + 0/5 1,6 CrylA(c) 0,075 - 0/5 3,4 0,040 - 0/5 2,6 0,020 - 0/5 2,8 0,020 + 1/5 0,0 0,010 + 0/5 0,2 0,005 + 1/5 0,0 0,0025 + 2/5 2,0 0,0012 + 0/5 1,0 0,0006 + 1/5 1,0 Nenhum NA + 0/5 4,0 Nenhum NA - 0/5 4,0 * Mortalidade = #insectos mortos / #total de insectos após 2 dias t A Pontuação do atraso do crescimento é definida pelo tamanho médio das larvas de insecto vivas no final do bioensaio: 4,0= controlo não tratado, 3,0= 75% do tamanho do controlo não tratado, 2,0 = 50% do tamanho do controlo não tratado, 1,0= 25% do tamanho do controlo não tratado, 0,0= nenhum' crescimento ou tamanho não alterado desde o início da experiência.

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 26 TABELA II EFEITOS POTENCIADORES DE la COM A PROTEÍNA DE Bt Proteína de Bt Spodoptera Exiaua Tido μα/ml la Mortalidade* Pontuação do atraso do crescimento t CrylA(c) 240 — 1/5 0,5 120 — 0/5 2,2 60 — 0/5 2,2 30 - 0/5 4,0 60 + 5/5 30 + 5/5 15 + 4/5 0,0 3 + 4/5 1,0 0,8 + 2/5 1,6 Cryll 300 — 1/5 0,8 150 — 2/5 0,7 75 — 1/5 0,2 38 - 0/5 0,8 19 - 0/5 1,6 9 - 0/5 1,8 5 - 1/5 4,0 38 + 3/5 1,0 19 + 2/5 0,5 9 + 3/5 0,0 5 + 1/5 0,5 2,4 + 1/5 0,0 1,2 + 3/5 0,5 0,6 + 2/5 0,3 Cryll 300 — 2/5 0,3 150 — 2/5 0,0 75 — 1/5 0,8 38 - 0/5 3,2 38 + 5/5 — 19 5/5 — 9 + 5/5 — 5 + 4/5 0,0 2,4 + 1/5 0,0 1,2 + 5/5 — 0,6 + 3/5 1,5 0,3 + 2/5 1,3 Nenhum NA - 0/5 4,0 Nenhum NA + 0/5 4,0 * Mortalidade = tfinsectos mortos / #total de insectos após 2 dias t a Pontuação do atraso do crescimento é. definida pelo tamanho médio das larvas de insecto vivas no final do bioensaio: 4,0= controlo não tratado, 3,0= 75% do tamanho do controlo não tratado, 2,0= 50% do tamanho do controlo não tratado, 1,0= 25% do tamanho do controlo não tratado, 0,0 = nenhum crescimento ou tamanho não alterado desde o início da experiência.

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 6.4 AVALIAÇÃO DE OUTRAS SUBESPÉCIES DE Baci/lus thurinaiensis E OUTRAS ESPÉCIES DE BaciHi

Faz-se a avaliação de várias espécies de Bacillus para a produção de la. Faz-se a fermentação das estirpes durante 72 horas a 30°C num meio constituído por uma fonte de carbono, como amido, amido hidrolisado ou glucose e uma fonte de azoto, como uma proteína, proteína hidrolisada, ou extracto solúvel de maceração do milho. Testam-se os sobrenadantes quanto à produção de la utilizando o micro-bioensaio de Spodoptera exigua descrito supra. Verificou-se que o B. thuringiensis subesp. aizawai estirpe EMCC0087 (depositada no NRRL como NRRL B-21148) e o B. thuringiensis subesp. ga/leriae (depositada no NRRL) produzem la aproximadamente na mesma concentração que o B. thuringiensis subesp. kurstaki. 0 la é também produzido em B. subtiiis, B. cereus, B.t. subesp. alesti, B.t. subesp. canadiensis, B.t. subesp. darmstadiensis, B.t. subesp. dendrolimus, B.t. subesp. entomocidus, B.t. subesp. finitimus, B.t. subesp. israelensis, B.t. subesp. kenyae, B.t. subesp. morrisoni, B.t. subesp. subtoxicus, B.t. subesp. tenebrionis, B.t. subesp. thuringiensis, e B.t. subesp. toumanoffi, B. cereus, B. subtiiis e B. thuringiensis subesp. kurstaki mutante cry- spo-, tal como determinado por electroforese capilar.

Especificamente, utiliza-se um sistema de electroforese capilar P/ACE Beckman, equipado com um capilar não revestido de 50 μιτ> x 57 cm, tampão fosfato 0,2 M pH 6,8, voltagem a 15 KV e detecção a 200 nm para a quantificação do nível de la. Os volumes de amostra são de 20 nl com um tempo de operação de 25 minutos.

Constrói-se uma curva padrão utilizando la purificado como padrão a níveis de 1,25mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml e 0,078 mg/ml. Obtém-se uma curva de calibração linear. Utiliza-se a equação y=mx+b resultante para obter a concentração de la em cada amostra.

Antes de cada operação, o capilar é passado com tampão de operação (fosfato 0,2 M, pH 6,8) durante três minutos. Após cada operação de 25 minutos, o capilar é passado com NaOH 1N durante 1 minuto, água para HPLC

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 28 filtrada durante 1 minuto, ácido fosfórico 0,5 M durante 3 minutos e água para HPLC filtrada durante 1 minuto. Faz-se a integração da área sob cada pico e determina-se a área do pico e calcula-se uma concentração final a partir da curva padrão. 6.5 AVALIAÇÃO DE PRODUTOS DE B.t. A quantidade de la presente em vários produtos de B.t. comercialmente disponíveis é determinada por electroforese capilar descrita na secção 6.4 supra. O BACTOSPEINE™, o JAVELIN™, o NOVODOR™, o SPHERIMOS™, o BACTIMOS™, o FORAY™, o FLORBAC™ e o BIOBIT™ são obtidos da Novo Nordisk A/S. O XENTARI™ e o DIPEL™ são obtidos da Abbott Laboratories. O AGREE™ é obtido da Ciba-Geigy; o MVP™ é obtido da Mycogen e o CUTLASS™ é obtido da Ecogen.

Os resultados são apresentados na tabela III infra e indicam que o la está presente em quantidades variáveis, desde menos de 0,001 g de la/BIU até 0,71 g de la/BIU. (Segue Tabela III)

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 29

TABELA III la EM PRODUTOS DE Bacillus thuringiensis PRODUTO tipo Número de lote JAVELIN™ WG Btk 9942281 XENTARI™ Bta 58715PG AGREE™ BIOBIT™ HPWP Bta/Btk RA208004 BIOBIT™ FC Btk 5012 FORAY™ 48B Btk AG46669071 DIPEL™ Btk BBN7018 FORAY™ 76B BACTOSPEINE™ Btk 58739PG BACTOSPEINE™ Btk BACTOSPEINE™ Btk B0B001 NOVODOR™ FLORBAC™ Btk KX02A SPHERIMOS™ Btk WP MVP™ Btt 9024 CUTLASS™ Bta 082-31-1 BACTIMOS™ B.sphr BSN006 Btk 21193542 Btk/Btk Bti BIB0024

Potência g la/BIU 32000 lU/mg 0,071 15000 lU/mg 0,06 25000 lU/mg 0,033 48950 U/mg PIA 0,018 8 BIU/L 0,013 12,6 BIU/L 0,012 32 000 lU/mG 0,011 20,0 BIU/L 0,007 1 23 653 lU/mg 0,003 100 000 lU/mg 0,003 1 6 000 lU/mg <0,001 1 6,3 Milhões LTU/qt 9,5 x10'9 g/LTU 30 000 U/mg E <0,001 nenhum nenhum nenhum 11 700 lU/mg nenhum

6.6 BIOENSAIOS DE INCORPORAÇÃO NA DIETA A actividade do B.t.k. é determinada por um bioensaio de incorporação numa dieta artificial utilizando larvas de terceira instar de Spodoptera exigua, larvas de segunda instar de Helicoverpa zea, larvas de terceira instar de Spodoptera frugiperda, larvas de segunda instar de He/iothis virescens, larvas de terceira instar de Tríchoplusia ni, larvas de terceira instar de Pseudop/usia includens, larvas de terceira instar de Plutella xylostella, larvas de terceira instar

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ de Spodoptera littoralis e larvas de terceira instar de Mamestra brassicae. A fim de determinar o nível de potenciação por adição de la a produtos de B.t. e para estabelecer a gama de insectos afectados, realizam-se bioensaios de incorporação na dieta. Nas experiências com concentrações elevadas de la contra Spodoptera exigua (7,4 - 23,7 g la/BIU), utiliza-se la purificado (70% de ingrediente activo, 30% de contra-ião acetato) para potenciar o BIOBIT™ FC (FC representa concentrado fluente). Os restantes dados apresentados na tabela IV mostram que a potenciação de BIOBIT™ HPWP (pó molhável de potência elevada) com la (0,658% de ingrediente activo). O S. littoralis e o M. brassicae são testados utilizando FLORBAC™ HPWP e la.

Pesam-se os vários produtos de B.t. e adiciona-se la de modo a obter 0,1 a 237 g la/BIU. Ajusta-se o volume com Tween™ a 0,1%. As amostras são submetidas a ultra-sons durante 1 minuto e em seguida diluídas para o volume final. Também se preparam amostras simples (sem la) e substâncias de referência. As substâncias referência incluem B.t.k. HD-1-S-1980 (obtido da NRRL), a que é atribuída uma potência de 1 6 000 unidades internacionais (IU) por miligrama e JAVELIN™ WG a que foi atribuída uma potência de 53 000 Unidades de Spodoptera!mg (SU).

As dietas artificiais padrão constituídas por água, ágar, açúcar, caseína, gérmen de trigo, metilparabeno, ácido sórbico, óleo de linhaça, celulose, sais e vitaminas são preparadas numa caldeira aquecida de 20 I. Isto proporciona dieta suficiente para testar 10 a 12 amostras com sete concentrações diferentes de cada substância de teste. As soluções de B.t. são diluídas em série para originar alíquotas de 16 ml. Cada alíquota é adicionada a 1 84 g de dieta fundida. A mistura é subsequentemente homogeneizada e em seguida vazada num tabuleiro de plástico com 40 células individuais. Preparam-se três tabuleiros para cada lote de dieta. Após a dieta ter arrefecido e solidificado, adiciona-se' um insecto de idade conhecida (2-3 instar) a cada célula e tapam-se os tabuleiros com uma folha de "mylar" transparente, perfurada. Colocam-se os tabuleiros em prateleiras e incubam-se durante quatro dias a 28°C e 65% de humidade relativa.

Após quatro dias, contabiliza-se a mortalidade dos insectos. Cada

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 31 tabuleiro é soprado com força contra o topo de uma mesa e as larvas que não se mexem são contabilizadas como mortas. Calcula-se a percentagem de mortalidade e analisam-se os dados por meio de uma análise probit paralela. Estimam-se as LC50, LCgo, o declive das linhas de regressão, o coeficiente de variação e as potências. As amostras são corridas um mínimo de 3 vezes ou até três potências estarem dentro de 20% da média calculada para cada amostra. Para calcular o aumento na actividade associado com cada concentração de la, corrige-se a LC50 da amostra de B.t.lla para reflectir a quantidade de B.t. na amostra. As LC50 das amostras simples emparelhadas são divididas pelos valores de LC50 corrigidos, para se obter a dimensão da redução da LC50 associada com la.

Utiliza-se o processo seguinte para o ensaio de Lobesia bothrana. Recolhem-se uvas atacadas pela Lobesia bothrana num campo não pulverizado e removem-se as larvas. Fazem-se diluições em série de la (250 pg/ml, 500 pg/ml e 1000 pg/ml) em água. Coloca-se uma larva no meio da placa de Petri. Se se verifica que a larva bebe, esta é transferida para uma placa de Petri com bagos de uvas recentemente cortados. As larvas são armazenadas a 22°C durante 3-4 dias.

Como mostrado na tabela IV, observam-se reduções significativas nas LC50 para todas as espécies. (Segue Tabela) 32 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ

TABELA IV

Bioensaios de incorporação na dieta

Aumento na actividade Insecto α de la oor BIU Dimensão da Redução de LCKn (n° de x) Spodoptera exígua 0,1 1,5 (BIOBIT™ HPWP) 0,2 1,7 2,0 4,3 4,0 7,5 Spodop tera exígua 7,4 13 (BIOBIT™ FC) 15 26 30 34 118 59 237 79 Spodoptera frugiperda 0,2 2,2 (BIOBIT™ HPWP) 0,8 3,9 2,0 7,2 4,0 11,6 Trichoplusia ni 0,1 1,1 (BIOBIT™ HPWP) 0,2 1,2 2,0 2,0 4,0 3,1 Pseudop/usia includens 0,1 0 (BIOBIT™ HPWP) 0,2 1,2 0,8 2,1 2,0 2,4 4,0 3,4 Píuteíía xyloste/la 0,2 1,6 (BIOBIT™ HPWP) 0,8 1,3 2,0 1,4 4,0 1,9 Heíicoverpa zea (BIOBIT™ HPWP) 3,2 12,6 Heliothie virescens (BIOBIT™ HPWP) 3,2 4,2 Lobesia bothrana (BIOBIT™ HPWP) 2,0 3,0 Spodoptera littoralis (FLORBAC™ HPWP) 2,0 8,6 Mamestra brassicae (FLORBAC™ HPWP) 2,0 4,9 33 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ A potenciação de vários produtos pelo la na Spodoptera exigua é determinada utilizando os bioensaios de incorporação em dietas descritos supra. As quantidades de la adicionado/BIU de produto são apresentadas na tabela V, infra. A mistura de produtos la/B.t. é incorporada numa dieta de caseína de gérmen de trigo à base de ágar. Fornece-se a dieta aos insectos durante quatro dias e mantêm-se a 28°C. Regista-se a mortalidade e analisa-se por meio de uma análise probit. Calculam-se a LC50, a LC90 e a potência a partir do produto correspondente que não contém la. Os resultados apresentados na tabela V indicam que o la potência vários produtos de B.t.k. e de B.t.a., obtidos a partir de várias fontes. As estirpes de B.t. contidas nestes produtos são descritas na secção 5.2, supra.

TABELA V

Potenciação de produtos de B. t. na Spodoptera exigua

Aumento na actividade

Produto α de la Dor BIU Grandeza da írV BACTOSPEINE™ WP 0,4 1,7 1,04 CONDOR ™ 0,4 2,3 1,7 2,4 AGREE ™ 0,4 5,1 CUTLASS™ 1,7 1,1 0,4 1,6 MVP ™ 1,7 1,1 0,4 2,5 FLORBAC ™ HPWP 1,7 2,0 6,0 7,7 DIPEL ™ 2X 0,2 12,1 0,8 1,1 0,2 2,0 JAVELIN ™ WG 0,8 1,2 2,0 2,3 XENTARI ™ 0,2 3,9 0,8 0 2,0 1,08 0,2 2,9 0,8 1,2 2,0 1,6 2,4 i50

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 34

6.7 BIOENSAIOS FOLIARES

Os bioensaios foliares são realizados com larvas de segunda instar de Spodoptera exigua em plantas de brócolos, utilizando BIOBIT™ FC e la. A razão entre la e BIOBIT™ FC é a mesma 2 g la/BIU BIOBIT™ FC. Os tratamentos são aplicados aos brócolos através de um "sistema de pulverização em sulcos" num / e volume de transportador de 20 galões por acre. As folhas são excisadas das plantas após o depósito do pulverizado ter secado e são infestadas com larvas de segunda instar de Spodoptera exigua. Os resultados são apresentados na tabela VI, infra. Observa-se uma mortalidade de 100% a uma taxa de 8,7 BlU/hectare de BIOBIT™ FC + la enquanto que o BIOBIT™ FC sozinho matou 92% das larvas a 58,8 BlU/hectare e 8% a 17,6 BlU/hectare, As plantas tratadas são também colocadas sob luz solar directa durante oito horas, após o que as folhas são excisadas e infestadas. Após oito horas sob luz solar, o BIOBIT™ sozinho a 58,8 BlU/hectare originou 27% de mortalidade, enquanto que o BIOBIT™ FC + la originou 100% de mortalidade a 8,7 BlU/hectare.

Num teste foliar realizado com larvas do início do quarto instar que receberam BIOBIT™ FC sozinho obteve-se 75% de mortalidade a 52 BlU/hectare e o BIOBIT™ FC (FC é concentrado fluente) + la originou 100% de mortalidade a 13 BlU/hectare. Tratamento BlU/hectare TABELA VI Bioensaios foliares % mortalidade "instar" larvar BIOBIT™ FC 58,8 92% 2 BIOBIT™ FC 17,6 8% 2 BIOBIT™ FC + la 8,7 100% 2 BIOBIT™ FC + 8h de luz solar 58,8 27% 2 BIOBIT™ FC + la + 8h de luz solar 8,7 100% 2 BIOBIT™ FC 52 75% 4 BIOBIT™ FC + la 13 100% 4

83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 35

6.8 ENSAIOS DE CAMPO

Os ensaios de campo em sementes de garbonzo (Spodoptera exigua) demonstraram que o BIOBIT™ FC sozinho a 70 BlU/hectare originou 51% do controlo, enquanto que 2 g de la/BIU BIOBIT™ a 40 BlU/hectare originaram 89% do controlo (relativo a nenhum tratamento). O JAVELIN™ WG a 45 BlU/hectare originou 51 % do controlo. Os ensaios de campo com milho doce (Spodoptera frugiperda) demonstraram que a 39,5 BlU/hectare, 2 g la/BIU BIOBIT™ FC proporcionaram 84% do controlo.

6.9 RAZÕES DE RESISTÊNCIA

Fazem-se bioensaios em colónias de Plutella xylostella susceptíveis e resistentes. As traças resistentes são amostras colhidas em campo na Florida, que desenvolveram resistência a B.t. após exposição intensiva a JAVELIN™ WG. Analisa-se o BIOBIT™ HPWP com la, utilizando um bioensaio de imersão da folha. A resistência a JAVELIN™ e a XENTARI™ é testada sem la. Mergulham-se discos de folha de couve de seis cm de diâmetro durante 10 segundos numa de oito concentrações diferentes de produtos de B.t. ou formulações de B.t.Aa. As concentrações variam entre 1 a 1000 ppm. Os discos de folha são deixados secar ao ar durante duas horas e são colocados em placas de Petri de plástico com larvas de segunda instar (0,2 a 0,4 mg). Fazem-se duas réplicas de vinte e cinco insectos/dose/dia, de modo a obter 50 insectos/dose. Após 72 horas a 27°C regista-se a mortalidade. A regressão entre a dose e a mortalidade é analisada por análise probit. As razões de resistência são calculadas dividindo os valores de LC50 e LC90 das traças susceptíveis. Os resultados são apresentados na tabela VII e indicam que o BIOBIT™ HPWP é potenciado com 2 g de la/BIU e 4 g la/BIU. Especificamente, com 4 g de la/BIU há um decréscimo de 2 vezes na razão de resistência LC50 e um decréscimo de 10 vezes na razão de resistência lc90.

I 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ

TABELA VII

Razões de resistência de Plutella xylostefla (resistente a B.t.k.) PRODUTO TESTADO RR LC50 RR LCgo JAVELIN™ WG 302,6 3829,7 BIOBIT™ HPWP 20,5 98,5 2,0 g la/BIU 23,2 88,0 BIOBIT™ HPWP 4,0 g la/BIU 10,4 11,5 BIOBIt™ HPWP XENTARI™ 9,7 8,2

7. DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

As estirpes seguintes de Bacillus thuringiensis foram depositadas de acordo com o tratado de Budapeste na Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Estirpe Número de acesso Data de depósito EMCC0086 NRRL B-21147 6 de Outubro, 1993 EMCC0087 NRRL B-21148 6 de Outubro, 1993

As estirpes foram depositadas sob condições que asseguram que o acesso à cultura estará disponível durante o período de pendência deste pedido de patente, a quem de direito, determinado pelo Comissário para Patentes e Marcas Registadas, nos termos de 37 C.F.R. §1.14 e 35 U.S.C. §122. O depósito representa uma cultura substancialmente pura de cada estirpe depositada. O depósito é disponibilizado quando solicitado por legislação estrangeira sobre patentes em países onde sejam apresentadas contrapartidas do pedido em questão, ou a sua progenia. No entanto, deverá entender-se que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar o presente invento com prejuízo dos direitos de patente concedidos por acção governamental. 37 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ

Lisboa,17 m. 2000

Por ABBOTT LABORATORIES - O AGENTE OFICIAL -

O ADJUNTO

AUTÓMIO J0ÂO· FERRESIÂ' . Of. Pr. Ind.

Rue ebs Flores, 74 - 4.* ieoo LISBOA

Claims (30)

1. 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Factor que se obtém a partir do sobrenadante da fermentação de uma estirpe de Bacillus e que potência a actividade pesticida de um pesticida relacionado com Bacillus thuringiensis, em que o referido factor contém 13 carbonos, é solúvel em água, é estável a 100°C durante pelo menos 5 minutos, é estável quando submetido a luz ultravioleta durante pelo menos 10 horas e é estável a pH 2, durante 3 dias.
2. 2. Factor de acordo com a reivindicação 1 em que o referido factor tem desvios de 1H RMN a 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35.
3. 3. Factor de acordo com a reivindicação 1, em que o factor tem um peso molecular de 350 a 700.
4. 4. Factor de acordo com a reivindicação 1 em que o pesticida relacionado com Bacillus thuringiensis compreende uma estirpe de Bacillus thuringiensis e um transportador aceitável.
5. 5. Factor de acordo com a reivindicação 1 em que o pesticida relacionado com Bacillus thuringiensis compreende um esporo de uma estirpe de Bacillus thuringiensis e um transportador aceitável para pesticidas.
6. 6. Factor de acordo com a reivindicação 1 em que o pesticida relacionado com Bacillus thuringiensis compreende uma proteína de uma estirpe de Bacillus thuringiensis ou um seu fragmento, com actividade contra uma praga, e um transportador aceitável para pesticidas.
7. 7. Factor de acordo com a reivindicação 6 em que a proteína de uma estirpe de Bacillus thuringiensis é uma delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis.
8. 8. Factor com a estrutura (I) 83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ

   2/5

   em que R1 é amino, hidroxi, alquilo C^o, benzamida, 3,5-dinitrobenzamida, p-nitrobenzamida, halobenzamida, alquilbenzamida, tiofenamida, furanamida, pirrolamida, imidazolamida, pirazolamida, alquilC·,. 10amino, dialquilC^oamino, éster de alquilo C^io ou benzilo, halogéneo ou alcoxiC·,.^; R2 é (CH2)n; em que n é um número inteiro de 0-10; R3 e R4 são independentemente (NH)p, em que p é 0 ou 1 ; CH2X1 O R5 é CH-CHX2-CH2-CHX3-CHX4-CHX5-CHX6-CX7 ou (CHOH)qCH2OH em que X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 são independentemente NH2/ OH, acetilo, halogéneo ou alcoxi Ct.to e q é um número inteiro de 1-10; R6 é hidroxilo, amino, um alcoxi Ci_10 ou benzoxi, éster benzílico, éster 3,5-dinitrobenzílico, éster p-nitrobenzílico, éster halobenzílico, éster alquilbenzílico, éster de tiofeno, éster de furano, éster de pirrolo, éster de imidazolo, ou um sal seu derivado aceitável para pesticidas.
9. 9. Factor de acordo com a reivindicação 8, em que o factor tem a estrutura (la)
10. 10. Factor que potência a actividade pesticida de um pesticida

    83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ 3/5 relacionado com Bacillus, em que o referido factor ou seu derivado é obtido por (a) fermentação de uma estirpe de Bacillus·, (b) recuperação do sobrenadante da fermentação de (a); e (c) isolamento do factor ou seu derivado do sobrenadante de (b).
11. 11. Factor de acordo com a reivindicação 10, em que o factor é obtido de um sobrenadante de fermentação de Bacillus subti/is. 2. Factor de acordo com a reivindicação 10 em que o factor é obtido a partir do sobrenadante da fermentação de Bacillus cereus.
12. 13. Factor de acordo com a reivindicação 10 em que o factor é obtido a partir do sobrenadante da fermentação de Bacillus thuringiensis.
13. 14. Factor de acordo com a reivindicação 13, em que o factor é obtido a partir do sobrenadante da fermentação de uma subespécie de Bacillus thuringiensis seleccionado a partir do grupo constituído por Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subesp. aizawai, Bacillus thuringiensis subesp. ga/leriae ou seus mutantes, que têm substancialmente a mesma actividade pesticida.
14. 15. Factor de acordo com a reivindicação 13 em que o factor é obtido a partir de um sobrenadante da fermentação de Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki, ou de um seu mutante com actividade pesticida.
15. 16. Factor de acordo com a reivindicação 13 em que o factor é obtido a partir de um sobrenadante da fermentação de um mutante cry-spo" de Bacillus thuringiensis subesp. kurstaki.
16. 17. Composição pesticida que compreende (a) o factor de acordo com a' reivindicação 1 e (b) um pesticida relacionado com Bacillus thuringiensis, em que o factor está presente na referida composição numa quantidade de pelo menos 0,1 g por BIU.
17. 18. Composição pesticida que compreende (a) o factor de acordo com a reivindicação 1 e (b) um pesticida relacionado com Bacillus thuringiensis, em

    83 807 ΕΡ 0 670 677/ΡΤ que ο factor está presente na referida composição numa quantidade de pelo menos 0,05 g por g de delta-endotoxina e esporo de BaciHus thuringiensis.
18. 19. Composição de acordo com a reivindicação 17 ou 18 em que a referida composição compreende ainda um vírus com actividade contra uma praga e em que o referido factor potência também a actividade pesticida de um vírus com actividade contra uma praga.
19. 20. Composição de acordo com a reivindicação 17 ou 18 em que o BaciHus thuringiensis é seleccionado de entre o grupo constituído por BaciHus thuringiensis subesp. kurstaki e BaciHus thuringiensis subesp. aizawai.
20. 21. Composição pesticida que compreende (a) o factor de acordo com a reivindicação 1 e (b) um vírus com actividade contra uma praga.
21. 22. Composição pesticida que compreende (a) o factor de acordo com a reivindicação 1 e (b) um transportador para pesticida em que o factor está presente na referida composição numa quantidade de pelo menos 0,01% em peso.
22. 23. Método para o controlo de uma praga que compreende expor a praga a uma quantidade eficaz para o controlo da praga, da composição pesticida de acordo com a reivindicação 17, 18, 21 ou 22.
23. 24. Método de acordo com a reivindicação 23 em que a praga está presente numa planta transgénica.
24. 25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a planta transgénica contém um gene de BaciHus thuringiensis.
25. 26. Método de acordo com a reivindicação 24 em que a planta foi previamente exposta a um pesticida relacionado com BaciHus thuringiensis.
26. 27. Método para potenciar a actividade pesticida de um pesticida relacionado com BaciHus thuringiensis que compreende administrar a uma praga exposta a um pesticida relacionado com BaciHus thuringiensis a composição de 83 807 ΕΡ Ο 670 677/ΡΤ 5/5 acordo com a reivindicação 22, numa quantidade eficaz, para potenciar a actividade pesticida do referido pesticida relacionado com Bacillus thuringiensis.
27. 28. Método para obter o factor de acordo com a reivindicação 1 que compreende (a) fermentação de uma estirpe de Bacillus·, (b) recuperação do sobrenadante da fermentação de (a); e (c) isolamento do factor do sobrenadante de (b), para obter o factor substancialmente puro.
28. 29. Método para identificar o factor de acordo com reivindicação 1 que compreende (a) fermentação de uma estirpe de Bacillus-, (b) recuperação do sobrenadante da fermentação de (a); e (c) ensaio do sobrenadante de (b) para potenciação de um pesticida relacionado com Bacillus.
29. 30. Mutante ou variante de uma estirpe de Bacillus que produz o factor de acordo com a reivindicação 1.
30. 31. Método para a obtenção do mutante ou variante de acordo com a reivindicação 30 que compreende: (a) tratar a estirpe progenitora com um mutagénio, (b) crescer a estirpe progenitora mutada num meio adequado para a selecção de uma estirpe mutante; e (c) seleccionar a estirpe mutante. Lisboa, t7< jjfc 2000 Por ABBOTT LABORATORIES - O AGENTE OFICIAL -

    ENG.· ÂNTÓNI0 JOAO DA CUNHA FERREIRA Ag. Qf. Pr. Ind. Rga das Flores, 74 - 4.* 1S©Q LISBOA