PT785773E - Lipossomas de eteres lipidicos e sua utilizacao terapeutica - Google Patents
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Description
84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ
DESCRICÃO “Lipossomas de éteres lipídicos e sua utilização terapêutica” O presente invento refere-se a lipossomas de éteres lipídicos e à sua utilização terapêutica, por exemplo, no tratamento de cancros.
Os éteres lipídicos são análogos sintéticos do factor activador de plaquetas (PAF; 1-0-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina), um efector que se pensa em geral estar envolvido numa variedade de processos fisiológicos, como a inflamação, a resposta imunitária, reacções alérgicas e reprodução. Verificou-se que os éteres lipídicos são agentes antitumorais eficazes em animais, e pensa-se que são selectivamente citotóxicos para uma vasta variedade de células cancerosas (veja-se, por exemplo, Dietzfelbinger et al. (1993); Zeisig et al. (1993); Powis et al. (1990); Berdel (1991); Bhatia e Hadju (1991); Reed et al. (1991); Workman (1991); Workman et al. (1991); Bail e Dexter (1990); Berdel (1990); Counsell et al. (1990); Tritton e Hickman (1990); Muschiol et al. (1990), Layton et al. (1980); Runge et al. (1980); Patente da Grã-Bretanha No. 1 583 661; Patente dos EUA No. 3 752 886). Também se verificou que os éteres lipídicos são anti-metastásicos e anti-invasivos e que são capazes de induzir a diferenciação celular. Nenhuma destas descrições refere ensinamentos sobre éteres lipídicos lipossómicos com as propriedades vantajosas das formulações lipossómicas do presente invento. Vários éteres lipídicos são actualmente o objecto de estudos de ensaios clínicos.
Os mecanismos da citotoxicidade dos éteres lipídicos, apesar de não estarem definitivamente estabelecidos, parecem envolver uma acção na, e possível ruptura, da membrana celular. A citotoxicidade selectiva dos éteres lipídicos poderá envolver acumulação intracelular e actividade diferencial de enzimas de clivagem de alquilo. Os éteres lipídicos podem ser também inibidores selectivos de actividades de fosfatidilinositol-fosfolipase C e de proteína-quinase C, bem como da biossíntese de fosfatidilcolina.
Os éteres lipídicos podem, para além da sua actividade antitumoral, ser hemolíticos, ou seja, podem lisar os glóbulos vermelhos. Para além disso, os resultados de ensaios clínicos mostram que a administração de éteres lipídicos pode conduzir a uma disfunção hepática e desordens gastrointestinais. Os 04 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ
ψ I 2 requerentes verificaram que certas formulações lipossómicas de éteres lipídicos podem tamponar estas toxicidades.
SUMÁRIO DO INVENTO
Proporciona-se aqui um lipossoma constituído por uma bicamada lipídica que compreende um lípido com o grupo de cabeça derivatizado e um éter lipídico. De preferência, o lipossoma tem um diâmetro inferior a cerca de 200 nm, mais preferencialmente, de maior do que cerca de 50 nm, a menor que cerca de 200 nm. O lípido com o grupo de cabeça derivatizado é de preferência um fosfatidiletanolamina-ácido dicarboxílico. O ácido dicarboxílico, por exemplo, ácido glutáríco, sebácico, succínico ou tartárico é de preferência ácido glutárico. A Φ fosfatidiletanolamina (PE) é de preferência diplamitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE) ou dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Mais preferencialmente, o lípido com o grupo de cabeça derivatizado é DOPE-GA. O lípido com o grupo de cabeça derivatizado pode ser, mas não é necessário que o seja, um lípido capaz de melhorar a circulação O éter lipídico tem a fórmula química: CH^O-R, CH-Z-R2
I CH2-R3, em que R, é Υ,Υ^ Y2 é CH3 ou C02H e Y1 é (CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9. n1 é igual a zero ou é um número inteiro de 3 a 23; n3 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 21; n5 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 18; n7 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 15; n9 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 12; e cada um de n2, n4, n6 e n8 é independentemente igual a zero ou 1. A soma n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + +n9 é igual a um número inteiro de 3 a 23. Y2 é de preferência CH3 e R, é de preferência (CH2)n1CH3, isto é um hidrocarboneto saturado. O hidrocarboneto saturado preferido para R, é (CH2)17CH3. Z é de preferência O, mos também pode ser S. R2 também pode ser Y.,Y2 e
84 300 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ pode ser igual ou diferente de Rv De preferência R2 é (0(Χ1)ηιο(Χ2)ηΐ2^Χ3Χ4Χ5. Cada um de X1( X2, X3, X4 e X5 é independentemente hidrogénio ou flúor, mas é de preferência hidrogénio. n10 é igual a zero, 1 ou 2; n11 é igual a zero, 1 ou 2; e n12 é igual a zero ou a um número inteiro de 1 a 23, mas é de preferência zero. Quando n12 é zero, R2 é CX3X4X5, X3, X4 e X5 são de preferência H, e R2 é CH3. Quando n12 não é zero, a soma n10 + n11 é igual a 2, n12 é de preferência igual a 1 e R2é de preferência CH2CH3 CH2CF3, CF2CF3. R3 tem a fórmula R5-P(0)2-0-R6, R5 é O, S ou NH, mas é de preferência O e Re é CH2CH2N(CH3)3 (colina) CH2CH2NH2, CH2CH(OH)CH2OH, ou CH2CH2NHC(0)R7, mas é de preferência colina. Assim, R3 é de preferência -O-P(Q)2-0-CH2CH2N(CH3)3. R7 é Y2CH3 ou Y2C02H.
Assim, o éter lipídico preferido é: CH2-0-(CH2)17CH3 ch-o-ch3
I CH2-0-P(0)2-CH2CH2N(CH3)3, isto é, o éter lipídico é 1-0-octadecil-2-0-metil-sn-glicero-3-fosfocolina ("ET-18-OCH3"). O lipossoma de acordo com o invento pode também compreender um lípido neutro, como uma fosfatidilcolina (PC). De preferência, a PC é fosfatidilcolina de ovo (EPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) ou palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC). Mais preferencialmente, a PC é DOPC. O lipossoma pode compreender também um esterol, de preferência, colesterol. O lipossoma pode também compreender um lípido capaz de melhorar a circulação, que pode compreender uma fosfatidiletanolamina e um ácido dicarboxílico, gangliósido ou polietilenoglicol.
Numa concretização preferida do invento, o lipossoma tem uma bicamada lipídica que compreende um éter lipídico, um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, um esterol e um lípido neutro. De preferência, o éter lipídico é ET-18-OCH3, O lípido com o grupo de cabeça derivatizado é um fosfatidiletanolamina-ácido dicarboxílico, mais preferencialmente, DOPE-GA, o esterol é colesterol e o lípido neutro ó uma PC, maio prcfcrcncialmonto, DOPC. Λ
84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 4 bicamada compreende geralmente desde cerca de 10 porcento molar a cerca de 30 porcento molar, mais preferencialmente cerca de 20 porcento molar do éter lipídico, de cerca dc 5 porcento molar, a cerca de 20 porcento molar, mais preferencialmente cerca de 10 porcento molar do lípido com o grupo de cabeça derivatizado, de cerca de 10 porcento molar a cerca de 50 porcento molar, mais preferencialmente cerca de 30 porcento molar do esterol e de cerca de 10 porcento molar a cerca de 50 porcento molar, mais preferencialmente cerca de 40 porcento molar do lípido neutro. Mais preferencialmente, a bicamada compreende cerca de 20 porcento molar de "ET-18-OCH3", cerca de 10 porcento molar de DOPE-GA, cerca de 30 porcento molar de colesterol e cerca de 40 porcento molar de DOPC. O lipossoma pode compreender um agente bioactivo adicional, que é de φ preferência um agente antimicrobiano, um agente antineoplásico, um agente anti- inflamatório, um lípido terapêutico ou um agente estimulante do crescimento celular hematopoiético. O lipossoma pode ser desidratado. O presente invento também proporciona uma composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e o lipossoma de éter lipídico de acordo com o invento. Também se proporciona um método para a administração de um éter lipídico a um animal que compreende administrar ao animal uma composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende um éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico tem a fórmula química; CHjj-O-R, CH-Z-Rz
I ch2-r3.
De preferência o animal é um humano. De preferência o lipossoma tem um diâmetro inferior a cerca de 200 nm, mais preferencialmente, de maior que cerca de 50 nm, a menor de cerca de 200 nm.
De preferência, um hidrocarboneto saturado, mais preferencialmente (CH2)17CH3, está ligado na posição 1 do éter lipídico através de O. De preferência, R2 é (C(X1)n10(X2)n11CX3X4X5, mais preferencialmente Cl l3. De preferência, o grupo
84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 5 polar na posição 3 é fosforiicolina. Assim, o éter lipídico é de preferência 1 -0-octadecil-2-0-metil-sn-glicero-3-fosfocolina (ET-18-OCH3).
De preferência, o lípido com o grupo de cabeça derivatizado é uma PE-ácido dicarboxílico, mais preferencialmente DOPE-GA. O lípido derivatizado pode ser um lípido capaz de melhorar a circulação. De preferência, a bicamada compreende colesterol e fosfatidilcolina, mais preferencialmente EPC, POPC ou DOPC. O lipossoma pode também compreender um lípido capaz de melhorar a circulação.
Numa concretização do invento, particularmente preferida, o lipossoma compreende 20 porcento molar de um éter lipídico, de preferência ET-18-OCH3, cerca de 10 porcento molar de DOPE-GA, cerca de 30 porcento molar de colesterol e cerca de 40 porcento molar de DOPC. O método de acordo com o invento pode ser utilizado para administrar um éter lipídico a um animal que sofre de cancro, incluindo, mas não se limitando a carcinomas, leucemias, mielomas, neuroblastomas, sarcomas, dos pulmões, cérebro, ovários, cólon ou mama. Um método deste tipo compreende, geralmente, a administração a um animal de uma quantidade do lipossoma que compreende uma quantidade antineoplásica eficaz do éter lipídico. As quantidades antineoplásicas eficazes do éter lipídico lipossómico são geralmente de cerca de 0,1 mg do éter lipídico por kg de peso corporal do animal tratado, a cerca de 1000 mg do éter lipídico por kg de peso corporal. De preferência, a quantidade antineoplásica eficaz do éter lipídico lipossómico é de cerca de 1 mg do éter lipídico por kg de peso corporal a cerca de 500 mg por kg. Mais preferencialmente, a quantidade eficaz anti-cancro do éter lipídico, é de 200 mg por kg de peso corporal. Podem-se administrar quantidades eficazes anti-cancro de um éter lipídico lipossómico, em administrações múltiplas. Também se podem administrar doses múltiplas de um éter lipídico lipossómico, compreendendo cada dose uma quantidade eficaz anti-cancro do éter lipídico. As metástases, ou a invasão, do cancro podem ser inibidas pela administração do éter lipídico. O método de acordo com o presente invento também pode ser utilizado para administrar um éter lipídico a um animal que sofre de uma desordem inflamatória, e.g. uma condição artrítica, uma reacção alérgica ou desordem asmática. Um método deste tipo compreende, geralmente, a administração de uma quantidade anti-inflamatória eficaz do éter lipídico lipossómico ao animal. As quantidades ,ÍS**'' 84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ ti? . V jr
Jt anti-inflamatórias eficazes de éter lipídicos são, geralmente, de cerca de 0,1 mg do éter lipídico por kg de peso corporal do animal tratado a cerca de 1000 mg do éter lipídico por kg de peso corporal. O método de acordo com o presente invento pode também compreender a administração de um agente biologicamente activo juntamente com o éter lipídico administrado. Este agente biologicamente activo adicional, que pode estar associado, ou não associado ao lipossoma é, por exemplo, mas não se limita a, um agente antimicrobiano, um agente antineoplásico, um agente anti-inflamatório, lípido terapêutico ou agente estimulante do crescimento celular hematopoiético.
DESCRICÃO SUMÁRIA DOS DESENHOS FIGURA 1.
Efeitos do éter lipídico lipossómico nas metástases do pulmão em ratinhos. Formulação lipossómica: EPC/Colesterol/DPPE-GA/EL (4:3:1:2). Dose: 25 mg/kg x 5. Eixo dos xx: controlo de tampão, controlo de lipossoma (sem éter lipídico), éter lipídico livre, éter lipídico lipossómico; eixo dos yy: número de nódulos de tumor (média mais d.p.). FIGURA 2.
Efeitos do éter lipídico lipossómico nas metástases de pulmão em ratinhos. Formulação de lipossomas: DOPC/Col/DOPE-GA/EL (4:3:1:2). Dose: 5 injecções. Eixo dos xx: controlo de tampão, controlo de lipossoma, controlo de lipossoma, éter lipídico livre, éter lipídico lipossómico (dose de 25 mg/kg de peso corporal), éter lipídico lipossómico (dose de 100 mg por kg); eixo dos yy: número de nódulos de tumor (média mais d.p.).
DESCRICÃO PORMENORIZADA DO INVENTO O presente invento proporciona um lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende uma lípido com o grupo de cabeça derivatizado e um éter lipídico. Os lipossomas são estruturas que se auto-organizam, compreendendo uma ou mais bicamadas lipídicas, em que cada uma envolve um compartimento aquoso e compreende duas monocamadas opostas de moléculas de lípidos antipáticos. Estes compreendem uma região de cabeça polar (hidrófila), ligada de forma covalente a uma ou duas cadeias acilo não polares (hidrófobas). Pensa-se que os contactos energeticamente desfavoráveis entre as cadeias de acilo hidrófobas e o meio aquoso Induzem as moléculas lipídicas a reorganizarem-se, de forma a que os grupos de cabeça polares estejam orientados para o meio aquoso, enquanto que as cadeias de acilo se reorientam para o interior da bicamada. Forma-se uma estrutura energeticamente estável, em que as cadeias de acilo estão blindadas de forma eficaz contra um possível contacto com o meio aquoso.
Os lipossomas podem ser produzidos por uma variedade de métodos (para uma revisão, veja-se, por exemplo, Deamer e Uster (1983)). Estes métodos incluem, sem limitação: métodos de Bangham para a produção de lipossomas multilamelares (MLV); métodos de Lenk, Fountain e Cullis para a produção de MLV com uma distribuição de soluto intralameiar substancialmente igual (veja-se, por exemplo, Patente dos EUA Nos. 4 522 803, 4 588 578, 5 030 453, 5 169 637 e 4 975 282); e o método de evaporação de fase inversa de Paphadjopoulos et ai (Patente dos EUA No. 4 235 871) para a preparação de lipossomas oligolamelares. Podem-se produzir vesículas unilamelares a partir de MLV através de métodos como a aplicação de ultra-sons (veja-se Paphadjopoulos et al. (1968)), ou extrusão (Patente dos EUA No. 5 008 050 e Patente dos EUA No. 5 059 421). O lipossoma de éter lipídico de acordo com o presente invento pode ser produzido pelos métodos de qualquer destas descrições, cujos conteúdos são aqui incorporados para referência.
Podem-se utilizar diversas metodologias, tais como a aplicação de ultra-sons, homogeneização, aplicação da prensa francesa, moagem e extrusão, para reduzir o tamanho dos lipossomas, isto é, para preparar lipossomas de menor tamanho, a partir de lipossomas maiores. Também se pode utilizar a filtração de fluxo tangencial (veja-se WO89/008846), para regularizar o tamanho dos lipossomas, isto é, para produzir lipossomas com uma população de lipossomas com uma menor heterogeneidade de tamanhos, e uma distribuição de tamanhos definida, mais homogénea. O lipossoma de acordo com o invento pode ser unilamelar ou multilamelar e tem de preferência um diâmetro inferior a cerca de 200 nm, mais preferencialmente de maior que cerca de 50 nm, a menor que cerca de 200 nm.
Um lípido com o "grupo de cabeça derivatizado" é um lípido que, quando presente numa bicamada lipídica lipossómica com um éter lipídico, consegue tamponar a toxicidade do éter lipídico, isto é, pode diminuir a toxicidade do éter lipídico, de forma que este é geralmente menos tóxico do que a forma livre do éter lipídico. Os lípidos com o grupo de cabeça derivatizado são geralmente lípidos
84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 8 ir*' <.·..· anfipáticos que compreendem uma ou mais cadeias acilo hidrófobas e uma cabeça polar, a que foi ligada uma porção química. As cadeias acilo contêm tipicamente de 4 a 24 átomos de carbono e podem sor saturadas ou insaturadas. As cadeias de acilo preferidas são as que podem adoptar configurações de empacotamento compatíveis com as porções hidrófobas de outros lípidos presentes na bicamada e que podem interagir com um éter lipídico de modo que a libertação do éter lipídico da bicamada é inibida e a toxicidade do éter lipídico é tamponada. Os grupos polares preferidos são aqueles, como a etanolamina, aos quais se podem ligar porções químicas. Porções químicas adequadas são, por exemplo, ácidos dicarboxílicos, gangliósidos, polietilenoglicois, éteres poiialquílicos e semelhantes, de preferência ácidos dicarboxílicos, que podem ser ligados a grupos polares e que dão origem a lípidos com o grupo de cabeça derivatizado. Os meios para identificar as porções químicas adequadas para a ligação de grupos como a etanolamina, por exemplo submetendo os lípidos derivatizados a um teste de toxicidade in vitro e in vivo, são bem conhecidos e facilmente aplicados pelos peritos na arte, atendendo aos ensinamentos do presente invento. Os meios para ligar as porções químicas aos grupos polares são também bem conhecidos na arte e são facilmente aplicados na prática pelos peritos na arte.
As cadeias de acilo preferidas, que incluem cadeias de palmitato e oleato, têm de 16 a 20 átomos de carbono. Mais preferencialmente, uma ou mais das cadeias acilo, como uma cadeia de oleato, é insaturada. O grupo polar preferido é a etanolamina. As porções preferidas para ligação da etanolamina são ácidos dicarboxílicos, incluindo os que são saturados, ou insaturados e que têm de 4 a 24 átomos de carbono, como ácido glutárico, sebácico, succínico e tartárico. Mais preferencialmente, o ácido dicarboxílico é ácido glutárico. Deste modo, os lípidos com o grupo de cabeça derivatizado preferidos são foafatidiletanolamina-ácidos dicarboxílicos, como diplamitoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico (DPPE-GA), palmitoiloeoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico ((POPE-GA) e dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico (DOPE-GA). Mais preferencialmente, o lípido derivatizado é DOPE-GA. Tipicamente, o lípido com o grupo de cabeça derivatizado compreende de cerca de 5 porcento molar a cerca de 50 porcento molar da bicamada lipídica do lipossoma.
As capacidades tamponantes de toxicidade dos lípidos com o grupo de cabeça derivatizado podem ser determinadas por diversos métodos de teste in vitro e in vivo bem conhecidos, e facilmente praticáveis, pelos peritos na arte, atendendo 9 ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ aos ensinamentos do presente invento. Por exemplo a hemólise de glóbulos vermelhos (GV) induzida por éteres lipídicos pode ser avaliada in vitro, por combinação de um éter lipídico com uma suspensão de GV, incubando a combinação e em seguida quantificando a percentagem de lise de GV por espectrofotometria. Os dados apresentados a seguir mostram que a concentração de éter lipídico livre que induz hemólise de cinco porcento de uma suspensão de GV (Hl5) foi de 5,2 micromolar, enquanto que os valores de Hl5 para éteres lipídicos em lipossomas que também possuem um lipido com o grupo de cabeça derivatizado variaram de 8,9 micromolar a 106 micromolar.
Além disso, a LDso para os éteres lipídicos pode ser determinada in vivo por injecção de uma gama de doses de éteres lipídicos em grupos de amostra de animais de teste adequados, e.g. ratinhos; determinando o número de animais de cada grupo que morrem e determinando a dose de éter lipídico à qual cinquenta porcento dos animais morrem. Os dados apresentados a seguir mostram que para doses de éteres lipídicos lipossómicos de 100 e 130 mg de éter lipídico/kg de peso corporal, nenhum dos animais tratado morreu, enquanto que para uma dose de 100 mg/kg de éter lipídico livre, os cinco de um total de cinco ratinhos no grupo testado morreram. A LD50 para o éter lipídico livre (ET-18-OCH3) foi de cerca de 32,2 mg de éter lipídico por kg de peso corporal, enquanto que a LD^, para o éter lipídico lipossómico foi maior que 130 mg por kg. A janela terapêutica "TW" é igual a Hlg/GIgo ("Gigo” é igual à dose de um agente que induz cinquenta porcento de inibição de crescimento numa população de células expostas ao agente). De um modo geral, quando a TW de um agente bioactivo é inferior a 1, o agente não pode ser administrado para se obter 50% de inibição de crescimento, sem que isso acarrete níveis de hemólise geralmente inaceitáveis. De um modo geral, quando a TW é de cerca de 1 ou maior, o agente bioactivo pode ser administrado sem induzir, em geral, níveis de hemólise inaceitáveis. Tipicamente, quanto maior o valor de TW, mais eficaz, do ponto de vista terapêutico, é o agente testado. Os lipossomas de éteres lipídicos com bicamadas que compreendem lípidos com o grupo de cabeça derivatizado podem ter TW maiores que 1. De preferência, a TW de um éter lipídico numa bicamada lipossómica que também compreende um lipido com o grupo de cabeça derivatizado, é maior que cerca de 1,5, mais preferencialmente, maior que cerca de 2 e ainda mais preferencialmente maior que cerca de 3. 10 ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ
Na tabela seguinte apresentam-se os valores de TW para éteres lipídicos livres e lipossómicos (1-0-octadecil-2-0-metil-sn-glicero-3-fosfocolina) em relação a células de cancro humano A549 e MCF7). TW Formulação A549 MCF7 EL livre 0,78 0,26 DOPC:Col:DOPE-GA:EL 7,36 3,61 EPC:Col:POPE-GA:EL 2,77 0,96 Col:DPPG:EL 2,14 >1,04
Os dados apresentados nos exemplos a seguir mostram que a actividade hemolítica de EL decresceu, quando aprisionada num lipossoma com um lípido com o grupo de cabeça derivatizado. As concentrações de éteres lipídicos que induzem 50% de hemólise de glóbulos vermelhos (HIgo) eram: EL livre, 13 μΜ; EL-Lip-1; 43 μΜ; EL-Lip-2 >180 μΜ. As concentrações de éteres lipídicos que induzem 50% de inibição de crescimento (Gl50) das células de cancro A549 eram semelhantes: EL livre, 10,2 μΜ; EL-Lip-1, 12,4 μΜ; EL-Lip-2, 14,1 μΜ. Para além disso comparou-se a actividade anti-metastásica da EL livre e de EL-Lip-1 contra o cancro do pulmão de Lewis em ratinhos. Verificou-se que a EL-Lip-1 inibe as metástases do pulmão espontâneas, enquanto que a EL livre tinha apenas uma eficácia limitada (controlo: 28 + 4,9 nódulos de pulmão; EL livre: 27,5 ± 5; EL-Lip-1: 8,1 ±6,5)
Os lípidos com o grupo de cabeça derivatizado também podem ser lípidos capazes de melhorar a circulação, isto é, as modificações direccionadas para o tamponamento da toxicidade de lípidos também podem ser direccionadas para a melhoria da circulação; os lípidos derivatizados podem inibir a eliminação dos lipossomas dos sistemas de circulação de animais a que foram administrados. Pensa-se, de um modo geral, que os lipossomas são eliminados do corpo de um animal através do seu sistema reticuloendotelial (RES). Evitar a eliminação pelo RES significa que a frequência de administração do lipossoma pode ser reduzida e que é necessária a administração menor quantidade de um agente bioactivo associado ao lipossoma, para se obterem os níveis séricos desejados do agente. A «4aua i- EP 0 785 773/PT £ 11 '·' , ’ 1 - melhoria dos tempos de circulação também podem permitir o direccionamento dos lipossomas para tecidos que não contêm RES. Pensa-se que as superfícies externas dos lipossomas ficam revestidas por proteínas do soro, como as opsoninas, nos sistemas circulatórios dos animais.
Sem pretender de forma alguma estar limitado à teoria, pensa-se que a eliminação de lipossomas pode ser inibida por modificação da superfície externa dos lipossomas, de forma que a ligação de proteínas séricas a estes, é geralmente inibida. Pensa-se que uma modificação eficaz da superfície, isto é, alterações nas superfícies externas dos lipossomas que resultam na inibição da opsonização e absorção pelo RES, é conseguida através da incorporação em lípidos da bicamada de lipossomas, cujas cabeças polares foram derivatizadas por ligação de uma porção química que pode inibir a ligação de proteínas séricas a lipossomas, de forma que o comportamento farmacocinético dos lipossomas nos sistemas circulatórios dos animais fica alterado (veja-se, e.g. Blume et ai (1993); Gabizon et ai (1993); Park et ai (1992); Woodle et al. Patente EUA No. 5 013 556; Patente dos EUA No. 4 837 028; e pedido de Patente dos EUA No. 08/065 928, apresentado em 21 de Maio de 1993). O éter lipídico tem a fórmula química: CH2-0-R.,
I ch-z-r2 3> ch2-r em que R, é Υ-,Υ^ Y2 é CH3 ou C02H e é (CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9. n1 é igual a zero ou é um número inteiro de 3 a 23; n3 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 21; n5 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 18; n7 é igual a zero ou é um inteiro de 1 a 15; n9 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 12; e cada um de n2, n4, n6 e n8 é independentemente igual a zero ou 1. A soma n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + +n9 é igual a um número inteiro de 3 a 23. Em acordo, está ligado um hidrocarboneto, através de um átomo de O na posição 1, ao esqueleto de glicerol do éter lipídico. O hidrocarboneto pode ter um grupo CH3 ou C02H terminal; de preferência o grupo terminal é um grupo metilo. O hidrocarboneto é de preferência saturado, isto é, de preferência não tem ligações
84 300 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 12 duplas entre átomos de carbono adjacentes, cada um de n2, n4, n6 e n8 é igual a zero e Rt é (CH2)n1CH3. Mais preferencialmente, R, é (CH2)17CH3.
Alternativamente, o hidrocarboneto pode ter uma ou mais ligações duplas, isto é, pode ser insaturado, e um ou mais de n2, n4, n6 e n8 podem ser iguais a 1. Quando o hidrocarboneto insaturado tem uma ligação dupla, n2 é igual a 1, n4, n6 e n8 são cada um igual a zero eY, é (CH2)n1CH-CH(CH2)n3. n1 é zero ou um número inteiro de 1 a 21, e n3 é também zero ou um número inteiro de 1 a 21, em que pelo menos um de n1 ou n3 não é igual a zero. Quando o hidrocarboneto tem duas ligações duplas, n2 e n4, são cada um, iguais a 1, n6 e n8 são, cada um, iguais a zero e Y, é (CH2)n1CH=CH(CH2)n3CH=CH(CH2)n5. n1 e n5 são, cada um independentemente, zero, ou um número inteiro de 1 a 18 e n3 é um número inteiro de 1 a 16. Quando o hidrocarboneto tem três ligações duplas, n2, n4 e n6 são cada um igual a 1, n8 é igual a zero e Y1 é (CH2)n1CH=CH(CH2)n3CH=CH(CH2)n5CH=CH(CH2)n7. n1 e n7 são, cada um independentemente, zero ou um número inteiro de 1 a 15 e n3 e n5 são, cada um, igual a um número inteiro de 1 a 15. Quando o hidrocarboneto insaturado tem quatro ligações duplas, cada um, de n2, n4, n6 e n8 é igual a 1 e Y, é (CH2)n1CH=CH(CH2)n3CH=CH(CH2)n5CH=CH(CH2)n7CH=CH(CH2)n9. n1 e n9 são, cada um independentemente, zero ou um número inteiro de 1 a 12; n3, n5 e n7 são, cada um independentemente, um número inteiro de 1 a 12. Z é de preferência O, mas também pode ser S. R2 também pode ser Y,Y2 e pode ser igual ou diferente de Rv De preferência R2 é (C(X, )n1o(X2)n1l)n12CX3X4X5-Cada um de Χυ X2, X3, X4 e X5 é independentemente H ou F, mas é de preferência H. n10 é igual a zero, 1 ou 2; n11 é igual a zero, 1 ou 2; e n12 é igual a zero ou a um número inteiro de 1 a 23. De preferência n12 é igual a zero, caso em que R2 é CX3X4X5. X3, X4 e X5 são de preferência H, e R2 é de preferência CH3. Quando n12 não é zero, a soma n10 + n11 é igual a 2, n12 é de preferência igual a 1 e R2é de preferência CH2CH3 CH2CF3, CF2CF3. R3 é R5-P(0)2-0-R6, R5 sendo O, S ou NH, mas de preferência O R6 pode ser CH2CH2N(CH3)3 (fosforilcolina) CH2CH2NH2 (fosforilserina), CH2CH(OH)CH2OH(fosforilglicerol), ou CH2CH2NHC(0)R7, mas é de preferência fosforilcolina. Assim, R3 é de preferência, mas não necessariamente, -0-P(0)2-0-CH2CH2N(CH3)3. R7 é Y2CH3 ou Y2C02H. ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ 13
Assim, ο éter lipídico preferido é: CH2-0-(CH2)17CH3
I CH-O-CH3
I CH2-0-P(0)2-0-CH2CH2N(CH3)3, isto é, 1-0-octadecil-2-0-metil-sn-glicero-3-fosfocolina ("ET-18-OCH3”). O lipossoma pode compreender lípidos adicionais, isto é, um ou mais lípidos para além do lípido com o grupo de cabeça derivatizado e do éter lipídico.
Os lípidos adicionais são seleccionados quanto à sua capacidade de adoptar conformações de empacotamento de cadeias de acilo compatíveis com os outros componentes da bicamada lipídica, de modo que os constituintes lipídicos estejam bem empacotados, sendo inibida a libertação dos lípidos a partir da bicamada. Os factores baseados em lípidos que contribuem para as conformações de empacotamento compatíveis são bem conhecidos dos peritos na arte. Estes factores incluem, sem limitação, o comprimento da cadeia de acilo e o grau de insaturação, bem como 0 tamanho e a carga do grupo de cabeça. Deste modo, os lípidos adicionais adequados podem ser facilmente seleccionados pelos peritos na arte, atendendo aos ensinamentos do presente invento.
Os exemplos de lípidos adicionais preferidos incluem lípidos neutros, como as fosfatidilcolinas (PC), fosfatidilcolina de ovo (EPC), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC) e dioleoilfosfatidilcolina (DOPC). As PC preferidas tem uma ou duas cadeias de acilo, como a DOPC que tem duas cadeias insaturadas. A bicamada do lipossoma de acordo com o invento pode também compreender um esterol. Os esteróis afectam geralmente a fluidez das bicamadas lipídicas (veja-se, por exemplo, Lewis e McElhaney (1992) e Darnell et al. (1986)). Deste modo, as interacções dos esteróis que envolvem as cadeias de hidrocarboneto inibem geralmente a emigração destas cadeias a partir da bicamada. O componente esterol da bicamada de acordo com 0 invento é, de preferência, mas não necessariamente, colesterol. O esterol pode ser também sulfato de colesterol ou hemissuccinato de colesterol. O lipossoma pode também compreender um lípido capaz de melhorar a circulação, isto é um lípido que juntamente com o lípido com o
84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 14 grupo de cabeça derivatizado pode ser, mas não é necessariamente, um lípido capaz de melhorar a circulação.
De preferência, o lipossoma de acordo com o presente invento tem uma bicamada que compreende um éter lipídico, um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, um esterol e um lípido neutro. De preferência, o éter lipídico é ET-18-OCH3, o lípido com o grupo de cabeça derivatizada é PE-ácido dicarboxíiico, o esterol é colesterol e o lípido neutro é uma PC. Mais preferencialmente, o PE-ácido dicarboxíiico é DOPE-GA e a PC é DOPC. Tipicamente, a bicamada compreende de cerca de 10 a cerca de 30 porcento molar de éter lipídico, de cerca de 5 a cerca de 20 porcento molar do lípido com o grupo de cabeça derivatizado, de cerca de 10 a cerca de 50 porcento molar do esterol e de cerca de 10 a cerca de 50 porcento molar do lípido neutro. Numa concretização do invento particularmente preferida, a bicamada compreende cerca de 20 porcento molar de ET-18-OCH3, cerca de 10 porcento molar de DOPE-GA, cerca de 30 porcento molar de colesterol e cerca de 40 porcento molar de DOPC. O lipossoma pode compreender um agente bioactivo adicional, isto é, um agente bioactivo para além do éter lipídico. Um "agente bioactivo" é qualquer composto ou composição de matéria que possa ser administrada a animais, de preferência humanos. Estes agentes podem ter uma actividade biológica em animais; os agentes podem ser também utilizados para diagnóstico em animais. Os agentes bioactivos incluem agentes terapêuticos e de imageologia. Os agentes bioactivos que podem ser associados aos lipossomas incluem, mas não se limitam a: agentes antivirais como o aciclovir, zidovudina e os interferões; agentes antibacterianos como os aminoglicósidos, cefalosporinas e tetraciclinas; agentes antifúngicos como os antibióticos de polieno, imidazolos e triazolos; agentes antimetabólicos como o ácido fólico e análogos de purinas e pirimidinas; agentes antineoplásicos como os antibióticos de antraciclina e alcaloides de plantas; esteróis como o colesterol; hidratos de carbono, e.g. açúcares e amidos; aminoácidos, péptidos, proteínas, como as proteínas de receptores celulares, imunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotransmissores e glicoproteínas; corantes, marcadores radioactivos como os radioisótopos e compostos marcados com radioisótopos; compostos radio-opacos; compostos fluorescentes; compostos midriáticos; broncodilatadores; anestésicos locais; e semelhantes. As formulações de agentes bioactivos lipossómicos podem melhorar o índice terapêutico do agente bioactivo, por exemplo por tamponamento da toxicidade do agente. Os lipossomas 84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ
15 podem também reduzir a taxa a que o agente bioactivo é eliminado da circulação de animais. Deste modo, a formulação lipossómica de agentes bioactivos pode significar que é necessário administrar uma menor quantidade de agente para alcançar o efeito desejado. Exemplos de outros agentes bioactivos preferidos para o lipossoma de acordo com o invento incluem agentes antimicrobianos, anti-inflamatórios e antineoplásicos, ou lípidos terapêuticos, por exemplo, ceramidas. Mais preferencialmente, o agente bioactivo adicional é um agente antineoplásico. »
Os lipossomas podem ser carregados com um ou mais agentes biologicamente activos por solubilização do agente na fase lipídica ou na fase aquosa utilizadas para preparar os lipossomas. Alternativamente, os agentes bioactivos ionizáveis podem ser carregados em lipossomas, formando primeiro os lipossomas, estabelecendo um potencial electroquímico, e.g. através de um gradiente de pH, através da camada mais externa da bicamada do lipossoma, e em seguida adicionando o agente ionizável ao meio aquoso externo ao lipossoma (veja-se Bally et al., Patente dos EUA No. 5 077 056 e W086/01102). O lipossoma de acordo com o invento pode ser desidratado, armazenado e depois reconstituído de forma que uma porção substancial do seu conteúdo interno fica retida nos lipossomas. A desidratação lipossómica requer geralmente a utilização de um agente protector de secagem hidrófilo (veja-se Patente do EUA Nos 4 229 360 e 4 880 635). Pensa-se que este composto hidrófilo evita geralmente o rearranjo dos lípidos no lipossoma, de modo que o tamanho e conteúdo são mantidos durante o processo de secagem e ao longo da re-hidratação, permitindo a reconstituição dos lipossomas. As qualidades adequadas para estes protectores de secagem são as de serem fortes aceitadores de ligações de hidrogénio e possuírem características estereoquímicas que preservam o espaçamento intramolecular dos componentes da bicamada do lipossoma. Os açúcares sacarídeos, preferencialmente monossacáridos e dissacáridos, são agentes protectores de secagem adequados para lipossomas. Alternativamente, o agente protector de secagem pode ser omitido se a preparação de lipossomas não for congelada antes da desidratação e se permanecer água suficiente na preparação subsequentemente à desidratação. O presente invento também proporciona uma composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e o lipossoma de acordo com o presente invento. Os "transportadores farmaceuticamente
84 300 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 16 aceitáveis", tal como aqui se utiliza, são geralmente destinados a utilização conjunta com a administração de lípidos e lipossomas, incluindo formulações lipossómicas de agentes bioactivos, a animais, incluindo humanos. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente formulados de acordo com vários factores que o perito na arte poderá facilmente determinar e ter em conta, incluindo sem limitação; o agente bioactivo lipossómico particular utilizado, a sua concentração, estabilidade e biodisponibilidade pretendida; a doença, desordem ou condição a tratar com a composição lipossómica; o indivíduo, a sua idade, tamanho e condição geral; e a via de administração a que se destina a composição, e.g. nasal, oral, oftálmica, tópica, transdérmica, vaginal, subcutânea, intramamária, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular (veja-se, por exemplo. Nairn (1985)). Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis típicos utilizados na administração parentérica de agentes bioactivos incluem, por exemplo, D5W, uma solução aquosa que contém 5% em peso por volume de dextrose e solução salina fisiológica. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem conter ingredientes adicionais, por exemplo, os que aumentam a estabilidade do ingrediente activo incluído, como conservantes e antioxidantes.
Também se proporciona um método para a administração de um éter lipídico a um animal que compreende a administração ao animal de uma composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende um lípido com o grupo de cabeça derivatizado e um éter lipídico. O éter lipídico tem a fórmula química: 1
CH2-0-R CH-Z-R2
I ch2-r3.
De preferência, o animal é um humano e o éter lipídico é administrado intravenosamente. De preferência, o lipossoma tem um diâmetro inferior a cerca de 200 nm, mais preferencialmente, de maior que cerca de 50 nm a menor que cerca de 200 nm. O lípido com o grupo de cabeça derivatizado é de preferência um fosfatidiletanolamina-ácido dicarboxílico, sendo o ácido de preferência ácido glutárico c a PE de preferência DPPE, POPE ou DOPE. Mais preferencialmente, o
84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 17 ci·· v.^· lípido com ο grupo de cabeça derivatizado é DOPE-GA. O lípido de cabeça derivatizado pode ser também um lípido capaz de melhorar a circulação.
De preferência, um hidrocarboneto saturado, mais preferencialmente CH3(CH2)17, está ligado na posição 1 do éter lipídico, através de um O; de preferência está ligado um grupo metilo na posição 2 através de um O; e preferencialmente, o grupo polar na posição 3 é fosforilcolina. Em acordo, o éter lipídico preferido é 1-0-octadecil-2-0-metil-3-sn-glicero-fosfocolina ("ET-18-OCH3”). De preferência, a bicamada lipídica lipossómica compreende também um esterol, mais preferencialmente, colesterol e um lípido neutro, como uma PC, e de preferência DOPC. A bicamada compreende também um lípido capaz de melhorar a circulação.
De preferência, o lipossoma utilizado no método de acordo com o invento tem uma bicamada lipídica que compreende ET-18-OCH3, DOPE-GA, colesterol e DOPC. Mais preferencialmente, a bicamada compreende cerca de 40 porcento molar de DOPC, cerca de 30 porcento molar de colesterol, cerca de 10 porcento molar de DOPE-GA e cerca de 20 porcento molar do éter lipídico.
Pensa-se que geralmente os éteres lipídicos são selectivamente citotóxicos para as células de tumor. Assim, o método de acordo com o presente invento pode ser utilizado para tratar animais que sofrem de cancro, incluindo, mas não se limitando a carcinoma, leucemia, mieloma, neuroblastoma ou sarcoma, do pulmão, cérebro, ovários, cólon ou mama. De um modo geral, os éteres lipídicos lipossómicos podem ser utilizados para tratar cancros tratados com éteres lipídicos livres, isto é não lipossómicos. No entanto, a encapsulação de um éter lipídicos num lipossoma pode aumentar o seu índice terapêutico, fazendo, portanto, com que o éter lipídico lipossómico seja um tratamento mais eficaz. O método colocado em prática por administração ao animal de uma quantidade antineoplásica eficaz do éter lipídico lipossómico de acordo com o invento. A administração do éter lipídico lipossómico pode inibir metástases de células cancerosas, ou a sua invasão de tecidos.
Para fins do presente invento, o termo "quantidades eficazes anti-cancro" de éteres lipídicos lipossómicos são quantidades eficazes para inibir, melhorar, diminuir ou impedir o estabelecimento, crescimento, metástases ou invasão de um ou mais cancrus em animais, a que foram administrados éteres lipídicos. As 84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ
18 quantidades eficazes anti-cancro são geralmente escolhidas de acordo com vários factores, e.g. idade, tamanho e condição geral do indivíduo, o cancro a tratar e a via de administração pretendida c determinadas por uma variedade de meios, por exemplo, ensaios de variação da dosagem, bem conhecidos e facilmente praticáveis pelos peritos na arte, tendo em conta os ensinamentos do presente invento. É esperado, geralmente, que as quantidades antineoplásicas eficazes do éter lipídico lipossómico do presente invento sejam aproximadamente as mesmas quantidades dos éteres lipídícos livres, não lipossómicos, e que variem numa gama de cerca de 0,1 mg de éter lipídico por kg de peso corporal do animal tratado, a cerca de 1000 mg de éter lipídico por kg de peso corporal. De preferência, a quantidade antineoplásica eficaz do éter lipídico é de cerca de 1 mg de éter lipídico por kg de peso corporal, a cerca de 500 mg por kg. Maís preferencialmente, a quantidade anti-cancro eficaz de éter lipídico lipossómico é de cerca de 5 mg/kg a cerca de 100 mg/kg. O método de acordo com o invento pode ser também utilizado para administrar um éter lipídico a um animal que sofre de uma desordem anti-inflamatória. As desordens inflamatórias que podem ser tratadas pelo método de acordo com o invento incluem, sem limitação, condições artríticas, como a gota, artrite reumatóide, artrite filar e doença de Lyme; desordens asmáticas; reacções alérgicas; e semelhantes. Os animais são tratados quanto a estas desordens por administração de uma quantidade anti-inflamatória eficaz de éter lipídico ao animal. A inflamação é um processo de reacções citológicas e histológicas que ocorrem nos vasos sanguíneos afectados e tecidos envolventes, em resposta a um dano (veja-se, e.g. Stedman's Medicai Dictionarv (lllustratedl (1982)). As respostas inflamatórias a estes estímulos, incluem reacções locais e alterações morfológicas resultantes, destruição ou remoção de materiais prejudiciais e activação de mecanismos de reparação. Assim, a inflamação pode ser parte do processo através do qual os animais se curam a si próprios. No entanto, a inflamação também pode ocorrer em resposta a estímulos fisiológicos anormais e pode originar problemas no corpo. As articulações, por exemplo, ficam inflamadas nas condições artríticas, como a gota, artrite filar, artrite reumatóide e doença de Lyme (veja-se, e.g. Stedman's Medicai Dictionarv (lllustratedl. supra nas páginas 123-124). Estes estados podem ser caracterizados pelo extravasamento de células, i.e., o deslocamento de células da circulação para a área inflamada. Podem-se utilizar agentes que podem inibir este extravasamento, ou que podem de outro modo inibir
84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 19 respostas inflamatórias a estímulos fisiológicos anormais, para melhorar a inflamação.
Uma "quantidade anti-inflamatória eficaz" de um éter lipídico lipossómico é qualquer quantidade do éter lipídico eficaz para melhorar, inibir ou impedir respostas ou reacções inflamatórias em animais que sofrem de condições caracterizadas por uma inflamação anormal, i.e. uma inflamação que ocorre em resposta a estímulos fisiológicos anormais e que não faz parte dos processos de reparação normais do corpo, em resposta a um dano. As quantidades anti-inflamatórias eficazes de éteres lipídicos são geralmente de cerca de 0,1 mg de éter lipídico por kg de peso corporal do animal tratado a cerca de 1000 mg de éter lipídico por kg de peso corporal. O método de acordo com o invento pode também compreender a administração de um agente biologicamente activo adicional a um animal, isto é, um agente biologicamente activo além do éter lipídico administrado. Este agente biologicamente activo adicional, e.g. um agente antimicrobiano, agente anti-inflamatório, agente antineoplásico, lípido terapêutico ou agente estimulante do crescimento celular hematopoiético pode ser associado, ou não associado ao lipossoma. A "associação" de um agente biologicamente activo a um lipossoma significa o aprisionamento do agente num compartimento aquoso ou na bicamada lipídica do lipossoma, ou a associação, por exemplo, por meio da formação de um complexo, do agente com a superfície da monocamada interna ou externa da bicamada. De preferência, o agente biologicamente activo adicional associado ao lipossoma é um agente antineoplásico como um antibiótico de antraciclina, um antimetabolito ou um alcaloide de vinca. Os agentes bioactivos não associados podem ser administrados conjuntamente com, ou em momentos diferentes, da administração do lipossoma. De preferência, os agentes biologicamente activos não associados, são agentes estimulantes do crescimento de glóbulos vermelhos, e.g. eritropoietina ou interleucina 3 (IL-3) e factor estimulante de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF). O presente invento será mais bem entendido a partir dos exemplos seguintes. No entanto, os peritos na arte facilmente entenderão que estes exemplos são meramente ilustrativos do invento, como definido nas reivindicações que depois se seguem.
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EXEMPLOS
Exemplo 1 Preparação
Químicos: O éter lipídico (EL), fosfatidilcolina de ovo (EPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dipalmitoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico (DPPE-GA), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico (POPE-GA) e dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico (DOPE-GA) foram obtidos de Avanti Polar Lipids (Birmingham, Alabama). O colesterol (Col) foi adquirido de Sigma Chemical Company U.S.A.. A solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) foi adquirida de Gibco BRL Life Technologies Inc. (Grand Island, New York, EUA). Todos os outros reagentes eram da maior pureza disponível.
Lipossomas: Os lipossomas "vazios" foram preparados pelo método de evaporação do solvente. Os lipossomas contendo EL foram preparados dissolvendo primeiro o EL em clorofórmio e misturando com EPC/Col, DOPC/Col ou DSPC/Col, a várias razões molares, com e sem 10% molar quer de DPPE-GA, POPE-GA ou DOPE-GA em clorofórmio e metanol (2:1 v/v). Removeu-se o solvente orgânico sob vácuo utilizando um evaporador rotativo e o filme fino seco foi hidratado com uma solução tampão de DPBS. As preparações resultantes foram extrudidas 10 vezes através de filtros Nucleopore de 0,1 pm duplamente empilhados, utilizando um dispositivo extrusor (Lipex Biomembrane Vancouver, BC, Canada). Os tamanhos dos lipossomas foram determinados por dispersão de luz num dimensionador de partículas submicrónicas Nicomp modelo 370. Para todos os estudos, os lipossomas tinham um diâmetro médio entre 96-126 nm.
Exemplo 2
Teste de hemólise de glóbulos vermelhos (GV)
Incubaram-se 0,5 ml de uma suspensão a 4% de glóbulos vermelhos (GV), lavados três vezes com PBS, com várias concentrações de lipossomas "vazios" (diluído em série), isto é lipossomas sem éteres lipídicos ou outros agentes biologicamente activos, éteres lipídicos livres (não lipossómicos) ou o éter lipídico lipossómico preparado como descrito acima. Estas amostras foram agitadas com vórtex num agitador a 37 graus C. durante 20 horas e foram em seguida centrifugados durante 10 minutos a 3000 rpm. Diluíram-se 0,2 ml do sobrenadante resultante para 1 ml com água e quantificou-se a percentagem de hemólise na amostra por espectrofotometria, fazendo a determinação a 550 nm. A libertação de
84 309 , -;L EP 0 785 773/PT .·*'/ * 21 ' hemoglobina por lise hipotónica de um número igual de GV em água foi tomada como o controlo positivo de 100%. O PBS foi utilizado como controlo negativo. O éter lipídico utilizado nas formulações era o 1-0-octadecil-2-0-metil-sn-glicero-3-fosfocolina (ET-18-0-CH3).
Os resultados destes estudos são apresentados na tabela 1 (veja-se a seguir), em que a primeira coluna indica os componentes da formulação testada quanto a actividade hemolítica, a coluna do meio indica as razões molares dos componentes respectivos e a terceira coluna indica a concentração de lípidos (micromolar) â qual se observa 5% de hemólise (Hl5). TABELA 1
Actividade hemolítica Composição Razão molar Mis EL livre N/A 5,2 Éter lipídico lipossómico: EPC/Col/EL 4:3:3 20,6 EPC/Col/DPPE-GA/EL 1:3:1:5 8,9 3:3:1:3 14,1 4:3:1:2 19,0 5:3:1:1 32,8 EPC/Col/POPE-GA/EL 1:3:1:5 13,9 3:3:1:3 20,1 4:3:1:2 29,9 5:3:1:1 31,1 EPC/Col/DOPE-GA/EL 4:3:1:2 58,7 DOPC/Col/POPE-GA/EL 4:3:1:2 106,0 Col/DPPG/EL 5:3:2 71,8 DSPC/Col/EL 4:3:3 20,4 DSPC/Col/DPPE-GA/EL 1:3:1:5 9,0 3:3:1:3 10,5 4:3:1:2 17,9 5:3:1:1 19,8 22 84 300 /Uás» . Λ? ¢4 c ΕΡ 0 785 773/ΡΤ
Exemplo 3
Estudos in vitro da inibição do crescimento de células de cancro de murídeo A inibição específica da proliferação in vitro de várias células de cancro por ET-I8-OCH3 livre, lipossómico ou por lipossomas vazios (isentos de EL) foi monitorizada através de um teste de Sulforodamina B (SRB). Em resumo, plaquearam-se em separado 5000 células de cancro de pulmão de Lewis (LLC), P388 ou P388-resistentes a adriamicina (ADR)/poço, em placas de microtítulo de 96 poços de fundo plano, em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, e mantiveram-se a 37°C numa atmosfera humidificada de C02 a 5%. Após 24 horas, as células foram expostas a várias concentrações quer de lipossomas vazios (isentos de EL), DPBS, éter lipídico livre ou éter lipídico lipossómico e fez-se a cultura por mais 48 horas a 37°C. As células tratadas com várias formulações de ET-18-OCH3 foram fixadas por adição de 50 μΙ de ácido tricloroacético (TCA) frio a 50% (peso/vol) e incubadas a 4°C, durante 1 hora. As placas foram lavadas cinco vezes com água desionizada e deixadas a secar ao ar durante a noite. Adicionaram-se 100 μΙ de SRB (0,4% peso/vol em ácido acético a 1%) e incubou-se à temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Removeu-se a SRB não ligada, lavando cinco vezes com ácido acético a 1%. As placas foram secas ao ar e solubilizou-se a SRB ligada com tampão Tris, leram-se as densidades ópticas a 551 nm e calculou-se a inibição de 50% do crescimento (Gl50) pela fórmula 50 x ((T - T0)/(C-T0)) = 50, em que a densidade óptica de controlo é (C), a densidade óptica de teste é (T) e a densidade óptica no tempo zero é (T0).
Os resultados são apresentados na tabela 2 (veja-se a seguir) como concentração de éter lipídico que alcançou cinquenta porcento de inibição de crescimento (Glso), em que a primeira coluna indica a composição da formulação testada, a segunda coluna indica as razões molares dos componentes da formulação respectivas e a terceira, quarta e quinta colunas são os dados de Gl^ para as culturas de LLC, P388 e P388-ADR, respectivamente. O éter lipídico utilizado nas formulações era 1-0-octadecil-2-0-metil-sn-glicero-3-fosfocolina. ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ 23 TABELA 2
Inibição do crescimento (Gl50) de células de cancro de murídeo por formulações de éter lipidico
Composição Razão LLC P388 P388-ADR EL livre molar N/A 26,5 + 5,1 4,2 + 0,2 6,1 ±1,6 EL lipossómico: EPC/Col/EL 4:3:3 40,6 EPC/Col/POPE-GA/EL: 1:3:1:5 44,5 + 3 5,6 ± 0,4 10,8 + 0,4 3:3:1:3 63,2 ± 4 5,2 + 0,1 9,8 ± 0,4 4:3:1:2 73,6 ± 0,5 5,3 + 0,2 9,6 ± 0,4 5:3:1:1 >75 5,9 + 0,5 12,3 ±0,4 EPC/Col/DPPE-GA/EL: 1:3:1:5 28,9 — — 3:3:1:3 30,6 — — 4:3:1:2 >75 5,1 ±1,3 8,2 ±4,3 5:3:1:1 >60 — — EPC/Col/DOPE-GA/EL: 4:3:1:2 71,9 7,5 13,3 DOPC/Col/DOPE-GA/EL: 4:3:1:2 67,6 + 3,3 5,7 + 0,2 11,5 + 0,4 Col/DPPG/EL 5:3:2 >75 11,2 24,3 DSPC/Col/EL 4:3:3 36,6 — — DSPC/Col/DPPE-GA/EL: 3:3:1:3 25,1 — —
Exemplo 4
Estudos in vitro da inibição do crescimento de células de cancro humanas
Plaquearam-se células humanas A549 de cancro de pulmão, MCF7 e MCF7/ADR (5000 células por poço) e após 24 horas de incubação estas foram expostas a várias concentrações de éter lipidico, quer livre, quer lipossómico, durante 72 horas. A inibição do crescimento foi determinada utilizando o teste de SRB. A incubação com lipossomas de controlo, que não contêm o éter lipidico, não causou uma inibição do crescimento a concentrações de lípido até 60 μΜ. Os resultados são apresentados na tabela 3 (veja-se a seguir), como a concentração de éter lipidico que atingiu cinquenta porcento de inibição do crescimento (Gl50), em que a primeira coluna indica a composição da formulação testada, a segunda coluna indica a razão molar dos constituintes da formulação e a terceira indica a razão molar dos constituintes da formulação, e a terceira, quarta e quinta colunas indicam os resultados para as culturas de A549, MCF7 e MCF7/ADR, respectivamente. O éter lipidico utilizado nas formulações era o l-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina. ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ 24TABELA 3 24
Inibição do crescimento (Gl50) de células de cancro humano por formulações de éteres lipídicos
Composição Razão A549 MCF7 MCF7/ADR EL livre molar N/A 6,7 + 2,5 20,2 + 7,7 28,4 + 4,5 EL lipossómico EPC:Col:POPE-GA:EL 1:3:1:5 9,9 + 0,1 19,1 + 1,8 34,9 + 1,8 3:3:1:3 11,8 + 0,2 29,1 + 1,7 41 + 0,4 4:3:1:2 10,8 + 0,4 31,2 + 2,2 45,1+0,7 EPC:Col:DPPE-GA:EL 5:3:1:1 4:3:1:2 18,3 + 0,1 9,2 + 3,4 >66 31,6 + 0,5 >75 55,7 + 0,1 EPC:Col:DOPE-GA:EL 4:3:1:2 15,8 36 >68,6 DOPC:Col:DOPE-GA:EL 4:3:1:2 14,4 + 0,4 29,4 + 14,6 >63,4 Col:DPPG:EL 5:3:2 33,5 >75 >75
Exemplo 5
Estudos de toxicidade in vivo
Injectaram-se grupos de ratinhos fêmea C57/BL6 (5/grupo, peso 20-22 g) com várias doses de éter lipídico livre (12,5 - 200 mg/kg) e lipossómico (12,5 -200 mg/kg) em PBS através da veia da cauda. Também se injectou etanol num grupo separado de ratinhos. Os ratinhos foram observados quanto à toxicidade aguda, imediata; os resultados são apresentados na tabela 4 (veja-se a seguir). TABELA 4
TOXICIDADE IN VIVO
Formulação Dose de #Animais éter lipídico mortos Controlo de etanol (mg/kg) 0/5 EL livre 200 5/5 100 5/5 50 4/5 25 1/5 12,5 0/5 6,25 0/5 EL lipossómico EPC/Col/GA/EL 100 0/5 (5/3/1/1) EPC/Col/GA/EL 130 0/5 (4/3/1/2) ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ - , ! « 25 _.*?/**
Exemplo 6
Estudos de eficácia in vivo
As células de cancro de pulmão de Lewis (LLC) foram obtidas da ATCC e mantidas em meio RPMI. Injectaram-se quatro grupos (10/grupo) de ratinhos fêmea C57/BL6 (peso corporal 18-22 g) com 2 x 105 células de LLC suspensas em 0,2 ml de PBS estéril, através da veia da cauda no dia 0. Aos dias 1, 3, 5, 7, 9 após a injecção do tumor, os primeiro e segundo grupos receberam ou 25 mg/kg de EL livre ou EL-lipossómico através da veia da cauda. Administrou-se aos terceiro e quarto grupos, ou a mesma quantidade de lípido doseada como lipossomas isentos de EL ou com 0,2 ml de PBS. A actividade anti-metastásica in vivo da EL livre e da EL-lipossómica foi avaliada com base no número de nódulos de tumores presentes nos pulmões de grupos experimentais de ratinhos. Os resultados são apresentados nas figuras 1 e 2
Referências citadas 4 522 803, 4 588 578, 4 734 225, 5 008 050, 5 013 556, 5 030 453,
Documentos de Patentes dos EUA 4 159 988, 4 163 748, 4 235 871, 4 382 035, 4 804 789, 4 837 028, 4 920 016, 4 975 282, 5 059 421,5 077 056, 5 169 637, 3 752 886.
Documentos de Patentes estrangeiras WO89/008846, 1 583 661,4 132 345
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Claims (48)
- ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende um éter lipídico e um lípido com um grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico tem a fórmula química: CH2-0-R, I ch-z-r2 I ch2-r3, em que R, é Y.,Y2, Y2 é CH3 ou C02H e Y1 é (CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8 (CH2)n9; em que a soma n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + +n9 é igual a um número inteiro de 3 a 23, n1 é igual a zero ou é um número inteiro de 3 a 23; n3 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 21; n5 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 18; n7 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 15; n9 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 12; e cada um de n2, n4, n6 e n8 é independentemente igual a zero ou 1. em que Z é O ou S; em que R2 é YiY2 ou (C(X1)n10(X2)n11)n12CX3X4X5, em que cada um de X1t X2, X3, X4 e X5 é independentemente H ou F, n10 é igual a zero, 1 ou 2; n11 é igual a zero, 1 ou 2; e n12 é um número inteiro de 1 a 23 e a soma n10 + n11 é igual a 2; em que R3 tem a fórmula R5-P(0)2-0-R6, R5 é O, S ou NH, R6 é CH2CH2N(CH3)3, CH2CH2NH2, CH2CH(OH)CH2OH, ou CH2CH2NHC(0)R7, e em que R7 é Y2CH3 ou Y2C02H.
- 2. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1, em que o lipossoma tem um diâmetro inferior a cerca de 200 nm.04 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 2/7
- 3. Lipossoma de acordo com a reivindicação 2 em que o lipossoma tem um diâmetro desde maior que cerca de 50 nm a menor que cerca de 200 nm.
- 4. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1, em que Y2 é CH3
- 5. Lipossoma de acordo com a reivindicação 4, em que R, é (CH2)n1CH3
- 6. Lipossoma de acordo com a reivindicação 5, em que R1 é (CH2)17CH3
- 7. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1, em que Zé O
- 8. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1, em que R2 é (C(X1)n10(X2)„l1)nl2CX3X4X6
- 9. Lipossoma de acordo com a reivindicação 8 em que n12 é um.
- 10. Lipossoma de acordo com a reivindicação 9, em que n12 é um e R2 é CH2CH3 CH2CF3 ou cf2cf3
- 11. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1, em que R3 é 0-P(0)2-0-R6
- 12. Lipossoma de acordo com a reivindicação 11, em que R3 é -0-P(0)2-0-CH2CH2N(CH3)3.
- 13. Lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende um éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico é definido como na reivindicação 1, com a condição de que n12 é O ou um número inteiro de 1 a 23, em que o lípido com o grupo de cabeça derivatizado é fosfatidiletanolamina-ácido dicarboxílico, de preferência dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico.
- 14. Lipossoma de acordo com a reivindicação 13, em que a fosfatidiletanolamina é dipalmitoilfosfatidiletanolamina, palmitoiloleoilfosfati-diletanolamina ou dioleoilfosfatidiletanolamina, de preferência dioleoilfosfatidiletanolamina.
- 15. Lipossoma de acordo com a reivindicação 13, em que o ácido ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ dicarboxílico é de preferência ácido glutárico, sebácico, succínico ou tartárico, preferivelmente ácido glutárico.
- 16. Lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende um éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico é definido como na reivindicação 1, com a condição de que n12 seja O ou um número inteiro de 1 a 23, em que o lípido com o grupo de cabeça derivatizado é um lípido capaz de melhorar a circulação.
- 17. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1, em que a bicamada compreende um esterol.
- 18. Lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende um éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico é definido como na reivindicação 1, com a condição de que n12 seja O, ou um número inteiro de 1 a 23, em que a bicamada compreende um lípido neutro.
- 19. Lipossoma de acordo com a reivindicação 18, em que o lípido neutro é uma fosfatidilcolina
- 20. Lipossoma de acordo com a reivindicação 19, em que a fosfatidilcolina é fosfatidilcolina de ovo, palmitoiloleoilfosfatidilcolina ou dioleoilfosfatidilcolina, de preferência dioeloilfosfatidilcolina.
- 21. Lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende um éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico é definido como na reivindicação 1, com a condição de que n12 seja O ou um número inteiro de 1 a 23, compreendendo um lípido capaz de melhorar a circulação.
- 22. Lipossoma de acordo com a reivindicação 21, que compreende ainda um esterol e um lípido neutro.
- 23. Lipossoma de acordo com as reivindicações 16, 18 ou 21, em que o éter lipídico é: 84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ4/7 CH2-0-(CH2)17CH CH-O-CH CH2-0-P(0)2-CH2CH2N(CH3)3,
- 24. Lipossoma de acordo com a reivindicação 23, em que o lípido com o grupo de cabeça derivatizado é dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico.
- 25. Lipossoma de acordo com a reivindicação 17 ou 22, em que o esterol é colesterol.
- 26. Lipossoma de acordo com a reivindicação 22, em que o lípido neutro é dioleoilfosfatidilcolina.
- 27. Lipossoma de acordo com a reivindicação 22, em que a bicamada compreende cerca de 20 porcento molar do éter lipídico, cerca de 10 porcento molar de dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico, cerca de 30 porcento molar de colesterol e cerca de 40 porcento molar de dioleoilfosfatidilcolina.
- 28. Lipossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, compreendendo um agente bioactivo adicional.
- 29. Composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e o lipossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28.
- 30. Método para a preparação de uma composição farmacêutica para administrar um éter lipídico a um animal, que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende o éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico tem a fórmula química: CH2-0-R. CH-Z-R. ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ 5/7 ’ em que R, é Y.,Y2, Y2 é CH3 ou C02H e Y, é (CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)[l7(CH-CH)n8 (CH2)n9; em que a soma n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + +n9 é igual a um número inteiro de 3 a 23, n1 é igual a zero ou é um número inteiro de 3 a 23; n3 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 21; n5 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 18; n7 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 15; n9 é igual a zero ou é um número inteiro de 1 a 12; e cada um de n2, n4, n6 e n8 é independentemente igual a zero ou 1; em que Z é O ou S; em que R2 é YiY2 ou (C(X1)n10(X2)n1i)ni2CX3X4X5, em que cada um de X^ X2, X3, X4 e X5 é independentemente H ou F, n10 é igual a zero, 1 ou 2; n11 é igual a zero, 1 ou 2; n12 é um número inteiro de 1 a 23 e a soma n10 + n11 é igual a 2; e em que R3 tem a fórmula R5-P(0)2-0-R6, Rs é O, S ou NH, R6 é CH2CH2N(CH3)3, CH2CH2NH2, CH2CH(OH)CH2OH, ou CH2CH2NHC(0)R7, e R7 é Y2CH3 ou Y2C02H.
- 31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o animal é um humano.
- 32. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o animal sofre de cancro e em que a preparação farmacêutica compreende uma quantidade anti-cancro eficaz do éter lipídico.
- 33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o cancro é um cancro do pulmão, cérebro, cólon, ovários ou mama.
- 34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a quantidade anti-cancro eficaz do éter lipídico é de cerca de 0,1 mg do éter lipídico por kg de peso corporal do animal ao qual é administrada a composição farmacêutica, a cerca de 1000 mg do éter lipídico por kg de peso corporal. 84 309 ΕΡ 0 785 773/ΡΤ 6/7
- 35. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o animal sofre de uma desordem inflamatória e a preparação farmacêutica compreende uma quantidade anti-inflamatória eficaz do éter lipídico.
- 36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a desordem inflamatória é uma condição artrítica, desordem asmática ou reacção alérgica.
- 37. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a quantidade anti-inflamatória eficaz do éter lipídico é de cerca de 0,1 mg de éter lipídico por kg de peso corporal do animal ao qual é administrada a composição farmacêutica, a cerca de 1000 mg do éter lipídico por kg de peso corporal.
- 38. Método de acordo com a reivindicação 30, em que a composição farmacêutica compreende um agente biologicamente activo adicional.
- 39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o agente biologicamente activo adicional é um agente antineoplásico, agente antimicrobiano, agente anti-inflamatório, lípido terapêutico ou agente estimulante do crescimento celular hematopoiético.
- 40. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o lipossoma tem um diâmetro desde maior que cerca de 50 nm a menor que cerca de 200 nm.
- 41. Método de acordo com a reivindicação 30, em que R, é (CH2 )itCH3.
- 42. Método de acordo com a reivindicação 30, em que R2 é CH3.
- 43. Método de acordo com a reivindicação 30, em que R3 é -0-P(0)2-0-CH2CH2N(CH3)3.
- 44. Método para a preparação de uma composição farmacêutica para administração de um éter lipídico a um animal, que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende o éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico é definido como na reivindicação 1, com a condição de que n12 seja 0 ou um número inteiro de 1 a 23, em que o lípido com o grupo de cabeça derivatizado é fosfatidiletanolamina-ácido dicarboxílico, de preferência ΕΡ Ο 785 773/ΡΤ 7/7 dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico.
- 45. Método para a preparação de uma composição farmacêutica para administração de um éter lipídico a um animal que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende o éter lipídico e um lípido com o grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico é definido como na reivindicação 1, com a condição de que n12 seja 0 ou um número inteiro de 1 a 23, em que a bicamada compreende ainda um esterol e um lípido neutro.
- 46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que o lípido com o grupo de cabeça derivatizado é dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico, o esterol é colesterol, o lípido neutro é dioleoilfosfatidilcolina e o éter lipídico é: CH2-0-(CH2)17CH3 I CH-0-CH3 I CH2-0-P(0)2-CH2CH2N(CH3)3.
- 47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que a bicamada compreende cerca de 20 porcento molar do éter lipídico, cerca de 10 porcento molar de dioleoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico, cerca de 30 porcento molar de colesterol e cerca de 40 porcento molar de dioleoilfosfatidilcolina.
- 48. Método para a preparação de uma composição farmacêutica para administração de um éter lipídico a um animal, que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma com uma bicamada lipídica que compreende o éter lipídico e um lípido com 0 grupo de cabeça derivatizado, em que o éter lipídico é definido como na reivindicação 1 com a condição de que n12 seja 0 ou um número inteiro de 1 a 23, em que o lipossoma compreende um lípido capaz de melhorar a circulação. r£\i IO. 5 U«. Lisboa, Por THE LIPOSOME COMPANY, INC. -°AGTOfi»iNTÓNiO JOÀO DT CUNHA FERREIRÀ Ag. 0|. Pr. Ind. Iííb des Floras, 74 - 4.* 1 SCO LiSBCA
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