PT811073E - Utilização de moduladores imunitários para preparar medicamentos que inibem as respostas imunitárias contra vírus recombinantes co-administrados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE MODULADORES IMUNITÁRIOS PARA PREPARAR MEDICAMENTOS QUE INIBEM AS RESPOSTAS IMUNITÁRIAS CONTRA VÍRUS RECOMBINANTES CO-ADMINISTRADOS"

Esta invenção foi apoiada pelas bolsas dos National Institutes of Health Nos. DK 47757-02 e AI 34412-502. O governo dos Estados Unidos tem certos direitos nesta invenção.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se geralmente a terapia génica, e mais especificamente, à utilização de moduledaores imunitários e vírus recombinantes co-administrados para a preparação de medicamentos nos quais o modulador imunitário inibe a resposta imunitária contra o vírus recombinante.

Antecedentes da Invenção

Os adenovírus recombinantes emergiram como veículos atractivos para transferência de genes in vivo para uma vasta variedade de tipos celulares. A primeira geração de vectores, que são tornados deficientes na replicação por deleção dos genes imediatos precoces Ela e Elb, é capaz de transferência de genes in vivo com elevada eficiência para células alvo que não se dividem [M. Kay et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:2353-2357 (1994); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 92:883-893 1 (1993); B. Quantin et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:2581-2584 (1992); M. Rosenfeld et al., Cell, 68:143 (1992); R. Simon et al. Hum. Gene Thera., 4:771 (1993); Rosenfeld et al., Science, 252:431-434 (1991); Stratford-Perricaudet et al., Hum.

Gene Ther., 1: 241-256 (1990].

As respostas imunitárias do receptor do vector virai, o transgene transportado pelo vector, e as células infectadas pelo virus emergiram como problemas recorrentes na aplicação inicial desta tecnologia a animais e humanos [Yang et al. J. Virol., 69:2004-2015 (1995) (Yang I)]. Virtualmente em todos os modelos, incluindo terapia génica dirigida para o pulmão e dirigida para o fígado, a expressão do transgene é transiente e associada com o desenvolvimento da patologia no sítio da transferência de genes. A natureza transiente da expressão transgénica a partir dos adenovírus recombinantes é devida, em parte, ao desenvolvimento de respostas imunitárias celulares específicas de antigénio contra as células infectadas pelo vírus e sua subsequente eliminação pelo hospedeiro. Especificamente, a primeira geração de vectores, embora com a região Ela removida do vector, expressa proteínas virais adicionalmente ao transgene. Estas proteínas virais activam linfócitos T citotóxicos (CTL) [Y. Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92: 1401-1405 (1995); Y. Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:4407-4411 (1994) (Yang II) e Y. Yang et al., Immunity, 1:433-442 (1994) (Yang III)]. A colaboração de CTL dirigidos contra proteínas virais sintetizadas de novo e células auxiliares T específicas para vírus [Zabner et al. Cell, 75:207-216 (1993); Crystal et al.,

Nat. Genet., 8:42-51 (1994)] leva à destruição das células infectadas por vírus. 2

Outro alvo antigénico para a eliminação mediada de forma imunitária, de células viralmente infectadas, pode ser o produto de um transgene quando esse transgene expressa uma proteína que é estranha ao hospedeiro tratado. Os CTLs são, deste modo, um efector importante na destruição de células alvo, com a activação a ocorrer, em alguns casos, no contexto do produto do transgene, ou das proteínas sintetizadas pelo vírus, sendo ambos apresentados por moléculas da classe I de MHC [Yang I; e Zsengeller et al., Hum. Gene Thera., 6:457-467 (1995)] . Foi também notado que estas respostas imunitárias causam a ocorrência de hepatite associada que se desenvolve em receptores de terapia génica dirigida ao fígado in vivo em 2-3 semanas de tratamento inicial.

Outra limitação dos adenovírus recombinantes para terapia génica foi a dificuldade em obter transferência de genes detectável após uma segunda administração de vírus. Esta limitação é particularmente problemática no tratamento de distúrbios de gene único hereditários ou doenças crónicas, tais como fibrose cística (CF), que necessita de terapias repetidas para obter uma reconstituição genética de longa duração. Foi demonstrada a diminuição da transferência de genes após uma segunda terapia numa vasta variedade de modelos animais após distribuição intravenosa ou intratraqueal do vírus [T. Smith et al., Gene Thera., 5:397 (1993); S. Yei et al., Gene Thera., 1:192-200 (1994); K. Kozarsky et al., J. Biol. Chem., 269: 13695 (1994)]. Em cada caso, a resistência a terapia génica repetida foi associada ao desenvolvimento de anticorpo neutralizante de adenovírus, que impediu a transferência de genes com sucesso a seguir a uma segunda administração de vírus. 3

As potenciais soluções para estes problemas foram dirigidas para o desenvolvimento de virus recombinantes de segunda geração [Y. Yang et al.r Nat. Genet., 1:362-369 (1994) (Yang IV); e J. Engelhardt et ai., Hum. Gene Thera., 2:1217 (1994)] concebidos para diminuir a expressão de proteínas virais sintetizadas de novo, e a utilização de transgenes não imunogénicos, para evitar a activação de CTL. 0 documento W092/19266 (US Gov't/Scholm) descreve um antigénio carcinoembriónico (CEA) recombinante/ vírus vaccinia ou outro vector virai gue estimula uma resposta humoral imunitária e/ou mediada por células, contra CEA quando utilizada in vivo. É também descrita a administração do vector virai com ciclofosfamida. 0 documento W096/12030 (Rhone Poulenc Rorer, Lee e Perricaudet) proporciona a inclusão de um gene adenoviral específico, gpl9k, numa construção de adenovírus para proporcionar um efeito protector numa célula infectada pela construção virai. 0 documento WO96/12406 (Genetic Therapy, Inc., Trapnell) proporciona um método de tratamento envolvendo a administração de um adenovírus e de um imunossupressor seleccionado a partir de anticorpos anti-CD4, imunoglobulina CTLA4 e alguns imunossupressores não específicos; descontinuando o curso da administração e repetindo a administração do agente imunossupressor e o vector adenoviral. Além disso, proporciona a re-administração de um adenovírus recombinante na presença de um modulador imunitário.

Deste modo, permanece a necessidade na técnica de um método e composição para melhorar a eficiência de transferência de genes durante administrações repetidas de terapia génica virai. 4

Sumário da Invenção A presente invenção utiliza um modulador imunitário e um vector virai recombinante para a preparação de um medicamento que resultam numa resposta imunitária reduzida contra o vector virai recombinante utilizado para constituir a terapia. A invenção envolve a co-administração com o vector virai da terapia génica de um modulador imunitário seleccionado, que reduz substancialmente a ocorrência de respostas de anticorpo neutralizante dirigida contra os antigénios codificados pelo vector e/ou a eliminação pelas células T citoliticas da proteína virai contida nas células. A invenção é particularmente útil quando a re-administração do vírus recombinante é desejada. De acordo com a invenção o modulador imunitário pode ser administrado antes ou simultaneamente com o vector virai recombinante que comporta o transgene a ser distribuído.

Contudo, quando o vírus recombinante é um adenovírus, não é reivindicada a re-administração do adenovírus na presença de um modulador imunitário em virtude da revelação no documento WO 96/12406 acima mencionado, que foi publicado depois da data de apresentação do presente caso.

Outras vantagens e aspectos da presente invenção são posteriormente descritos na descrição detalhada que se segue das suas formas de realização preferidas.

Breve Descrição das Figuras A Fig. IA é um gráfico que resume o título de anticorpo neutralizante presente em amostras de fluido de lavagem 5 bronquioalveolar (BAL) de murganhos C57BL-6 infectados com adenovírus no dia 0 e sacrificados no dia 28 como descrito no Exemplo 2. 0 controlo representa murganhos normais ("controlo"); CD4 mAB representa murganhos sem células CD4+; IL-12 representa murganhos tratados com IL-12 nos dias 0 e +1 e IFN-γ representam murganhos tratados com IFN-γ nos dias 0 e +1. Os dados são apresentados como a média ± 1 desvio padrão para as três experiências independentes. A Fig. 1B é um gráfico que resume as quantidades relativas (OD405) da IgG presente em amostras BAL. Os simbolos são como descrito na Fig. IA. A Fig. 1C é um gráfico que resume as quantidades relativas (OD405) da IgA presente em amostras BAL. Os simbolos são como descrito na Fig. IA. A Fig. 2 é um gráfico que resume o titulo de anticorpo neutralizante, expresso como a diluição reciproca de amostras de soro para os animais do Exemplo 4. Os simbolos que representam os murganhos são descritos como se segue: murganhos C57BL-6 infectados com H5.OlOCMVLacZ no dia 0 e com H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos B6"); murganhos C57BL-6 infectados com H5.OlOCMVLacZ inactivados com UV no dia 0 e com H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos B6-UV"); murganhos deficientes em MHC da classe II, infectados com H5.OlOCMVLacZ no dia 0 e com H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos classe II"); murganhos deficientes em microglobulina B2 infectados com H5.OlOCMVLacZ no dia 0 e com H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos p2m~") ; e murganhos C57BL/6 tratados com mAb GK1.5 (anti-CD4) e infectados com 6 Η5.OlOCMVLacZ no dia 0 e com H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos CD4Ab"). A Fig. 3A é um gráfico que resume o titulo de anticorpo neutralizante, expresso como a diluição reciproca de amostras de soro para murganhos C57BL/6 infusionados na veia da cauda no dia 0 com H5.010CMVLDLP no dia 21 com H5. OlOCMVLacZ e no dia 42 com H5.010CBALP, e administrados com soro fisiológico nos dias -3, 0 e 3. 0 titulo é reportado como uma função de dias pós-infecção. A Fig. 3B é um gráfico semelhante ao da Fig. 3A para murganhos C57BL/6 infusionados na veia da cauda no dia 0 com H5.010CMVLDLP e no dia 21 com H5.OlOCMVLacZ, e no dia 42 com H5.010CBALP, e administrados com o mAb anti-CD4 GK1.5 nos dias -3, 0 e 3. A Fig. 3C é um gráfico semelhante ao da Fig. 3A para murganhos C57BL/6 infusionados na veia da cauda no dia 21 com H5. OlOCMVLacZ, e no dia 42 com H5.010CBÃLP, e administrados com o mAb anti-CD4 GK1.5 nos dias -3, 0, 3, 18, 21 e 24. A Fig. 4A é um gráfico que resume as quantidades relativas (OD405) de IgGl presente em amostras de soro como uma função de diluições de amostras, como descrito no Exemplo 6. A Fig. 4B é um gráfico que resume as quantidades relativas (OD405) de IgG2a presente em amostras de soro como uma função de diluições de amostras como descrito em Exemplo 6. 7 A Fig. 5 é um gráfico ilustrando percentagem de lise especifica com infecção simulada ("mock") em células C57SV e infectadas com H5.010CBALP ("ALP") como uma função de proporções efector para alvo, para um ensaio de libertação de 51Cr do Exemplo 6B. Os esplenócitos de murganhos C57BL/6 ("B6") e murganhos C57BL/6 tratados com IL-12 ("B6+IL12") 10 dias após administração de H5.010CBALP, foram re-estimulados in vitro com H5.OlOCMVLacZ durante 5 dias. A Fig. 6A é um gráfico de barras que proporciona os anticorpos neutralizantes para Ad5 obtidos no BAL (experiência do pulmão) do Exemplo 7. Os resultados na coluna 1 são de murganhos C57BL/6 (controlo), os resultados da coluna 2 são de murganhos desactivados deficientes para CD40L (CD40L-KO) e os resultados da coluna 3 são de murganhos C57BL/6 tratados com anticorpo CD40L (CD40L Ab) . Os dados são apresentados como a média do titulo de anticorpo neutralizante das três amostras +/- 1 D.P. A Fig. 6B é um gráfico de barras como descrito na Fig. 6A, com os dados obtidos para o soro para a experiência do fígado do Exemplo 7. A Fig. 7A é um gráfico de linhas comparando a percentagem de lise específica em linfócitos recolhidos de murganhos C57BL/6 controlo (círculos abertos) e de murganhos C57BL/6 tratados com anticorpo contra CD40L (círculos a cheio). Sete dias após a administração do vírus, os linfócitos foram re-estimulados in vitro durante 5 dias e testados para lise específica em células C57SV com infecção simulada num ensaio de libertaçãode 51Cr de 6 horas. A percentagem de lise específica é expressa como uma função da proporção do diferente efector para o alvo (6:1, 12:1, 25:1, e 50:1). Os esplenócitos foram utilizados para esta experiência do pulmão. A Fig. 7B é um gráfico de linhas como descrito na Fig. 7A, utilizando células C575V infectadas com vírus. A Fig. 7C é um gráfico de linhas como descrito na Fig. 7A, utilizando células com infecção simulada. As células do nódulo da linfático mediastinal (MLN) foram utilizadas para estas experiências do fígado. A Fig. 7D é um gráfico de linhas como descrito na Fig. 7A, utilizando células infectadas com vírus. As células MLN foram utilizadas para estas experiências do fígado.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção utiliza um modulador imunitário para a preparação de um medicamento para melhorar a capacidade de um animal ou humano tolerar a administração de vectores virais de terapia génica. A invenção proporciona um medicamento para evitar de forma transiente a activação de células T CD4+ que estão envolvidas nas barreiras celulares e humorais à terapia génica. A invenção envolve a administração a um indivíduo a receber um vector de terapia genica, de uma quantidade adequada, de um modulador imunitário de modo preferido, de actuação rápida. O modulador imunitário é, de modo preferido, administrado simultaneamente com a administração do vector de terapia génica, i. e., um vírus recombinante, utilizado para distribuir um transgene terapêutico desejado para terapia 9 génica. 0 modulador imunitário pode também ser administrado antes ou depois da administração do vector, desde que, quando o virus recombinante é um adenovirus, a referida utilização é

ainda caracterizada por 0 adenovirus ser re-administrado na ausência de um moduledaor imunitário. A re-administração do adenovirus na presença de um modulador imunitário não é reivindicada atendendo ao que é revelado no documento WO 96/12406 como mencionado acima. A invenção, que evita o desenvolvimento de respostas imunitárias celulares e humorais adversas a vectores virais de terapia génica, é baseada na supressão imunitária para bloquear a activação de células T auxiliares, especificamente a função CD4, e células B. Em contraste com a técnica anterior, que envolvia supressão imunitária crónica por administração continua de fármacos imunossupressores não específicos, a presente invenção utiliza uma abordagem transiente da imunossupressão. Sem desejar estar restritos pela teoria, os requerentes teorizam que o estímulo primário para a activação imunitária são as proteínas da cápside virai do vector recombinante. A imunossupressão crónica não é necessária neste cenário.

Especificamente, a ablação transiente da função CD4 na altura ou próximo da administração do vírus recombinante, de acordo com esta invenção, evita a formação do anticorpo neutralizante, permitindo deste modo a eficiente transferência de genes a seguir a, pelo menos, duas administrações subsequentes de vectores virais de terapia génica.

Como ilustrado a seguir, a administração de moduladores imunitários de acordo com a invenção é, de modo preferido, conduzido apenas na altura da administração do vírus. Contudo, pode ser necessária uma modulação imunitária mais prolongada do 10 que a necessária nos seguintes exemplos de transferência de genes para fígado e/ou pulmão de murganho, dependendo da maneira em que os antigénios são apresentados nos diferentes protocolos de terapia génica. Deste modo, o método de modulação imunitária transiente da invenção pode, em certas circunstâncias, ser combinados com imunossupressão de longo prazo ou outras terapias imunomodulatórias. I. Moduladores imunitários 0 modulador imunitário seleccionado é aqui definido como um agente capaz de inibir a formação, por células B activadas, de anticorpos neutralizantes dirigidos contra o vector virai recombinante e/ou capaz de inibir a eliminação do vector por linfócitos T citolíticos (CTL). 0 modulador imunitário pode ser seleccionado para interferir com as interacções entre os subconjuntos de auxiliares T (THi ou TH2) e células B para inibir a formação de anticorpos neutralizantes. Alternativamente, o modulador imunitário pode ser seleccionado para inibir a interacção entre células THi e CTLs para reduzir a ocorrência da eliminação do vector pelos CTL. Mais especificamente, o modulador imunitário interfere desejavelmente com ou bloqueia a função das células T CD4.

Os moduladores imunitários para utilização na inibição de formação de anticorpo neutralizante, de acordo com esta invenção, podem ser seleccionados com base na determinação do subtipo de imunoglobulina de qualquer anticorpo neutralizante produzido em resposta ao vector virai. 0 anticorpo neutralizante que se desenvolve em resposta à administração de um vector de terapia génica virai é frequentemente baseada na identidade do 11 vírus, na identidade do transgene, do veículo que é utilizado para distribuir o vector e/ou da localização do alvo ou tipo de tecido para distribuição do vector virai.

Por exemplo, as células TH2 são geralmente responsáveis por interferir com a eficiente transferência de genes administrados durante a terapia génica. Isto é particularmente verdade quando o vector virai é baseado em adenovirus. Mais particularmente, os requerentes determinaram que os anticorpos neutralizantes dos subtipos, IgGl e IgA, que são dependentes da interacçâo entre as células TH2 e células B, parecem ser a causa principal dos anticorpos neutralizantes principais contra vectores adenovirais. A identidade dos anticorpos neutralizantes induzidos pela administração de um vector virai recombinante especifico de terapia génica é rapidamente determinada em ensaios de animais. Ver, e. g., Exemplo 6. Por exemplo, a administração de vectores adenovirais através dos pulmões induz geralmente a produção de anticorpos neutralizantes IgA, enquanto a administração de vectores adenovirais através do sangue induz geralmente anticorpos neutralizantes IgGi. Nestes casos, uma resposta imunitária dependente de TH2 interfere com a transferência do vector virai com base em adenovirus portador de um transgene terapêutico.

Quando o anticorpo neutralizante induzido pela administração do vector virai é um anticorpo mediado por TH2, tal como IgA ou igGi, o modulador imunitário seleccionado desejavelmente suprime ou evita a interacçâo das células TH2 com células B. Alternativamente, se se verifica que o anticorpo neutralizante induzido é um anticorpo mediado por THi, tal como IgG x 2A, o 12 modulador imunitário desejavelmente suprime ou evita a interacção de células THi com células B. Quando é desejada a redução da eliminação de vectores virais por CTL, assim como o bloqueio da formação do anticorpo neutralizante, o modulador imunitário é seleccionado pela sua capacidade para suprimir ou bloquear as células THi CD4+, para permitir uma residência prolongada do vector virai in vitro.

Os moduladores imunitários podem compreender proteínas solúveis ou que ocorrem naturalmente, incluindo citocinas e anticorpos monoclonais. Os moduladores imunitários podem compreender outros produtos farmacêuticos. Adicionalmente, os moduladores imunitários, de acordo com a invenção, podem ser utilizados isoladamente ou em combinação uns com os outros. Por exemplo, ciclofosfamida e o modulador imunitário mais específico anticorpo monoclonal anti-CD4 pode ser co-administrado. Nesse caso, a ciclofosfamida serve como um agente para bloquear a activação de THi e para estabilizar a expressão transgénica para lá do período transiente de bloqueio imunitário induzido pelo tratamento com MAb anti-CD4.

Uma quantidade adequada ou dosagem do modulador imunitário seleccionado dependerá primariamente da identidade do modulador, a quantidade do vector recombinante portador do transgene que é inicialmente administrada ao doente, e o método e/ou sítio de distribuição do vector. Estes factores podem ser avaliados empiricamente por um especialista da técnica utilizando os processos aqui descritos. Outros factores secundários tais como o estado a ser tratado, a idade, peso, saúde geral, e estado imunitário do doente, podem também ser considerados pelo médico na determinação da dosagem do modulador imunitário a ser 13 distribuído ao doente em conjunto com um vector de terapia génica, de acordo com esta invenção.

Geralmente, por exemplo, uma dosagem humana terapeuticamente eficaz de uma proteína modulador imunitário, e. g., IL-12 ou IFN-γ, é administrada no intervalo de cerca de 0,5 pg a cerca de 5 mg por cerca de 1 x 107 pfu/mL de vírus vector. Podem ser determinadas várias dosagens por um especialista da técnica para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais. A. Anticorpos Monoclonais e Proteínas Solúveis

De modo preferido, uma resposta imunitária adversa ao vector de terapia genica de acordo com a invenção envolve inactivação não específica de células CD4+ através, por exemplo, da administração de um anticorpo monoclonal apropriado. De modo preferido, estes anticorpos bloqueadores são "humanizados" para evitar que o receptor monte uma resposta imunitária ao anticorpo bloqueador. Um "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo possuindo as suas regiões determinantes complementares (CDRs) e/ou outras porções das suas regiões de estrutura dos domínios variáveis leves e/ou pesados derivados de um dador não humano de imunoglobulina, sendo as restantes partes da molécula derivadas da imunoglobulina derivadas de uma ou mais imunoglobulinas humanas. Estes anticorpos podem também incluir anticorpos caracterizados por uma cadeia pesada humanizada associada com uma cadeia leve não modificada de um dador ou receptor ou uma cadeia leve quimérica, ou vice-versa. Esta "humanização" pode ser conseguida através de métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, G.E. Mark e E. A. Padlan, "Cap. 4. "Humanization of 14

Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 113, Springer-Verlag, Nova Iorgue (1994), pp. 105-133, que é agui incorporada por referência.

Outros anticorpos apropriados incluem os gue inibem especificamente ou removem células CD4+, tal como um anticorpo dirigido contra CD4 da superfície celular. Foi demonstrado pelos requerentes que a remoção de células CD4+ inibia a eliminação do virai vector por CTL. Estes agentes moduladores incluem, mas não estão limitados a anticorpos anti-células T, tais como anti-0KT3+ [ver, e. g., Patente US N° 4 658019; Pedido de Patente Europeia N° 501233, publicada em 2 de Setembro, 1992] . Ver Exemplo 2 a seguir, que emprega o anticorpo comercialmente disponível GK1.5 (N° de Acesso ATCC TIB207) para remover células CD4+.

Alternativamente, qualquer agente que interfere com ou bloqueia as interacções necessárias para a activação das células B pelas células TH, e deste modo a produção de anticorpos neutralizantes, é útil como um modulador imunitário de acordo com os métodos desta invenção. Por exemplo, a activação das células B pelas células T requer que ocorram certas interacções [F. H. Durie et al, Immunol. Today, 15 (9):406-410 (1994)], tal como a ligação do ligando de CD40 da célula auxiliar T ao antigénio CD40 na célula B, e a ligação dos ligandos CD28 e/ou CTLA4 na célula T ao antigénio B7 na célula B. Sem ambas as interacções, a célula B não pode ser activada para induzir a produção do anticorpo neutralizante. A interacção ligando CD40 (CD40L)-CD40 é um ponto desejável para bloquear a resposta imunitária aos vectores de terapêutica genética devido à sua vasta actividade tanto na activação como 15 na função de células auxiliares T, assim como a ausência de redundância na sua via de sinalização. Um método presentemente preferido da presente invenção envolve assim o bloqueamento transiente da interacção de CD40L com CD40 no momento da administração do vector adenoviral. Isto pode ser realizado por tratamento com um agente que bloqueia o ligando CD40 na célula TH e interfere com a ligação normal do ligando CD40 na célula auxiliar T com o antigénio CD40 na célula B. 0 bloqueamento da interacção CD40L-CD40 evita a activação das células T auxiliares que contribuem para problemas com a estabilidade e re-administração do transgene.

Deste modo, um anticorpo para o ligando CD40 (anti-CD40L) [disponível em Bristol-Myers Squibb Co; ver, e. g., Pedido de Patente Europeia 555880, publicado em 18 de Agosto de 1993] ou uma molécula de CD40 solúvel pode ser um modulador imunitário seleccionado de acordo com a invenção.

Alternativamente, um agente que bloqueia os ligandos CD28 e/ou CTLA4 presentes nas células T auxiliares interfere com a ligação normal destes ligandos com o antigénio B7 na célula B. Deste modo, uma forma solúvel de B7 ou um anticorpo para CD28 ou CTLA4, e. g.r CTLA4-Ig [disponível em Bristol-Myers Squibb Co; ver, e. g.r Pedido de Patente Europeia 606217, publicado em 20 de Julho de 1994] pode ser o modulador imunitário seleccionado de acordo com a invenção. A invenção possui mais vantagens do que a administração de citocina descrita abaixo para prevenir a activação de TH2, porque se debruça tanto sobre as respostas imunitárias celulares como humorais aos antigénios estranhos. 16 B. Citocinas

Ainda outros moduladores imunitários que inibem a função da célula TH podem ser empregues na invenção.

Deste modo, numa forma de realização, um modulador imunitário para utilização na invenção que inibe selectivamente a função do subconjunto THi das células T auxiliares CD4+ pode ser administrado no momento da administração primária do vector virai. Um tal modulador imunitário é a interleucina-4 (IL-4). IL-4 aumenta a actividade especifica do antigénio das células TH2 às custas da função da célula THi [ver, e. g.r Yokota et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:5894-5898 (1986); Patente dos

Estados Unidos N° 5017691]. Está contemplado que outros moduladores imunitários que podem inibir a função da célula THi também irá ser útil na invenção.

Noutra forma de realização, o modulador imunitário pode ser uma citocina que evita a activação do sub-conjunto TH2 de células T auxiliares. O sucesso desta forma de realização depende da contribuição relativa que os isotipos Ig dependentes de TH2 desempenham na neutralização de virus, cujo perfil pode ser afectado pela estirpe, a espécie do animal, assim como o modo de distribuição do vírus e órgão alvo.

Um modulador imunitário desejável para utilização na invenção que inibe selectivamente a função do sub-conjunto TH2 de células T CD4+ no momento da administração primária do vector virai inclui interleucina-12 (IL-12). A IL-12 aumenta a actividade específica para o antigénio das células THi às custas da função das células TH2 [ver, e. g., Pedido de Patente Europeia N° 441900; P. Scott, Science, 260:496-497 (1993); R. Manetti et 17 al. J. Exp. Med., 177:1199 (1993); A. D'Andrea et al. J. Exp. Med., 176:1387 (1992)]. IL-12 para utilização na invenção é, de um modo preferido, na forma de proteína. Pode ser produzida IL-12 humana de forma recombinante utilizando técnicas conhecidas ou pode ser obtida comercialmente. Alternativamente, pode ser construída num vector virai (que, opcionalmente pode ser o mesmo que é utilizado para expressar o transgene) e expressa numa célula alvo in vivo ou ex vivo. A remoção específica de TH2 com IL-12 é particularmente eficaz em terapêuticas genéticas dirigidas ao pulmão em que IgA é a fonte principal do anticorpo neutralizante. Em terapia génica dirigida ao fígado, tanto as células THi como TH2 contribuem para a produção de anticorpos específicos para vírus. Todavia, a quantidade total de anticorpo neutralizante pode ser diminuída com IL-12.

Outro modulador imunitário seleccionado que realiza uma função semelhante é o interferão gama (IFN-γ) [S.C. Morris et al. J. Immunol., 152:1047-1056 (1994); F.P. Heinzel et al. J. Exp. Med., 177:1505 (1993)]. Crê-se que o IFN-γ medeia muitos dos efeitos biológicos de IL-12 através da secreção de macrófagos activados e células T auxiliares. O IFN-γ também inibe parcialmente a activação de TH2 estimulada por IL-4. O IFN-γ também pode ser obtido a partir de uma variedade de fontes comerciais.

Alternativamente, pode ser construído num vector virai e expresso numa célula alvo in vivo ou ex vivo utilizando técnicas de engenharia genética conhecidas. 18

De um modo preferido, esses moduladores imunitários de citocina estão na forma de proteínas humanas recombinantes. Estas proteínas podem ser produzidas através de métodos existentes na técnica. Péptidos activos, fragmentos, subunidades ou análogos dos moduladores imunitários conhecidos aqui descritos, tais como IL-12 ou interferão gama, que partilham a função inibidora de TH2 destas proteínas, serão também úteis neste método quando os anticorpos neutralizantes são mediados por Th2.

Como ilustrado nos exemplos abaixo, as citocinas IL-12 (que activam células THi para secretar IFN-γ) e IFN-γ demonstram eliminar apenas a imunidade humoral (i. e., eles inibem a diferenciação de TH2) . A co-administração de qualquer das citocinas no momento da instilação do vírus previne a formação de IgA e permitiu a re-administração eficiente de vírus.

Para permitir uma segunda administração eficaz de vírus na terapia génica dirigida ao fígado, o método pode, de um modo preferido, compreender a administração de mais do que uma citocina, regimes de dosagem específicos e/ou co-administração de um modulador imunológico adicional, tais como um ou mais dos anticorpos discutidos acima. A utilização de citocinas é vantajosa porque as citocinas são produtos naturais, e por isso não é provável que criem quaisquer respostas imunitárias adversas no doente ao qual sejam administradas. C. Outros Produtos Farmacêuticos

Outros moduladores imunitários ou agentes que inibem não especificamente a função imunitária, i. e., ciclosporina A ou 19 ciclofosfamida, também podem ser utilizados nos métodos da invenção. Por exemplo, uma administração de curta duração de ciclofosfamida demonstrou interromper com sucesso a activação de células auxiliares T, tanto CD4 como CD8 para a proteina da cápside de adenovirus no momento da distribuição do vírus ao fígado. Como resultado, a expressão do transgene foi prolongada e, em doses mais elevadas, foi prevenida a formação do anticorpo neutralizante, permitindo a re-administração do vector com sucesso. No pulmão, a ciclofosfamida preveniu a formação de anticorpos neutralizantes em todas as doses e estabilizou a expressão do transgene a uma dose elevada. II. Vectores Virais

Vectores virais adequados úteis em terapia génica são bem conhecidos, incluindo retrovírus, vírus vaccinia, poxvírus, adenovirus e vírus adeno-associados, entre outros. 0 método desta invenção é antecipado que seja útil com qualquer vírus que forme a base de um vector de terapia génica. Todavia, exemplos de vectores virais para utilização nos métodos da invenção são vectores de adenovirus [ver, e. g., M.S. Horwitz et al. "Ãdenoviridae and Their Replication", Virology, segunda edição, pp. 1712, ed. B.N. Fields et al. Raven Press Ltd., Nova Iorque (1990); M. Rosenfeld et al. Cell, 68:143- 155 (1992); J.F.

Engelhardt et al. Human Genet. Ther., 4:759-769 (1993); Yang IV; J. Wilson, Nature, 365:691-692 (Out. 1993); B.J. Cárter, em "Handbook of Parvoviruses", ed. P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990). São particularmente desejáveis adenovirus humanos de tipo C (Ad), incluindo os serotipos Ad2 e Ad5, que tornaram a 20 replicação deficiente para terapia génica eliminando o locus do gene precoce que codifica Ela e Elb. Realizaram-se muitas publicações sobre a utilização de adenovírus com EI removido, em terapia génica. Ver, K.F. Kozarsky e J.M. Wilson, Curr. Opin. Genet. Dev., 3:499-503 (1993). As sequências de ADN de vários dos tipos de adenovírus estão disponíveis em Genbank, incluindo o tipo Ad5 [N° Acesso no Genbank M73260]. As sequências de adenovírus podem ser obtidas a partir de qualquer tipo de adenovírus conhecido, incluindo os 41 tipos humanos presentemente identificados [Horwitz et al. Virology, 2a ed., B.N. Fields, Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1990)]. Estão disponíveis uma variedade de estirpes de adenovírus na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ou disponíveis a pedido de uma variedade de fontes comerciais e institucionais. Na seguinte forma de realização, um adenovírus de tipo 5 (Ad5) é utilizado por conveniência. A selecção do vírus útil para construir os vectores recombinantes, incluindo o tipo virai, e. g., adenovírus, e estirpe não se prevê que limitem a seguinte invenção.

De um modo semelhante, a selecção do transgene contido no vector virai não é uma limitação desta invenção. Prevê-se que este método seja útil com qualquer transgene. Transgenes adequados para distribuição a um doente num vector virai para terapia génica podem ser seleccionados pelos especialistas na técnica. Estas sequências de ácido nucleico terapêuticas codificam tipicamente produtos para administração e expressão num doente in vivo ou ex vivo para substituir ou corrigir um defeito genético herdado ou não herdado ou tratar um distúrbio ou epigenético ou doença. Esses genes terapêuticos que são desejáveis para o desempenho da terapia génica incluem, sem 21 limitação, um gene receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-R) para o tratamento de hipercolesterolemia familiar ou hiperlipidemia familiar combinada, o gene regulador de transmembrana da fibrose cistica (CFTR) para o tratamento de fibrose cistica, alelo de DMD Becker para o tratamento de distrofia muscular de Duchenne, e uma variedade de outros genes que podem ser rapidamente seleccionados por um especialista na técnica para tratar um distúrbio ou doença particular. Deste modo, a selecção do transgene não é considerada como sendo uma limitação desta invenção, como tal a selecção está dentro do conhecimento dos especialistas na técnica. 0 vector virai comportando um gene terapêutico pode ser administrado a um doente, de um modo preferido, suspenso numa solução biologicamente compatível ou veiculo de distribuição farmaceuticamente aceitável. Um veiculo adequado inclui soro fisiológico estéril. Outras soluções aquosas e não aquosas isotónicas e injecção estéril e suspensões aquosas e não aquosas estéreis conhecidas como sendo veículos farmaceuticamente aceitáveis e bem conhecidas do especialista da técnica podem ser empregues para este objectivo. 0 vector virai é administrado em quantidades suficientes para transfectar as células desejadas e proporcionar níveis suficientes de transdução e expressão do transgene seleccionado para proporcionar um benefício terapêutico sem efeitos adversos indesejáveis ou com efeitos fisiológicos medicamente aceitáveis que podem ser determinados pelos especialistas nas técnicas médicas. Vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem distribuição directa ao órgão alvo, tecido ou sítio, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, 22 intradérmica, oral e outras vias de administração parentéricas. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.

As dosagens do vector virai irão depender principalmente de factores, tais como o estado a ser tratado, o gene seleccionado, a idade, peso e saúde do doente, e por isso pode variar entre doentes. Por exemplo, uma dosagem humana terapeuticamente eficaz dos vectores virais está geralmente no intervalo desde cerca de 20 até cerca de 50 mL de solução de soro fisiológico contendo concentrações desde cerca de 1 x 107 até 1 x IO10 pfu/mL de virus. Uma dosagem preferida para adulto humano é de cerca de 20 mL de solução de soro fisiológico nas concentrações acima. A dosagem será ajustada para equilibrar o beneficio terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais. Os níveis de expressão do gene seleccionado podem ser monitorizados para determinar a selecção, ajuste ou frequência da dosagem de administração. III. Administração do medicamento da invenção A invenção envolve a co-administração do modulador imunitário seleccionado com o vector virai recombinante seleccionado. A co-administração ocorre de modo a que o modulador imunitário e vector são administrados numa proximidade de tempo muito curta em relação um ao outro. É presentemente preferido administrar o modulador em simultâneo com, ou não mais do que um a três dias antes da administração do vector. O modulador imunitário pode ser administrado separadamente do vector recombinante, ou, se desejado, pode ser administrado em mistura com o vector recombinante. 23

Como ilustrado pelos exemplos abaixo, o modulador imunitário, quer seja um anticorpo anti-CD40L, anticorpo anti-CD4 ou citocina, é administrado desejavelmente numa proximidade de tempo curta em relação à administração do vector virai utilizado para terapia génica. Particularmente, a administração de IL-12 ou IFN-γ provoca redução nos níveis de células C\) az Eh durante cerca de 2-3 dias. Por isso, IL-12 e/ou IFN-γ são administrados desej avelmente no espaço de um dia após a administração do vector virai contendo o gene a ser distribuído. De um modo preferido, todavia, o IL-12 e/ou IFN-γ são administrados essencialmente em simultâneo com o vector virai. 0 modulador imunitário pode ser administrado num veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, tal como soro fisiológico. Por exemplo, quando formulado separadamente do vector virai, o modulador imunitário é desejavelmente suspenso em solução de soro fisiológico. Uma tal solução pode conter componentes convencionais, e. g. ajustadores de pH, conservantes e semelhantes. Esses componentes são conhecidos e podem ser rapidamente seleccionados por um especialista na técnica.

Alternativamente, o modulador imunitário pode ser ele próprio administrado como ADN, quer separadamente do vector ou misturado com o vector recombinante contendo o transgene.

Existem métodos na técnica para a preparação farmacêutica do modulador como proteína ou como ADN [Ver, e. g., J. Cohen,

Science, 259:1691-1692 (1993) em relação a vacinas de ADN].

Desejavelmente, o modulador imunitário é administrado pela mesma via que o vector recombinante. 0 modulador imunitário pode ser formulado directamente na composição contendo o vector virai administrado ao doente. 24

Alternativamente, o modulador imunitário pode ser administrado separadamente, de um modo preferido, imediatamente antes ou depois da administração do vector virai. Noutra alternativa, a composição contendo um modulador imunológico, tal como IL-12, pode ser administrado separadamente de uma composição contendo um segundo modulador imunológico, tal como anticorpo anti-CD40L, e assim em diante dependendo do número de moduladores imunitários administrados. Estas administrações podem independentemente ser antes, em simultâneo com, ou após a administração do vector virai. A administração do modulador imunitário seleccionado pode ser repetida durante o tratamento com o vector virai recombinante comportando o transgene durante o período de tempo em que o transgene é expresso (como monitorizado pelos ensaios que detectam a expressão transgénica ou o seu efeito pretendido), ou com cada reforço do vector recombinante. Alternativamente, cada re-injecção do mesmo vector virai pode empregar um modulador imunológico diferente. Todavia, quando o vírus recombinante é um adenovírus, a sua utilização é ainda caracterizada por o adenovírus ser re-administrado na ausência de um modulador imunitário. A re-administração do adenovírus na presença de um modulador imunitário não é reivindicada à luz da revelação no documento WO 96/12406, como mencionado acima.

Uma vantagem da invenção é que representa uma manipulação transiente, necessária apenas no tempo de administração do vector de terapia génica. Prevê-se que esta estratégia seja mais segura do que as estratégias baseadas na indução de tolerância, que pode prejudicar permanentemente a capacidade do recipiente para responder a infecções virais. 25

Além disso, prevê-se que a utilização preferida de moduladores imunitários tais como as citocinas ou anticorpos acima mencionados seja mais segura do que a utilização de agentes tais como ciclosporina ou ciclofosfamida (que provoca supressão imunitária generalizada) porque a modulação imunitária transiente é selectiva (i. e., as respostas mediadas por CTL são retidas, tal como o são as respostas humorais dependentes da função de THi) .

Num exemplo de transferência de genes eficiente de acordo com a invenção, os moduladores imunitários seleccionados são IL-12, que provoca a indução selectiva de células THi, e/ou IFN-γ, que suprime a indução de células TH2. Outro modulador imunológico preferido é o anticorpo anti-CD4+, GK1.5, que elimina as células THi e reduz a eliminação de CTL do vector. Ainda outro modulador imunológico preferido é o anticorpo monoclonal anti-ligando CD4 0, MR1, disponível na American Type Culture Collection, Rockville, MD.

Como exemplificado abaixo, a utilização dos moduladores imunitários acima identificados permitiram a transferência genética eficiente, assim como a utilização repetida do mesmo vector virai. Em conjunção com a terapia génica que utilizou um vector de adenovirus contendo ou um transgene de fosfatase alcalina ("ALP"), um transgene de beta-galactosidase ("LacZ") ou um transgene do receptor da lipoproteína de baixa densidade CLDLR") .

Os exemplos seguintes ilustram os métodos preferidos para preparar vectores virais adequados úteis na terapia génica de acordo com a invenção. Estes exemplos são apenas ilustrativos e não limitam o âmbito da invenção. 26

Exemplo 1 Construção e Purificação de Vectores de

Adenovírus Recombinantes Exemplificativos 0 adenovírus recombinante H5.OlOCMVlacZ, foi construído como se segue. 0 plasmídeo pAd.CMVlac [descrito em Kozarsky et al. J. Biol. Chem., 269(18):13695-13702 (1994)], que contém as unidades de mapa de adenovírus de 0-1, seguido por um intensificador/promotor de citomegalovírus [Boshart et al. Cell, 41:521-530 (1985)], um gene da beta-galactosidase de E. coli (LacZ), um sinal de poliadenilação (PA), 5 unidades de mapa de adenovírus 9,2-16 (Ad 9.2-16) e foram utilizadas sequências de plasmídeo genérico incluindo uma origem de replicação e gene de resistência a ampicilina. pAd.CMVlacZ foi linearizado com Nhel e co-transfectado em células 293 [ATCC CRL1573] com ADN de sub360 (derivado do adenovírus de tipo 5) que tinha sido digerido com Xbal e Ciai como previamente descrito [K.F. Kozarsky, Somatic Cell Mol. Genet, , 19:449-458 (1993) e Kozarsky (1994), citados acima]. O vírus recombinante resultante, H5.OlOCMVlacZ, contém unidades de mapa de adenovírus 0-1, seguido por um

intensificador/promotor de CMV, um gene lacZ, um sinal de poliadenilação (PA), unidade de mapa de adenovírus 9,2-100, com uma pequena deleção no gene E3 a 78,5 a 84,3 mu de Ad 5 sub360 da estrutura. O adenovírus recombinante H5.010CBALP contém as unidades de mapa de adenovírus 0-1, seguido por um CMV aumentado, promotor da β-actina citoplásmica de galinha [T.A. Kost et al. Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)], um gene ALP de placenta humana, um sinal de poliadenilação (PA), e unidade de mapa de adenovírus de tipo 5 9-100, com uma pequena deleção no gene E3 a 78,5 a 84,3 mu de Ad 5 sub360 da estrutura. Este adenovírus recombinante foi construído substancialmente de um 27 modo semelhante ao adenovírus H5.OlOCMVlacZ descrito acima. Ver, também, Kozarsky (1994), citado acima.

Estes adenovírus recombinantes, H5.OlOCMVlacZ e H5.010CBALP, foram isolados após transfecção [Graham, Virol., 52:456-467 (1974)], e foram sujeitos a duas rondas de purificação de placas. Os lisados foram purificados em dois gradientes de densidade de cloreto de césio sequencial como previamente descrito [Englehardt et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:11192-11196 (1991)]. 0 cloreto de césio foi removido passando o vírus por colunas de filtração em gel BioRad DG10 utilizando soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).

Para experiências com murganhos, o vírus foi quer utilizado fresco, ou após purificação em coluna, foi adicionado glicerol para uma concentração final de 10% (v/v), e o vírus foi armazenado a -70 °C até utilização.

Exemplo 2 - Aumento de Transferência de Genes Mediada por Adenovírus após Segunda Administração por IL-12 e IFN-γ em Pulmão de Murganho.

Os adenovírus recombinantes H5.OlOCMVlacZ e H5.010CBALP foram utilizados neste exemplo. Cada vírus expressa um transgene repórter diferente cuja expressão pode ser discriminada daquela do primeiro transgene repórter.

Murganhos C57BL/6 fêmea (de 6-8 semanas de idade) foram infectados com suspensões de H5.010CBALP (1 x 109 pfu em 50 pL de PBS) através da traqueia no dia 0 e de um modo semelhante com H5.OlOCMVlacZ no dia 28. Foi utilizado um grupo desses murganhos 28 como um controlo. Outro grupo de murganhos foi desprovido de células CD4+ da forma aguda por injecção i.p. do anticorpo para células CD4+ (GK1.5; ATCC No. TIB207, diluição 1:10 de ascites) no tempo da terapia génica inicial (dias -3, 0, e +3) . Um terceiro grupo de murganhos foi injectado com IL-12 (injecções de 1 pg intratraqueal ou 2 pg, i.p.) no momento da primeira administração de virus (dias 0 e +1). Um quarto grupo de murganhos foi injectado com interferão gama (injecções 1 pg intratraqueal ou 2 pg, i.p.) no momento da primeira administração de virus (dias 0 e +1).

Quando os murganhos foram subsequentemente sujeitos a eutanásia e a necropsia nos dias 3, 28, ou 31, os tecidos de pulmão foram preparados para criossecções, enquanto que a lavagem bronquioalveolar (BAL) e os nódulos linfáticos mediastinais (MLN) foram recolhidos para ensaios imunológicos. A. Criossecções

Os tecidos de pulmão foram avaliados para expressão de ALP no dia 3 e dia 28 por coloração histoquímica, seguindo os processos de Yang I, citado acima. A expressão de β-galactosidase foi avaliada no dia 31 por coloração histoquímica com X-gal. Os resultados descritos abaixo foram obtidos a partir de colorações com fosfatase alcalina (amplificação X100) ou colorações com β-galactosidase X-gal (amplificação X100). A instilação de virus ALP (109 pfu) nas vias respiratórias de todos os grupos dos murganhos C57BL/6 resultou num nível de expressão transgénica elevada na maioria das vias respiratórias

condutoras que diminuíram até níveis indetectáveis ao dia 28. A 29 perda de expressão transgénica demonstrou ser devida à eliminação mediada por CTL dos hepatócitos geneticamente modificados [Yang I, citado acima]. Nos murganhos de controlo, não foi detectada expressão genética recombinante três dias após a segunda administração de virus, i. e., no dia 31. A administração de vírus aos animais desprovidos de CD4 + foi associada à expressão transgénica recombinante de nivel elevado que foi estável durante um mês. A expressão do segundo vírus foi detectável no dia 31. Deste modo, a eliminação das células CD4+ permitem eficazmente a re-administração do vector sem a eliminação imediata de CTL. 0 nível elevado inicial da transferência genética diminuiu após cerca de um mês nos murganhos tratados com IL-12. Todavia, em contraste com o controlo, o nível elevado de transferência de genes para as células epiteliais das vias respiratórias foi atingido quando o vírus foi re-administrado aos animais tratados com IL-12 no dia 28, como observado nos resultados do dia 31.

Animais tratados com interferão gama foram virtualmente indistinguíveis dos animais tratados com IL-12 em que a transferência de genes eficiente foi atingida após uma segunda administração de vírus.

Deste modo, a utilização destas citocinas como moduladores imunitários permitiram a administração repetida do vector sem a sua eliminação imediata por anticorpo neutralizador. Noutras experiências, as células TH2 não foram inibidas à custa de activação incrementada de THi. Em murganhos tratados com o vírus ALP parentericamente e IL-12 i.p., o IL-12 não aumentou a actividade de CTL específica de adenovírus como demonstrado 30 através de ensaios de libertação de crómio. Mais importante, o tratamento dos animais com IL-12 no momento da instilação intratraqueal do virus não aumentou a inflamação ou diminuiu a persistência do transgene a seguir a uma segunda administração de virus.

B. Ensaios Imunológicos - MLN

Linfócitos do MLN do grupo controlo e grupo tratado com IL-12 de murganhos C57BL/6 foram recolhidos 28 dias após a administração de H5.010CBÃLP e re-estimulados in vitro com H5.OlOCMVlacZ inactivado com UV a 10 partículas/célula durante 24 horas. Foram ensaiados sobrenadantes isentos de células para a presença de IL-2 ou IL-4 em células HT-2 (uma linha de células dependentes de IL-2 ou de IL-4) [Yang I, citado acima]. A presença de IFN-γ no mesmo sobrenadante de cultura de linfócito foi medida em células L929, como descrito [Yang I, citado acima]. O índice de estimulação (S.I.) foi calculado dividindo 3H-timidina cpm incorporado em células HT-2 cultivadas em sobrenadantes de linfócitos re-estimulados com vírus por 3-timidina cpm incorporado em células HT-2 cultivadas em sobrenadantes de linfócitos incubados em meio isento de antigénio. 31

Os resultados são apresentados na Tabela I abaixo.

Tabela I

Incorporação de JH-Timidina (cpm ± DP) título de IFN-γ Meio H5.OlOCMVlacZ S.I. (IU/mL)α C57BL/6 175 ± 40 2084 + 66 11, 91 80 anti-IL2 (1:5000) 523 ± 81 2, 98 anti-IL4 (1:5000) 1545 ± 33 8, 83 C57BL/6 + IL12 247 ± 34 5203 ± 28 21,07 160 anti-IL2 (1:5000) 776 ± 50 3,14 anti-IL4 (1:5000) 4608 ± 52 18, 66 A estimulação de linfócitos a partir de nódulos de linfócitos regionais com ambos os adenovírus recombinantes conduz à secreção de citocinas específicas para a activação de ambos os sub-conjuntos de células T auxiliares THi (i. e., IL-2 e IFN-γ) e TH2 (i. e., IL-4) (Tabela I). A análise de linfócitos dos animais tratados com IL-12 estimulados in vitro com vírus revelou uma secreção aumentada de IL-2 e IFN-γ em relação à produção de IL-4, quando comparado com animais que não receberam IL-12 (í. e., a proporção de IL-2/IL-4 foi aumentada de 3 para 6 quando foi utilizado IL-12; Tabela I). 32

C. Ensaios imunológicos - BAL

Amostras de BAL obtidas dos animais 28 dias após a exposição primária ao vírus recombinante foram avaliadas para anticorpos neutralizantes para adenovírus e isotipos de anticorpo anti-adenovírus como se segue. Os mesmos quatro grupos de murganhos C57BL/6, i. e., controlo, removidos de CD4+, tratados com IL-12 e tratados com IFN-γ, foram infectados com H5.010CBALP. 0 anticorpo neutralizante foi medido em amostras de BAL diluídas em série (100 pL) que foram misturadas com H5.01OCBlacZ (1 x 106 pfu em 20 pL), incubadas durante 1 hora a 37 °C, e aplicadas a células Hela a 80% de confluência em placas de 96 poços (2 x 104 células por poço) . Após 60 minutos de incubação a 37 °C, foi adicionado a cada poço 100 pL de DMEM contendo FBS a 20%. As células foram fixadas e coradas para a expressão de β-galactosidase no dia seguinte.

Todas as células foram positivas para lacZ na ausência de anticorpos anti-adenovirais. O isotipo de anticorpo específico para adenovírus foi determinado em BAL utilizando um ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA). Em resumo, as placas de 96 poços foram revestidas com 100 pL de PBS contendo 5 x 109 partículas de H5.010CBlacZ durante 18 horas a 4 °C. Os poços foram lavados 5 vezes com PBS. Após bloqueamento com 200 pL de BSA a 2% em PBS, as placas foram enxaguadas uma vez com PBS e incubadas com amostras de BAL diluídas 1:10 durante 90 minutos a 4 °C.

Posteriormente, os poços foram extensivamente lavados e re-enchidos com 100 pL de IgG ou IgA anti-murganho conjugado com ALP diluído 1:1000 (Sigma). As placas foram incubadas, subsequentemente lavadas 5 vezes, e foi adicionado 100 pL da 33 solução de substrato (fosfato de p-nitrofenilo, PNPP) a cada poço. A conversão do substrato foi parada pela adição de 50 pL de EDTA a 0,1 M, e as reacções foram lidas a 405 nm.

Os resultados são apresentados graficamente nas Figs. IA a 1C, que resumem o titulo de anticorpo neutralizante, e as quantidades relativas (OD405) de IgG e IgA presentes nas amostras BAL. 0 titulo do anticorpo neutralizante para cada amostra foi registado como a diluição mais elevada com a qual menos de 50% das células coraram de azul.

Como demonstrado na primeira barra das Figs. IA a 1C, as citocinas identificadas na Tabela 1 acima foram associadas nos murganhos de controlo com o aparecimento de anticorpos para proteínas de adenovirus em BAL de ambos os isotipos IgG e IgA que foram capazes de neutralizar o vector recombinante forma de realização Ad5 humano num ensaio in vitro para uma diluição de 1:800.

Como apresentado na segunda barra dos gráficos das Figs. IA a 1C, a eliminação das células CD4+ transientes inibiu a formação do anticorpo neutralizante (Fig. IA) e anticorpo IgA especifico para o virus (Fig. 1C) em 80 vezes, permitindo assim que ocorra a transferência eficiente de genes a seguir a uma segunda administração de virus. Fig. 1B apresenta também uma ligeira inibição de IgG.

Como apresentado na terceira barra dos três gráficos, IL-12 bloqueia selectivamente a secreção de IgA especifico para o antigénio (Fig. 1C), sem um impacto significativo na formação de IgG (Fig. 1B) . Isto foi simultâneo com uma redução de 20 vezes 34 da redução em anticorpo neutralizante específico para o vírus (Fig. IA).

Os animais tratados com interferão gama (quarta barra das Figs. IA e 1B) foram virtualmente indistinguíveis dos animais tratados com IL-12 nesse anticorpo específico para o vírus IgA (Fig. 1C) e neutralizante (Fig. IA) foram diminuídos quando comparado com os animais de controlo não tratados com citocina, mas não até ao ponto obtido com aqueles tratados com IL-12.

Estes estudos demonstram que a administração de modulador imunitário seleccionados a receptores de vectores virais recombinantes de terapia génica no momento da exposição primária ao vector ou próximo desta pode prevenir a formação de anticorpos bloqueadores e/ou eliminação do vector de CTL quer inicialmente e no momento da exposição repetida ao vector virai. A redução concordante do anticorpo neutralizante com IgA antiviral sugere que a imunoglobulina do subtipo da IgA é principalmente responsável para o bloqueamento da transferência de genes.

Exemplo 3 - Aumento de Transferência de Genes Mediada por Adenovírus após a Segunda Administração por IL-12 e IFN-γ em Fígado de Murganho

Foram realizadas experiências substancialmente idênticas às descritas no Exemplo 2 acima em que os vectores virais foram administrados no sangue para a introdução do transgene no fígado (em vez da distribuição intratraqueal no pulmão). 35

Os adenovírus recombinantes H5.OlOCMVlacX e H5.010CBALP foram utilizados neste exemplo.

Murganhos C57BL/6 fêmea (6-8 semanas de idade) foram injectadas com suspensões de H5.010CBALP (1 x 109 pfu em 50 pL de PBS) i.p. no dia 0 e de um modo semelhante com H5.OlOCMVlacZ no dia 28. Um grupo desses murganhos foi utilizado como um controlo. Outro grupo de murganhos foi eliminado completamente de células CD4+ por injecção i.p. de anticorpo às células CD4+ (GK1.5; ATCC N° TIB207, diluição 1:10 de ascites) no momento da terapia génica inicial (dias -3,0, e +3). Um terceiro grupo de murganhos foi injectado com IL-12 (2 pg, injecções i.p.) no momento da primeira administração do vírus (dias 0 e +1) . Um quarto grupo de murganhos foi injectado com interferão gama (2 pg, injecções i.p.) no momento da primeira administração de vírus (dias 0 e +1).

Quando os murganhos foram subsequentemente sujeitos a eutanásia e a necropsia nos dias 3, 28, ou 31, foram preparados tecidos de fígado para criossecções de acordo com os processos utilizados acima para tecido de pulmão no Exemplo 2.

Os resultados de criossecção foram substancialmente semelhantes para terapia génica dirigida ao fígado de acordo com este método, como para a terapêutica dirigida ao pulmão do Exemplo 2 acima. Os resultados descritos abaixo foram obtidos a partir de colorações histoquímicas com fosfatase alcalina (ampliação X100) ou colorações com X-gal β-galactosidase (ampliação X100). A administração de vírus ALP (109 pfu) nas veias de todos os grupos de murganhos C57BL/6 resultou num nível elevado de 36 expressão transgénica em tecido do fígado que diminuiu para níveis indetectáveis pelo dia 28. Foi demonstrado que a perda da expressão transgénica se deve à eliminação mediada por CTL dos hepatócitos geneticamente modificados [ver também, Yang I, citado acima].

Nos murganhos de controlo, não foi detectada expressão genética recombinante três dias após a segunda administração de vírus, i.e., dia 31. A administração de vírus aos animais empobrecidos em CD4+ foi associada a anticorpos neutralizantes substancialmente mais baixos e nível elevado de expressão transgénica recombinante que foi estável durante um mês. A expressão do segundo vírus foi detectável no dia 31. 0 nível elevado inicial de transferência de genes diminuiu após cerca de um mês nos murganhos tratados com IL-12; todavia, em contraste com o controlo, alguma transferência de genes para o fígado através do sangue foi alcançada quando o vírus foi re-administrado a animais tratados com IL-12 no dia 28 e o nível do anticorpo neutralizante foi reduzido.

Os animais tratados com interferão gama foram virtualmente indistinguíveis dos animais tratados com IL-12 em que a transferência eficiente de genes foi realizada após uma segunda administração de vírus.

Deste modo, a utilização destas citocinas e os anticorpos anti-CD4+ como moduladores imunitários permitiu a administração repetida dirigida ao fígado do vector sem a sua eliminação imediata por anticorpos neutralizantes. 37

Exemplo 4 - Transferência de Genes Mediada por Adenovírus em Fígado de Murganho

As respostas imunitárias à administração primária de vírus recombinante foram ainda caracterizadas utilizando diferentes estirpes de murganhos. 0 vírus recombinante (H5.OlOCMVLacZ ou H5.010CBALP) foi inactivado com luz ultravioleta na presença de 8-metoxipsoraleno. Em resumo, o vírus purificado foi ressuspenso em 0,33 mg/mL de solução de 8-metoxipsoraleno e exposto a uma fonte de luz UV a 365 nm em gelo a 4 cm do filtro da lâmpada durante 30 min. O vírus foi então passado por uma coluna de Sephadex G-50 equilibrada com PBS. Os ensaios de transdução de diluição limitante de stocks inactivados de vírus demonstraram menos de um vírus funcional por 105 partículas de vírus inactivado. As suspensões dos vírus (2xl09 pfu em 100 pL de PBS) foram sujeitas a infusão na veia da cauda de murganhos fêmea de 6 a 8 semanas de idade, como detalhado nas experiências seguintes. Cada experiência foi realizada com um mínimo de três murganhos nos quais a expressão transgénica foi quantificada numa secção de cada um de 5 lóbulos. A análise mínima foi de 15 secções por condição experimental. a. murganhos C57BL/6 [H-2b; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME] foram injectados com suspensões de H5.OlOCMVlacZ no dia 0 e de um modo semelhante com H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos B6") ; 38 b. murganhos C57BL/6 foram injectados com H5.OlOCMVlacZ inactivado com UV no dia 0 e H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos Ββ-UV"); c. murganhos da classe MHC II-deficientes (II") [GenFarm

International, Mountain View, CA], criados num ambiente de C57BL/6 (entre 5-10 gerações) e que comportam o haplotipo H-2b, são incapazes de expressar determinantes I-Ab e não podem desenvolver respostas mediadas por células T CD4+ [Grusby et al. Science, 253:1417-1420 (1991)]. Estes murganhos foram infectados com H5.010CBALP no dia 0 e H5.OlOCMVlacZ no dia 28 ("murganhos classe 11”); d. murganhos deficientes em microglobulina B2 (β2πι~) [GenFarm International, Mountain View, CA], criados num ambiente de C57BL/6 (entre 5-10 gerações) e que comportam o haplotipo H-2b são incapazes de desenvolver respostas associadas a MHC de classe I. Estes murganhos foram infectados com H5. OlOCMVlacZ no dia 0 e H5.010CBALP no dia 28 ("murganhos β2Γη”") ; e. murganhos C57BL/6 foram inoculados i.p. com fracções de 0,5 mL de diluição 1:10 de liquido ascitico de murganho contendo o GK1.5 (MAb anti-CD4, ATCC TIB207) nos dias -3, 0 e +3 como descrito no Exemplo 2. Isto foi equivalente a 100 pg de anticorpo monoclonal purificado por injecção. Estes murganhos empobrecidos em células CD4+ foram infectados com H5. OlOCMVlacZ no dia 0 e H5.010CBÃLP no dia 28 ("murganhos CD4Ab"); e f. murganhos C57BL/6, tratados com IL-12 (2 pg em 200 pL de PBS) i.p. no dia 0 e dia +1 como descrito no Exemplo 2, 39 foram infectados com H5.OlOCMVlacZ no dia 0 e HS.010CBALP no dia 28 ("murganhosIL-12") .

Murganhos de cada grupo foram subsequentemente sujeitos a eutanásia e tecidos de fígado foram avaliados para expressão de lacZ por histoquímica de X-gal (ampliação X100) no dia 3 e dia 28; e para expressão de ALP por coloração histoquímica no dia 31 (ampliação X100). O desenvolvimento do anticorpo neutralizante para adenovírus em cada grupo de murganhos foi examinado em amostras de soro obtidas no dia 28. A infusão de vírus lacZ em murganhos C57BL/6 foi associada a nível elevado, mas transiente, de expressão do gene repórter e o eventual desenvolvimento do anticorpo neutralizante dirigido contra antigénio adenoviral (Fig. 2) . Não foi detectada transferência de genes quando o vírus ALP foi subsequentemente infusionado nestes animais. Em contraste, os murganhos de classe II" não produziu anticorpo neutralizante (Fig. 2) e foram receptivos a transferência de genes de nível elevado de uma segunda administração de vírus. De um modo semelhante, os animais empobrecidos de CD4 de modo transiente estabilizaram parcialmente a expressão de lacZ e não desenvolveram anticorpo neutralizante, permitindo a re-administração eficiente de vírus.

Nos murganhos B6-UV que receberam vírus recombinante inactivado com UV, o vírus inactivado criou uma resposta de anticorpo neutralizante completo (Fig. 2) que previne completamente a subsequente transferência de genes. Este resultado demonstra que as proteínas da cápside do vírus de entrada são suficientes para activar uma célula auxiliar T bloqueadora e resposta imunitária mediada por células B. 40 A experiência com murganhos β2ιη~ foi realizada para avaliar o papel das células CD8 e a expressão de MHC de classe I na resposta primária ao vírus [Zijlstra et al. Nature, 344:742-746 (1990)]. A expressão transgénica foi estável nestes animais, consistentes com resultados relatados anteriormente [Yang III, citado acima]. Todavia, a transferência de genes ocorreu a um nível significativo no início de uma re-administração de vírus. Isto foi inesperado porque esta estirpe de murganhos devia possuir todos os componentes da resposta imunitária necessários para produzir anticorpo neutralizante, (i. e., células CD4, expressão de MHC de classe II e células B) . Estes animais não conseguiram montar uma resposta de anticorpo neutralizante significativa aos antigénios adenovirais. Estes resultados sugerem desregulação da activação de células auxiliares T e/ou B (Fig. 2) . A análise de linfócitos de animais β2ιη- demonstrou secreção de IFN-γ activada por antigénios em excesso em relação à medida em murganhos C57BL/6, possivelmente devido à persistência de células infectadas pelo vírus e à activação crónica de células THi. A resposta amplificada de THi em murganhos β2ιη- poderia conduzir a uma inibição de células TH2 resultando na produção diminuída de anticorpos anti-virais.

Verificou-se que a expressão transgénica era estabilizada em animais deficientes em células CD8 e MHC de classe I em virtude de uma interrupção da linha germinal β2ιη-. A remoção específica de perforina, a molécula em CTLs e células assassinas naturais (NK) que medeiam a citólise, de um modo semelhante prolonga a expressão transgénica (resultados não apresentados). 41

Exemplo 5 - Efeito de Anticorpo CD4 em transferência de genes mediada por Ad após administrações repetidas

As suspensões dos adenovírus recombinantes expressando diferentes transgenes foram sujeitas a infusão na veia da cauda de murganhos C57BL/6 (H-2b) a intervalos de 21 dias. H5.010CMVli7.LR é um adenovírus removido dos genes Ela e Elb e possui uma deleção no gene E3 a 78,5 a 84,3 mu da cadeia sub360 de Ad, com um gene receptor LDL em vez da deleção EI [descrita em Kozarsky et al. J. Biol. Chem., 269:1-8 (1994)]. H5.OIOCMVLDLR foi administrado no dia 0; H5.OlOCMVLacZ no dia 21; e H5.010CBALP no dia 42. Um grupo de murganhos de controlo foi administrado por injecções i.p. de soro fisiológico nos dias -3, 0 e +3, em relação a cada infusão de vírus. A um segundo grupo de murganhos foi administrado injecções i.p. de CD4 anticorpo eliminador para bloquear a activação de células auxiliares T (GK1.5 mAb) no mesmo protocolo. A um terceiro grupo de murganhos foram administradas injecções i.p. de GK1.5 mAb nos dias -3, 0, 3, 18, 21 e 24, Um quarto grupo de murganhos, que não recebeu a administração inicial de H5.010CMVLDLR, foi tratado com GK1.5 mAb nos dias -3, 0 e 3.

Os murganhos foram subsequentemente sujeitos a eutanásia, e os tecidos de fígado foram avaliados para expressão de LDLR por imuno-histoquímica no dia 3, para a expressão de lacZ por histoquímica de X-gal no dia 24, e para a expressão de ALP por coloração histoquímica no dia 45. Os ensaios foram realizados como se segue: A. A coloração de imunofluorescência para a expressão de LDLR foi realizada como se segue: Secções congeladas (6 μιη) 42 foram fixadas em metanol como descrito em Morris et al. citado acima. Após bloqueamento com 10% de soro de cabra em PBS (GS/PBS), as secções foram incubadas com um anticorpo policlonal para LDLR (1:200) durante 60 minutos, e depois com IgG-FITC anti-coelho de cabra durante 30 minutos. As secções foram lavadas e montadas com Citiflour (Citifluor, UK) . B. Foi realizada histoquímica de X-gal como se segue: as secções de tecido congelado fresco (6 pm) foram fixadas em glutaraldeído a 0,5% durante 10 minutos, enxaguadas duas vezes durante 10 minutos em PBS contendo MgCl2 a 1 mM e incubadas em 1 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido (X-gal), K3Fe(CN)6 a 5 mM, K4Fe(CN)6 a 5 mM e MgCl2 a 1 mM em PBS durante 3 horas. C. A histoquimica de ALP foi realizada como se segue: Secções congeladas (6 pm) foram fixadas em glutaraldeído a 0,5% durante 10 minutos, enxaguadas em PBS, incubadas a 65 °C durante 30 minutos para inactivar a actividade de ALP endógena, lavadas em Tris a 100 mM (pH 9,5), NaCl a 100 mM e MgCl2 a 50 mM, e coradas no mesmo tampão contendo 0,165 mg/mL de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) e 0,33 mg/mL de Nitroblue Tetrazólio (NBT) a 37 °C durante 30 minutos.

Os resultados discutidos abaixo foram obtidos de análises de colorações citoquímicas de tecido de fígado três dias após cada infusão de vírus, incluindo vírus LDLR no dia 0, vírus lacZ no dia 21 e vírus ALP no dia 42 (ampliação X150). 43

As amostras de soro foram também recolhidas nos dias 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 de cada grupo de animais e ensaiadas para o titulo de anticorpo neutralizante. As amostras de soro foram incubadas a 56 °C durante 30 minutos e depois diluídas em DMEM em passos de duas vezes começando com 1:20. Cada diluição de soro (100 pL) foi misturada com H5.OlOCMVlacZ (2 x 106 pfu em 20 pL), incubada durante 1 hora a 37 °C, e aplicada a células Hela com 80% de confluência em placas de 96 poços (2 x 104 células por poço). Após 60 minutos de incubação a 37 °C, foram adicionados a cada poço 100 pL de DMEM contendo FBS a 20%. As células foram fixadas e coradas para expressão de β-galactosidase no dia seguinte. Todas as células coraram de azul na ausência de amostras de soro. O título do anticorpo neutralizante para cada amostra foi apresentado como a diluição mais elevada com a qual menos de 50% das células coraram de azul. As Figs. 3A-3D apresentam o título de anticorpo expresso como uma função de dias após infecção.

Estas experiências demonstraram que no grupo de murganhos que não receberam anticorpos CD4, a transferência eficiente de genes ocorreu após o primeiro vírus. Todavia, o desenvolvimento do anticorpo neutralizante bloqueou a transferência de genes com os dois vírus subsequentes. O anticorpo neutralizante surgiu rapidamente no soro após o segundo vírus se não tivessem sido co-administrados anticorpos CD4 (Fig. 3B). O terceiro vírus não foi eficaz nestes animais. Em contraste, a administração de anticorpos CD4 no momento da primeira infusão de vírus preveniu a formação de anticorpos neutralizantes (Fig. 3B) e permitiu um nível elevado transferência de genes com o segundo vírus. O surgimento de anticorpo neutralizante após o segundo vírus foi acelerado (Fig. 3B em comparação como o período de tempo da resposta primária na Fig. 3A), sugerindo que ocorre activação de 44 algum nível de imunidade celular mesmo na presença de anticorpos CD4 .

Estas experiências demonstram que o bloqueamento imunitário transiente no momento da distribuição vírus, contrariamente à supressão imunitária crónica, é tudo o que é necessário para a transferência eficiente de genes. 0 terceiro grupo de animais recebeu anticorpo CD4no dia -3 sem administração de H5.010CMVLD.LR, i. e., 21 dias antes da administração primária do vírus. O anticorpo neutralizante que se desenvolveu subsequentemente ao desafio primário do vírus bloqueou a transferência de genes 21 dias mais tarde (Fig. 3C) de um modo indistinguível daquele observado em animais "naive" não pré-tratados com anticorpo CD4 (Fig. 3A) . Este resultado confirma a natureza transiente da eliminação de CD4.

Exemplo 6 - Efeito de IL-12 em respostas de Isotipos de Anticorpo específicos para Ad e respostas de CTL A. Amostras de estudo obtidas a partir de murganhos C57BL/6 ("B 6") e murganhos C57BL/6 ("B6+IL12") tratados com IL-12 do

Exemplo 5 foram testadas 28 dias após infecção para isotipos de IgGl e IgG2a de anticorpo específico.

Foi realizado um ensaio de imunoabsorção ligado a enzima em fase sólida (ELISA) utilizando vírus H5.OlOCMVlacZ purificado como antigénio. Placas de microtitulação Immunolon-2-U (Fisher) foram revestidas com 200 ng/poço de antigénio virai em 100 mL de PBS durante 6 horas a 37 °C, lavadas três vezes em PBS, e bloqueadas em PBS/BSA a 1% durante a noite a 4 °C. No dia 45 seguinte, foram adicionadas amostras de soro diluídas em série 4 vezes a placas revestidas com antigénio e incubadas durante 4 horas a 37 °C. As placas foram lavadas três vezes em PBS/BSA a 1% e incubadas com IgGl-biotina anti-murganho de cabra ou IgG2a-biotina anti-murganho de cabra (CALTAG Laboratories, São Francisco, CA) a diluição de 1:5000 durante 2 horas a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e foi adicionada Avidina-ALP (Sigma) a cada poço a diluição de 1:5000 durante 1 hora a 37 °C. Os poços foram novamente lavados como acima e foi adicionado substrato de PNPP. As densidades ópticas foram lidas num leitor de microplacas Biorad modelo 450.

As Figs. 4A e 4B sumariam as quantidades relativas (OD405) de IgGl e IgG2a, respectivamente, presentes nas amostras de soro como uma função de diluições da amostra. Os ensaios de ELISA dos soros revelaram anticorpos anti-virais de ambos os subtipos IgGl e IgG2a, consistente com a activação de ambos os sub-conjuntos Tm e TH2, respectivamente. Os animais que receberam IL-12 produziram menos IgGlanti-viral à custa de um aumento da produção de IgG2a. B. Esplenócitos recolhidos de murganhos C57BL/6 ("B6") e murganhos C57BL/6 tratados com IL-12 ("B6+IL12") do Exemplo 5 foram re-estimulados in vitro 10 dias após a administração de H5.010CBÃLP com H5.OlOCMVlacZ durante 5 dias em DMEM suplementado com FBS a 5% e 2-mercaptoetanol a 50 mM. Estas células foram testadas para lise específica em células infectadas simuladamente ("mock") e C57SV infectadas com H5.010CBALP ("ALP") num ensaio de libertação de 51Cr de uma hora realizado subsequentemente utilizando as seguintes proporções de células efectoras para alvo (C57SV, H-2b) em 200 pL de DMEM com 46 FBS a 10% em placas de 96 poços com fundo em V (E:T = 50:1, 25:1, 12:1, 6:1, 5:1 e 3:1) .

Antes de misturar com as células efectoras, células alvo (1 x 106) foram marcadas com 100 pCi de 51Cr após uma infecção de 24 horas com H5.OlOCMVlacZ a um moi de 50 e utilizadas a 5 x 103 células/poço. Após incubação durante 6 horas, foram removidas aliquotas de sobrenadante de 100 pL para contagem num contador gama. A percentagem de libertação especifica de 51Cr foi calculada como: [(cpm da amostra - cpm de libertação espontânea)/(cpm de libertação máxima - cpm de libertação espontânea)] x 100. Os resultados, relatados como percentagem de lise especifica como uma função de diferentes proporções de efectoras para alvo (Fig. 5), demonstram que a actividade de CTL contra células alvo infectados por virus não foi afectada pelo tratamento com IL-12. O resultado liquido foi uma redução de 3 vezes no anticorpo neutralizante, cuja magnitude foi insuficiente para permitir a transferência de genes eficiente após re-administração de vírus. Diferenças na eficiência da re-administração de vírus entre os murganhos β2ιη- e os murganhos C57BL/6 tratados com IL-12 pode reflectir repressão mediada por citocina inadequada após injecção i.p. de IL-12 ou outros mecanismos para além da inibição da activação de TH2. 47

Exemplo 7 - Murganhos deficientes em CD40L Ilustram o Papel Necessário da Activação de células T nas Respostas do Hospedeiro a Vectores Adenovirais 0 papel da sinalização de células T mediada por CD40L nas respostas imunitárias celulares e humorais a vectores adenovirais foi estudado em murganhos geneticamente deficientes em CD40L. Estudos anteriores demonstraram anormalidades nas respostas de células B dependentes do timo nestes murganhos [J. Xu et al. Immunity, 1:423-431 (1994) e B. Renshaw et al. J. Exp. Med., 180:1889-1900 (1994)]. Murganhos deficientes em CD40L (CD40L KO) e os seus parceiros de ninhada normais num ambiente C57BL/6-129 quimérico [J. Xu et al. citado acima] foram administrados com lacZ contendo adenovírus com EI removido (H5. OlOCMVlacZ) no dia 0 na traqueia (1 x 109 em 50 pL de PBS), para realizar a transferência de genes para pulmão, e na via de circulação periférica através da veia da cauda (2 x 109 em 100 pL em PBS), para uma eficaz transferência de genes para o fígado. Os animais foram re-tratados com H5.010CBALP, um vector adenoviral contendo um gene repórter diferente (fosfatase alcalina, ALP), no dia 28. O sangue foi analisado antes da administração do segundo vector para anticorpos neutralizantes, e os tecidos foram recolhidos para análise da expressão do gene repórter 3 dias mais tarde (i. e., dia 31). Os animais foram sacrificados 3 e 28 dias mais tarde para avaliar a eficiência e estabilidade de expressão transgénica, respectivamente. A Tabela II sumaria as análises morfométricas destes tecidos. 48

Tabela II

Análise Quantitativa de Pulmão e Figado de Murganho para Expressão Transgénica Eficiente

Dia 3 Dia 28 Dia 31 1Pulmâo (% expressão transgénica nas vias respiratórias > 25% Controlo 76 0 0 CD40L Ab 72 42 30 CD40L KO 75 30 45 ^Fígado (% expressão transgénica) Controlo 90,5 ± 2,6 0 0 CD40L Ab 89,3 ± 3,1 46,7 ± 4, 8 8, 2 ± 4,2 CD40L KO 92,3 ± 4,0 60,4 ± 2, 8 85 ,9 ± 3,4 10s resultados foram quantificados vias respiratórias de 3 murganhos epiteliais respiratórias contende examinando um total de 100 para a presença de células ) transgene, utilizando o critério de uma via respiratória positiva como um transgene superior a 25% 2os resultados são apresentados como uma média ±1 D.P.

Os parceiros de ninhada normais aos quais foram administrados vectores demonstraram nivel elevado de expressão transgénica no dia 3 no pulmão e no figado que diminuíram até níveis indetectáveis ao dia 28 (semelhante ao que se observa em murganhos C57BL/6 "naive"; Tabela 11). As lavagens do soro e bronquioalveolar (BAL) foram analisadas para anticorpo neutralizante para Ad5 humano como descrito em Y. Dai et al.

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92:1401-1405 (1995). Desenvolveu-se anticorpo neutralizante substancial para as proteínas da cápside adenoviral ao dia 28 em cada fluido de BAL de animais que receberam vector intratraquealmente ou no sangue de animais que

receberam vector na circulação venosa (Fig. 6) . A 49 re-administração de vector no dia 28 não obteve sucesso como evidenciado pela ausência de expressão do transgene no órgão alvo 3 dias mais tarde (semelhante ao que foi observado em murganhos C57BL/6, Tabela II) . Foram obtidos resultados substancialmente diferentes nos murganhos deficientes em CD40L. A expressão do transgene foi estável com uma pequena diminuição durante 28 dias no pulmão e no figado (Tabela II) . Adicionalmente, o anticorpo neutralizante não se desenvolve (Fig. 6), resultando numa expressão do transgene altamente eficiente após uma segunda administração do virus.

Exemplo 8 - Bloqueio Transiente do Ligando CD40 com o

Anticorpo Evita Activação Primária de Células T e Prolonga a expressão do Transgene 0 exemplo que se segue demonstra que a inibição transiente de CD40L com anticorpo bloqueia a iniciação das células T CD4+ no modelo do pulmão de terapia genica, e eliminava eficazmente as respostas efectoras das células T e B BD4. A expressão transgénica persistente e a eficiência da re-administração do vector no pulmão foram essencialmente idênticas em animais geneticamente deficientes em CD40L (Exemplo 7 acima) em comparação com os inibidos de forma transiente com o anticorpo CD40L (ver abaixo).

Os resultados encorajadores obtidos nos murganhos deficientes em CD40L, como apresentado no Exemplo 7 acima, forneceram a base para o desenvolvimento de uma terapia génica com adenovectores virais baseada na inibição farmacológica da sinalização de CD40L. Esta terapia tem por base descobertas de que as proteínas da cápside do vírus de entrada são a primeira 50 fonte de antigénio para activação célula T CD4+, restringindo, deste modo, o tempo de bloqueio co-estimulatório para um curto intervalo quando o vector é administrado.

Experiências em murganhos C57BL/6 (seis semanas de idade, fêmeas) não tratados com anticorpo ou tratados com isotipo de

anticorpo controlo demonstram um elevado nível de expressão transgénica no dia 3 no pulmão (Tabela II) e fígado (Tabela II), que diminuiu para níveis não detectáveis no dia 28 (Tabela II) . Experiências de transferência de genes foram também realizadas em animais C57BL/6 injectados com 100 pg de mAb contra CD40L (MR1, Hibridoma ATCC HB11048) , i.p., nos dias - 3, 0, +3 e +6 em relação à administração inicial do vector ou quantidades equivalentes de um anticorpo monoclonal de hamster controlo. Os estudos em pulmão de murídeo demonstraram a estabilização da expressão transgénica em animais tratados com mAb para CD40L: o número de vias respiratórias que apresentam o transgene em >25% das células epiteliais apresentou um declíneo minímo de 72% no dia 3 para 42% no dia 28 (Tabela II) . A expressão transgénica foi também estabilizada no fígado de animais tratados com CD40L mAb, em que o transgene que expressa hepatócitos diminui ligeiramente de 89% a 47% ao longo de um intervalo de 28 dias (Tabela II) . A expressão do transgene é estabilizada em animais tratados com anticorpo para CD40L, pelo menos 6 emanas, que é o tempo de vida mais longo avaliado (dados não apresentados).

Os animais receptores foram analisados para a activação de células CD4+ e CD8+ específicas para o antigénio utilizando quer ensaios in vitro como in vivo. O efeito do bloqueamento de CD40L em células T CD4+ foi estudado em ensaios de proliferação de linfócitos estimulados com adenovírus inactivados com UV, essencialmente como descrito abaixo (Tabela III) . Em resumo, os 51 linfócitos de nódulos linfáticos mediastinais (para experiência no pulmão) ou esplenócitos (para experiência no fígado) de murganhos de 10 dias após administração de vírus foram re-estimulados com vírus inactivados com UV durante 24 horas. Os sobrenadantes foram testados em células HT-2 (ATCC, CRL 1841) para secreção de citocina, e proliferação foi avaliada 72 horas mais tarde medindo a incorporação de 3H-timidina. A activação de células T específicas adenovirais, como quantificada pelo índice de estimulação, foi documentada inicialmente no dia 7 em animais não tratados com anticorpo que foram administrados através de vector no pulmão ou fígado. A activação de células T específicas adenovirais aumentou progressivamente ao longo dos 14 dias seguintes. O índice de estimulação foi calculado dividindo as contagens de 3H na presença de antigénio por aqueles na ausência de antigénio. A activação de células T foi substancialmente inibida em ambos os modelos por co-administração de anticorpo CD40L. A maior inibição foi observada em 20 animais administrados com o vector no pulmão. 52

Tabela III

Respostas de Células T CD4+ e Anticorpo Neutralizante índice de Estimulação1 Anticorpo Neutralizante1 Dia 7 Dia 21 Dia 28 Pulmão Controlo 11,2 ± 1,1 52 ± 2 267+92 CD40L Ab 1,2 ± 0,1 10 ± 1 20 ± 0 CD40L KO N.D. N.D. 20 + 0 Fígado Controlo 20 ± 1 53 ± 2 533 ± 185 CD40L Ab 4,1 ± 0,5 21 ± 1 66 ± 23 CD40L KO N.D. N.D. 20 ± 0 x0s dados são apresentados como o índice de estimulação médio de três determinações ±1 D.P. N.D. - Não determinado 20s dados são apresentados como o titulo de anticorpo neutralizante médio (diluição reciproca) de três amostras v 1 D.P. A activação de células T CD8+ por células infectadas com vírus foi analisada em ensaios de libertação de crómio utilizando células H-2 alvo MHC compatíveis infectadas com vectores adenovirais. Como anteriormente apresentado, a lise específica foi demonstrada com linfócitos recolhidos a partir de receptores C57BL/6 no dia 7, que foram estimulados in vitro com células apresentadoras de antigénio infectadas com adenovírus, e incubadas com alvos infectados com adenovirais (Fig. 7). Não foi demonstrada lise nos alvos com simulação de infecção.

Linfócitos recolhidos a partir de animais tratados com anticorpo CD40L demonstraram também actividade de CTL contra células infectadas com adenovírus. Todavia, a extensão da lise foi consistentemente inferior à obtida a partir de animais sem imunidade. A necessidade de amplificar CTL através de 53 estimulação in vitro antes do ensaio citolitico pode obscurecer diferenças mais significativas na activação de CTL que ocorreram após a exposição primária in vivo. 0 efeito primário da inibição de CD40L na activação de células T CD4+ especificas para adenovirus foi ainda avaliado in vivo utilizando técnicas de imunocitoquimica. Estas experiências restringiram-se ao modelo da transferência de genes dirigida para o fígado devido a limitações técnicas de imunofluorescência nas secções do pulmão. Os tecidos do fígado foram analisados no dia 14 por infiltração de células T CD4+ e CD8+ através de imunofluorescência dupla. Animais não tratados com anticorpo apresentaram um infiltrado de linfócitos misto típico, que foi dominado pelas células T CD4+ e associado com a substancial sobre-regulação de MHC da classe I na superfície basolateral de hepatócitos. Estudos anteriores sugeriram que a secreção de IFN-γ a por células T CD4+ activadas por THi contribuía para o aumento da classe I de MHC que podia sensibilizar os hepatócitos para a eliminação mediada por CTL. Os animais tratados com anticorpo contra CD40L ainda mobilizavam um infiltrado de linfócitos misto. Todavia, a proporção de células T CD4+ é substancialmente inferior e o aumento em MHC de classe I é substancialmente estancado. A especificidade dos ensaios de imunofluorescência foi demonstrada em animais com infecção simulada.

Exemplo 9 - Anticorpo CD40L Evita a Formação de Anticorpo Bloqueante na transferência de Genes Dirigidos ao Pulmão 0 impacto do bloqueio transiente da sinalização de CD40L, na altura da administração do vector, na produção do anticorpo 54 neutralizante e eficiência da administração repetida do vector foram avaliados nesta experiência. Os animais que receberam vector no dia 0, com ou sem mAb, foram re-tratados com um vector adenoviral contendo um gene repórter diferente no dia 28. o sangue foi analisado antes da administração do segundo vector para anticorpos neutralizantes, e os tecidos foram recolhidos para análise de expressão do gene repórter 3 dias mais tarde (i. e., dia 31) .

Os resultados mais impressionantes foram obtidos no modelo de terapia génica dirigida para o pulmão. O desenvolvimento do anticorpo neutralizante em BAL, após transferência de genes do vector dirigida para o pulmão, foi inibido 20 vezes em animais a que foi administrado o anticorpo CD40L (Fig. 7). A transferência de genes com o segundo vector não obteve sucesso em animais não tratados com anticorpo ou animais tratados com um mAb isotipo controlo (resultados não apresentados), como evidenciado pela completa ausência de expressão transgénica 3 dias após a re-administração do vector. Isto contrasta com os animais tratados durante a primeira administração do vector com anticorpo CD40L, em que a transferência de genes foi obtida a seguir a uma segunda administração de vector. A expressão do transgene foi detectada em >25% de células epiteliais superiores de 30% de vias respiratórias depois do segundo vector, o que é apenas ligeiramente inferior ao número de vias respiratórias que expressam o transgene num animal "naive" tratado com vector (i. e., 75%; Tabela II). O anticorpo contra CD40L bloqueou parcialmente a produção do anticorpo neutralizante em soro após infusão intravenosa do vírus (Fig. 7). Isto foi suficiente para permitir alguma transferência de genes para o fígado com o segundo vector (8% de hepatócitos) , que não ocorrem na ausência de anticorpo, mas é substancialmente reduzida a partir da que é 55 conseguida após uma administração primária de vector em animais "naive" (89%) .

Exemplo 10 - Ciclofosfamida por um Período Curto Previne Respostas Imunes Destrutivas no Fígado e Pulmão de Murganho

Foi dada ciclofosfamida a murganhos C57BL/6 em vários regimes de dosagem ao mesmo tempo que um vírus EI com lacZ removido foi administrado no sangue, para estudar a transferência de genes dirigida para o fígado, e na traqueia, para estudar a transferência de genes dirigida para o pulmão. Um segundo vírus EI excisado, expressando o gene repórter da fosfatase alcalina, é re-administrado no mesmo órgão que recebeu o primeiro vector. Foram isolados linfócitos de sítios regionais e avaliados in vitro para activação específica do vector de células T. Os tecidos foram recolhidos em vários tempos para análise de inflamação e suas consequências assim como de expressão dos genes repórter lacZ e ALP. 56 A. Estudos em Animais

Murganhos fêmea C57BL/6 foram injectados com 1 x 109 pfu de H5.OlOCMVLacZ através da traqueia (estudos do pulmão) ou veia da cauda (estudos do fígado) no dia 0. as injecções de ciclofosfamida foram dadas iv como indicado (em 200 mL de PBS).H5.010CBALP foi injectado como descrito acima no dia 28. Os animais foram sacrificados no dia 3, 28, 31 e 50 para análise de expressão transgénica. Quando foi efectuada a necropsia, os tecidos do pulmão e fígado foram preparados para criossecção, enquanto o baço, lavagem bronquioalveolar (BAL) e nódulos linfáticos mediastinais (MLN) foram recolhidos para ensaios imunológicos. B. Análises Morfológicas

Para análises imunocitoquímicas, tecido congelado de fígado foi crio-seccionado, enquanto os pulmões foram inflados com uma mistura 1:1 de PBS/OTC, congelados e crio-seccionados em blocos. Para a histoquímica de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolil β-D-galactopiranósido), foram fixadas secções de 6 mm de tecido congelado em 0,5% de glutaraldeído durante 10 min, lavados duas vezes com PBS contendo 1 mM de MgCl2, e incubados em 1 mg de X-Gal por mL, 5 mM de K3Fe(CN)6, 5 mM de K4Fe(CN)6, e 1 mM de MgCl2 em PBS durante 4 horas. Para coloração da fosfatase alcalina, foram fixadas secções congeladas em 0,5% de glutaraldeído durante 10 minutos e lavados duas vezes em PBS. As secções foram incubadas a 65 °C durante 30 minutos para inactivar a actividade da fosfatase alcalina endógena, lavadas uma vez em PBS e coradas em 100 mM de Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM de NaCl, 50 mM de MgCl2 contendo 0,165 mg de BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3- 57

indolilo) e 0,33 mg de nitroblue tetrazolio por mL a 37 °C durante 30 minutos. C. Imunofluorescência

As secções congeladas foram fixadas em metanol a -20 °C durante 10 minutos, secas ao ar e re-hidratadas em PBS duas vezes e bloqueadas para ligações não especificas em 10% de soro de cabra/PBS durante 30 minutos. As secções foram incubadas durante 1 hora com qualquer dos anticorpos anti CD4 de murganho de rato (anti L3T4, GibcoBRL, diluição 1:100 em soro de cabra a 2%) , seguido por uma incubação de 30 minutos com 5 mg de imunoglobulina G (IgG) anti-rato de cabra-fluoresceína ou CD8a anti-murganho de rato-isotiocianato de fluoresceína (anti-Ly-2, GibcoBRL, diluição 1:100 em soro de cabra a 2%). Para a coloração de MHC de classe I, as secções foram incubadas com sobrenadante de hibridoma de murganho diluído 1:50 em H-2KbDb(20-8-4s) durante 60 minutos, seguido por uma incubação de 30 minutos com 5 mg/mL de isotiocianato de fluoresceína conjugado com IgG anti-murganho de cabra(FITC). As secções foram lavadas duas vezes e montadas com o anti-redutor Citifluor (Canterbury Chemical Lab., Canterbury, UK).

D. Ensaio CTL

Para os ensaios CTL, foram misturados esplenócitos de três murganhos ou linfócitos de 10 murganhos. As células foram re-estimuladas in vitro durante 5 dias com H5.OlOCMVXacZ (MOI 0,5) e ensaiadas em células alvo MHC-compatíveis, que foram previamente infectadas com H5.OlOCMVLacZ e carregadas com 51Cr, 58 utilizando diferentes proporções efector/células alvo. A percentagem de libertação especifica de 51Cr foi calculada como [(cpm da amostra - cpm de libertação espontânea)/(cpm ou libertação máxima - cpm de libertação espontânea)] x 100. A libertação espontânea foi determinada ensaiando células alvo sem células de efector em meio, enquanto que a libertação máxima foi estimada adicionando 5% SDS às células alvo durante o periodo de incubação de 6 horas. E. Ensaio de Libertação de Citocina

Foram cultivados 6 x 106 esplenócitos com ou sem antigénio (i. e., H5.OlOCMVLacZ inactivado por UV a uma MOI de 10) durante 24 h numa placa de 24 poços. Foram transferidos 100 mL de sobrenadante isento de células sobre 2 x 103 de células HT-2 (linha celular dependente de IL-2 e IL-4) em placas de fundo redondo de 96 poços. Foram utilizados como controlos positivo e negativo meio e 10% de sobrenadante concanavalina A de rato. A proliferação foi determinada 48 h mais tarde por um pulso de 6 h com [3H] timidina (0,35 mCi/poço). F. Ensaio de Anticorpo Neutralizante

Foram incubados soro e BAL durante 30 min a 56 °C para inactivar o complemento. As diluições em série do soro e BAL em DMEM sem FBS (50 mL, começando a 1:20) foram incubadas com 1 x 10β pfu de H5.OlOCMVLacZ durante 60 min e aplicadas sobre 2 χ 104 células Hela (com 80% de confluência) em placas de 96 poços. Após uma incubação de 60 minutos, foram adicionados 100 mL de DMEM contendo 20% de FBS. As células foram fixadas 16-18 horas 59 mais tarde e coradas para actividade da β-galactosidase. Todas as células coraram de azul quando foi adicionado meio em vez de soro ou BAL. 0 título de anticorpo neutralizante foi determinado pela diluição mais elevada com a qual menos de 50% das células coraram de azul. São incluídas numerosas modificações e variações da presente invenção na especificação acima identificada e que se esperam ser óbvias para o especialista da técnica. Crê-se que estas modificações e alterações incluindo o modulador imunológico específico seleccionado, a forma de administração, o vector recombinante e o transgene seleccionado, via de administração, etc. estejam incluídas no âmbito das reivindicações em apêndice.

Lisboa, 9 de Março de 2007 60

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um modulador imunológico para a preparação de um medicamento para iniber uma resposta imunitária contra um virus recombinante que é co-administrado com o referido medicamento, caracterizado por o referido virus recombinante compreender um gene terapêutico, e caracterizado por o referido medicamento inibir as respostas de anticorpos neutralizantes contra o referido virus, e caracterizado por no caso de uma outra re-administração do virus recombinante, a re-administração ser opcionalmente realizada na ausência do modulador imunitário, com a condição de que, quando o referido virus recombinante é um adenovirus, a re-administração deve ser efectuada na ausência de um modulador imunitário.
2. 2. Utilização de virus recombinante para a preparação de um medicamento em que o vírus recombinante é co-administrado com um modulador imunitário para inibir uma resposta imunitária contra o vírus recombinante, caracterizado por o referido vírus recombinante compreender um gene terapêutico, e caracterizado por o referido modulador imunitário inibir as respostas de anticorpos neutralizantes contra o referido vírus, e caracterizado por no caso de uma outra re-administração do vírus recombinante, a re-administração ser opcionalmente realizada na ausência do modulador imunitário, com a condição de que, quando o referido vírus recombinante é um adenovirus, a re-administração deve ser efectuada na ausência de um modulador imunitário.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido modulador imunológico compreende um agente seleccionado do grupo consistindo em: a) uma citocina; b) um agente que inibe selectivamente a activação ou função das células CD4+, reduzindo assim a eliminação do virus pelos CTL; c) um anticorpo anti-células T; d) um agente que se liga ao ligando CD40 numa célula T e inibe a ligação do referido ligando com CD40 numa célula B; e e) um agente que liga o ligando CD28 ou o ligando CTLA4 numa célula T e inibe a ligação do referido ligando com o antigénio B7 numa célula B.
4. 4 . Utilização de acordo com a reivindicação 3a, em que a citocina é interleucina-4.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 3a, em que a citocina é interleucina-12.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 3a, em que a referida citocina é interferão gama.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 3b, em que 0 referido agente compreende um anticorpo anti- CD4 .
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 3d, em que 0 referido agente é seleccionado do grupo consistindo numa molécula de CD40 solúvel e um anticorpo anti-ligando de CD40. 62
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 3e, em que o referido agente é seleccionado do grupo consistindo em CD28 solúvel, CTLA4 solúvel, anticorpo anti-CD28 e anticorpo anti-CTLA4.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o referido modulador imunológico compreende uma molécula de ADN.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o referido modulador imunológico compreende uma proteína.
12. 12. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, em que o referido vírus recombinante é seleccionado do grupo consistindo em vírus adenoassociado, retrovírus, vaccinia e poxvírus.
13. 13. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, em que o referido vírus recombinante é um vírus adenoassociado recombinante.
14. 14. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado por o medicamento ser administrado simultaneamente com o referido vírus recombinante.
15. 15. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por o vírus recombinante ser re-administrado na ausência de um modulador imunitário. Lisboa, 9 de Março de 2007 63