PT835299E

PT835299E - Desoxigenacao de um produto azeitado com uma laccase

Info

Publication number: PT835299E
Application number: PT96914863T
Authority: PT
Inventors: Bent Riber Petersen; Thomas Erik Mathiasen; Bastienne Peelen; Henrik Andresen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1995-05-11
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 2000-04-28
Also published as: CN1190984A; EP0835299A1; US5980956A; AU702447B2; CN1064397C; ATE186323T1; ES2140853T3; IN181947B; GR3032393T3; JPH11504963A; EP0835299B1; DE69605042D1; WO1996035768A1; AU5684796A; DE69605042T2

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

DESOXIGENAÇÃO DE UM PRODUTO AZEITADO COM

UMA LACCASE

Campo da invenção

Está invenção se refere a um método simples e eficaz de desoxigenação um azeite ou um produto que contenha azeite.

Estado da técnica

Muitos alimentos, como os temperos para saladas, por exemplo temperos franceses e maioneses são preparados com azeites vegetais, por exemplo, azeite de soja. O azeite de soja contém uma grande quantidade de ácidos linoléicos e linolênicos que reagem rapidamente com o oxigénio dissolvido no produto, pelo que se produz compostos voláteis indesejáveis. Foi constatado que a qualidade do sabor dos azeites poderia ser aperfeiçoada eliminando o oxigénio dissolvido nos azeites (como referência ver Journal of Food Science 57(1), 1992, p. 196).

Os antioxidantes como o butilidroxianisol, o butilidroxitolueno, e o gaiato de propilo somente se acrescentam nos alimentos que contenham gordura para melhorar sua estabilidade oxidante.

Foi descrito que desoxigenação enzimática com glicose oxidase reduz significativamente a quantidade de oxigénio dissolvido nos temperos para saladas (como referência ver Journal of Food Science 57(1), 1992, p. 199): um 0.5% de glicose foi suficiente para eliminar um 92% do oxigénio dissolvido no tempero da salada durante 5 dias de armazenamento. A glicose oxidase catalisa a oxidação da d-glicose a ácido d-glucónico na presença do oxigénio molecular: C6Hi206 + 2(¾ + 2H20 -> 2C6H12O7 + 1

2H202. Como pode-se observar, um produto derivado desta reacção é H202, que pode ser destrutivo para o produto composto por azeite. Com o objectivo de evitar este problema foi sugerido agregar um catalisador junto a glicose oxidase; o catalisador catalisa a reacção: 2H202 -> 2H20 + 02, então é produzido o oxigénio novamente - mas, o efeito global da extracção enzimática do ar usando uma combinação de glicose oxidase e um catalisador, é a extracção de 0.5 mol de oxigénio para cada mol de d-glicose oxidada.

Um dos objectivos da presente invenção é encontrar um sistema enzimático simples e eficaz para a extracção de oxigénio do azeite ou em um produto que contenha azeite, de maneira que o peróxido de hidrogénio não esteja implicado.

Resumo da invenção

Surpreendentemente se descobriu que as laccases são muito eficientes na redução do oxigénio em, por exemplo, temperos para salada.

Em consequência, a presente invenção prove um método desoxigenação de um azeite ou um produto que contenha azeite, incluído no método a adição de uma quantidade efectiva de uma laccase a dito azeite ou a dito produto.

Descrição breve dos desenhos A presente invenção é ademais ilustrada fazendo referência aos desenhos anexos, nos que

Fig. 1 mostra a relação entre % de oxigénio e tempo em tempero para salada diferentes depois de agregar uma laccase, as experiências levados a cabo como se descreve no Exemplo 1. 2

Fig. 2 mostra a relação entre % de oxigénio e tempo em tempero para salada depois de agregar laccase, as experiências levados a cabo como se descreve no Exemplo 2.

Descrição detalhada da invenção

Azeites e produtos aue contém azeite.

Segundo a presente invenção azeite ou um produto que contenha azeite pode ser desoxigenado agregando uma quantidade eficaz de uma laccase. No contexto desta invenção o azeite se define e se caracteriza como qualquer azeite ou gordura ou cera ou lipídio segundo foi descrito por Frank D. Gunstone et ao. em "The Lipid Handbook", 2nd Ed., Chapman & Hall, 1994, pp. 49 - 223 incluído o azeite de azeitona, azeite de babaçu, azeite de ayote, azeite de noz de candelas, azeite de carnaúba, azeite de rícino, sebo vegetal chinês e azeite de stillingia, manteiga de cacau, azeite de coco, azeite de milho (azeite de maçaroca), azeite de semente de algodão, azeite de couve marinha, azeite de espécies de Cuphea, azeite de ónagra, azeite de peixe, azeite da semente de uva, azeite de amendoim, azeite de semente de cânhamo, manteiga de illipé, ceras de insectos, azeite de jojoba, azeite de semente de kapok, lanolina, azeite de linhaça, gordura de leite, manteiga de illipé, azeite de semente de mostarda, azeite de oiticica, azeite de azeitona, azeite de palma, azeite de palmito, azeite de semente de papoula, azeite de colza, azeite de farelo de arroz, azeite de alazor, gordura de sal, azeite de sésamo, azeite do fruto de karité, azeite de soja, azeite de stillingia, azeite de girassol, talol, azeite de semente de chá, azeite de semente de tabaco, azeite de tunga, azeite de ucuuba, azeite de vemonia, azeite de germe de trigo, e azeite de baleia. 3

Segundo a presente invenção é preferido os azeites vegetais, particulannente o azeite de soja, azeite de palma, azeite de milho, azeite de colza, azeite de azeitona e manteiga de cacau.

Segundo a invenção um produto que contém um azeite pode ser um alimento como por exemplo um tempero para salada ou um produto para o cuidado pessoal.

No contexto da presente invenção, os temperos para salada são divididos em espessos (por exemplo, maionese, creme) e líquidos (por exemplo, temperos franceses). Esta definição de tempero para salada também foi oferecida por "Functional Properties of Food Components", 2nd Ed., Academic Pre, Inc, p. 268-269, que está incluída aqui como referência. A maionese é um alimento semi-sólido que si obtém normalmente a partir de um azeite vegetal comestível, gema de ovo ou ovo inteiro (fresco, congelado, ou desidratado), vinagre, e opcionalmente um ou mais dos seguintes ingredientes: sal, pimenta, adoçante, mostarda, pimentão, glutamato mono sódico, sumo de limão e/o de lima fruta, estabilizante(s), conservantes, água, e outros temperos. O produto finalizado normalmente conterá ao menos 65% de azeite vegetal. A continuação figura um exemplo de uma maionese:

Azeite

Vinagre (4.5% ácido acético) Gema de ovo Açúcar Sal Mostarda Pimenta branca 75.0-80.0% (w/w) 9.4-10.8% (w/w) 7.0-9.0% (w/w) 1.5-2.5% (w/w) 1.5% (w/w) 0.5-1.0% (w/w) 0.1-0.2% (w/w). 4

Os temperos líquidos são parecidos a maionese, excepto que contêm menos azeite. Podem conter grudes como espessantes. Os temperos líquidos para salada podem ser produzidos de varias maneiras; um tempero para uma salada comum para qualquer uso pode ter a seguinte composição (em referência ver INFORM Vol.3, 1992, p. 1277): 39.5% (w/w) 10.0% (w/w) 10.0% (w/w) 2.0% (w/w) 30.0% (w/w) 2.0% (w/w) 1.0% (w/w) 5.0% (w/w) 0.5% (w/w)

Agua

Vinagre

Sacarose

Amido

Azeite

Sal

Goma

Aromatizantes

Conservantes O método da invenção pode também ser muito útil em um produto para o cuidado pessoal, em particular em um produto para o cuidado da pele como uma creme ou uma loção. Os azeites (gordura e ceras) de interesse particular em produtos para o cuidado da pele podem ser, por exemplo, lanolina, ceras de insecto, azeite de rícino, azeite de carnaúba e azeite de jojoba.

Compostos fenólicos

Segundo a presente invenção, dependendo do azeite ou produto azeitado em questão, pode em alguns casos ser uma vantagem também agregar um composto fenólico, em cujo caso o composto fenólico actua como um 5 substrato para a laccase, aumentando desse modo a de dito azeite ou produto azeitado.

Os compostos fenólicos que podem ser usados, segundo a invenção, poderiam ser, por exemplo, uma antocianina ou uma especiaria ou um agente aromatizante ou uma combinação de mais de um composto fenólico, por exemplo, uma especiaria e um agente aromatizante. Exemplos de tais compostos são, por exemplo, pimentão, mostarda e sumo de limão como se descreve no Exemplo 2.

Com certeza o composto fenólico usado deverá ser um que seja aceitável normalmente como ingrediente alimentício. A quantidade óptimas de um composto fenólico agregado ao azeite ou produto azeitado dependerá de vários factores, do qual o mais importante é que haverá um limite máximo em cuja concentração o azeite ou produto azeitado si faz incomestível devido a um excesso de condimento ou agente aromatizante.

Pode-se achar a medida desejável para cada composto fenólico realizando uma série de provas que combinem varias concentrações do composto fenólico com varias concentrações de uma laccase e julgar o efeito desoxigenação conseguido e ao mesmo tempo tendo um painel de prova que comprove o sabor do azeite ou produto azeitado para verificar se é aceitável.

Laccase A laccase (EC 1.10.3.2) caracteriza-se por ser um grupo de proteínas de multicobre de especificidade baixa que atua tanto sobre o- como p-quinoles, pelo qual o oxigénio é reduzido a água. 6

Segundo a invenção prefere-se a laccase micro. A laccase micro pode ser derivada de bactérias ou fungos (incluído fungos e fermento filamentosos). A laccase micro é preferivelmente obtida de um fungo.

Alguns fungos preferidos incluem variedades que pertencem a subdivisão Basidiomvcotina e a subdivisão Ascomvcotina. Exemplos adequados incluem uma laccase obtenível de uma cepa de Aspergillus. Neurosnora. por exemplo, N. crassa. Podospora. Botrvtis. Collvbia. Fomes. Lentinus. Pleurotus. Pvricularia. por exemplo, P. orvzae. Trametes. por exemplo, T. villosa e T. versicolor. Rhizoctonia. por exemplo, R. solani. Coprinus. por exemplo, C. plicatilis e C. cinereus. Psatvrella. Mvceliophtora. por exemplo, M. thermophila. Schvtalidium. por exemplo, S.termophilum. Polvporus. por exemplo, P. pinsitus. Phlebia. por exemplo, P. radita (WO 92/01046), Coriolus. por exemplo, C. hirsutus (JP 2-238885), Hygrophoropsis. Agaricus. Vascellum. Crucibulum. Mvrothecium. ou Sporormiella.

Em particular preferem-se as laccases obtenível de T. villosa. T.versicolor. M. thermophila ou P. orvzae. A laccase pode ademais ser uma que seja produzível por um método que tenha o cultivo de uma célula hóspede transformada com um vector recombinante do ADN que leve uma sequência de ADN que codifique dita laccase, assim como sequências de ADN que codifiquem as funções que permitem a expressão da sequência de ADN que codifica a laccase em um meio de cultivo baixo condições que permitam a expressão da laccase e a recuperação da laccase do cultivo.

Determinação da actividade da Laccase ÍLACU) A actividade da laccase é determinada pela oxidação de 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) por oxigénio. A cor azul

7 esverdeado produzido é medido por fotometria a 418 nm. As condições analíticas são 1.67 mM de ABTS, 0.1 M de tampão de fosfato, pH 7.0, 30°C, reacção de 3 minutos. 1 unidade de laccase (LACU) é a quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 pmol de ABTS por minuto nestas condições.

Adição de Laccase

Segundo esta invenção o azeite ou o produto que contém um azeite pode ser produzido da maneira conhecida per si.

Segundo a invenção a adição de laccase pode ter lugar em qualquer momento durante a produção de dito azeite ou dito produto azeitado, normalmente a adição terá lugar como o último ou um dos últimos passo do processo, porém a laccase pode também ser agregada como um tratamento profilático numa fase anterior com o objectivo de eliminar qualquer oxigénio que possa introduzir-se no azeite ou produto azeitado durante o processo. A quantidade de laccase agregada geralmente estará na margem de 0.001-1000 LACU por g de azeite, preferivelmente na margem de 0.01-500 LACU por g de azeite, mais preferível ainda na margem de 0.1-100 LACU por g de azeite, o mais preferivelmente no margem de 1-50 LACU por g de azeite. A invenção é ademais ilustrada nos exemplos seguintes que não devem ser entendidos de nenhuma maneira limitadores do objectivo da invenção como se reivindica.

Exemplo 1

Desoxigenacão de temperos para salada a diferentes valores de nH usando Laccase 8

Para mostrar o consumo de oxigénio em temperos para salada usando laccase a diferentes valores de pH se usou o seguinte tempero: 334 g 110g 25.08 g 2.84 g 1.70 g 1.06 g 1-12 g 66 g; azeite vegetal (azeite de colza) vinagre açúcar granulado sal iodada goma de xantano pimentão em pó mostarda seca sumo de limão o conteúdo total de azeite neste tempero de salada é 62.8% (w/w). Este tempero de salada foi então diluído com água mesmo um conteúdo de azeite total de 12.6% (w/w).

Uma laccase (uma laccase de Trametes villosa disponível por Novo Nordisk A/S baixo o nome comercial SP 504) a uma dosificação de 33.5 ou 67 LACU por g de azeite foi então agregada ao tempero para salada a pH 3, a pH 4 e a pH 5 (a pH 3 só se avaliou a dosificação de 67 LACU por g de azeite); a temperatura foi ambiente (25°C), e o percentagem de oxigénio foi medido (% em relação à água saturada com oxigénio) mediante um eletrodo de Oxigénio de Rank durante os seguintes 50 minutos.

Na Figura 1 apresentam-se os resultados. Usaram-se os símbolos seguintes: II (pH 3; 67 LACU por g de azeite) V (pH 4; 67 LACU por g de azeite) 9 Δ (ρΗ 4; 33.5 LACU por g de azeite) ▼ (pH 5; 67 LACU por g de azeite) A (pH 5; 33.5 LACU por g de azeite).

Como mostra-se na Figura 1, a laccase é claramente capaz do tempero para salada e desse modo o azeite; a concentração de oxigénio é zero depois de 30 minutos a pH 4 e a pH 5, e a pH 3 é zero depois de 50 minutos.

Exemplo 2

Efeito dos agentes aromatizantes em temperos para salada sobre o nível desoxigenacão

Mostrou-se o efeito dos agentes aromatizantes como sumo de limão, pimentão e mostarda em temperos para salada sobre o nível de com laccase agregando só um agente aromatizante a um tempero para salada básica e então medindo o nível de esse agente em particular. Usou-se o tempero básico seguinte: azeite vegetal (azeite de colza) 334 g vinagre 110g açúcar granulado 25.08 g sal iodada 2.84 g goma de xantano 1.70 g A este tempero básico se lhe agregou um dos seguintes agentes aromatizantes: 1) 12.8% sumo de limão 2) 0.4% pimentão em pó e 12.4% água 3) 0.4% mostarda seca e 12.4% água. 10 O tempero resultante foi diluído com água até um conteúdo de azeite total de 12%(w/w) e o pH foi ajustado a 4.

Uma laccase (uma laccase de Trametes villosa disponível de Novo

Nordisk A/S baixo o nome comercial SP 504) a uma dosificação de 60 LACU por g de azeite foi então agregada aos diferentes temperos de salada; a temperatura foi ambiental (25°C), e o percentagem de oxigénio foi medido (% em relação à água saturada com oxigénio) mediante um Elétrodo de Oxigénio de Rank durante os seguintes 60 minutos.

Na Figura 2 apresentam-se os resultados. Foram usados os símbolos seguintes: • tempero para salada sem agentes aromatizantes (controle); V + mostarda; ▲ + pimentão; I + sumo de limão.

Como mostra-se na Figura 2 os agentes aromatizantes têm uma influência muita positiva sobre o nível desoxigenação; a concentração de oxigénio é zero depois de 35-40 minutos quando se agrega mostarda ou sumo de limão; a concentração de oxigénio é zero depois de 60 minutos quando se agrega pimentão, enquanto que o controle sem agregar agentes aromatizantes ainda contém perto do extremo do tubo de 10% de oxigénio depois de um tempo de reacção de 60 minutos.

Lisboa, 28 de Janeiro de 2000

Gonçalo de Cunha Adiunto do-AíTw*BrT7fTrT«r-i4«

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método de azeite ou um produto que contém azeite, compreendendo a adição de uma quantidade efectiva de uma laccase a dito azeite ou a dito produto.
2. Método segundo a reivindicação 1 na qual o azeite é um azeite vegetal.
3. Método segundo a reivindicação 2 na qual o azeite é seleccionado do grupo consistente em azeite de soja, azeite de palma, azeite de milho, azeite de colza, azeite de azeitona, e manteiga de cacau.
4. Método segundo a reivindicação 1 na qual o produto que contém um azeite é um alimento.
5. Método segundo a reivindicação 4 na qual o alimento é um tempero para salada.
6. Método segundo a reivindicação 5 na qual o tempero de salada é uma maionese.
7. Método segundo a reivindicação 1 na qual o produto que contém um azeite é um produto para o cuidado pessoal.
8. Método segundo as reivindicações 1-7 na qual a laccase é uma laccase micro.
9. Método segundo a reivindicação 8 na qual a laccase micro é obtenível de um fungo, em particular de um fungo que pertence a subdivisão Basidiomvcotina ou a subdivisão Ascomvcotina.
10. Método segundo a reivindicação 9 na qual a laccase micro é obtenível de uma cepa de Aspergillus. Neurospora. Podospora. Botrvtis. Collvbia. Fomes. Lentinus. Pleurotus. Trametes. Rhizoctonia. Coprinus. Psatvrella. Mvceliophthora. Schvtalidium. Polvporus. Phlebia. Pvricularia. Coriolus. Hvgrophoropsis. Agaricus. Vascellum. Crucibulum. Mvrothecium. ou Sporormiella.
11. Método segundo a reivindicação 10 na qual a laccase micro é obtenível de T. villosa. T.versicolor. M. termo ou P. orvzae.
12. Método segundo qualquer das reivindicações 1-11 na qual a quantidade de laccase está na margem de 0.01-100 LACU por g de azeite.
13. Método segundo qualquer das reivindicações 1-12 que agrega adicionalmente ao menos um composto que atua como um substrato para a laccase.
14. Método segundo a reivindicação 13 na qual o composto é mostarda, pimentão ou sumo de limão. 2 Lisboa, 28 de Janeiro de 2000 Pela requerente f O Agente Oficial 3.....4 Gonçaío da Cunha Ferreíra íciunío do Âg«*te C|it..:. Propriedade iedusi' R. D. João v;^2o'd};3-1250 ÍISEOT'J 3