PT843732E

PT843732E - Sequência de retroelementos naturais ou sintéticos que têm a função de permitir a inserção de sequências nucleotídicas numa célula eucariótica

Info

Publication number: PT843732E
Application number: PT96927085T
Authority: PT
Inventors: Andre Choulika; Jean-Francois Nicolas
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1995-08-07
Filing date: 1996-07-25
Publication date: 2007-01-31
Also published as: ATE339511T1; ATE477326T1; CA2226301C; DE69638235D1; JPH11510391A; HK1105662A1; CA2226301A1; JP4173543B2; EP0843732A1; JP4482578B2; WO1997006271A1; US20060269522A1; EP1760154A2; ES2276407T3; DE69636546D1; EP1760154B1; US6200800B1; EP1760154A3; FR2737731B1; FR2737731A1

Description

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DESCRIÇÃO

"SEQUÊNCIA DE RETROELEMENTOS NATURAIS OU SINTÉTICOS QUE TÊM A FUNÇÃO DE PERMITIR A INSERÇÃO DE SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS NUMA CÉLULA EUCARIÓTICA" A presente invenção diz respeito a uma sequência de retroelementos naturais ou sintéticos, particularmente a uma sequência de nucleótidos retrovirais LTR, mais particularmente ao ADN retroviral, bem como a um vector retroviral que contém esta sequência e que permite, durante a infecção de uma célula na qual se deseja integrar um gene de interesse contido neste vector, a eliminação de uma grande parte das sequências provirais que já não são necessárias depois da integração do provírus recombinante. A presente invenção diz respeito a um polinucleótido que compreende: (a) a sequência LTR3' ou LTR5' de um retroelemento natural ou sintético; e (b) uma sequência de inserção que compreende uma sequência de nucleótidos de interesse, bem como, para um determinado sistema de recombinação, uma única sequência de reconhecimento de uma recombinase, sendo a referida sequência de inserção introduzida na referida LTR'3 ou na referida LTR5', de forma a permitir a inserção, com a intervenção de um vector retroviral, da referida sequência de interesse no genoma de uma célula hospedeira, sem que sejam inseridas sequências provirais que já não são necessárias depois da integração da sequência de interesse no genoma da célula hospedeira. 2

Os recentes progressos na utilização dos retrovirus, enquanto vectores de genes, enquadram-se em três categorias: (i) a melhoria das linhagens celulares de encapsidação, (ii) a manipulação do tropismo das proteínas da membrana, (iii) expressão de genes múltiplos. A modificação da estrutura do provírus integrado não foi ainda bem explorada, uma vez que esta última encerra determinados elementos essenciais que actuam em cis. Estes elementos estão na origem de múltiplos problemas.

Do ponto de vista da estrutura, o sistema de vector retroviral é construído a partir de dois elementos: os genes transcomplementares (gag, pol e env) , e as sequências que actuam em cis (U3, R, U5, o segmento polipurina (PPT) , o sítio de ligação do iniciador (PBS) e o sinal de encapsidação e de dimerização).

Os genes transcomplementares são incorporados nas células transcomplementares. Não são transferidos para as células alvo.

As sequências que actuam em cis são incorporadas nos vectores retrovirais. A maior parte delas é transferida para as células alvo infectadas, sendo integradas no provírus recombinante. A eliminação de qualquer das sequências que actuam em cis conduz a um sistema retroviral não funcional. É necessário o sinal de encapsidação para a encapsidação do genoma retroviral nas partículas virais. São necessários o PBS, PPT e R para a transcrição inversa. As sequências U3 e U5 são indispensáveis para a transcrição inversa e para a integração do produto retroviral introduzido na célula. 3

Depois do provírus ser integrado, estas sequências já não são necessárias para a expressão do gene. Pelo contrário, estas sequências podem até estar na origem de numerosos problemas. (i) Uma interferência transcripcional pode resultar da presença do promotor forte nas sequências U3. (ii) 0 PBS pode actuar como um elemento inibidor em cis para os promotores internos. Por exemplo, nas células pluripotentes, o PBS é uma sequência de reconhecimento para um repressor forte e ainda actua como um elemento inibidor. (iii) A sequência U3 apresenta pelo menos um dos elementos de regulação negativa situados nos activadores à distância repetidos directos entre -345 e -306. (iv) A LTR3' (Long Terminal Repeat) pode activar os genes que flanqueiam as células por vezes com consequências nefastas para a célula (v). O ARN expresso a partir do promotor da LTR5' contém o sinal de encapsidação, podendo, por consequência, ser recuperado numa partícula retroviral. Este ARN pode recombinar-se com um ARN celular ou com o ARN retroviral de um fenótipo, levando à recuperação de um retrovírus dotado de novas propriedades (criando um perigo biológico potencial). Estes problemas não foram ainda totalmente superados, na medida em que todos estes elementos são necessários para a replicação e para a inserção do vírus no genoma.

No âmbito da presente invenção, os inventores desenvolveram uma sequência de retroelementos naturais ou sintéticos, nomeadamente uma sequência de nucleótidos retrovirais e, mais especificamente, um vector retroviral que contém esta sequência, concebido de forma a permitir a eliminação de uma grande parte das sequências provirais que já não são necessárias depois da integração de um provírus numa célula hospedeira. Mais especificamente, esta sequência retroviral é um ADN retroviral que pode permitir a integração de uma 4 única sequência LTR, de um elemento de retrotransposição, ou de uma sequência que compreende uma região U3, R ou U5 no genoma de uma célula hospedeira. A invenção diz respeito igualmente às célula hospedeiras, de preferência células eucarióticas, obtidas a partir da transfecção pela sequência de retroelementos da invenção ou de um vector que a contém. A presente invenção diz respeito assim a um polinucleótido que compreende: (a) a sequência LTR3' ou LTR5' de um retroelemento natural ou sintético; e (b) uma sequência de inserção que compreende uma sequência de nucleótidos de interesse, bem como, para um determinado sistema de recombinação, uma única sequência de reconhecimento de uma recombinase, sendo a referida sequência de inserção introduzida na referida LTR'3 ou na referida LTR5', de forma a permitir a inserção, por intervenção de um vector retroviral, da referida sequência de interesse no genoma de uma célula hospedeira, sem que sejam inseridas as sequências provirais que já não são necessárias depois da integração da sequência de interesse no genoma da célula hospedeira.

Especificamente, esta sequência de inserção é incorporada numa região que actua em cis, mais particularmente, na região LTR3' ou LTR5' e, de forma preferencial, na região U3 da LTR3' ou U5 da LTR5' desta sequência retroviral. Esta sequência de inserção compreende uma sequência de nucleótidos de interesse, que pode ser integrada no genoma de uma célula hospedeira, assim como uma sequência de 5 reconhecimento para uma recombinase. De forma preferencial, o conjunto da sequência retroviral contém apenas uma única sequência de reconhecimento situada, com a sequência de interesse, a montante ou a jusante, por exemplo, embora este último parâmetro não seja absolutamente necessário. A sequência de nucleótidos de interesse pode estar situada a jusante da sequência de reconhecimento, desde que esta última esteja compreendida na reqião transferida numa célula alvo durante a infecção desta célula alvo por um retrovirus que contenha a sequência retroviral. 0 comprimento máximo da sequência de inserção que o vector retroviral da invenção apresenta situa-se normalmente entre 0,5 e 10 kb.

De forma especifica, a sequência da invenção compreende igualmente uma sequência do ADN que codifica para uma recombinase susceptivel de reconhecer a sequência do seu sitio de reconhecimento, encontrando-se esta sequência de ADN que codifica para uma recombinase situada, de forma vantajosa, entre as regiões LTR5' e LTR3' do vector. A invenção diz respeito ainda a um vector retroviral ou retrovirus recombinante, que compreende a sequência acima descrita. De forma preferencial, o vector retroviral, que pode apresentar-se na forma de um retrovirus recombinante, contém apenas uma única sequência de reconhecimento incorporada na região que pode ser transferida para uma célula alvo. O ADN da invenção permite, deste modo, a inserção, por intermédio de um vector retroviral, de sequências de nucleótidos de interesse nas células hospedeiras, por exemplo do tipo eucariótica, sem que sejam inseridas sequências provirais que já não são necessárias depois da integração das sequências de interesse no provirus. 6 A expressão "sequências de nucleótidos de interesse", aqui empregue acima, faz referência às sequências a serem inseridas no genoma das células hospedeiras, permitindo assim àquelas a produção de moléculas de interesse, mais particularmente em terapia ou para a vacinação. Estas sequências de interesse incluem, entre outros, os genes, sequências de ADN ou de ARN que codificam tanto para proteínas (hormonas, imunoglobulinas, enzimas ou outras), quando os vectores retrovirais da invenção forem utilizados em terapia com genes, como para proteínas humanas ou não humanas (como as proteínas virais), quando se trata de utilizar os vectores retrovirais da invenção no âmbito dos protocolos de vacinação. As sequências nucleotídicas de interesse podem ainda ser constituídas, em parte, por elementos de regulação (ou seja, promotor, activador) homólogos ou heterólogos à célula hospedeira, por um lado, e por outro, por sequências que codificam para todo ou parte de um ou mais genes ou ADN complementar. Além disso, as sequências nucleotídicas de interesse podem também codificar um ARN antissentido ou uma sequência ribozima. São múltiplas as aplicações possíveis para a sequência de retroelementos da presente invenção. A sequência da invenção é utilizada quer simplesmente para a inserção de sequências de nucleótidos em células hospedeiras, tais como as células eucarióticas num ambiente que favorece uma melhor expressão deste gene, quer na terapia com genes, quer ainda na vacinação. A título de exemplo, pode ser utilizada a sequência de interesse descrita em Nature Medicine, Volume No. 7, de Julho de 1995 correspondente à inserção dos plasmídeos pMEPVH-/pMEPVL ou pMEPVH/pREPVK, e o produto de expressão in vivo pode ser um elemento de uma composição terapêutica. 7 0 vector retroviral da invenção é obtido pela transfecção de uma linhagem celular virai transcomplementar com uma sequência de retroelementos da invenção que se apresentam de forma preferencial na forma de plasmídeos e que compreendem de forma preferencial numa das suas LTR e, mais particularmente, na sua LTR da direita, uma sequência de nucleótidos de interesse, assim como uma sequência de reconhecimento. 0 plasmídeo pode ainda conter uma sequência de nucleótidos que codificam para uma recombinase susceptivel de reconhecer o sitio de reconhecimento, situado a montante ou a jusante da sequência de interesse, podendo esta sequência de nucleótidos estar situada, de forma vantajosa, entre as regiões LTR3' e LTR5'. Depois de ter sido efectuada a transfecção da linhagem celular virai, obtém-se um vector retroviral que pode ser utilizado para a infecção de uma célula hospedeira, na qual se pretende integrar a sequência de nucleótidos de interesse. 0 plasmídeo acima definido, assim como o método de transfecção da linhagem celular pelo referido plasmídeo, entram igualmente no âmbito da presente invenção. A invenção refere-se igualmente a um método ou processo de introdução de sequências de nucleótidos de interesse numa célula hospedeira, tal como uma célula eucariótica. 0 método é caracterizado pelo facto de compreender uma fase de infecção de uma célula eucariótica por um vector retroviral que contém a sequência retroviral da invenção, que compreende a sequência de nucleótidos a ser introduzida na célula eucariótica, em condições que permitam a integração no genoma celular da célula de uma única LTR do vector retroviral que contém a sequência a introduzir no genoma da célula hospedeira, e uma segunda fase de 8 expressão da sequência de interesse e depois dos elementos do produto desta a partir da célula recombinada. A invenção diz respeito igualmente a um hospedeiro celular tendo integrado no seu genoma uma estrutura proviral que compreende uma única região LTR de um vector retroviral que contém a sequência retroviral da invenção, compreendendo esta sequência LTR uma cópia única de uma sequência de nucleótidos de interesse. Mais especificamente, o hospedeiro celular da invenção é uma célula eucariótica e a estrutura proviral é caracterizada pelo facto de ser essencialmente livre da sequência PBS, do sinal de encapsidação e da dimerização e/ou do PPT. A invenção refere-se igualmente ao emprego da sequência de retroelementos ou do vector retroviral da invenção para a fabricação de uma composição que permita a produção, nas células hospedeiras, de proteínas codificadas por uma sequência de nucleótidos de interesse compreendida neste ADN retroviral. A invenção refere-se ainda ao polinucleótido ou ao vector retroviral da invenção para a utilização no tratamento médico de pacientes, visando integrar uma sequência de nucleótidos de interesse no genoma das células visadas.

Mais particularmente, a sequência da invenção permite igualmente a transferência de sequências de nucleótidos que codificam para anticorpos nas células hospedeiras. Fala-se então de imunização extra-celular, uma vez que os anticorpos gerados a partir destas sequências produzem o seu efeito no interior das células que os integraram. Entre as sequências de nucleótidos que codificam para anticorpos que podem ser integrados nas células hospedeiras, empregando a sequência retroviral e o vector retroviral da 9 invenção, podem-se mencionar, a titulo de exemplo não restritivo, os anticorpos que reconhecem as proteínas da membrana do vírus HIV, particularmente as proteínas gp.120 do vírus HIV—1 e do vírus HIV-2, assim como os anticorpos que permitem bloquear a transcriptase reversa. Tais anticorpos encontram-se descritos, entre outros, na publicação de Maciejewski et al. (Nature Medicine, Volume No 7, Julho de 1995). 0 vector retroviral da invenção permite uma integração mais eficaz destas sequências de nucleótidos de interesse, cuja eficácia terapêutica desta abordagem é melhorada na mesma proporção. A invenção refere-se igualmente a um método ou processo de expressão de uma molécula codificada por uma sequência de nucleótidos de interesse numa célula hospedeira em cultura. 0 método compreende: - a infecção da célula hospedeira por um vector retroviral da invenção que compreende a sequência de nucleótidos de interesse; - o crescimento da célula hospedeira em condições que permitam a expressão da sequência de nucleótidos de interesse; e - a obtenção da molécula desejada. A sequência de nucleótidos retroviral, bem como os vectores retrovirais da invenção, podem ser utilizados de diversas formas para permitir a integração da sequência de nucleótidos de interesse desejada. Na realidade, os inventores demonstraram não ser necessário associar a expressão da recombinase directamente ao vector retroviral, embora os rendimentos da integração sejam superiores quando 10 uma sequência nucleotídica que codifica para a recombinase é parte integrante do vector. transfecção , terminando por uma recombinaçao sem integração. Emprega-se uma sequência retroviral que compreende uma sequência nucleotídica que inclui uma sequência de

Um vector retroviral compreendendo na região LTR3' ou LTR5' do vector retroviral uma primeira sequência de nucleótidos que compreende uma sequência de nucleótidos de interesse, assim como uma sequência de reconhecimento situada a jusante ou a montante da sequência de interesse, bem como uma segunda sequência de nucleótidos idêntica à primeira sequência de nucleótidos inserida na região LTR5' do vector, que é introduzido no genoma de uma célula hospedeira por infecção. Um plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para uma recombinase susceptível de reconhecer a sequência de reconhecimento é introduzido igualmente na célula por transfecção. A expressão da recombinase por transfecção transforma a estrutura de um provírus de duas LTR num provirus de uma única LTR. Neste tipo de reacção, cerca de 50% dos transformantes estáveis apresentam o provirus modificado. Este resultado parcial pode ser explicado pela expressão efémera do plasmideo que compreende a sequência de nucleótidos que codificam para a recombinase após a

interesse, assim como uma sequência de reconhecimento situada a jusante ou a montante desta sequência de interesse. A sequência completa é inserida na região LTR3' de um retrovirus. 0 vector retroviral assim obtido é em seguida utilizado para infectar uma linhagem celular que exprime constitutivamente ou por indução uma recombinase susceptível de reconhecer a sequência de reconhecimento. A 11 eficácia de um sistema desta natureza é elevada, principalmente quando o gene que codifica para a recombinase é expresso desde o inicio da infecção retroviral.

Um vector retroviral compreende uma sequência de nucleótidos inserida na sua região LTR3'. Esta sequência de nucleótidos compreende uma sequência de interesse, assim como uma sequência de reconhecimento que pode ser reconhecida por uma recombinase. A sequência de reconhecimento encontra-se situada a jusante ou a montante da sequência de interesse. Além disso, um gene que codifica para uma recombinase, assim como um promotor, são integrados no vector retroviral entre as duas LTR deste vector. Em seguida, é infectada uma linhagem celular por este retrovirus. Um vector retroviral desta natureza gera apenas provírus de uma única LTR. A eficácia deste sistema é elevada, uma vez que todos os eventos integrados e analisados apresentam esta estrutura. A principal vantagem de um vector retroviral desta natureza é o facto de associar eventos de recombinação obtidos entre as duas LTR com a delecção do gene que codifica para a recombinase. Como consequência, as células infectadas só conseguem exprimir a recombinase de forma efémera.

Os inventores empregaram o sistema de recombinase Crelox especifica do sitio do bacteriófago PI. 0 sitio de reconhecimento LoxP foi inserido na LTR3' a montante da sequência de nucleótidos de interesse num vector do tipo Enh, e o gene que codifica para a recombinase Cre entre as duas LTR. Na linhagem celular produtora, a proteína Cre é expressa a partir da construção plasmídica proviral. Contudo, uma vez que o plasmídeo contem apenas um único alvo loxP, não é recombinado pela proteína Cre. Depois da 12 infecção, o sítio loxP é duplicado da LTR3' para a LTR5' . Desta forma, Cre recombina os dois sítios loxP repetidos directos, o que se traduz na deleção de todas as sequências compreendidas entre os dois loxP, inclusive o PBS, o sinal de encapsidação e de dimerização e a PPT. Integrado no genoma celular, resta apenas uma única LTR que contém o gene transferidor. 0 gene Cre foi igualmente perdido durante a recombinação. A sequência de nucleótidos de interesse, que é geralmente uma sequência estranha ao retrovírus, é introduzida de forma vantajosa na região U3 da LTR3' da sequência retroviral. Efectivamente, a possibilidade de se introduzirem sequências, até mesmo unidades transcripcionais completas, na região U3 da LTR3', encontra-se muito bem documentada. Pode-se, ainda assim, considerar a introdução de sequências de interesse noutras regiões sem ser a região U3 da LTR3' do vector retroviral. Os exemplos contemplam a região U5 da LTR5'. Além disso, embora seja preferível que o sítio de reconhecimento se situe imediatamente a jusante ou a montante da sequência de nucleótidos de interesse, pode-se igualmente colocar esta sequência a uma distância apreciável, que pode variar de 32 nt a 4,5 Kb sem afectar a integração final da sequência de interesse na célula visada. A quantidade de produtos genéticos estranhos introduzidos na região U3 do ADN virai pode ser elevada e, nalguns casos, superior a 4 kpb. Estas sequências podem até corresponder a uma unidade transcripcional completa com um promotor independente, o que demonstra a polivalência destes vectores. A possibilidade de se introduzirem quantidades consideráveis de produtos genéticos estranhos na 3'LTR do 13 vector retroviral da invenção faz deste vector retroviral um sistema alternativo para a inserção de sequências de genes nas células, mais especificamente, nas células eucarióticas. Diversos tipos de células eucarióticas podem assim ser transformadas. Entre as células eucarióticas que podem ser utilizadas no âmbito da presente invenção, destacam-se particularmente os tipos de células descritos a seguir: NIH 3T3, BRL, HM1, D3, PLL4, LT. A inserção de uma sequência de nucleótidos que codificam para um marcador está prevista na região LTR3' do vector retroviral. A presença deste marcador permite demonstrar a inserção do novo produto. A título de exemplos não restritivos, podem ser utilizados os marcadores descritos a seguir: LacZ, GFP (green fluorescent protein), CD9, PAL (alkaline phosphatase) e HRP (Horse Radish Peroxydase).

Embora o sistema de recombinase Crelox constitua um sistema alternativo para o vector retroviral da invenção, podem ser utilizados igualmente outros sistemas de recombinase. A título de exemplos não restritivos, podem ser utilizados os sistemas de recombinação descritos a seguir: o sistema de levedura FLP (denominado "Flip") e o sistema bacteriano R.

Os vectores retrovirais da invenção fornecem assim um meio de transferência eficaz do ADN para as células hospedeiras. A integração proviral é precisa e não causa o reordenamento cromossómico. A concepção dos vectores duplicadores partia do princípio segundo o qual a transposição do gene para a LTR5', fora da unidade transcripcional retroviral, melhora a sua expressão. 14

Se bem que a presença do sinal de encapsidação permita a geração de um vírus competente para a replicação por recombinação entre as sequências do retrovírus e do provírus endógenos, que a presença do PPT e de outros elementos em cis permitam a transposição, e que a presença de sequências PBS possa ter efeitos negativos sobre a expressão do transgeno, todos estes eventos são bastante improváveis quando se utiliza um vector retroviral de acordo com a invenção, uma vez que todas estas sequências virais são deletadas.

Os sistemas das sLTR é um conceito novo na construção dos retroelementos em geral. Há diversos retrovírus cujo espectro de hospedeiro da partícula apresenta um interesse, mas para os quais a concepção de vectores requer a presença de determinadas sequências cis ou trans activas, diferentes daquelas que foram mencionadas anteriormente e que permitem a montagem correcta do virião e que lhe permite ser infeccioso, como por exemplo os vírus humanos VIH, HTLV ou o vírus da cabra CAEV. Depois de serem integrados, os elementos cis ou trans reguladores tornam-se inúteis para o gene transduzido, mas apresentam efeitos patogénicos para a célula, aumentando significativamente as probabilidades da ressurgência de um vírus selvagem. A necessidade deste tipo de sequência para este tipo de retrovírus torna-os praticamente inutilizáveis para um emprego enquanto vectores. A aplicação do sistema sLTR da presente invenção para estes retrovírus permite considerar com mais segurança e fiabilidade transcripcionais uma utilização como vectores para a transdução dos genes. A presente invenção será descrita com mais clareza confrontada com os exemplos não restritivos descritos a seguir e que fazem referência às figuras a seguir: 15 a figura IA representa a estrutura do plasmídeo pMloxPL; a figura 1B representa a estrutura do provírus MloxPL resultante da infecção do retrovirus MloxPL; a figura 1C representa um provírus depois da recombinação induzida por cre ao se utilizarem os dois sítios loxP no interior das LTR; a figura 1D representa uma análise por "Southern blot" do ADN celular proveniente dos fibroblastos NIH3T3 infectados por MloxPL; a figura 1E representa uma análise por "Southern blot" do ADN celular proveniente do clone NIH3T3 MloxPL.1 transfectado pelo plasmídeo pMCl-Cre; a figura 2A representa a estrutura e a análise molecular do provírus MloxPL resultante da infecção do retrovirus MloxPL e da recombinação induzida por Cre, utilizando os dois sítios loxP no interior das LTR; a figura 2B representa os resultados de uma análise por "Southern blot" do ADN celular proveniente dos fibroblastos NIH 3T3 Cre.1 infectados por MloxPL com digestão por endonuclease de restrição Bell; a figura 2C representa os resultados de uma análise por "Southern blot" do ADN celular proveniente dos fibroblastos NIH 3T3 Cre.1 infectados por MloxPL com digestão pelas endonucleases ECORV; a figura 3A representa a estrutura do plasmídeo pMCreloxPL; a figura 3B representa um diagrama do 3'sLTR de algumas realizações preferenciais do vector retroviral da invenção; a figura 3C representa os resultados de uma análise por "Southern blot" do ADN celular proveniente dos fibroblastos NIH 3T3 infectados por MCreloxPL por digestão por endonuclease de restrição Bell; 16 - a figura 3D representa os resultados de uma análise por "Southern blot" do ADN celular proveniente dos fibroblastos NIH 3T3 infectados por MCreloxPL por digestão por endonuclease de restrição EcoRV; - a figura 3E representa os resultados de uma análise por "Southern blot" do ADN celular proveniente dos fibroblastos NIH 3T3 infectados por MCreloxPL por digestão por endonuclease de restrição Kpnl; - a figura 4 representa um diagrama do mecanismo da geração de sTLR com o vector retroviral McreloxPL.

EXEMPLOS

Nomenclatura A nomenclatura dos diferentes vectores e das diferentes células foi estabelecida, tal como se segue: o p designa o vector plasmídico (por exemplo, pMloxPL); os nomes com um ψ2 (depositada em 10/3/1993 no ECAC com o número 93031002) designam a linhagem celular do virus selvagem auxiliar ψ2 transfectado com este vector (por exemplo, \|/2-MloxPL) ; os nomes sem -p- designam os virus produzidos pelas células do virus selvagem auxiliar (por exemplo, MloxPL); o nome de uma linhagem celular seguido do nome do virus indica que a linhagem celular contém um provirus resultante de uma infecção (por exemplo, NIH3T3MloxPL).

Cultura e selecção das células

As linhagens celulares estabelecidas NIH 3T3 (fibroblastos de ratos) e ψ2 (linhagem celular de encapsidação do retrovirus ecotrópico do rato) são referidos em (7) e (13). São cultivadas num DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) de elevado teor de glicose (4,5 g/1) preenchido com soro de vitelo fetal a 5 %. As células são incubadas a 37 °C numa atmosfera humidificada, contendo 12% de CO2. É 17 adicionado G418 ao meio apropriado, a uma concentração de 600 mg/ml. A clonagem das colónias resistentes ao G418 foi realizada por pipetagem de colónias individuais e isolamento numa caixa de cultura distinta. A clonagem das células infectadas é realizada por diluição limitante 48 horas após a infecção.

Transfecção, infecção, coloração das células e análise dos ácidos nucléicos por "Southern blot"

Foram realizadas precipitações por fosfato de cálcio, como foi descrito em (12) . 0 sobrenadante que continha o virus foi utilizado para infectar as células NIH 3T3 na presença de 5 μρ/ιηΐ de polibreno, como foi descrito anteriormente no parágrafo (37). Foram preparadas hibridações por "Southern blot" pelo processo em referência (6). A actividade de 13-galactosidase foi destacada por coloração em X-gal, como foi descrito anteriormente em (38).

Detecção de LacZ por PCR A PCR é realizada em 1 μρ de ADN celular genómico numa reacção de 40 μΐ (Tris-HCl 50 mM (pH9), 150 μρ/ml de albumina de soro bovino, (NH4)20S4 16 mM, MgCl2 7 mM, 250 μΜ para cada dNTP, 1,25 U Taq DNApol (USB), 0,078 U Vent(exo+) DNApol (N.E. Biolabs)). Foram adicionados os iniciadores a uma concentração final de 0,25 μΜ (para 20 matrizes). A reacção da PCR foi aquecida a 80 °C durante 5 minutos antes do inicio. 35 ciclos (94 °C, 55 min.; 59 °C, 30 s; 70 °C, 3 min. 30 s) com os iniciadores seguintes: 5'- GCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAAT-3' e 5'- GACACCAGACCAATGGTAATGGTAGCGAC-3' para a detecção de LacZ e 5'-GGACTGGGTGGCTTCCAACTCCCAGACAC-3' e 5'- AGCTTCTCATTGCTGCGCGC-CAGGTTCAGG-3' para a detecção do RAP-SYN endógeno de rato, como padrão interno. Os produtos de 18 reacçao da PCR foram analisados por electroforese sobre gel.

Exemplo 1 - Construção do vector retroviral pMloxPL e transfecção de linhagens celulares

a) Construção do vector pMloxPL pMloxPL resulta do plasmídeo pG-MPL (descrito na publicação de Choulika et ai., 1995), no qual o sitio de reconhecimento loxP é inserido no sitio Nco I num adaptador de ligação (5'-CATGCATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATC-3 ' e 5'-CATGGATAACTTCGTATAATGTATGCTTATCGAAGTTATATG-3'), em vez do sitio I-Sce I. A sequência do sitio loxP foi verificada pela sequenciação do ADN. 0 retrovirus utilizado encontra-se ilustrado na fig. la. pMloxPL é construído a partir de um provírus de leucemia murina de Monloney defectivo (privado dos genes gag, pol e env) , inserindo-se a sequência que codifica para PhleoLacZ na região U3 da LTR de direita no lugar das sequências de activação à distância. 5' resultante do gene PhieoLacZ foi colocado entre o sítio aceitador do entrelaçamento do gene env de MoMuLV e um sítio loxP com 32 pb de comprimento resultante do bacteriófago PI. Nas células infectadas, este tipo de vírus possui a LTR que contém o gene activado por um promotor celular flanqueando por captura do promotor.

b) Transfecção de linhagens celulares com o Plasmídeo PMloxPL

As linhagens celulares que produzem o vírus foram geradas, transfectando-se o plasmídeo pMloxPL com o plasmídeo de selecção pUSVneo na linhagem celular do vírus selvagem auxiliar ψ2, que exprime o vírus selvagem auxiliar ecotrópico defectivo em encapsidação. Após a selecção para 19 G418 (neomicina), foram testados clones individuais seleccionados quanto à sua actividade de β-galactosidase para titular o vírus. A titulação foi realizada, clonando-se as células NIH 3T3 logo após a infecção por diluição limitante, e detectando-se a presença do provírus que continha LacZ por PCR. As linhagens celulares produtoras \y2-MloxPL.l e \|/2-MloxPL.2 mostraram um título na linhagem celular NIH3T3 de respectivamente 2,5 χ 104 e 5 χ 104 (Quadro 1). A titulação das unidades que formavam colónias azuis por mililitro (BCFU/ml) do sobrenadante virai de ψ2-MloxPL.l e \|/2-MloxPL.2 é de, respectivamente, 3 e 6, o que corresponde a uma relação aproximada de 1 colónia azul para cada 104 integrações. Como foi descrito anteriormente, estes provírus funcionam como armadilhas para o promotor e unicamente uma integração em 104 exprime o gene tranferidor na linhagem celular fibroblástica NIH3T3.

As estruturas do ADN dos provírus MloxPL integrados estão esquematizadas na figura lb. Nas figuras do presente texto, estão indicadas as posições das LTR e dos sítios de restrição Bell e das dimensões dos fragmentos (-x- indica o fragmento Bdl com dimensão aleatória do braço esquerdo e -y- o fragmento Bell de dimensão aleatória do braço direito). P indica uma sonda LacZ radiomarcada a 32p. Estas estruturas foram em seguida analisadas por hibridação por "Southern blot" em 6 clones NIH 3T3 independentes. Os resultados desta análise são apresentados na figura ld. Todos os clones contêm um provírus no qual as sequências no interior da região U3 da 3'LTR foram duplicadas na 5'LTR; a digestão por endonuclease Bcl I gera o fragmento considerado da parte dos provírus com duas LTR contendo PhleoLacZ (o enzima de restrição Bcl I possui um sítio de reconhecimento em cada sequência LacZ nas LTR) . A hibridação por "Southern blot" que utiliza LacZ como sonda 20 mostra um fragmento de clivagem de 6 kpb, o gue demonstra uma duplicação fiel da região U3. As duas bandas suplementares com dimensões variáveis representam os fragmentos que se estendem dos sítios Bcl I no provírus até ao ADN celular que os flanqueia. As duas bandas suplementares mostram haver aí uma integração proviral por clone, enquanto as suas dimensões variáveis confirmam que cada linhagem celular era um clone independente.

Exemplo 2: Co-transfecção de linhagens celulares com os Plasmídeos pMloxPL e pMCI-Cre

Examinámos se a duplicação loxP por intermédio da LTR podia ser recombinada pela recombinase Cre. Utilizámos a linhagem celular clonal NIH3T3MloxPL.1 para alvejar uma recombinação com a proteína Cre. Procedemos à co-transfecção nesta linhagem celular do vector de expressão pMCI-Cre com o vector de selecção pUSVneo. A estrutura do provírus depois da recombinação induzida por Cre encontra-se ilustrada na figura lc. 0 ADN de 24 clones resistente à neomicina foi analisado por hibridação por "Southern blot". A detecção dos provírus recombinados foi realizada, analisando-se as digestões de Bcl I. 0 ADN restrito dos clones foi sondado com um LacZ radiomarcado de 32p. Os resultados desta análise estão ilustrados na figura le. A estrutura parental do provírus revela uma banda de 6 kpb correspondente à duplicação fiel da sequência U3 que contém o LacZ e de duas bandas suplementares de 8 kpb e de 12 kpb (descritas acima (fig. lb e d)). A análise do ADN dos clones resistentes à neomicina revela 5 clones em 24 nos quais foi eliminada a banda de 6,0 kpb (fig. le) . As bandas de 8 kpb e de 2 kpb correspondentes ao ADN celular que flanqueia o provírus encontravam-se sempre presentes, revelando desta forma que 21 o sítio de integração proviral não havia sido reordenado. Este resultado sugere que a expressão do gene cre numa célula que contenha o provírus MloxPL pode conduzir a uma recombinação frequente dos dois sitios loxP incluídos nas LTR.

Para testar a eficácia da recombinação por intermédio de Crelox, analisámos igualmente o ADN de 25 clones resistentes ao G418 por hibridação por "Southern blot", com o propósito de testar a presença da sequência cre) . 0 ADN foi digerido com a endonuclease de restrição Xho I e sondado com um ADN cre de comprimento total radiomarcado a 32p. Os resultados desta análise estão ilustrados na figura le. Três dos cinco clones recombinados em loxP revelam uma banda que se híbrida com a sonda cre de 1,9 kpb, sugerindo que a unidade de expressão cre de comprimento total de pMCl-Cre se encontra presente. Um dos cinco clones recombinados em loxP não revelou nenhuma banda a hibridar-se com a sonda cre. Um clone recombinado em toxP revela uma banda de 5 kpb resultante de um rearranjo do plasmideo pMCl-Cre. Quatro outros clones, mostrando uma banda de 1,9 kpb a hibridar-se com cre, não apresentam nenhuma recombinação no provírus integrado MloxPL. Não detectámos a presença do ADN cre nos restantes 16 clones. Este resultado revela que a eficácia da recombinação induzida pela presença do plasmideo pMCl-Cre não era absoluta nas linhagens celulares transfectadas estáveis, onde apenas 50% dos sítios loxP são recombinados. Este resultado sugere igualmente que a recombinação entre os dois sítios loxP pode ser obtida pela expressão efémera de pMCl-Cre (Quadro 2) .

Exemplo 3 - Infecção das células que exprimem o enzima Cre com MloxPL 22

Produzimos uma linhagem celular NIH3T3, que continha o plasmídeo pMCl-Cre, por co-transfecção dos plasmídeos pMCl-Cre e pUSVneo. Foram seleccionados clones num meio contendo G418 e o seu ADN foi analisado após a digestão com uma endonuclease de restrição Xho 1 por hibridação por "Southern blot". A presença do gene Cre foi detectada por hibridação com uma sonda de ADN cre de comprimento total radiomarcada a 32p. Dez dos 12 clones resistentes ao G418 analisados revelaram a presença da sequência Cre sob uma quantidade variável de cópias (tendo aproximadamente 1 a 10 cópias) (dados não ilustrados).

Foi escolhido o clone NIH3T3Cre.l, que continha aproximadamente 10 cópias do plasmídeo pMCl-Cre, para efeitos de análise complementar. Infectámos o clone NIH3T3Cre.l com o vírus MloxPL. Os clones foram isolados por diluição limitante. A estrutura do provírus resultante da infecção do retrovírus MloxPL e da recombinação induzida por Cre encontra-se ilustrada na figura 2a. A estrutura do vector integrado é uma LTR solitária (sLTR). Falta uma LTR e todas as sequências situadas entre as duas LTR nos provírus integrados (fig. 2a e c). A estrutura do ADN dos provírus MloxPL foi analisada por hibridação por "Southern blot" após a digestão pela endonuclease de restrição Bcl I do seu ADN celular, com o propósito de detectar a presença, ou a ausência, de LTR duplicadas na estrutura proviral. Tal como foi demonstrado na figura 2b, a análise dos 12 clones resultantes da infecção do NIH3T3Cre.l por MloxPL revelou a ausência em todos os clones da banda de 6 kpb indicadora da duplicação. 23

Para demonstrar a ausência da 5'LTR no provírus, foi realizada uma restrição do ADN por EcoR V. A hibridação por "Southern blot" do fADN de NIH3T3Cre.1.MloxPL, limitado pela endonuclease EcoR V ao utilizar-se uma sonda LacZ radiomarcada (fig. 2a e c), revela a presença de uma banda de 2,1 kpb e de uma banda com dimensão aleatória. A ausência de uma banda de 3,9 kpb demonstra a ausência de uma 5'LTR.

Exemplo 4 - Construção do vector retroviral pMcreloxPL e transfecção de linhagens celulares

a) Construção do plasmídeo pMcreloxPL A estrutura do retrovirus utilizado no presente exemplo encontra-se ilustrada na fig. 3a. 0 pMCreloxPL resulta da inserção do gene cre de 1.3 kpb fundido com uma localização nuclear do antigeno maior T do vírus símio 40, entre as duas LTR do plasmídeo pMloxPL. O gene cre está sob o controlo transcripcional do promotor do gene da timidina-cinase (tk) do vírus herpes simplex flanqueado por uma duplicação do activador à distância do vírus do polioma mutante PYF441 com adaptadores de ligação ao nível do sítio Pstl de pMloxPL. A sequência Cre encontra-se na mesma orientação do genoma virai. O plasmídeo pMcreloxPL foi depositado no CNCM em 13 de Junho de 1995 com ο n° I -1599.

b) Transfecção de linhagens celulares com o Plasmídeo PMcreloxPL

Foram geradas linhagens celulares produtoras do vírus, ao co-transfectar-se o plasmídeo pMCreloxPL com o plasmídeo de selecção pUSVneo na linhagem celular de encapsidação ψ2. Depois da selecção das células ψ2 transfectadas num meio contendo o G418, foram seleccionados clones individuais para a produção de um retrovirus exprimindo LacZ. Um clone 24 produziu um vírus infeccioso; este clone foi denominado \|/2-MCreloxPL . 1. Em \|/2-MCreloxPL . 1, o plasmídeo pMCreloxPL foi integrado a uma única cópia no genoma celular hospedeiro (dados não ilustrados). As linhagens celulares produtoras de \|/2-MCreloxPL. 1 produzem 1 χ 104 vírus infecciosos por mililitro; a presença do gene LacZ é detectada por PCR (Quadro 1). A titulação das unidades que formam uma colónia azul por mililitro (BCFU/ml) do sobrenadante virai de \|/2-MCreloxPL. 1 é de 3 BCFU/ml, o que corresponde, como previsto, a uma diminuição aproximada de 104 relativamente à titulação por PCR. A produção de ψ2-MCreloxPL apresentava uma eficácia inferior quando comparada com a produção de \|/2-MloxPL, tendo sido recuperado um único clone produtor depois de várias experiências de co-transfecção. Este clone integrava uma única cópia da construção plasmídica virai. Deduzimos daí que as células que integram mais do que uma cópia do plasmídeo não podem ser recuperadas, em vvirtude da presença da actividade de recombinase que modifica os transgenes integrados.

c) Estrutura proviral de MCreloxPL 0 isolamento de células NIH 3T3 infectadas com o McreloxPL foi realizado por diluição limitante, depois da infecção a uma multiplicidade de 0,5 partículas virais por célula. A estrutura do provírus resultante da infecção do retrovírus pMCreloxPL encontra-se ilustrada na figura 3b. Nesta figura, α indica o fragmento de dimensão aleatória do braço esquerdo. "Southern A estrutura do ADN dos provírus integrados foi analisada por hibridação por "Southern blot" em 6 clones NIH NIH3T3MCreloxPL independentes. A análise por 25 blot" do ADN proviral limitado pelas endonucleases Bcl I e detectado com uma sonda Lacz radiomarcada gerou dois fragmentos de dimensões variáveis, não tendo estes clones gerado nenhuma banda de 7,5 kpb suplementar (figura 3c). A ausência deste fragmento suplementar de 7,5 kpb revela a presença de uma única LTR contendo PhleoLacZ. Para determinar ainda que a estrutura proviral corresponde a uma única LTR, foi levada a cabo uma análise suplementar. Para demonstrar definitivamente a ausência de uma 5'LTR no provirus, foi realizada uma restrição do ADN celular por EcoR V. A hibridação por "Southern blot" do ADN de NIH3T3MCreloxPL, limitado pela endonuclease EcoR V ao utilizar-se uma sonda LacZ radiomarcada (fig. 3d) , revela a presença de uma banda de 2,1 kpb e de uma banda com dimensão aleatória. A ausência de uma banda de 6 kpb demonstra a ausência de uma 5'LTR. Este "blot" foi então hibridado com uma sonda cre radiomarcada. A ausência de uma banda no ADN de NIH3T3MCreloxPL revela que o ADN proviral está desprovido do gene cre (fig. 3d).

Finalmente, para se determinar que a estrutura da LTR restante não havia sofrido rearranjado, o ADN de NIH3T3MCre-loxPL foi limitado pela endonuclease Κρη I e sondado com um ADN de LacZ radiomarcado. Foi observado um fragmento de 4,3 kpb em todos os casos, revelando que a LTR PhleoLacZ tinha a dimensão prevista (fig. 3e) . Como consequência, todos os clones isolados continham um provirus integrado com uma única LTR não reordenada. QUADRO 1. Títulos das linhagens celulares ψ2 MloxPL e MCreloxPL-

Clone IP/ml° (10Ú BCF/mlc Relaçaoa (10 *) \|/2-MloxPL. 1 2,5 3 1,2 \|/2-MloxPL. 2 5 6 1,2 \|/2-MCreloxPL. 1 1 3 3 26 clone resistente ao G418 resultante do clone NIH3T3MloxPL. 1 co-transfectado com pMCl-Cre e pUSVneo. b Índica a presença da sequência pMCl-Cre. ( + ) Indica a presença de um fragmento Xho 1 de 1,9 kpb correcto resultante de pMCl-Cre detectado com uma sonda cre radiomarcada em 32P (*) Indica a presença de um fragmento Xho I que se hibridiza com a sonda cre radiomarcada em 32P, mas com uma dimensão incorrecta. (-) Indica a ausência do plasmideo pMCl-Cre. c Resultados da recombinação loxP por intermédio de Cre detectada por análise por "Southern blot" . QUADRO 2, Recombinação loxP por intermédio de uma transfecçao pMCl-Cre. Quantidade de clones resistentes ao G418a Presença de pMCl-Creb Recombinação loxPc 3 + + 1 - + 1 * + 4 + - 16 - - a Foram transfectadas células ψ2 respectivamente, tanto com pMloxPL+pUSVneo, como com pMCreloxPL+pUSVneo, os clones resistentes ao G418 foram seleccionados num meio contendo o G418. Os stocks de vírus foram preparados, incubando-se 8 ml de meio com 5 χ 106 células de cada clone resistente ao G418, 5 χ 104 células NIH 3T3 foram submetidas a diversas diluições de vírus durante 8 horas e em seguida clonadas por diluição limitante ou testadas quanto à sua actividade de -galactosidase por coloração por X-gal. b Os títulos foram calculados pela relação entre os clones infectados isolados após a clonagem e detectados por PCR (IP: partícula infecciosa) e os clones não infectados (PCR+/PCR-)/1 χ 105) . BCFU é o acrónimo de "blue colony forming unit" (unidade formadora de colónia azul) . As BCFU são infecções que terminam em armadilhas do gene que activa o gene PhleoLacZ detectado por coloração por X-gal. d A relação é a quantidade de BCFU por clone infectado.

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Lisboa, 27 de Novembro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido, compreendendo (a) a sequência LTR3' ou LTR5' de um retroelemento natural ou sintético; e (b) uma sequência de inserção que compreende uma sequência de nucleótidos de interesse, bem como, para um determinado sistema de recombinação, uma única sequência de reconhecimento de uma recombinase, estando a referida sequência de inserção introduzida na referida LTR'3 ou na referida LTR5', de forma a permitir a inserção, com a intervenção de um vector retroviral, da referida sequência de interesse no genoma de uma célula hospedeira, sem que sejam inseridas sequências provirais que já não são necessárias depois da integração da sequência de interesse no genoma da célula hospedeira.

2. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de inserção estar incorporada na região U3 da LTR3', U5 da LTR5' ou R da LTR.

3. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 2, caracterizado por o retroelemento ser uma sequência de ADN retroviral.

4. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a referida sequência de reconhecimento que pode ser reconhecida por uma recombinase estar situada a montante da referida sequência de nucleótidos de interesse. 2

5. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a referida sequência de reconhecimento que pode ser reconhecida por uma recombinase estar situada a jusante da referida sequência de nucleótidos de interesse.

6. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de reconhecimento compreender o sitio de reconhecimento LoxP.

7. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de nucleótidos de interesse compreender uma sequência que codifica para uma proteína ou um ARN de interesse, principalmente um ARN antissentido ou uma sequência ribozima.

8. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de nucleótidos de interesse compreender ainda elementos de regulação.

9. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma sequência de nucleótidos que codifica para uma recombinase susceptível de reconhecer a referida sequência de reconhecimento.

10. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referida sequência de nucleótidos que codifica para uma recombinase estar situada entre as regiões LTR5' e LTR3' do referido vector. 3

11. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a sequência de nucleótidos que codifica para uma recombinase codificar para a proteína Cre.

12. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 11, contido no plasmídeo depositado em 13 de Junho de 1995 no CNCM sob o número 1-1599.

13. Vector retroviral, caracterizado por compreender um polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores.

14. Vector retroviral de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido vector ser um provírus de leucemia murina de Moloney defectivo, compreendendo a referida sequência de reconhecimento na sua reqião U3 da LTR3', U5 da LTR5' ou R.

15. Hospedeiro celular tendo integrado no seu genoma uma estrutura proviral que compreende uma única sequência LTR de um vector retroviral, de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 14, compreendendo a referida sequência LTR uma cópia única de uma sequência de nucleótidos de interesse.

16. Hospedeiro celular de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se tratar de uma célula eucariótica, e por a estrutura proviral ser essencialmente livre de sequências PBS, do sinal de encapsulação e da dimerização e do PPT.

17. Método para a introdução de um gene numa célula hospedeira em cultura, caracterizado por o referido método compreender a infecção da referida célula hospedeira pelo 4 vector retroviral de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 14.

18. Método de expressão de uma molécula codificada por uma sequência de interesse numa célula hospedeira em cultura, caracterizado por o referido método compreender: a infecção da referida célula hospedeira por um vector retroviral de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 14, compreendendo a referida sequência os nucleótidos de interesse; o desenvolvimento da referida célula hospedeira em condições que permitam a expressão da referida sequência de nucleótidos de interesse; e a obtenção da molécula desejada.

19. Utilização de um polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, para a fabricação de uma composição que permita a produção, por células hospedeiras, de proteínas ou de ARNs codificados por uma sequência de nucleótidos de interesse.

20. Utilização de um vector retroviral de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 14, para a fabricação de uma composição que permita a produção por células hospedeiras, de proteínas codificadas por uma sequência de nucleótidos de interesse.

21. Polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, para a utilização no tratamento médico de um paciente. 5

22 Vector retroviral de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 14, para a utilização no tratamento médico de um paciente.

23. Composição farmacêutica compreendendo um vector retroviral de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 14 em combinação com um excipiente farmacêutico aceitável.

24. Composição farmacêutica constituída por células hospedeiras de acordo com as reivindicações 15 ou 16. Lisboa, 27 DE Novembro de 2006