PT85229B - Processo para a preparacao de variantes da alfa-antitripsina humana glicosilada e vectores virais de expressao da alfa1-at - Google Patents
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Description
A alfa^antitripsina (alfa^-AT) é o inibidor de protea se mais abundante no plasma.
A inibição desta protease serina desempenha um papel importante no controlo da elastase neutrôfila humana e do factor Xla. 0 centro reagente da alfa1~AT é formado pelos dois resíduos amino-âcidos denominados P1 e P'^· A natureza do resíduo P^ determina a especificidade da inibição pela alfa1-AT e a substituição da metionina P.^ natural pela arginina (alfa^-AT Met3^---Arg3^) produz um inibidor que tem uma afinidade muito aumentada para a trombina com uma diminuição concomitante da afinidade para a elastase neutrôfila humana.
variante alfa^-AT (Met3^--->Arg3^3) é também capaz de inibir eficazmente enzimas de fase de contacto da proteôlise do plasma, isto em contraste com a proteína nativa. A inibição da calicreína e do factor Xla é aumentada entre 20 000 e 70 000 vezes, respectivamente, pela presença da arginina na posição 358. 0 factor XII actividade (Xllf) é também inibido de maneira eficaz, e a alfa^-AT nativa não tem nenhuma actividade em relação a esta protease . Como as proteases do sistema de fase de contacto são activadas nas .272
Ref: D 11683/333529
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doenças como os choques sépticos, os ataques de angio-edema hereditário e as síndromas de detrease respiratória dos adul
O C O Q r O tos, a administração da alfa^-ATÍMet 9--> Arg J ), pode ser muito eficaz no controlo destas doenças.
A alfa^-AT que se encontra no plasma é glicolisada. Ê desejável, portanto, que a alfa^-AT (Met358---> Arg358) produzida para a utilização in vivo seja também modificada desta maneira.
Analogamente, visto que a requerente demonstrou que há interesse em utilizar outros variantes da alfa^AT, tem também interesse poder preparar estes variantes sob forma glicolisada .
Trata-se em particular dos variantes truncados:
5 (delta Glu ------>Gli ) alfa^-AT que serão designados por /delta 1----->5/ alfa^AT assim como dos variantes de alfa^AT ou de alfa^-AT transformados na posição 357 e/ou 358 designados por /AA357 alfa^-AT /ÀA358/ alfa-j-AT ou/ÃA357 AA35?7 alfa^-AT.
358
Em particular, além dos variantes Arg , têm interesse os variantes seguintes, conforme é demonstrado na patente W0 86 00337:
(Gli358), (Ala358),(Ile358), (Vai358), (Leu358) e (Phe358) que também podem ser truncados. Além disso, o variante /Lis3587 alfa^-AT apresenta um determinado interesse como inibidor especifico da plasmina.
357
Finalmente, os variantes na posição 357 como Ala , . r 357 também têm interesse, em particular o variante /Ala ' , Arg358/ que têm propriedades melhoradas em comparação com o q rO variante Arg 9 descrito anteriormente .
Estes variantes são preparados, de acordo com o presen te invento, por meio de cultura de células eucariotas, em .272
Ref: D 11683/333529
-2 JULJ997 /
I particular células de mamíferos que compreendem um bloco de expressão do gene correspondente ao variante desejado.
Em particular, este bloco de expressão está situado sobre vector virai, particularmente um poxivírus como a vacina. Trata-se de um vector virai de expressão de um variante da alfa^-AT, escolhido de entre: /AA^T/ alfa^-AT, /ΑΑ^θ/ alfa^-AT /ÁA^^f ΑΑ^θ/ alfa^-AT e os variantes correspondentes que têm a forma truncada /delta 1 ----> alfa^-AT assim como /delta 1 ----=>5/ alfa^-AT, caracterizado por ser constituído por um vírus híbrido da vacina que compreende uma sequência de ADN que codifica para o referido variante da alfa -AT, inserido numa parte não essencial do genoma do vírus e sob o controlo de uma sequência de expressão eficaz na vacina.
Este tipo de construção já foi descrito pela requerente, designadamente nas patentes WO 85/04810 e W0 85/05376. A expressão e modificação pós-traducional correcta de diferentes proteínas estranhas, nas células de mamíferos, utilizando o vírus da vacina, foram descritos diversas vezes.
Para se conseguir isto, o gene correspondente ao variante derivado da alfa^-AT é inserido preferivelmente numa parte do genoma não essencial do vírus da vacina e de maneira ainda mais preferível num gene marcador como o gene TK.
A inserção neste gene suprime a sua expressão e as células transfectadas pelo vírus correspondente podem ser seleccionadas, conforme será descrito mais adiante.
bloco de expressão compreenderá, preferivelmente, uma sequência que promove a expressão do gene em questão nas células, depois de transfecção, e em particular, o gene que codifica para o variante da alfa^-AT ficará na dependência de um promotor da vacina como o promotor do gene 7,5K que será designado por P 7,5K.
Células de mamíferos, em particular células BHK infectadas pelo vector vírus híbrido atrás descrito, produzirão variantes de alfa^-AT, se forem cultivadas em meios de
58 .272
Ref: D 11683/333529
I
I cultura apropriados.
Os vectores em questão são, de maneira geral, obtidos por meio de co-transfecção de um vírus vacina selvagem e de um plasmídeo que tem os elementos atrás indicados, e o vírus híbrido é constituído in vivo, por recombinação. Esta tecnologia está descrita nas patentes citadas anteriormente .
presente invento diz também respeito às variantes da alfa^-AT, glicosilada assim obtida, podendo estes produtos ser separados do meio de cultura por meio de processos conhecidos na tecnologia das proteínas.
Trata-se, em particular, dos variantes /ÁA357/ alfa -AT
AA358/ alfa -AT [ AA357 AA358/ alfa^-AT e dos variantes /delta 1----> 5/ alfa^-AT correspondente assim como dos variantes /delta 1---->5/ alfa^-AT, variantes que são glicosilados e não têm resíduo Met na extremidade 3' .
Entre estes variantes, é necessário citar os variantes: /Ala357 Arg35^/ alfa^-AT glicosilado /delta 1 5/ /Arg3^^ alfa^-AT glicosilado /delta 1 §7 /Àla357 Arg35^/ alfa^AT glicosilado e /Arg3^8/ alfa^-AT glicosilado.
Estes variantes da alfa-pAT serão -Citeis como medicamentos, em particular para a substituição da alfa^-AT obtida por meio de extracção a partir do plasma, e alguns deles como inibidores da calidrelna.
Os exemplos que se seguem destinam-se mais particularmente a evidenciar as construções utilizáveis no âmbito do presente invento.
EXEMPLO 1:
58 .272
Ref: D 11683/333529
CONSTRUÇÃO DO ADN DO pTG1952
O plasmideo pTG1952 tem a estrutura seguinte:
Na extremidade 5' do cADN da alfa^-AT encontra-se a sequência sinal (ss), uma sequência que é responsável pela exportação da proteína para o exterior da célula. Durante a maturação da proteína, esta sequência é clivada para produzir a proteína nativa. Esta construção contém também o codão arginina no amino-âcido 358. A clivagem deste plasmideo por BglII produz um fragmento de 1,3 Kb que contém o conjunto do cADN da alfa^-AT e a sequência sinal.
EXEMPLO 2:
PREPARAÇAO DO pTG1954 ( figura 1) plasmideo pTG186 contém o gene que codifica para a proteína da timidina quinase do virus da vacina. Um fragmento de ADN de pequena dimensão que contém o promotor 7,5 K do vírus da vacina (VP) e um polylinker que tem diferentes locais de restrição, entre os quais BamHI, foram colocados no gene da timidina quinase conforme é indicado adiante .
fragmento 1,3 Kb BglII de pTG1952 ê inserido no local BamHI do pTG186 para produzir o plasmideo pTG1954.
A orientação do fragmento BglII inserido é estudado utilizando o local BamHI no cADN da alfa-pAT e permite que o terminal amino-âcido desta sequência de cADN esteja próximo do promotor virai VP.
EXEMPLO 3:
TRANSFECÇAO DO PTG1954 NO VÍRUS DA VACINA
Efectuaram-se a produção e selecção dos virus de vacina recombinantes TK“ utilizando o pTG1954 por meio das téc
.272
Ref: D 11683/333529
nicas conhecidas que estão descritas, em particular, nas patentes PCT FR 85/00096 e W0 85/05376. Escolhem-se 8 placas e utilizam-se para infectar mono-camadas de células BHK em cultura de tecidos orgânicos.
ADN é preparado a partir das células infectadas com recombinantes do vírus da vacina TK”por meio de técnicas conhecidas . Depois de restrição com HindIII, o ADN é submetido à electoforese sobre um gel de agarose a 0,8%. 0 ADN é transferido sobre nitrocelulose e o gene da alfa.-AT é detectado com nucleótidos específicos fosfosilados no p.
Os 8 vírus recombinantes TKmostraram ter integrado o cADN da alfa^-AT no gene TK. Escolhe-se um destes para estudo mais amplo.
EXEMPLO 4:
EXPERIÊNCIA DE UM MEIO DEPOIS DE INFECÇÃO DAS CÉLULAS BHK COM
UM RECOMBINANTE VACINA QUE CONTÊM pTG1954
Inibição da trombina
Depois de incubação a 379C durante 24 horas, o meio é centrifugado para eliminar as células e os detritos celulares e experimentam-se alíquotas quanto à sua capacidade para inibir a trombina.
A experiênciaefectua-se em tinas de 1 ml numa soluçãc que contém 150 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8,0 e 0,1% de PEG ftam pão TB). A trombina (240 mU) é incubada num tampão TB com diferentes quantidades de meio, durante 20 minutos à temperatura ambiente. A quantidade de actividade trombínica que resta, é medida por meio da utilização de 100 μΐ de substrato (Cromozima TH Boehrimser Mannheim; 100 nanomoles) e medindo a modificação da densidade éptica a 410 nanómetros, após 4 minutos . A curva obtida a partir de uma experiência típica está indicada na figura 2A. Obtêm-se 50% de inibição com esta quar tidade de trombina (240 mU) com 150 μΐ de meio. A curva 0—0 representa o vírus recombinante e X---X o vírus selvagem.
.272
Ref: D 11683/333529
Inibição da calicreína
Efectua-se a inibição da calicreína de maneira análoga. A calicreína (4 mu) é incubada com diferentes quantidades de meio, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, em tinas que contêm 90 |il de tampão calicreína (0,1 M fosfato de sódio (pH 6,5); 0,15 M Nacl) . As experiências da actividade residual de calidreína efectuam-se por meio da adição de substrato (225 nanomoles) e as modificações na densidade óptica a 410 nanómetros são medidas após 4 minutos. A curva obtida a partir de uma experiência típica está representada na figura 2B . Obtêm-se 50% de inibição com esta quantidade de calicreina (4 mu) neste caso, com 120 p.1 de meio.
EXEMPLO 5:
IMUNOPRECIPITAÇAO DE ALFA,-AT (ARGININA VARIANTE) MARCADA NO
- -----------z-------—±-PRODUZIDO POR CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Infectam-se mono-camadas de células BHK com 0,2 pfji de vírus vacina recombinante e em seguida incubam-se durante 6 horas a 379C em 1 ml de meio que contém 100 pCi de metionina S . Efectua-se um controlo com um vírus vacina selvagem. 0 meio é colhido como precedentemente e submetido a um desafio com anticorpos anti-alfa^antitripsina como segue. A 1 ml de meio junta-se tampão RIPA (1MKC1), 2% Triton X-100, 100 mM Tris pH 8,0) e 5 pl de anticorpos alfa-antitripsina (Dako Immunoglobulins, Dinamarca) e deixa-se repousar a mistura durante 2 horas a 25 9 C.
Adicionam-se então 50 μΐ de tampão RIPA contendo 8 mg de proteína A sefarose previamente equilibrada e deixa-se a mistura incubar durante 1 hora a 259C, possivelmente com agi tação. A sefarose proteína A é então colhida por meio de cen trifugação e o depósito é lavado 5 vezes com 0,5 M KC1, 10 nM Tris-ECl pH 8,8 0,5% Triton X-100 e 2 vezes com 2 x 10 mM .272
Ref: D 11683/333529
- 2 JULJooí
Tris KC1 pH 8,8. Os depósitos são dissolvidos em 100 ju.1 de tampão Laemmli e colocam-se 20 pl num gel de poliacril amida a 10% que é depois autoradiografado após fluorografia.
Segundo um perfil de gel típico (Figura 3) e em comparação com uma imunoprecipitação que utiliza a antitripsina-alfa^ marcada metionina, obtida a partir de um extracto bacteriano, pode observar-se que se precipitou especificamente uma proteína a partir do meio de células infectadas com os vírus vacina recombinantes. Esta proteína não estâ presente nos extractos celulares a partir de vírus da vacina selvagem. No entanto, esta proteína, reconhecida pelos anticorpos anti-alfa^-AT, é maior que a encontrada nos extractos celulares bacterianos, o que constitui uma indicação de que a alfa^-AT variante arginina produzida nas células de mamíferos foi glicosilada.
EXEMPLO 6:
B
Utilizando em vez do plasmideo pTG1952, os plasmideos descritos na patente W0 86 00337, obtêm-se os variantes correspondentes glicosilados.
Por exemplo, o pTG1981 que é idêntico ao pTG1954, apenas com a diferença de o gene introduzido em / Ala0 - Arg 3587 alfa^-AT ter sido construído da mesma maneira.
Os resultados dos ensaios de iiibíção da trombina e da calicreína para o sobrenadante, foram representados na figura 4. Conforme foi abservado para a/Ala - Arg J alfa^ -AT produzida pelo E. Coli, o produto segregado a partir de células BHK é activado sobre calicreína, mas tem pouca ou nenhuma actividade inibidora relativamente à trombina.
depósito do primeiro pedido para o invento acima des crito foi efectuado em França, em 2 de Julho de 1986, sob o n$ . 86 09608 .
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Ref: D 11683/333529
Claims (1)
15 . - Vector virai de expressão da alfa^AT ou de uma variante da alfa^-AT escolhido de entre:
/ AA 3577 alfa^-AT, AA3587 alfa^-AT /ÃA357 , AA35?/ alfa^-AT e as variantes correspondentes da forma truncada /delta 1----> 57 alfa^-AT assim como /delta 1---->7 alfa^
AT, caracterizado por ser constituído por um virus híbrido da vacina que compreende uma sequência de ADN que codifica para a referida variante da alfa^-AT inserida numa parte não essen ciai do genoma do vírus e sob o controlo de uma sequência de expressão eficaz na vacina.
25 . - Vector virai de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de ADN que codifica para a referida variante ser precedida, pelo menos, por uma parte da sequência sinal.
35. - Vector virai de expressão de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a sequência de ADN ser inserida no gene TK.
45 . - Vector virai de expressão de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por a sequência de expressão compreender um promotor da vacina.
55 . - Vector virai de expressão de acordo com a reivindi cação 4, caracterizado por o promotor ser o promotor do gene 7,5K.
65 . - Células de mamíferos caracterizadas por serem transfectadas por um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 5 ·
75. - células de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas por serem células BHK.
85 . - Processo para a preparação de variantes da alfa^-AT, caracterizado por se cultivarem células transfectadas de
- 9 58 .272
Ref: D 11683/333529
1 acordo com uma das reivindicações 6 e 7 num meio apropriado e se recuperar a variante da alfa^-AT obtida.
95. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se preparar as variantes da alfa^-AT 5 f J alfa^-AT [ AA3587 alfa -AT [AA357 AA3587 alfa-j-AT e as variantes de /~delta 1
---->7 alfa^AT correspondentes na forma glicosilada.
10^ . - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por as variantes serem [ Ala 3^7 Arg3^8] alfa^AT glicosilada
C delta 1---->5 ./ /~ Arg358/ alfa^AT glicosilada /delta 1----^5 J /Àla357 Arg358/ alfa^
-AT glicosilada, + /Arg3^^/ - alfa^-AT glicosilada.
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