PT85754B - Processo para a preparacao de vectores virais com base em papovavirus linfotropo (pvl) e de expressao destes vectores - Google Patents
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Description
O papovavírus linfotropo só se propaga en linhas de células derivadas de linfomas B, por exemplo, a linha de células B BJA, originária dum linfoma B maligno humano (Menezes et al. Biomedicine 22 (1975) 276-284) ou em escala muito reduzida em linhas de células linfoblastóides B (Linfó— eitos B, que foram tornados imortais pelo vírus de Epstein Barr» Pawlita et al., Virology 143 (198?) 196-211, e a literatura mer cionada nesta publicação).
Esta especifidade em relaÇao aos tecidos é uma qualidade das partículas víricas, uma vez que o ADN virai após transfecçao também se expressa em células nao permissivas. Daqui resulta deste modo a possibilidade de utilizar este vírus altamente específico ou um factor com base neste vírus para introduzir em células B malignas sequências de ADN que codi fiquem para toxinas ou para outras substâncias activas (Mechanics of B Cell Neoplasia 1985, Editiones Roche, Basileia,
- págs. 274-278).
âmbito da presente invenção está defini^ do nas reivindicações. Na presente memória descritiva apresen tam-se mais em pormenor informações adicionais.
papovavírus linfotropo (PLV ou LPV) encontra-se depositado na American Type Culture Collection sob o nômero ATCC VR 961.
A sequencia integral de ADN dum clone de LPV (LPV K38) encontra-se reproduzida em Pawlita et al., op. cit.. 0 plasmídeo referido naquela publicação pLPV K38 contêm o genoma integral aberto no sítio de corte singular BamHI e ligado no sítio BamHI do plasmídeo pBR322. Este plasmídeo ê adequado como material de partida para a preparaçao dos vecto^ res e das células hospedeiras de acordo com o processo da pre sente invenção.
Naturalmente, ê também possivel sintetizar os segmentos de ADN de LPV utilizados de acordo com o processo da presente invenção a partir da sequencia conhecida do ADN do LPV de acordo com técnicas conhecidas» eventualmente por meio 1 do uso de segmentos homólogos de outros vírus (Pawlita et al. , op. cit*).
As figuras apresentam sob a forma dum esquema de fluxo a preparaçao de vectores e de segmentos de ADN de LPV com os quais se transfectaram células eucarióticas. As figuras não estão desenhadas à escala, especialmente no domíni o, do adaptador de ligaçao polimérico a escala está dilatada. 0 ADN do LPV está salientado por meio de linhas mais grossas.
A figura 1 e a respectiva continuação, figura la, apresentam a síntese do plasmídeo pL30, o qual contêm a região gênica precoce do LPV sob regulaçao dum promotor es* tranho bem como um sistema de resistência à neomicina como mar
cador. Este plasmídeo é apropriado para a transfecção de uma linha de células permissiva, obtendo-se com alto rendimento células que expressam o antigene T do LPV.
A figura 2 apresenta a síntese do plasmidja o pL9, que apés corte com HincII dá origem a um fragmento de cerca de 4,9 kb> o qual pode ser acondicionado em partículas
M virais em virtude da sua dimensão· Se se introduz este fragmej to de ADN nas células LPV-T+, formam-se partículas víricas infecciosas mas deficientes no que respeita à replicaçao.
A
A figura 3 θ a respectiva continuação, fi gura 3a, apresentam a síntese de vectores que podem expressar ADN estranho. Para este fim sintetiza-se em primeiro lugar o vector pL61, que contém a origem de replicaçao do ADN e a região tardia do gene de LPV. Por substituição da fracçao pUC19 pelo gene pretendido obtêm-se o vector LPV X, o qual provoca nas células da presente invenção, que exprimem a região gêni ca precoce do LPV de forma estável, a replicaçao e o acondiciç» namento do gene estranho X em partículas víricas infecciosas deficientes.
Para a construção do vector LPV utilizou-se o principio do ’'early replacement vector” descrito por Gluzman, Cell 23 (1981) 175-182 (sistema SV4O-COS). A região gênica precoce codifica no genoma do LPV para uma proteína (antigene T) que ê necessária para a replicaçao do ADN virai e para a expressão das regiões “tardias” que codificam para as proteínas do capsideo dos vírus VP1, VP2, e VP3. As particuias LPV deficientes na replicaçao utilizadas como vectores no processo da presente invenção contêm no respectivo genoma em vez da região gênica precoce sequências de ADN estranho. Durante a síntese destas partículas deficientes ê necessária a presença do antigene LPV-T nas células sintetizadoras, nomea damente nas células permissivas ao LPV obtidas de acordo com a presente invenção que expressam de modo estável a região gênica precoce do LPV.
- 3 0 processo descrito em seguida» que ê van tajoso para a preparaçao de linhas de células que expressam de forma estável o antigene LPV-T bem como para a preparação de partículas de LPV infecciosas deficientes no que respeita a replicaçao que transportam e provocam a expressão de ADN estranho em células susceptíveis ao LPV de forma efeiciente e especifica» pode evidentemente ser levado a efeito por um especialista na matéria também sob a forma alterada, por exem pio mediante a utilização de outros fragmentos do genoma, de outras linhas de células ou de outros fragmentos de ADN estra nho.
Como linha de células de linfoma B humano susceptíveis ao LPV usou-se a linha de células já estabelecida BJÀ-B (Menezes et al., op. cit.), uma vez que esta pode ser transfectada de forma efectiva. Esta linha de células pode ser obtida da European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury (GB), onde foi depositada de acordo com as condições do Tratado de Budapeste sob o número 86081105·
Uma vez que no plasmídeo de partida pLPV K38 o sitio de corte por restrição BamHI está localizado na região genica ”precoce”, torna—se necessário em primeiro lugar obter ADN virai cuja região precoce que codifica para o antigene LPV-T não esteja interrompida. Para esse fim, cortou-se o ADN plasmldico de pLPV K38 com BamHI e ligou-se ao ADN do LPV para fechar em anel. Com este ADN ligado transfectaram-se células BJA-B e utilizou-se o LPV K38 sintetizado nesta cultji ra como vírus de inoculação para a preparaçao de quantidades maiores de ADN de LPV.
A partir do ÀDN de LPV K.38 clonou-se o fra gmento de restrição Xmal de 4695 pb de dimensão no sítio de corte por restrição Xmal do vector bacteriano pUC19· θ plasmí deo obtido pL3 contém a região gênica precoce integral e a fracção 3’ terminal da região gênica tardia, a qual, no entan to, nao pode ser expressa por causa da perda da região tardia
do promotor e da sequência 5* terminal. Para supressão da ori gem da replicaçao do ADN do LPV, substitui-se a região de regu laçao LPV nao codificante (nucleátidos 1 a 528) por um elemen to de amplificaçao do promotor da região ”immediate early” do citomegalovlrus humano (HCMV) (Pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 173 177)· Para esse fim, digere-se o plasmldeo pL3 com as enzimas de restrição Ncol e Sall e preen chem-se as extremidades 5’ salientes por meio do fragmento de Klenow da polimerase de ADN I de E. coli. À partir do ADN do HCMV (fragmento m PstI) isola-se o fragmento de restrição maior AvalI-HincII (nucleétidos -598 até +52) e depois de preenchimento das extremidades 5’salientes clona-se no fragmento já preparado do plasmldeo pL3» obtendo-se deste modo o plasmldeo «φ ** pL12. A orientação correcta do elemento de amplificaçao do pro motor de HCMV em relação com a região gênica precoce do LPV resulta por um lado da reconstituição do sitio de corte Ncol-Avall e por outr® lado por meio de digestão com Bgll com base nos dois sítios de corte para estas enzimas de restrição no ADN do plasmldeo pUC19 e nos sítios de corte Bgll no fragmento de HCMV.
plasmldeo pSV2Neo (Southern e Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982)» 327-341) contêm o gene procariético Neo em conjunto com três elementos eucariéticos de regulaçao w» A .
nomeadamente o promotor de amplificaçao precoce, uma sequencia de junção de ARN e um sinal de poliadenilaçao do genoma do SV— 4o. Às células eucariéticas nas quais este gene se expre_s sa são resiètentes perante o antibiótico aminoglicosido tóxico análogo da neomicina G 418. Por digestão com Accl, preenchimen to das extremidades 5’ salientes e corte com EcoRI isola-se a partir de plasmldeo pSV2Neo o fragmento maior de 2867 pb de dimensão, o qual ê clonado no plasmldeo pL12 digerido com EcoR L e Smal. Deste modo obteA-se o plasmldeo pL3D.
plasmldeo pL30 é linearizado com EcoRI e com este ADN são transfectadas células BJÀ-B. Por selecçao com base na resistência perante G 418,identificam-se clones de
células Neor que se isolam por meio de subculturas. Por imuno fluorescência indirecta com um soro anti-LPV-T identificam-se as linhas de células que expressam o antigene LPV-T. As linhas BJA-B (Neo LPV-T ) assim obtidas sao cultivadas e um dessees clones (3IB3—K6) ê usado para as experiências que se seguem.
Para a preparaçao de partículas víricas deficientes, o genoma de LPV K38 ê clonado sobre o sítio de corte por restrição Bcll (nucleétido 3328) no sítio de corte de restrição BamHI do plasmídeo pSP64, obtendo—se deste modo o plasmídeo pL9· Por meio desta inserção do plasmídeo pSP64 ê assegurado através da inactivaçao da região LPV precoce que nenhum antigene T funcional será sintetizado pelo plasmídeo pL9· Uma transfecçao das células 31B3~K6 com o plasmídeo pL9 de 8,27 kb de dimensão sob forma circular fechada dá origem, 48 horas depois da treansfecçao a 0, 1% de células LPV-VP, prol porção que em seguida se reduz. Em células BJA-B transfectadas para comparaçao nao ê dectetável qualquer síntese de LPV-VP. Deste modo comprova-se que o antigene LPV-T presente nas cêlu las 31B3-K6 é funcional.
Uma vez que nao é possível acondicionar o plasmídeo pL9 em partículas de vírus LPV em consequência da respectiva dimensão, corta-se aquele plasmídeo com a endonucle ase de restrição HincII num fragmento de 3415 pb de dimensão* o qual contêm, juntamente com a sequência pSP64, ainda 370 pb da região gênica precoce do LPV (nucleôtidos 3328 até 3898) bem como um fragmento com a dimensão de 4912 pb, o qual compreende, juntamente com 12 pb da sequência de ADN do plasmídeo pSP64, a sequência de ADN do LPV de 4900 pb (nucleôtidos 3698 até 3327). 0 fragmento de dimensão 4912 contém, juntamente com a região de regulaçao nao codificante do LPV e com a origem da replicaçao do ADN do LPV, a região tardia do LPV e parte da região precoce do LPV, a qual porém nao possui já capacidade* de codificar para o antigene LPV-T.
Digere-se o ADN do plasmldeo pL9 com HincII e, com o produto resultante, provoca-se a transfecção de células 3IB3-K6. 48 horas depois da transfecção obtêm-se igualmente 0,1% de células LPV—VP+. Em contraste com o que se observara com as células obtidas com o plasmldeo pL9, a frajc çao das células LPV-VP* aumenta no decurso de seis estágios de incubaçao adicionais até mais de 5θ%» o que constitui uma indicaçao da produção de partículas vlricas de LPV infecciosas. Por tratamento das células BJA-B e 3IB3-K6 com sobrena dantes das culturas filtrados esterilmente, obtém-se 10% de células LPV-VP* 48 horas depois da inoculação das células 3IB3-K6, enquanto que as células BJA-B inoculadas dao resulta, do negativo mesmo depois de oito dias. Deste modo demonstra-se a existência de partículas de LPV infecciosas mas deficiW A* entes em relaçao a replicaçao.
capsldio do LPV pode albergar um genoma de dimensão até 5>3 kb. A região de regulação nao codificante e a região gênica tardia» as quais sao ambas necessárias no genoma para a preparaçao de partículas deficientes, abrangem em conjunto 2605 pb. Para a clonagem de ADN estranho resta por tanto apenas um máximo de 2,7 kb aproximadamente, no caso de todas as sequências da região gênica precoce tenham sido supri, mi das.
Apés introdução dum sitio de corte por res trição EcoRI na posição 2843 por mutagênese dirigida in vitro (GrundstrtJm et al. , Nucleic Acids Res. 13 (19^5) 33θ5·“3316) é possivel retirar por corte a região gênica LPV precoce inte— gral por dupla digestão com as endonucleases de restrição Ncol (posição 5268) e EcoRI.
Para esse fim, abre-se em primeiro lugar o vector pUC19 com BamHI e liga-se com o genoma de LPV K38 igualmente aberto com BamHI, obtendo-se deste modo o plasmldeo pPLV K38-I. A partir deste último plasmldeo elimina-se por cor te com Apal o fragmento de 240 pb e liga—se novamente o reèto
do plasmídeo, obtendo-se deste modo o plasmídeo pL24. A partir de pL24 isola—se o ADN virai por corte com BamHI e clona—se s_o bre o sitio de restrição BamHI no vector M13mpl8 (New England Biolabs), obtendo-se deste modo o vector mL5Ô. Hibrida-se o oligonucleétido sintético de 21 pb tcttcaattagaattccatgc, que contém a sequência do LPV desde o nucleétido 2832 até ao nucleétido 2852 com um resíduo de guanosina em vez de um resl. duo de citosina na posição 11 (LPV 2842), no ADN de cadeia simples dos fagos e utiliza-se como iniciador para a síntese da cadeia de ADN complementar com o fragmento de Klenow. Iden tificam-se clones M13 com sítios de corte por restrição (mL6o)l por meio de analise de restrição da forma replicativa. A par tir destes isola-se o fragmento de 2826 pb por corte com BamHI e EcoRI e integra-se por clonagem sobre o sitio de corte correspondente em pUC19, obtendo-se deste modo o plasmídeo pL61. Este plasmídeo contém, juntamente com a região gênica tardia ** completa de LPV e da origem da replicaçao do ADN do LPV, também o elemento de amplificaçao do promotor e a sequência de sinal de poliadenilaçao da região génica precoce do LPV, de tal modo que sé devem ser integradas por clonagem as sequêncjL as de codificação dum gene estranho X no plasmídeo aberto por meio de dupla digestão com as endonucleases de restrição Ncol e BamHI, para que se obtenha um gene eucariótico funcional que seja possivel expressar (plasmídeo pLX).
Como genes de ensaio a serem introduzidos são apropriados neste caso especialmente aquelas sequências que codificam para uma enzima que seja facilmente mensurável e quantificável» como fracções da —galactosidase ou a cloraii fenicol-acetil-transferase. Apés dupla digestão do plasmídeo pLX com as endonucleases de restrição EcoRI e BamHI seguida de transfecção em células 3íB3—K6 formam-se partículas vlricas deficientes LPV X, com as quais se infectam linhas de células susceptxveis ao LPV tais como as linhas BJA—B ou Namalwa. A expressão do ADN estranho pode ser detectada então numa reacção enzimática em extractos proteicos das células infectadas.
Também se podem utilizar como outros genes de ensaio apropria dos sequências de ADN que codificam para antigenes bem caracte rizados, como o antigene superficial da hepatite B (HBs-Àg) e ** ** cuja expressão seja facilmente detectavel por reacçoes com anticorpos.
A utilização de acordo com a presente in— vençao do alto grau de especificidade em relaçao a tecidos p<j de ter lugar por meio de se ter um gene estranho introduzido que codifica para um polopeptideo que é táxico para a célula hospedeira ou que tem actividade antitumoral. Deste modo pode, por exemplo, usar-se o peptídeo A da toxina da difteria para matar de modo especifico as células de linfoma permissivas ao LPV. Uma outra possibilidade está na expressão de ÀRN de sentido oposto contra oncogenes activados. Também se podem conse guir efeitos antitumorais por meio da expressão de antigenes ligados a membranas contra os quais apresentam boa imunidade.
Também se pode prever a utilização dos sistemas de vectores obtidos de acordo com o processo da pre <N> M sente invenção para a imunização de pacientes nao afectados por tumores, uma vez que presumivelmente determinadas fases de diferenciação das células B normais também sao susceptíveis de serem infectadas por LPV. A expressão de novos antigenes codjL ficados pelo ADN estranho como proteínas de membranas, por exemplo HBsAg, pode ser útil para esse fim para induzir imuni dade especifica em relaçao a um antigene» especialmente por intermédio das células. Uma outra possibilidade de utilização da invenção ê constituída pela eliminação de tecido saudável, por exemplo relacionada com uma imunossupressao.
A presente invenção foi elucidada especial^ mente no que se refere ao LPV e à respectiva extraordinária especificidade em relação a tecidos. Ê, no entanto, conhecido que existem outros vírus humanos que também presentam especi-* ficidade em relaçao a tecidos, como sejam, por exemplo, os dois retrovírus humanos HTLV I e LAV/HTLV III, os quais atacam
de modo altamente preferencial as células da linha dos linfó eitos T. 0 vírus do papiloma humano (HPV) foi até agora isola, do exclusivamente a partir de células epiteliais da epiderme ou de mucosas. 0 vírus de Epstein-Barr (EBV), um vrus de he.r pes humano, sé foi até agora detectado nos linfécitos B e no epitélio da região nasofaríngea· A presente invenção abre assin igualmente uma via para a construção de outros ãstemas vectores específicos em relaçao a tecidos por meio da utilização de outras partículas víricas* especificas para determinados tecidos.
Os modos de concretização descritos nos exemplos seguintes sao elucidados por meio das figuras, haven do concordância de numeração entre as figuras e os exemplos.
EXEMPLO 1
Corta-se o plasmídeo pLPV K38 (1) com BamHI e liga-se o ADN do LPV de modo a fechar o anel, obtendo-se o plasmídeo LPV K38 (2). Apés purificação, mistura-se para transfecçao o ADN ligado de acordo com o método de McCutchan e Pagano, J. Natl. Câncer Inst. 41 (1968), 351-3571 em 600 μΐ/ml de tampao de transfecçao com dextrano (meio RPMI 1640 com 500 μΐ/ml de DEAE-dextrano de peso molecular 50θ 000) com 2 x 10 células BJA-B lavadas e incuba-se 30 minutos à temperatura ambiente. Apos algumas lavagens, incubam-se as células transfectadas em 10 ml de meio de crescimento (RPMI 1640, 10% de soro fetal de vitela) a 37CC e com 5 vol.-% de C02« 0 LPV K38' sintetizado nesta cultura foi usado como inoculo de vírus para a preparação de maiores quantidades de ADN de LPV de acordo com o méto^ do de Hirt, J. Mol. Biol. 26 (1967), 365-369·
Para a fase seguinte de clonagem em E. coli (estirpe 490 A) e de preparação do ADN do plasmídeo seguiram—se métodos normais (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 19^2)·
Digere-se o plasmídeo LPV K38 (2) com Xmal e isola-se o fragmento de 4695 pb (nucleótidos 1104 até 529) (3)· Abre-se o vector pUC19 com Xmal e liga—se o plasmi— deo linearizado resultante (4) com o fragmento (3), obtendo-se o plasmídeo pL3 (5)·
Digere-se o plasmídeo (5) com Ncol e Sall e preenchem-se as extremidades salientes com pólimerase de Klenow, obtendo—se o fragmento (6) de extremidades alinhadas·
Digere-se o fragmento HCMV AD169-PstI-m (EP-A1-0 173 177) com Avall e HincII e isola-se o fragmento de 650 pb (nucleêtidos -59θ atê ^52). Por preenchimento com pólimerase de Klenow obtêm-se o fragmento (7) de extremidades alinhadas·
Ligam-se os dois fragmentos (6) e (7) sob condiçoes de ”blunt end”, obtendo-se o plasmídeo pL12 (8). Verifica—se a orientação correcta do elemento promotor de HCMV na região genica precoce do PLV por analise de restriçãoí o plasmídeo pretendido contêm um sítio de corte Ncol e estê sujeito com Bgll aos cortes previstos na fracçao de pUC19 e no fragmento HCMV.
Abre-se o plasmídeo (8) com EcoRI e Smal e isola-se o fragmento maior (9)·
Digere—se o vector pSV2Neo com Accl, preen chem-se as extremidades salientes com pólimerase de Klenow e corta—se de novo com EcoRI, obtendo-se deste modo o fragmento (10). Por ligação dos fragmentos (9) e (10) obtêm-se o plasmí deo pL30 (11).
plasmídeo pL30 (11) ê linearizado com % **
EcoRI e com o produto resultante procede—se a transfecçao de 10* células da linha de células BJA-B em 3 ml de tampao de transfecçao com dextra.no conforme anteriormente descrito.
— Após 48 horas de incubaçao, diluem-se as células até uma con— >
centraçao de 2 x 10 células por ml e, depois de adicionar G 418 até uma concentração final de 1,2 mg/ml em l$o jug de cultura, deposita-se em placas de cultura de tecidos de 96 alvéolos. Após 10 dias substitui-se 50% do sobrenadante das culturas por meio fresco. 25 dias depoisi.da transfecçao podem identificar— se clones de células Neor, os quais podem ser is o. lados por meio de subculturas. Após mais 10 dias é possivei identificar por meio de imunofluorescência indirecta com um soro anti-LPV-T as linhas de células que expressam o antigene LPV-T. As linhas assim obtidas BJA-B(NeorLPV—T+) sao clonadas por diluição extrema. Os clones de uma única célula BJA-B(Neor LPV-T+) que sao obtidos depois de 20 dias de cultura sao subme tidos ao mesmo tratmenxo. Um desses clones de células BJA—B (NeorLPV-T+), a linha de células 31B3-KÓ, ê usado para experiências adicionais.
EXEMPLO 2
Abre-se o plasmídeo comercial pSP64 com BamHl, obten do—se deste modo o plasmídeo linearizado (12).
Abre—se o plasmídeo LPV K38 (2) com Bcll e liga-se o genoma (13) com (12).
Deste modo obtém-se o plasmídeo pL9 (14). Este último é digerido com HincII obtendo-se deste modo dois fragmentos de 4912 pb (15) e de 3415 pb (16).
Transfecta-se a linha de células 3IB3-K6 (Exemplo 1) com o ADN do plasmídeo pL9 digerido com HincII (condições de transfecçao como no Exemplo 1)* obtendo-se 48 horas depois da transfecçao 0,1 % de células LPV—VP+. No decujr so de seis outros estágios de incubaçao a fracçao das células LPV-VP aumenta para mais de 5θ%· Por transferencia de sobrenadantes de culturas filtrados esteriimente sobre células • 3IB3-K6 é possivei detectar 48 horas após a inoculação 1Θ% de
células LPV-VP*. Quando se inocula com o sobrenadante de cultura de células BJA-B nao;é possível detectar qualquer célula LPV-VP nem mesmo oito dias depois.
Quando se procede à transfecçao de células 3IB3—K6 com plasmídeo pL9 nao digeridoλ(14) resultam, 48 horas depois da transfecçao 0,1% de células LPV-VP*, cuja quantidade torna depois a decrescer. Quando se procede à transfecçao para comparaçao de células BJA—B sob condiçoes idênticas não ê de— tecta^el qualquer síntese de LPV-VP.
EXEMPLO 3
Para a experiência que se segue começa—se por clonar o genoma do LPV no vector pUC19· Para este fim abre—se este com BamHI, obtendo-se deste modo o plasmídeo linearizado (17).
Abre-se igualmente com BamIII o plasmíde o LPV K38 (2) e liga-se o genoma de L^V linearizado (18) com (17)» obtendo-se deste modo o plasmídeo pLPV K38-I (19)·
Para a supressão do fragmento Apal de 240 pb que contêm a duplicação da origem da replicaçao de ADN em LPV K38, corta-se o plasmídeo (19) com Apal e liga-se o fragmento maior de modo a obter-se o plasmídeo pL24 (20).
Por corte do plasmídeo (20) com BamHI obtêm—se o genoma do LPV encurtado, o qual 6 ligado no vector fágico M13mpl8 (22) cortado com BamHI, obtendo-se deste modo o vector mL58 (23)·
Hibrida-se o oligonucleétido sintético (24) com o ADN de cadeia simples do vector (23)» servindo nes ta operação o oligonucleétido sintético (24) de iniciador para a síntese da cadeia complementar de ADN com polimerase de Klenow. Os clones M13 mutados com o sítio de corte por restri ção EcoRI introduzido são identificados por análise de restri. ção com a forma replicativa. Estes clones recebem a denomina—
çao mL60 (25)
Digere-se mLéO (25) com BamHI e EcoRl e isola-se o fragmento de 2826 pb (26). Digere-se igualmente pUC19 com BamHI e EcoRl e liga-se o fragmento maior (27) com (26), obtendo—se deste modo o plasmídeo pL61 (28).
Corta-se o plasmídeo pL61 (28) com BamHI e Ncol e isola-se o fragmento maior (29)· Este fragmento ê apropriado para a integração dum fragmento de ÀDN de dimensão atÓ 2,7 kb (30), obtendo-se deste modo um plasmídeo pLX (31)· Por corte de (31) com EcoRl e BamHI a transfecçao em células 3IB3-K6 formam-se partículas vlricas deficientes LPV X (32) que contêm o gene estranho X.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES- ia Processo para a utilização de siste mas hospedeiro - vector caracterizado por se utilizarem vect£ res específicos em relaçao a tecidos, nos quais o ÀDN virai foi substituido por ÀDN estranho e se utilizarem células hospedeiras permissivas com expressão constitutiva deste ADN suprimido.Processo de acordo com a reivindica ção 1 caracterizado por o vector virai especifico em relaçao a tecidos abranger a origem da replicaçao do ADN e essencialmente a região tardia do gene do papovavirus linfotropo (PVL) e células permissivas em relaçao a PVL, que exprimem de modo estável a região precoce do gene de PVL, desempenharam a fun— çao de hospedeiras.- 3a - **Processo para a expressão de ADN estranho caracterizado por este ADN estranho substituir ADN virai num sistema hospedeiro — vector de acordo com a reivindica çao 1.- 4a -Processo de acordo com a reivindica, çao 3 caracterizado por o ÀDN estranho codificar para uma pro. teína que é tóxica para as células hospedeiras._ 5& - • Processo para a preparaçao dum vector • para um sistema hospedeiro — vector de acordo com a reivindica çao 1 caracterizado por se integrar no genoma do PVL um sitio de corte singular entre a região precoce e a região tardia do gene e se utilizar o segmento de cerca de 3 kb de extensão desde o sitio de corte Ncol até ao sitio de corte introduzido.- 6a Processo para a preparaçao de células hospedeiras para um sistema hospedeiro - vector de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se transfectar uma linha de células permissiva com um fragmento de ADN de PVL que abran ge o segmento Ncol de 4,2 kb.A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alema em 20 de Setembro de 1986, sob o nS P 36 32 O38.2.Lisboa, 18 de Setembro de 19θ7
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