PT86128B - Processo para a preparacao de composicoes para o tratamento do cancro utilizando anti-corpos monoclonais contra gangliosido gd3 junto com il-2 - Google Patents
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Description
SLOAN-KETTERING INSTITUTE FOR CÂNCER RESEARCH
PROCESSO PARA a PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇffES PARA O TRATAMENTO
DO CANCRO UTILIZANDO ANTI-CORPOS MONOCLONAIS
CONTRA GANGLIOSIDO G^^ COM IL-2” ·
Sumário da invenção
O anticorpo monoclonal, ou a sua porção F(ab’)2, específico para o gangliosido Gp^ estimula a prolifracção de linfócitos em células T humanas.
Este efeito também demonstra a indução de receptores IL-2 e de secreção IL-2 pelos linfócitos, assim como um aumento na percentagem de células de G^yi-. Este efeito de estimulação das células T é aumentado por IL-2 exógeno, PHA e PMA.
Descrição resumida dos desenhos
A Figura 1, representa a coloração R24 de timóci tos, timo fetal, gânglios linfáticos de adultos e linfócitos. A Figura 2 representa a cromatografia em camada fina e o rastreio densitométrico de preparações de gangliosidos.
A Figura 3 representa a inibição da reactividade do mAB R24 pelos gangliosidos purificados.
A Figura 4 representa a proliferação de linfócitos E + com R24.
A Figura 5 representa o efeito mitogénico de diferentes concentrações de R24.
A Figura 6 representa uma análise, em citómetro de fluxo, de células E + estimuladas pelo anticorpo anti-CD3 (OKT-3) ou R24.
A Figura 7 representa o efeito do PHA do mBA anti -célula T e PMA sobre a proliferação de células E + induzida pelo mAB R24.
Memória descritiva
Descrição Pormenorizada dos Desenhos
Figura 1
Coloração imunofluorescente de timo fetal (a-c) e gãnglio linfático adulto (d) com mAB R24. 0 mAB R24 reage com os timócitos nas áreas sub-corticais (a) em torno dos vasos sanguíneos (b) e próximo dos corpúsculos de Hassal (c). 0 mAB colora aglumerados de linfócitos nas áreas paracorticais (d). Amplificação original, 200x.
Figura 2
Cromatografia em camada fina e rastreio densitomêtrico de preparações gangliosídicas. a) Estimularam-se células E + com mAB R24 (100 /ig/ml) durante 5 dias (jug = micrograma). Efectuou-se uma preparação de gangliosido de melanoma (MEL) a partir de um tumor metastásico de melanoma recente a partir de gânglios linfáticos axilares, b) Rastreio densitométrico da cromatografia de camada fina em a)_________,
Rastreio de uma preparação de gangliosido de células
Rastreio de uma calha normalizada G^. do G^.
A seta designa o pico
Figura 3
Inibição por gangliosidos purificados da reactividade do mAB R24 contra uma preparação de gangliosidos provenientes de células E + não estimuladas. As barras represen tam um desvio padrão.
Figura 4
Tempo de decurso da proliferação dos linfócitos de E + na presença (·) ou ausência (o) de mAB R24 (100 jig/ /ml).
~ 3
A proliferação foi medida pela libertação de H-timidina, conforme descrito a seguir. Apresentam-se os resultados como a média e os 100% de uma série de experiências independentes (e o desvio padrão e o acumulado da libertação de ^H-timidina dos meios de controlo estava dentro dos 10% de valores médios).
Figura 5
Efeito mitogénico de diferentes concentrações de mAB R24 (Fig. 5a) ou fragmentos F(ab’)2 de mAB R24 (Fig.
5b). Os resultados apresentam-se como a libertação de H-timidina durante 1 a 5 dias de cultura. Cada ponto representa o meio de culturas triplicadas. Os 100% da série estão compreendidos nos 15% da média. A Figura 5a representa a proliferação de células E + na ausência de anticorpos (meio de controlo). As concentrações de mAB R24 ou de fragmentos F(ab’)2 de mAB R24 encontram-se representadas na Figura: (200) = 200 jig/ml; (20) = 20 pg/ml; (2) = 2 jig/ml.
Figura 6
Análise por citometria de fluxo de células E + estimuladas com o anticorpo anti-CD3 (OKT-3) (2,5 mg/ml) ou de mAB R24 (100 jig/ml). Incubaram-se as células E + no início das culturas (dia 0) ou no dia 5 das culturas, com mAB R24 (10 pg/10 células), seguindo-se a incubação com imunoglobulina de cabra-anti-murganho marcada com FITC (GAMIgFITCi AnaliSaram-se as células com um FACS IV. A: Coloração com mAB R24 + GAMIgFITC de culturas estimuladas anti-CD3 (OKT-3) (18% de células R24+) (dia 5) ou coloração com apenas GAMIgFITC (controlo). B: Intensidade de fluorescência de células E + coradas com mAB R24 + GAMIgFITC no dia 0 (9,9% de células R24+) e no dia 5 (44% de células R24+) da cultura. A intensidade de fluorescência apresenta-se numa escala logarítmica.
Figura 7
Efeitos de PHA, anticorpos monoclonais anti-cêlula T (anti-CD2, anti-CD3, anti-CD8) e PL1A sobre a prolife** Z + ru raçao de células E induzida pelo mAB R24. A proliferação induzida apenas pelo mAB R24, conforme medida pela libertaçao de H-timidina, apresenta-se a 100% e corresponde a 63426 + 4729 cpm. As concentrações de mAB R24 foram de 100 jig/ml, PHA a 1% (v/v), OKT-3 250 jug/ml, OKT-11 1 /ig/ml e OKT-8 1 jig/ml, PMA 5 ng/ml. Mediu-se a proliferação no 5dia da cultura. Os resultados das experiências que se efectuaram nos dias 3 e 7 da cultura apresentaram o mesmo diagra ma das experiências realizadas no dia 5.
Os gangliosidos são uma classe de glicosfingolíΛ
- 5 pidos que contêm grupos oligossacáridos sialilados ligados a uma estrutura de núcleo lipidico. Apesar de não se conhecer a função exacta dos gangliosidos, tem sido sugerido que desempenham uma função na sinalização e reconhecimento celulares /Hakamori, S (1981) Ann. Rev. Biochem.” 50 : 733; Yu, R.K. e outros (1984) Adv. Exp. Med. Biol.” 174 í 8^7· Tem-se considerado os gangliosidos específicos como receptores de virus /Markwell, M.A.K., e outros (1981) ”Proc. Natl. Acad. Sei. USA” 78 : 5406; Bergelson, L.D. e outros Eur. J, Biochem. 128 : 467 (1982); Suzuki, Y. e outros (1985) J. Biol. Chem. 260 : 13627 e de toxinas /Éishman, P.H., (1982) J. Membr. Biol. 69 : 857. Outras provas sugerem que os gangliosidos podem modificar as funções do receptor de crescimento e alterar a afinidade destes receptores /Bremer, E.G., e outros (1984) J. Biol. Chem. 259 : 6818; Bremer, E.G. e outros (1986) J, Biol. Chem. 261 : 2434; Lacetti, P., e outros (1984) Adv. Exp. Med. Biol 174 : 3557. Tem-se prestado especial atenção à relação entre os gangliosidos e 0 crescimento e diferenciação de células de origem neuro-ectodéimica. Por exemplos os gangliosidos podem induzir a proliferação de células nervosas (los neurônios), aumentar a formação de neurite /Perrari G. e outros (1983) Brain Res. 284 : 215; Tsuji, S. e outros (1983) J. Biochem. (Tokyo) 94 : 303; Nakajuir.a, J. e outros (1986) Biochem. Bioplis. Acta. 876 : 657 e facilitar a adesão das células nervosas /Blackburr, C.C., e outros (1986) J. Biol. Chem. 261 : : 28737.
Provas experimentais sugerem que os gangliosidos e os anticorpos que se dirigem contra os gangliosidos podem
influenciar também as células do sistema imunológico /Marcus, D.M. (1984) ”Mol. Immunol.” 21 : 1083 Whisler, R.L., e outros (1980) J. Immunol.” 125 : 2106; Merrit, W.D. e outros (1984) Cell. Immunol.” 89 : 17. Descobertas recentes demonstraram que a ligação da subunidade B da toxina da cólera ao Gj^i da superfície celular pode induzir a proliferação de timócitos de ratos /Spiegel, S., e outros (1985) Science” 230 : 12857 e que os anticorpos monoclonais dirigidos contra o dissialogangliosido Gp^ pode aumentar a resposta dos linfócitos aos mitogênios /Hersey, P. e outros (1986) Aust. NZ. J. Med. 16 : 1527. Uma vez que estes resultados sugeriram que a ligação a gangliosidos específicos pode modular o crescimento de células linfociticas, calculou-se o efeito nas células linfóides dos anticorpos monoclonais para os gangliosidos Gp£, Gj)-} θ θΜ2* ^rabalhos anteriores demonstraram que os anticorpos monoclonais contra estes gangliosidos reagem principalmente com tipos de células derivadas da neuro-ectoderme /Real, E.X., e outros (1985) Câncer Res. 45 : 4401; Saito, M., e outros (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 127 : 1; Natoli, E., e outros (1986) Câncer Res. 46 : 4116/. No estudo presente, demonstra-se que os anticorpos para o Gp^ também reagem com um subgrupo de timócitos de feto humano e com subpopulação de linfócitos nos gânglios linfáticos e no sangue periférico. A ligação polivalente de anticorpos monoclonais anti-Gp^ e de fragmentos F(ab’)2 para linfócitos T, activa uma subpopulação de células Gp^ positivas, induzindo a produção de IL-2, a expressão de receptores para o IL-2 e a proliferação celular.
f -7-Os exemplos seguintes servem para ilustrar a presente invenção sem a limitar aos exemplos específicos. Os equivalentes estão, também, englobados no âmbito da presente invenção,
Materiais e Métodos
Anticorpos Monoclonais e IL-2
Demonstrou-se que os anticorpos monoclonais de murganho (mAB) R24 (IgG3), (IgG3) θ K9 (I$O reagem com o Gpg /Dippold, W., e outros (1980) Proc. Natl. Acad. SCI. USA 77 : 6114; Rekel, C., e outros (1982) J. Exp. Med. 155 : 11337. 0 mAB 3F8 (IgG3) de murganho (uma revelação do Dr. Nai-Kong Cheung, Case-Western Reserve University, Cleveland, Ohio) reconhece 0 gangliosido G^ /Saito, M., e outros (1985) Biochem. Res. Comm. 127 : 17; 0 mAB 10-11 (IgM) de murganho, reconhece o G^ /Natoli, E., e outros (1986)Câncer Res. 46 : 41167 e 0 mAB P 36/22 (lgG3) de murganho reage com uma glicoproteína de peso molecular elevado da superfície celular, espressa pelas células do carcinoma da mama, mas não pelas células linfóides /Papsidero, L.D., e outros (1984) Câncer. Res. 44 : 46537· θ mAB R24 foi utilizado como sobrenadante de hibridoma ou foi preparado a partir de ascite de murganhos portadores de tumores de hibridoma. Purificaram-se as preparações de mABs R24, 3?θ, C5 e F 36/22 de ascites, por precipitação com uma solução saturada de sulfato de amónio que se adicionou para proporcionar a concentração final /ta» de 35% (p/v). Para purificação adicional fez-se a aplicaçao das preparações do anticorpo IgG3 a uma coluna de proteína A em Sepharose (Pharmacia, Inc., Piscataway, KJ) e eluiu-se /
- 8 - / ί
com tampão de citrato 0,5M/NaCl 0,15 M, a pH 4,0. As fracçÕes de proteína eluída passaram através de uma coluna de Sephadex G25 K (Pharmacia, Inc.) e eluiu-se com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), a pH 6,0. Os anticorpos monoclonais OKT-3, OKT-4, OKT-6, OKT-8 e OKT-11, conjugados ou não conjugados com FITC, foram adquiridos em ”Ortho Diagnostics Systems” Raritan, RJ). Os anticorpos OKT-3 e OKT-8 e OKT-11 foram intensamente dialisados antes de se utilizarem em ensaios de proliferação.
Os receptores anti-IL-2 dos anticorpos mono cl o -r nais marcados com FITC e Leu-2a, Leu-3a e Leu-4 conjugados com ficoeritrina (PE) foram adquiridos na Becton-Dickinson, Inc. Konntainview, CA”, 0 IL-2 recombinante foi amavelmente cedido por Cetus” (Emeryville, CA).
Produção de Fragmentos F(ab*)2
Os mABs R24 ou 3F8 purificados em citrato de sódio 0,05 M/cloreto de sódio 0,15 K, a pH 4,0, foram digeridos com pepsina a 37°C, durante 5 minutos. Utilizou-se pepsina em uma quantidade que proporcionasse a obtenção da proporção enzima: Anticorpo de 1 : 33, em peso. Interrompeu-se a reacção adicionando um terço do volume de Tris 3&, a pH 8,6. 0 produto da digestão foi eluído sobre uma coluna de proteína A em “Sepharose” (Pharmacia, Inc.), equilibrada previamente com PBS, a pH 7,0. Recolheram-se os fragmentos F(ab’)2 e armazenaram-se a 4°0. A electrofo.rese em gel com dodecil-sulfato de sóiio/poliacrilamida (SDS/PAGE) sob condi ? ões de não redução, revelou uma banda única de 122000 daltons. A coloração por imunofluorescéncia de um painel de linhas de célu/
-9-/ las R-24-positivas e R24-negativas (11 R24+ de melanomas e 11 R24” de carcinomas) confiimou que a especificidade das preparações de F(ab’)2 de R24 foi a mesma da globalidade de IgG R24.
Coloração de Tecidos Normais
Obtiveram-se os gânglios linfáticos humanos adul tos histologicamente normais, a partir de espécimes de patologia cirúrgica de pacientes sem cancro, ao fim de 1 - 2 horas após ressecção, Obtiveram-se os espécimes de timo fetal a partir de abortos escolhidos. A idade gestacional do feto foi determinada por medidas do perímetro cefálico, perímetro pélvico e de peso. Mergulharam-se os tecidos em isopentano, previamente arrefecido em azoto líquido, embeberam-se no com posto OTC em criomoldes (Miles labs, Inc. Naperville, IL) e armazenaram-se a 70°C.
As reacções de tecido de corte criostático (4-8 micra de espessura) utilizaram-se não fixas ou fixas com ace tona a 4-8°C, durante 10 minutos. Coaram-se as secções de tecido por imunofluorescência indirecta ou métodos de peroxidase, conforme descrito antes /Oordon-Cardo, C. e outros (1986) Int. J. Câncer 37 : 667/. Resumidamente, fez-se a incubação das secções de tecido em soro supressor de cabra (10% v/v) durante 20 minutos e depois em anticorpo primário durante 1 hora. Utilizou-se o mAB R24 em concentrações compreendidas entre 20 - 40 jig/ml sob a forma de sobrenadante de hibridoma ou de ascite de murganho purificada. Para coloração por imunofluorescência, fez-se a incubação das secções durante 45 minutos com um anticorpo secundário marcado por
fluorescência anti-IgG de murganho (Oappell Labs, Cochranvil le, PA) e examinou-se com um microscópio equipado com epi fluorescência com uma lâmpada de mercúrio de 100 watts. Para coloração com imunoperoxidase, os tecidos foram tratados com 0,01% de Η202 em PBS durante 10 minutos, fez-se o bloqueio com soro supressor e procedeu-se à incubação com o anticorpo primário, conforme descrito antes. Os anticorpos secundários foram conjugados com peroxidase de rábano bravo (horseadish peroxidase”) (Ortho Diagnostics, Inc. Raritan, NJ). Utilizou -se a diaminobenzidina como um cromogénio. Apôs coloração, as secções foram entrastadas com hematoxilina e procedeu-se à montagem.
Células Mononucleares do Sangue Periférico
Separaram-se as células mononucleares do sangue periférico (PB1IC) de doadores humanos, por centrifugação em gradiente de densidade num Ficollhypaque” /Boynm, A., (1976) Scand. J. Immun.” 5 (Suppl. 5) : 9/. Lavaram-se as células três vezes em meio RPLiI 1640 enriquecido com 2 niC de L-glutamina, 50 U/ml de penicilina, 50 ^ug/ml de estreptomicina e 10% de soro de feto de bovino inactivado pelo calor (PBS).
Conservaram-se as células neste meio durante todos os procedimentos de incubação e lavagem subsequentes.
No sentido de se recolherem as células aderentes, fez-se a incubação de até 3 x 10 PBIÚC durante 90 minutos a 37°C em 5% de CO^ num volume total de 10 ml, em recipientes de cultura de tecidos Falcon 3003 (Falcon Labware Div., Becton - Dickinson, Oxnard, CA). Separaram-se as células não aderentes rodando cuidadosamente os recipientes e pipetando /
/ r lentamente o meio. Lavaram-se os recipientes três vezes com o meio e recolheram-se as células aderentes utilizando uma espátula de borracha. A fracção de células aderentes continha mais do que 90% de monócitos/macrófagos, conforme se verificou por coloração com alfa-naftil-acetato-estearase.
Separação dos Linfócitos T
Para isolar as células T, tingiram-se de cor-de-rosa as PBMC não aderentes, com glóbulos vermelhos de ovelha tratados com neuraminidase, de acordo com um método modificado por V/einer e outros /Weiner, 16.S,, e outros (1973) Blood 42 í 9397· Esta fracção continha menos do que 2% de monócitos/macrófagos e mais do que 90% de células que reagiram com o anticorpo monoclonal OKT-3. Esta população celular designa-se por : células E+.
Análise dos Antigénios de Superfície dos Linfócitos
Para ensaios indirectos de imunofluorescência, ~ 6 fez-se a incubaçao de 10 PBMC em 0,1 ml com diluições apropriadas do anticorpo monoclonal não conjugado, durante 30 minutos em gelo, lavaram-se três vezes com PBS/2% de albumina de soro de bovino (BSA) frio e, depois, fez-se a incubação em gelo com 0,1 ml de uma diluição a 1 : 40 de anti-IgG F(ab*)2-FITC do murganho desenvolvida na cabra e purificada por afinidade (Cappel Lab, Cochranville, PA). Para duas análises de cor, lavaram-se mais três vezes as células e incubaram-se com 0,02 ml de anticorpo monoclonal marcado com PE, durante 30 minutos em gelo. Lavaram-se as células três vezes e ajustaram-se para uma concentração de 1 x 10 células/ml
ν para análise por citometria de fluxo. Determinou-se a fluorescência de contraste testando com anticorpos de murganho de controlo (adequadamente marcados) em vez do anticorpo de ensaio. Para fluorescência directa, fez-se a incubação de 10^ células durante 30 minutos com o anticorpo monoclonal directamente conjugado com FITO, lavaram-se três vezes e fez-se uma nova suspensão para análise.
Analisaram-se as células por citometria de fluxo, utilizando um citofluorografo H-50 (Ortho Diagnostic Systems, Inc. Raritan, NJ) ou um FACS IV (Becton-Dickinson). Gerou-se um citograma de fluorescência verde segundo um ângulo recto em função de um ângulo de dispersão desfasado com avanço, no sentido de demarcar a vizinhança da região com interesse (isto é, para diferenciar as células linfocíticas, monociticas e granulociticas) e excluir os detritos celulares e as células moribundas. Quando se utilizou o citofluorografo H-50, instalou-se na vizinhança das células linfocíticas um laser de ioes de a'rgon sintonizado para 488 nm na vizinhança da região demarcada. A partir desta região demaracada geraram-se histogramas de fluorescência verde (FITC). Para fluorescência a duas cores, determinou-se e analizou-se a fluorescência verde (FITC) em função da vermelha (PE). Analizaram-se para cada histograma um mínimo de 10 000 células e determinou-se a percentagem de células positivas por comparação com a marcaçao pelo anticorpo de controlo. Estimaram-se os dados utilizando um sistema computarizado Data General, modelo 2150.
/
- 13 -v
Ensaios de Proliferação
Faz-se a incubação separada de células PBMC ou E+ em micro-recipientes de cultura em triplicado (Costar 3595 placas, Costar Inc. Cambridge, LIA) na presença ou ausên cia de mAB R24. Outros factores avaliados nos ensaios de proliferação englobam o IL-2 recombinante (Cetus Corporation), fito-hemaglutinina (PHA) (Gibco Labs, Grand Island, NY), forbol-miristato-acetato (PMA) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), e proteína A (Pharmacia, Inc.). Em determinados momentos certos, removeram-se 100 pl de sobrenadante de cada recipiente para se ensaiar a actividade IL-2. Em momentos específicos, as culturas triplicadas foram batidas durante 4 horas em H-timidina (0,5 juCi/recipiente, New England Nuclear, ~ 3
Boston, MA) e mediu-se a libertação de H-timidina conforme descrito antes /Welte, K., e outros (1933) ”J. Immunol'’ 131 : 2356/.
Ensaio Para a Actividade IL-2
Para os ensaios de IL-2, utilizou-se uma linha de células citotóxicas T de murganho dependentes do IL-2, conforme descrito antes /Welte, K., e outros (1933) supra/. Neste ensaio uma unidade de actividade é equivalente a uma unidade de actividade do padrão IL-2 do programa Biological Response Modifier”, National Institutes of Health.
Lise Medida por Complemento das Células Positivas R24
- 14 <í ratura ambiente com diferentes concentrações de mAB R24 (100, 10, 1 pg/ml) durante 1 hora, lavaram-se e incubaram-se com uma fonte de complemento (soro humano, previamente rastreado, diluído a 1: 8 em meio tamponado com Veronal) a 37°C durante 2 horas. Lavaram-se três vezes as células e fez-se nova suspensão para utilização em ensaios de proliferação. Trataram-se as células de controlo com PBS, seguindo-se apenas a fonte complementar ou com mAB R24 (100 pg/ml) seguindo-se o meio tamponado com Veronal sem fonte do complemento.
Preparação e Avaliação dos Gangliosidos
Purificou-se o G
D3 ma humano e purificou-se o Gp2 a partir de tecido de melanoa partir de cérebro humano, conforme descrito a seguir, 0 G^ foi adquirido em Sulpeco, Inc. (Bellafonte, PA). Preparou-se o G^2 por tratamento do GM1 com t’e‘ta-Salac'fcosi(iase (do Dr. George V/. Jourdian, University of Michigan, Ann Arbor, MI) conforme descrito por
Cahan e outros/(Cahan, D.L., e outros (1982) Proc. Natl.
Acad. Sei. USA” 79 : 7629/. Verificou-se a pureza das prepa· rações gangliosídicas mediante cromatografia de camada fina.
Isolaram-se os glicolípidos por uma modificação do método descrito por Saito e Kahamori /Saito, T. e outros (1971) ”J. Lipid Res.” 12 : 257/. Resumidamente, homogenei zaram-se as células em clorofórmio: metanol (C:K) a 2 : 1 e extrairam-se num volume 100 vezes superior de C:M. Filtrou-se o homogeneto e tornou a extrair-se duas vezes em C:M, primeiro a 1 : 1, depois a 1 : 2. Evaporaram-se os filtrados num evaporador rotativo, acetilaram-se, fez-se o desenvolvimento numa coluna de florisil, desacetilaram-se e fez-se a
diálise em HgO durante 24 horas. Depois, fez-se uma nova evaporação e suspensão da amostra em C : M : HgO (30:60:80) e aplicou-se a uma coluna de Sephadex-DEAE” (Pharmacia, Inc.) equimibrada com C : ií : 0,8 M de acetato de sódio (30:60:8).
Para análise por cromatografia de camada fina, activaram-se placas de gel de sílica (Analtech, Newark, Delaware), aquecendo-as a 100°C durante 1 hora. Utilizou-se N-propanol : hidróxido de amónio : H^O (60:95:11,4) para desenvolver as cromatografias. Após o solvente ter migrado 12 cm a partir da origem, secaram-se as placas ao ar, colocaram-se em estufa durante 10 minutos a 120°C, arrefeceram-se até â temperatura ambiente e aspergiram-se com resorcinol-HC1. Avaliou-se a densitometria utilizando um cromatografo de camada fina Shimadan 05 - 930 (Kyoto, Japan).
Imuno-Ensaio ligado a Enzimas para a Reactividade do mAB com os Gangliosldos
Colocaram-se as preparações gangliosidicas a partir de células E+ em placas de microteste (Bellco Glass, Inc. Vineland, NJ). Secaram-se as placas ao ar durante duas horas e fez-se o bloqueio com BSA a 1%, durante 2 horas. Pez-se a incubação de 20 jig/ml de mAB R24 com diversas concentrações de preparações gangliosídicas durante 2 horas, e, depois, adicionaram-se às placas de microteste e fez-se a incubação durante uma hora à temperatura ambiente. Lavaram-se três vezes as placas e fez-se a incubação durante 45 minutos com anti-IgG de murganho conjugada com fosfatase alcalina (Sigma Chemical Corp., St. Louis, Liu) diluída a 1 : 200. Lavaram-se as placas e fez-se a incubação com substracto de dietanolamiΊ
- 16 na durante 20 minutos a 37°C. Avaliou-se a reactividade num leitor Artec Systems Corp., modelo 210 (Farmingdale, NJ).
Radio-imunoprecipitação e Marcação de Western
Testou-se a capacidade do mAB R24 para reagir com antigenos de proteína ou de glicoproteina de células E nao estimuladas ou de células E+ estimuladas com mAB R24 (100 jog/ml). Prepararam-se extractos a partir de células E+ solubilizadas com detergentes (em NP-40 a 0,05%, 0,01 M de Tris, pH 7,5, 0,15 M de NaCl e 2 mM de MgClg), ou a partir de extractos tratados por ultra-sons de preparações de membrana solubilizadas em SDS a 2% (p/v). Marcaram-se os extractos com 12¾ ρθιο método da cloramina T /Greenwood, F.C., e outros (1963) Biochem. J.” 89 : 1147· Fez-se a incubação durante 1 hora do mAB R24 anti-HLA A, B, C, anticorpo W6/32 /Bamstable, C. J., e outros (1978) Cell” 14 ; 97, OKT-3 ou anti-soro de controlo (soro de murganho normal) com extractos marcados e anti-IgG de murganho desenvolvida no coelho, a 4°C, seguindo-se a imunoprecipitação com proteína A em Sepharose (Pharmacia, Inc.), conforme descrito antes /Lloid, K.O. e outros (1981) ”J. Immunol.” 126 : 24087. Eluiram-se os imunoprecipitados com SjS a 2% e analisaram-se em geles a 9% em SDS/PAGE.
Efectuou-se a marcarão de 'Western conforme descrito /Towbin, H. e outros (1979) Proc. líatl. Acad. Sei. USA 76 : 43507. Separaram -se os extractos por SDS/PAGE e transferiram-se para nitrocelulose (Schleicher e Schuell, Keene, NH) ou membranas Zeta Probe (BioRad Labs, Richmond,
CA) durante 1,5 - 3 horas a 70 V (230 mA) com arrefecimento. Secaram-se as membranas, incubaram-se com mAB R24, seguindo-se anti-IgG de murganho desenvolvida na cabra, marcada com peroxidase de rábano bravo e desenvolveram-se com diamino-benzidina/HgOg.
Os exemplos seguintes servem para ilustrar a invenção e não se pretende que esta fique limitada â especificidade dos exemplos.
Exemplo I mAB R24 reage com Timócitos e linfócitos
Descobriu-se que o mAB R24 reage com sub-populações de células nos tecidos do timo de três fetos de 12 - 14 semanas de idade. Os timócitos R24+ estão localizados nas áreas sub-cordicais e nos aglomerados na vizinhança dos vasos sanguíneos e dos corpúsculos de Hassal (Figura la - c).
Observaram-se resultados idênticos nos tecidos tingidos por técnicas de imunofluorescência e imunoperoxidase. No sentido de confirmar que o mAb R24 reagia com os timócitos, tingiram-se 4 micro-secções consecutivas com mAbs R24 ou OKT-6; demonstrou-se que as células R24+ reagem com o marcador de timócitos OKT-6. Nos Gãnglios linfáticos derivados de adultos saudáveis o mAb R24 tingiu pequenos cachos de linfócitos na vizinhança dos vasos sanguíneos, nas áreas interfoliculares e pericorticais (Figura ld).
mAb R.24 reagiu com 13,9 + 5,5% (desvio padrão S.D.) da PBMC de 13 indivíduos saudáveis (intervalo de 7,4 - 24,3% de células positivas R24). A análise por citometria
-w-L· de fluxo bicolor para o PBLÍC demonstrou que o mAb R24 reagiu com a sub-população de linfócitos T. Nas restantes células T derivadas do sangue periférico de 13 pessoas saudáveis, o mAb R24 reagiu com 14,8 + 5,7% (S.D.) de células CD3+ (inter valo de 5,0 - 25,5%) com 20,1 + 11,7% (S.D.) de células CD8+ (intervalo de 7,0 - 44,0%) e com 14,0 + 6,7% (S.D.) de células T CD4+ (intervalo de 6,0 - 29,7%).
Exemplo II mAb R24 Reage com o Gangliosido
nos Linfócitos T
Para confirmar que o mAb R24 reagiu melhor com o GD3 do que com outros componentes da superfícies das células T, demonstrou-se que o deteminante antigénico detectado pelo mAb R24 possuía as caracteristicas de um gangliosido. A reactividade do mAb R24 com as células E+ destruiu-se tratando previamente as células alvo com neuraminidase e etanol, con sistente com as propriedades de um glicolípido sililado mas, nao foi afectada pela protease e pela tripsina. Demonstrou
-se que o Gp^ era um componente gsngliosídico menor das preparações glicolípidas ácidas de células E+ do sangue periférico estimuladas com mAb R24 durante 5 dias (Figura 2a). I’as células E+ estimuladas, o Gp^ constitui 3-5% ios gangliosidos totais (Figura 2b), enquanto as células E+ não estimuladas contem níveis inferiores de Gp^· 0 mAb R24 reagiu com uma fracção gangliosidica purificada derivada das células T do sangue periférico e esta reactividade foi especificamente inibida por Gp^ purificado, mas não por GT.O,
OU GD2 (Figura 3). Estes resultados demonstraram que o mAb R24 de19 ( tectou o gangliosido G^ nas células T e que o mAb R24 não reagiu com os outros gangliosidos presentes na preparação de células T. Finalmente, o mAb R24 não reagiu com os componentes prpteioos cbs células E+ do sangue periférico, por análise de marcação de Western ou por radio-imunoprecipitação dos extractos marcados com Ί pelo método da cloramina T.
Exemplo III mAb R24 Induz a Proliferação de Linfôcitos E+
Descobriu-se que o mAb R24 estimula o crescimento de células PBMC e de células E+. A cinética da libertação da ^H-timidina pelas células cultivadas na presença de 100 jig/ml de mAb R24 encontra-se representada na Figura 4· A proliferação máxima observou-se decorridos 5 a 7 dias de estimulação. A Figura 5a representa o efeito de diversas con centrações de mAb R24 sobre a proliferação de células E+ entre 2 e 5 dias de cultura. Observou-se a resposta de prolife ração dependente da dose em todos os pontos testados. Uma
I concentração de 20 pg/ml proporcionou um acréscimo significa ~ 3 tivo na libertação de H-timidina sobre o meio de cultura (em cultura apenas no meio) em todos os dias testados. Para concentrações tão baixas como 2 jig/ml, o mAb R24 ainda produziu um acréscimo detectável na proliferação.
Para determinar que a estimulação das células T era devida especificamente ao anticorpo que reage com G·^, ensaiou-se um segundo anticorpo IgG3 (mAb C5) e dirigiu-se um anticorpo IgM (mAb K9) contra o Gpy Ambos os anticorpos anti-Gp^ induziram a proliferação de células T (Tabela 1) [ (A proliferação induzida pelo mAb G5 foi idêntica aos resultados com o mAb R24) · Os anticorpos monoclonais que reconhecem outros gangliosidos, incluindo um IgG3 contra o G·^ e 11111 IgM contra ο G^, nao esfimularam as células T. De modo idên tico, um IgG3 de controlo (mAb F36/22) que não reconhece gan gliosidos nem reage com células T, não estimulou as PBMC ou as células E+. Excluiu-se a possibilidade de os anticorpos ou substâncias de contaminação (por exemplo, proteína A) serem responsáveis pela estimulação de células T. 0 mAb R24 | preparado por diversos métodos induziu níveis idênticos de proliferação de células E em concentrações proteicas equivalentes. A estimulação foi produzida por sobrenadantes a partir do hibridoma R24, de ascites não purificadas de murganhos portadores de hibridoma R24 e de ascites purificadas por precipitação com sulfato de amónio com ou sem cromatogra fia por afinidade de proteína A (Tabela 1). A própria proteí na A induziu apenas uma proliferação mínima de células E+ (2379 + 145 cpm, libertação de ^H-timidina ao 52 dia com 5 jag/ml de proteína A).
I
Exemplo IV
Os Fragmentos F(ab*)2 de R24 estimulam as Células T
Para excluir a possibilidade do mAb R24 estimular as células T através da porção Fc da molécula, isolaram-se fragmentos F(ab’)2 de mAB R24 per digestão com pepsina. A Figura 5b demonstra a libertação de ^H-timidina das PBL1C durante a estimulação para diferentes concentrações (2, 20 e 200 ug/ml) de fragmentos F(ab’)2 de mAb R24. A incubação f
Λ de células com fragmentos F(ab*)2 de um anticorpo monoclonal IgG3 de controlo, mAb 3P8 (anti-G^), não produziu acréscimo na proliferação. 0 nível de proliferação durante a estimulação com fragmentos F(ab’)2 foi de metade do nível da prolif£ ração induzida pela mesma concentração de moléculas de anticorpo R24 intactas Zpor exemplo, 30 000 cpm para 200 jig/ml de mAb R24 total contra 18 000 çpm com 200 Jig/ml de F(ab’)27.
Exemplo V mAb R24 Induz a Produção de IL-2 e a Expressão do Receptor para IL-2
Detectou-se a produção de IL-2 durante a estimulação de células E+ pelo mAb R24, numa cultura de sobrenadar tes entre o l2 e o 5- dias (Tabela 2). Pelo 72 dia não havia IL-2 mensurável nos sobrenadantes da cultura. 0 tempo decorrido para a produção de IL-2 foi diferente do da indução por outros mitógenos em que se produz IL-2 durante os primeiros dias de estimulação /Welte, K., e outros (1983) J. Immunol. 131 í 23567. A Tabela 2 pormenoriza a percentagem de células E+ positivas receptoras de IL-2 até ao 72 dia em cultura. Detectou-se a expressão do receptor IL-2 por ensaios com anticorpo monoclonal, mas não se distinguiram os receptores de elevada afiniiade e de baixa afinidade. Os resultados de três experiências independentes efectuadas com células E+ de três doadores saudáveis diferentes, demonstraram que a percentagem de células positivas receptoras de IL-2 subiu desde menos do que 3% inicialmente até aproximadamente 50% pelo 72 dia.
Exemplo VI
A Estimulação pelo mAb R24 Aumenta a Proporção de Células R24
A estimulação de células E+ e de PBMC com o mAb R24 produziu um acréscimo na percentagem de células R24+. Análises sequenciais de células E+ estimuladas por citometria de fluxo demonstraram que a proporção de células R24+ subiu significativamente entre o 52 e o 7- dias (Tabela 1 e Figura 6). Na figura 6 apresenta-se a intensidade de coloração imunofluorescente de células estimuladas pelo mAb R24. A intensidade de coloração foi heterogénea; contudo, a coloração mais brilhante após estimulação observou-se, em grande extensão, nas células semelhantes a blastos quando se analisaram por 0 + e se dispersou a 90° por citometria de fluxo, sugerindo que foi a população de linfócitos R24 positiva que estava a proliferar e a expandir-se durante a estimulação. A análise das PBMC originou percentagens idênticas de células positivas R24 : 26% no 22 dia, 33% no 32 dia, 36% no 5dia e 39% no 79 dia. Quando se utilizou como estimulador 0 anticorpo anti-CD3 (OKT-3), a percentagem de células R24+ não aumentou durante os 5 dias de cultura (Figura 6).
Exemplo VII
A Mitogenicidade Inluzida pelo mAb R24 Depende da Presença de Células R24+
A deplecção de células R24+ a partir de células
E por lise com 0 mAb R24 e complemento humano originou uma redução na proliferação induzida pelo mAb R24 (Tabela 3). 0
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Γ - . . :' · Ί /
( . ' - 23 grau de diminuição na proliferação estava relacionado com a concentração de mAb R24 utilizada para a lise intermédia com plementar e com a proporção das restantes células R24+ da cultura. Quendo a lise das células R24+ estava virtualmente completa, houve uma anulação completa da estimulação de cêlu las E+ pelo mAb R24.
Exemplo VIII
A Proliferação Induzida pelo mAb R24 Ocorre em Culturas com Deplecção de Macrôfagos mAb R24 induziu estimulação equivalente nas culturas de PBMC contendo 10 - 20% de macrôfagos e culturas de células E+ com deplecção de macrôfagos (confirmado por análise de citometria de fluxo) conforme medido pela expressão dos receptores IL-2 e pelo nível de proliferação celular (Tabela 4). 0 PHA e o anti-mAb CD3, dois mitogênios que exigem células acessórias, não estimularam estas culturas E+ com deplecção de macrôfagos. Quando se adicionaram novamente macrôfagos às células E+ (até 5% e 10% do número final de cê lulas), não houve alteração na indução da proliferação pelo mAb R24 (Tabela 4).
Exemplo IX
Efeitos de Outras Células T Mitogênicas ou Co-estimuladas na Estimulação Induzida nas Células T pelo mAb R24
Avaliou-se a influência potencial de outras células T, que se demonstrou serem mitogénicas, na proliferação de células T induzida pelo R24. A Pigura 7 apresenta os re24 . /
J / í sultados de experiências representativas (ao 5S dia de cultura). 0 PHA em concentrações de 1% (v/v) aumentou aproximadamente 1,5 vezes a proliferação de células E+ induzida pelo R24, embora o PHA a 1% apenas seja minimamente mitogénico (menos do que 10% do nível de proliferação atingido com PHA a 1% na presença de macrófagos). A estimulação com anti-CD3 (OKT-3) também está dependente da presença de macrófagos. 0 anti-CD3 em concentrações de 2,5 ng/ml, 25 ng/ml e 250 ng/ml não aumentou nem inibiu a estimulação de células E+ com deI plecção de macrófagos, induzida pelo R24 (Figura 7).
anti-CD2 (OKT-11) não induziu a estimulação de células E+ quando utilizado sozinho, mas o anti-CD2 inibiu a proliferação induzida pelo mAb R24 (60% de inibição a 1 pg/ml e 33% de inibição a 100 ng/ml) (Figura 7). 0 anti-CD8 (OKT-8), que pertence à mesma sub-classe do anti-CD2 e do anti-CD3 e é conhecido por inibir a produção de IL-2 e a proliferação induzida pelo anti-CD3 /Welte, K., e outros (1933) supra7 não inibiu nem aumentou a estimulação pelo mAb R24. 0 éster de forbol, PMA, um potente activador da proteoquinase C /Ííishizuka, Y (1986) Science 233 : 3057 e um co-estimulador para a proliferação induzida pelo anti-CD3 nas células T, com deplecção de monócitos /Hara, T., e outros (1985) ”J. Exp. Med.” 161 : 6417 aumentou em mais do dobro a proliferação induzida pelo R24 (Figura 7). A proliferação induzida pelo mAb R24, conforme medida por libertação de H-timidina, foi o resultado da produção de IL-2 e da expressão do receptor IL-2 (Tabela 1). Para se testar se o IL-2 exógeno podia aumentar a proliferação induzida pelo mAb R24, adicionou-se IL-2 recombinente (100 U/ml) a culturas estimuladas pelo
- 25 mAb R24. Conforme se apresenta na Tabela 5 o IL-2 exógeno aumentou substancialmente a proliferação de células E , quando comparado com a estimulação feita apenas pelo mAb R24.
Exemplo X
Demonstra-se na Tabela 6 seguinte nue a proteína
A (material recombinante de Pharmacia Corp., Piscataway, N.J.) também aumenta a proliferação de células T e pode servir com um agente estimulador, conforme indicado.
Tabela 6
Efeito da Proteína A na Proliferação de Linfócitos
Proliferação (libertação de H-timidina no 3- dia de cultura)
| Meio | 65 | cpm |
| R 24 (100 jug/ml) | 17443 | cpm |
| Proteína A (5 pg/ml) | 2426 | cpm |
| Proteína A (0,5 jug/ml) | 1558 | cpm |
Em referências anteriores demonstrou-se que o dissialogangliosido está expresso nos tipos de células derivadas da neuro-ectoderme, incluindo melanócitos, células de medula adrenal, glia, neurómios e nas células dos ilhéus do pâncreas Z^eal, F.X., e outros (1935) Câncer Res. 45 : 44017. Com a descoberta de que o G^ se exprime por uma sub-população de timócitos e linfócitos do sangue periférico, /
o Gpg junta-se a uma classe de antigénios partilhados pelas células da neuro-ectoderme e pelas células do sistema imunitário. Uma vez que ambas as linhagens são abundantes em célu las cuja junção primária é a comunicação célula a célula, é possível que o possa desempenhar um papel crucial na sinalização celular nestas vias de diferenciação. No estudo actual, demonstra-se que a ligação ao G^ induz a activação das células T, incluindo a expressão dos receptores IL-2, a produção de IL-2 e a proliferação celular. Podem estimular-se as células T por IgM, IgG e fragmentos F(ab*)2 que reagem com o Gpy Estes resultados são consistentes com a inter pretação de que a união e as ligações cruzadas do G^^ sobre a superficie das células I conduzem a um sinal para activação.
Como o soro contém Gp^, é possível que o G^^ da superfície dos linfócitos seja o resultado de adsorção passiva.
Contudo, diversas linhas de evidência sugerem que o G^g é sintetizado activamente pelas células T. Em primeiro lugar, o Gpg é expresso selectivamente em níveis elevados por apenas uma pequena sub-população de células T em vez de o ser por uma ampla população de células. Sm segundo
o número de células T que exprimem o GD3 aumenta substanciulmente em cultura de tecidos rr presença de anticorpos antí-Gpy Em terceiro lugar, o G·^ pode detectar-se nas células T de linhas celulares leucêmicas assim como em células linfóciticas leucémicas recentes. Demonstrou-se, a este respeito, que o nível de expressão de Gp^ pelas linhas celulares CEL de células T leucémicas, aumenta durante a es· timulação com o éster de forbol, PMA /Kignebi, K. e outros (1986) Câncer Res. 46 : 30277.
Demonstrou-se que os gangliosidos interferem nos sinais e receptores que influenciam 0 crescimento e diferenciação celulares. Descobriu-se que adicionando exogensmente gangliosidos às células em crescimento se altera a afinidade de ligação dos factores de crescimento para os seus receptores e se afecta o estado de fosforilação da tirosina dos receptores dos factores de crescimento /Bremer, E.G. e outros (1984) J· Biol. Chem. 259 : 6818; Bremer, E.G. e outros (1986) J. Biol. Chem. 261 : 2434/. Diversas moléculas glicoproteicas da superfície das células T, podem ser intermediárias na activação das células T, incluindo 0 receptor IL-2, 0 complexo molecular Ti/CD3 e 0 antigênio CD2 /Weiss, K.J. e outros (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 6836/. A activação por estes receptores exige, geralmente, células auxiliares receptoras positivas Pc, tais como macrófagos e componentes solúveis (por exemplo, IL-1) ou PMA /Hara, T. e outros (1985) J. Exp. Med. 161 : 6417. Uma excepção ê o receptor CD2 que se expressou permaturamente nas células T em diferenciação no timo /Mener, S.C. e outros (1984) Cell 36 : 8977· A activação por ligação a Gpp tal como a activação mediada por CD2, não parece depender d? células auxiliares. Apesar da diversidade de receptores da superfície celular disponíveis para activação supõe-se que existem apenas vias limitadas disponíveis por transdução de sinais no interior das células /Nishizuka, Y. (1986) Science 233 : 305; Imboden, J.B, e outros (1985) J. Exp. Med.” 161 : 446/. Não é evidente que a ligação do G^ pelo mAB inicie a acti vação ao nível dos conhecidos ligantes receptores superficiais ou através de um complexo receptor separado ainda não identificado. Diversas referências sugeriram que os gangliosiios extracelulares podiam ligar o IL-2, inibindo assim a proliferação de linfócitos induzida por um mitogénio /Robb, R.J. (1986) ”J. Immunol” 136 : 971; Parker J., e outros (1984) PEBS letters” 170 : 3917· Neste caso, os gangliosidos podem competir contra a reactividade IL-2, por remoção ou inactivação de IL-2. Para além da sua possível reactividade com a molécula IL-2 solúvel, Robb e outros /Robb, R.J. (1986) ”J. Immunol.” 136 í 9717 demonstraram que os gangliosidos são susceptíveis de diminuir a expressão do receptor IL-2 (antigênio Tac) nos blastos induzidos por PHA. Estes resultados sugerem que os gangliosidos celulares podem estar envolvidos na supressão da expressão do receptor IL-2 das restantes células T. Neste modelo, a ligação de IL-2 ou de anticorpos a gangliosidos críticos nas células T, poderão permitir a expressão total dos receptores IL-2. Isto também poderá ser compatível com a observação de que o IL-2 seja susceptível de regular muito bem o seu próprio receptor /Reem, G.H. e outros (1984) Science 225 : 429; Welte, K. e outros (1984) ”J. Exp. Med. 160 : 139Q7 e que um efeito proeminente do mAb R24 nas células seja a indução da expressão dos receptores IL-2. Isto também é suportado pelo acréscimo substancial na proliferação de células E+ estimuladas pelo mAb R24 na presença de IL-2 exógeno (Tabela 5). A estimulação das células T pelos anticorpos anti-G^^ pode ser aumentada por IL-2 exógeno, PHA e PLiA, mas não pelo mAb anti-CD3. A inibição da
- 29 activaçao mediada pelo Gpg pelos anticorpos monoclonais para
CD2 sugere que o
pode estar associado com a molécula CD3, mas existem outras explicações possíveis para esta descoberta, por exemplo, desregulação da activaçao mediada por CD3 por ligação a CD2 /Mener, S.C. e outros (1983) Science 222 : 1232/. Pensa-se que as células T de Gp^+ sejam essenciais para a activação inicial pelo mAb R24 uma vez que a de plecção desta população anula a resposta proliferativa. Embora seja possível que a estimulação possa conduzir ao recrutamento de células Gpg“ numa população Gp^+ , ê mais verosímil que a activaçao pelo anti-Gp^ conduza à expansão do agregado G-pg das células T : 1) as células T Gp^ são necessárias para estimulação; 2) a expansão do agregado G^ ê constituída essencialmente por células semelhantes a blasto, em proliferação; 3) a estimulação por outros mitogénios tais como o PHA ou o anti-CD3 não conduz a um acréscimo maior na proporção de células GD3 (Figura 6). Experiências com linhas de células T G^ e clonadas ajudarao a clarificar este ponto e permitirão uma análise funcional das células T Gp^ . As experiências demonstram que o mAb R24 reage com os linfócitos T3 e que a população em proliferação em culturas esti muladas por R24 englobam uma mistura de linfócitos T4 e T8.
mAb R24 pode aniquilar as células alvo por ci toxicidade me liada pelo complemento e ,ci toxicidade celular dependente do anticorpo. Com base na reactividade restrita e nos efeitos citotóxicos do mAb R24 in vitro, iniciou-se uma experiência clínica preliminar para avaliar o mAb R24 no tratamento de pacientes com melanomas metastásicos /Houghton, /
Α.Ν. e outros (1985) ”Proc. Natl. Acad. Sei. USA” 82 : 1242?. A infusão intravenosa de mAb R24 induziu sinais clínicos e sintomas de inflamação na vizinhança dos tumores e regressão ou desaparecimento das lesões em alguns pacientes. Foi evidente que o tratamento com o mAb R24 produziu deposição e infiltração complementar de células T (CD3+/CD8+/Ia+) nos tumores. Apesar de diversas propriedades biológicas do mAb R24 poderem contribuir para a sua actividade anti-tumor, a função potencial de activação das células T é particularmente intrigante. Este ponto de vista é suportado pela descoberta de que as células T se infiltram em tumores em regressão após tratamento com R24, mas não em biopsias de tumor antes do tratamento. Além disso, os clones de células citotóxicas T foram confirmados a partir de um paciente tratado com R24. Estes clones de células T aniquilam especificamente as células de melanoma do mesmo indivíduo e não tecidos normais ou melanomas alógenos. A possível activação de células T nos pacientes tratados ê um assunto complexo, uma vez que o mAb R24 pode também proporcionar a lise das células T alvo na presença de complemento humano e abolir, assim, a estimulação de células T (Tabela 3). A capacidade do mAb R24 para efectuar a lise das células hospedeiras, pode explicar parcialmente a observação de que as regressões de tumor apenas foram genericamente verificadas após o tratamento com doses reduzidas, mas não com doses elevadas de mAb R24 /fíoughton, Α.Γ., e outros (1985) ”Proc. Natl. Sei. USA” 82 : 12427. Será possível investigar esta questão, uma vez que os fragmentos F(ab’)2 de mAb R24 podem estimular as células T mas não medeiam a lise /
do complemento (P. Chapman, observação não publicada). Inves tigar-se-ão os fragmentos F(ab’)2 numa experiência clínica com o objectivo de avaliar a sua função potencial no tratamento do cancro.
Há uma teoria que admite que uma ponte” mAb tal com um braço do mAb R24 se liga às células T e as activa enquanto um braço diferente de mAb se liga ao tumor efectuando a aniquilação.
A proteína A recombinante é outro agente de esti mulação. Para o tratamento do cancro apenas, pode injectar-se Proteína A por via intravenosa ou pode remover-se o sangue de um corpo e passá-lo por proteína A e, depois, efectuar a re-infusão (ex vivo). Em qualquer dos casos de modelos animais observou-se regressão dos tumores.
Será mais aconselhável o uso de PHA ou PILA em tratamento ex vivo conjuntamente com IL-2 e/ou R24.
Também se observou a possibilidade de utilizar fragmentos F(ab )2 interligados com fragmentos Fc de imunoglobulina humana num anticorpo quimérico o qual pode influên ciar a tolerância melhorada para o mAb R24, em pacientes. Deste modo, é possível estimular cada uma das células T directamente in vivo, as quais são depois orientadas para o tumor, ou para estimular as células I de um paciente, no exterior do corpo, conforme demonstrado antes, e, depois, injectar estas células estimuladas para efectuar a citoxicidade do tumor em conjunto com o IL-2, Proteína A, R24, etc., adicionados.
intervalo de tratamento com IL-2 varia aproximadamente entre uma dose reduzida inferior a 1 milhão de uni
dades até uma dose elevada superior a 3 milhões de unidades de IL-2. Considera-se um intervalo médio quando varia aproxi madamente entre 1-3 milhões de unidades de IL-2.
Tabela 1
Análise da Estimulação de Células T por Anticorpos Monoclonais Contra Gangliosidos
Incorporação de
H-timidina
KAb
Concentração (CPK + SD)
| R241 R241 | 100 pg/ml 30 pg/ml | 28497 + 5390 + | 6501 536 |
| R24 sobrenadante | |||
| de hibridoma | 30 }ig/ml | 4899 + | 951 |
| K9 (IgM, anti-GD3) | 100 pg/ml | 10777 + | 3982 |
| 10-11(IgM, anti-G^) | 100 pg/ml | 565 + | 186 |
| 3F8(IgG3, anti-GD2) | 100 jug/ml | 610 + | 79 |
| F36/22(lgG3 controlo) | 100 jug/ml | 1137 + | 55 |
| Meio | - | 733 + | 415 |
Purificado a partir de ascite dias em cultura
- 34 Tabela 2
Produção àe IL-2, Receptor de IL-2 e Expressão de (L· pelas
Células E estimuladas com KAb R24
| Dia | Produção | Células Positivas | Células |
| de | de IL-2 | Receptoras de IL-2 | R24+ |
| Estimulação | (U/ml+SD)1 | (% Positiva + SD)1 | (% Positiva) |
| 0 | 0 | 3 | 2 9,9^ |
| 1 | 1,4+3., 2 | 6,6+2,0 | 15,9 |
| 2 | 1,3 | 12,8+8,0 | 21,6 |
| 3 | 0,9+0,3 | 22,3+11 | 25,9 |
| 5 | 0,7+0,5 | 38,9+7,5 | 44,02 |
| 7 | 0 | 49,7+4,5 | 43,0 |
- Resultados de 3 experiências independentes (com excepção de uma única medição de produção de IL-2 no 25 dia) utilizando o mAb R24 (100 jig/ml) para estimulação.
- Também apresentado na Figura 6
Tabela 3
Proliferação ias Células E+ iniuziia pelo B.24 após Deplecção
Intermédia Complementar de Células R24+^
| Células E+ Tratadas com | Células | E+ Após | Tratamento |
| %R24+ Libertação | 3 de H-timidina | ||
| (CPM) | |||
| 32 dia | 52 dia | ||
| R24(100 jug/ml) + Complemento | <1 | 55 | 36 |
| R24(1O pg/ml) + Complemento | 3 | 320 | 1729 |
| R24(l Jig/ml) + Complemento | 7 | 977 | 4138 |
| Apenas Complemento | 15 | 4942 | 31330 |
| Apenas R24(100 jug/ml) | 15 | 4656 | 25069 |
| 1 As células E+ foram trata mento (ver Materiais and | das com ou Methods), | sem mAb R24/comple- ensaiadas para uma |
percentagem de células R24+ e depois estimulaías com mAb R24C1OO pg/ml).
Tabela 4
Efeito à.a Deplecção âe Nacrófagos na Proliferação le Células
E+ induzida pelo R24
- 36 /
| Incorporação | |
| Pracção Celular | 3 de H-timidina |
| (CPM) | |
| Exp.l | |
| E+ | 7235 + 775 |
| E+ + 5% Macrófagos | 5341 + 729 |
| E+ + 10% Macrófagos | 7486 + 1301 |
Exp. 2
E+
PBMG
15076 + 631
12240 + 710
1-3 dias de cultura estimulada com mAb R24 (100 pg/ml). Apresentam-se os resultados como média e desvio padrão de culturas triplicadas.
Tabela 5
| Efeito do IL-2 | m » 4* Exógeno na Proliferação de Células E Iuduzila | ||
| pelo mAb R24 | |||
| Dia de | R24 | Aumento | |
| Estimulação | R24 Sozinho | 2 + IL-2r | Vezes |
| 3 | 17672 + 325 | 27710 + 2356 | 1,6 |
| 5 | 25069 + 1041 | 104402 + 2038 | 4,2 |
| 7 | 16667 + 2442 | 98007 + 10373 | 5,9 |
| 9 | 4461 + 930 | 45573 + 2443 | 10,2 |
- MAb R24 100 pg/ml
- MAb R24 100 pg/ml mais IL-2 100 U/ml. A libertação máxima de -Ή-timidina na presença de IL-2 apenas foi de
2536 + 11705 CPN no 7- dia de cultura.
Os resultados apresentara-se como média e desvio padrão de culturas triplicadas.
Claims (3)
1) timocitos fetais em regiões subcorticais e vasos próximos
1. - Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro em seres humanos, e susceptíveis de induzir a activação de células T, caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal que reage imunologicamente com gangliosido G^ junto com IL-2 em quantidades fisiologicamente activas.
2) linfócitos de nódulos de linfa em áreas interfoliculares e vasos próximos e 3) um pequeno subconjunto de células T no sangue periférico. Verificou-se que anticorpos monoclonais de murganho
Z dois IgGs, um IgM e fragmentos de F(ab')gJ7 que reagem com Gd3 estimulam a proliferação de células T derivadas de sangue periférico. Pode aumentar-se, a proliferação induzida por ligação a Gd3 de proteína A, PHA, PMA ou IL-2 exógeno.
Lisboa, 13 de Novembro de 1987
0 , /·. . - = . ......
FigurA 1 /
/ *
Figura 2b
FigurA 3
DtNSiOADE OPTICA oe fc-AtJ GMOSVOO \tJ16lDQ
FigutA 4 οε (CPW)
D\ A DE CU LTO RA
Ε οι ς.υι.ιυ«Λ Ο'α. ο e cultora
ι.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal incluir o anticorpo IgG ou IgM.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar o fragmento F(ab’)2 óo referido anticorpo monoclonal.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal escolhido no grupo que consiste em R24 K9 e C5.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se incorporar a porção Fíab’^ do referido anticorpo monoclonal.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a activação de células T ser caracterizada pela expressão de receptores de IL-2, produção de IL-2, proliferação de células e aumento nas células T de
7Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro em seres humanos, em que as referidas composições são susceptíveis de activar células T, caracterizado por se incorporar um inticorpo monoclonal que reage imunologicamente com gangliosido Gd3 junto com proteína A, em quantidades fisiologicamente activas.
8.- Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro em seres humanos, em que as referidas composições são susceptíveis de activar células T, caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal que reage imunologicamente com gangliosido Gd3 junto com PMA ou PHA ex vivo em quantidades fisiolo-40- /
gicamente activas,
Lisboa, 13 de Novembro de 1987
-41RESUMO
Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro utilizando anti-corpos monoclonais contra gangliosido junto com IL-2
Presume-se que os gangliosidos de superfície das células intervêm no crescimento e diferenciação das células. Assim, a presente invenção, que utiliza anticorpos monoclonais dirigidos contra Gd3, um disialogangliosido expresso predominantemente por células de origem neuro-ectodermal, verifica que Gd3 ê expresso por uma subpopulação de células do sistema imunológico que inclui:
3 σ
LL
Figur* 6
o)OKT5 b)R24
MU ME.RO OE CUUOLAS
FigurA 7
PH*
OKT-3 (250nG/n£>) ♦
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