PT86864B

PT86864B - Processo para clonagem molecular e expressao de genes que codificam para enzimas proteoliticas

Info

Publication number: PT86864B
Application number: PT86864A
Authority: PT
Inventors: Johannes Cornelis Van Der Lann; Leonardus Johannes S Mulleners; Christian Albertus Gerardus
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1992-05-29
Also published as: FI884904A0; KR890700665A; FI105483B; FI925413A0; CA1339100C; DE3856339D1; FI925413L; KR0127560B1; BG49049A3; NO884423L; DE3856339T2; LT4000B; FI884904L; PT86864A; DE3856331D1; DK200401262A; AU1398088A; DK175738B1; DK593988A; WO1988006624A2

Description

Descrição

Introdução

Âmbito Técnico âmbito da presente iíivenção refere-se à produção elevada de protease de tferina em estirpes de Bacillus empregando técnicas recombinantes.

Antecedentes

Têm-se utilizado amplamente os bacilos para a produção de enzimas industrialmente importantes tais como a alfa-amilase, a protease neutra e proteases alcalinas

ou de serina.

Podem-se obter geralmente, as proteases de gerlna bacterianas a partir de muitos organismos procarióticos incluindo organismos gram-negativos, tais como espécies de Serratia ou de Pseudomonas e bactérias gram-positivas tais como espécies de Micrococcus e de Bacillus. um grupo de proteases de serina industrialmente importantes de especial interesse são aqueles que possuem elevada actividade em meios alcalinos. E_nquanto as proteases de serina industriais são produzidas por diversas espécies de Bacillus incluindo B. subtilis, B. licheniformis, B. amiloliquefacíens, B. alcalophilus e outras espécies de Bacillus, as proteases DE alcalinidade elevada são, geralmente produzidas por estirpes do Bacillus que são capazes de se desenvolver a pH alcalino. Utn exemplo de um bacilo deste tipo é o Bacillus novo species PB92.

É de especial interesse o desenvolvimento de estirpes de bacilos capazes de produzirem enzimas proteolíticas com rendimentos elevados, especialmente proteases de alcalinidade elevada.

) Literatura Relevante

Efectuou-se, com êxito, a clonagem de diversos genes para enzimas extracilulares de bacilos, tais como os genes da alfaamilase de B. amvloliquefaciens (Paiva e outros, Gene 15 (1981) 43-51) de B. liaheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983) 267), de B. st earothermophilus (Mielenz e outros, Proc. Natl. Acad. _>ci. USA 80 (1983) 5975-5979; EP-A-OO57976) e de B. subtilis (Yang e outros, Nucleic Acids Res. 11 (1983) 237); o gene da levansucrase de B. subtilis (Gay e outros, J. Bacteriol; 153 (1983) 1424); os genes que codificam para a protease neutra de B. st^earothermophilus (Fuji e outros, J. Bacteriol. 156 • (1983) 831). de B. amylolique.facie.ns (Honjo e outros, J.

Biotech. 1 (1984) 165) e de B. subtilis (Yang e outros, J. Bacteriol. 160 (1984) 115); os genes que codificam para a protease de serina ou para protease alcalina de B. subtilis / Yong e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81(1984j_7, de B. licheniformis (Jacobs e outros, Nucleic. Acids Res. 13 (1985) 891.37 ^e cl® ê· am.ylo 1 iquefaciens (Wells e outros, Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7911),

A produção de proteases de serina industriais em diversas espécies de Bacillus foi descrita, por exemplo, nas Patentes dos Estados U_nidos N^s 3 674 643; 3 723 250; e e 4 480 043. A produção da enzima proteolítica de alcalinidade elevada por estirpes de Bacillus capazes de se desenvolverem a pH alcalino foi descrita por exemplo, nas Patentes dos E_stados Unidos N^s 3 723 250; Re.

602 e 4 480 037. Para um artigo de revisão sobre a utilização dos bacilos para a produção de enzimas industrialmente importantes ver, por exemplo, Debaboy, The Industrial Use of Bacilli, em: The Molecular Biology of Bacilli, (acad. Press, New York, 1982).

Chang e Cohen (Mol. Gen. Genet, 168 (1979) 111-115) elaboraram um protocolo para a transformação de protoplastos de B. subtilis. Protocolos idênticos foram descritos para a transformação com êxito de protoplastos de B. megaterium (Vorobjevae outros, FEMS Microbiol. Letters 7 (1980) 261-263 e protoplastos de B. amilo1iquefaciens (Smith e outros, Appl. and Env. Microbiol. 51 (1986) 634), de protoplastos de B. thurinqiensis (Fisher e outros, Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), de protoplastos de B. sphaericus (McDonald, J. Gen, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 2O3_7 e de protoplastos de B. larvae, Barkhiet e outros, Appl. e Env. Microbiol 49 (1985) 57'7_7. Contudo, Barkhiet e outros (supra) referiram resultados mal sucedidos com B. propillae. Mann e outros, Current Microbiol. 13 (1986) 131-135 referiram a transformação com êxito com 3. polymyxa B licheniformis, B.macerans e B. laterosporus.

Contudo o protocolo não foi bem sucedido com 3. coagulans, B, cereus e B. pumilus, ainda que se tivesse observado uma boa formação de protoplasto. °utros métodos para a introdução de ADN dentro dos protoplastos incluem a fusão com lipossomas que contem ADN, Holubova, Folia Microbiol 30 (1985) 97.

Resumo da Invenção

Proporcionam-se novas estirpes alcalofílicas Bacillus, métodos e composições para a transformação de tais estirpes. Também se proporciona uma nova sequência de ADN, compreendendo a referida sequência de ADN um gene que codifica para uma enzima proteolítica de elevada alcalinidade derivado a partir de uma estirpe alcalofílica de Bacillus. Transforma-se uma célula hospedeira, que possua, de preferência, uma característica positiva, utilizando uma construção plasmidica contendo um gene que codifica para a referida enzima proteolítica de elevada alcalinidade. Po^e empregar-se uma transformação de protoplastos com a construção plasmidica na presença de polietileno-glicol a pH alcalino A sequência de ADN pode ser mantida extracromossomicamente ou integrada dentro do genoma da célula hospedeira.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 apresenta os resultados da electroferase em gel de histidina/MOPS efectuada em sobrenadantes de culturas de B.subtilis DB104 que contém respectivamente pUBUO e pM58 comparada com diversas subtilisinas.

Pista 1 : subtilisina de Carlsberg

Pista 2 : protease de Bacillus PB92 Pista 3 í subtilisina de Bacillus subtilis

A Figura

4B

Pista 4 : Bacillus subtilis DB104 pM58)

Pista 5 : Bacillus subtilis DB104 pUBUO) apresenta o mapa de restrição do plasmíõio mP58. Para além disso, apresenta-se na parte superior da Figura a estratégia de sequenciação. A_s linhas a cheio com setas representam os fragmentos que se clonaram nos vectores mplO, mpll e mp 18 do bacteriófago ml3. N_a parte inferior da Figura apresenta-se a estratégia de sequenciação utilizando 10 oligonucleótid.os localizados a distâncias regulares no gene de protease.

apresenta a sSquência nucleótidica de cadeia de codificação correlacionada com a sequência de ácidos aminados da protease de serina de Bacillus PB92. Também se apresentam os promotores (P^, P₂), os locais de ligação dos ribossomes (Abs) e as regiões de terminação (extremidade) da sequência de ADN. A_s linhas a cheio nomeadas representam a localização dos dez oligonucleótidos que se utilizaram para sequênciação.

apresenta a construção do plasmídeo pE194-neo.

apresenta a construção do plasmídeo pMAX-4

Descrição dos Modos de Concretização..Específicos

De acordo com o objectivo da presente invenção, proporcionam-se novas construções de ADN e estirpes de Bacillus para a produção de enzimas proteolíticas em rendimentos elevados, bem como métodos para a sua preparação. Transformam-se células hospedeiras por combinação de protoplastos preparados a partir de estirpes hospedeiras de Bacillus sob condições de fusão, com uma construção plasmídica que contém uma sequência de ADN que codifica para uma enzima proteolítica.

A_s proteases de alcalinidade elevada são proteases de serina ou subtilisinas corri actividade elevada em meios alcalinos. Mais especificamente, as. proteases de alcalinidade elevada possuem uma actividade óptima a valores de pH superiores a cerca de 9 e retêm pelo menos 80% desta actividade óptima a um pH de cerca de 11 ou mesmo superior. Ag proteases de alcalinidade elevada são produzidas, qeralmente, por estirpes de Bacillus que são capazes de se desenvolver a pH alcalino.

São do conhecimento do especialista as técnicas que se utilizam no isolamento do gene de protease, incluindo a síntese, o isolamento a partir de ADN genóm.ico, preparação a partir de cADN ou combinações das mesmas. Divulga-se o isolamento e a expressão dos genes da protease de alcalinidade elevada no documento da prioridade no qual se baseia o presente requerimento, Pedido de Patente Europeia N2 EP-A-872OO358.7, o qual aqui se indica como referência. São bem conhecidas as diversas técnicas para a manipulação dos genes e incluem restrição, digestão, resecção, ljgação, mutagénese, in vitro, renovação de precursores, emprego de ligantes e adaptadores e similares (ver Maniatis e outros, Mol^ecul^ar Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

Λί-***'

Geralmente, o método compreende a preparação de uma biblioteca genómica a partir de um organismo que expressa uma protease de alcalinidade elevada. Isola-se o genoma do microorganismo dador e corta-se com uma enzima de restrição adequada. Ligam-se então os fragmentos de ADN da estirpe dadora resultante num vector de clonagem o qual foi cortado com uma endonuclease de restrição compatível.

F_odem identificar-se os clones que contêm o fragmento de ADN inserido por meio de um marcador de resistência ou pela utilização de um procedimento de selecção positiva ou directa tal como o que foi desenvolvido para B. subtilis (Gryczan e Dubnow, Gene 20 (1982) 459-469). Para além disso, podem identificar-se os clones que expressam uma protease de alcalinidade elevada mediante a utilização de anti corpos dirigidos contra o produto de expressão ou por detecção de perda de substrato ou a formação do produto da enzima proteolítica. P_or exemplo, pode efectuar-se a selecção em relação à produção de protease das colónias que expressam um gene de marcação tal como uma resistência a antibióticos, determinada pelo acréscimo de caseína em redor das colóni as contendo caseina.

precipitação de colocadas sobre

Uma vez gene completo, quer sob a forma de cADN ou de ADN cromossómico, pode ser, então, manipulado segundo diversos meios para proporcionar expressão. P_odem empregar-se hospedeiros Bacillus que incluem, por exemplo, bactérias alcalofílicas, incluindo os bacilos alcalofílicos que já produziam a protease de alcalinidade elevada. Um organismo hospedeiro preferencial é o Bacillus novo sp. PB92. P_or conseguinte, é conveniente manter a sequência tipo selvagem com sinais reguladores e com sequências guia de secreção etc., se bem que também se possam utilizar as regiões de regulação derivadas de outros bacilos que sejam funcionais na estirpe hospedeira de Bacillus. Assim, um vector adequado para a transformação de uma célula de Bacillus

inclui um gene estrutural que codifica para uma protease de alcalinidade elevada obtenível a partir de um Bacillus alcalofílico englobando regiões de regulação tais como uma sequência de promotor, uma sequência que constitui o local de ligação ribossónico e sequências gue controlam a terminação da transcrição e da translação do gue da protease alcalina, sendo as referidas regiões de controlo funcionais na célula hospedeira do B_acillus alcalofílico.

Além disso, o vector pode incluir o gene de marcação, por exemplo, para conferir resistência a um antibiótico ao qual a estirpe hospedeira é sensível, e uma origem de replicação que é capaz de se replicar de forma autónoma na célula hospedeira. A origem de replicação pode ser uma origem que possua uma mutação que terna o seu funcionamento sensível à temperatura na célula hospedeira, possibilitando assim a selecção para integração cromossómica conforme descrito por Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 1433.

P_ode utilizar-se a sêquência de ácidos aminados para projectar uma sonda para o rastreio de um cADN ou de uma biblioteca genómica preparada a partir de mARN ou de ADN de células com interesse como células dadoras de um gene de protease de alcalinidade elevada. Utilizando o cADN de protease de alcalinidade elevada ou um seu fragmento para uma sonda de hibridação, pode efectuar-se facilmente a clonagem dos genes estruturalmente seleccionados descobertos noutros organismos. É de particular interesse o isolamento de genes a partir de organismos que, expressam proteases de serina de alcalinidade elevada utilizando sondas oligonucleotídicas com base nas sequências nucleotídicas dos genes das proteases de serina de alcalinidade elevada obteníveis a partir de estirpes do Bacillus alcalofílicos, incluindo Bacillus novospecíes PB92.

T_ais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência completa mas deverão possuir

pelo menos 10, de preferência, pelo menos 15 e, mais preferencialmente 20 oligonucleotidos de comprimento. T_ambém são úteis oligonucleôtidos mais extensos, até ao comprimento total do gene, de preferência de não mais do que 1200 nutleótidos em extensão. P_odem utilizar-se tanto sondas ARN como de ADN.

Na prática, as sondas são usualmente marcadas de um modo detectável (por exemplo, com ^ozp. H, biotina ou avidina) e são incubadas com ADN ou com ARN de cadeia simples do organismo no qual se pesquisa o gene. Detecta-se a hibridação por meio da marca, após ter-se separado (usualmente utilizando papel cie nitrocelulose). 0 ADN (ou ADN/ARN) (hibrido) de cadeia simples e dupla. As técnicas adequadas de hibridização a serem utilizadas com oligonucleôtidos são bem connecidos pelos especialistas.

Apesar de se utilizarem normalmente as sondas com uma marca detectável que permite urna fácil identificação, os oligonucleôtidos não marcados também são úteis como precursores de sondas marcadas e para uso em procedimentos que proporcionam a detecção directa de ADN (ou ADN/ARN) de cadeia dupla. D_este modo, a expressão sonda, oligonucleótidica refere-se tanto às formas marcadas como às não marcadas. Utiliza-se então a mistura de ligação para transformar as células competentes do B. subtilis. Utilizando o gene de marcação cora um meio de selecção, podem então isolar-se e caracterizar-se os plasmídeos recombinantes por análise de restrição e por sequenciação.

Para a produção de protease de alcalinidade elevada, uma sequência de ADN preferida para se utilizar na transformação de estirpes de Bacillus que já produzem protease de serina e uma sequência que proveniente de Bacillus novo species PB92. A sequência aminoácida de serina protease codifica pela sequência de ADN é a seguinte:

H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-NG-H-G-T-Ii-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-í-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P—S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

Embora a estirpe preferida para proporcionar o gene da serina protease seja o Bacillus novo species PB92, pode obter-se, essencialmente, a mesma serina protease a partir de outros bacilli alcalofílicos. Tais como genes de protease que possuem, pelo menos, cerca de 70/ e de preferência cerca de 80/ de homologia com a sequência aminoácida do Bacillus PB92, devem considerar-se englobados no âmbito da presente invenção. E desejável que 0 produto de expressão seja segregado. Desde que a protease alcalina seja segregada, podem utilizar-se os sinais liders de secreção primitiva e os sinais de processamento. Para além disso, pode preparar-se um gene de fusão proporcionando uma sequência 5' ao gene estrutural que codifica um lider de secreção e um sinal de processamento.

Exemplos de liders de secreção heterólogos incluem os liders de secreção dos genes da amilase e da protease do Bacillus. Por fusão do lider de secreção com 0 gene estrutural de interesse, num aparelho preparado de forma adequada, pode segregar-se a protease alcalofílica completa, no meio de cultura.

A sequência de expressão pode ser to tal ou parcialmente derivada de fontes naturais e ou parcia ou completamente derivada de partes homologas da célula hos pedeira ou heterólogas da célula hospedeira.

purificaram-se, ou sintetizaram-se e, como tal não surgiram naturalmente as diversas construções de ADN (sequências de ADN, vectores, plasmidos, sequências de expressão) da presente invenção.

Pode incluir-se ou não um sistema de replicação para o Bacillus, dependêndo de se pretender a integração do gene estrutural dentro do cromossoma da estirpe hospedeira ou de se desejar a manutenção, num elemento extracromossómico.

Para integração, podem utilizar-se extensões de homologia na construção do plasmído com o genona do Bacillus para aumentar a probabilidade de recombinação. Para além disso, a inclusão na construção de plasmido de uma origem de replicação sensível â temperatura permite a selecção para integração cromossómica. Ver, por exemplo, Ehrlich, Proc. N_atl. Acad. Sbi.USA 75 (1978) 1433.

P_ode inserir-se mais do que uma cópia do gene estrutural, dentro da célula hospedeira, para amplificar a expressão do gene estrutural. Pode obter-se a amplificação de forma estável do gene estrutural por integração de, pelo menos, uma cópia adicional do gene estrutural dentro do genoma da célula hospedeira e e fectuando a selecção dos transformantes nos quais as cópias do gene estrutural estão separadas por sequências cromossómicas endógenas. Na Aplicação Europeia N2 EP-A-872OO356.1, cuja descoberta aqui se indica como referência, descrevem-se construções de ADN e métodos sistemas procarióticos.

Para além do sistema de replicação, existe pelo menos um gene indicador englobado na construção plasmídica. Por gene indicador compreende-se um gene estrutural capaz de se expressar num hospedeiro que proporciona resistência biocida ou vírica^ ou resistência aos metais pesados, imunidade, e similares. N_a resistência biocida, pode

incluir-se resistência aos antibióticos, por exemplo, neomicina, canamicina, tetraciclina, etc. 0 gene de marcação deverá ser escolhido para proporcionar, com um baixo número de cópias, uma selecção a uma concentração de antibióticos que não impeça, seriamente o desenvolvimento das células recombinantes. A resistência à neomicina é de especial interesse.

A_s diversas sequências de ADN podem ser derivadas de várias fontes e ligadas entre si para proporcionar um vector que inclui um ou mais locais de restrição convenientes, de preferência singulares, para permitir a inserção ou a substituição dos genes estruturais, nesses locais a fim de proporcionar a construção do plasmídeo.

Uma vez preparada a construção do plasmídeo, esta pode ser utilizada para a transformação de uma célula hospedeira adequada. 0 Badllus hospedeiro pode ser qualquer estirpe de Bacillus, contudo, na escolha de uma estirpe adequada devem ter-se em conta factores que possam melhorar a produção de proteases alcalinidade elevada. P_ode melhorar-se a produção segundo uma diversidade de procedimentos, que incluem a utilização de um hospedeiro no qual a degradação do produto desejado é reduzida, o reconhecimento dos sinais reguladores a facilidade de secreção, etc.. Assim, enquanto um Bacillus hospedeiro preferido é um produtor de protease de alcalinidade elevada, seja um Bacillus de tipo selvagem, seja um Bacillus mutante, o Bacillus hospedeiro também pode ser um mutante produtor de protease de alcalinidade elevada que não produz protease de alcalinidade elevada.

Os bacilos que produzem protease de alcalinidade elevada não estão bem classificados taxonòmicamente e faz-se-lhes referência, geralmente, como estirpes de Bacillus alcalofílicos. E_xemplos de estirpes de Bacillus susceptíveis de se desenvolverem a pH alcalino são descritos,

por exemplo, na Patente dos Estados l^idos N2s 3 723 250; Re 30 602 e 4 480 037. Num exemplo de uma estirpe hospedeira de Bacillus alcalofílica a que se da preferência é a estirpe Bacillus novo species PB92 descrita, entre outras, na Patente dos Estados Unidos NQ Re 30 602.

Também se podem utilizar como células hospedeiras as estirpes industriais do Bacillus alcalofílico. A_s estirpes industriais de Bacillus são originárias de organismos que podem isolar-se no solo ou se encontram disponíveis a partir de depositários ou de outras fontes e são obtidas por modificação genética de tais estirpes de Bacillus. A estirpes industriais de Bacillus caracterizam-se pela sua resistência à permuta genética, como seja a infecção por bacteriófagos ou à transformação. A_s estirpes são estáveis e podem ser ou não capazes de formar esporos. São, usualmente, protróficas e são modificadas para proporcionar rendimentos elevados de produtos proteicos endógenos, tais como as enzimas alfa-amilase e diversas proteases. 0 rendimento de produto proteico endógeno que se obtem num processo de produção industrial pode atingir a, pelo menos, 5g/l (0,5 % p/v). As estirpes industriais também segregam DNases, de que resulta a degradação de ADN no meio, proporcionando protecção contra a permuta genética.

A transformação de estirpes de Bacillus alcalofílico envolverá, de preferencia, a utilização de protoplastos a partir das referidas estirpes. Contudo, o protocolo de transformação de protoplastos convencional, conforme descrito por Cohen e outras, supra, não se aplica às estirpes de Bacillus alcalofílico. P_or conseguinte, foi necessário desenvolver protocolos adicionais.

Para os bacilos alcalofílicos, a formação e regeneração dos protoplastos pode ocorrer a pH elevado, de preferência a pH 8, aproximadamente. P_odem preparar-se os protoplastos por nova suspensão das células num meio de

fixação alcalino (MFA) de pH 7,8 a 8,5# e incubando depois as células durante 30 a 80 minutos a 37°C. Para um exemplo de um MFA, ver Exemplo 5. Lavaram-se então os protoplastos resultantes para remover a lizozima, e, então efectua-se nova suspensão em MFA. Combinam-se então a construção plasmídica e o protoplasto do B^cillus alcalofílico hospeceiro na presença de um agente de fusão adequado. Embora se possa empregar qualquer agente de fusão que proporcione a eficiência desejada, verificou-se que, para a maioria, o polietileno-glicol (mw 1000-8000) proporciona uma fusão altamente eficaz com grande vantagem. Mistura-se os protoplastos preparados a partir da estirpe receptora do Baçillus com a construção plasmídica durante não mais do que 5 minutos, de preferência por um período não superior a 2 minutos na presença de polietileno-glicol. Substituiu-se, então a mistura de fusão por um meio nutriente convencional no qual se incubam as células durante um i -máximo de 5 horas, de preferência 2 a 3 horas, antes de se transferirem para as placas de regeneração. A_s placas de regeneração contém um antibiótico, por exemplo neomícina, para a selecção dos transformantes.

Podem identificar-se os clones com manutenção epissónica da construção de ADN através da detecção da expressão da protease de serina de alcalinidase elevada. Para identificar os clones gue contém a construção de expressão como uma parte integral dos seus cromossomas, efectua-se o o rastreio dos clones que se desenvolveram, isolamento do ADN celular total e a selecção desses clones nos quais não se podem detectar ADN plasmídico livre, mas nos quais se expressa o gene marcador do plasmídio. Em seguida, pode efectuar-se, de forma adequada, o rastreio dos clones, para detecção da expressão da protease de serina de alcalinidade elevada.

Podem empregar-se diversas técnicas de detecção, incluindo a utilização de anticorpos específicos

a hibridização de ADN ou de ARN, a formação do produto enzimático ou desaparecimento do substrato de enzima, para efectuar o rastreio dos clones para determinar a presença da construção de expressão e a expressão do gene estrutural.de interesse, nomeadamente a produção de protease. Pode caracterizar-se bioquimicamente a protease produzida, por exemplo, pela determinação do peso molecular da protease por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, por electroforese em gel de histidina/MOPS e por determinação dos parâmetros cinéticos Km e V , medidos no substrato sintético succinilmax

-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenilalanil-jo-nitro-analida.

Promove-se o crescimento do Bacillus hospedeiro, que contem a construção d; expressão integrada no epissoma ou no cromossoma, num meio nutriente sob condições que favorecem a síntese enzimática. 0 meio nutriente inclui, habitualmente, um meio de conservação do plasmídeo. como seja a presença de um antibiótico ao qual o hospedeiro não transformado é sensível. P_ode continuar-se a fermentação até exaustão do caldo de cultura. Quando o produto é segregado, o referido produto deve ser isolado a partir do caldo de cultura segundo técnicas convencionais, por exemplo, por extracção, por cromatografia, por electroforese, ou similares. Quando o produto fica retido no citoplasma, devem recolher-se as células por centrifugação, filtração, etc., efectua-se a lise por cortes mecânicos, por detergentes por lisozima ou por outras técnicas e isolar-se o produto conforme previamente descrito. Quando a célula hospedeira não transformada por um produtor de protease de alcalinidade elevada, podem conseguir-se empregando o método, exposto, grandes acres· cimos no rendimento de protease de serina de alcalinidade elevada, habitualmente pelo menos cerca dc 120% em comparação com a produção das células hospedeiras não transformadas, com uma única cópia do gene extracromossómico.

Os exemplos seguintes apresentam-se a título ilustrativo e não a título de limitação.

PARTE EXPERIMENTAL

Exemplo 1

Pr-eparacão de uma biblioteca, de ADN qenómico a partir do Bacillus de Serina Alçalofilico novo sp. PB92 e Isolamento do Gene de Protease

Efectuou-se a digestão parcial do ADN cromossómico isolado a partir do Bacillus novo sp. PB92 (depositado sob o NQ OR-6O no Laboratorium voor Microbiologie, Universidade Técnica de Delft, Paises Baixos, ver Patente dos Estados U_nidos N^s Re 30 602) de acordo com o procedimento descrito por Saito-Miuva, Biochim. Biophys. Acta 72 (1963) 619-632, com a enzima de restrição Sau3A e ligou-se no local BamHI do plasmídeo pUBUO (Gryczan e outros, -T. Bacteriol. 134 (1978) 318-329). P_reparou-se o ADN plasmídico de pUBUO conforme descrito por Birnboim e Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523).

Transformou-se a mistura de ligação em 5.· subtilis 1A40 (Bacillus Genetic Stock C_entre) de acordo com o método de Spizizen e outros, J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746, utilizando 0,6-1 _zug de ADN por ml de células competentes. Colocaram-se as células obtidas a partir da mistura de transformação, em placas mínimas contendo : K₂HP0^, a 2,8%, KH₂PO₄ a 1,2%, (NH^) ₂ ^SO4 ^a citrato trissódico

2H₂O a 0,2%, MgSO₄.7H₂O a 0,4%, MnS0₄.4H₉0 a 0,00005%, ácido L-glutâmico a 0,4%, glucose a 0,5%, ácidoscasamínicos a 0,02%, 50 -ug/ml de triptofano, 20 jag/ml de metionina, 20_zug/ml de lisina, 20 _zug/ml de neomicina, caseina a 0,4% e água a 1,5%. Após incubação das placas a 37°C durante a noite, uma de entre 50 000 colónias resistentes à neomicina apresentou um acréscimo na produção de protease, conforme se determinou pelo acréscimo de precipitação de um halo de produtos de cisão de caseina em redor da colónia na placa de agar. A partir desta colónia isolou-se o ADN plasmídico de

.s' acordo com ο método descrito por Birnboim e Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523, e que se designou por pM58.

Exemplo 2

Expressão do Gene da Protease de Serina de PB32

Cultivou-se Bacillus subtilis 1A40, concendo pM58 em meio mínimo (Spizizen e outros, Pr^oc· Natl. Acad. Sei. USA 44 (1958) 1072-1078) ao qual se tiritam adicionado ácidos casamínicos a 0,02%, 50 /ug/ml de triptofano, 2o Aig/ml de metiomina, 2 ug/ml de lisina e 20 _xug/ml de neomicina. Após 24 horas, centrifugou-se a cultura e analisou-se a actividade do sobrenadante da protease utilizando dimetil-caseína como substrato (Lin e outros, J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. Uma cultura de B. subtilis 1A40 contendo o plasmido pUBUO, gue se utilizou como uma comparação, apresentou menos do que 1/gO da actividade da protease apresentada pela cultura transformada por pM58. A actividade da protease foi completamente inibida por tratamento com fluoreto de fenilsulfonilo (PMSF) 1 mM, mas não pelo tratamento com SDTA 20 mM.

Analisaram-se aliquotas dos sobrenadantes referidos antes sobre gel de proteína, de acordo com o método de Laemmli, N_ature 227 (1970) 68D. P_repararam-se as amostras, para análise sobre estes geis, por tratamento dos sobrenadantes com ácido tricloroacético a 5% (TCA). Após centrifugação da amostra, lavou-se o agregado de proteína precipitada duas vezes com acetona, depois dissolveu-se em 40/|ILde tampão de amostra (Tris/HCl 0,5 M pH 7,5, 2-mercapto-etanol a 10% v/v, glicerol a 50% v/v e Azul de Bromo-fenol a 0,05%) por ebulição durante 10 minutos. Após electroforese, coraram-se os geis utilizando Azul Brilhante de Coomassie. Analisaram-se em seguida por electroforese as amostras dos sobrenadantes da cultura. Utilizaram-se três estirpes diferentes do B. sútilis 1A40 : uma estirpe contendo

pUBUO; ou pM58; ou sem plasmídeo; e protease de Bacillus PB92 como comparação. Após electroforese coraram-se os geis utilizando Azul Brilhante comassie e descoloraram-se. A amostra a partir de estirpe 1A4O do B. subtilis contendo pM58, continha uma proteína de 31 kD, que migrou conjunta mente com a protease de Bacillus PB92.

Não se detectou esta proteína na pista de comparação da estirpe B. subtilis

1A40 contendo pUBUO.

Todas as proteínas de serina possuem pesos moleculares semelhantes. Por conseguinte, a protease de serina de clonagem do Bacillus PB92 diferenciou-se das proteases de serina conhecidas (subtilisina de B. subtilis, subtilisina de Carlsberg) pela transformação de pM58 e de pUBUO na estirpe DB104 de B. subtilis negativa em relação a protease (R. Doí, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) e por análise das proteases extracelulares produzidas. Cultivaram-se os transformantes obtidos em meio mínimo (Spizizen e outros, supra) contendo ácidos casamínicos a 0,02%, 50 jig/ /ml de histidina e 20 /íg/ml de neomícina.

Após 24 horas, colheram-se amostras, centrifugaram-se e analisaram-se sem tratamento prévio sobre geis de histidina/MOPS contendo KOH 75 mM, histidina 40 mM, MOPS (ácido 3-(N-morfolino)-propano-sulfónico) 10 mM pH

7,5 e poliacrilamida a 5%. 0 tampão de electroforese continha 40 mM e MOPS 100 mM a pH 6,6. A_s amostras migraram em direcção ao cátodo. D_etectasa®-se as bandas de protease com película profissional Agfa Pan 100 (Zuidweg e outros), Biotechnol. e Bfoengin. 14 (1972) 685-714). Apresentam-se estes resultados na Figura 1. Conforme se mostra, o pM58 contém o gene que codifica para a protease de Bacillus PB92.

Exemplo 3

5_fiquenciação do Gene da P_rptease. _de .Serina do Bacillus PB92

Determinou-se, segundo o método de F.

S_anger, P_roc. N_atl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463, a sequência completa do fragmento Ball-Hpal do pM58. Efectuou-se a clonagem dos fragmentos de restrição do pM58 (ver Figura 2) nos vectores mplO, mpll e mpl8 do bacteriófago M13 (Messing e outros, Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321.

Efectuou-se o rastreio das inserções dos fragmentos do pM58 por hibridação em placa. Após sequênciação, obtiveram-se dez nucleótidos localizados no gene a distâncias regulares e repetiu-se a sequênciação, o que confirma a sequência apresentada na Figura 3.

Exemplo 4

Construção do Piasmídio pMAX-4 que contém Protease.de Serina

Para se construir o plasmídeo pUCN710 (Figura 4A), efectuou-se a digestão de pUBUO com TagI e PvuII. P_urificou-se em agarose de baixo ponto de fusão o fragmento que contém o gene que confere resistência à neomicina e alinharam-se as extremidades com polimerase de Klenow e NTP¹s (Maniatis, Molecular Cioning: A Laboratory Manual. Col Spring Harbor 1982). Linearizou-se o plasmídeo pUC7 (Vieira e outros, Gene 19 (1982) 259-268) com Sal I e alinharam-se as extremidades conforme descrito antes. Ligaramse ambos os fragmentos com ligase T4 (Maniatis) e transformou-se em E. coli. JM103. A selecção efectuou-se em placas de 2xTY (Bacto-trypton, a 1, 6% p/v, extracto de levedura a 1% p/v, NaCl) a 0,5% contendo 50 /ug/ml de ampicilina e 10 ,ug/ml de neomicina. Efectuou-se a digestão do plasmídeo resultante, que foi designado por pUCN710, com BamHI. Efectuou-se a digestão do plasmídeo pE194 (Jordanescu, Piasmid 1_ (1978) 468-479) com BclI. Ligaram-sc os fragmentos das duas digestões com ligase T4 e transformaram-sc em B. subtilis 1A40. Efectuou-sc a selecção em placas mínimas contendo 20 /ug/ml de neomicina (ver Exemplo 1).

Ο plasmídeo obtido, pE194-neo (Figura 4), contém o gene da neomícina. Efectuou-se a subclonagem do gene da protease no vector de integração pH194-neo, conforme se segue; efectuou-se a digestão de pM58 (ver Exemplo 1) com Hpal, Bali e BglII. Efectuou-se a digestão do plasmídeo pE194-neo com Hpa I. Ligaram-se estes fragmentos com ligase T4 e transformaram-se em B. subtilis 1A40. S_eleccionaram-se os transformantes com base na resistência à neomícina e num acréscimo de prddução de protease, conforme verificado pela precipitação dos produtos de cisão da caseína (formação do halo, ver E_xemplo 1). Obteve-sc o plasmido pMAX-4, cuja estrutura se confirmou por análise com enzimas de restrição (ver Figura 4B).

Exemplo 5

Transformação de Protoplastos da Estirpe P392 de Bacillus por pMAX-4

Cultivou-se durante a noite a estirpe PB92 de Bacillus, em 100 ml de meio NBSG-X (Thorne e outros, J. Bacteriol. 91 (1966) 1012-10 20). Centrifugou-se a cultura durante 10 minutos a 4500 r.p.m. num rotor Sorvall modelo GSA. P_repararam-se protoplastos por incubação dos bacilos durante uma hora a 37°C em 10 ml de Meio de Fixação Alcalino (AHM) (Alcaline Holding Médium) contendo sucrose 0,5 M MgCl₂ 0,02 M e Tris/maleato 0,02 M a pH 8,0 em água esterilizada à qual se adicionou C, 4 mg/ml de lizozima. Agregaram-se os protoplastos (10 minutos a 4500 rpm), efectuou-se nova suspensão em 5 ml de tampão (AHM a pH 8,0 (tampão AHM ao qual se adicionou Bacto Penassay Broth a 3,5% p/v e Albumina Merieux a 0,04% p/v), misturou-se e efectuou-se em seguida nova agregação conforme descrito antes. Após nona suspensão em 5,0 ml de meio de fixação alcalino, misturaram-se 0,5 ml desta suspensão de protoplastos com 5 de água desmineralizada contendo 1 _zug do ADN plasmídico e incubou-se durante 2 minutos na presença de

polietilenoglicol 8000 a 30% p/v a pH 8,0. Após diluição de 1 s 3 com meio AHM⁺ a pH 8,0 e centrifugação, efectuou-se nova suspensão do agregado num pequeno volume (1 ml) de AHM e incubou-se durante 2 a 3 horas. Colocaram-se alíquotas de 100 microlitros em placas de regeneração, recentemente preparadas, contendo succinato de Na / HC1 0,5 M a pl!

8,0, agar a 1,5% p/v, ácidos casamínicos a 0,5 % p/v, extractr de levedura a 0,5% p/v, tampão fosfato 0,031M a pH 8,0, glucose a 0,5% p/v MgCl₂ 0,02 M e Albumina Merieux a 0,0 2% p/v. Estas placas cambem continham 1000 ;ug/ml de neomicina para selecção. Após incubação a 37° C durante, pelo menos, horas, as colónias dispuseram-se, por replicação, sobre as placas de agar com infusão de coração que continham 20 _zug/ /ml de neomicina.

Ekeroplo 6

Integracão_._do pMAX-4 no Cromossoma da Estirpe PB92 de Bacillus

Inoculou-se uma colónia da estirpe

PB92 de Bacillus contendo pMAX-4, cultivada numa placa com infusão de coração contendo 20 _zug/ml de neomicina, em 100 ml de Tryptone Soya Broth (TSB) contendo 1 _xug/ml de neomicina e incubou-se durante 24 horas a 37°C. Diluiram-se duas porções de 2 ml da cultura (aproximadamente 10⁹ celulas/ml) em 100 ml de mesmo meio, contendo 1 _xug/ml de neomicina, e incubou-se durante 24 horas a 50°C. Após 24 horas, diluiram-se novamente 5 ml de cultura (aproximadamente 10^ células/ /ml), conforme descrito antes e incubou-se durante 24 horas a 50°C na presença de 1 _zug/ml de neomicina. Repetiu-se mais uma vez o último procedimento. Então, diluiu-se a suspensão celular aem vezes a colocou-se em placas de agar (Difco) com Infusão de coração (HI) contendo 1 _xug/ml de neomicina. Incubaram-se as placas durante 16 horas a 50°C. Isolaram-se as colónias resistentes a neomicina e cultivaram-se em 1C ml de meio TSB contendo 1 _zug/ml de neomicina, durante 16 horas

a 37°C. A partir destas culturas, isolou-se o ADN total (Holmes e ;outros, Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197) e investigou-se a ausência do plasmídeo por electroforese do ADN em gel de agarose. Voltaram a examinar-cc por transformação do ADN total em B. subtilis 1A40 as amostras nas quais não se detecuou ADN plasmídico. As amostras que não possuíam a capacidade para transformar o B. subtilis 1A40 consideraram-se isentas de plasmíde. foi designada por PBT109. Uma estirpe derivada do Bacillus PB92 resistente à neomicina e isenta de plasmídeo. Egtas estirpes continha uma cópia do plasmídeo pMAK-4 integrada no seu cromossoma.

Efectuou-se a integração na estirpe PBT109 através do chamado mecanismo tipo C_ampbell porrecombinação homologa resultando dois genes de protease localizados de forma sucessiva no cromossoma separados por sequências plasmídicas. Confirmou-se esta organização genética da estirpe PB1O9 conforme se apresenta na EPA- O 000 000, que aguarda despacho e cujo pedido foi apresentado conjuntamente com este, cuja descrição aqui se indica como referência.

Exemplo 7

Produção de Protease das Estirpes Transformadas

Investigou-se a produção de protease das estirpes transformadas por adição de 0, 2 ml de uma cultura TBS contendo aproximadamente 10 células/ml a balões de Erlenmayer de 500 ml contendo 100 ml do meio de produção descrito na Patente dos Egtados Unidos Ne Re. 30 602 quando se ensaiaram as estirpes B. subtilis, ajustou-se, no entanto, o pH para pH 7.0. Adicionou-se neomicina a uma concentração de 20 _zug/ml, para as estirpes DB104 (pUBllo), DB104 (pMAX-4) PB92 (pMAX-4) e numa concentração de 1 _zug/ml para PBT109. A produção relativa de protease para estes linhas de células é apresentada no Quadro 1.

Tabela 1

Produção de Protease nos bacilos transformados

Estirpe	P_rodução relativa de Protease MS*	Adição de Neomicina
Bacillus PB92	100.0%	-
Bacillus PB92 (pMAX-4)	120.0%	+
Bacillus PBT109	120.0%	+
B. subtilis DB104 (pUBllO)*	1.5%	+
B. subtilis DB104 (pMAX-4)	10.0%	+ —-....... .^1 .. .......... .4

* Para medir a produção de protease a partir do gene de protease apenas do pMAX-4, também se transformou este plasmídeo (Spizizen e outros (1961) supra) na estirpe DB104 do B. subtilis negativo em relação exoprotease (R. Doi, J. Baeteriol. 160 (1984) 442-444), as conforme descrito no Exemplo 2,

Mau Analizou-se a actividade da protease utilizando dimetilcaseina como substrato, conforme descrito por Lin e outros J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793.

Em fermentações em maior escala (10 litros), O Bacillus PB92 (pMAX-4) apresentou instabilidade e um decréscimo de produção em comparação com ο PBT109, se não se adicionar neomicina ao meio de fermentação.

Como base nos resultados anteriores, á evidente que se proporciona um procedimento simples e eficiente para produzir protease de serina mediante a introdução de forma estável, de um gene homólogo ou heterólcgo, que

do cromossoma

T_ambém se proporciona a hospedeiro que codifica para a protease de serina no interior de estirpes industriais de Bacillus. acréscimo de produção de protease num Bacillus já produz protease de serina. A integração de construções plasmídicas no interior dos cromossomas da célula hospedeira origina uma situação mais estável para fermentações de produção e um grande acréscimo na produção de protease do que quando estão presentes construções plasmídicas extracromossómicas.

Todas as publicações e Pedidos de Patente mencionados nesta especificação indicam o grau de especialização dos especialistas a quem pertence a presente invenção.

as publicações e que teriam se se tente individual

Indicam-se aqui como referência todas pedidos de Patente como o mesmo alcance indicasse cada publicação ou pedido de pae especificamente, como referência.

Uma vez que a presente invenção se encontra completamente descrita, será evidente para o especialista que nela se podem efectuar numerosas alterações e modificações sem fugir ao espírito ou âmbito das reivindicações em anexo.

Claims

Processo para a produção de uma protease de serina numa célula de um hospedeiro Bacillus alcalofllico, caracterizado por:

introduzir-se na referida célula hospedeira um bloco integrado de expressão que inclui, na direcção de transcrição, | uma região reguladora do início de tradução e de transcrição; uma sequência de ADN que codifica para uma protease de serina; uma região reguladora do fim de tradução e de transcrição, em que as referidas regiões reguladoras são funcionais na referida célula hospedeira; e um gene marcador de selecção para seleccionar as células hospedeiras transformadas;

cultivarem-se as células hospedeiras transformadas referidas que incluem o referido bloco integrado de expressão sob condições selectivas pelo que se obtem uma cultura transformada substancialmente isenta de células progenitoras não transformadas; e incubar-se a referida cultura transformada num meio nutriente pelo que a referida protease serina é produzida em excesso.

- P_rocesso de acordo com a reivindicação

1, caracterizado por a referida célula hospedeira ser produtora de protease de serina do tipo selvagem.

- 3â • Processo de acordo com a reivindicação — 1, caracterizado por a referida célula hospedeira ser um mutante de um produtor de protease de serina do tipo selvagem.

_ 4« _

P_rocesso de acordo com a reivindicação

3, caracterizado por o referido mutante não ser um produtor de protease de serina.

Processo de acordo com a reivindicação
2, caracterizado por a referida estirpe alcalofílica ser Bacillus novo species PB92.

- 6δ Processo para a transformação de células de Bacillus alcalofílico caracterizado por tratarem-se previamente as referidas células de Bacillus com lisozima num meio alcalino a uma temperatura compreenO o dida entre cerca de 20 C e cerca de 37 C para formar protoplastos;

separarem-se os referidos protoplastos da referida lisozima;

combinarem-se os referidos protoplastos com uma construção de ADN na presença de um fusogénio a uma temperatura compreendida entre 20°C e cerca de 37°C;

diluir-se o referido fusogénio e regenarem-se as referidas células de Bacillus; e cultivarem-se as referidas células de Bacillus regeneradas sob condições selectivas.

- 7® Processo de acordo com a reivindicação
6, caracterizado por a referida construção de ADN incluir, na direcção de transcrição, uma região reguladora do início da tradução e da transcrição; uma sequência de ADN que codifica para um polipeptídeo de interesse; e uma região reguladora do fim da tradução e da transcrição, sendo as referidas regiões reguladoras funcionais nas referidas células hospedeiras.

- 8® P_rocesso para aumentar a produção de um polipeptídeo de interesse numa célula hospedeira de uma estirP^e de Bacillus alceiofílica, caracterizado por:

combi.nar-se, na presença de um fusogénio a um pH alcalino, um protoplasto da referida célula hospedeira e uma construção plasmídica que inclui uma sequência de ADN que codifica para uma enzima endógena à referida célula hospedeira, um sistema de replicação funcional na referida célula hospedeira e um gene marcador de relação, incorporando-se o referido ADN na referida célula hospedeira;

seleccionarem-se as referidas células hospedeiras que contém o referido ADN; e cultivarem-se as referidas células hospedeiras sob condições que favorecem a síntese do referido polipeptídeo de interesse:

_ gs _

Processo de acordo com a reivindicação
8, caracterizado por a referida célula hospedeira ser Bacillus novo species PB92.

- 10* Processo de acordo com qualquer das reivindicações 8 ou 9, caracterizado por a enzima endógena ser uma protease de serina de preferência uma protease de alcalinidade elevada.

- llê uma das reivindicações de nos uma cópia do referido célula hospedeira.

Processo de acordo com qualquer

8 a 10, caracterizado por pelo rae-

ADN ser incorporada na referida

- 12* Processo de acordo cora as reivindicações anteriores caracterizado por a sequência de ADI codificar para uma polipeptideo que tem substancialmente a seguinte sequência de aminoácidos:

ÍÍ2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-NG-H-G-T-íi-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-tl-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P^Í-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-LI-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-^rl -L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-5-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COO^T.I .

Processo de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por a sequência de ADN que codifica a protease de serina ser originária de Bacillus novo species PB92.

- 143 _

Processo para se obter uma célula hospedeira de Bacillus caracterizado por isolar-se um fragmento de ADN que inclui um gene que codifica para uma protease de serina susceptível de expressão na referida célula hospedeira:

ligar-se o referido fragmento de ADN ao ADN de vector linear para produzir um vector que inclui o gene referido e um marcador para selecções;

combinar-se um protoplasto preparado a partir de uma célula hospedeira com o referido vector na presença de um fusogénio a um pH alcalino, introduzindo-se o referido gene na referida célula hospedeira e integrando-se no cromossoma da referida célula hospedeira;

e seleccionarem-se as células hospedeiras que contém de forma estável o referido gene.

- 15§ Processo de acordo com a reivindicação

14, caracterizado por o referido Bacillus ser Bacillus novo species PB92.

16*

I^ocesso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido vector ser pMAX-4.

- 172 _

P_rocesso para a preparação de oligonucleótidos de ADN ou de ARN úteis, como sondas de hibridação caracterizado por se ligarem pelo menos 15 nucleótidos sequenciais seleecionados de um nucleótido susceptlvel de hibridar com uma sequência que codifica para uma sequência de ácidos aminados de uma protease de serina de elevada alcalinidade obtida a partir de Baçillus novo species PB92.

-18* -

P_rocesso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o oligonucleótido incluir uma marcação radioactiva.

-19* -

P_rocesso de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado por o oligonucleótido incluir pelo menos 20 nucleótidos sequenciais.

-20* -

P_rocesso para a preparação de um bloco integrado de expressão, segundo o qual são integradas, na direcção de transcrição, uma região reguladora de transcrição e uma região de início de tradução funcional numa célula hospedeira de Bacillus, uma sequência de ADN que codifica para uma enzima proteolítica de alcalinidade elevada e regiões de fim de transcrição e de tradução funcionais na referida célula hospedeira, caracterizado por a expressão da referida sequência de ADN estar sob regulação das referidas regiões de início e de fim; e integrar-se igualmente pelo menos urn gene de marcação e uma origem de replicação de um plasmídeo bacteri-ano sensível à temperatura.

- 21â P_rocesso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a enzima proteolítica referida ser obtida a partir de uma estirpe de Bacillus alcalofílica, species PB92.

- 22ã -

P_rocesso de acordo com a reivindicação

20, caracterizado por a referida sequência de ADN ter pelo menos 70% de homologia na sequência nucleotídica com um gene que codifica para uma enzima proteolítica de Bacillus novo species PB92.

- 23â -

P_rocesso de acordo com a reivindicação

20, caracterizado por a referida sequência de ADN codificar para um polipeptídeo que inclui subst ancialmente a seguinte sequência de ácidos aminados:

H2N-A-Q-S-V-P-'>7-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-L-D-T-G-I-S-T-M-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-NG-H-G-T-U-V-A-G-T-I-A-À-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-T-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-lJ-P-S-W-S-rf-V-O-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

- 24-â Processo para a preparação de uma célula hospedeira de Bacillus transformada, segundo a qual se integram um bloco integrado de expressão que contém, na direcção de transcrição, uma região reguladora de transcrição e uma região de início de tradução funcional na referida célula hospedeira, uma sequência de QDN que codifica para uma protease de serina de elevada alcalinidade e regiões reguladoras de fim de transcrição e tradução na referida célula hospedeira, caracterizado por a expressão da referida sequência de ADN estar sob regulação das referidas regiões de trans crição e de tradução; e integrar-se igualmente pelo menos um gene marcador e uma origem de replicação de um plasmídeo bacteriano sensível à temperatura.

- 25^ã Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por se integrarem pelo menos duas cópias da referida sequência de ADN no cromossoma da célula referida.

32 - 26^a Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a referida célula hospedeira ser uma célula produtora de protease de serãna do tipo selvagem transformada.

- 27^a Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizazado por a referida célula hospedeira ser uma estirpe mutante transformada de um produtor de protease de serina do tipo selvagem.

- 28^a P_r°^cesso de acordo

27, caracterizado por o referido mutante de protease de serina.

com a reivindicação não ser um produtor

- 29S Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a referida prote ase de serina de eleva da alcalinidade ser obtida a partir de Bacillus novo species PB92.