PT87536B - Processo para a preparacao de peptidos ciclicos anticoagulantes - Google Patents

Description

MERRELL DOW PHARMACEUTICALS INC,

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÊPTIDOS CÍOLIOOS ANTICOAGULANTES

ÂMBITO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos pêptidos cíclicos que são úteis como agentes anticoagulantes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os anticoagulantes são agentes terapêuticos úteis no tra tamento farmacológico de, por exemplo, trombose venosa aguda, em bolismo pulmunar, embolização arterial aguda das extremidades, enfarte do miocárdio e coagulação intravascular disseminada. Acre, dita-se que a administração profilática de anticoagulantes evita a repetição do embolismo em doentes com doenças cardíacas_yreumáticas ou artereoescleróticas e que evita algumas complicações tromboembólicas em cirurgia. A administração de anticoagulantes também tem sido prescrita no tratamento de doenças das artérias coronárias e doenças cerebrovasculares. A trombose arterial, par ticularmente nas artérias que alimentam o músculo cardíaco e o

cérebro, constitui uma das principais causas de morte.

A hirudina é um polipéptido com 65 radicais isolado a partir das glândulas salivares das sanguessugas. Trata-se de um agente anticoagulante o qual constitui um inibidor específico da trombina. Apesar de ser bastante poderoso, a utilização clínica de hirudina isolada a partir de extractos de sanguessugas parece ser inviável devido à sua quantidade limitada, ao preço e a reacções alérgicas que normalmente ocorrem após a administração de uma proteína estranha desta dimensão.

Os requerentes descobriram agora uma região específica da hirudina que é responsável, pelo menos parcialmente, pela sua actividade anticoagulante. Sintetizou-se quimicamente esta região e admite-se que alguns dos seus análogos cíclicos se ligam ao sítio de reconhecimento da trombina mas não ao sítio da clivagem enzimática o qual está espacialmente separado. A ligação de péptidos sintéticos competitivamente evita a ligação do fibrinogéneo ao sítio de reconhecimento da trombina, um pré-requisito para a produção da fibrina e para a formação de coágulos. Os pépti. dos da presente invenção possuem uma actividade anticoagulante significativa e a sua capacidade invulgar de se ligarem apenas ao. sítio de reconhecimento sem ligação ao sítio de clivagem da trombina pode proporcionar um suplemento cientificamente interes sante e terapeuticamente significativo para a terapia anticoagulante.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a derivados que possuem a fórmula estrutural ;

de hidrudina

CO — A₅ — A6-NR<

X-A1-A2-A3 - N(R-|)-C-R

R'-C-CO - Ae-A₉-A₁₀-Y

Alq,

Ala, na qual X representa um radical amino terminal escolhido entre um átomo de hidrogénio, 1 ou 2 grupos alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, 1 ou 2 grupos acilo de 2 a 10 át£ mos de carbono, um grupo carbobenziloxi, ou um grupo t-butiloxi-carbonilo;

Ag_ representa uma ligação ou representa um péptido que contém 1 a 5 radicais de qualquer aminoácido:

A2 representa Phe, SubPhe, $-(2- e 3-tienil)-alanina, f>-(2- e 3-furanil)-alanina, J$-(2-_a3- θ 4—piridil)-alanina ^-(benzotienil-2- e 3-il)-alanina, ^-(1- e 2-naftil)-ala nina, Tyr, ou Trp;

A^ representa Glu ou Asp;

representa Ile, Vai, Leu, Nle, ou Thr;

Αθ representa Pro, Hyp, 3,4-desidropro, tiazolidino-4-carboxilato, Sar, NMePgl, ou quaisquer aminoácidos que possuam a configuração D;

Aq representa qualquer aminoácido;

Ag representa um aminoácido lipofílico escolhido entre Tyr, Tyr(SO^H), Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, His, e Pro ou representa um dipéptido contendo pelo menos um destes aminoácidos lipofílicos;

A_1q representa uma ligação ou representa um fragmento péptídico contendo entre 1 e 5 radicais de qualquer aminoácido;

Y representa um radical carboxi terminal escolhido entre grupos OH, alcoxi C^-Οθ, amino, dialquil -amino ou monoalquil-ÇC^-C^)-amino substituído ou benzilamino;

R, R’, R-j_, e R^' representam, cada um, um átomo de hidro génio ou um grupo alquilo 0-^-0^;

B representa um grupo escolhido entre -S-, -S-S-, ou -S-Alq^-S-; e

Alq^, Alq£, e Alq^ representam, cada um, um grupo etileno ou metileno Cp-Cg-, e em que D e L indicam que a estereoquímica do átomo de carbo no indicado é a que corresponde à D-cisteína e L-cisteína, respec tivamente, e bem assim aos dímeros destes derivados peptídicos e às suas misturas e à utilização destes derivados peptídicos, díme ros e respectivas misturas como agentes anticoagulantes.

Em toda esta memória descritiva utilizam-se as seguintes abreviaturas comuns dos aminoácidos:

Gly - glicina Ala - alanina

Vai - valina

Leu - leucina

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Ile	- isoleucina
Pro	- prolina
Phe	- fenilalanina
Trp	- triptofano
Met	- metionina
Ser ·	- serina
Thr	- treonina
Cys	- cisteína
Tyr ·	- tirosina
Asn	- asparagina
Gin ·	- glutamina
Asp «	- ácido aspártico
Glu	- ácido glutâmico
Lys	- lisina
Arg -	- arginina
His -	- histidina

Nle - norleucina

Hyp - hidroxiprolina

,tr

3,4 - desidroPro—3,4-desidroprolina

Tyr - (SO^H) - sulfato de tirosina

Pgl - fenilglicina

NMePgl - N-metil-fenilglicina

Sar - sarcocina (N-metilglicina) pSubPhe - fenilalanina para-substituída

Subphe - fenilalanina orto, meta ou para, mono- ou di-subjs tituída

DAla - D-alanina

Ac - acetilo

Suc - succinilo pClPhe - para-cloro-fenilalanina pNC^Phe - para-nitro-fenilalanina

Pen - penicilamina Q3,j5-dimetilcisteína)

DCys - D-cisteína grupo alquilo e o radical alquilo de um grupo alcoxi significa grupos alquilo de cadeia linear, ramificada ou cíclicos, por exemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc.-butilo, pentilo, isopentilo, secrpentilo, ciclopentilo, hexilo, iso-hexilo, ciclo-hexilo e ciclopentilmetilo. Um grupo aci. lo de 2 a 10 átomos de carbono significa grupos acilo de cadeia linear, ramificada, cíclicos, saturados e insaturados possuindo um ou dois radicais carbonilo por exemplo, acetilo, benzoílo e succinilo. 0 termo grupo etileno ou metileno C^-Οθ refere-se a um gru po bivalente derivado de um grupo alquílico saturado ou insaturado, cíclico ou acíclico de 1 a 8 átomos de carbono por eliminação conceptual de 2 átomos de hidrogénio de um dos átomos de carbono ou de dois dos átomos de carbono adjacentes do grupo alquílico. Os exemplos de grupos etileno ou metileno C]_“Cg da presente invenção são o me-7-

tileno ou metilideno , etilideno (CH^CH<), 1-metiletilideno (CH^CÍCH^ X) , 1-metilpropilideno ou sec-butilideno (CH^CE^C (CHg)<),

2,2-dimetilpropilideno ou neopentilideno (CH^C(CH^)₂CH ), etileno ou dimetileno (-Ct^CE^-), metiletileno (-Cf^CEUCH^)-) , etiletileno (-CH₂CH(C₂Hj- )-), etenileno ou vinileno (-CH=CH-), 1,1-etenilideno (CH₂=C4), 1,1-ciclo-hexilideno (Ο^Η^θό), e 1,2-ciclopentilideno (Cj-HgX). Um grupo halogéneo significa um átomo de flúor cloro, bromo ou iodo.

termo qualquer aminoácido conforme utilizado nesta memória descritiva,engloba os aminoácidos que ocorrem naturalmente e bem assim os outros -aminoácidos não proteicos vulgarmente utilizados por especialistas na química dos péptidos quando se preparam compostos sintéticos análogos dos péptidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são glicina, alanina, valina, leu cina, isoleucina, serina, metionina, treonina, fenilalanina, tirosina triptofano, cisteína, prolina, histidina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, arginina, ornitina e lisina. Os exemplos de -aminoácidos não proteicos são norleucina, norvalina, aloisoleu cina, homoarginina, tiaprolina, desidroprolina, hidroxiprolina (Hyp), homos-serina, ciclohexilglicina (Chg), ácido -amino-n-butírico (Aba), ciclo-hexilalanina (Cha), ácido aminofenilbutírico (Pba), fenilalani. nas substituídas na posição para do radical fenilo com um grupo alqu_i lo C^-C^, alcoxi C^-C^, halogéneo, ou nitro, β-(2- e 3-tienil)-alanina, /3-(2- e 3-furanil )-alanina, β-(2-, 3- e 4-piridil)-alanina, B-(ben zotienil-2- e 3-il)-alanina, J3-(1- e 2-naftil )-alanina, derivados O-aJ. quilados de serina, treonina, ou tirosina, cisteína S-alquilada, o és.

ter O-sulfato de.

-8tirosina, 3,5-di-iodotirosina e os isómeros D dos aminoácidos que ocorrem naturalmente.

termo aminoácido lipofílico engloba Tyr, Tyr(SO^H),

Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, His, e Pro.

Os aminoácidos naturais, com a excepção da glicina, con têm um átomo de carbono quirálico. Salvo quando especificado de outro modo, os aminoácidos opticamente activos referidos nesta memória descritiva, consideram-se da configuração L. Por exemplo qualquer dos aminoácidos do grupo A^_ ou Α^θ pode estar na confi guração D ou L. Conforme é habitual, a estrutura dos péptidos descrita apresenta-se de modo que a extremidade amino fica do la do esquerdo da cadeia e a extremidade carboxi fica do lado direi, to da cadeia.

termo dímeros refere-se aos péptidos que resultam da ligação de dois péptidos lineares separados durante o passo de ciclização quer pelo processo topo a topo quer pelo processo de unir o topo de um com a parte final de outro. Ao efectuar-se a desejada ciclização interna através do grupo B, algum do mate rial peptídico linear de partida ligar-se-á com outro material peptídico linear de partida em vez de se ligar a ele próprio. 0 produto resultante constitui um dímero no sentido em que é formado por dois péptidos lineares de partida, mas não é um díme ro no sentido de que a fórmula molecular do dímero seja exactamente duas vezes a fórmula molecular do monómero. Um dímero de derivados peptídicos da presente invenção apresentará a seguinte fórmula estrutural :

CO-A5 — Ag

NRi'

X-A1-A2-A3 - níro-c-r i

Alk-i

I

B

I

Alk₂

ΙχY-Aw-Ag-As —CO-C-R'

R'-C-CO - A₈-A₉-A₁₀-Y I

Alk₂

I

B

I

Alki

NRf—A₆

R-C-N(Ri) -A3-A2-AJ-X

I

A₅— CO

Dimero Topo-Extremidade Final

CO

A₅ —Ae-NRf

X-Aí-A₂-A₅ - N(Ri)-C-R

I

Alki

I

B

I

Alki

Ιχ*

X-A_rA2-A₃ - NfR^-C-R

R'-C-CO-A₈-A₉-Aio-Y

I

Alk₂

I

B

I

Alk₂

R'-C-CO - A₈-A₉-A₁₀-Y

CO

A₅ Ae — NR<

Dimero Topo-a-Topo

-lOna qual os substituintes possuem a significação anteriormente definida para a estrutura 1. Ao longo desta memória descritiva, a referência aos derivados peptídicos engloba os dímeros e suas misturas salvo quando o contexto implique esp_e cificaçao diferente. Apesar de as misturas de monómeros e de dímeros resultantes da reacção de ciclização se poderem separar fácilmente por meios bem conhecidos pelos especialistas na matéria, é possível utilizar as misturas em composições an ti-trombóticas da presente invenção sem separação.

Os polipéptidos de fórmula geral 1 podem formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com quaisquer ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Os exemplos ilustrativos de ácidos inorgânicos que formam sais adequados são os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico e sais de metais ácidos tais como mono-hidrogeno ortofosfato de sódio e sulfato ácido de potássio. Os exemplos de ácidos orgânicos ilus trativos que formam sais adequados englobam os ácidos mono-, die tri-carboxílicos. São exemplos de tais ácidos, os ácidos acé tico, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzóico, hidroxibenzóico, fenilacético, cinâmi co, salicílico, 2-fenoxibenzóico e os ácidos sulfónicos tais co ao o ácido metano-sulfónico e o ácido 2-hidroxietano-sulfónico. Os sais do radical aminoácido de carboxi terminal englobam os sais de ácido carboxílico não tóxicos formados com bases inorgjâ nicas ou orgânicas adequadas. De modo ilustrativo esses sais en globam os de metais alcalinos, por exemplo, sódio e potássio; de metais alcalino-terrosos, tais como o cálcio e o magnésio; de

L

-11metais leves do grupo IIIA incluindo o alumínio; e de aminas primárias, secundárias e terciárias, nor exemplo, trialquila minas, incluindo trietilamina, procaína, dibenzilamina, 1-etenamina, N,Ν'-dibenziletilenodiamina, di-hidroabietilamina, N-alquil inferior-piperidina e de qualquer outra amina adequada.

Tal como sucede com quaisquer grupos genéricos de com postos químicos, alguns grupos são preferidos. Os requerentes preferem os derivados peptídicos de fórmula geral 1 na qual X representa um átomo de hidrogénio, ou um grupo acetilo ou suc cinilo.

Também são preferenciais os compostos de fórmula geral I na qual A^ representa -His-Asn-Asp-Gly-Asp-,

-Asn-Asp-Gly-Asp-,

-Asp-Gly-Asp-,

-Gly-Asp-,

Asp-, ou uma ligação ^2 representa de preferência Phe, J5-(2- ou 3-tienil)-alanina, Tyr, Trp ou pClPhe,;

A^ representa Glu;

A^ representa Ile;

Ag representa Pro, Sar, DAla, Hyp ou NMePgl;

Ag representa Glu ou Asp;

Αθ representa Tyr ou um fragmento dipeptídico em que pelo menos um radical é Tyr ou Tyr(SO^H);

ί

12Α^θ representa Leu, Asp, Asp-Glu, Leu-Gln, ou Leu-Pro;

Alq^ θ Alq£ representam, cada um, um grupo metileno;

Y representa um grupo OH ou NHp; e

B representa um grupo -S-S-.

São especialmente preferidos os derivados peptídicos de fórmula geral 1 na qual X representa um grupo acetilo e Arepresenta Gly-Asp ou Asp, ou X representa um grupo succinilo e A^ representa uma ligação e em que

A 2 representa Phe, 3-(2-tienil)-alanina ou Tyr;

A^ representa Glu;

A^ representa Ile;

Ag representa Pro;

Ag representa Glu ou Asp;

A^ representa Tyr ou Ala-Tyr;

A_1q representa Gin, Asp, Leu-Pro, uma ligação, -Leu-Glnou -Asp-Glu;

R, R', Rj, e R'^ representam, cada um, um átomo de hidro génio;

Alq^ e Alq2 representam, cada um, um grupo metileno;

B representa um grupo -S-S-; e

Y representa um grupo OH.

-13Os pêptidos da presente invenção podem ser preparados de acordo com uma diversidade de procedimentos conhecidos pelos especialistas na matéria. Tais procedimentos englobam a síntese de blocos e sequencial em fase sólida, a clonagem de genes e a combinação destas técnicas. 0 procedimento sequencial em fase sólida pode efectuar-se utilizando métodos automatizados normalizados tais como os que se praticam num sintetizador automático de pêptidos. Neste procedimento liga-se um aminoácido de radical -amino protegido a um suporte de resina. 0 suporte de resina utilizado pode ser qualquer resina adequada utiliza, da convencionalmente na especialidade para a preparação de polipéptidos por técnica sequencial em fase sólida, de preferência poliestireno que tenha sido submetido a reticulação com cerca de 0,5 a 3% de divinil-benzeno, o qual haja sido clorometilado ou hidroximetilado pa ra proporcionar locais para a formação de ésteres com o aminoácido de radical -amino protegido inicialmente introduzido.

Um exemplo de resina de hidroximetilo foi descrito por Bodanszk^ e outros., Chem. Ind. (London) 38 , (1966) p. 1597-98 . Encontra-se comercialmente disponível uma resina clorometilada, nos Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia, e a preparação de tal resina foi descrita por Stewart e outros, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman Co., San Francisco 1969), capítulo 1, p. 1-6. 0 aminoácido protegido pode ser ligado à resina pelo procedimento de Gisin, Hely. Chem. Acta¹ 56, (1973) p. 1476. Encontram-se comercialmente disponíveis diversos aminoácidos protegidos ligados a resina. A título de exemplo, para a preparação de um polipéptido da presente invenção em que a extremidade carboxi é um radical Thr, pode utilizar-se um resíduo Thr prote gido por terc-butiloxicarbonilo (Boc) ligado a uma resina de fe nilacetamidometilo (PAM) benzilada e hidroximetilada, encontran do-se comercialmente disponível.

A seguir ao acoplamento do aminoácido de radical x-amino protegido ao suporte de resina, faz-se a eliminação do grupo de protecçao utilizando qualquer procedimento adequado, tal como a utilização de ácido trifluoroacêtico em cloreto de metileno, ape nas ácido trifluoroacêtico ou HCl em dioxano. A desprotecção efe_c tua-se a uma temperatura compreendida entre 0°C e a temperatura ambiente. Podem utilizar-se outros reagentes e condições de cli vagem normalizados para a eliminação de grupos específicos de protecção dep(-amino. Após a eliminação do grupo de protecçao de ot-amino faz-se a ligação dos outros aminoácidos de radical amino protegido passo a passo pela ordem desejada. Em alternativa, pode fazer-se o acoplamento de grupos de aminoácidos múltiplos pelo método de solução antes do acoplamento com a sequência de ami noácido suportada em resina.

grupo de protecção de of -amino utilizado com cada amino ácido introduzido na sequência polipéptídica pode ser qualquer grupo de protecção conhecido na especialidade. Entre as classes dos grupos de protecção de o(-amino contempladas estão (1) grupos de protecção do tipo acilo tais como: formilo, trifluoroacetilo, ftalilo, toluenos-sulfonilo (tosilo), benzenos-sulfonilo, nitrofenilsulfenilo, tritilsulfenilo, o-nitrofenoxiacetilo e ^-clorobutirilo; (2) grupos de protecção do tipo uretano aromático tais como benziloxicarbonilo e benziloxicarbonilo substituído, como p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenzilcarbonilo, p-bromobenzi-15 loxicarbonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, l-(p-bifenil-il)-l-metiletoxicarbonilo -dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarboni lo e benzo-hidriloxicarbonilo; (3) grupos de protecção do tipo uretano alifático tais como terc-butiloxicarbonilo (Boc), di-isopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarboni lo e aliloxicarbonilo; (4) grupos de protecção do tipo uretano cicloalquílico tais como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxi. carbonilo e ciclohexiloxicarbonilo; (5) grupos de protecção do tipo tio-uretano tais como feniltiocarbonilo; (6) grupos de pro tecção do tipo alquílico tais como trifenilmetilo (tritilo) e benzilo; e (7) grupos trialquilsilano tais como trimetilsilano.

grupo de protecção 0(-amino preferido é terc.-butiloxicarbonilo.

A selecção de um reagente de acoplamento apropriado é do âmbito dos especialistas da matéria. Quando o aminoácido que se pretender adicionar for Gin, Asn ou Arg, o reagente de acoplamento particularmente adequado é a Ν,Ν'-di-isopropilcarbodi. -imida e o 1-hidroxibenzotriazol. A utilização destes reagentes evita a formação de nitrilo e de lactama. Outros reagentes de acoplamento são (1) carbo-di-imidas (por exemplo, N,N'-diciclo-hexilcarbo-di-imida e N-etil-N'-(^-dimetilaminopropilcarbo-di-imida); (2) cianamidas (por exemplo, Ν,Ν-dibenzilcianamida);

(3) ceteniminas; (4) sais de isoxazólio (por exemplo, N-etil-5-fenil-isoxazólio-3'-sulfonato; (5) amidas heterocíclicas conten do azoto monocíclico, de cáracter aromático, contendo entre 1 e 4 átomos de azoto no anel, tais como as imidazolidas, pirazolidas e 1,2,4-triazolidas. As amidas heterocíclicas específicas que são úteis englobam o N,N’-carbonil~di-imidazol e o N,N-carbonil-di-1,2,4-triazol; (6) acetileno alcoxilado (por exemplo, etoxiace-

tileno); (7) reagentes que formam um anidrido misto com o radical carboxilo do aminoácido (por exemplo, o cloroformato de etilo e cloroformato de isobutilo) ou o anidrido simétrico do aminoácido que se pretende acoplar (por exemplo, Boc-Ala-O-Ala-Boc) e (8) compostos heterocíclicos contendo azoto, que possuam um grupo hi droxi sobre um átomo de azoto do anel (por exemplo, N-hidroxifta limida, N-hidroxisuccinimida e 1-hidroxibenzotriazol). Encontram -se descritos outros reagentes activadores e a sua utilização no acoplamento de péptidos, em Kapoor, J. Pharm. Sei», 59 1970 pp.

1-27* Os requerentes preferem a utilização do anidrido simétrico como reagentes de acoplamento para todos os aminoácidos com excepção de Arg, Asn e Gin.

Cada aminoácido protegido ou sequência de aminoácidos é introduzida no reactor de fase sólida com um excesso cerca de 4 vezes superior e efectua-se o acoplamento num meio de dimetilfor mamida cloreto de metileno (1:1) ou apenas em dimetilformamida ou de preferência apenas em cloreto de metileno. Nos casos em que ocorra o acoplamento incompleto repete-se o procedimento de acoplamento antes da eliminação do grupo de protecção deo(-amino, an tes do acoplamento do aminoácido seguinte no reactor de fase sól·! da. Efectua-se o controlo do sucesso da reacção de acoplamento em cada estádio de síntese pela reacção de ninidrina conforme descri to por E. Kaiser e outros, Analyt. Biochem. 34 1970 p. 595·

Depois de se ter obtido a desejada sequência de aminoácidos elimina-se o péptido da resina. Isto pode efectuar-se por hidrólise, por exemplo por tratamento do polipeptido ligado à resina com uma solução de sulfureto de dimetilo, p-cresol e tiocresol em ácido fluorídrico aquoso diluído.

Conforme é do conhecimento da especialidade de síntese de

ί * péptidos pela técnica de fase sólida, muitos dos aminoácidos su portam funcionalidades que exigem a protecção durante a prepara ção da cadeia. A utilização e selecção do grupo de protecção apropriado é da competência dos especialistas na matéria e depen derá do aminoacido que se pretende proteger e da presença de ou tros radicais de aminoácidos protegidos no péptido. A selecção de tal grupo de protecção da cadeia lateral é crítica uma vez que este não deve ser eliminado por clivagem durante a clivagem do grupo de protecção do radical o(-amino. Por exemplo, os grupos de protecção de cadeia lateral adequados para a lisina são o benziloxicarbonilo e o benziloxicarbonilo substituído, sendo o referido substituinte escolhido entre átomos de halogéneo (por exemplo, cloro, bromo, fluor) e o grupo nitro (por exemplo, 2-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, 3,4--dicl£ robenziloxicarbonilo), tosilo, t-amiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo e di-isopropilmetoxicarbonilo. Pode proteger-se o gru po hidroxilo alcoólico da treonina e da serina com um grupo ace tilo, benzoílo, terc-butilo, tritilo, benzilo, 2,6-diclorobenz.i lo ou benziloxicarbonilo. 0 grupo de protecção preferido é o benzilo.

Estes grupos podem ser eliminados por procedimentos bem conhecidos na especialidade. Normalmente efectua-se a eliminação do grupo de protecção depois de se completar a síntese da cadeia peptídica mas os grupos de protecção podem ser eliminados em qualquer momento apropriado.

Em geral, efectua-se a preparação dos péptidos utilizados a partir de um derivado linear apropriado, antes ou após a

-18eliminação do péptido linear do suporte sólido. Os compostos de estrutura 1 na qual B representa um grupo -S-S- prepararam-se a partir dos correspondentes pêptidos lineares contendo sulfídrilo livre, de acordo com técnicas de acoplamento por oxidação bem conhecidas, tais como a oxidação de pêptidos lineares com ferro cianeto de potássio descrita por exemplo por Stewart e outros, Solid Phase Peptide Synthesis” (Preeman Co., San Prancisco 1969) capítulo 1, p. 95· Os compostos de estrutura geral 1 em que B re presenta um grupo -S-Alq^-S- e Alq^ representa um grupo etileno ^σΓ'^σ8 P°^{dem ser} P^reP^ara(i^{0S a} partir dos pêptidos lineares conten do sulfídrilo livre por reacção com um derivado de 1,2-dibromo de um alquilo acíclico ou cíclico, saturado ou insaturado, apropriado por um processo análogo ao descrito por Η. I. Hosberg e J.

R. Omnaas, ”J. Amer. Chem. Soe.” 107, 1985. P· 2986-298?. Os com- ?

postos de estrutura geral na qual B representa um grupo -S-Alq^-Se Alq^ representa um grupo metileno C^-Cg preparam-se por reacção do péptido linear contendo sulfídrilo livre com um aldeído ou cetona alquílica acíclica ou cíclica, saturada ou insaturada, por um processo análogo ao descrito em J. Amer. Chem. Soc.”76, 1954-j p. 1945. A preparação dos compostos de estrutura geral 1 na qual B representa um grupo -S- pode efectuar-se conforme descrito por K. Jost, Collect. Czech. Chem, Commun.36, 1971>Ρ·218, e na patente de invenção norte-americana com o 4 161 521.

A dose anticoagulante de um derivado peptídico da presen te invenção está compreendida entre 0,2 mg/kg e 250 mg/kg de peso do corpo do doente por dia, dependendo do doente, da gravidade do estado trombótico que se pretende tratar e do derivado peptídico seleccionado. A dose adequada para um doente particular pode de-

terminar-se facilmente. De preferência administrar-se-ão 1 a 4 doses diárias compreendidas normalmente entre 5 mg e 100 mg de composto activo por dose.

A terapia anticoagulante está indicada para o tratamen to e prevenção de uma diversidade de estados trombóticos, particularmente no caso de doenças das artérias coronárias e doen ças cerebrovasculares. Os especialistas neste domínio estão atentos às circunstâncias que exijam terapia anticoagulante. 0 termo doente¹¹ agora utilizado refere-se a mamíferos tais como os primatas, incluindo o homem, caprinos, equídeos, bovinos, suínos, cães, gatos, ratazanas e ratos.

Embora muitos dos derivados peptídicos possam sobreviver à passagem através do intestino após a administração oral, os requerentes preferem a administração não oral, por exemplo subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal; administração por injecção depot; por implantação; ou por apli. cação às membranas mucosas, tais como as do nariz, garganta ou brônquios, por exemplo, num recipiente para aerossol que conte nha um derivado peptídico da presente invenção sob a forma de uma aspersão ou de pó seco.

Para a administração parentérica é possível administrar os compostos como doses injectáveis de uma solução ou suspensão do composto num diluente fisiologicamente aceitável, com um veí culo farmacêutico, o qual pode ser um líquido esterilizado como a água e óleos, com ou sem a adição de um agente tensio-activo ou de outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. A título de exemplo, os óleos que se podem utilizar nestas preparações são os derivados de petróleo, os de origem animal , vegetal ou

-20de origem sintética, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, a água, as soluções salinas, a dextro se aquosa e soluções associadas ao açúcar, etanol e glicois tal como o propileno-glicol ou o polietileno-glicol são considerados veículos líquidos preferenciais, particularmente adequados para as soluções injectáveis.

- Os compostos podem ser administrados sob a forma de uma ^w injecção depot ou por implantação, formuladas de tal como que permitam uma libertação lenta do ingrediente activo. 0 ingrediente activo pode ser comprimido em aglomerados ou pequenos cilindros fazendo-se a implantação subcutaneamente ou intramuscularmente na forma de injecções depot” ou de implantações. As implantações podem utilizar materiais inertes tais como os poli, meros biodegradáveis ou os silicones sintéticos, por exemplo, Silastic, borracha de silicone preparada pela Dow-Corning Cor poration.

>

EXEMPLOS

Ilustra-se a presente invenção pelos exemplos seguintes não limitativos

EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DE

I I

H-Gly-Asp-Phe-Glu-DQys -11e-Pro -Cys -Glu.-Tyr-Leu.-G ln-CH

Sintetizou-se o péptido por métodos em fase sólida uti lizando 0,1 mmole de uma resina Boc-Gln-PAM a 0,66 mmoles/g. E fectuaram-se ós acoplamentos duplos por anidrido simétrico com 2,0 mmole de NoÇ-Boc-amino ácido (Peptides International) excepto no caso de Boc-Gln, o qual foi acoplado pelo método DCC/HOBT. A protecção da cadeia lateral utilizada foi: Asp(Chx), Cys(pMeBzl), Glu(Bzl), Tyr(2-Brz). Depois de se completar a síntese eliminou-se a protecção M-Boc com 50/ de ácido trifluoroacético em cloreto de metileno. Lavou-se a resina 5 vezes com cloreto de metileno, neutralizou-se com três lavagens de di-isopropiletilamina a 10% em cloreto de metileno, lavou-se 3 vezes com cloreto de metileno, acetilou-se com N-acetilimidazol em clore to de metileno, lavou-se 3 vezes com cloreto de metileno, e s_e cou-se in vacuo. Desprotegeu-se o péptido e clivou-se a partir da resina com água e com uma pequena quantidade de ácido acético aquoso a 30/. Diluiu-se o extracto com água até se obter o volume de 2 litros e ajustou-se o pH para 8,5 com hidróxido de amónio. Adicionou-se à solução ferrocianeto de potássio (0,01 N) até persistir uma cor amarela. Agitou-se a solução durante 30 minutos e depois ajustou-se o pH para um valor entre 4 e 5 com ácido acético. Depois agitou-se com uma resina de permuta iónica

Bio-Rad AG3-X4A, durante 2 horas. Filtrou-se a mistura e liofili. zou-se o filtrado.

Purificou-se o péptido dessalinizando-o numa coluna ”Sephadex G-15 de 92 x 2,6 cm com ácido acético aquoso a % e lio18 filizou-se. Efectuou-se a CLEP preparativa numa coluna ” C Vydac 218TP1010 (250 x 10 mm) com acetonitrilo a 24% em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% à velocidade de 5 ml/min. Recolheu-se o pico principal e liofilizou-se para se ohter 24 mg do produto de.

sejado e isolou-se o dímero como último pico eluido (14,2 mg).

Determinou-se a homogeneidade por CLEP CCP. CLEP em coluna C Vydac 218TP54 (250 x 4,6 mm), 2 ml/min., ΐθ = 1,8 min.: tempo de eluição com acetonitrilo a 25-50% em gradiente linear de ácido trifluoroacético a 0,1% à razão de 1%/min. (CLEP) de 9»3 min.

PAB-EM: (Μ + H) = 1414 + 1 (calculado 1413). Na Tabela 1 apresenta-se a análise de aminoácidos: (hidrólise) (HCl 6N; 24 horas a 1O6°C). Teor de 62% de pêptidos em peso.

De modo idêntico fez-se a preparação dos pêptidos dos exem pios 2-4 seguintes.

EXEMPLO 2 (H-Gly-Asp-Phe-Glu-D0ys-Ile-Pro-0ys-Glu-Tyr-Leu-Gln-0H)2

S S

EXEMPLO 3

H-Gly-Asp-Phe-Glu-DOys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

EXEMPLO 4 (H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu-Gln-0H)2

I I s s

Os pêptidos dos exemplos 1-4 possuem as seguintes propriedades:

TABELA 1

EXEMPLO NO.	Análise de Aminoácido (hidrólise Hcl 6N; 24 h a 106°C)
Asx	Glx	Pro	Gly	Ile*	Leu	Tyr	Phe
	1.03(1)	3.08(3)	0.91(1)	1.01(1)	0.72(1)	0.98(1)	0.95(1)	1.04(1)
w 2	1.00(1)	3.10(3)	0.97(1)	0.99(1)	0.91(1)	1.01(1)	0.88(1)	0.94(1)
3	1.00(1)	3.00(3)	0.83(1)	1.01(1)	0.68(1)	1.01(1)	1.00(1)	0.99(1)
4	1.01(1)	2.94(3)	0.98(1)	1.02(1)	0.35(1)	1.02(1)	1.02(1)	1.01(1)

Não está quantificada a porção convertida a allo-lle durante a hidrólise

Características físicas
EXEMPLO	CLEP	PAB-EM
NO.	^(min)	(M+H)
1	9,3	1414
2	12,8	2826
3	9,2	1445
4	13,6	2883

L,

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para a preparação de um derivado de péptido de fórmula geral

   CO — As — Afi-Νΐη' ^X-Af-A2-Aj - N(Ri)-C-R ^L ”~~RLC-CO - A₈-Ag-A₁₀-Y

   Alqj_ - Β - , Alqg

   I na qual X representa um radical amino escolhido entre um átc> mo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo C^-Cg, um ou dois grupos acilo ^C2^-Cl0' ^um 9^ruP° carbobenziloxi ou um grupo T-bu tiloxi-carbonilo;

   A^ representa uma ligação ou um péptido que contém 1 a 5 radicais de qualquer amino-ácido;

   Ag representa Phe, SubPhe, 3-(2- e 3-tienil)-alanina,

   3-(2- e 3-furanil)-alanina, 3-(2-, 3- e 4-piridil)-alanina 3-(benzotienil-2- e 3-il)-alanina, 3-(l- e 2-naftil)-alanina, Tyr, ou Trp;

   26representa Glu ou Asp;

   Ag representa Ile, Vai, Leu, Nle, ou Thr;

   Αθ representa Pro, Hyp, 3»4-desidroPro, tiazolidino-4-car boxilato, Sar, NMePgl, ou quaisquer amino-ácidos possuindo a configuração D;

   A_s representa Glu ou Asp;

   >

   A^ representa um amino-ácido hipofílico escolhido entre Tyr íyr(SOgH), Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, His e Pro ou repre senta um dipéptido que contém pelo menos um destes amino-ácidos hipofílicos;

   Aq_Q representa uma ligação ou um fragmento de pêptido que possui um a cinco radicais de qualquer amino-ácido;

   Y representa um radical carhoxi terminal seleccionado dos grupos OH, alcoxi Gq-σθ, amino, mono- ou di-alquil (Gq-C^)-amino substituído, ou benzilamino;

   I

   R, R', Rq e Rq’ representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Cq-C^. 5

   B representa um grupo escolhido entre -S-,-S-S- ou -S—Alq-g-S-;

   Alq₁,Alq2 θ Alq^, representam, cada um, um grupo metileno ou etileno Cq-Cg;

   e em que D eL indicam que a estereoquímica do átomo de carbono indicado é a corresnondente à D-cisteína e L-cisteína, respectivamente, assim como um dímero ou uma mistura de um derivado de péptido e o dímero correspondente, caracterizado pelo facto de se pre parar o pêptido linear que contém sulfi irilo livre mediante sínte se de blocos ou sequencial de fase sólida, clonagem de genes, ou uma sua combinação e de se submeter subsequentemente o pêptido li near a uma ligação oxidante.
2. 2. Processo de síntese de blocos ou sequencial de fase sólida para a preparação de um derivado de pêptido de fórmula geral.

   CO-A5 — Αθ-NR/

   ΧΆ1-Α2-Α3 - N(R<|)-C-R

   Alq^ -B-Alq₂ , Alq2» θ Alqz bem os significados definidos antes >

   na qual X, A-j_, A2, A^, A^, Ag, Ag, A^, Α^θ, X, R, R*, Rq*,

   Rq, B, Alq^ e em que D e ”L” indicam que a estereoquimica do átomo de carbono indicado é a correspondente à D-cisteína e L-cisteína, respectivamente, assim como um dímero ou uma mistura de um derivado péptídico e 0 dímero correspondente, caracterizado pelo facto de se ligar um amino-ácido protegido adequadamente de fórmula A·^ a um suporte de resina activada, de se ligar subsequentemente os outros amino-ácidos oÇ-amino-protegidos de A2 a Α^θ ao grupo amino terminal da cadeia peptídica crescente que foi entretanto exposta por remoção do seu

   -28grupo protector amino, e de se submeter finalmente o péptido linear a uma ligação oxidante.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação, 1 caracterizado por A₂ representar Phe, ^-(2- ou 3-tienil)-alanina, ou Tyr.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar Glu.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Ag representar Ile.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Αθ representar Pro.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Ag representar Glu ou Asp.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Ag representar Tyr, Ala-Tyr, Ala-Tyr(SO^H) ou Glu-Leu.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Α^θ representar Gin, Leu, Asp-Glu, Leu-Pro, Leu-Gln, Leu-Ala, ou uma ligação.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X representar um átomo de hidrogénio ou um grupo acetilo ou succi. nilo.

    · -29
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y representar o grupo GH ou NH^.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R, R', R^, R^', representarem, cada um, um átomo de hidrogénio.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por B representar o grupe -S-S-.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Alq^ e Alq₂ representarem, cada um, um grupo metileno de fórmula -(ch₂)-.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar fe

    His-Asn-Asp-Gly-Asp, Asn-Asp-Gly-Asp,

    Asp-Gly-Asp,

    Gly-Asp,

    Asp, ou uma ligação