PT877546E

PT877546E - Processo para a propagacao de material de plantas

Info

Publication number: PT877546E
Application number: PT96944605T
Authority: PT
Inventors: Glyn Alyn Edwards; John Gilbert Purse
Original assignee: Shell Int Research
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2001-12-28
Also published as: JP2000510325A; AU1303197A; EP0877546A2; IL124971A0; ATE204120T1; CN1219102A; MY132360A; BR9612217A; WO1997023126A2; UY24420A1; AR006750A1; HUP9901292A2; CA2240847A1; WO1997023126A3; DE69614569D1; OA10799A; EP0877546B1; HUP9901292A3; AU721423B2; NZ325798A

Description

msn

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PROPAGAÇÃO DE MATERIAL DE PLANTAS" O presente invento refere-se a um processo para a propagação vegetativa de material de plantas.

As técnicas de propagação vegetativa in vitro (micropropagação) são amplamente usadas para a produção à escala comercial de plantas. Estas técnicas possuem uma potencial vantagem sobre os outros métodos de propagação vegetativa, por exemplo, propagação através de cortes, em que um grande número de plantas pode ser produzido num determinado período de tempo. Além disso, as técnicas são úteis para propagar material de plantas geneticamente manipulado. No caso de alguns genótipos de plantas, as técnicas de micropropagação podem ser o único método disponível para a propagação vegetativa. Contudo, embora largamente utilizada na horticultura, o uso comercial de micropropagação vegetativa para a propagação de plantas lenhosas, pro exemplo, árvores, não está difundido. A grande maioria das técnicas de micropropagação para a propagação vegetativa de plantas lenhosas são os meios de crescimento gelificados ou o uso de outros meios físicos para suportar o material de planta em ou sobre um meio de crescimento líquido. (Os meios gelificados são ffequentemente designados por "sólidos", quer sejam de facto sólidos quer sejam semi-sólidos. A menos que estaja especificado de outro modo, os termos "meio sólido" e "meio semi-sólido", tal como aqui usado, incluem ambas as formas sólida e semi-sólida de meios gelificados). Contudo, as técnicas de micropropagação que empregam meios sólidos ou suportes físicos possuem a desvantagem de serem geralmente de trabalho intensivo e caros. Adicionalmente, as técnicas de micropropagação para plantas lenhosas sofrem muitas vezes da desvantagem de ser difícil de produzir produtos uniformes. A razão para isto é que é muitas vezes difícil induzir os meristemas existentes, por exemplo, rebentos axilares, para se desenvolverem uniformemente. Isto pode ser devido aos meristemas serem quiescentes ou dormentes e/ou devido ao alongamento e desenvolvimento não uniformes, uma vez que este crescimento tenha começado. Para a produção comercial, a uniformidade do produto é extremamente importante. Qualquer heterogeneidade de desenvolvimento dos rebentos para a formação de raízes é frequentemente amplificada durante o subsequente desenvolvimento das plantas.

Existem deste modo claros incentivos para se desenvolverem técnicas de micropropagação alternativas para plantas lenhosas que sejam mais eficientes, mais rentáveis e capazes de produzir um produto mais uniforme.

Tem sido proposto usar meios líquidos submersos para a micropropagação uma vez que há um certo número de potenciais vantagens sobre os meios sólidos, incluindo uma maior capacidade de automatizar e, deste modo, de reduzir despesas. A cultura submersa de tecidos de plantas tem sido extensivamente empregue na cultura de células, ou seja, crescimento de células únicas, pequenos grupos de células indiferenciadas e tecidos embriogénicos ou tecidos meristemáticos. Contudo, tentativas para usar meios líquidos para propagar rebentos e plântulas foram frustradas devido a um certo número de problemas, e parece que a técnica tem apenas uma aplicação muito limitada, para certas plantas específicas. A hiper-hidricidade dos rebentos é um problemas muitas vezes encontrado em sistemas de micropropagação líquidos, ver por exemplo, Ailken-Christie et al 1994 e George E F 1993/1996. A hiper-hidricidade foi previamente designada por vitrificação (água -abate) mas isto não é tecnicamente correcto. A hiper-hidricidade refere-se à condição de material cultivado in vitro que tem uma aparência morfológica anormal e uma função fisiológica. A susceptibilidade à hiper-hidricidade não é a mesma em todas as plantas. Os sintomas típicos são rebentos com intemódulos mais curtos, folhas quebradiças, enroladas ou translúcidas, anatomia anormal, incluindo grandes espaços intercelulares, sistema vascular reduzido e cera na superfície; estornas e cloroplastos fracamente desenvolvidos; e características bioquímicas alteradas incluindo reduzida lenhina e celulose e alteradas actividades de enzima.

Virtualmente todas as plantas cultivadas in vitro, mesmo quando feitas crescer em meios semi-sólidos, mostram em alguma extensão os sintomas associados à hiper-hidricidade. Contudo, os sintomas visuais são irrelevantes caso estes sintomas sejam ligeiros e possam ser facilmente invertidos. Em tais casos, os sintomas ligeiros podem não afectar adversamente a propagação das plantas. O material sob propagação pode ser recuperado, ou seja, enraizado, e o desempenho subsequente, e deste modo o valor dos propágulos, não é adversamente afectado. A hiper-hidricidade pode causar problemas na propagação das plantas quando é encontrada uma expressão extrema dos sintomas característicos descritos acima. Os rebentos hiper-hídricos que apresentam uma expressão extrema dos sintomas característicos sob condições de propagação in vitro tomam-se geralmente difíceis de propagar e podem morrer enquanto ainda em cultura. Estes não produzem normalmente raízes adventícias ou produzem raízes apenas fracamente. Os rebentos hiper-hídricos raramente sobrevivem à -4- 5' h f t-.j, transferência de um ambiente in vitro, por exemplo, para uma estufa. Estes rebentos são por isso geralmente inadequados para formação de raiz e/ou subsequente propagação. A hiper-hidricidade é muito frequentemente encontrada na propagação de espécies lenhosas. Em plantas lenhosas, a hiper-hidricidade dos rebentos e das plântulas é um problema difundido e pode ser severo. Na verdade, muitas plantas lenhosas são susceptíveis de ter uma hiper-hidricidade severa mesmo quando crescem em meios de crescimento sólidos ou semi-sólidos.

Park et al em Biotechnology and Bioengineering Vol 34, 1209 1213, 1989, descrevem a cultivação de plântulas de Artemísia annua, uma planta herbácea anual, numa cultura líquida submersa. Contudo, as plântulas produzidas não foram testadas em relação à sua capacidade de se desenvolverem em plantas, um passo crucial na micropropagação, e Park indica a necessidade de mais estudos em relação à vitrificação. Num artigo posterior, 1993 Biotechnology techniques 7; (10): 697-702, 1993, Park com o co-autor Woo descreve um sistema de cultura misto que estes desenvolveram e o seu uso para o cultivo de Dianthus caryophyllus. Referindo-se ao seu artigo de 1989, Park declara que por causa do tamanho grande e da sensibilidade ao corte, se tinha registado uma dificuldade para cultivar os tecidos organizados num meio líquido. Park também declara que uma vez que acontece uma séria vitrificação dos rebentos em meio líquido, os passos de aclimação dos rebentos podem ser consumidores de tempo ou terem mesmo insucesso.

Woerdenbag et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture 32: 247-57 (1993) fez crescer rebentos de Artemísia annua. Os autores referem-se ao artigo de Park de 1989 mas eles próprios não usaram o método de cultura submersa descrita por Park em 1989. Um vez disso eles usaram os frascos agitados -5-convencionais para a cultura dos rebeutos de Artemísia.

Uma hiper-hidricidade severa é um fenómeno extremamente comum em sistemas de microporpagação líquidos. Por essa razão, os sistemas líquidos são geralmente evitados através do uso de suportes sólidos ou semi-sólidos, por exemplo, meios gelificados. Na maioria dos casos, quando é usado um sistema líquido, são tomadas cuidadosas precauções para evitar a completa submersão do material das plantas no meio de cultura líquido.

Tem sido desenvolvido um certo número de técnicas de propagação, em que os rebentos ou plântulas são feitos flutuar num meio líquido ou feitos crescer em sistemas de meio líquido não submersos (raso) ou em sistemas em que estes são periodicamente inundados com o meio de cultura. Gupta et al (Plant Sei Lett 20: 195-201, 1981) descreve um método para a multiplicação e formação de raízes de plântulas e clones maduros de Eucalvptus citriodora usando protocolos que possuem passos com meios de cultura sólidos e líquidos semi-submersos. Contudo, tais técnicas possuem apenas vantagens limitadas em comparação com as técnicas que empregam meios sólidos ou semi-sólidos. Têm sido feitas tentativas para reduzir a hiper-hidricidade em culturas líquidas usando retardadores de crescimento tais como o paclobutrazol e o ancimidol, que reduzem o crescimento do tecido mais afectado, ou seja, as folhas. No entanto, o uso de retardadores de crescimento tem tido sucesso apenas com as espécies Gladiolus ou Nerine que são propagadas in vitro através de tubérculos ou bulbos. O presente invento proporciona um processo para a micropropagação de rebentos, rebentos com raízes ou plântulas de uma planta lenhosa, que compreende o cultivo dos rebentos, rebentos com raízes ou plântulas -6-

Ai h*.?h i num meio de cultura líquido arejado, por exemplo, oxigenado, com os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas sendo submersos no meio líquido. O meio é geralmente agitado ou movimentado de outra forma.

Os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas podem ser deixados em movimento no meio líquido, por exemplo, estes podem ser deixados em movimento livre, por exemplo a trambolhar, por exemplo rolando livremente, no meio líquido. Altemativamente, o seu movimento pode ser restringido ou impedido de outro modo. O processo do invento é simples, barato, reduz os custos de mão de obra e dá origem a um material de excelente qualidade que é adequado para uso comercial, em larga escala, tal como mostrado na Figura 1 dos desenhos em anexo. A Figura 1 mostra quatro massas de rebentos: 1: Rebento de Eucalyptus grandis micropropagado típico usado como inoculo. 2: Rebento de Eucalyptus grandis típico produzido após 5 semanas de cultivo em meio de micropropagação sólido (meio KM). 3a, 3b: Duas massas de rebento de Eucalyptus grandis típicas recolhidas após 27 dias de cultura líquida submersa em meio líquido KM de acordo com o presente invento.

No processo do presente invento, os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas são cultivados sob condições tais que são completamente imersos no -7-

meio líquido. Os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas podem ser deixados a mover-se no meio líquido, por exemplo, estes podem ser deixados a moverem-se livremente. Por exemplo, os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas podem trambolhar, por exemplo tambolhar livremente, no meio líquido. O trambolhamento pode ser vigoroso e pode ser substancialmente contínuo. Altemativamente, o movimento dos rebentos, rebentos com raízes ou plântulas pode ser restringido, por exemplo, podem ser retidos em meios de restrição perfurados, por exemplo uma caixa ou um saco, dentro do vaso de crescimento da planta ou dentro de uma secção separada do vaso que está em contacto com o meio líquido. O meio líquido em que o material de planta é cultivado deve compreender oxigénio suficiente para suportar o metabolismo do material da planta. É geralmente necessário proporcionar oxigénio, usualmente sob a forma de ar, e/ou para iluminar os sistema de modo a que o oxigénio seja produzido por fotossíntese. O meio pode ser agitado através de meios mecânicos, por exemplo, por meio de um dispositivo mecânico, por exemplo, uma pá ou um agitador, por exemplo, um agitador magnético, ou o vaso que contém o meio pode ser agitado, por exemplo abanado, vibrado ou rodado. Os meios usados para agitação, por exemplo, agitação ou remeximento, podem oxigenar suficientemente o meio para suportar o mecanismo do material da planta. Se não, pode ser proporcionado oxigénio, geralmente sob a forma de ar, e/ou o sistema pode ser iluminado de modo a seja produzido oxigénio por fotossíntese. A produção de oxigénio por fotossíntese pode proporcionar totalmente ou em parte o oxigénio requerio pela cultura. A luz necessária para a produção de oxigénio por fotossíntese provocará geralmente movimento no meio -8- íj*. d***—.( líquido por convecção. O meio líquido pode ser tanto agitado como oxigenado por passagem de oxigénio ou, mais usualmente, ar, através do meio. As técnicas de circulação de ar, por vezes designadas por técnicas de "fluxo de ar", são particularmente úteis para proporcionar oxigenação e agitação simultânea no processo do presente invento. O meio líquido num vaso apropriado, por exemplo, um vaso de fermentação, por exemplo, um balão, uma garrafa, um tanque ou uma coluna pode ser feito circular ou ser oxigenado por introdução de ar através de, por exemplo, um difusor de gás. Tais vasos são frequentemente chamados "fermentadores de fluxo de ar". O volume de ar e a taxa de introdução podem ser facilmente ajustados para originar o grau desejado de agitação do meio líquido e deste modo do material de planta quando é deixado em movimento livre.

Quando o material de planta é deixado a mover-se livremente, a agitação do meio por passagem de ar ou outro gás contendo oxigénio através do meio pode ser preferível em relação à agitação por meios mecânicos, por exemplo, agitação, uma vez que as forças de corte sobre o material de planta podem ser inferiores. Contudo, as forças de corte sobre o material de planta, em sistemas agitados ou remexidos do presente invento, podem ser reduzidas por restrição do movimento do material de planta, por exemplo, tal como descrito em mais detalhe abaixo. Num sistema em que ar ou outro gás é feito passar através do meio pode também ser desejável restringir o movimento do material de planta, de modo a que o meio líquido é agitado mas o material de planta e restringido.

Se a passagem de gás não é suficiente para se conseguir a agitação desejada, podem ser proporcionados meios de agitação adicionais, por exemplo, o vaso de crescimento de planta pode também ser agitado ou o seu conteúdo pode ser remexido. O vaso pode ser iluminado para proporcionar mais oxigénio por -9- A .-ο ι /<fC T"S v ^ i. fotossíntese.

Deve notar-se que após a inoculação no meio líquido os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas podem não ficar molhados rapidamente porque bolhas de ar podem ficar agarradas às suas superfícies. Se isso acontecer, os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas podem flutuar na, ou próximo da, superfície do meio. Pode ser incluído um tensioactivo no meio de cultura para auxiliar a molhagem. Mesmo na ausência de tensioactivo, contudo, as superfícies dos rebentos, rebentos com raízes ou plântulas ficará geralmente completamente molhada no espaço de alguns dias. Num sistema de fluxo de ar, se existir agitação suficiente, e se estes não forem restringidos estes geralmente trambolharão livremente.

Tal como indicado atrás, os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas que são propagados de acordo com o processo de cultura em líquido submerso do presente invento podem ser deixados a moverem-se livremente no meio de cultura líquido ou o seu movimento pode ser restringido ou impedido de outro modo. O material de planta pode ser fisicamente restringido num recipiente dentro do vaso de crescimento de plantas ou o vaso pode ser dividido em secções, uma ou mais secções contendo o material de planta. Os meios para restrição ou divisão devem permitir a passagem de meio líquido suficiente para permitir uma oxigenação adequada do material de planta. Materiais perfurados ou em rede podem ser usados para construir os meios de restrição, por exemplo, podem ser usados materiais de metal ou de plásticos perfurados, uma rede de arame ou uma malha tecida, por exemplo, musselina. Altemativamente, o meio líquido contendo oxigénio fresco pode ser feito passar através de um vaso de crescimento de plantas contendo o material de planta, quer continuamente quer periodicamente, sendo submerso o material de planta todo o tempo. O movimento do material de planta pode ser restringido em qualquer sistema de cultura líquido do presente invento, incluindo aqueles em que a oxigenação é conseguida por agitação ou remeximento do meio líquido, por passagem do ar ou de outro gás contendo oxigénio, através do meio líquido, por fotossíntese, ou por qualquer combinação destes. A restrição do movimento do material de planta pode ter a vantagem de reduzir as forças de corte sobre o material. No caso das culturas agitadas, é particularmente preferível restringir o material de planta porque este pode ser danificado pelo agitador se for deixado a mover-se livremente. O meio líquido usado para a propagação pode ser qualquer meio que seja adequado para a propagação dos rebentos, rebentos com raízes ou plântulas escolhidos. Deve geralmente incluir fontes de carbono e de azoto, sais orgânicos e inorgânicos tal como requerido e reguladores de crescimento e/ou fito-hormonas. Os meios de crescimento adequados são conhecidos, e um meio apropriado pode ser escolhido para a planta lenhosa particular a ser propagada. Os meios sólidos conhecidos podem ser modificados através da omissão do gelificante ou de outro agente de solidificação para dar um meio líquido. Pode também ser adequado modificar os níveis de um ou mais dos componentes de um meio conhecido para ser usado de acordo com o invento, por exemplo, pode ser possível usar níveis reduzidos de fito-hormonas e/ou de reguladores de crescimento de plantas em comparação com os níveis usados nos correspondentes meios sólidos. O nível óptimo de qualquer componente particular ou de combinações de componentes pode ser determinado através de métodos convencionais.

Devem ser usadas condições de cultura adequadas, por exemplo, no

- 11 - que diz respeito à temperatura e à luz. Pode ser preferível iluminar a cultura para proporcionar uma oxigenação endógena para suplementar ou mesmo, em alguns casos, para substituir a oxigenação exógena. Se a cultura está em crescimento autotrópico sob luz, a fonte de hidratos de carbono no meio pode ser omitida ou reduzida. Em tais casos, o fornecimento de ar ou de outro gás contendo oxigénio pode ser suplementado com dióxido de carbono. Altemativamente, se é proporcionado suficiente oxigénio para suportar o metabolismo do material de planta, o cultivo pode ser realizado inteiramente ou parcialmente no escuro.

Os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas produzidos em cultivo no escuro podem ser alongados, em comparação com os produzidos sob iluminação. O alongamento pode ser vantajoso para manipulação subsequente, por exemplo, para dissecação do rebento ou plântula. Para além disso, os rebentos alongados de algumas plantas, por exemplo, E. Grandis e híbridos deste, formam raízes mais facilmente do que rebentos curtos. De acordo com isto, o sistema de cultura líquido do presente invento permite a manipulação de condições de iluminação para a manipulação da qualidade dos rebentos, que é importante nos sistemas comerciais de micropropagação. O cultivo pode ser continuado até que o desejado aumento de biomassa e das velocidades de multiplicação sejam alcançados. Os rebentos podem ser removidos do meio de cultura líquido antes ou após a formação de raiz se ter iniciado ou ter acontecido e então transferir-se para um meio de formação de raiz sólido, para a iniciação e/ou desenvolvimento de raiz. O meio de formação de raiz usado pode conter carvão activado, se desejado. Altemativamente, a iniciação da formação das raízes e/ou subsequente desenvolvimento de raízes pode ser realizada in vivo usando substratos orgânicos e/ou inorgânicos adequados, por exemplo, vermiculite, adubo composto, solo ou turfa.

Os rebentos, rebentos com raízes (plantas pequenas) ou plântulas usados para inoculação podem ser obtidos por micropropagação, ou germinados e/ou crescerem numa câmara ou cabine de crescimento, numa estufa ou no exterior. Os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas podem ser obtidos a partir de um cultivar, clone ou semente, especialmente de cultivares, clones ou sementes geneticamente valiosos, ou a partir de material de planta geneticamente modificado. Os rebentos usados para inoculação possuem preferencialmente um ou mais nódulos, por exemplo, de dois a quatro nódulos. A ponta da raiz (meristema apical) pode estar presente ou pode ser removida antes da inoculação. A remoção do sistema apical pode resultar num produto mais uniforme. A contaminação microbiana é um problema potencial nos sistemas de cultura líquidos em geral. No caso presente, pode ser um problema particular quando o material de partida foi obtido a partir de plantas que cresceram sob condições não estéreis, por exemplo, numa estufa ou no exterior, mesmo que se tenha feito a esterilização ou a desinfecção da superfície, de acordo com os métodos convencionais. Mesmo quando o material de partida foi produzido sob condições estéreis pode haver contaminação microbiana a partir de outras fontes.

De acordo com isto, o meio de cultura líquido empregue no processo do presente invento compreende preferencialmente um antibiótico, por exemplo augmentina. Contudo, o facto de as massas de rebentos, rebentos com raízes ou plântulas estarem totalmente imersas no meio líquido deve resultar numa penetração mais eficiente do antibiótico nos tecidos das massas dos rebentos do que o ocorre em meio sólido, e assim o efeito da contaminação microbiana, caso ocorra, é reduzida.

Isto é particularmente importante para a micropropagação, de acordo com o processo do presente invento, do material de planta geneticamente modificado obtido usando a transferência mediada por Agrobacterium. Tal material pode apresentar problemas particulares para a subsequente microrpopagação por causa da inevitável contaminação com as próprias Agrobacteria. Tais problemas são minimizados no processo do presente invento.

Mesmo assim, são preferencialmente tomadas precauções para minimizar o potencial de contaminação através de microorganismos exógenos, por exemplo, qualquer fornecimento de ar ou de outro gás usado para oxigenação é preferencialmente filtrado, irradiado quimicamente ou de outro modo tratado para remover os microorganismos; As juntas e as ligações são preferencialmente vedados, e a aparelhagem é preferencialmente esterilizada antes de ser usada, por exemplo, por autoclavagem. Os materiais com o grau de cultura de tecido, por exemplo, tubagens, são preferencialmente usados. O processo do presente invento é aplicável a plantas lenhosas, o que é o mesmo que dizer, a plantas perenes que apresentam um crescimento secundário (espessamento secundário) das raízes ou dos caules aéreos, que é o resultado da formação de madeira. A madeira é o xilema secundário, e é composta de um ou mais dos seguintes: traqueídos, vasos, fibras e raios. As plantas lenhosas incluem árvores de floresta, outras árvores, matas e arbustos.

Exemplos de plantas lenhosas que podem ser micropropagadas pelo processo do presente invento incluem, mas não são limitados a, gimnoespermas e angioespermas dicotiledóneas, por exemplo, tal como usados na pasta para papel, para combustível ou para madeira serrada, por exemplo, Eucalyptus, Pinus, Picea, Acacia, Populus, Bétula, Tectona e folhosas tropicais; árvores, matas e arbustos que produzem frutos ou frutos secos, por exemplo, macieiras, citrinos, pessegueiros, oliveiras, nogueiras e amendoeiras, cafeeiros, arbustos de groselhas e plantas de framboesa; árvores, matas e arbustos a partir dos quais se podem

- 14- obter outros produtos comercialmente úteis, por exemplo, árvores da borracha e árvores e arbustos que produzem substâncias farmaceuticamente úteis ou precursores de substâncias farmaceuticamente úteis, por exemplo, teixo; e árvores e arbustos ornamentais, por exemplo árvores e arbustos tendo flores, folhagem ou casca ornamentais.

As plantas lenhosas que parecem ter um desempenho particularmente bom no sistema de cultura líquido do presente invento são as espécies esclerofilosas. A definição de esclerófila é "folha espessa, como o couro". Isto inclui as folhas verdadeiras, tal como no caso do eucalipto e filodes, tal como no caso das acácias. As espécies consideradas como esclerofilosas são geralmente de folha persistente e a condição habitual das esclerofilosas está geralmente associado a uma fraca disponibilidade em nutrientes e muitas vezes com tolerância às secas. Exemplos de géneros esclerofilosos são os Rhododendron, Azalea e Kalmia (Ericáceas); Olea (Oleáceas); muitas acácias australianas (Fabáceas); e eucaliptos (Mirtáceas).

Contudo, não são apenas as espécies esclerofilosas que têm um bom desempenho no sistema de cultura líquido do presente invento. As Malus (macieira), Pyrus, Prunus e Rosa (Rosáceas), Forsythia e Syringa (Oleáceas) são ainda exemplos de géneros de plantas lenhosas que podem ser propagados usando o sistema de cultura líquido do presente invento.

Tal como indicado, o eucalipto é um exemplo de uma planta lenhosa esclerofilosa que pode ser propagada de acordo com o presente invento. O sub-género sinfiomirto Eucalyptus contém muitas espécies comercialmente úteis, por exemplo E. Grandis. E. Globulus. E. Nitens. E.dunnii. E. Saligna. E. Calmadulensis, E. Urophvlla e híbridos destes. Outras espécies de Eucalyptus comercialmente importantes incluem E. Regnans. E. Citriodora. E. Fraxinoides. e híbridos destes.

De acordo com uma concretização particularmente preferida do processo do presente invento, os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas são propagados numa cultura líquida submersa que é oxigenada e agitada por meio de circulação de ar, de modo a que os rebentos ou plantas rolem, de prefereência livremente. Num tal sistema, que é frequentemente designado por sistema de "fluxo de ar", ar comprimido (ou outro gás adequado) é fornecido a um vaso de crescimento de plantas contendo um meio líquido e os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas. O ar ou outro gás fornecido é preferencialmente humidificado antes de entrar no vaso de crescimento de plantas, por passagem através de água, especialmente água destilada.

De acordo com outras concretizações preferidas do invento, os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas são propagados num vaso que seja agitado ou remexido. É particularmente preferido restringir o movimento do material de planta, por exemplo, num recipente perfurado, por exemplo uma caixa ou um saco, tal como descrito atrás. Pode também ser vantajoso restringir o movimento do material de planta num sistema de cultura do invento quando é feito passar ar através do meio líquido.

Tal como indicado atrás, é preferível assegurar que todo o dispositivo e todos os materiais usados sejam estéreis para minimizar a contaminação microbiana. O dispositivo é preferencialmente esterilizado antes de uso por autoclavagem ou filtração, quando possível, e são preferencialmente usados materiais de grau de tecido de cultura. Todas as juntas do dispositivo devem ser cuidadosamente vedadas.

Quando ar ou outro gás é fornecido a um vaso de crescimento de

f U *Ί -16- plantas, são prcferencialmeiile proporcionados filtros na entrada e na saída do fornecimento de gás ao vaso para manter a esterilidade dentro do vaso. O ar fornecido pode ser feito passar através de um filtro, por exemplo, um filtro de carvão activado, para remover contaminantes gasosos e/ou voláteis do ar fornecido. Os filtros usados, particularmente filtros de exaustão, são preferencialmente hidrofóbicos, uma vez que existe uma inevitável evaporação a partir do dispositivo com o potencial de condensação na corrente de ar de exaustão. Para operação a longo prazo, pode ser desejado incorporar um condensador na corrente de ar de exaustão para se evitar a formação de condensação e um potencial crescimento microbiano que pode ocorrer nos filtros, diminuindo os caudais e possivelmente causando infecção da cultura (fenómeno de "crescimento através" do filtro). O vaso de crecimento de plantas pode ser de qualquer tamanho e forma adequados para a cultura líquida submersa. Os vasos adequados são bem conhecidos para sistemas de "fluxo de ar" e para sistemas em que o meio líquido é agitado ou remexido. O vaso pode ser, por exemplo, um balão, garrafa, coluna ou tanque. O vaso pode ser de vidro, metal ou mesmo de um polímero sintético, por exemplo, polipropileno ou policarbonato. Se o material de planta é para ser iluminado para fotossíntese, o vaso deve permitir a passagem de luz de comprimento de onda apropriado. O meio líquido é introduzido no vaso, é preferencialmente trazido até à temperatura em que o cultivo é efectuado, o inoculo dos rebentos, rebentos com raízes ou plântulas é adicionado ao meio, e o dispositivo é geralmente selado. O vaso de crescimento de plantas e o seu conteúdo são mantidos a uma temperatura adequada, por exemplo, de 20 a 30°C, com ou sem iluminação.

No caso em que o ar ou outro gás contendo oxigénio é feito passar através do meio líquido em que o material de planta se move livremcntc, o fornecimento é preferencialmente ajustado ao caudal máximo que dá origem a uma corrente estável de bolhas, de modo a que os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas sejam sumersos e preferencialmente rolem, e especialmente rolem livremente, no meio. O trambolhamento deve ser praticamente contínuo. No caso de sistemas em que o meio líquido é agitado ou remexido, a agitação ou remeximento deve ser suficiente para oxigenar o meio ao mesmo tempo que se assegura que o material de planta é submerso.

Um meio adequado é escolhido para as plantas lenhosas a ser propagadas, por exemplo, o meio KM (sem agente de gelificação) pode ser usado para a propagação de Eucalyptus grandis e híbridos deste. Similarmente, para outras plantas o agente de gelificação pode ser omitido de um meio sólido ou semi-sólido previamente usado para a propagação dessa planta.

Nalguns casos pode ser possível usar níveis de fito-hormonas inferiores aos que são convencionalmente usados em meio sólido, por exemplo, na propagação do Eucalyptus grandis de acordo com o presente invento, são obtidos bons resultados com 25% (ou mesmo menos) da quantidade convencional de BAP (6-benzilaminopurina).

Quando os rebentos de uma planta lenhosa compreendendo um meristema apical, por exemplo, Eucalyptus grandis. são propagados de acordo com o sistema de fluxo de ar do presente invento, com os rebentos a rolarem livremente no meio líquido, os efeitos de inibição correlativa em meristemas de rebentos axilares parecem ter sido completamente abolidos. Todo o sistema de ramificação que se origina a partir dos nódulos existentes presentes no período da inoculação contâm ramos terciários. Os nódulos de idade decrescente resultantes do crescimento em extensão a partir do ápice do rebento inoculado possuem sistemas de ramificação de complexicidade decrescente. As pontas dos rebentos dos caules originais, os ramos primários e os ramos secundários de ambos os meios, originam todos pontas de rebentos que são bem alongados, possuem caules espessos e robustos e dois ou mais nódulos bem separados. Existem um grau assinalável de uniformidade entre os rebentos colhidos, apesar do número de nódulos que os ramos da origem possuíam na recolha. Quase todos os ramos terciários consistiam de uma ponta de rebento (duas folhas e meristema) e sem nódulos.

Quando os rebentos são propagados num sistema de cultura líquido submerso do presente invento, por exemplo, ao serem retidos num recipiente perfurado, por exemplo uma caixa ou um saco, dentro do vaso de crescimento de plantas, os rebentos resultantes apresentam praticamente as mesmas características tal como descritas atrás para os rebentos que são capazes de se moverem livremente. Estes apresentam um elevado grau de uniformidade e são de boa qualidade. Para além disso, as velocidades de multiplicação são geralmente tão elevadas como aquelas dos rebentos que se movem livremente. Parece que uma elevada densidade de inoculação de rebentos pode conduzir a uma elevada velocidade de multiplicação.

Ao contrário do esperado, os sintomas de hiper-hidricidade (vitrificação) das folhas, se ocorrerem, são fracos e são apenas aparentes em folhas velhas, bem expandidas. Material mais jovem (ou seja nas pontas dos rebentos e nódulos apicais) não apresenta quaisquer sinais significativos de hiper-hidricidade. Verificou-se que, se se observarem quaisquer sinais de hiper-hidricidade durante o uso da técnica de cultura líquida do presente invento, tais sinais são geralmente não significativos, e são prontamente invertidos durante a cultura subsequente em meio sólido, e assim têm pouco ou nenhum efeito sobre a propagação ou formação de raízes subsequentes dos rebentos.

Os rebentos colhidos dos vasos de crescimento de plantas formam raízes bem e, por exemplo no caso do E. erandis. a eficiência da formação dc raízes pode ser melhor do que a resultante dos métodos de propagação que utilizam meio sólido. No caso da Acacia maneium. os rebentos resultantes podem criar raiz no composto e ser transferidos directamente para a estufa, sem necessidade de criar raiz em meio sólido. Esta é uma vantagem muito surpreendente, que é muito importante comercialmente. A qualidade dos rebentos de Rhododendron e de eucalipto e a sua boa eficiência de formação de raiz indica que estes, também, podem criar raiz directamente no composto e serem transferidos para a estufa, sem um passo de formação de raiz intermédio em meio semi-sólido. Na verdade, a boa qualidade do material obtido de acordo com o processo do presente invento, sugere que a formação de raiz directa no composto e a transferência para a estufa pode ser possível com outros géneros, para além da Acacia e do Eucalyptus.

Em resumo, o processo do presente invento proporciona uma abundância de rebentos verdes, saudáveis e altamente uniformes, capazes de formar raízes ou outra propagação. Em muitos casos os rebentos são suficientemente alongados de modo a que podem formar raízes directamente sem mais passos específicos de alongamento. Nalguns casos os rebentos podem mesmo formar raízes directamente no composto sem um passo intermediário de formação de raiz num meio semi-sólido.

Algumas plantas, por exemplo, a oliveira, tomam-se cloróticas (amarelas) quando propagadas num meio gelificado. Em contraste, quando propagadas de acordo com o sistema de cultura líquido do presente invento, os rebentos de oliveira são verdes e saudáveis. Uma outra vantagem é a de que os rebentos de oliveira são bem alongados. Em contraste, quando propagados em meio gelificado, os rebentos de oliveira requerem um extenso período de alongamento, usualmente de cerca de um mês, antes de formarem raiz. «Ά -20-

As velocidades de extensão dos novos rebenlus propagados usando o sistema de cultura líquido do presente invento parecem ser não usualmente uniformes. Para micropropagação comercial a uniformidade do produto é extremamente importante. Qualquer heterogeneidade de desenvolvimento dos rebentos fixados para formação de raiz é muitas vezes amplificada durante o desenvolvimento subsequente das plantas. Tal heterogeneidade é usual em plantas lenhosas, resultando na necessidade de classificar os produtos e em possíveis interrupções de fornecimento.

Este problema é ilustrado na produção comercial de rododendros. Em todos os sitemas gelificados usados na produção de rododendros, podem-se formar grandes quantidades de calos na base dos rebentos de multiplicação. Os rebentos adventícios são muitas vezes produzidos a partir destes calos através de organogénese. Estes rebentos adventícios são frequentemente de tipo não verdadeiro (isto é anormais) devido ao fenómeno de variação somaclonal. (Este fenómeno é frequentemente associado a alterações no número de cromossomas ou em rearranjos de cromossomas). Correntemente, os produtores comerciais de rododendros têm que sacrificar as velocidades de multiplicação de modo a evitar calos e a formação de rebentos adventícios para assegurar que as plantas que estão a propagar são do tipo verdadeiro. O sistema líquido do presente invento evita este problema uma vez que a uniformidade dos rebentos resultantes é excelente e muito superior ao obtido usando sistemas de propagação gelificados. Em particular, não são produzidos rebentos adventícios, e todos os novos crescem como resultado do desenvolvimento de botões axiliares.

Para além disso, tal como indicado atrás, os rebentos de Acacia podem formar raízes no composto e serem directamente transferidos para a estufa, sem a necessidade de formação de raiz em meio sólido. Esta vantagem surpreendente é muito importante comercialmente. -21- A*- Wt1

u Há também enormes vantagens de custos em comparação com os sistemas de propagação que usam meios sólidos, incluindo poupanças em trabalho manual (ou os elevados custos de capital de processos automatizados usando meio sólido), resíduos e tempo. Por exemplo, para produzir 50 rebentos de E. grandis a partir de um rebento de partida único usando um meio sólido típico, o protocolo requer três passos de subcultura (e preparação do meio associada e uso de pratos de cultura de usar e deitar fora) e leva três meses. Isto em comparação com um passo de cultura simples e um mês usando o sistema do presente invento.

Verificou-se uma outra vantagem quando se propagava Acacia e Eucalyptus de acordo com o presente invento. Os rebentos de Acacia formam-se em amontoados que podem ser dissecados para dar rebentos de formação de raiz individual. O remanescente dos amontoados, consistindo de caules ramificados mas sem as pontas dos rebentos, pode ser reintroduzido no meio de cultura líquido de acordo com o processo do presente invento, altura em que então os rebentos se desenvolvem. Este processo pode ser desenvolvido pelo menos várias vezes, sem um efeito prejudicial sobre a qualidade e a quantidade do produto.

Com o Eucalyptus, os rebentos pode ser colhidos a partir de um sistema líquido de acordo com o invento, dissecados a partir de massa de rebentos e imediatamente reinoculados em vasos de crescimento de plantas contendo um meio fresco. O processo pode ser repetido durante pelo menos vários ciclos, sem qualquer efeito significativo nas velocidades de multiplicação dos rebentos e sem qualquer deterioração na qualidade dos rebentos produzidos em ciclos sucessivos. É considerado que a reciclagem de material de propagação no processo do presente invento terá aplicabilidade geral, e pode ser usado para outros géneros para além da Acacia e do Eucalyptus. A reciclagem de material de propagação resulta em poupanças consideráveis e num produto uniforme, pelo que é particularmentc atractiva comercialmente.

Deste modo, o sistema do presente invento é altamente atractivo comercialmente. Os rendimentos obtidos são geralmente superiores aos obtidos com sistemas gelificados, e são frequentemente muito superiores. A elevada qualidade do produto, tanto a sua saúde geral como a sua notável uniformidade, são de atracção comercial particular. Para algumas espécies há ainda vantagens específicas, tal como descrito acima.

Os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas obtidos por qualquer processo do invento aqui descrito podem crescer até formar plantas, por exemplo, plantas maduras, sob condições adequadas, por exemplo, numa estufa ou no exterior. É uma vantagem em muitos casos, que os rebentos obtidos de acordo com o processo do invento possam formar raiz directamente no composto e crescerem numa estufa, em vez de requerem um passo intermédio de formação de raízes em meio semi-sólido.

Como verificado atrás, dependendo da concretização do invento, as plantas podem ser, por exemplo, plantas anuais, bienais ou perenes; podem ser plantas gimnoespérmicas, monocotiledóneas ou dicotiledóneas; podem ser plantas herbáceas ou lenhosas, por exemplo, as plantas esclerofilosas e outras plantas lenhosas, especificamente descritas atrás. As plantas podem ser para serem usadas na agricultura, horticultura, floresta ou em culturas de plantação. As plantas podem ser ornamentais ou produzir culturas ou produtos úteis. Exemplos de plantas e dos seus usos são dados atrás.

As plantas obtidas a partir de rebentos, rebentos com raízes ou plântulas, através de qualquer processo do presente invento, são elas próprias partes do presente invento, assim como são os produtos obtidos a partir de tais -23-

At plantas. Tais plantas podem ser micropropagadas de acordo com o processo de micropropagação do presente invento. Pelas razões mencionadas atrás, isto é particularmente útil para a propagação de plantas maduras, por exemplo, eucaliptos maduros.

Os seguines Exemplos não limitativos ilustram o invento. EXEMPLOS 1 a 10

PROPAGAÇÃO DE E. GRANDIS E HÍBRIDOS DE E. GRANDIS A menos que especificado de outro modo, o meio, os materiais de planta, a temperatura, o fluxo de ar e as condições de iluminação descritas abaixo foram usados nos Exemplos 1 a 10:

Meio

Meio sólido KM para micropropagação de E. grandis & híbridos de E. grandis

Phytagel 3 g/1

Sacarose 10 g/1 10 x solução macronutriente1 100 ml(l

MgS04.7H20 0,925 g/1 NH4NO3 0,825 g/1

Sal basal Murashige e Skoog (1962)2 50 ml/1

Solução de carga micronutriente (Sigma M0529) 1000 x Murashige e Skoog (1962) 0,5 ml/1 solução de vitaminas (Sigma M03900) BAP (6-benzilaminopurina) 0,04 mg/1

Ajustar a pH 5,6 com KOH e autoclave a 121°C durante 20 minutos. 110 x solução macronutriente contém 2,2 g/1 de CaCl2.2H20,0,85 g/1 KH2P04 e 1,9 g/1 KN03. ^ · » · Murashige T; Skoog F: (1962) A revised médium for rapid growth and assay with Tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15 473-497.

Meio líquido KM para micropropagação de E. grandis & híbridos de E. grandis

Ingredientes: tal como para o meio sólido KM, excepto que (i) o Phytagel é omitido (ii) são usados 0,01 mg/1 BAP em vez de 0,04 mg/1 BAP que é usado no meio sólido

Meio KM de meia resistência para a formação de raízes de rebentos de E. grandis & híbridos de E. grandis

Este meio contém metade do teor de macronutriente, o micronutriente, MgS04.7H20 e NH4NO3 do meio sólido KM médio. O BAP é omitido e substituído com 0,2 mg/1 IBA (ácido indoil-3-butírico). O pH é ajustado a pH 5,6 e o meio é autoclavado a 121°C, durante 20 minutos, tal como descrito atrás para KM básico de resistência total.

Quando aplicável, é adicionado 1,0 g/1 de carvão activado antes da esterilização.

Temperatura, fluxo de ar e condicoes de iluminação A micropropagação líquida, micropropagação e formação de raiz em meio semi-sólido foram conduzidos a 22°C com um fotoperíodo de 16 horas (50-70 pmol.m^.s'1, fornecido por lâmpadas fluorescentes). A menos que especificado de outro modo, os caudais de ar estavam na gama de 0,3-0,7 litros por minuto por litro de meio líquido.

Material de planta usado para inoculação

Todos os materiais de planta usados para inoculação foram previamente micropropagados em meio semi-sólido. Clones híbridos de E. urophvlla x grandis 18,50 e 18,52 foram obtidos do Centre National de Recherches Forestieres, B.P. 764, Pointe Noire, República do Congo.

Clones de E. grandis 5046 e 5048 foram fornecidos pelo Prof D.L. Rockwood, Dept. Forestry, Univ. Florida, Gaunesville, Florida 32611-0303 Estados Unidos da América.

Clone híbrido de E. grandis x E. camaldulensis 11/25 foi fornecido à Shell South África pelo South African Forestry Research Institute, PO Box 727, Pretória 0001, África do Sul. A estirpe de plântulas de E. grandis T14 L10 foi derivada de semente de E. grandis fornecida pelo Institute of Commercial Forestry Research, University of Natal, P.O. Box 375, Pietermaritzberg 3200, República da África do Sul (lote de sementes referência n° 38064).

Preparação de rebentos usados para inoculaçgo

Rebentos micropropagados de E. grandis ou de híbridos de E. grandis, possuindo meristemas apicais, foram usados como material de partida.

Cada rebento possuía 2-4 nódulos e uma ponta de rebento. Os rebentos tinham previamente sido subcultivados em série num meio KM sólido básico contendo 0,04 mg/1 BAP. As culturas a partir das quais as pontas dos rebentos foram colhidas tinham formado raízes espontaneamente. O material de planta a partir dos quais os rebentos foram derivados tinham previamente sido cultivados durante extensos períodos num meio contendo antibiótico (augmentin) e que era * conhecido como isento de contaminantes microbianos Velocidade de multiplicação dos rebentos A menos que especificado em contrário, as velocidades de multiplicação (propagação) dadas nos Exemplos são para rebentos que são adequados para formação de raiz directamente no composto ou indirectamente através do meio semi-sólido. EXEMPLO 1

Propagação de rebentos de E. grandis usando um sistema de fluxo de ar com movimento livre dos rebentos. O meio, temperatura, fluxo de ar e as condições de iluminação usadas foram as referidas atrás.

Dispositivo O dispositivo consistia num fornecimento de ar comprimido efectuado através de um regulador de pressão combinado com um manómetro. A válvula de libertação da pressão (NUPRO SS-6C-MM-10), activada quando a -27- J&f. d~—^[ pressão atinge aproximadamente 10 psi (aproximadamente 67000 Pa), foi colocada na linha a juzante do regulador. A corrente de ar foi feita passar através de um filtro de carvão activado (Whatman Carbon Cap 75) e humidificado por passagem através de água destilada usando um difusor de gás (Pyrex n°2) e um balão Erlenmayer de 21. A corrente de ar desodorizada e humidificada foi usada para abastecer o fermentador de fluxo de ar. A corrente de ar foi esterelizada por passagem através de um filtro de gases (Whatman Hepa-Vent com tamanho de poro de 0,3 pm) antes de ser alimentada ao fermentador de fluxo de ar. O fermentador compreendia um vaso de cultura de 51 (Quickfit FV) com uma tampa (Quickfit MAF2/2) possuindo 5 orifícios de 19 mm. A corrente de ar foi feita passar através da abertura central usando um tubo de aço inox de 6 mm de diâmetro e um adaptador da tampa (Quickfit). Um tubo de difusão de gás (Pyrex n°2) foi ligado à entrada de aço inox de modo a que o difusor estivesse a aproximadamente 0,5 cm da base do vaso de cultura montado. A exaustão consistia de um tubo de aço inox, inserido numa entrada usando um adaptador de junta de rosca (Quickfit) ventilado para a tmosfera através de um filtro de gás (Whatman Hepa-Vent). O tubo de silicone (Grau cultura de tecido, Merck) foi usado no dispositivo a juzante do filtro de carvão activado. É possível substituir o vaso de cultura de vidro por garrafas de plástico (grau de cultura de tecido), por exemplo, garrafas de polipropileno ou policarbonato de grau de cultura de tecido, que são consideravelmente mais baratas.

Preparação do dispositivo O vaso fermentador de remoção de ar foi cheio com 4,5 1 do meio líquido KM descrito atrás. Foi usado pasta de silicone para assegurar uma boa vedação da flange e a tampa foi fixada usando um grampo (Quickfit JC 100F). -28-

Duas das entradas remanescentes foram bem fechadas. Os orifícios de entrada e de saída foram embrulhados com uma folha e seladas com uma fita, como precaução adicional contra estas possíves potenciais vias de contaminação. O orifício remanescente foi tapado e embrulhado em folha e fita sem apertar muito para permitir o acesso de vapor durante a esterilização e para permitir a subsequente inoculação com os rebentos. O fermentador e os filtros de entrada/exaustão foram autoclavados como unidades montadas usando um ciclo de 30 min de pré-aquecimento/60 minutos de pressão máxima (121°C). O fermentador foi deixado a arrefecer à temperatura ambiente (durante a noite), antes do orifício de inoculação ser fixado e o fermentador removido do autoclave. O fermentador foi colocado um banho de água a 22°C, ligado ao fornecimento de ar e equilibrado durante 1 hora antes da inoculação (caudal de ar de aproximadamente 1,8 litros/minuto).

Micropropagacão dos rebentos

No primeiro dia, o fermentador foi inoculado com dez rebentos de E. grandis micropropagados obtidos a partir da estirpe de plântula T14 LIO. O peso total do inoculo foi de 493 mg. O fermentador foi novamente ligado ao fornecimento de ar. O fluxo de ar foi ajustado ao caudal máximo que dava origem a uma corrente estável de bolhas, aproximadamente 1,8 1/minuto. O fermentador foi isolado com escudos de protecção, e operado durante um período de 27 dias antes da estimativa das velocidades de multiplicação e do aumento da biomassa. O aumento da biomassa foi estimado por remoção de três massas dc rebentos, secas em papel de filtro e pesadas. O teor de humidade foi estimado por secagem até peso constante numa estufa de vácuo a 60°C durante 72 horas. A percentagem de teor de humidade dos rebentos micropropagados, similar à usada para inoculação, foi estimada usando o mesmo método. As velocidades de -29- Ι/^Λ, γ --" ^ *"·& multiplicação foram estimadas por dissecação de três massas de rebentos de cada fermentador em explantes de nodais de ponta de rebentos. Os explantes nodais e alguns dos explantes da ponta dos rebentos foram subcultivados em dois meios de micropropagação básicos sólidos (meio KM sólido contendo 0,04 mg/1 BAP e/ou meio KM sólido contendo 0,04 mg/1 BAP e 1% p/v de carvão activado). As eficiências de formação de raiz de explantes de pontas de rebentos foram estimadas por transferência para dois meios de formação de raízes (meio KM sólido de meia resistência, contendo 0,2 mg/1 IBA e meio KM sólido contendo 0,2 mg/1 IBA e 1% de carvão activado). Após 5 dias, algumas das pontas dos rebentos que foram inicialmente transferidas para meios de formação de raízes contendo carvão activado foram subcultivados em meios de formação de raízes sem carvão.

Resultados

Após inoculação inicial, a superfície dos rebentos não ficava rapidamente molhada. As bolhas de ar ligavam-se aos rebentos que flutuavam na superfície do meio e não trambolhavam muito. Após vários dias, as superfícies dos rebentos ficavam molhadas e os rebentos começavam a trambolhar com intensidade.

Nove dias após a inoculação os rebentos mostravam altas taxas de crescimento nos ápices e a maioria dos botões axilares que estavam presentes na altura da inoculação tinham começado a crescer. Algumas, poucas, das maiores folhas presentes na altura da inoculação mostravam sinais de hiper-hidricidade (vitrificação), necrose e sofriam de abscisão.

Dezasseis dias após a inoculação, o meio começava a tomar-se

-30- turvo. Alguns sinais de hiper-hidricidade, necrose e abcisão das folhas mais velhas tomaram-se aparentes. Os rebentos laterais continuaram a alongar-se. Os novos axilares resultantes do crescimento em extensão a partir dos ápices e dos ramos primários começaram a crescer. Todos os novos crescimentos pareciam saudáveis sem nenhum desenvolvimento anormal aparente. Seis das massas de rebentos começaram a desenvolver raízes a partir da base das massas de rebentos.

Vinte e quatro dias após inoculação, a turvação do meio tinha aumentado e um depósito espumoso tinha-se formado no interior do vaso acima do nível do meio. Os sinais de hiper-hidricidade, necrose e abcisão das folhas mais velhas tomaram-se mais pronunciados e ocorriam nas folhas maiores dos ramos primários. Foram retiradas amostras do meio e examinadas microscopicamente de modo a determinar a causa da turvação. O meio continha células de planta intactas e corrompidas e também grandes quantidades de resíduos celulares, mas não havia evidência de contaminação microbiana. Globalmente, as massas de rebentos eram compactas, verdes e mostravam poucos sinais de hiper-hidricidade. Alguns poucos dos novos ramos primários e secundários tinham-se partido das massas principais de rebentos.

As massas de rebentos foram recolhidas a partir do fermentador, 27 dias após a inoculação. A Figura 1 mostra a aparência das massas de rebentos típicas do fermentador em comparação com os rebentos típicos usados como inoculo e com uma massa de rebentos típica cultivada em meio sólido: a massa de rebento 1 na Figura 1 é um rebento micropropagado típico usado como inoculo. A massa de rebento 2 é uma massa de rebento típica produzida após 5 dias de cultivo num meio de micropropagação sólido (meio KM): As massas de rebentos 3a e 3b são duas massas de rehentos típicas colhidas após 27 dias de cultura -31 -líquida submersa num meio líquido KM.

Estimativas do aumento em percentagem em peso, biomassa seca e teor de humidade dos rebentos colhidos a partir dos fermentadores são mostrados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Peso húmido, biomassa seca e teor de humidade - Peso húmido do inoculo (10 rebentos) 493 mg - Peso seco estimado do inoculo (a 91,8% de teor de humidade) 40,4 mg - Peso húmido de 3 massas de rebentos típicas recolhidas dos fermentadores 15,466 g - Aumento estimado de peso húmido (corrigido para o total de 10 massa de rebentos) 104,5 vezes - Peso seco de três massas de rebentos típicas recolhidas dos fermentadores 1,671 g - Aumento estimado de peso seco (corrigido para o total de 10 massa de rebentos) 137,9 vezes

Estimativas das velocidades de multiplicação totais e das velocidades de multiplicação das pontas dos rebentos são mostradas na Tabela 2 abaixo. Nessa tabela, as estimativas das velocidades de micropropagação são expressas como explantes das pontas dos rebentos que foram julgadas adequadas para ajuste directo da formação de raízes e como explantes totais que eram adequados para mais micropropagação em meio sólido. -32-

<V i •i.

Tabela 2

Velocidades de multiplicação Número de explantes de pontas de rebentos adequados para formação de raiz a partir de cada uma das três massas de rebentos 59, 46, 56 Média 54 Número estimado de explantes adequados para mais micropropagação a partir de cada uma das três massas de rebentos 111,102,121 111 Média

Nos rebentos resultantes, os efeitos da inibição correlativa nos meristemas de rebentos axilares pareceram ter sido completamente abolidos. Todos os sistemas de ramificação que se originavam a partir dos nódulos existentes na altura da inoculação continham ramos terciários. Os nódulos de idade decrescente que resultavam do crescimento em extensão a partir do ápice do rebento inoculado possuíam sistemas ramificados de complexicidade decrescente.

Os ramos terciários tinham começado a formar-se a partir dos botões axiliares nos ramos secundários. Os caules principais tinham crescido extensivamente e as massas de rebentos possuíam uma média de 10 nódulos (gama de 9-11 nos três rebentos dissecados). Os caules dos explantes originais tinham-se expandido até aproximadamente 2 mm de diâmetro na base e os ramos primários, secundários e terciários possuíam diâmetros das hastes -33-

C—-J decrescentemente menores nos seus pontos de ramificação. As pontas dos rebentos dos caules originais, os ramos primários e os ramos secundários, a partir de ambos os meios, deram origem a pontas dos rebentos que eram bem alongados, possuíam hastes espessas e robustas e dois ou mais nódulos bem espaçados. Dentro de uma única classe de ramos dos rebentos, havia um notável grau de uniformidade entre os rebentos colhidos, apesar do número de nódulos que os ramos de origem possuíam. Quase todos os ramos terciários consistiam de uma ponta de rebento (duas folhas e meristema) e sem nódulos. A maior diferença entre os rebentos de uma única classe de ramos foi verificada no grau de alongamento dos rebentos terciários. Apenas os rebentos terciários bem alongados foram colhidos para subsequente transferência para o meio sólido. Verificou-se que as raízes apenas se desenvolveram na base de sete dos principais rebentos inoculados.

Quando observado, os sinais de hiper-hidricidade das folhas eram aparentes nas folhas velhas, bem expandidas e não estavam tão avançados como seria de esperar das observações efectuadas quando o fermentador estava em operação. Em material jovem (ou seja nas pontas dos rebentos e nos nódulos apicais) não eram mostrados quaisquer sinais significativos de hiper-hidricidade. A dissecação das massas de rebentos indicou que os caules mais velhos eram bastante quebradiços, indicando hiper-hidricidade.

Após recolha das massas de rebentos produzidos no meio líquido KM e subsequente transferência para o meio de micropropagação sólido KM, os explantes das pontas dos rebentos e os explantes nodais pareciam saudáveis. Quatro dias após a transferência, não se detectavam diferenças entre os explantes transferidos para o meio de micropropagação KM, com ou sem carvão activado. Os explantes pareciam saudáveis em comparação com pontas de rebentos e explantes nodais tratados do mesmo modo antes de serem cultivados num meio -34-

de micropropagação sólido KM, sem carvão activado. 28 dias após a transferência, o crescimento de meristemas apicais (quando presentes), o início do crescimento dos novos meristemas axilares e o subsequente crescimento de alongamento dos rebentos axilares pareciam ser semelhantes em explantes, quer colhidos a partir de massas de rebentos produzidos no meio líquido KM, quer em explantes previamente cultivados em meio de micropropagação sólido KM sem carvão activado.

As eficiências de formação de raízes dos explantes de pontas de rebentos colhidos quer a partir de massas de rebentos produzidas em meio líquido KM quer colhidos a partir de rebentos, previamente cultivados em meio de micropropagação sólido KM, sem carvão activado, são mostrados na Tabela 3. TABELA 3

Eficiência da formação de raiz de explantes de pontas de rebentos 28 dias após transferência para o meio de formação de raiz

Percentagem de formação de raiz de explantes de pontas de rebentos

Tratamento de Explantes de pontas Explantes de pontas Formação de raiz de rebentos colhidos de rebentos colhidos a partir de massas a partir de culturas produzidas em meio produzidas em meio líquido KM sólido KM sem carvão activado 66 86

Meio de formação de raiz KM de resistência média -35-

Meio de formação de raiz KM de resistência média mais carvão activado 52 41

Meio de formação de raiz KM de resistência média: 5 dias com carvão activado, 23 dias sem carvão activado 84 53

Sob as três condições ensaiadas , as eficiências de formação de raiz dos explantes de pontas de rebento colhidas de massas de rebentos produzidas em meio líquido KM eram superiores às dos explantes das pontas dos rebentos colhidas a partir de rebentos previamente cultivados em meio de micropropagação sólido KM, sem carvão activado. A formação de raízes dos explantes de pontas de rebentos colhidos a partir do fermentador foi primeiramente observada 10 dias após a tranferência para o meio de formação de raízes sólido, dois dias antes das pontas dos rebentos colhidos a partir de rebentos previamente cultivados em meio de micropropagação sólido KM, sem carvão activado. A micropropagação de E. grandis descrita atrás deu origem a elevadas velocidades de multiplicação e a uma abundância de rebentos para subsequente formação de raiz. Os rebentos para formação de raiz mostraram um aumento de cerca de 50 vezes por mês e o número total de explantes que podem ser usados para quaisquer passos de micropropagação subsequentes aumentaram -36-c~

I Λ «-λ num excesso de 100 vezes por mês. Os elevados níveis de multiplicação foram espelhados pelo aumento da biomassa.

Tal como descrito atrás, a qualidade dos rebentos colhidos a partir das massas de rebentos produzidas em meio líquido foi elevada, com alguns sinais de hiper-hidricidade.Os sinais de hiper-hidricidade que foram observados foram confinados aos tecidos mais velhos. Os rebentos colhidos dos fermentadores pareciam formar raiz mais rapidamente em meio sólido contendo EBA do que os rebentos de controlo colhidos directamente a partir de culturas propagadas em meio sólido. A qualidade dos rebentos é tal que estes podem ser adequados para formação de raiz directa no composto na estufa, tal como para os rebentos de Acacia mangium descrita no Exemplo 11 a seguir. EXEMPLO 2

Propagação de clones híbridos de E. grandis & plântulas de E. grandis

Diferentes clones híbridos de E. grandis e a plântula de E. grandis micropropagada estirpe T14 LIO foram micropropagados usando o método de fluxo de ar descrito no Exemplo 1 excepto que foram usados vasos de policarbonato comercialmente disponíveis possuindo uma capacidade de cerca de 2,5 litros (vasos de "2 litros" da Nalgene, Nalge Co. Box 20365, Rochester, NY 14602-00365, USA; n° cat. 2015-2000) e tampas de rosca de polipropileno contendo aberturas de entrada e de saída (Nalgene n° cat. 2162-0531), em vez dos vasos de vidro. O sistema de oxigenação/arejamento foi ajustado usando uma abertura (entrada) pré-formada tal como descrito no Exemplo 1,2,0 litros de meio de micropropagação líquido KM, tal como descrito atrás, foram colocados em cada vaso e os vasos foram autoclavados (ciclo de 10 min de pré-aquecimento, 20 min à pressão máxima (12°C)). Uma vez arrefecidos, cada vaso foi ligado ao fornecimento de ar para equilíbrio durante 1 hora antes da inoculação com 20 rebentos de um dos clones ou da estirpe de plântula indicada, clones e plântulas que tinham sido previamente propagados em meio sólido. A operação dos vasos terminou após 22 dias porque alguns dos vasos tinham ficado cheios com massas de rebentos para propagação.

Cinco massas de rebentos típicas de cada vaso foram dissecadas de modo a estimar as velocidades de multiplicação conseguidas. A Tabela 4 mostra as velocidades de multiplicação obtidas para cinco clones e uma estirpe de plântula usados. TABELA 4

Velocidades de multiplicação de diferentes genótipos e híbridos de E. grandis em fermentadores de fluxo de ar

Velocidade de multiplicação (após 22 dias) (média de 5 rebentos) 24,4 24.7 31,3 30.7 11.7 3,1

Genótipo do rebento

Estirpe de plântula T14 LIO Clone E. Grandis x camaldulensis 11/25

Clone E. urophylla x grandis 18,50

Clone E. urophylla x grandis 18,52

Clone E. grandis 5046 Clone E. grandis 5048 -38- tr^rh C—

Para os cinco ou seis genótipos usados, as velocidades de multiplicação são consideravelmente superiores às que seriam alcançadas usando um sistema de meio sólido (gelificado). Em quatro dos seis genótipos, as velocidades de multiplicação são 8 a 10 vezes superiores às que seriam alcançadas usando um sistema de meio sólido (gelificado). EXEMPLO 3

Propagação de rebentos de eucalipto usando um sistema de fluxo de ar com os rebentos restringidos O sistema de fluxo de ar usado nos Exemplos 1 e 2 foi modificado por restrição dos rebentos inoculados numa caixa de aço inox de 125 cm3 contendo perfurações para permitir a livre passagem do meio sobre os rebentos, em vez de permitir que os rebentos se movessem livremente no meio líquido. Foi efectuado um duplicado em que os rebentos não estavam restringidos. O método usado foi descrito no Exemplo 2 excepto que foram usados recipientes de policarbonato de 250 ml (Nalgene N° cat. 2127-0250) e tampas de enroscar de polipropileno contendo aberturas de entrada e de saída (Nalgene N° cat. 2162-0531) em vez dos vasos previamente descritos. O volume do meio usado foi de 150 ml por vaso. A preparação e a operação dos vasos foi tal como descrita para o exemplo anterior.

Cada vaso foi inoculado, quer com 5 rebentos do Clone E. Grandis x camaldulensis 11/25, quer com 5 rebentos de estirpe de plântula T14 L10 de E. grandis micropropagados, tendo os rebentos sido previamente propagados em culturas de meio sólido KM. Num conjunto de vasos os rebentos foram deixados a moverem-se livremente. Noutro conjunto de vasos os rebentos foram restringidos numa caixa tal como descrito atrás. Os rebentos foram cultivados durante 21 dias e então foram dissecados para se determinarem as velocidades de multiplicação alcançadas, que são mostradas na Tabela 5 abaixo. TABELA 5

Genótipo do rebento Velocidade de multiplicação (após 21 dias) (média de 5 rebentos) Não restringido Restringido

Clone E. Grandis x camaldulensisl 1/25 8 10 Estirpe de plântula T14 LIO de E. grandis 17,7 16,8

As velocidades de multiplicação alcançadas indicam que o movimento livre dos rebentos não é necessário para se alcançarem velocidades de multiplicação elevadas. EXMPLO 4

Propagação de rebentos de eucalipto num sistema de balão agitado O método usado foi tal como descrito no Exemplo 3 excepto que o tubo de difusão do gás não estava presente do dispositivo. Os vasos foram ventilados para a atmosfera, usando um filtro único ligado a uma abertura de entrada/saída, tal como previamente descrito. Os vasos foram agitados a 125 r.p.m. num agitador Infors CHI043, durante 22 dias. Os rebentos usados foram da estirpe de plântula T14 LIO micropropagados. Foram feitos duplicados dos conjuntos dos vasos. Num conjunto os rebentos não estavam restringidos; no outro estes estavam restringidos muna caixa tal como descrito no Exemplo 3. -40-

As velocidades de multiplicação obtidas foram de 2 para os rebentos não restringidos e de 4,2 para os rebentos restringidos. Este resultado demonstra que a multiplicação ocorrerá num balão agitado em que o material de planta está completamente submergido. EXEMPLO 5

Propagação do eucalipto usando um sistema agitado O procedimento descrito no Exemplo 4 foi efectuado excepto que, em vez de ser agitado, o conteúdo dos vasos foi agitado usando um agitador magnético com uma barra de 2,5 cm. Os vasos foram colocados em agitadores magnéticos ajustados para terem uma velocidade de agitação da barra do agitador de aproximadamente 250 r.p.m.. Cada vaso foi inoculado quer com 5 rebentos de clone E. Grandis x camaldulensisl 1/25 quer com 5 rebentos de estirpe de plântula TI4 LIO de E. grandis micropropagados. Foram feitos duplicados dos conjuntos dos vasos; num conjunto os rebentos estavam restringidos numa caixa tal como descrito no Exemplo 3, no outro conjunto os rebentos foram deixados a moverem-se livremente. Os resultados são dados na Tabela 6 abaixo. TABELA 6

Genótipo do rebento

Velocidade de multiplicação (após 21 dias) (média de 5 rebentos) Não restringido Restringido

Clone E. Grandis x camaldulensisl 1/25 Estirpe de plântula T14 LIO de E. grandis macerado macerado 8 3,2 -41 - Não foram recolhidos rebentos que pudessem ser usados do vaso contendo os rebentos não restringidos devido a dano mecânico dos rebentos provocados pela barra do agitador magnético. EXEMPLO 6

Propagação de rebentos de eucalipto na luz & no escuro O procedimento descrito no Exemplo 2, ou seja, usando o sistema de fluxo de ar foi repetido excepto que foram usados vasos de 250 ml e os rebentos foram de estirpe de plântula T14 LIO de E. grandis micropropagados. As condições de iluminação foram como descritas no início desta secção, ou seja, luz com um fotoperíodo de 16 horas (50-70 pmol.m^.s'1 fornecido por lâmpadas fluorescentes). Foi efectuado um duplicado, mas em condições de escuridão em vez de luz contínua.

As velocidades de multiplicação obtidas após 22 dias de cultura foram de 24,4 para o vaso incubado à luz e de 21,2 para o vaso incubado na escuridão. Isto indica que a luz não é essencial para se obterem altas velocidades de multiplicação desde que a oxigenação seja adequada.

Os rebentos cultivados no escuro eram mais alongados do que os produzidos com luz, indicando que a manipulação das condições de iluminação podem ser usadas para manipular a qualidade dos rebentos, o que é importante em sistemas de micropropação comercial. Por exemplo, os rebentos mais alongados de E. grandis e dos híbridos relacionados formam frequentemente raízes mais eficientemente do que os rebentos menos alongados. -42- Μ h^vh EXEMPLO 7

Propagação de eucalipto com oxigenação por fotossíntese O procedimento descrito no Exemplo 6, ou seja, cultivo à luz e no escuro foi efectuado excepto que os tubos de distribuição de gás foram omitidos do dispositivo. Neste sistema não há outra agitação para além da existente por convecção e/ou difusão, e não há oxigenação activa, ou seja, aplicada extemamente. Os rebentos eram de estirpe de plântula T14 LIO de E. grandis micropropagados.

As velocidades de multiplicação dos rebentos obtidas após 22 dias foram de 6,2 no vaso incubado à luz e de 1 (sem multiplicação) no escuro. O resultado indica qua a fotossíntese pode compensar, pelo menos em parte, a falta de oxigenação activa ou seja, aplicada extemamente. EXEMPLO 8

Propagação de eucalipto com oxigenação e luz O método descrito no Exemplo 6 usando as condições de luz contínuas foi repetido excepto que o ar borbulhado através do meio líquido foi substituído por azoto puro. Foram usados rebentos de clone de E. grandis x camaldulensis 11/25.

Foi obtida uma velocidade de multiplicação de 4 vezes, usando azoto, quando comparado com a velocidade de multiplicação de 10 quando é usado ar (ver Exemplo 6). Isto indica que oxigenação adequada, por exemplo oxigenação activa, ou seja, extemamente aplicada e/ou por fotossíntese, é requerida para apoiar a multiplicação dos rebentos. EXEMPLO 9

Propagação de eucalipto usando diferentes tamanhos de inóculos O método descrito no Exemplo 2 foi efectuado excepto que os vasos foram inoculados com quer 5, 20 ou 40 rebentos de clone de E. grandis x camaldulensis 11/25. Após 23 dias de incubação, foram obtidas velocidades de multiplicação de 8, 24,7 e 36,4, respectivamente. Isto sugere que existe uma vantagem ao usar uma elevada densidade de inoculação. EXEMPLO 10

Propagação de eucalipto por material de rebentos reciclado

Usando o procedimento descrito no Exemplo 2, clone de E. grandis x camaldulensis 11/25 e estirpe de plântula T14 LIO de E. grandis micropropagado foram inoculados nos vasos de cultura e colhidos após 23 dias. 20 rebentos foram dissecados a partir das massas de rebentos e imediatamente inoculados em vasos contendo meio líquido fresco e incubados durante mais 23 dias. Este processo foi repetido por mais um ciclo, dando um total de três ciclos de propagação.

As velocidades de multiplicação dos rebentos não diferem significativamente entre os ciclos e não havia deterioração na qualidade dos rebentos produzidos após ciclos sucessivos. Isto demonstra que o material de rebentos pode ser reciclado por sucessivas vezes através de micropropagação líquida, o que é uma vantagem comercial significativa. EXEMPLO 11

Propagação da Acacia mangium (i) Culturas micropropagadas de Acacia mangium foram

estabelecidas a partir de sementes (lote 945) obtidas da HDRC, Ryton ou Dunsmore, Coventry CV8 3LG UK. (ii) Rebentos de Acacia mangium micropropagados, previamente produzidos em meio semi-sólido compreendendo um meio de sal completo MS (Murashige e Skoog, 1962) suplementado com 2,2 μΜ BAP, foram inoculados em meio líquido da mesma composição mas sem agente de gelifícação. O método e dispositivo foram tal como descritos no Exemplo 2.

Os rebentos não mostraram sinais de hiper-hidricidade (vitrificação) e multiplicaram-se bem (velocidades de multiplicação de 12-15 vezes por mês). Os amontoados de rebentos formaram raízes a partir da base. A velocidade de multiplicação dos rebentos deste material derivado de plântulas usando o método previamente descrito em meio semi-sólido é de menos do que 3 vezes/mês. (iii) rebentos com um comprimento de 10-20 mm produzidos usando o líquido de micropropagaçõ descrito na secção (ii) atrás foram colhidos, imersos em pó de formação de raiz (pó de formação de raiz Seradix n°2, Hortichem Ltd. Salisbury, Wilts SP2 7NU, UK) a ajustados para formação de raiz em composto numa câmara de nevoeiro (96% de humidade relativa), a 25°C, sob luz de dia com sombra (máximo de 250 pmol.m" s‘). As eficiências de formação de raiz obtidas foram superiores a 70% para material produzido no processo em comparação com menos de 60% de formação de raiz para rebentos produzidos em meio semi-sólido usando o mesmo procedimento de formação de raiz. (iv) O efeito de ciclos repetidos de material de rebentos de Acacia mangium por sucessivas vezes em micropropagação líquida foi determinado usando o método descrito na secção (ii) atrás. Os rebentos foram colhidos após um ciclo inicial de um mês de propagação no sistema de -45-

Ls C_Λ fermentador de fluxo de ar, descrito na secção (ii) atrás, colhidos e reinoculados em vasos contento meio fresco e cultivados, durante mais um mês. Este processo foi repetido durante mais um ciclo, dando um total de três ciclos de propagação. As velocidades multiplicação dos rebentos não diferiam muito entre os ciclos e não havia uma deterioração detectável da qualidade dos rebentos produzidos após ciclos repetidos. A capacidade de reciclar o material de partida é uma vantagem comercial considerável. EXEMPLO 12

Propagação de oliveiras

Os rebentos micropropagados de Olea europaea (cultivar Dolce Agogia previamente produzido em meio semi-sólido, tal como descrito por Rigini et al. (Sei Hortic (Amst), 24(2), 1984, 123-134) foram inoculados em meio líquido da mesma composição mas com as fito-hormonas ajustadas a 4,9 μΜ Zeatin e 2,9 μΜ GA3 (ácido giberélico) sem agente de gelificação. O método e dispositivo foram como descritos no Exemplo 2.

Foi obtido material muito saudável. As velocidades de multiplicação são ligeiramente superiores às publicadas para sistemas de meios gelificados (7 vezes/mês no sistema líquido vs um máximo de 6/mês para este genótipo, em sistemas de meio gelificado) e houve mais duas importantes vantagens do sistema líquido em relação ao sistema gelificado: 1) os rebentos resultantes são muito mais saudáveis; os sistemas gelificados todos relatavam clorose (amarelecimento), enquanto que o sistema líquido produz rebentos verdes escuros saudáveis. 2) Os rebentos produzidos no sistema líquido são mais alongados e -46-deste modo não requerem um passo de alongamento extenso antes da formação de raiz. Os rebentos produzidos em sistemas de meio gelificado requerem uma etapa extensa de alongamento (mais de 1 mês) antes da formação de raiz. EXEMPLO 13

Propagação de Rhododendron

Os rebentos micropropagados de Rhododendron yakushimanum cultivar Dopey previamente produzidos num meio semi-sólido tal como descrito por Lloyd e McCowan (Combined Proceedings of the International Plant Breeders Society 30, 1980, 421-437) foram inoculados em meio líquido da mesma composição mas com as fito-hormonas ajustadas a 2,5 μΜ 2iP (N6-(2-isopentiladenina)) sem agente de gelificação. O método e dispositivo foram tal como descritos no Exemplo 2.

Foi obtida uma multiplicação de 6 vezes em 4 semanas, em comparação com uma multiplicação de 2-3 vezes em 6 semanas em meio gelificado. A uniformidade dos rebentos obtida de acordo com o sistema de cultura líquido foi excelente e muito superior à obtida usando sistema de propagação gelificado. Uma grande vantagem do sistema líquido é a de que não são produzidos rebentos adventícios e todos os novos rebentos são produzidos a partir de botões axilares. Em todos os sistemas gelificados, podem ser formadas grandes quantidades de calos na base dos rebentos de multiplicação. Os rebentos adventícios são frequentemente produzidos a partir dos calos através de organogénese. Estes rebentos adventícios são por vezes não de tipo verdadeiro (ou seja são anormais) devido ao fenómeno de variação somaclonal. (Este fenómeno é com frequância associado a variações no número de cromossomas ou -47- /<(<-

em rearranjos cromossómicos). Correntemente, os produtores de Rhododendron têm que sacrificar as velocidades de multiplicação de modo a evitar a formação de calos e a formação de rebentos adventícios para assegurar que as plantas que estão a propagar são do tipo verdadeiro. O sistema líquido do presente invento evita este problema.

Os rebentos produzidos no bioreactor foram alongados numa cultura de 2-3 semanas em meio semi-sólido tal como descrito atrás antes da formação de raiz no composto usando o método descrito para a Acacia mangium. As eficiências de formação de raiz obtidas foram em excesso de 90% e equivalentes às eficiências de formação de raiz de rebentos produzidos em meio semi-sólido, tal como previamente descrito, usando o mesmo procedimento de formação de raiz. A manipulação das condições de crescimento no bioreactor facilita a produção de rebentos mais alongados que serão adequados para formação de raiz imediatamente após a recolha da cultura líquida. EXEMPLO 14

Propagação de malus domestica

Rebentos de Malus domestica cultivar Greensleeves previamente produzidos em meio semi-sólido compreendendo meio de sais MS completo (Murashige e Skoog, 196) suplementados com 5 μΜ BAP, 0,5 μΜ IBA e 3 μΜ GA3 foram inoculados em meio líquido da mesma composição mas sem agente de gelificação e reguladores de crescimento de planta, sendo o método e o dispositivo descritos no Exemplo 2.

As velocidades de multiplicação dos rebentos foi de 3/mês, o mesmo que foi obtido em meio semi-sólido descrito atrás. Contudo, o sistema líquido requer menores passos de manuseamento do que o sistema semi-sólido, e por isso η -48-tem vantagens comerciais. Os rebentos obtidos apresentavam alguns sintomas dc hiper-hidricidade, mas quandos os rebentos colhidos do vaso eram transferidos para o meio semi-sólido, tal como descrito atrás, todo o novo crescimento era isento de sintomas. EXEMPLO 15

Propagação de Forsythia 15 rebentos micropropagados de Forsythia x ontermedia cv. Lynwood previamente produzidos em meio semi-sólido LS (Linsmaier ES & Scoog S, Phys. PI (1965) 18 100-127) suplementados com 3% de sacarose e 10 μΜ BAP foram inoculados em meio líquido da mesma composição mas sem agente de gelifícação, sendo o método e o dispositivo descritos no Exemplo 2. Os rebentos foram colhidos após quatro semanas.

Os rebentos colhidos cresceram bem. Não havia sinais de hiper-hidricidade e os rebentos eram semelhantes na aparência, em particular na textura e cor, em relação aos rebentos que cresceram em meio semi-sólido. Contudo, no meio semi-sólido pode desenvolver-se um amontoado de rebentos muito curtos dos quais apenas 2-3 rebentos se alongam normalmente. No meio líquido todos os rebentos eram alongados indicando que as velocidades globais de multiplicação podem ser consideravelmente superiores às existentes no meio semi-sólido. Os rebentos colhidos do meio líquido pareciam ser adequados para formação de raiz directamente no composto, sob nevoeiro, numa estufa. EXEMPLO 16

Propagação de Syringia

Foi usado meio MS semi-sólido (Linsmaier ES & Scoog S, Phys. Pl. (1965) 18, 100-127) suplementado com 3% de sacarose e 30 μΜ BAP ou com -49- 3% sacarose e 10 μΜ zeatina para a micropropagação de rebentos de Syringia vulgaris cv. Madame Mamoine. O meio de BAP suplementado deu origem a boa proliferação mas a fraco alongamento ao mesmo tempo que o meio de zeatina dava origem a uma fraca proliferação dos rebentos. Os amontoados dos rebentos produzidos no meio BAP foram transferidos para o meio de zeatina para alongamento. Para a cultura líquida o meio BAP sem agente de gelificação foi usado como meio líquido. 15 rebentos micropropagados foram inoculados no meio líquido, sendo o método e o dispositivo descritos no Exemplo 2. Os rebentos foram colhidos após quatro semanas. As folhas de explantes originais tinham ficado castanhas mas o novo crescimento era verde escuro e apresentava poucos sintomas de hiper-hidricidade. Os rebentos pareciam ser adequados para formar raiz directamente no composto sob nevoeiro numa estufa.

Lisboa, 13 de Setembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrie RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a micropropagação de rebentos, rebentos com raízes ou plântulas de uma planta lenhosa, que compreende o cultivo dos rebentos, rebentos com raízes ou plântulas, num meio líquido oxigenado, com os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas sendo submersos no meio líquido.
2. Processo tal como reivindicado na reivindicação 1, em que o meio líquido é agitado.
3. Processo tal como reivindicado na reivindicação 2, em que o meio de cultura é agitado e é proporcionado oxigénio por passagem de oxigénio ou de ar através do meio.
4. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas são livre de se moverem no meio líquido.
5. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o movimento dos rebentos, rebentos com raízes ou plântulas é restringido.
6. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que os rebentos, rebentos com raízes ou plântulas são obtidos a partir de um cultivar, clone ou semente.
7. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a planta lenhosa é uma gimnosperma ou uma angioesperma dicotiledónea usada para pasta de papel, para combustível ou para madeira serrada; uma árvore, um arbusto ou uma moita que produzam frutos ou frutos secos; uma árvore ou arbusto a partir do qual é obtido um produto comercialmente útil que não um fruto ou um fruto seco; ou uma árvore ornamental ou arbusto.
8. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a planta lenhosa é de uma espécie esclerófila.
9. Processo tal como reivindicado na reivindicação 8, em que a planta lenhosa é um Rhododendron, Azalea ou Kalmia (Ericácea); uma Olea (Oleácea); ou uma Acacia Australiana.
10. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a planta lenhosa é uma Malus (maçã); Pyrus, Prunus ou Rosa (Rosácea); Forsythia ou Syringia (Oleácea).
11. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a planta lenhosa é um eucalipto.
12. Processo tal como reivindicado na reivindicação 11, em que o eucalipto é um eucalipto do sub-género Eucalvntus symphyomyrtus.
13. Processo tal como reivindicado na reivindicação 12, em que o eucalipto é E. grandis. E. globulus. E.nitens. E. dunnii. E. saligna. E. camaldulensis. E. urophvlla ou um híbrido destes, ou E. regnans, E. citriodora, E. fraxinoides ou um híbrido destes.
14. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o cultivo dos rebentos é continuado até que a formação da raiz se tenha iniciado ou tenha ocorrido.
15. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o rebento, rebento com raiz ou plântula resultante é ainda micropropagado repetindo o processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
16. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o meio líquido oxigenado compreende também um antibiótico.
17. Processo tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que os rebentos, rebentos com raiz ou plântulas crescem até formar uma planta.
18. Processo tal como reivindicado na reivindicação 17, em que é obtido uma pasta para papel, combustível, madeira serrada, fruta, fruto seco, uma substância farmaceuticamente aceitável ou um precursor de uma substância farmaceuticamente aceitável a partir da planta. Lisboa, 13 de Setembro de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA