PT89010B - Processo para a preparacao de um novo fungicida que se obtem da cultura de cercospora fusimaculans e de composicoes fungicidas que o contem - Google Patents

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um principio activo -bioquimicamente que se obtém por cultura de fungos do género

Cercospora; as composições fungicidas que compreendem uma quan tidade eficaz com características fungicidas do referido princípio, juntamente com diluentes ou veículos compatíveis do pon to de vista agronómico e fisiologico e eventualmente outros ma teriais activos e ainda à utilização do referido princípio e com posiçoes fungicidas para combater fungos em plantas ou em animais, incluindo mamíferos e ainda como conservante em alimentos, pinturas ou madeiras preparadas.

TÉCNICA ANTERIOR

Até ao presente momento os fungos são controlados nas plantas mediante a aplicaçao de fungicidas sintéticos, orgânicos ou inorgânicos na área a tratar.

Estes fungicidas são dispendiosos e consomem energia para a sua preparaçao e frequentemente nao sao muito eficazes para combater os fungos. Estes factos podem frequentemente ser devidos ao clima ou ãs condiçoes ambientais que prevalecem na área e no momento da aplicaçao. Também a utilização do fungicida durance um período prolongado tende a seleccionar fungos que sao tolerantes ao fungicida.

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ecosistemas em que são dissiminados e também tendem a acumular e eventualmente a exibir efeitos secundários indesejáveis.

Por estas e outras razões é desejável desenvolver fun gicidas biológicos que são fácilmente digeridos na natureza e que não consomem grande quantidade de energia como a requerida para a sintese química da maior parte dos fungicidas conhecidos.

Através do desenvolvimento do trabalho do inventor des_ cobriu-se surpreendentemente que os fungos que pertencem ao género Cercospora exibem interessantes propriedades relacionadas com este aspecto.

género Cercospora é largamente conhecido como provocador de doenças de manchas na folha em largo número de hospedeiros de diferentes géneros. Algumas espécies de Cercospora São conhecidos como produtores de diferentes metabolitos.

Cercospora Beticola produz ácido fúlvico (Sakaki T., Ichihara A., Sakmura S. Isolation of fulvic acid from Cercospora Beticola; Agric.Biol. Chem 45(5): 1275-1276 (1981) £e uma fitotóxina amarela (Martin S.S., Steinkamp M.P. The yellow plytotoxins of Cercospora Beticola.Proc. Int. Bot. Congr. 13: 296 (1981)J. C. kikuchii produz cerosporina (Matsueda S. , Takagaki K., Shimoya ma M., e Shiota A., Studies of fungai products V. Ãntimicrobia1 aspects of Quinone derivatives. Yakugaku Zasshi 100(9):900-902 (1980) jj e ergosterol-5,8-peroxide (Matsueda S., Shimoyama Μ. ,

Imaizumi T., Tsushima Y., Studies on fungai products 4. Biological effects of ergosterol-5,8-peroxide. Yakugaku Zasshi 102(4):

347-351 (1982)J.

Matsueda et al. verificaram que a cercosporina inibe o crescimento de estafilococos aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas Aeruginosa, E. coli e Candida japonica . A cercosporina foi τ

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isolada sob a forma de cristais vermelhos, Pfizer Handbook of

Microbial Metabolites McGraw-Hill Book Co.Inc. N.Y. Toronto London from Shimpei Kuyama and Telichi Tamura . J. Am.Chem Soc. 79:

5725-5726 (1957).

C. arachidicola produz um metabolito antraquinonoide ÍStoessl A., Stothers J.B., Minor anthraquinonoide-metabolites of Cercospora arachidicola . Can. J. Chem. 63(6): 1 258-1262- (1985)3 e C. cruenta produz metabolitos que são estruturalmente relacionados com o ácido abscísico (Takayuki Oritani, Kyohei Yamashita.

Isolamento e estrutura do ácido 4 '-hidroxi - -ionilideno-acêtico a partir de Cercospora cruenta, um fungo produtor de ( + )-áci_ do abscisioo Agríc. Biol. Chem 51(1): 275-278 (1987)3 tal como a mutasteína, patente de invenção japonesa N2 48920 publicada a

86-10-27.

C. rosicola produz ácido abscísico, (pedido de patente de invenção japonesa N2 192674, pedido em 82-11-02).

C. fusimaculans foi isolado a partir de um certo número de ervas (Ellis M.B.) More dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England (1976) J e tem sido referido como a causa da doença foliar do sorghum spp. (Wall G.C., Mughogho L.K., Frederiksen R.A., Odvody G.N. Foliar disease of sorghum spp. caused by Cercospora fusimaculans. Plant Dis. 71(8): 759-760 (1987) 7 e Bajra Pennisetum typhoides (Patel

K.S. A Cercospora fusima culans leaf spot disease of Bajra Pennise tum typhoides in Gujarat. Curr. Sei. (Banga lor e ) ' 4 2 (1 ) 34). Até ao momento não foi regista da qualquer produção de um princípio activo fungicida de C. fusimaculans.

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RESUMO DA INVENÇÃO

Como foi referido anteriormente, a presente invenção refere-se à surpreendente descoberta de fungos gue pertencem ao género Cercospora e gue exibem propriedades fungicida s de inte_ resse. Freguentemente a presente invenção refere-se a um princípio activo bioguímico gue se obtém através da cultura de fungos do género Cercospora, o qual se verificou exibir uma activi_ dade fungicida única.

De acordo com esta invenção, um segundo aspecto refere-se a composições fungicidas gue incluem uma quantida de eficaz de princípio activo fungicida que se obtêm através da cultura de um fungo do género Cercospora e conjuntamente com veículos compatíveis do ponto de vista agro-guímico e/ou fisiológico ou com um solvente.

Ainda num outro aspecto da presente invenção referem-se composições fungicidas gue incluem uma suspensão de um número efi_ caz de esporos ou de Micilium provenientes de um fungo do gênero

Cercospora num meio compatível.

Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para combater fungos nas plantas e nos animais, incluindo animais mamíferos em gue uma quantidade eficaz de um prin

I cípio activo fungicida gue se obtém mediante a cultura de um fun_ go do género Cercospora é aplicado numa região a ser tratada.

Neste aspecto desta invenção também se inclui o comba. te ou controlo de fungos em alimentos, madeiras preparadas, tintas e outros incluindo meios de crescimento para micro-organismos .

Ainda num quinto aspecto da presente invenção refere-se a utilização de um princípio activo fungicida que se obtêm

a partir da cultura de um fungo pertencente ao género Cercospora que contro la fungos nas plantas ou animais incluindo os mamí_ feros.

esente invenção diz respeito a princípio activo fungicida megênero Cercospora e isolamento

Um sexto aspecto da pr um proceso para a produção de um diante a cultura de um fungo do do referido princípio activo.

DEPOSIÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS

A espécie do género Cercospora, Cercospora fusimaculans

Atk foi depositada no Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS),

P.O. Box 273, NL-3740 AB BAARN, Holanda para fins de processo de patente na data abaixo indicada. A CBS ê um depositário internacional autorizado de acordo com o tratado de Budapeste que oferece permanência do depósito de acordo com a regra número nove do referido tratado

Data do depósito: 22 de Outubro de 1987

Ref. dos depositantes: Cercospora fusimaculans Atk

Designação da CBS: CBS 616, 8 7

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

Como foi indicado nesta invenção no seu primeiro aspeç to, ela refere-se a um princípio fungicida activo gue se obtém mediante a cultura de um fungo do género Cercospora.No seu segun do aspecto a invenção refere-se a uma composição fungicida gue inclui uma quantidade eficaz de um princípio activo fungicida de acordo com a reivindicação N2 1 e que se obtém por cultura de um fungo do gênero Cercospora e ainda um veículo ou diluente compatível sob o ponto de vista agro-químico e/ou fisiológico.

Dependendo das circunstâncias, tais como a cultura em

que o fungo deverá ser combatido, as condições ambienta is ou ou_ tros factores, a composição da presente invenção além do referi, do princípio activo fungicida também pode conter outros ingredientes activos tais como agentes biocidas, pesticida s, herbicidas, insecticidas, nematocidas, acaricidas ou agentes nutrientes ou fertilizantes das plantas.

Para combater os fungos nos animais as composições da presente invenção deverão incluir habitualmente o referido princípio activo só com um veículo compatível sob o ponto de vista fisiológico ou com um diluente mas podem ser a ssociadas com outros ingredientes activos tais como um antibiótico.

Num aspecto especial da presente invenção uma composição é constituída por uma suspensão de uma quantidade eficaz de esporos ou micelium de um fungo do género Cer co spora para um meio compatível apropriado.

As r e ferida s composições são preparadas de um modo con veniente utilizando-se um meio de desenvolvimento líquido para a preparação do fungo, o qual, subsequentemente é diluído para um certo número de unidades viáveis (esporos e/ou micelium) p/ml,

10 tipicamente numa escala compreendida desde 10 a 10 , de prefe λ 4 6 rencia de cerca de 10 a cerca de 10 .

Subseguentemente a referida suspensão é aplicada na área a tratar. A quantidade aplicada à referida área pode variar depen dendo das circunstâncias gue se referiram anteriormente.

Num aspecto preferido da presente invenção o referido princípio activo fungicida obtém-se por cultura de um fungo da espécie Cercospora fusima culans e num aspecto especialmente preferido a referida espécie é Cercospora fusimaculans Atk gue foi depositada em 22 de Outubro de 1987 no Centraalboreau voor

-7Schimmelcultures de acordo com o número de depósito: NQ CBS 616,87.

Um composição fungicida de acordo com a presente invenção gue possui um princípio activo fungicida como ingrediente activo pode ser constituida para aplica ções agronómicas e/ou para horticultura mediante a mistura do princípio activo com veí_ culos ou diluentes inertes apropriados compatíveis para se obter uma composição geralmente utilizada na agricultura tal como um pó humectável, um concentrado emulsionante, uma composição sob a forma de granulado, um pó solúvel na água, um alginato, uma goma xantica e/ou um aerossol. Como veículos sólidos podem mencionar-se a bentonite, a vermiculite, a apatite, o talco, a piro filite , a terra diatomaceas, o gesso, conchas pulverizadas e argila. Também pode ser adicionado um agente tensio-activo com o fim de produzir uma composição estável e homogénea.

solvente ou veículo das composições da presente invenção pode, como indicado, ser um sólido ou líquido eventualmente em associação com um agente tensio-activo, por exemplo um agente de dispersão, um agente emulsionante ou um agente humectante.

Agentes tensio-activos apropriados incluem compostos aniónicos tais como um carboxilato, por exemplo um carboxilato de metal de um ácido gordo de cadeia longa; um N-acilsarcosinato; Mono ou di-estéres do ácido fosfórico com etoxilatos de álcoois gordos ou sais destes estéres sulfatos de álcoois gordos tais como dodecil sulfato de sódio, octadecil sulfato de sódio ou cetil sulfato de sódio, sulfatos de álcoois gordos etoxilados, sulfatos de alquifenois etoxilados, sulfonatos de lenhina, sulfonatos do petróleo, sulfonatos de alquilarilo tais como os sul-8-

fonatos de alguilbenzeno ou sul fonatos de alquil inferior naftaleno·; por exemplo sul fonatos de butil-naftaleno, sais de con_ densados de naftaleno sulfonatado formaldeído; sais de condensados de fenol sulfonado formaldeído ou sulfonatos mais complexos tais como os sulfonados de amida, por exemplo produtos de condensação sulfonados do ácido oleico e N-metil taurino ou sulfo-succinatos de dialquilo, por exemplo sulfonato de sódio de succinato de dialquilo. Agentes não aniônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos, ami das de ácidos gordos ou fenois substituidos por alcenilo ou alquilo gordos com óxido de etileno , esteres gordos de éteres de álcool poli-hidrico, por exemplo ésteres de ácidos gordos de sor_ bitano, produtos de condensação desses ésteres com óxido de etil no, por exemplo esteres de écido gordo de polioxietileno sorbita. no, blocos copolimér icos de óxido de etileno e óxido de propile. no, glicois acetilenicos tais como 2,4,7,9-tetra-etil-5-decin-4 ,7-diol, ou glicois acetilênicos etoxilados .

Exemplos de um agente tensio-activo catiónico inclui, por exemplo, um mono-, di-, ou poliamida alifática sob a forma de um acetato, naftaleno ou oleato; uma amina gue contém oxigénio tal como um óxido de amina ou uma alquilamina de poliox ietileno ou uma amina ligada a uma amida prepara da por condensação de um ácido carboxílico com uma di- ou poliamina ou um sal de amónio quaternário.

As composições da presente invenção podem apresentar-se sob qualquer forma técnicamente conhecida para a composição de produtos agro-químicos, por exemplo sob a forma de uma solução, de uma dispersão, de uma emulsão aquosa, de um pó dispersível, de uma semente revestida, um pó dispersível, um concenX /

-96 *ξ· traão emulsionável ou grânulos.

Além disso pode apresentar-se sob uma forma apropria_ da para a aplicação directa ou sob a forma de um concentrado ou composição primária que requer diluição numa quantidade apropria, da de água ou outro diluente antes da aplicação

Um concentrado emulsionável contem o ingrediente acti. vo dissolvido num solvente imiscível em água sob a forma de uma emulsão com água na presença de um agente emulsionante.

Um pó para aspersão consiste numa mistura intima de um ingrediente activo com um diluente pulverulento sólido finamente dividido, por exemplo o caulino.

Um granulado consiste num ingrediente activo associado com diluentes idênticos aos gue são utilizados para os pós para pulverização mas a mistura está sob a forma de granulado mediante a utilização de métodos convenciona is alternativamente pode consistir num ingrediente activo absorvido ou adsorvido num diluente pré-granular, por exemplo terra de Fuller, atapulgite ou areia calcária.

Os pós humectáveis, granulados ou grãos, de um modo geral incorporam o ingrediente activo de uma mistura com um agen. te tensio-activo apropriado e um diluente em pó inerte tal como o caulino.

Outro concentrado apropriado é um concentrado em suspensão fluida formada por um ingrediente activo pulverizado com água ou outro líquido, um agente humectante e um agente de suspensão .

Para utilizar no combate de fungos em animais, incluin do mamíferos o referido princípio activo pode ser composto media te a mistura deste com um ou mais , veículos compatíveis inertes /

10apropriados tecnicamente conhecidos para se utilizarem em com_ posições tópicas.

A concentração do princípio activo aqui referido nas composições da presente invenção pode verificar dentro de largos limites dependendo do tipo de composição e do campo de aplicação.

Em conecção com isto refere-se que os testes ultimamente referidos mostraram que o princípio activo é eficaz para controlar os fungos que atacam os mamíferos em concentrações en_ tre 0,5 f-hg/ml e 5 J^g/ml e é consequentemente considerado que o princípio activo pode ser aplicado em concentrações que variam desde cerca de 0,01 Jtg/ml a cerca de 10 Jig/ml para se utilizar no controlo de fungos em animais.

No seu terceiro aspecto a presente invenção refere-se a um método para fungos de plantas ou animais, incluindo mamíferos em gue uma quantidade eficaz de um princípio activo fungicida gue se obtém por cultura de um fungo do género Cercospora é aplicado a uma região gue vai ser tratada..Em ligação com este aspecto as composições da presente invenção para aplicação em agronomia e/ou em horticultura são aplicadas numa região a ser tratada quer directamente ao solo como um tratamento de pré-emergência ou são aplicadas nas folhas ou frutos das plantas como um tratamento de pós-emergência. Dependendo da cultura e circunstâncias o tratamento pode ser retardado atê que as semen_ tes ou os frutos apareçam nas plantas em que os fungos têm de ser controlados.

A preparação activa ou as composições da presente invenção podem ser aplicadas directamente na planta, por exemplo mediante dispersão ou pulverização no momento em que o fungo

iniciou o seu aparecimento sobre a planta ou antes âo aparecimento do fungo como uma medida protectora . Em ambos os casos a forma de aplicação preferida é por dispersão sobre as folhas.

De um modo geral é importante obter um bom controlo dos fungos nos estados precoces de desenvolvimento da planta porque este é

o., momento em que a planta pode ser mais gravemente danificada.

Se se considerar necessário, o aerossol ou pó podem conter, de modo conveniente, um herbicida de pré- ou pós-emergência.

Algumas vezes é prático tratar as raízes da planta an. tes ou durante a plantação, por exemplo emergindo as raízes num líquido apropriado ou numa composição sólida. Quando a preparação activa da presente invenção é aplicada directamente na planta, uma taxa apropriada de aplicação está compreendida entre 0,001 e até 100 Kg por hectare, de preferência desde 0,05 a 5 Kg por hectare.

No método da presente invenção a preparação activa des. ta invenção isolada ou em associação com um agente biocida convencional também pode ser aplicada às sementes ou no seu meio am biente. Assim a prepara ção pode ser aplicada directamente ao solo antes ou após perfuração, de tal modo que a presença do ingre. diente activo no solo possa controlar o desenvolvimento dos fun. gos que podem atacar as sementes.

Quando o solo é tratado directamente a preparação activa, isolada ou em mistura com um agente biocida convencional, po. de ser aplicada de qualquer modo que permita a sua mistura ínti_ ma com o solo, por exemplo por aspargimento, por dessiminação de uma forma sólida em granulado ou mediante aplicação do ingredien. te activo no mesmo momento das perfurações por imerção na mesma perfuração gue se destina às sementes. Uma taxa de aplicação

apropriaãa deverá estar compreendida entre 0,01 e 20 kg por hec tare, de preferência entre 0,05 a 10 Kg por hectare.

Para utilização em veter inária e medicina as composições da presente invenção devem ser aplicadas a uma região a ser tratada guando o diagnóstico tenha sido estabeleci, do por um veterinário ou um médico.

As composições podem ser aplicadas em quantidades compre, endidas entre cerca de 1 g e cerca de 100 kg de princípio activo fungicidamente por hectare.

Ainda que a presente invenção tenha sido descrita detalhadamente em relação ao controlo em animais e em plantas, tam. bém foi antecipado que o princípio activo fungicidamente pode ser utilizado para a preservação de madeiras tratadas mediante adição do princípio activo a composições de protecção de madeira e/ou por meio de composições de impregnação. Também o princípio activo da presente invenção pode ser utilizado como um agente fungicida e conservante em tintas, quer para evitar o desenvolvimento de fun gos nas tintas armazenadas ou o desenvolvimento da pintura de uma superfície como por exemplo uma superfície plástica de um edifício .

Também o princípio activo fungicidamente da presente invenção pode, devido à sua reduzida toxicidade, ser utilizado para a conservação de produtos alimentares tais como compotas, marmeladas ou outros alimentos em gue o princípio possa ser adi. cionado a seguir a qualquer processo de cozinhado.

Também o princípio com aetividade fungicida da presente invenção pode ser utilizado como um aditivo fungicida a meios de desenvolvimento para diversos micro-organismos tais como g.

Coli, B.subtilis, pseudomonas aerugenosa e S. Aureus.

PRINCÍPIO COM ACTIVIDADE FUNGICIDA

principio com a ctivida de fungicida da presente invenção pode ser produzido de um modo extra-celular na superfície ou submerso nos substractos gue contêm diferentes fontes de hidratos de carbono e de azoto. Quando aplicados no estado impu_ ro _f tal como são produzidos em frascos de agitação não existe um efeito aparente sobre o desenvolvimento de:

E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Torulopsis ernobii, Rhodotorula ruda, Rhodorula gracilis, Hansenula holstii, Candida albicans, Penicillium funiculosum, Aspergillus fumigatus,

Aspergillus aculeatus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus awamor i, e Estafilo cocos aureus.

Descobriu-se gue este tem um efeito inibitório no desenvolvimento dos fungos dos seguintes géneros:

Botrytis, Rhizomucor, Pyricularia, Fusarium, Penicillium, e especialmente em Botrytis cinerea, Rhizomucor miehei, Pyricularia oryzae,

Penicillium digitatum, Cercospora traversiana, Cercospora sorghii,

Cercospora sesami, Cercospora scirpicola, kikuchii, Cercospora haji, Cercospora beticola, Sclerotinia fructicola, Aspergillus oryzae, Fusarium culmorum, Fusarium decemcellulase, Fusarium a cuminatum, Fusarium moniliforme, Fusarium sporotrichioides,Fusarium poae, Fusarium fugikurai, Fusarium longipes, Rhizopus oligosporus, Trichophyton, Microsporum, Epidermaphyton, Pichia sp.,

Torulopsis spherica, Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula glutinis,

Rhodotorula minuta, Candida a lbicans, Tr ichoderma viride, Drechslera australiensis, Gibberellá fugikuri, Phoma herbarum, Pycnoporus sangiuneus, Penicillium notatum, Penicillium oxalicum, Penicillium crustosum, Penicillium implicatum, Penicillium lividum, Penicillium cyclopium, Penicillum digitatum, Penicillium italicum, Aspergillus

cervinus, Aspergillus cremens e outros.

Anteriormente referiu-se gue Matsueãa et al,198O descobriu gue a cercosporina, um composto isolado de C. kikuchii tinha um efeito inibitório sobre certos micro-organismos.

Do referido no parágrafo anterior torna-se obvio gue o princípio activo da presente invenção ê diferente da cercosporina . Também um pigmento vermelho produzido por a CBS 616,87, o gual contem cercosporina, pode ser fácilmente separado do princípio activo da presente invenção sem afectar a actividade do referido princípio. 0 pigmento citado não exibe qualquer acção inibitória no desenvolvimento de Botrytis cinereia.

O princípio ê activo sobre uma grande escala de phs e temperaturas mas ê inactivado guando levado à ebulição durante cerca de um minuto. Não se regista perda de actividade aparente guando conserva do sob a forma de caldo de cultura no refrigerador durante três meses.

Não exibe inícios de actividade mutagénica guando na presença ou na ausência de sistemas de activação metabólica S-9 (teste de Ames). Os caldos de cultura gue contêm o fungicida e esporos viáveis não mostraram acção sobre os murganhos quando aplicados por via intra-peritonea 1 numa dose de 20 ml por kg de g

peso corporal. Estes continham 3x10 contagens viáveis.

ESTIRPES QUE PRODUZEM 0 FUNGICIDA

Os fungos gue produzem o princípio activo da presente invenção têm sido identif ica dos como pertencentes aos géneros

Cercospora.

As colónias são na sua maior parte hipof ilo sa s. Têm conidioforos f a sei cuia dos, de um castanho azeitonado pálido, com pequenas manchas. Os conidios entrecruzam-se freguentemente, hia

linos, com cerca ãe 3 a 4 septos, 15-70x2-2,5 m.

o CBS 616,87 foi isolado das folhas de Panicum maximum recolhidas em St. Andrews, Jamaica, em Dez. de 1986. Foi identificado como Cercospora fusimaculans. Na mesma altura .um deter_ minado número de Cercospora gue produzia um princípio activo fungicida foi isolado das folhas de P. maximum e em Agosto de

1988 Cercospora também produtora da mesma actividade foi isolada das folhas de P. maximum recolhidas em St. Catherine, Jamaica .

As espécies podem ser isoladas das folhas em muitas ervas diferentes (Ellis supra).

Também se descobriu que a Cercospora setariae Atkinson, depositado no Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane,Kew,

Surrey, England e designado por CMI 161118 e CBS 494,71 exibe a produção do princípio activo fungicida.

CULTIVO DAS ESTIRPES

A estirpe gue produz o fungicida pode-se desenvolver sobre lâminas de agar contendo os seguintes ingredientes em g por :

extracto de levedura 4,0 di-hidrogênio fosfato de potássio 1,0 sulfato de magnésio hepta-hidratado .0,1 glicose 15 bactoTM (Difco Laboratories, Detroit USA) agar 20.

Este substrato é esterelizado à temperatura de 121^0 durante 20 ou 40 minutos e será posteriormente aqui referido por IPG agar. As lâminas gue contêm 12 ml de IPG agar são, ápós inoculç ção incubados a uma temperatura de 20 a 25°C durante 7 dias ou .0.

mais.

PRODUÇÃO DO FUNGICIDA

Preparou-se um substracto para frascos de agitação com os seguintes ingredientes por litro:

extracto de levedura 4,0 g hidrogénó fosfato de potássio 1,0 g sulfato de magnésio hepta-hidrata do 0,1 g glicose 15 g TM plurovic L61 (BASF. R.F.A.) O,lg água desmineralizada.

Realizou-se a esterilização a uma temperatura de 121°C durante 20 minutos. Um Erlenmeyer de 500 ml, com 100 ml de substracto foi inoculado com 10& esporos retirados de uma placa inclinada de agar IPG previamente inocula da com Cercospora fusimaculans CBS 616,87. Os frascos foram agitados a 230 r.p.m. a uma temperatura de 25^C durante 3 a 7 dias após o que o caldo de fer mentação se centrifugou.

A fracção sobre-nadante que continha o fungicida foi se parada do micelium. 0 micelium foi regeita do e a fracção sobre-na_ dante foi analisada para se determinar a actividade fungicida .

fungicida também pode ser produzido em colunas de su_ perfície

ANALISE ô

Âdicionaram-se 10 esporos de Botrytis cmereia a 50

ml de sais diluído	s :
hidrogéno fosfato	de	amónio	- 66	mg
di-hidrogeno fosfa	to	de potássio	- 68	mg
hidrogéno fosfato	de	dipotássio	- 87	mg
cloreto de cálcio	di-	-hidra ta do	~ 7,	4 mg

-1 7cloreto de magnésio hex a-hidrata ão mg água destilada esterilizada a até prefazer 1 litro e 121^0 durante 20 minutos.

Este meio foi misturado com 50 ml temperatura gue favoreceu a viabilidade dos compreendida entre cerca de 30^C e cerca de veniente, onde o agar foi conservado líquido

de agar IPG a uma esporos de R-otritis 45®C, de um modo con sem qualquer prejui zo para os esporos. Verteram-se 12 ml desta mistura em placas de petri de 9 cm e deixou-se solidificar. Fizeram-se de 1 a 5 cavidades de 4 mm no agar e colocaram-se 15 ml de caldo de cultura em cada cavidade.

As placas de petri foram incubadas a uma temperatura entre 20 e 25^0 durante dois dias. A presença de um fungicida re velar-se-ia como um zona sem desenvolvimento nítido em volta das cavidades. A zona mais larga corresponderia ao fungicida mais for te. A fracção sobrenadante produziu sob estas condições uma zona transparente de 25 mm.

EXTRACÇÃO DO PRINCÍPIO ACTIVO princípio activo da presente invenção pode ser extraído mediante adsorção sobre o adsorvente Amberlite XAD-4, gue foi cuidadosamente lavado com acetona, etanol e água destilada. A aplicação da amostra sobre o adsorvente é seguida de diversas imagens com água destilada. Ã eluição é realizada com etanol e acetona e o princípio activo é concentrado sob vácuo à temperatura ambiente.

PROTECÇÃO DE UVAS CONTRA A BOTRITIS CINEREIA _

Uvas verdes comercializadas foram separadas, lavadas e secas. Retiveram-se os pedúnculos nos frutos. Foram feitos dois orifícios com 1 mm de profundidade nos frutos com as pontas de uma seringa gue continha 10& por ml de esporos de Botri. tis. As uvas em seguida foram incubadas à temperatura ambiente numa atmosfera húmida durante 24 horas.

foram em seguida submersas no caldo de cultura e pos

de 1 semana no caldo de seringa conincubados sob quadro 1, a tas de novo em condições de humidade durante cerca

Num outro caso, os frutos foram submersos cultura e 24 horas depois foram perfuradas com uma tendo esporos de Botritis. Também neste caso foram uma atmosfera húmida durante cerca de 1 semana.

Os resultados deste ensaio mostramrse-no seguir.

QUADRO 1

Tipo de tratamento

IR dia

Botrites cinereia

Ãgua

Caldo de cultura

2° dia água caldo de cultura botritis cinereia

Exp. 1

Φ % de -protecção

Exp . 2 Exp . 3

Φ

Φ

Φ

Φ * Nesta experiência a estirpe utilizada de Botritis cinereia gue foi resistente a 100 partes por milhão de Iprodione (Rhone RouLenc)

Como se pode ver no quadro 1 as uvas gue foram tratadas com o caldo de cultura de CBS 616,87 foram controladas de um modo muito eficaz contra a Botritis cinereia guando comparadas com as gue foram tratadas com água.

Quando os esporos não foram injectados no interior das uvas pode-se esperar um grau de protecção ainda mais elevado.

-19Também a protecção é óbvia quando a Botritis cinereia é resistente a fungicidas químicos conhecidos.

ENSAIOS DE CAMPO PARA PROTECÇÃO CONTRA A BOTRITIS CINEREIA

I: Tomate fungicida foi testado relativamente à sua capacidade para proteger tomateiros da Botrite cinereia em estufa.

Ambos os controlos e materiais de experiência consistiram em 3 conjuntos de 8 plantas cada, medindo entre 75 e 90 cm de altura. Fizeram-se 100 sulcos nas folhas das 8 plantas e estas foram imediatamente pulverizadas com 1% de uma amostra liofilizada de caldo de cultura. Os controlos foram pulverizados com água. Decorridas 4 horas cada planta foi pulverizada com 4x10^ esporos de Botritis cinereia. A estufa foi mantida a uma tempe_ ratura entre os 18°C e os 20°C e a humidade relativa de cerca de 90% durante duas semanas. Após as quais se contou o número de folhas infectadas.

As plantas de controlo exibiam um total de 126 infecções enquanto que as tratadas com o fungicida de Cercospora exi_ biam 44 infecçoes.

II ERVILHAS eluido a 20% (ver a extracção do princípio activo) foi dessiminado sobre ervilhas (do tipo Bodil) no campo para se observar quantas seriam protegidas da infecção natural por Bo2 tritis 4 conjuntos) cada um de 3 m foram utilizados para o ensaio e 4 como controlo. Juntaram-se ao eluato os seguintes compostos :

- 0,2% de Bevaloid 211, um agente dispersante (Bevaloid Ltd.',

P.O. Box 3, Flemingate Berverley, North Humberside HK 270 NW

Inglaterra ).

1% de alcopol, um agente tensio-activo (Allied Colloids Ltd., P.O. Box 38, Low Moor, Bradford Yorkshire BD 120 UZ, Inglaterra )

1:1600 de adesivo Chevron em Spray, produto Ortho NQ 2786.

A primeira pulverização foi realizada no inicio da flo_ ração e a segunda foi realizada 10 dias mais tarde. Quando as va gens estavam totalmente maduras e as plantas estavam secas, esco_ lheram-se 10 plantas ao acaso de cada conjunto e verificaram-se no laboratório para detecção de infecção por Botr itis nas vagens e nos caules. Os resultados seguidamente expostos representam a média de infecção por conjunto

TRATAMENTO	% DE INFECÇÃO
VAGENS	CAULES
Controlo	11	63
Fungicida de Cercospora	6	35

COMBINAÇÃO COM HERBICIDAS

Prepararam-se placas de petri como descrito na rubrica

Análise e utilizaram-se para investigar o efeito de herbicida^ sobre o fungicida de Cercospora. Descobriu-se gue o fungicida não tinha actividade guando associado com Cloro sul furon (du Pont) (0,05 a 0,5 mg/ml), Atrazine (Ciba Geigy) (1 a 10 mg/ml) e Simazine (Ciba Geigy) (0,1 a 1 mg/ml). A sua actividade foi ligeira_ ente aumentada (10 a 20%) guando se adicionou 0,1 a 10 mg/ml de

Lasso (Monsanto). Os 4 herbicidas não exerceram efeito sobre a

Botritis guando aplicados i sola damente .

O fungicida pode ser utilizado em casos em gue a Botrite cinereia é resistente a produtos químicos que são presentemente utilizados. Pode ser utilizado sobre os frutos e vegetais como por exemplo uvas, morangos, tomate, frutos citrinos e para a pro_ tecção após colheita por exemplo sobre as cenouras também pode ser utilizado para proteger ou curar as plantas gue normalmente são atacadas por Botritis.

EFEITO DO FUNGICIDA SOBRE DERMATÕFITOS fungicida produzido por CBS 616,87 foi ensaiado sobre Trichophyton rubrum, T. Mentagrophytes e Microsporum cannis.

Estes eram isolados clínicos recentes e foram cultivados à temperatura de 25°C sobre agar que continha os ingredientes que se seguem em gramas/litros:

Bacto Yeast Morphology agar 35;

Sulfato de amónio 1,5;

di-hidrogeno-fosf ato de sódio di-hidratado 0,429 hidrogéno-fosfato-dipotássico 0,92 hidróxido de sódio 5N - 1 ml pH de 7,1

Este substrato foi esterilizado à temperatura de 121^C durante 20 minutos. Os micèlium provenientes de 3 fungos foram fragmentados com pérolas de vidro estéril em água estéril e uma gota aplicada no centro de placas de petri que continham o mesmo meio de agar como referido anteriormente mas a gue se tinha adicionado fungicida Cercospora. 0 fungicida foi adicionado numa concentração desde 0,5 g/ml até 5 g/ml do elvato descrito

sob a rubrica extracção do principio activo. TJtilizou-se para comparação Griseofulvina. Os controlos foram preparados com o mesmo agar mas isentos de fungicida. Foram feitas cinco répli_ cas para cada teste.

Todas as placas foram incubadas à temperatura de 25@C durante 5 dias após os quais foram observadas para se determinar o desenvolvimento fúngico.

RESULTADOS fungicida de Cercospora preveniu totaIntente o desen. volvimento dos três fungos em todas as concentra ções ensaiadas. Este facto significa que a concentração inibidora minima foi de 0,5 /'-g/ml. Esta, C.I.M. para a Griseofulvina ê de 1,5 /ig/ml, 3^/ml e 10 f*g/ml para Trichophgton rubrum, Microsporum cannis e T.

mentagrophgtes, respectivamente

PRESERVAÇÃO DA MADEIRA

Cultivaram-se dois fungos que contaminam a madeira,

Poria placenta e Gloeophgllum trabeum, sobre agar de malte a uma temperatura de 25°C durante guatro dias. Humedeceram-se dis_ cos de papel de filtro de 8 mm de diâmetro com 25 μ1 de eluado que continha o princípio fungicida da presente invenção e colocaram-se sobre o agar a 20 mm do topo de colónias em desen. volvimento activo. Fizeram-se 3 réplicas. Posterior incubação mostrou que o desenvolvimento dos dois fungos fora for temente.

inibido pelo fungicida.

Claims (13)

1.- Processo para a preparação de um agente fungicida apropriado para combater fungos em plantas ou animais, incluindo mamíferos, quando aplicado em quantidades eficazes à região a tratar ou quando incorporado como antifúngico em meios aditivos apropriados para preservação de alimentos ou madeiras, como ingre diente activo, caracterizado pelo facto de se cultivar um fungo do género Cercospora na presença de fontes de azoto, carbono e oxigénio assimiláveis, conjuntamente com nutrientes essenciais, e de se isolar o referido ingrediente activo.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se isolar o referido ingrediente activo do caldo de cultura.

3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se isolar o referido ingrediente activo subme

Αsubmetendo ο citado caldo de cultura a uma cromatografia de ab sorção e subsequente concentração sob vazio.

4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se utilizar um fun go da espécie Cercospora fusimaculans ou um seu mutante ou trans formante obtido por recombinação genética que exiba a mesma ca pacidade caraeteristica de produzir o referido ingrediente activo .

5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, carac. terizado pelo facto de o referido fungo ser Cercospora fusimaculans Atk, depositado no Centraalbureau voor Schimmelcultures em 22 de Outubro de 1987, a que foi atribuído o número de aceitação CBS 616.87, ou um seu mutante ou transformante obtido por recombinação genética que exiba a mesma capacidade cara£ terística de produzir o referido ingrediente activo.

6. - Processo para a preparaçao de composiçoes fungicidas apropriadas para combater fungos em plantas, especialmente fungos dos géneros Botrytis, em particular Botrytis cinerea, Rhizomucor, Fusarium, Pyricularia, Penicillium e/ou Rhizopus, ou para com bater fungos em animais, incluindo mamíferos, quando aplicadas ã região a tratar, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz compreendida entra 0, l^ig/ml e 10^ig/ml, de preferência 0,5 a 5yug/ml, de um agente fungicida, obtido mediante cultura de um fungo do genero Cercospora, com um vei culo ou excipiente compatível sob o ponto de vista agroquímico e/ou fisiológico.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se associar o ingrediente activo com actividade fungicida com outro ou outros ingredientes activos.

8, - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se escolherem os outros ingredientes activos referidos antes entre agentes biocidas, agentes pesticidas, agentes herbicidas, agentes insecticidas, agentes nematoci das, agentes acaricidas e agentes fungicidas.

9.- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se escolherem os outros ingredientes activos referidos antes entre nutrientes de plantas, agentes promotores do crescimento de plantas e agentes fertilizantes.

10.- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se escolherem os outros ingredientes activos citados antes entre antibióticos e sulfonamidas.

11.- Processo para a preparaçao de composiçoes fungicidas, caracterizado pelo facto de se suspender um numero eficaz de unidades viáveis (esporos e/ou micélio) de um fungo do gênero Cercospora em um meio compatível, tipicamente 0,1 ,ug/ml /

10yig/ml, de preferência 0,5 a 5yig/ml.

3.

12.- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de composiçoes fungicidas ou de um ingrediente fungicida apropriados para inclusão em meios aditivos para a preservação de alimentos ou madeiras, caracterizado pelo facto de se utilizar um fungo da estirpe Cerc spora fusimaculans, ou um seu mutante ou transformante obtido por engenharia genética, que exiba a mesma capacidade característica de produzir o ingrediente activo referido.

13.- Processo para a preparação de um ingrediente fungicida ou de composições fungicidas de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se utilizar um fungo da estirpe Cercospora fusimaculans Atk, depositada no Centraalbureau voor

Schimmelcultures'’ em 22 de Outubro de 1987, a que foi atribuída o número de aceitação CBS 616.87, ou um seu mutante ou transformante obtido por meio de engenharia genética, que exibe a mesma capacidade característica de produzir o referido ingrediente activo.