PT89426A

PT89426A - Processo para a preparacao de derivados de nigericina e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT89426A
Application number: PT89426A
Authority: PT
Inventors: Gerhard Seibert; Peter Hamann; Irvin Winkler; Susanne Grabley; Axel Zeeck; Ilsemarie Steinhoff; Hartmut Voelskow
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-01-12
Filing date: 1989-01-11
Publication date: 1990-02-08
Also published as: JPH01213283A; DK11489D0; KR890011888A; EP0324390A3; DK11489A; EP0324390A2; AU2836289A

Description

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) invenção de HOECHST AKTIENGESEL-LSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Franfc furt/Main 80, Republica Federal Alemã, (inventores: Dr. Axel Zeeck, Dr. Ilsemarie Steinhoff, Dr. Peter Hammann, Dr. Susanne Grabley, Dr. Hartmut Voelskow, Dr. Irvin Winkler, Prof. Dr. Ger hard Seibert, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE NIGERICINA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM".

DESCRIÇÃO 0 polieter nigericina, que pode ser obtido por cultura de Streptomyces hygroscopicus, ê descrito entre outros em J. Berger et al., Am. Chem. Soc. 73, 5295 (1951)

N

1

Descobriu-se agora que a nigericina e os seus derivados são substâncias com acentuada eficácia anti-vírica.

A invenção refere-se a 1. Derivados de nigericina de fórmula I

na qual Z representa hidrogénio, sódio, potássio, lítio, magnésio, cálcio ou amónio e R1 representa hidrogénio ou alquilo com 1 a 8 átomos de carbo no e R representa hidrogénio ou um radical de fórmula 0 0 0 II ·3 II “3 II *3 -C-R , -C-NH-R OU -C-O-R nas quais R representa alquilo com 1 a 26 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 15 átomos de carbono ou cicloalquilo com 3 a 9 âto mos de carbono, podendo estes radicais alquilo, alcenilo e cicloalquilo estar eventualmente substituídos por halogê-nio, nitro, ciano, carboxilo, alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono, tienilo, feniloxi ou fenilo, podendo por sua vez os radicais fenilo mencionados estar substituídos por halo gênio, nitro, ciano, alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono, ou em que 3 R representa fenilo, furilo ou tienilo, podendo estes radicais fenilo, furilo ou tienilo estar substituídos por halo

génio, nitro, ciano, carboxilo, alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono, ou em que 2 * 4 R representa um sulfonato de formula -S00R , em que 4 - R representa hidroxi, alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, fenilo ou p-toloilo, ou em que 12

R e R em conjunto representam um radical de formula II

RJ (II) \ /

C

R

/ N na qual 5 6 R e R são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, ou 5 6 R e R representam uma cadeia de alquileno que conjuntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um ane] de 5, 6 ou 7 membros, assim como os sais fisiologicamente aceitáveis destes compos- 12

tos, exceptuados os compostos de fórmula I nos quais R e R representam simultaneamente hidrogénio (nigericina) e aqueles em que R representa hidrogénio e R representa acetilo ou benzoilo, e o sal de sódio de um composto de fórmula I no qua] 12 R e R em conjunto representam um radical de fórmula II no 5 6 qual R e R sao iguais e representam metilo. 2. Aos compostos acima referidos para utilização como medicamentos. 3. Aos compostos anteriormente referidos para utilização como me dicamentos com acção antibacteriana. 4. Aos compostos anteriormente referidos, mas incluindo a nigeri cina e os derivados de nigericina de fórmula I em que R^ re- 2 presenta hidrogénio e R representa acetilo ou benzoilo, e o 12 sal de sódio do composto de fórmula I no qual R e R em conjunto representam um radical de fórmula II em que R^ e R^ são iguais e representam metilo, para utilização como medicamentos com actividade antivírica. 5. A um processo para a preparação dos compostos de fórmula I no qual Λ

ou um derivado em R3- com um composto de fórmula III ou IV 0 0 X-C-R3 (III) X-C-O-R3 (IV) nas quais X representa cloro, bromo ou um anidrido e 3 R tem o significado indicado acima para a fórmula I ou em que 12

b) se faz reagir nigericina (fórmula I: R = R = hidrogénio) ou um derivado em R^ com um isocianato de fórmula V 0=C=N-R3 (V) 3 em que R tem o significado acima indicado para a fórmula I, ou em que 12 - c) se faz reagir nigericina (fórmula I: R = R - hidrogénio)

ou em derivado em R^ com um complexo SO_/piridina ou com - 4 J um composto de formula Y-S00~R , no qual Y representa clo-4 Á ro ou bromo e R tem os significados acima indicados para a fórmula I excepto hidroxi ou em que 12 d) se faz reagir nigericina (fórmula I: R = R = hidrogénio) 2 -

ou um derivado em que R , na presença de um ácido de Lewis, com um álcool de fórmula VI

R 1

OH (VI) e) em que R1 tem o significado indicado I excepto hidrogénio, ou em que se faz reagir nigericina (fórmula I: na presença de um catalisador com um de fórmula VII/r5 acima para a fórmula 12 R = R = hidrogénio) composto de carbonilo 0

(VII) 5 6 em que R e R tem os significados indicados acima para a fórmula I, e em que eventualmente se transformam em seguida os compostos de fórmula I nos seus sais fisiologicamen-te aceitáveis. _ λ . Ψ

Por halogêneo entende-se fluor, cloro, bromo e iodo, especialmente cloro e bromo. 1 2

Por um derivado em R ou em R enten 2 dem-se os compostos de fórmula I nos quais R (para o derivado 11 2 em R ) ou em R (para o derivado em R ) representa hidrogénio e em cada caso o outro radical ê diferente de hidrogénio.

Por ácidos de Lewis entendem-se neste caso halogenetos de cobre, ferro, ou litio, tais como cloreto de cobre, cloreto de ferro (III) ou brometo de litio, especialmente o brometo de litio.

Os grupos alquilo e alcenilo com mais do que 2 átomos de carbono podem possuir cadeias tanto lineares como também ramificadas.

Os grupos alquilo, alcenilo, cicloal quilo, fenilo, furilo e tienilo mencionados podem estar substituídos quer uma vez quer também várias vezes.

Adiante serão descritos mais pormeno rizadamente os processos a) até e) que permitem preparar os diversos derivados substituídos de nigericina.

Com auxílio das variantes a), b) e c) do processo podem introduzir-se diversos substituintes R na molécula. Com auxílio da variante d) do processo introduz-se o

substituinte R^ na molécula. A variante e) do processo serve pa- ~ 12 ra a preparaçao dos derivados de nigericina nos quais R e R em conjunto representam um radical de fórmula II. A sequência da introdução dos deriva dos em geral não ê crítica, isto ê, pode-se introduzir na molêcu 2 la tanto primeiro o substituinte R e eventualmente em seguida o substituinte r\ como também seguir-se a ordem inversa, portanto 1 2 primeiro R e depois R .

Na variante a) do processo trabalha--se preferivelmente fazendo-se reagir a nigericina ou um derivado em R^ em quantidades equimoleculares ou num excesso até 50 ve zes, eventualmente num dissolvente inerte aprõtico, como por exem pio clorofórmio, cloreto de metileno, tetrahidrofurano (THF) ace tato de etilo ou dioxano, com um composto de fórmula III ou IV -especialmente os anidridos - até, ao termo da reacção, eventual- 5

mente na presença de uma base, de preferência piridina ou DMAP (dimetilaminopiridina).

As temperaturas da reacção neste caso estão compreendidas entre -709 C e +1009 C, e de preferência, no caso da utilização de umdissolvente, entre o ponto de solidificação e o ponto de ebulição do dissolvente, especialmente entre -709 C e +409 C. Os tempos da reacção oscilam entre 1 e 180 horas, preferivelmente 1 a 48 horas. O termo da reacção pode ser verificado por exemplo por meio de cromatografia em camada delga da (controle DC). A nigericina, necessária como substância de partida, pode ser preparada por exemplo de acordo com o processo descrito por J. Berger (obra citada Am. Chem. Soc.). Pode no entanto ser preparada também de acordo com o processo proposto no pedido de patente alemã P 3 700 325.9, obtendo-se a nigericina, além da amicina, numa cultura de Streptomyces parvu-lus DSM 3816. A nigericina pode ser extraída do micilio por meio de hexano e ser recristalizada depois da concentração.

Os compostos de partida para a variante a) do processo, os compostos de formula III ou IV, se não puderem ser obtidos no comércio, podem ser preparados facilmente por meio de processos descritos na literatura. Por exemplo, os cloretos de ácido são obtidos por reacção dos correspondentes ácidos carboxílicos com cloretos de tionilo, tricloreto de fôsfo ro ou pentacloreto de fósforo. Os compostos estão descritos por exemplo em Gattermann/Wieland, "Die Praxis des Organischen Chemi Q ^ kers", 43- edição, Walter de Gruyter, Berlim, Nova York, 1982, pãg. 303 e seguintes (para a preparação dos anidridos ver por * exemplo: ORGANIKUM, Organisch-Chemisches Grundpraktikum, 15- edi ção (1976) VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlim, registo do método pãg. 824; anidridos de ácidos carboxílicos).

Na variante b) do processo trabalha--se de preferência fazendo-se reagir a nigericina ou um seu deri vado em R^-, em quantidades equimoleculares ou num excesso até 50 vezes, com um composto de fórmula V.

Pode-se também eventualmente reali-• zar esta reacção com adição de bases. Como bases interessam por - fi -

V

exemplo trietilamina, piridina ou lutidina. Uma variante do processo b) consiste em se trabalhar num dissolvente apropriado, de preferência um dissolvente inerte tal como clorofórmio, cloreto de metileno, tetrahidrofurano, acetato de etilo ou dioxano. Pode -se também neste caso usar um excesso do composto anteriormente referido, até 50 vezes.

As temperaturas da reacção nesta variante estão compreendidas entre - 709 C e +1009 C, de preferência, no caso da utilização de um dissolvente, entre o ponto de solidificação e o ponto de ebulição do dissolvente, especialmente entre -709 C e +409 C. Os tempos de reacção oscilam entre uma e 180 horas, de preferência 1 a 48 h. O termo da reacção pode ser verificado por meio de, por exemplo, um controle em cromato-grafia de camada delgada.

Os compostos de partida para a variante b) do processo, se não existirem no comércio, podem ser facilmente preparados por processos descritos na literatura (iso- a w cianatos: Houben-Weyl, 4- edição, editora Georg Thieme, Estugar-da (1983) vol. E4).

Na variante c) do processo trabalha--se de preferência analogamente â variante b) do processo. O com plexo SOg/piridina ê obtido comercialmente. Os halogenetos de ácidos arilsulfõnicos ou alquilsulfõnicos de fórmula Y-S02R4 são obtidos por exemplo por reacção de radicais de alcanos com cloro e S02 ou por halogenação de compostos aromáticos com ácido halo-genosulfõnico Y-SO^H.

Na variante d) do processo trabalha--se de preferência fazendo-se reagir a nigericina ou um corres-pondente derivado em R com um excesso de um álcool de fórmula R^-OH na presença de um ácido de Lewis, até ao termo da reacção. Uma variante deste processo consiste em se trabalhar num dissolvente apropriado, tal como clorofórmio, cloreto de metileno, tetrahidrof urano , acetato de etilo ou dioxano. Como ácidos de Lerns prestam-se por exemplo halogenetos de cobre, ferro ou lítio, especialmente cloreto de cobre, tricloreto de ferro ou brometo de lítio. Ê muito particularmente preferida a utilização do brometo • de lítio. •n «# í*

A concentração do ácido de Lewis -referida â nigericina ou ao derivado de nigericina - ascende a 0,1 ate 50% em peso, de preferencia 0,5 ate 20% em peso. As temperaturas da reacção estão neste caso compreendidas entre -409 C e +1009 C, especialmente entre 09 C e 309 C e de preferência, quando se utiliza um dissolvente, entre o ponto de solidificação e o ponto de ebulição do dissolvente, especialmente 09 C e 309 C, Os tempos de reacção oscilam entre 1 e 180 minutos, de preferência entre 5 atê 60 minutos. O termo da reacção pode ser determinado por exemplo por meio de crornatografia em camada delgada.

Na variante e) do processo trabalha--se de preferência fazendo-se reagir a nigericina em excesso com um composto de fórmula VII atê ao termo da reacção, eventualmente na presença de um catalisador tal como cloreto de zinco, brometo de zinco, cloreto de ferro, sulfato de cobre ou cloreto de cobre. A concentração destes catalisadores - referida à nigerici na - ê preferivelmente de 0,1 atê 50%. Uma variante do processo consiste em se trabalhar num dissolvente aprõtico apropriado, co mo por exemplo clorofórmio, cloreto de metileno, tetrahidrofura-no, acetato de etilo ou dioxano. Também neste caso se pode empre gar um excesso do composto VII.

As temperaturas da reacção estão nes te caso compreendidas entre -209 C e +1009 C, de preferência, e no caso da utilização de um dissolvente, entre a temperatura ambiente e o ponto de ebulição do dissolvente, especialmente entre 209 C e 1009 C. Os tempos de reacção oscilam entre 1 e 50 horas, de preferência 1 a 12 horas. O termo da reacção pode ser determi nado por exemplo por meio de um controle cromatogrãfico em camada delgada.

Os compostos de partida para a variante e) do processo, que são os compostos de fórmula VII, quando não são susceptíveis de obtenção no comércio, podem ser facilmen te preparados de acordo com processos conhecidos da literatura. Por exemplo, obtêm-se os aldeídos de fórmula VII por oxidação de álcoois primários ou por redução de derivados de carboxilo, por exemplo com hidretos complexos, ou por redução de cloretos de • ácidos carboxílicos (outros exemplos para a síntese dos aldeídos

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ou cetonas encontram-se em Organikum, Organisch Chemisches Prak-tikum, 15- edição, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften Berlim, 1976, registo de métodos, aldeídos, cetonas, pâgs. 819 e se guintes).

A preparação dos sais fisiologicamen te aceitáveis i realizada de acordo com métodos conhecidos por si, por reacção com bases orgânicas ou inorgânicas. Para a forma ção de sais são especialmente apropriados hidróxidos, carbonatos ou bicarbonatos, tanto de metais alcalinos como de metais alcali noterrosos, assim como compostos orgânicos fisiologicamente acei tãveis que possuem um grupo amino primário, secundário ou terciário. A purificação, isolamento e tratamen to pós-reactivo das substâncias são realizados de acordo com métodos correntes; por exemplo, os produtos da reacção podem ser purificados por cromatografia através de materiais de suporte po lares, tais como sílica-gel ou ' 'Sephadex LH 20, com dissolventes como por exemplo alcanois inferiores tais como metanol, ou clorofórmio ou acetato de etilo, ou misturas metanol/clorofôrmio, mas também podem empregar-se métodos extractivos como extracção líquido/líquido ou extracção sõlido/líquido, ou por cristalização.

A nigericina, bem como os seus derivados exibem uma marcada acção antivírica. Esta actividade anti-vírica foi ensaiada em culturas celulares que foram infectadas com vírus de ensaio. Do mesmo modo os derivados exibem uma acção antibacteriana.

Os compostos de acordo com a invenção, devido âs suas propriedades farmacológicas, são apropriados para o tratamento de doenças bacterianas e doenças de origem ví-rica, que são causadas por exemplo por HSV I, II (Vírus Herpes simplex I ou II) ou também por picornavirus e retrovirus, bem co mo HIV (vírus de imunodeficiência humana). A invenção refere-se pois também â utilização dos compostos de fórmula I de acordo com a invenção, assim como os seus sais fisiologicamente aceitáveis, no tratamen . to e profilaxia de doenças bacterianas ou de doenças causadas por $

vírus Herpes, picornavirus e retrovirus.

Os novos compostos podem ser empregues como medicamentos quer isoladamente quer misturados com substâncias auxiliares ou substâncias veiculares fisiologicamen-te aceitáveis. Com esta finalidade podem ser aplicados oralmente em doses de 0,01 a 5,0 mg/kg/dia, de preferência 0,01 atê 1,0 mg/kg/dia, ou parentericamente por via subcutânea em doses de 0,001 até 2,5 mg/kg/dia, de preferência 0,001 atê 1,0 mg/kg/dia, especialmente de 0,005 a 0,2 mg/kg/dia. Ê particularmente preferida a utilização tópica, sendo então a concentração da substância activa nas pomadas de 0,001 atê 1%, de preferência de 0,01 a 0,1%. A dose pode também ser aumentada em casos difíceis. Em mui tos casos bastam todavia doses reduzidas. A invenção compreende ainda a utilização dos compostos de acordo com a invenção para a preparação de medicamentos que são utilizados no tratamento e profilaxia das doenças anteriormente enumeradas.

Um outro objectivo da presente inven ção são medicamentos que contêm um ou mais dos compostos de fórmula I de acordo com a invenção.

Os medicamentos são preparados por processos conhecidos por si e correntes para os especialistas na técnica. Como medicamentos os compostos farmacologicamente efica zes de acordo com a invenção (=substância activa) são utilizados ou tal qual ou de preferência em combinação com substâncias auxi. liares ou substâncias veiculares farmacêuticas apropriadas, na forma de comprimidos, drageias, cápsulas, supositórios, emulsões, suspensões ou soluções, sendo o teor da substância activa de atê 95%, estando preferivelmente compreendido entre 10 e 75%. Nas formas para aplicação tópica são no entanto suficientes concentrações da substância activa de 0,001 até 1%, de preferência de 0,01 atê 0,1%.

As substâncias auxiliares e substâncias veiculares apropriadas para as formulações pretendidas de composições são por exemplo, alêm de dissolventes, gelificantes, bases de supositórios, substâncias auxiliares para comprimidos e • outras substâncias veiculares da substância activa, também os an

tioxidantes, os dispersantes, emulsionantes/ antiespumantes, cor rectores de paladar, conservantes, auxiliares de dissolução ou corantes.

As substâncias activas podem ser aplj. cadas por via oral, parentêrica (subcutânea), tópica ou rectal, sendo preferida a aplicação tópica.

Os compostos activos são misturados com os aditivos apropriados para o efeito, tais como substâncias veiculares, estabilizadores ou diluentes inertes e recorrendo-se a métodos correntes são transformadas em formas apropriadas para administração, como por exemplo comprimidos, drageias, cápsulas, soluções aquosas, alcoólicas ou eleosas, ou suspensões aquosas, alcoólicas ou oleosas, cremes ou pomadas. Como substâncias veicu lares inertes podem empregar-se por exemplo goma arábica, magnê-sia, carbonato de magnésio, fosfato de potássio, lactose, glucose ou amidos, especialmente fécula de milho. Neste caso a composição pode ser realizada tanto na forma de granulado seco como também na de granulado húmido. Como substâncias veiculares ou dissolventes oleosos interessam por exemplo óleos vegetais ou animais tais como por exemplo óleo de girassol ou óleo de fígado de bacalhau.

Para a aplicação subcutânea ou intra venosa os compostos activos se desejado são postos em solução, em suspensão ou emulsão com as substâncias apropriadas para o efeito, como por exemplo parceiros de dissolução, emulsionantes ou outras substâncias auxiliares. Como dissolventes interessam por exemplo soro fisiológico ou álcoois, por exemplo etanol, pro panol, glicerina, e além destes também soluções de açúcares como soluções de glucose ou de manite, ou também uma mistura dos diversos dissolventes citados.

No seguimento a invenção será descri ta mais pormenorizadamente com base nos exemplos.

MARCHA GERAL DOS PROCESSOS . Processo 1 [ 725 mg (1 mmol) de nigericina são Ί 1

dissolvidos em 10 ml de piridina e fazem-se reagir com 1,5 mmo-les de anidrido na presença de 10 mg de dimetilaminopiridina durante 4 a 24 horas. Depois da adição de 40 ml de água agita-se por mais 20 minutos â temperatura ambiente. A fase aquosa ê extraída com acetato de etilo (3 x 20 ml) e a fase orgânica ê lava da com 2 x 10 ml de ácido clorídrico 0,1N e 2 x 10 ml de água. Depois da secagem com sulfato de sõdio evapora-se em vácuo num evaporador rotativo. A cromatografia em 250 g de sílica-gel com clorofõrmio/metanol desde 30:1 atê 9:1 produz o éster.

Processo 2 725 mg (1 mmol) de nigericina são agitados conjuntamente com 1,5 mmoles de cloreto de ácido durante 1 a 24 horas em piridina (10 ml). Depois da adição de água agita-se por mais 20 minutos â temperatura ambiente. A fase aquo sa ê extraída com acetato de etilo (3 x 20 ml) e a fase orgânica ê lavada com 2 x 10 ml de ácido clorídrico 0,1N e 2 x 10 ml de água. Depois da secagem com sulfato de sõdio evapora-se em vácuo num evaporador rotativo. A cromatografia em 250 g de sílica--gel com clorofõrmio/metanol desde 30:1 atê 9:1 produz o éster.

Processo 3 725 mg (1 mmol) de nigericina são dissolvidos em 10 ml de clorofórmio e agitados â temperatura ambiente durante 24 horas com 1,5 mmoles de isocianato. Depois da adição de água (50 ml) extrai-se com clorofórmio (2 x 20 ml). De pois da secagem com sulfato de sõdio evapora-se em evaporador ro tativo até à obtenção de um xarope. A cromatografia através de 250 g de sílica-gel com clorofõrmio/metanol desde 30:1 atê 9:1 produz o derivado de ácido carbâmico.

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Processo 4 725 mg (1 mmol) de nigericina são agitados em 10 ml de clorofórmio com 300 mg do complexo SO^/piri dina durante 20 horas. A fase orgânica ê lavada com acido clorídrico 0,1 N e em seguida ê seca com sulfato de sódio. A cromato-grafia através de sílica-gel com clorofÕrmio/metanol desde 30:1 até 9:1 produz o produto pretendido.

Processo 5 725 mg (1 mmol) de nigericina são dissolvidos em 10 ml de álcool e são aquecidos ao refluxo durante 2 horas com 100 mg de brometo de lítio. Em seguida evapora-se até â secura. 0 resíduo ê tomado em 20 ml de acetato de etilo e extraído com agua (2 x 20 ml). Depois da evaporação num evapora-dor rotativo o cetal ê obtido na forma de um resíduo sólido.

Processo 6

725 mg (1 mmol) de nigericina são dissolvidos em 10 ml do composto de carbonilo e aquecem-se ao re fluxo conjuntamente com 200 mg de cloreto de zinco. Seguidamente evapora-se até â secura. O resíduo ê tomado em 20 ml de acetato de etilo e ê lavado com 2 x 20 ml de agua. Depois da evaporação num evaporador rotativo o cetal ê obtido na forma de um resíduo sólido.

Processo 7 1 mmol do derivado de nigericina ê dissolvido em acetato de etilo (20 ml) e ê agitado 10 minutos com uma solução de um hidróxido do correspondente catião (pH 12--14). A fase orgânica ê lavada 2 vezes com água, ê seca e o dissolvente é eliminado num evaporador rotativo. O controle da for-• mação do sal ê realizado por espectroscopia ! IR (COOH) "9 = 1740 nmf (COONa)V = 1600 nm.

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Nos quadros adiante apresentados os compostos sintetizados segundo os processos 1 a 6 descritos ante riormente. No quadro 1 estio indicados os diversos substituintes 12 R e R dos derivados de nigericina com o proposito de identificação dos compostos. Indica-se igualmente no quadro 1 o peso molecular bem como o composto de partida, o tempo de reacção, o processo de preparação e o rendimento químico. No quadro 2 indicam-se dados analíticos característicos seleccionados dos compois tos obtidos (análise elementar, pico molar do composto de sódio 13 no espectro de massa e dados C-NMR). 1 A - # ·?

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QUADRO

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QUADRO 00 Γ- 00 CN 00 00 00 3* σι ι— ιο kk kk kk kk kk kk kk — — — — 00 00 00 σ> 00 00 00 00 σι 00 σι Μ X X Μ X X Ε Ε Ε Ε Ε 1 d cn Η «-μ 00 Η cn ι— 00 ο ο X υ ο — — kk — S kk Κ — — — kk Η I—I Γ Γ ιη 00 00 Γ •3* 00 Γ Γ k. t d (d ιο ιο ιο ΙΟ ΙΟ ιο ΙΟ ιο ιο ιο ιο U ϋ Η υ υ υ υ U Ο υ υ U Ο Ο ·· • X 0· 1 2 cn ^μ ιη ιο Γ- οο σι ο γΗ CN cn *3· m 10 Γ Η £ Η γΗ Η Η Η Η Η Η - 1 « -

QUADRO

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EFIC&CIA ANTIVÍRICA

Actividade antivírica na cultura celular

As substâncias ensaiadas foram dissolvidas num meio de cultura celular (Dulbecco's MEM) e foram co locadas, segundo uma diluição obdecendo a uma série geométrica de factor 3, em placas de microtítulo Standard, em 100 pl de meio de cultura celular. Em seguida realizou-se a adição de 100 pl de uma suspensão de células HeLa ou Vero no meio de cultura com 5% de soro de vitelo fetal numa densidade de células de 2 x x 105 cêlulas/ml. Os preparados foram infectados com 50 μΐ de uma suspensão de cada um dos vírus ensaiados, que foram ajustados de modo que as células apresentassem um efeito citopatogéni-co (CPE) decorridas 72 horas. A avaliação foi realizada pór observação microscópica do crescimento celular e medição fotomêtrô. ca da absorção de vermelho neutro (teste colorimetrico de acordo com Finter). Como valores MHK tomaram-se as concentrações dos preparados (ug/ml) âs quais cerca de 50% das células sobreviveram à infecção.

No quadro 3 apresenta-se a acção (in dicação dos valores MHK em pg/ml) dos diversos compostos de acor do com a invenção relativamente aos seguintes vírus:

Adeno 5, Vaccina, Herpes I, Herpes II, Influenza A, Paramyxo. III, Rhinovirus II. Ο Λ ...................

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QUADRO 3: Valores MHK em ug/ml 1 LD d to <U <3 i—1 CM σ σ\ LD 00 σ σ σ 00 CM to σι to «tf o 00 to CM ci . O o «tf O «tf «tf «tf «tf «tf O rH «tf rH «tf in «tf 1 1 rH o H (tf k» k» k» k» k» k. k» k. * k» k. k. k» k» 4-1 N o o o o O rH o o o rH o o o o «tf o rH o o Cl . H V V H ir> H LO CM o CM O σι CM σ to σ to CM σ σ 00 to CM LD CM CM σ CM ω o O O «tf O «tf rH «tf rH 00 O «tf «tf «tf rH o O O O «tf o (D a o O O o o o o o o 00 O o o H o o O O O o o ti (D V V rH V V V V a : 00 H to

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Valores MHK em ug/ml (continuação)

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EFICÃCIA ANTIBACTERIANA A eficácia antibacteriana dos compos tos de acordo com a invenção foi determinada num teste de diluição em agar de acordo com Lorian (Antibiotics in Laboratory Medi cina Williams & Wilkins, Baltimore/Londres, 1980). Neste caso di luiram-se os preparados segundo uma serie de diluição geométrica com o factor 2, em Muller Hinton agar. Uma placa de Petri continha apenas Muller Hinton agar e serviu para o controle do cresci mento das bactérias. As placas de Petri foram depois inoculadas com as correspondentes bactérias de ensaio com auxílio de um ino culador Denley - Multipoint, o qual transferia 0,6 μΐ de uma cul tura das bactérias de ensaio de 18 horas diluída a 1:100. Ao fim de 16 a 18 horas de incubação a 379 C analisaram-se microscópica mente as placas de Petri quanto ao crescimento das bactérias. A concentração mais baixa dos compos tos de acordo com a invenção que impedia ainda completamente o crescimento das bactérias foi tomado como valor MIC (Minimum In-hibitory Concentration - concentração inibitória mínima).

No quadro 4 mostra-se a acção (indicação do valor MIC em pg/ml) dos diversos compostos de acordo com a invenção relativamente ãs seguintes bactérias:

Staph. aureus (SG 511), Staph. aureus (285),

Staph. aureus (503), Strept. pyogenes (308 A),

Strept. pyogenes (77 A), Strept. faecium (D). A nigericina (composto A) serviu como substância de comparação.

Surpreendentemente os aductos de ãci do dicarboxílico da nigericina manifestam também uma acção contra bactérias gram-negativas. Assim por exemplo, a substância do exemplo 32 possui contra E.coli um valor MHK de 0,55 pg/ml, contra E.coli (DC 2) um valor MHK de 25,0 pg/ml e contra Entrob. Cloacae (1321 E) um valor MHK de 25,0 jig/ml.

Valores MIC em ug/ml

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QUADRO 4: continuação

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Claims

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REIVINDICAÇÕES -1-- Processo para a preparação de um composto de fórmula I

na qual Z representa hidrogénio, sódio, potássio, lítio, magnésio, cálcio, amónio e representa hidrogénio ou alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, e
2 R representa hidrogénio ou um radical de fórmula 0 0 0 M
3 II O II o -C-R , -C-NH-R ou -C-0-R em que R representa alquilo com 1 a 26 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 15 átomos de carbono ou cicloalquilo com 3 a 9 átomos de carbono, podendo estes radicais alquilo, alcenilo e cicloalquilo estar eventualmente substituídos por halogênio, nitro, ciano, carboxilo, alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono, tienilo, feniloxi ou fenilo, podendo por sua vez os radicais fenilo men cionados estar substituídos por halogênio, nitro, ciano, alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, ou em que 3 R representa fenilo, furilo ou tienilo, podendo estes radicais fenilo, furilo ou tienilo estar substituídos por halogênio, nitro, ciano, carboxilo, alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono, ou em que 2
„ 4 * R representa um sulfonato de formula -S0oR , em que • L* Λ /* 4 R representa hidroxi, alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, feni lo ou p-toloilo, ou em que 1 2 R e R em conjunto representam um radical de fórmula II

''R6 (IX) na qual 5 6 R e R são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, ou em que 5 6 R e R representam uma cadeia de alquileno que conjuntamente coir o átomo de carbono a que estão ligados formam um anel de 5, 6 ou 7 membros, exceptuando o composto de fórmula I no qual 12 R e R simultaneamente representam hidrogénio (nigericina) e 1 2 aqueles em que R representa hidrogénio e R representa aceti lo ou benzoilo, e o sal de sódio do composto de fórmula I no 12 qual R e R em conjunto representam um radical de fórmula II 5 6 com R =R =metilo, caracterizado pelo facto de ^ 12 a) se fazer reagir nigericina (fórmula I: R =R =hidrogênio) ou um derivado em R^" com um composto de fórmula III ou IV O 0 X-C-R3 (III) x-C-O-R3 (IV) nas quais X representa cloro, bromo ou um anidrido e R tem o significado indicado anteriormente para a fórmula I, ou pelo facto de 12 b) se fazer reagir nigericina (fórmula I: R =R =hidrogênio) ou um derivado em R1 com um isocianato de fórmula V 3 O = C = N - R (V) 3 na qual R tem o significado anteriormente indicado para a fórmula I, ou pelo facto de 12 c) se fazer reagir nigericina (fórmula I: R =R =hidrogênio) ou um derivado em R"*" com um complexo SO_/piridina ou um - 4 ó composto de formula Y-SC>2-R na qual Y representa cloro ou <

bromo e R excepto hidroxi tem os significados anteriormen te indicados para a fórmula I, ou pelo facto de d) se fazer reagir nigericina (fórmula Is R =R =hidroginio) 2 ou um derivado em R na presença de um ácido de Lewis com um álcool de fórmula VI (VI) R1-OH na qual R^" excepto hidrogénio tem os significados anterior mente indicados para a fórmula I, ou pelo facto de e) 12 se fazer reagir nigericina (fórmula I: R =R =hidrogênio) na presença de um catalisador com um composto de carbonilo de fórmula VII 0

(VII) 5 6 ^ na qual R e R têm os significados anteriormente indicados para a fórmula I, e eventualmente se transformarem em seguida os compostos de fórmula I nos seus sais fisiologicamente aceitáveis. - 2- - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se verificar pelo menos uma das seguintes condições: Z representa hidrogénio, sódio, potássio, magnésio, cálcio, amô nio, R"*" representa hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; R representa alquilo com 1 a 22 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 8 átomos de carbono ou cicloalquilo com 5 a 7 átomos de carbono, estando estes radicais alquilo, alcenilo e cicloalquilo eventualmente substituídos por carboxilo, tienilo, feni loxi ou fenilo, podendo por sua vez os radicais fenilo meneio _ oa

nados estar substituídos por halogenio, ou 3 R representa fenilo, furilo ou tienilo, podendo estes radicais fenilo, furilo ou tienilo estar substituídos por halogéneo, carboxilo ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono, 4 R representa hidroxi ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, R^ e R^ são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se verificar pelo menos uma das seguintes condições: Z representa hidrogénio, sédio, potássio, amónio, R·*" representa hidrogénio, metilo ou etilo, 3 R representa alquilo com 1 a 22 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 4 átomos de carbono ou ciclohexilo, estando estes radicais alquilo, alcenilo e cicloalquilo eventualmente substituídos por carboxilo, tienilo, feniloxi ou fenilo, ou 3 R representa fenilo, furilo ou tienilo, podendo o radical fenilo estar substituído por cloro, bromo, carboxilo e/ou metoxi, 4 R representa hidroxi ou metilo, 5 6 R e R sao iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou metilo. - 4ã - Processo para a preparação de composições farmacêuticas com acção anitibacteriana, caracterizado pe lo facto de se incorporar na composição como substância activa um composto de acordo com a invenção, quando preparado por umprc cesso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores. — OQ 4 A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na Republica Federal Alemã, em 12 de Janeiro de 1988 e em 2 de Setembro de 1988, sob os n?s. P 38 00 598.0 e P 38 29 780.9, respectivamente. Lisboa, 11 de Janeiro de 1989. I
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