PT90592B

PT90592B - Processo para a preparacao do antibiotico galidermina e de composicoes farmaceuticas e cosmeticas que o contem

Info

Publication number: PT90592B
Application number: PT90592A
Authority: PT
Inventors: Hans Zahner; Rolf-Gunter Werner; Gunther Jung; Thomas Horner; Roland Kellner; Friedrich Gotz; Hermann Allgaier
Original assignee: Thomae Gmbh Dr K
Priority date: 1988-05-18
Filing date: 1989-05-17
Publication date: 1995-01-31
Also published as: ES2042868T3; IE891591L; PT90592A; CA1338310C; ATE75752T1; US5231013A; JPH02117696A; DE68901415D1; JP2801023B2; IE61615B1; GR3005344T3; GB8811760D0; EP0342486B1; EP0342486A1

Description

A presente invenção refere-se a um novo antibiótico, denominado Galidermina, aos seus sais, a composiçoes farmacêuticas contendo o mesmo e a métodos para a sua produção .

Sao conhecidos vários antibióticos peptí_ deos policiclicos. Alguns destes antibióticos contêm uma estrutura de lantionina, por exemplo nisina, subtilina, duramicina, cinamicina, ancovenina, Ro 09-0198, pep5 e epidermina .

Estes antibióticos possuem tipicamente um alto conteúdo de ácidos aminados insaturados (deidroala1

nina, deidrobutirina) e de ácidos aminados de tioéter (meso-lantionina, (2S_, 3S_, 6R_)-3-me t i lan t i on i na ) . Encontraram-se igualmente em alguns membros lisinolanina, ácido 3-hidroxiaspártico e S-(2-aminovinil)-D-cisteína.

Para alem de semelhanças estruturais entre a duramicina e a cinamicina, parece existir pouca homologia de sequência entre estes vários antibióticos peptídeos conhecidos. Isto e tornado tra as sequências propeptídicas desta Figura torna-se evidente, mina nao apresenta homologia de os outros antibióticos.

claro na Figura I, que mosdos antibióticos. A partir por exemplo, que a epidersequência significativa com

Pode, além disso, notar-se que a proveniência da epidermina difere da dos outros antibióticos (excepto o pep5) por ser obtida por cultura de uma estirpe do microorganismo Staphylococcus epidermis, enquanto que os outros antibióticos foram obtidos por cultura de estirpes de Streptococcus lactis (Nisina), Bacillus subtilis (subtil i n a ) , Streptornyces cinnamoneus e Strptomyces sp. (Cinamicina, Duramicina e Ancovenina) e Streptovertici11 um griseoverticillum (Ro 09-0198).

A epidermina é particularmente activa contra o microorganismo Propionibacterium acnes e, por essa razao, tem sido estudada como uma substância terapeuticamente activa possível para uso no tratamento desta doença.

Constatamos agora, no entanto, que um peptídeo intimamente relacionado estruturalmente com epider_ mina tem uma actividade surpreendentemente maior em relaçao ao Propionibacterium acnes comparado com epidermina. Tendo em conta que os antibióticos peptídeos conhecidos, de uma maneira geral, diferem consideravelmente na sua estrutura uns dos outros, é inesperada a existência de um outro antibiótico como este, que difere de um dos seus memebros pela

substituição de apenas um acido aminado, e ainda e mais surpreendente e completamente imprevisível que tal troca de um unico ácido aminado na epidermina conduza a um aumento sign_i ficativo na actividade contra o microorganismo Propionibacter ium acnes .

Portanto, a presente invenção proporciona um composto, a que demos o nome de Galidermina, com a estrutura

CHg-S-CH₂

H-Ile-Ala-NH-^H-CO-Lys-Phe-Leu-NH-GH-CO-NH-D- -LCH„

I

CH-_s-_CH ^{1 1}

CH-CO-Pro-Gly-NH-CH-CO-Ala-Lys-Dhb-Gly

D- -LC H _-S-C H

I ² l

-NH-CH-CO-Phe-Asn-NH-CH-CO-Tyr-NH-CH-CO-NH-CH -D- || ¹¹

CH₂-S-CH e os seus sais de adiçao de acido farmaceuticamente aceitáveis.

A Galidermina pode ser produzida por cultura do microorganismo Staphylococcus gallinarum (F16/P57) TU 3928, o qual foi depositado na Deutsche Sammlung von Microorganismen , nos termos do Tratado de Budapeste, em 18 de Maio de 1988 e recebeu o numero de depósito DSM 4616 ou dos seus mutantes.

A Staphylococcus gallinarum (F16/P57)

TU 3928 (DSM 4616) pertence a uma espécie de estafilococos recentemente descoberta, que foi descrita por Devriese et al. (Int. J. Syst. Bacteriol. 33 , 480-486 (1983)). As estir3

A estirpe S. gallinarum (F16/P57) Τΰ 3928 (DSM 4616) e descrita em pormenor no artigo de Devriese et al., mencionado no parágrafo anterior.

É de notar que a homologia ADN/ADN entre o S. gallinarum e o S. epidermis é apenas entre 10 a 25% indicando que as estirpes produtoras de galidermina e de epidermina pertencem a espécies nitidamente separadas. É igualmente de notar que as duas especies sao diferenciadas por muitos outros marcadores, tais como a resistência á novobiocina e o vasto número de reacções positivas de hidratos de carbono (celobiose, manitol, melizitose, trealose, arabinose, ribose e xilitol) de S. gallinarum (Arch. Microbiol. 92, 65-85 (1973), J. Clin. Microbiol. i, 82-88 (1985), e The Procaryotes, Springer Verlag, Heidelberg, 1548-1569 (1981)).

Deste modo a presente invenção proporciona ainda um processo para a preparaçao de galidermina e respectivas sais farmaceuticamente aceitáveis que compreende cultivar um microorganismo capaz de expressar galidermina, de preferência, S. galidermin (F16/P57) TU 3928 (DSM 4616) sob condiçoes nas quais a galidermina e expressa e segregada no meio de cultura, isolar a galidermina no meio de cultura e, se se desejar, converter a substância isolada num sal de galidermina farmaceuticamente aceitável.

Pode realizar-se a cultura de microorganismos produtores de galidermina, tal como S. gallidermin (F16/P57) TU 3928 (DSM 4616) de acordo com os métodos normais, usando um meio de cultura convencional. Por exemplo, pode-se cultivar S. gallidermin (F16/P57) TU 3928 (DSM 4616) num meio contendo uma fonte de nitrogénio, uma fonte de carbono e um hidróxido de um metal alcalinoterroso adequados, por exemplo um meio contendo extractos de carne e de malte e Ca(0H)2 num biorreactor adequado. A cultura deve ser efectuada com arejamento e numa gama de pH de por ex. 5,4 a 8,5 de preferência começando o cultivo num pH numa gama de 6 a

7.

A galidermina pode ser isolada do caldo de fermentação por qualquer método convencional adequado para isolar de tal meio proteínas de pequeno peso molecular.

Constatou-se, especialmente, que se pode isolar imediatamente a galidermina pelo simples método de tratar o meio de cultura com um adsorvente seguido de um processo que inclui as fases de adsorçao numa resina permutadora de ioes catiónica fraca, eliminação dos sais e, opcionalmente, uma fase posterior de purificação cromatografica, por exemplo, por HPLC de fase inversa ou por cromatografia em Gel de Sephadex LH20 usando, por exemplo, metanol/LH20 em HCI 0,01 N (9:1) como eluente.

Como o composto galidermina é fortemente básico, formar-se-ao imediatamente sais de adiçao de acido com ácidos adequados, aceitáveis farmaceuticamente, de acordo com os métodos convencionais. Os ácidos orgânicos ou inorgânicos fisiologicamente aceitáveis que podem ser usados para este fim sao por exemplo os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfurico, benzossulfónico, metanossulfónico, p-toluenossulfónico e o ciclo-hexi1 sulfâmico.

Actividade Antibacteriana

Determinaram-se as concentrações inibidoras mínimas (MIC, Quadro 1) em meio BF líquido da seguinte composição:

0,5% de lactato de sódio, 0,5% de sulfato de sódio, 0,05% de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,15% de hidrogenofosfato dipotássico, 0,02% de cloreto de magnésio, 0,05% de clorerto de amónio e 1% de glucose suplementado (por ml) com

jig de pantotenato de cálcio, 0,25 /ug de ácido fólico, jig de niacina, 25 Aig de acido p-aminobenzoico, 50 Aig de cloridrato de piridoxal e 25 Aig de riboflavina.

Os resultados estão apresentados no

Quadro 1 abaixo.

QUADRO 1

Microorganismos MIC (pg/ml)

St. aureus SG 511 4

St. aureus E 88 8

St. epidermidis ATCC 12228 4

St. pneumoniae ATCC 6302 4

Sc. pyogenes ATCC 8668 1

Sc. faecalis ATCC 29212 64

Cb. xerosis ATCC 9755 1

E. coli ATCC 11775 128

Ps. aeruginosa BC 19 128

Mc. luteus ATCC 9341 0.25

Mc. luteus 15957 0.5

Bac. fragilis(Bonn) 128

Bac. fragilis (K8ln) 128

Peptostreptococcus anaerobicus 0.5

Num estudo comparativo com epidermina em Propionibacterium acnes obtiveram-se os seguintes valores MIC:

MIC (jig/ml)

Galidermina 0,125

Epidermina 0,25

Em virtude do amplo espectro de actividade antibacteriana , a galidermina e os seus sais de adiçao de acido sao uteis para combater bactérias e para tratar infecções bacterianas. Sobretudo, em virtude da sua acti

vidade contra importantes estirpes de Propionibacterium acnes a galidermina e os seus sais de adiçao de acido sao particularmente uteis no combate a infecçoes cutâneas , tal como acne, eczema, impetigo e celulite.

Deste modo, de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, e proporcionado um processo para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas caracterizado por se incorporara, como ingrediente activo, galidermina ou um respectivo sal de adiçao de ácido, farmaceuticamente aceitavel, em associaçao com uma ou mais substâncias veiculares e/ou excipientes farmacêuticos inertes.

Para administraçao farmacêutica, o referido polipeptídeo pode ser incorporado em preparações quer sob forma líquida quer solida, usando substâncuias veiculares e excipientes, convencionalmente empregues na técnica farmacêutica, opcionalmente em combinação com outros ingredientes activos. A preparaçao pode, por exemplo, ser administrada oralmente, por via parentérica, entérica ou, de preferência, topicamente. Formas preferidas incluem, por exemplo, soluçoes, emulsões, geis, aerosois, loçoes, unguen_ tos, pomadas ou pós.

As composiçoes podem ser formuladas vantajosamente sob a forma de unidades de dosagem, sendo cada unidade adaptada de modo a prover uma dose fixada de ingrediente activo. A dose diária total pode, é claro, ser variada, dependendo do indivíduo tratado e das queixas deste.

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para o tratamento de um paciente sofrendo de infecção ou susceptível a ela, e que compreende administrar ao referido paciente uma quantidade eficaz de galidermina ou de um sal desta farma ceuticamente aceitável.

Pode-se usar igualmente a galidermina e os seus sais de adiçao de acido como aditivos em formulações cosméticas, especialmente as que contêm colagénio, nos quais actuam como estabilizador.

Uma preparaçao cosmética, de acordo com a presente invenção, incluirá galidermina ou um sal de adiçao de acido desta em associaçao com uma substância veicular e/ou excipiente adequados, de preferência colagénio, e, opcionalmente, outros aditivos adequados para preparações cosméticas, tais como perfumes e agentes corantes.

EXEMPLO 1

Fermentação

Utilizaram-se culturas congeladas de S, galinarum a fim de inocular discos de agar, contendo meio GA. Após manter os discos inoculados durante 12 horas à temperatura de 37°C, estes foram transferidos para balões de Erlenmeyer contendo 100 ml de um meio de cultura constituído em 3,3% de extracto de carne, 3,0% de extracto de malte, 0,38% de Ca (OH)^ a pH 6,5.

Os balões inoculados foram mantidos num agitador rotativo (tipo RC106), Infors AG Basel) a uma velocidade de 160 rpm e a uma temperatura de 36°C durante 8 horas. Utilizaram-se 200 ml de pré-cultura resultante a fim de inocular um tíb rreactor de fermentação de 20 litros de capacidade (Giovanola Frères, Monthey) equipado com um sistema intensificador . 0 meio usado foi o mesmo anteriormente descrito no paragrafo anterior, mas contendo adicionalmente 6% de NaCl. Os graus de ventilação e de agitaçao foram ajustados para 0,4 vol./vol./min e 900 rpm. 0 p0^ diminui rapidamente para menos de 10% nas primeiras 5 horas; após 10 horas aumentou para 80% até ao fim do tempo de fermentação. 0 pH diminuiu de 6,5 para 5,4 nas primeiras 8 horas, depois aumentou para 8,5 ate ao fim do tempo de fermentação. A densidade máxima das células foi alcançada apos 24 horas com 8 a 9 x 10 células por ml. Diminuiu-se o desenvolvimento de espuma através de repetidas adições de Polyurax Polyol PPG2025 (BP Chemicals).

Isolamento

Apos 34 horas de fermentação, adicionou-se directamente a resina adsorvente Amberlite XAD-1180 ao fermentador. Adicionaram-se três porçoes de adsorvente (em quantidades de 2%, 1% e 1% em realçao ao volume do caldo de fermentação) a intervalos de 45 minutos. Separou-se a resina por filtraçao e lavou-se com 30 litros de água e metanol/HCl 0,01 N (9:1) e concentrou-se o eluído activo (1,4 litros) sob pressão reduzida a fim de dar um peso seco de 2,7 g.

Em seguida tornou a dissolver-se o produto em metanol/HCl 0,01 N (9:1) e aplicou-se a Amberlite IRC-50 (forma H⁺) a pH 5,5. Lavou-se então a resina com agua e eluiu-se com HCl 0,1 N.

Fez-se em seguida contactar o eluente contendo galidermina com Amberlite XAD-1180 a fim de se eliminarem os sais, separou-se a solução da Amberlite e submeteu-se a 1iofi1izaçao .

Em seguida, dissolveu-se em água o produto liofilizado e croraatografou-se por HPLC de fase inversa. Esta fase realiza-se no sistema Waters, com duas bombas 501, um auto-injector WISP 712 e um programador de gradiente M680. Como fases estacionárias usam-se Nucleosil 10C18 ou 5C18 (colunas de 4,6 x 150 mm e 8 x 250 mm) e HD-Gel-RP-7s-300 (colunas de 4 x 150 mm). A eluição é levada a cabo usando vários gradientes de acetonitrilo/0,1% de acido trifluoroacético em água. Recolheu-se o eluente resultante contendo galidermina, o qual poderia ser concentrado por eveporaçao e, se desejado, retomado em agua e

liofilizado várias vezes.

Pode-se purificar o produto liofilizado resultante da fase de diminuição de sais por meio de cromatografia em gel, como uma alternativa ã RP-HPLC. Numa operação como esta, o liofilizado é dissolvido em metnol/HCl 0,01 N (9:1) e feito passar através de uma coluna, usando Sephadex LH 20 como fase estacionária. 0 eluente resultante, contendo galidermina, e manipulado como acima se descre ve.

A produção de galidermina por fermentação, como por exemplo descrita acima, pode ser seguida usando a estirpe de teste padrao de Hicrococcus luteus ATCC 9341 em placas de agar contendo 10 ml de agar GA constituído por 10 g de peptina, 8 g de lab lemco em pó (Oxoid), g de NaCl, 2 g de Na^HPO^, 10 g de glucose (esterilizada separadamente),20 g de agar, 1 litro de H₂0, pH 7,2 a 7,4.

A estirpe S. gallinarum pode ser armazenada a -18°C em tubos, no seguinte meio: 33 g de lab lemco em pó (Oxoid), 30 g de extracto de malte (FrSnkel + ech), 3,7 g de Ca(0H)_2> 400 g de glicerol, 1 litro de í^O a pH 6,0.

EXEMPLO 2

Tintura

100 g de tintura contêm:

Galidermina	1,0 g
í Etanol (94,5% em volume)	56,0 g
1,2-Propilenoglicol	40,0 g
Água desmineralizada	3,0 g

Preparaçao

Dissolve-se a galidermina numa mistu10

ra de etanol/1,2-propilenoglicol/água e a solução é então estirilizada por filtraçao.

EXEMPLO 3

Loção

100 g de loção contêm:

Galidermina 1,00 g

1,2-propilenoglicol 7,00 g

Cloreto de alquildimetilbenzilamónio (Benzalkon A 0,15 g

Monopalmitato de sorbitano (Span 40^(R)) 0,40 g

Palmitato de sorbimacrogol (Tween 40^) 1,20 g

Oleato de decilo (Cetiol V 2,40 g

Mistura de álcoois cetílico e esteárico (Lanette 0^ ') 1,60 g

Palmitato de cetilo 0,80 g

Água desmineralizada até 100 g

Preparaçao

Agitam-se as quantidades acima referidas de cloreto de alquildimetilbenzilamónio, monopalmitato de sorbitano, palmitato de sorbimacrogol , oleato de decilo, álcoois cetílico e esteárico e palmitato de cetilo em 75 ml de água, mistura-se aí a solução filtrada de galidermina em 1,2-propilenoglicol e a agua restante; e a tintura e homogeneizada.

EXEMPLO 4

Gel

100 g de gel contêm:

Galidermina 1,0 g

Éter polietilenoglicólico de álcool laurílico (Brij 35^^R^) 1,0 g

1,2-propilenoglicol 5,0 g

Polímero de ácido acrílico (Carbopol 934 1,2 g p- Hidroxibenzoato de metilo 1,6 g p-Hidroxibenzoato de propilo 0,4 g

Perfume q.b.

Solução de hidróxido de sódio até pH 6,5

Água desmineralizada até 100 g

PREPARAÇAO

Agitam-se as quantidades especificadas de excipiente em 75 ml de água; dissolve-se a galidermina numa mistura de 1,2-propilenoglicol e da água restante e agita-se novamente esta solução; o gel acabado é homogeneizado uma vez mais.

EXEMPLO DE REFERENCIA 1

Quando submetidos a cromatografia de camada fina em placas de gel de sílica (Merk Darmstadt), encontraram-se os seguintes valores para a galidermina:

Rf (clorofórmio/metanol/NH^ a 17% 2:2:1) = 0,73

Rf (clorofórmio/metanol/NH^ a 17% 70:35:10) = 0,30

Rf (1-butanol/ácid o acético/água 4:1:1) = 0,05

EXEMPLO DE REFERENCIA 2

Foi levada a cabo a hidrólise total do peptídeo (100 mmol) em HCl 6 N (200 ul) contendo ácido tíoglicólico (5 ul) sob a acçao de nitrogénio a 110°C durante 18 horas em recipientes selados. Após evaporaçao dissolveu-se o hidrolisado residual em tampao de citrato de sódio a pH 2,2 e analisou-se usando o programa padrao do analisador de ácidos aminados LKB 4150. Foram encontrados os seguin

tes valores (cale.):

Ala 1.98 (2), Asp 0.98 (1), Gly 2.10 (2), Ile 0.92 (1), Leu 0.98 (1), Lan 2.0 (2), Lys 1.91 (2). MeLan 1.0 (1), Phe 1.86 (2), Pro 0.91 (1), Tyr 0.87 (1).

EXEMPLO DE REFERENCIA 3

Determinação da configuração dos ácidos aminados

Determinou-se a configuração dos ácidos aminados da proteína e, em particular, de lantionina e de 3-metil-lantionina de acordo com um método de cromatografia em fase gasosa recentemente eleborado (Kusters E. et al. Chromatographia 18, 287-293 (1984)), separando ésteres de n-propilo dos ácidos aminados em capilares de vidro (25-33 m) revestidos com Chirasil-Val (Frank H. et al., J. Chromatographia, 146, 197-206 (1978)) usando um cromatógrafo de fase gasosa Sichromat Autoderivat 100 (Siemens). Prejffaram-se os derivados de amostras contendo aproximadamente 100 nmol de ácidos aminados do seguinte modo:

ί esterificaçao com HCl 4 N/l-propanol (1 ml) a 110°C durante 30 minutos num recipiente selado; adicionou-se anidrido trifluoroacético (50 pl) após secagem numa corrente de nitrogénio e aqueceu-se no recipiente selado a 140°C durante 10 minutos. Evaporou-se novamente a solução numa corrente de nitrogénio. Para a análise aplicaram-se amostras em diclorometano. 0 gás portador foi nitrogénio e usou-se um detector de ionizaçao por chama. Para o programa de temperatura, ver as referências acima mencionadas. Encontraram-se os seguintes valores:

L-Ala (2), L-Asp (1), L,-Gly (2), L>-Ile (1), meso-Lan (2), i _L-Leu (1), I^-Lys (2), (2S^, 3S_, 6R_)-3-MeLan (1), _L-Phe (2),

L-Pro (1).

- 13 EXEMPLO DE REFERENCIA 4

Cisão tríptica

Dissolveu-se a galidermina numa solução tampao (1 mg/ral), constituída por N-acetato de etilmorfolina 0,05 M, CaCl^ . 6 1^0 0,01 M, pH 7,8 e tripsina (50 ug Calbiochem). Após 24 horas a 37°C, fez-se parar a cisão por adiçao de ácido acético até pH 4 e arrefeceu-se a solução a 0°C, a fim de precipitar o fragmento C-terminal 14-21. Após centrifugação liofilizou-se o sobrenadante e purificaram-se os componentes solúveis por RP-HPLC para produzir o fragmento N-terminal 1-13.

EXEMPLO DE REFERENCIA 5

Espectrometria da massa espectro de massa FAB positivo (Figura 3) foi registado com um espéctrometro VG 70/250/SEQ equipado com uma fonte de ioes de cesio. Aplicaram-se amostras numa matriz de álcool 3-nitrobenzílico/metanol.

valor ]_ M+H_7* ί 2166 M.U. confirmou a massa molecular calculada. 0 espectro dos ioes gerados (Figura 3b) mostra os fragmentos ^2’ ^13’ ^14 ^e ^15 ^^stes fragmentos sao típicos para o local de císao tríptico e esta justaposição combina os resultados obtidos para os fra_ gmentos N- e C-terminais, analisados separadamente.

Obteve-se o espectro de massa por ionizaçao de termopulverizador, usando o sistema termopulverizador HP 5988 (Hewlett Packard). Injectaram-se amostras do fragmento tríptico 14-21 de galidermina. Aplicou-se ionizaçao positiva com impacte de electrao adicional e detecpi ram-se os ioes na região de exposição de 350 a 950 unidades de massa. Na região significativa de 350 a 550 unidades de massa obteve-se a detecção de vários fragmentos após subtrac çao do ruído ambiente e confirmou-se através de coeluiçao de massas.

Na Figura 2 apresenta-se o espectro na região de análise de 350 a 550 Daltons. A estabilidade de Cys(Avi) que forma a extremidade C-terminal amidada é digna de referência porque forma o pico principal. Uma fragmentação característica quadrupla, cada uma com uma cisão dupla de ligações, e característica para os fragmentos C-terminais tanto da Galidermina 14-21 como da epidermina 14-21. A coeluiçao das massas confirma este padrao de fragmentação peculiar.

EXEMPLO DE REFERENCIA 6

Sequência de peptídeos

Sequenciou-se a galidermina e o seu fragmento N-terminal por degradaçao de edman automatizada usando um sequenciador de fase de gas com líquido por pulsação 477A com analisador PTH em linha (Applied Biosystems). Aplicaram-se amostras de separações de RP-HPLC dissolvidas no eluente HPLC directamente ao disco do filtro na câmara de reacçao.

Efectuaram-se analises de sequência e de PTH com os programas normais.

Esta analise revelou a sequência

N-terminal _T1 1 .. 2 3 _T 4 _D, 5 _T 6 7 8 _D 9 _P1 10 11 ... 12 _T 13 lie -Ala -x -Lys -Phe -Leu -x -x -Pro -Gly -x -Ala -Lys x nas posiçoes 3,7, 8 e 11 designa as posiçoes nas quais nao se detectou qualquer derivado de ácidos aminados. Estas posiçoes correspondem a um resíduo

Lan e a um resíduo MeLan de acordo com a composição de ácido aminado de fragmento N-terminal.

Devido as pontes de sulfureto e ás propriedades peculiares do bis-PTH-Lan, nao se pode avaliar a degradaçao automatica nestas posiçoes; no entanto, a degradaçao segue adiante. Os produtos da degradaçao para galidermina sao apresentados na Figura 4.

Detectou-se, inequivocamente, o ácido aminado Leu na posição 6.

Ha um local de cisão enzimático ca. 13 14 racteristico Lys -Dhb na parte central de galidermina. Durante a digestão tríptica observa-se precipitação do fragmento 14-21 C—terminal resultante nao carregado e hidrofóbico, enquanto que o fragmento 1-13 N-terminal quatro vezes mais carregado e hidrofílico permanece em solução.

A velocidade de cisão para a ligaçao Lys-Dhb e muito baixa comparada com a de outras ligações de Lys com qualquer ácido aminado de proteínas. Tal como no caso de epidermina, a cisão tríptica leva á conversão de Dhb num residuo de 2-oxo-butirilo, o que evita a elucidação de estrutura por degradaçao de Edman do fragmento C-terminal .

EXEMPLO DE REFERENCIA 7

Análise ultra-violeta espectro UV de galidermina confirma a ligaçao dupla vinilica a 267 nm que apresenta um coeficiente de extinção muito elevado de 11000 M ^cm (água, 0,1 mg/ml, d=l cm, 21°C) comparado com o baixo valor da absorçao de tirosina (1400 M ^cm ^).

Claims

REIVINDICAÇÕES

- I^a Processo para a preparaçao do novo antibiótico Galidermina de fórmula

C H _-S-C H „ , Z ι z

H-Ile-Ala-NH-CH-CO-Lys-Phe-Leu-NH-CH-CO-NH -D- -LCH.

CH«

-CH_ « z

CH-CO-Pro-Gly-NH-CH-CO-Ala-Lys-Dhb-GlyD- -Lch₂_ S-ch₂

-NH-CH-CO-Phe-Asn-NH-CH-CO-Tyr-NH-CH-CO-NH-CH

-DCH₂-s

CH e dos seus de adiçao de acido farmaceuticamente aceitáveis caracterizado por compreender as fases de se cultivar uma estirpe de Staphylococcus gallinarum produtora de galide£ mina sob condiçoes de expressão de galidermina e de secreção desta para o meio de cultura, isolar a galidermina a partir do meio de cultura, e, se se pretender, converter a galidermina num seu sal de adiçao de acido.
2^a

Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado por o procedimento de isolamento incluir as fases de tratar o meio de cultura com um adsor vente e as fases seguintes de adsorçao numa resina permutadora de ioes cationica, eliminar os sais e opcionalmente levar a efeito uma fase adicional de purificação por cromatografia.

- 3^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estirpe utilizada para a produção de galidermina ser a estirpe Staphylococcus gallinarum DSM 4616 ou um seu mutante.

- 4^a Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar um composto conforme definido na reivindicação 1, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 em associaçao com uma substância veicular e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitavel.

- 5^a Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a composição farmacêutica obtida se destinar a aplicaçao tópica em particular para o tratamento de eczema, impetigo, celulite ou acne.

- 6^a Processo para a preparaçao de um preparado cosmético, caracterizado por se incorporar um composto conforme definido na reivindicação 1 quando pre parado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em associaçao com uma substância veicular e/ou um excipiente apropriado e incluindo de preferência colagénio.