PT906430E

PT906430E - Processo de biossíntese que permite a preparação de o-fosfo-l-treonina

Info

Publication number: PT906430E
Application number: PT97921933T
Authority: PT
Inventors: Francis Blanche; Denis Thibaut; Joel Crouzet; Beatrice Cameron; Laurent Debussche; Elisabeth Remy
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1996-05-13
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2006-12-29
Also published as: HUP9902730A2; ATE334204T1; CA2254717A1; DK0906430T3; SI0906430T1; EP0906430A1; HUP9902730A3; US6156545A; WO1997043421A1; HU230179B1; FR2748492A1; FR2748492B1; EP0906430B1; EA199801007A1; JP2000509992A; ES2270458T3; AU2781297A; EA002588B1; JP4293637B2; DE69736387T2

Description

DESCRIÇÃO

"PROCESSO DE BIOSSÍNTESE QUE PERMITE A PREPARAÇÃO DE O-FOSFO-L-TREONINA" A presente invenção refere-se a um processo para melhorar a síntese in situ de O-fosfo-L-treonina de um microrganismo produtor de cobalaminas. A vitamina B12 faz parte de uma classe de moléculas designadas cobalaminas, cuja estrutura é apresentada em especial no documento W091/11518.

As cobalaminas são sintetizadas quase exclusivamente por bactérias segundo um processo complexo também descrito no documento W091/11518. A nível industrial, devido ao elevado grau de complexidade dos mecanismos de biossíntese, a produção de cobalaminas e em especial de vitamina B12 é principalmente efectuada utilizando culturas de grande volume das bactérias Pseudomonas denitrificans, Propionobacterium shermanii e Propionobacterium freudenreichii. É amplamente conhecido que as cobalaminas são sintetizadas por certos microrganismos a partir dos seguintes substratos: ácido aminolevulínico, S-adenosil-L-metionina, cobalto, glutamina, Rl-amino-2-propanol e 5,6-dimetilbenzimidazole.

De entre os precursores anteriormente referidos, o 5,6-dimetilbenzimidazole é sintetizado pelos microrganismos produtores de cobalaminas. Parecem existir duas vias de biossíntese para o 5,6-dimetilbenzimidazole: uma é 1 característica de microrganismos aeróbios e envolve oxigénio molecular, enquanto o outro é utilizado por microrganismos anaeróbios. Só um gene que intervém na via anaeróbia foi isolado, tratando-se do gene cobT de Salmonella typhimurium (Trzebiatowski et al., 1994). Até agora não foi identificado nenhum gene para a síntese de 5,6-dimetilbenzimidazole nos microrganismos aeróbios. A quantidade de 5.6- dimetilbenzimidazole sintetizada por microrganismos é, frequentemente, limitante.

Em consequência, o 5,6-dimetilbenzimidazole é preparado quimicamente e adicionado aos meios de produção. A eliminação desta adição aos meios constituiria, portanto, uma vantagem segura.

Até agora, nenhum processo de preparação industrial de cobalaminas refere a adição de precursores que não cobalto e 5.6- dimetilbenzimidazole. Certas estirpes que só produzem cobalaminas em meios contendo Rl-amino-2-propanol foram descritas recentemente (Crouzet et al., 1990, Grabau et al., 1992). O Rl-amino-2-propanol podia, portanto, ser utilizado para melhorar a produção de cobalaminas. Contudo, a sua utilização para uma eventual fermentação industrial é delicada e dispendiosa porque, por um lado o Rl-amino-2-propanol é um produto irritante e volátil e, por outro lado, pode inibir o crescimento do microrganismo. Seria, por isso, particularmente vantajoso encontrar um outro precursor do resíduo de Rl-amino-2-propanol das cobalaminas que não apresentasse estes inconvenientes. A este respeito, está descrita uma via para a biossíntese de Rl-amino-2-propanol a partir de L-treonina através de aminoacetona em certos microrganismos. Mas, contudo, a L-treonina não permite a complementação das estirpes citadas anteriormente. 2

Mais genericamente, para melhorar a produção das cobalaminas, pode ser vantajoso aumentar a quantidade dos seus precursores no meio, em particular se são limitantes. Esta abordagem pode ser realizada quer por adição directa ao meio do precursor limitante ou de um dos seus derivados ou análogos, quer amplificando a síntese in situ deste precursor na estirpe produtora, utilizando técnicas de genética e, em particular, tecnologia de ADN recombinante. 0 conhecimento das vias de biossíntese das cobalaminas e dos seus precursores é, para isso, um passo chave para melhorar a produção das cobalaminas.

Assim, a maioria dos passos da via de biossíntese da vitamina B12 foram recentemente caracterizadas em Pseudomonas denitrificans (Blanche et al., 1995). Nada menos que 22 genes cob, envolvidos na biossíntese das cobalaminas, foram isolados e a função da maioria dos polipéptidos codificados por esses genes foi identificada.

Outros genes provavelmente envolvidos na biossíntese de cobalaminas ou dos seus precursores foram isolados de outros microrganismos. Por vezes a função destes genes não é conhecida. Só a determinação exacta do seu papel ou do seu efeito permitiria encontrar uma aplicação para eles. Assim numa bactéria fotossintética facultativa, Rhodobacter capsulatus, um fragmento de ADN que tem, pelo menos, um gene necessário para a formação do aparelho fotossintético foi, recentemente, sequenciado (Pollich et al., 1993, Pollich et al., 1995a). Foi sugerido que 5 dos 8 genes isolados são genes de biossíntese de cobalaminas devido à sua forte homologia com 5 dos 22 genes cob de P. denitrificans descritos anteriormente. Em contraste não 3 foi possível atribuir directamente qualquer função exacta aos 3 genes remanescentes, i. e. os genes bluB, bluE e bluF. Os genes bluB, bluE e bluF, incluindo as suas sequências promotoras, foram sequenciados e descritos por Pollich et al., 1995a.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado um novo precursor de cobalamina. A presente invenção tornou, de facto, possível obter um melhoramento da produção de cobalamina com meios que contêm 0-fosfo-L-treonina. Este precursor de cobalaminas, não descrito até á data, tem um papel comparável ao do outro precursor já conhecido, o Rl-amino-2-propanol. Contudo, a O-fosfo-L-treonina tem a vantagem em comparação com o Rl-amino-2-propanol de não ser tóxica e de ser um produto que é fácil de manusear. Além disso, a sua eficácia para o melhoramento da produção de cobalaminas pode ser mais de 1000 vezes superior à do Rl-amino-2-propanol. A presente invenção tem igualmente como objectivo a utilização de um fragmento de ADN de Rhodobacter capsulatus para melhoramento ou para obtenção ou aumento da síntese in situ de O-fosfo-L-treonina ou 5,6-dimetilbenzimidazole por uma dada célula. A presente invenção permitiu obter um melhoramento da produção de cobalaminas, com meios não contendo Rl-amino-2-propanol ou O-fosfo-L-treonina, utilizando um fragmento de ADN que tem, nomeadamente, os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus. A presente invenção permitiu assim obter um melhoramento da produção de cobalaminas, com meios não contendo 5,6-dimetilbenzimidazole, introduzindo um fragmento de ADN tendo, nomeadamente, o gene bluB de Rhodobacter capsulatus. 4 A presente invenção tem como objectivo um processo para melhorar a síntese In sltu de 0-fosfo-L-treonina de um microrganismo procariota produtor de cobalamina, caracterizado por utilizar um microrganismo transformado por, pelo menos, um fragmento de ADN compreendendo os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus e em que se cultiva o referido microrganismo em condições que permitem a expressão dos referidos genes. A invenção também tem como objectivo um processo tal como aqui acima mencionado, em que o microrganismo transformado por, pelo menos, um fragmento de ADN compreendendo os genes bluE e bluF Rhodobacter capsulatus é, por outro lado, transformado com, pelo menos, um fragmento de ADN que codifica uma enzima envolvida na via biossintética do 5, 6-dimetilbenzimidazole e compreendendo o gene bluB de Rhodobacter capsulatus. 0 microrganismo pode conter de forma endógena um gene tal como aqui caracterizado acima. Nesse caso, o processo de acordo com a invenção permite a sobre-expressão da enzima. Mas o referido microrganismo pode estar igualmente isento deste tipo de gene de modo endógeno.

Por "fragmento de ADN que codifica uma enzima envolvida numa via de biossíntese da O-fosfo-L-treonina ou do 5,6-dimetilbenzimidazole", entende-se que a expressão do referido fragmento de ADN se traduz por uma síntese da 0-fosfo-L-treonina ou do 5,6-dimetilbenzimidazole na célula, seguida eventualmente por uma libertação no meio de cultura. A cultura pode ser feita em descontínuo ou em contínuo, e a purificação das cobalaminas pode ser feita por métodos já utilizados ao nível industrial (Florent, 1986). 5

Numa forma de realização, utiliza-se um microrganismo transformado com um fragmento de ADN que codifica um polipéptido envolvido numa via de biossintese da 0-fosfo-L-treonina compreendendo os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus.

Noutra forma de realização, utiliza-se um microrganismo transformado com um fragmento de ADN que codifica uma enzima envolvida numa via de biossintese do 5,6-dimetilbenzimidazole compreendendo o gene bluB de Rhodobacter capsulatus. A invenção implica a utilização de um fragmento de ADN de origem natural, sintética ou recombinante e homólogo. Por fragmento, entende-se um fragmento resultante da degenerescência do código genético.

De forma apropriada, utiliza-se um microrganismo cultivado em aerobiose e o referido fragmento de ADN codifica para uma enzima envolvida numa via de biossintese em aerobiose do 5,6-dimetilbenzimidazole. A presente invenção tem igualmente como objectivo um processo de preparação de estirpes recombinantes de um microrganismo procariota produtor de cobalamina, caracterizado por se transformar o referido microrganismo pelas técnicas de engenharia genética com, pelo menos, um fragmento de ADN que codifica uma enzima envolvida numa via de biossintese da 0-fosfo-L-treonina ou do 5,6-dimetilbenzimidazole, tal como definido acima. A presente invenção também tem como objecto as estirpes recombinantes obtidas pelo processo de preparação de estirpes, de acordo com a presente invenção. 6 A presente invenção envolve a utilização nos processos, de acordo com a invenção, de um ADN recombinante que contém, pelo menos, uma sequência de ADN que codifica um referido polipéptido e em que a ou as referidas sequências estão colocadas sob o controlo de sinais de expressão. A este respeito, pode em especial posicionar-se em 5' da sequência de ADN das regiões promotoras. Essas regiões podem ser homólogas ou heterólogas em relação à sequência de ADN. Em especial, é possível utilizar os promotores bacterianos fortes, tais como o promotor do operão triptofano Ptrp ou promotor do operão lactose Plac de E. coli, o promotor esquerdo ou direito do bacteriófago lambda, os promotores fortes de fagos de bactérias, tais como as corynebactérias, os promotores funcionais das bactérias gram-negativas, tais como o promotor

Ptac de E. coli, o promotor PxylS dos genes do catabolismo do xileno do plasmideo TOL, o promotor da amilase de Bacilus subtilis Pamy. Também se pode citar os promotores derivados dos genes glicoliticos de levedura, tais como os promotores dos genes que codificam fosfoglicerato quinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, lactase ou enolase, que podem ser utilizados quando o ADN recombinante foi introduzido num hospedeiro eucariota. Um sítio de fixação dos ribossomas está, também, posicionado em 5' da sequência do ADN e pode ser homólogo ou heterólogo, tal como o sítio de fixação dos ribossomas do gene cll do bacteriófago lambda.

Os sinais necessários para terminação da transcrição podem estar localizados em 3' da sequência de ADN. 0 ADN recombinante utilizado nos processos de acordo com a presente invenção pode, em seguida, ser directamente introduzido 7 numa célula hospedeira que é compatível com os sinais de expressão escolhidos ou ser clonado num vector plasmídico, de forma a permitir a introdução, de modo estável, da sequência de ADN em questão na célula hospedeira. A invenção implica a utilização, de forma conhecida, de plasmídeos que contêm uma sequência de ADN que codifica um referido polipéptido. De modo conhecido, estes plasmídeos também contêm um sistema de replicação funcional e um marcador de selecção.

Podem ser utilizados diferentes tipos de vectores. No contexto da invenção, é preferida a utilização de vectores do tipo RK2, isto é, de vectores com uma origem de replicação RK2. Pode citar-se a título de exemplo específico, o vector RK2 (Saurugger et al., 1986), o vector pXL435 (Cameron et al., 1989), o vector pRK290 (documento US 4590163; Ditta et al., 1985) e o vector pXL1635 (documento W091/16439). Um vector especialmente vantajoso é o vector pXL1635. Outros vectores estão descritos no pedido W091/16439.

De acordo com uma forma de realização, utiliza-se um microrganismo que é transformado com um fragmento de ADN, compreendendo um fragmento BamHI de 6,8 kb do plasmídeo pERl (figura 1), descrito nos exemplos adiante e que codifica a síntese dos dois precursores, O-fosfo-L-treonina e 5, 6-dimetilbenzimidazole.

Numa forma de realização, especialmente mais apropriada, para expressão de um polipéptido envolvido na síntese de O-fosfo-L-treonina, utiliza-se um fragmento de ADN compreendendo o fragmento EcoRI/Clal com 2,1 kb do plasmídeo pER2 (figura 2), descrito nos exemplos a seguir. 8

Numa forma de realização que é especialmente apropriada para expressão de um polipéptido envolvido na síntese de O-fosfo-L-treonina, utiliza-se um fragmento de ADN compreendendo o fragmento EcoRI/EcoRV com 1,6 kb do plasmídeo pER2 (figura 2) descrito nos exemplos a seguir.

Noutra forma de realização, especialmente apropriada para expressão de um polipéptido envolvido na síntese de 5,6-dimetilbenzimidazole, utiliza-se um fragmento de ADN que compreende o fragmento BamHI com 6,8 kb do plasmídeo pERl, descrito nos exemplos a seguir.

Os microrganismos procariotas hospedeiros que podem ser utilizados, de acordo com a invenção, são mais especificamente as bactérias do género E. coli, Pseudomonas denitrificans, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, ou

Rhizobium melitoti ou ainda Rhodobacter capsulatus. Outras bactérias estão descritas no documento W091/11518.

Contudo, utilizar-se-á vantajosamente uma bactéria P. denitrificans ou A. radiobacter.

Outras vantagens e características da presente invenção virão à luz, a partir da descrição pormenorizada que se segue.

Os exemplos 1 e 2 descrevem como é possível obter uma produção de cobalaminas por adição de O-fosfo-L-treonina ao meio de cultura de uma estirpe de Pseudomonas denitrificans ou Rhodobacter capsulatus. 0 exemplo 2 demonstra como a O-fosfo-L-treonina pode substituir vantajosamente o Rl-amino-2-propanol nos meios de produção, dado que são necessárias concentrações, pelo menos, 1000 vezes maiores de 9

Rl-amino-2-propanol para se obter uma produção de cobalaminas. O exemplo 2 demonstra também que a região do cromossoma de Rhodobacter capsulatus que tem os genes bluE e bluF está envolvida na síntese da 0-fosfo-L-treonina. O exemplo 3 descreve a construção de plasmídeos que têm os genes bluE e bluF, a partir de um fragmento de ADN de Rhodobacter capsulatus. 0 exemplo 3 demonstra, sobretudo, como é que estes plasmídeos, uma vez introduzidos nas estirpes para as quais a produção de cobalaminas está dependente da adição de Rl-amino-2-propanol ou de 0-fosfo-L-treonina, permitem obter uma produção de cobalaminas em meios que não contêm Rl-amino-2-propanol ou 0-fosfo-L-treonina. 0 exemplo 4 demonstra que a região do cromossoma de Rhodobacter capsulatus que tem o gene bluB está envolvida na síntese de 5,6-dimetilbenzimidazole.

Lista das figuras:

Figura 1: mapa de restrição do plasmídeo pERl

Figura 2: mapa de restrição do plasmídeo pER2

Figura 3: mapa de restrição do plasmídeo pER3

As figuras 1 a 3 representam os plasmídeos pERl, pER2 e pER3, respectivamente. 1. Estirpes e plasmídeos

As estirpes AH2 e BB1 de Rhodobacter capsulatus (Pollich et al., 1995a) foram construídas a partir da estirpe 37b4 (DSM 938). A estirpe G2650 de Pseudomonas denitrificans foi 10 construída a partir da estirpe SBL 27 Rifr por inserção do transposão Tn^ (Crouzet et ai., 1990). Uma estirpe G2650[Tet] foi, em primeiro lugar, construída utilizando um transposão Tn^ portador do gene da resistência a tetraciclina. Em seguida foi construída uma estirpe G2650[Sp] a partir da estirpe G2650[Tet] por substituição do gene de resistência à tetraciclina do

transposão Tn^ por um gene de resistência à espectinomicina. A estirpe SBL 27 Rifr deriva da estirpe MB 580 (Patente US 3018225). O plasmídeo pBBWl foi construído a partir de um fragmento de ADN de Rhodobacter capsulatus (Pollich et al., 1995a). O plasmídeo pAHW25 (Pollich e Klug, 1995a) foi construído a partir do plasmídeo pBBWl. 2 . Técnicas moleculares

As técnicas gerais de manipulação de ADN utilizam, como referência, o manual de laboratório (Sambrook et ai., 1989).

As enzimas são utilizadas de acordo com as recomendações do fabricante e são provenientes dos laboratórios New England Biolabs e de Boehringer Mannheim.

As técnicas utilizadas referem-se essencialmente aos seguintes passos: - digestão por enzimas de restrição; - ligação das moléculas de ADN pela ligase do bacteriófago T4 . 11 3. Técnicas de transformação A transformação das estirpes de E. coli é realizada por electroporação (Dower et al., 1988). 4. Técnicas de conjugação

As conjugações entre a estirpe S17-1 de E. coli e as diferentes estirpes de P. denitrificans são realizadas de acordo com um protocolo que foi adaptado do descrito por Simon e colaboradores (Simon et al., 1986). A transformação das estirpes de Pseudomonas pode ser feita por qualquer outra técnica de engenharia genética. 5. Preparação dos meios de produção de cobalaminas 0 meio utilizado para a produção de cobalaminas pelas estirpes de P. denitrificans é o meio PS4 descrito por Cameron et al., 1989. O meio utilizado para a produção de cobalaminas pelas estirpes de Rhodobacter capsulatus é o meio RA descrito por

Pollich, 1995b. 6. Doseamento das cobalaminas produzidas A quantidade de cobalaminas produzida é determinada por um doseamento microbiológico ou por cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC). 12 - Doseamento microbiológico: A quantidade de cobalaminas produzida é determinada por um método semiquantitativo utilizando a estirpe indicadora 113-3 de E. coli, auxotrófica para a vitamina B12 (Davis e Mingioli, 1950).

Esta estirpe indicadora é um mutante metE de E. coli que não tem, por isso, a não ser uma só homocisteina metiltransf erase (EC 2.1.1.13) que é dependente de B12. Em meio mínimo, só requer a presença de vitamina B12 para se desenvolver. Quando esta estirpe é incluída numa sobrecamada de meio mínimo M9 (Miller, 1972) gelificado (ao qual não falta, a não ser a vitamina B12, para permitir o crescimento da estirpe), é possível dosear a vitamina B12. De facto, se se depositar à superfície da sobrecamada uma amostra de uma solução contendo vitamina B12, é visível uma auréola de crescimento no local de deposição após 16 h de incubação a 37 °C. A vitamina B12 contida na amostra difunde-se e permite o crescimento das bactérias incluídas no agar. O diâmetro da auréola de crescimento é proporcional à concentração de B12 na amostra.

As amostras são obtidas por lise das células de acordo com o seguinte protocolo: São misturados 0,1 mL de uma solução de (Tris-HCl pH=8 100 mM, EDTA 20 mM, sacarose 200 g/L) contendo 24 mg/mL de lisozima (Boehringer Mannheim) com 0,5 mL de cultura de células a dosear. Após 30 min de incubação a 37 °C, adiciona-se 60 yL de uma solução de dodecil sulfato de sódio a 30 g/L e a mistura é vortexada durante alguns segundos. Deposita-se 10 pL do lisado celular obtido ou, eventualmente, uma diluição de 1/50, na superfície da sobrecamada. 13

Doseamento por HPLC:

Os métodos utilizados para o doseamento de cobalaminas por cromatografia liquida de alto desempenho são os descritos por Blanche et ai., 1990. EXEMPLO 1: Efeito da O-fosfo-L-treonina na produção de cobalaminas por uma estirpe de Pseudomonas denitrificans. A estirpe G2650 [Tet] de Pseudomonas denitrificans é cultivada em 25 mL de meio PS4 contendo 2 yg de tetraciclina/mL, num Erlenmeyer de 100 mL. Após 24 h de fermentação a 30 °C com agitação (250 rpm), adiciona-se ao meio, consoante apropriado, 0,16 ou 0,32 ou 1,5 mL de uma solução de O-fosfo-L-treonina a 10 g/L, o que corresponde a uma concentração final de respectivamente 66, 132 e 600 mg/L. As quantidades de cobalaminas produzidas em cada uma destas condições são doseadas por HPLC após 148 h de fermentação. Os resultados (tabela 1) demonstram que a estirpe G2650 [Tet] não produz vitamina B12 em meio PS4. Em contraste, a presença de O-fosfo-L-treonina no meio permite a produção de B12 por esta mesma estirpe. A quantidade de vitamina B12 produzida é então tanto maior quanto maior for a quantidade de O-fosfo-L-treonina adicionada. TABELA 1 O-fosfo-L-treonina adicionada ao meio 0 66 132 600 600 (adicionada em t=0) B12 produzida (mg/L) 0 1,8 2,5 4,2 3, 8 14 EXEMPLO 2: Comparação dos efeitos de O-fosfo-L-treonina e Rl-amino-2-propanol na produção de cobalaminas por uma estirpe de Rhodobacter capsulatus. A estirpe AH2 de Rhodobacter capsulatus é cultivada num Erlenmeyer de 100 mL em 70 mL de meio RA na presença de 10 pg/mL de kanamicina e diferentes concentrações de O-fosfo-L-treonina e Rl-amino-2-propanol. Após 24 a 48 h de fermentação a 30 °C com agitação (100 rpm), a quantidade de cobalaminas produzida nas diferentes condições é determinada por doseamento microbiológico.

Os resultados estão apresentados na Tabela 2, em que significa a ausência de auréola de crescimento da estirpe indicadora e "+" a presença de uma auréola de crescimento com um diâmetro tanto maior quanto maior for o número de símbolos Estes resultados mostram que a estirpe AH2 de R. capsulatus, cultivada em meio RA não produz vitamina B12. Pelo contrário, em presença de O-fosfo-L-treonina ou de Rl-amino-2-propanol, esta estirpe é capaz de produzir vitamina B12. Os resultados também demonstram que é preciso adicionar da ordem das 6.10^ vezes mais de Rl-amino-2-propanol para ter o mesmo resultado que com a 0-fosfo-L-treonina. TABELA 2

Concentração de 0-fosfo-L-treonina no meio 10 nM 2 5 nM 50 nM 100 nM 250 nM Produção de B12 — + + + + + + + +++ 15

Concentração de 0-Rl-amino-2-propanol no meio 6 pM 30 pM 150 pM 1,2 mM Produção de B12 - - — + EXEMPLO 3: Efeito da presença de um fragmento de ADN derivado do plasmídeo pBBWl na estirpe G2650, não produtora de cobalaminas. 3.1. Construção do plasmídeo pERl (figura 1) 0 plasmídeo pERl de 17,4 kb foi construído por clonagem no sítio BamHI do vector pXL435 (Cameron et ai., 1989) do fragmento de ADN BamHI de 6, 8 kb purificado a partir do plasmídeo pBBWl (Pollich e Klug, 1995). 3.2. Introdução de plasmídeo pERl na estirpe G2650 de P. denitrificans 0 plasmídeo pERl foi inicialmente introduzido por electroporação na estirpe S17-1 de E. coli e subsequentemente introduzido na estirpe G2650 [Tet] de P. denitrificans por conjugação com a estirpe S17-1 de E. coli contendo o plasmídeo pERl. Os transconjugantes resistentes a 50 pg de rifampicina/mL e a 100 pg de lividomicina/mL foram seleccionados. 9 clones analisados continham o plasmídeo pERl.

Uma estirpe de controlo G2650 [Tet], contendo apenas o vector pXL435, foi construída do mesmo modo. 16 3.3. Produção de cobalaminas pela estirpe G2650 contendo o plasmídeo pERl.

Os clones G2650 [Tet] contendo o plasmídeo pERl bem como 2 clones contendo o plasmídeo pXL435 foram cultivados em meio PS4 na presença de rifampicina, tetraciclina e lividomicina. Após 140 h de fermentação a 30 °C com agitação (250 rpm), a quantidade de cobalaminas produzida foi determinada por doseamento microbiológico e por HPLC. Os resultados estão apresentados na Tabela 3. TABELA 3 B12 doseamento microbiológico B12 HPLC (mg/L) 1 ++ 3 2 ++ 3, 5 Estirpes 3 ++ 3,4 G2650 [Tet] 4 ++ 3,2 contendo o 5 ++ 2,9 plasmídeo pERl 6 ++ 3,9 7 ++ 3, 6 8 ++ 3, 3 9 ++ 3,9 Estirpes G2650 [Tet] 1 0 contendo o plasmídeo pXLA35 2 0 Estirpe G2650 [Tet] - 0 17

Enquanto que nem a estirpe G2650 [Tet], nem esta estirpe contendo o plasmideo pXL435 produzem vitamina B12 em meio PS4, esta mesma estirpe contendo o plasmideo pERl é capaz de produzir B12 numa concentração da ordem dos 3,5 mg/L. A estirpe G2650 [Tet] contendo o plasmideo pXL435, isto é, unicamente o vector de clonagem que serviu para a construção do plasmideo pERl, não produz B12: é portanto a presença do fragmento de ADN com 6,8 kb derivado do plasmideo pBBWl que é responsável pela produção de B12 .

Este fragmento de ADN BamHI com 6, 8 kb purificado a partir do plasmideo pBBWl, confere portanto à estirpe G2650 [Tet] de P. Denitrificans, a aptidão para produzir vitamina B12 em meio PS4. 3.4. Subclonagens

As regiões do fragmento de ADN BamHI com 6,8 kb contendo os genes bluE e bluF foram subclonadas no vector de clonagem pXL435, dando origem aos plasmideos designados pER2 e pER3, graças a construções intermediárias. 0 plasmideo pER2 com 12,9 kb (figura 2) contém o fragmento EcoRI/CIal com 2,1 kb purificado a partir do plasmideo pBBWl e clonado no vector pXL435. Este fragmento de ADN foi previamente clonado nos sítios EcoRI/Clal do plasmideo pBluescript II SK+ (Stratagene) e depois purificado a partir deste plasmideo recombinante, na forma de um fragmento de ADN BamHI/Sall para a clonagem no vector pXL435. O plasmideo pER3 com 11,9 kb (figura 3) contém o fragmento PstI com 1,2 kb purificado a partir do plasmideo pBBWl e clonado no vector pXL435. Foi previamente clonado no sítio Pstl do 18 plasmídeo pBluescript II SK+ e depois foi purificado a partir deste plasmídeo recombinante, na forma de um fragmento de restrição BarnHI/SalI para a clonagem no vector pXL435. 0 plasmídeo pAHW25 (Pollich e Klug, 1995a) contém o fragmento EcoRI/EcoRV com 1,6 kb purificado a partir do plasmídeo pBBWl e clonado no vector pRK415 (Keen et ai., 1988): o gene bluE é então transcrito a partir do promotor lac do vector.

Os plasmídeos pER2 ou pER3 foram introduzidos na estirpe G2650 [Tet] de P. denitrificans por conjugação com estirpe S17-1 de E. coli contendo estes mesmos plasmídeos. Os clones de G2650 [Tet] contendo os plasmídeos pER2, pER3 ou pXL435 foram cultivados em 5 mL de meio PS4 na presença de rifampicina, tetraciclina e lividomicina. Os plasmídeos pAHW25 e pRK415 foram introduzidos nas estirpes G2650[Sp] de P. denitrificans por conjugação com a estirpe S17-1 de E. coli contendo estes mesmos plasmídeos. Os clones das estirpes G2650[Sp] contendo os plasmídeos pAHW25 ou pRK415 foram cultivados em 25 mL de meio PS4 na presença de rifampicina, lividomicina e espectinomicina. Após 140 h de fermentação a 30 °C com agitação (250 rpm) , a quantidade de cobalaminas produzida é determinada por doseamento microbiológico e por HPLC.

Os resultados, apresentados na Tabela 4, demonstram que só os clones das estirpes G2650 contendo os plasmídeos pER2 ou pAHW25 são capazes de produzir vitamina B12 em meio PS4. 19 TABELA 4 B12 doseamento B12 por HPLC microbiológico (mg/L) Estirpe G2650[Tet] - 0 Estirpe G2650[Sp] - 0 Estirpes G2650 [Tet] 1 - 0 contendo o 2 - 0 plasmideo pXL435 3 - 0 1 + + 7,4 2 + + 5,3 Estirpes G2650[Tet] 3 + + 7, 9 contendo o 4 + + 3,5 plasmideo pER2 5 + + 5,2 6 + + 6, 8 7 + + 7,2 1 - 0 2 - 0 Estirpes G2650[Tet] 3 - 0 contendo o 4 - 0 plasmideo pER3 5 - 0 6 - 0 7 - 0 8 - 0 Estirpes G2650[Sp] 1 - 0 contendo o 2 - 0 plasmideo pRK415 3 - 0 4 - 0 1 + + 3, 0 2 + + 2,2 Estirpes G2650[Sp] 3 + + 3, 0 contendo o 4 + + 2, 9 plasmideo pAHW25 5 + + 2, 9 6 + + 3,3 7 + + 3,1 8 + + 2,4 20 EXEMPLO 4: O gene bluB está envolvido na biossíntese do 5,6-dimetilbenzimidazole (DBI), um precursor conhecido da B12. A estirpe BB1 de Rhodobacter capsulatus é uma estirpe mutante que foi obtida por inserção de um interposão no gene bluB: é uma estirpe bluB- estirpe (Pollich et ai., 1995). A estirpe BB1 é cultivada em 7 0 mL de meio RA num Erlenmeyer de 100 mL em presença de 10 pg/mL de kanamicina e de diferentes concentrações de DBI. As quantidades das cobalaminas produzidas por esta estirpe nas diferentes condições são determinadas por doseamento microbiológico após 24 a 48 h de fermentação a 30 °C com agitação (100 rpm) . Os resultados, sumariados na Tabela 5, mostram que a estirpe mutante BB1, não produtora de B12 em meio RA só, sintetiza esta molécula quando estão presentes no meio pelo menos 14 nM de DBI. O gene bluB está portanto envolvido na biossíntese de 5, 6-dimetilbenzimidazole. TABELA 5 concentração de DBI 0 7 14 35 70 140 350 no meio nM produção de B12 — — + ++ +++ ++++ +++++ 21

REFERENCIAS 1. Davis B. D. e E. Mingioli (1950), J. Bacteriol., 60:17-28 2. Dower W. J., J. F. Miller e C. W. Ragsdale (1988) Nucl. Acids Res.r 16:6127-6145 Ref M9 3. Sambrook J., E. F. Fritsch e T. Maniatis (1989)

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Lisboa, 25 de Outubro de 2006 23

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para melhorar a síntese in situ de O-fosfo-L- treonina de um microrganismo procariota produtor de cobalamina, caracterizado por se utilizar um microrganismo transformado com, pelo menos, um fragmento de ADN compreendendo os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus e se cultivar o referido microrganismo em condições que permitem a expressão dos referidos genes.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o microrganismo transformado com, pelo menos, um fragmento de ADN compreendendo os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus, é também transformado com, pelo menos, um fragmento de ADN que codifica uma enzima envolvida numa via de biossíntese do 5,6-dimetilbenzimidazole e compreendendo o gene bluB de Rhodobacter capsulatus.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o fragmento de ADN compreender um fragmento BamHI com 6, 8 kb do plasmídeo pERl representado na figura 1 compreendendo os genes bluE e bluF e bluB de Rhodobacter capsulatus.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fragmento de ADN compreendendo os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus, compreender o fragmento EcoRI/Clal com 2,1 kb do plasmídeo pER2 representado na figura 2.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido fragmento de ADN compreendendo os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus, compreender o fragmento EcoRI/EcoRV com 1,6 kb do plasmídeo pAHW25 ou do plasmídeo 1 pER2 representado na figura 2.
6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o referido microrganismo ser uma estirpe de Pseudomonas denitrificans ou de Aerobacterium radiobacter.
7. Processo de preparação de estirpes recombinantes melhoradas para a sintese de 0-fosfo-treonina, caracterizado por se transformar um microrganismo procariota produtor de cobalamina, por técnicas de engenharia genética, com pelo menos, um fragmento de ADN compreendendo os genes bluE e bluF de Rhodobacter capsulatus tal como defenido nas reivindicações 1 a 5.
8. Processo de preparação de estirpes recombinantes de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o microrganismo procariota produtor de cobalamina ser também transformado com, pelo menos, um fragmento de ADN gue codifica uma enzima envolvida numa via de biossintese do 5,6-dimetilbenzimidazole tal como defenido na reivindicação 2. Lisboa, 25 de Outubro de 2006 2