PT90963B

PT90963B - Processo para a preparacao de uma sequencia de acido nucleico e/ou de um fragmento desta ultima que codifica para pelo menos uma proteina reconhecida pelos anticorpos anti-p30 de "toxoplasma gondii" e suas aplicacoes

Info

Publication number: PT90963B
Application number: PT90963A
Authority: PT
Inventors: Andre Tartar; Marie-France Cesbron-Delauw; Pierrette Maes; Francoise Darcy; Andre Capron; Raymond Pierce; Paola Leite
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1989-06-23
Publication date: 1995-01-31
Also published as: WO1989012683A1; PT90963A; FR2633309A1; DK48890D0; EP0353111A1; JPH03503240A; FR2633309B1; DK48890A

Description

Processo para a preparação de uma sequência de ácido nucleico e/ou de um fragmento desta última que codifica para pelo menos uma proteína reconhecida pelos anticorpos anti-P30 de toxoplasma gondii e suas aplicações

A presente invenção diz respeito a uma sequência de ácido nucleico e/ou a um fragmento desta que codifica para pelo menos uma proteína reconhecida pelos anticorpos anti-P30 de Toxoplasma gondii (TG), assim como aos produtos da expressão desta sequência. A presente invenção diz igualmente respeito aos processos para a sua preparação, à sua aplicação no diagnóstico precoce, vigilância e à imunoprotecção da toxoplasmose.

protozoário parasita Toxoplasma gondii membro da classe dos Sporozoa e da ordem dos Coccidia é um parasita intracelular que se reproduz em uma grande variedade de tipos de células no interior dos seus hospedeiros, que são mamíferos.

No homem adulto, foram descritas duas formas do parasita: o taquizóito, que é a forma multiplicativa encontrada durante a fase aguda da doença e o bradizóito, forma resistente que persiste enquistada nos tecidos nervosos e é verosimilmente

- 2 7 responsável pela manutenção de uma imunidade durável à reinfecção.

Este parasita é um importante patogénio, não somente no homem mas igualmente em medicina veterinária e está muito largamente espalhado geograficamente, em tal escala que se pode estabelecer que perto de 500 milhões de pessoas no mundo inteiro apresentam uma reacção serológica positiva à infecção.

No homem, a toxoplasmose é frequentemente assintomática, passa a maior parte do tempo despercebida e não apresenta nenhuma consequência. Contudo, em certos casos, uma toxoplasmose pode ter consequências graves para os sujeitos ditos em risco que são as mulheres grávidas e os indivíduos imunodeprimidos.

Na mulher grávida, uma infecção toxoplásmica está na origem de terríveis complicações fetais e neo-natais, se o tratamento maternal não for iniciado precocemente e continuado com constância.

Em particular, a toxoplasmose é responsável por danos oculares e cerebrais severos e mesmo mortais nos recém-nascidos contaminados por via transp1 acentária; tais complicações encontram-se igualmente nos pacientes imunodeficientes .

isolamento do parasita apenas é possível nas formas evolutivas ou congénitas; raramente é praticado e aceita-se habitua 1mente só o diagnóstico serológico. Os sinais clínicos, quando existem, são geralmente pouco evocadores, o que confere ao diagnóstico serológico um valor essencial.

A multiplicidade das técnicas, dos antigénios e/ou dos anti-corpos utilizados, traduz a dificuldade deste diagnóstico, sobretudo quando se trata de caracterizar as imunoglobulinas

M (IgM), testemunhas da infecção recente evolutiva.

Alguns testes baseiam-se na detecção dos anticorpos, eventualmente presentes num indivíduo; outros testes baseiam-se na detecção dos próprios antigénios.

HUGHES, £CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMUNOLOGY, vol. 120 (1985), SPRINGER ED., Páginas 105-139_7 passa em revista os diferentes testes de serodiagnóstico disponíveis: teste de coloração de SABIN E FELDMAN, padronizado por BEVERLY e BEATTIE (1958) e aperfeiçoado por FELDMAN e LAMB (1966), WALDELAND (1976) e BALFOUR e colab. (1982), que requer parasitas vivos, grandes quantidades de soro humano normal e especialistas bem treinados para a sua realização e interpretação; teste de detecção de anticorpos por imunofluorescência, que foi aplicado por REMINGTON (1968) e por KARIM e LUDLAM (1975) para a detecção de anticorpos IgM, que pode dar reacções não específicas (falsos positivos); os testes de hemaglutinação que levam à detecção demasiado tardia dos anticorpos, particularmente na mulher grávida; teste ELISA para a detecção de anticorpos de Toxoplasma , mediante isolamento de IgM in Situ sobre a microplaca do teste (NOAT e REMINGTON, 1980). No que diz respeito aos testes serológicos utilizando a detecção dos antigénios solúveis, estes últimos obtêm-se mediante simples extracção (lise com água, congelação e descongelação ou rebentamento por ultra-sons de taquizoítos de Toxoplasma). Estas técnicas não asseguram a presença de antigénios da membrana no sistema de teste visto que são facilmente solúveis em água ou no tampão ou se a etapa final de centifrugação deixa subsistir pequenos fragmentos de membrana em suspensão na solução.

Os testes que se baseiam na detecção de diferentes antigénios de Toxoplasma gondii pelos anticorpos apropriados, necessitam da produção de anticorpos específicos de taquizoítos.

Demonstrou-se que a maior parte dos anticorpos monoclonais dirigidos contra a superfície dos taquizóitos (HANDMAN e colab., 1980, Detection and characterization of membrane an»1 tigens of Toxoplasma gondii, Aust. J. Esp. Biol. Med. Sei, 59,

505), (SETHI e colab., 1980, Hybridomas secreting monoclonal 1» antibody with specificity for Toxoplasma gondii, J . Parasitol., 6, 1921), (JOHNSON e colab. 1981, Hybridomas secreting monocloff nal antibody to Toxoplasma gondii Aust. J. Exp. Biol. Med.

Sei . , 59, 505) (JOHNSON e colab., 1985 , Monoclonal antibodies to Toxoplasma cell membrane surface antigens protect mice from tοχop1asmosis , J . Protozool., 50 , 551 ), (KASPER e colab., 1 985, Purification of a major membrane protein of Toxoplasma gondii by immunoabsorption with a monoclonal antibody, J. Immunol . ,

150, 2407), (RODRIGUEZ e colab., 1985 Major surface protein of Toxoplasma gondii (P50) contains an immunodominant region with repetitive epitopes, Eur. J. Immunol . , 15, 747) reconhecem uma proteína de 27 a 55 kDa, definida mediante electroforese em gel de acrilamida (SDS-PAGE) e que se denominou P50 (KASPER, RODRIGUEZ) Experiências de transferência passiva (JOHNSON) ou de imunização activa com a P50, parcialmente purificada (ARAÚJO e colab., 1984, Partially purified antigen preparations of Toxoplasma gondii protect against lethal infection in mice, Infect. Immun., 45 122), indicam, além disso, que aquela desempenha um papel de imunoprofilaxia da toxoplasmose.

Por outro lado, a presença de anticorpos específicos da P30, no soro de doentes que apresentem uma toxoplasmose recente ou distante foi demonstrada (HANDMAN e colab., 1980, Detection and characterization of membrane antigens of Toxoplasma gondii , J. Immunol. , 124, 2578 ), (KASPER e colab.), (SHARMA e colab., 1985, Western blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognised by human IgM and IgG antibodies, _J. Immunol, 131, 977).

Como exemplo para a detecção dos anticorpos anti-TG, pode-se citar o teste imunoenzimático descrito no artigo de CESBRON e colab., publicado em 1986; trata-se de um método da captura dos IgM anti-P30. 0 princípio do teste baseia-se na captura dos IgM séricas que se revelam indirectamente, em dois tempos, por um par antigénio/anticorpo monoclonal dirigido contra a P30.

Este teste já melhora a sensibilidade do diagnóstico e é nitidamente superior aos testes anteriormente citados e particularmente à imunofluorescência ou à hemaglutinação.

Os testes que se baseiam na detecção dos antigénios de TG pelos anticorpos específicos, assim como os testes que se baseiam na detecção dos anticorpos anti-TG produzidos pelo indivíduo, disponíveis actualmente, não apresentam as características de fiabilidade pretendidas em todos os casos de toxoplasmose.

Os Inventores consideraram, por consequência, como indispensável utilizar testes que possam com vantagem ser fiáveis, qualquer que seja o tipo e o estádio de toxoplasmose e assim melhorar ainda a especificidade e a sensibilidade da detecção da toxoplasmose, particularmente evolutiva e evitar portanto os falsos negativos e os falsos positivos.

Os Inventores têm, por consequência, como objectivo providenciar, particularmente, compostos para o diagnóstico que possam ser utilizados em um processo de diagnóstico, que não apresente o inconveniente dos processos anteriormente propostos e particularmente pelo facto de serem independentes do estado do Toxoplasma gondii.

A presente invenção tem por objecto uma sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo facto de apresentar a seguinte sequência de bases nucleotídicas (I):

10 20 30 40 SO

AAGGGGAGACCGGTGGACGGTCCAGGTCTTCGTGGAATGCTCGTCTTGCGCGCACCGGC

70 SO 90 100 110

CGAAATTTCCGGTTCTACGACCCGGCGAAAGTGAÀGAGCCTCGTGGTCACGGACTTCAG

120 130 140 ISO 160

TCGCCTCATGCTCCGCAAGGCCCTGGAGAAGAAAGAAGCCCTCAAG (I ) , e pelo facto de codificar para uma proteína reconhecida pelos anticorpos anti-P30.

Esta sequência foi denominada clone P-30.8 pelos

Inventores.

te por objecto uma elo facto de compreenfórmula I indicada nucleotídicas de sequênci der pelo antes e fórmula

A presente invenção tem igualmen a de ácido nucleíco, caracterizado p menos um fragmento da sequência de por apresentar a sequência de bases II a seguir:

1· 2» 30 4· 5· 60 ú u γ ú . ú à

GTATCAGACCCTCGTCAAAAGTATCGTTCTTCAGCTGCGATACAAGCGTCGCAGTGACGT

7t 40 90 100 11· 12· ú ú ώ ú ύ _

CAAGGAGCACAOTCOCCAAGCTATACACACAGTCGTACCTTAAGTGACGATGCATTTTCT

130 14β 15· 16· 17· 1·· ú ú Ú -ú—— -ώ-iu coagtttctccccaacactccggttgcttgagJaaggggagaccggtccacggtccaggtc^

19· 200 210 220 230 240

XTÇÇTÇÇAATGCTCGTCTTGCGrt^rÂAGCAAGCGATCCArnxrronnri >pnçiçr,i

250 26· 270 280 29· 3·· u ú ú ύ ú

AGOTCAGCTTCTTCAGTGCCGTTCAATCGGTATACGTCCAGCTGGGTCGCTGGAGTCGAG

310 320 330 340 350 360 à ú ú ú ú u

AÇÇCGGTTCGCAAGAGAGCGGACTGCGTGCATCTGTTGGGTTCGACAGTCGTGTGCTTCG

370 380 39· 400

Q Ú .Ú Ú

ATGTCCAAAGGGGCAGCTGCGAGTCGGGGAGTTTCGTCGACCTCCAG

Esta sequência é denominada clone GPP5 pelos Inventores e corresponde a um fragmento de uma inserção de 1600 pares de bases denominada G 42 pelos Inventores e correspondendo a um fragmento do ADN genómico de Toxoplasma gondii.

Entende-se por sequência de ácido nucleico, na presente invenção, tanto uma sequência de ADN de cordão duplo, como uma sequência de ADN de cordão simples e assim como os compostos de transcrição das ditas sequências de ADN.

A presente invenção tem igualmente por objecto oligonucleótidos, caracterizados pelo facto de serem constituídos por um fragmento de uma sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção.

Entre estes fragmentos, pode-se citar em particular:

- um oligonucleótido, caracterizado pelo facto de apresentar a seguinte sequência de fórmula III:

5' CAGCTGCGATAGAAGCGTCGCAGTG (III)

Uma tal sequência corresponde em particular à sequência de bases 32-56 da sequência de fórmula II;

- um oligonucleótido, caracterizado pelo facto de apresentar a seguinte sequência de fórmula IV:

5' GGGGAGACCGGTGGACGGTCCAGGTC (IV)

Uma tal sequência corresponde em particular à sequência de bases 155-180 da sequência de fórmula II, ou à sequência de bases 3-28 da sequência de fórmula I;

- um oligonucleótido, caracterizado pelo facto de apresentar a seguinte sequência de fórmula V:

5' GCAGGTCGACCCAGCGACCTCAGC (V)

Uma tal sequência corresponde em particular à sequência de bases 275-298 da sequência de fórmula II.

De acordo com um modo de realização vantajoso, os referidos oligonucleótidos obtêm-se por síntese.

A presente invenção tem igualmente por objecto pares de iniciação para a síntese de um ácido nucleico de Toxoplasma gondii, caracterizados pelo facto de cada iniciador compreender uma sequência ou um fragmento de sequência nucleotídica tal como definida antes.

Tais iniciadores permitem a síntese específica do ADN ou do ARN de Toxoplasma gondii.

De acordo com a presente invenção, os referidos pares de iniciação podem marcar-se, com vantagem, mediante qualquer meio apropriado (biotinilação ) .

De acordo com um modo de realização vantajoso dos referidos pares, estes são constituídos por um o1igonuc1eótido de fórmula III emparelhado com um o 1igonuc1eótido de fórmula V para a síntese do referido ácido nucleico.

A presente invenção tem igualmente por objectivo sondas nuc1eotídicas , caracterizadas pelo facto de compreenderem uma sequência nucleotídica ou um fragmento desta tal como definido antes, eventualmente marcada com ajuda de um marcador tal como um isótopo radioactivo, uma enzima apropriada, um fluorocromo ou mediante qualquer outra modificação química ou um anticorpo.

De acordo com um modo de realização vantajoso da presente invenção, a referida sonda é um oligonucleótido de fórmula IV indicada antes.

A presente invenção tem igualmente por objecto uma proteína e/ou um fragmento desta apresentando propriedades antigénicas, caracterizada pelo facto de ser reconhecida pelos anticorpos anti-P30 e pelo facto de a sua sequência de ácidos aminados (VI), deduzida da sequência I indicada antes, ser a seguinte:

10 Gly -Glu-Thr-Gly-Gly-Arg-Ser-Arg-Ser-Ser -Trp-Asn-Ala-Arg-LeuAla-Arg-Thr-Gly-Arg^^-Asn-Phe-Arg-Phe-Tyr-Asp-Pro-Ala-Lys-Val^^Lys-Ser-Leu-Val-Val^-Thr-Asp-Phe-Ser-Arg^G-Leu-Met-Leu-Arg-LysAla-Leu-Glu-Lys-Lys^O-Glu-Ala-Leu-Arg (VI)

A presente invenção tem igualmente por objecto um péptido, caracterizado pelo facto de apresentar a seguinte sequência VII de aminoácidos:

Thr-Asp-Phe-Ser-Arg-Leu-Met-Leu-Arg-Lys-Ala-Leu-Glu-Lys-Lys-GluAla-Leu-Arg (VII) pelo facto de ser reconhecida pelos anticorpos anti-P30 e pelo facto de corresponder à fracção C-terminal da proteína de fórmula

VI antes definida.

De acordo com uma variante do péptido de fórmula Vil, o aminoácido N-terminal é uma aceti1cisteίna e o referido péptido apresenta a seguinte sequência de aminoácidos de fórmula VIII:

AcetylCys-Asp-Phe-Ser-Arg-Leu-Met-Leu-Arg-Lys-Ala-Leu-Glu

Lys-Lys-Glu-Ala-Leu-Arg (VIII)

A presente invenção tem igualmente por objecto um

1

conjugado apresentando propriedades antigénicas, caracterizado pelo facto de ser constituído por um peptido de fórmula VII ou de fórmula VIII, ligado por covalência a uma proteína de transporte.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, a referida proteína de transporte é constituída por albumina bovina.

A presente invenção tem igualmente por objecto uma proteína e/ou um fragmento desta que apresenta propriedades antigénicas, caracterizada pelo facto de ser reconhecida pelos anticorpos anti-P30 e pelo facto de a sua sequência de aminoácidos de fórmula IX, deduzida da sequência de fórmula II antes definida ser a seguinte:

Glu-Gly-Glu-Thr-Gly-Gly-Arg-Ser-Arg-Ser-Ser-Trp-Asp-Ala-Arg-LeuAla-Arg-Lys-Gln-Ala-Ile-Asp-Asp-Gly-Gln-Gln-Glu-Glu-Arg-Gly-GlnLeu-Leu-Gln-Cys-Arg-Ser-Ile-Gly-Ile-Arg-Pro-Ala-Gly-Ser-Leu-GluSer-Arg-Arg-Gly-Ser-Gln-Glu-Ser-Gly-Leu-Arg-Ala-Ser-Val-Gly-PheAsp-Ser-Arg-Val-Leu-Arg-Cys-Arg-Lys-Gly-Gln-Leu-Arg-Val-Gly-GluPhe-Arg-Arg-Pro-Ala. (IX)

A presente invenção tem igualmente por objecto um produto de expressão da proteína de fórmula VI, caracterizado pelo facto de ser expresso por um vector de expressão recombinante na qual foi inserida a sequência de ADN de fórmula I e pelo facto de ter um peso molecular de 120 kDa.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, o referido produto de expressão compreende um fragmento peptídico de 6 kDa que corresponde a uma parte de uma pro1 2 teína antigénica de Toxoplasma gondii, é igual à proteína de fórmula VI, anterior, e comporta pelo menos um epítope reconhecido pelos anticorpos anti-P30.

A preparação da proteína e/ou dos péptidos e/ou dos conjugados, de acordo com a presente invenção, realiza-se de maneira conhecida por síntese em fase sólida de acordo com o processo descrito por MERRIFIELD.

A presente invenção tem igualmente por objecto um plasmídeo recombinante comportando uma inserção de ADN de fórmula I antes definida.

dito plasmídeo recombinante foi depositado na Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes do INSTITUT PASTEUR, em 24 de Junho de 1988 sob o nS. 1-773.

A presente invenção tem igualmente por objecto um plasmídeo recombinante comportando uma inserção de ADN contendo o fragmento de ADN de fórmula II antes definida.

Esta inserção de ADN é o fragmento de 1600 pares de bases de ADN genómico de Toxoplasma gondii denominado G42 pelos

Inventores.

referido plasmídeo recombinante foi depositado na Coilection Nationale de Cultures de Micro-Organismes do INSTITUT PASTEUR, em 22 de Junho de 1989 sob o nS. 1-876.

A presente invenção tem, além disso, por objecto produtos de diagnóstico da toxoplasmose, caracterízados pelo facto de conterem como ingredientes activos, uma proteína de fórmula

VI e/ou uma proteína de fórmula IX e/ou um péptido de fórmula VII

3 ou VIII e/ou um conjugado de acordo com a presente invenção reconhecido(s) pelos anticorpos anti-P30.

A presente invenção tem igualmente por objecto os produtos para o diagnóstico da toxoplasmose, caracterizados pelo facto de conterem como ingredientes activos uma sequência de ácido nucleico e/ou um fragmento deste de acordo com a presente invenção.

A presente invenção tem, além disso, por objecto a preparação de vacinas próprias para se obter uma protecção significativa contra a toxoplasmose, caracterizadas pelo facto de comportarem como ingrediente activo uma proteína e/ou um péptido e/ou um conjugado de acordo com a presente invenção, eventualmente associado a pelo menos um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

A presente invenção tem igualmente por objecto um processo para a detecção e/ou vigilância da toxoplasmose, particularmente da toxoplasmose aguda e da toxoplasmose congénita, caracterizado pelo facto de utilizar pelo menos um composto de diagnóstico de acordo com a presente invenção.

De acordo com um modo de realização, faz-se contactar os produtos de diagnóstico representados pelas proteina(s) e/ou péptido(s) e/ou conjugado(s) apresenatando uma actividade antigénica tal como a definida antes, denominados adiante fracções antigénicas, com uma amostra biológica a testar para determinar assim a ligação das referidas fracções antigénicas aos anticorpos anti-P30, no caso em que estes estão presentes na amostra biológica a testar, sendo o referido complexo revelado de maneira apropriada.

De acordo com um outro modo de realização, faz-se contactar os produtos de diagnóstico representados por uma sonda de acordo com a presente invenção, com uma amostra biológica tratada de maneira apropriada, de modo a permitir o acesso dos seus ácidos nucleicos à sonda e realização de uma hibridação eficaz quando os toxoplasmas pesquisados estão presentes, eliminação de qualquer sonda não hibridada e detecção apropriada das sondas de ADN retidas mediante hibridação.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, antes da hibridação, faz-se contactar, em condições apropriadas, o ácido nucleíco a detectar com um par de iniciação de acordo com a presente invenção, para amplificar pelo menos um fragmento do referido ácido nucleico.

A amplificação utilizada é particularmente uma das técnicas de amplificação genética tais como o método dito Q replicase (LIZZARDI PM. e colab., Biotechnol , 1 988,6) ou o método dito reacção de polimerização em cadeia (P.C.R.) descrito nos pedidos de patente de invenção europeia nS. 200 363, n?. 201 184 e n?. 229 701 depositados por CETUS CO.

Um tal teste de diagnóstico tem a vantagem de permitir a detecção específica do ADN genómico de Toxoplasma gondii nas colheitas biológicas ou nas amostras tecidulares.

No caso da toxoplasmose congénita, utiliza-se-á sangue do cordão ou tecido placentário; para os doentes imunodeprimidos, utilizar-se-á lavagens bronco-alveolares, líquido cefaloraquidiano ou sangue.

A presente invenção tem, para além disso, por objecto

5 um Kit, ou estojo para a detecção de Toxoplasma gondii nas amostras biológicas, caracterizado pelo facto de compreender:

- uma quantidade apropriada de proteína e/ou péptido e/ou conjugado, de acordo com a presente invenção, eventualmente um testemunho positivo, um testemunho negativo e todos os outros reagentes apropriados.

Em variante, o Kit compreende uma quantidade apropriada de sonda de acordo com a presente invenção, eventuaimente associada a uma quantidade apropriada de pelo menos um par de iniciadores convenientes e eventualmente preparações testemunhos de ácidos nucleícos de Toxoplasma gondii e todos os outros reagentes apropriados.

Além das disposições anteriores, a presente invenção compreende ainda outras disposições que sobressairão na descrição que se segue, que se refere a exemplos de clonagem do gene que codifica para a P30 e à utilização da P30 como vacina.

Entenda-se bem, contudo, que estes exemplos são dados unicamente como ilustração do objecto da presente invenção, pelo que não constituem de modo algum uma limitação.

EXEMPLO 1: PURIFICAÇÃO DO ANTIGENIO DE SUPERFÍCIE

RECONHECIDO PELOS ANTICORPOS ANTI-P3O:

a) Protocolo para a extracção dos antigénios membranares de taquizóitos:

Mantém-se a estirpe virulenta RH de Toxoplasma gondii mediante passagens bi-semanais no murganho SWISS. Os parasitas são recolhidos a partir do peritoneu de murganhos infectados três dias antes. São filtrados com filtros do policarbonato, 3^í4,m (Nuclepore) e lavados três vezes com PBS (tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM). Suspende-se o sedimento final com PBS contendo 0,5% de Nonidet NP40 (Sigma) e 100 unidades/ml de aprotinina (Sigma). Após uma incubação durante uma hora a 4°C, centrifuga-se o extracto a 10000g durante vinte minutos a 4°C. Utiliza-se o sobrenadante para a continuação como estirpe do antigénio reconhecido pelos anticorpos anti-P30.

b) Purificação do antigénio reconhecido pelos anticorpos anti-P30 mediante HPLC:

Injecta-se o extracto total de taquizóitos ( 500 ) em uma coluna Vydac (4,6 x 250 mm) como uma porosidade de o

300 A e microesferas de 5. A eluição efectua-se com uma mistura CH-jCN/H^O/CF^COOH ( 5:95 :0,05 em volume) durante 12 minutos seguida de um gradiente linear durante 180 minutos até 80% em CH^CN, mantendo-se esta concentração durante 5 minutos. 0 pico contendo o antigénio reconhecido pelos anticorpos anti-P30 é eluído a uma concentração de CH^CN de 3 4,4 % após 90 minutos.

c) Purificação do antigénio reconhecido pelos anticorpos anti-P30 mediante cromatografia de imunoafinidade.

Purifica-se o antigénio reconhecido pelos anticorpos anti-P30 exactamente de acordo com o método descrito por Santoro e colab. (1985). 0 anticorpo monoclonal (mAb) fixa-se ao suporte de afinidade activado pelo glutaraldeído (Boehringer, Mannheim, R.F.A.) de acordo com as recomendações do fabricante.

Resumidamente, suspende-se o adsorvente de afinidade (1 g) em cloreto de sódio 0,9% (5 ml) contendo mAb a 20 mg/ml.

- 17/Depois de uma incubação de 4 horas à temperatura ambiente com agitação, despeja-se o gel na coluna cromatografica e lava-se com cloreto de sódio 1,5%, até que a densidade óptica (D.O») do eluato seja inferior a 0,005. Os grupos aldeído livres residuais são saturados com etanolamina/ácido clorídrico 0,5 M (pH 7,5) durante uma hora. Depois das lavagens sucessivas com 50 ml de cloreto de sódio 0,9%, 50 ml de glicina 0,5 M, pH 3,75 e 100 ml de cloreto de sódio 0,9%, armazena-se o imunoadsorvente a 4°C.

A purificação da P30 realiza-se durante uma noite a 4°C fazendo circular 10 ml de um extracto total de taquizóitos de Toxoplasma gondii (200 mg) na coluna de imunoadsorvente em circuito fechado com um débito de 2 ml/hora. Em seguida abre-se o sistema cromatográfico e lava-se a coluna com cloreto de sódio 0,9%. Elui-se o antigénio ligado específicamente ao imunoadsorvente com ajuda da trietilamina 0,1 M (pH 11,5) e neutraliza-se rapidamente com ácido clorídrico 1M. Depois de uma diálise exaustiva contra PBS, pH 7,2, armazena-se a P30 pura a -70°C.

EXEMPLO 2: PREPARAÇAO DOS COMPOSTOS DE TRADUÇRO DOS ARNs MENSAGEIROS DE TAQUIZOITO:

a) Extracção do ARN total:

Utiliza-se a técnica descrita por AUFFRAY e ROUGEON (Eur. J Biochem., 1980, 107, 305). Os taquizóitos lisam-se mediante adição de uma solução de LiCl 3M, Heparina 200 /ml, acetato de sódio 10 mM, pH 5, SDS 0,1%.

Depois de se homogeneizar em Potter e se conservar durante toda a noite para precipitar os ARNs, centrifuga-se o lisado a 16300g durante 40 minutos, a 4°C. Lava-se o sedimento duas vezes e suspende-se em uma solução de LiCl 4M, ureia 8M depois centrifuga-se de novo a 16300g durante 40 minutos, a 4°C. Dissolve-se em seguida, o sedimento em água, leva-se a solução a 0,1 M em acetato de sódio, pH 5 e a 0,1 % em SDS e extrai-se sucessivamente com um volume de fenol saturado de água e com um volume de fenol/clorofórmio. Leva-se finalmente a fase aquosa a 0,2M em acetato de sódio, pH 5, depois precipita-se o ARN com 2,5 volumes de etanol a -20°C durante uma noite.

b) Purificação dos ARNs mensageiros:

Utiliza-se o método descrito por ARNEMANN e colab.

(Nucl. Acids Res., 1977, 4, 4023-4026). Este método consiste em separar os ARNs poli A+ do ARN total mediante cromatografias sucessivas em oligo (dT) celulose.

EXEMPLO 3: CLONAGEM DOS PRODUTOS DE EXPRESSÃO:

a) Preparação do banco de cDNA a partir do ARNm de taquizóitos :

A síntese do cDNA realiza-se de acordo com o método descrito por GUBLER e HOEFMANN (Gene , 1 983 , 25 , 263 ). 0 primeiro cordão de ADN complementar é sintetizado pela acção da transcriptase inversa de AMV. 0 ADN, tornado de cordão duplo pela acção conjunta da RNAse H e da polimerase I, trata-se, em seguida, com a DNA polimerase para tornar as suas extremidades livres. Após metilação pela enzima EcoRI metilase, adiciona-se linkers EcoRI às extremidades dos cDNAs pela acção da DNA Ligase. Os cDNAs são em seguida digeridos pela enzima EcoRI e purificam-se mediante cromatografia em uma coluna AcA34 Ultrogel (0,2X30 cm) de acordo com o método descrito por WATSON e JACKSON (em Glover D.M. ed.:

DNA Cloninq, vol. I.A. praticai approach: Oxford, Washington IRL

Press, p.49, 1985). Em seguida insere-se os cDNAs (500 a 7000 pares de bases) no sítio EcoRI do fago lambda gt 11 (Huynh e colab. 1985 em Glover D.M. ed.; DNA Cloninq, vol. I.A praticai approach, Oxford Washington IRL Press, p. 49). Após ligação, os fagos recombinantes são empacotados in vitro. E assim constituído um banco de 3X10^ fagos.

b) Rastreio do Banco e escolha dos candidatos P30:

derivado do fago lambda gtl1 permite a expressão de genes estranhos sob o controlo do promotor Lac, após fusão do cDNA com o gene da -galactosidase de E. coli (Young e Davis,

983 ) .

Inocula-se uma amostra do banco em lambda gtl1 na estirpe de E. coli Y 1090 com uma diluição representando 10^ fagos por caixa de 90 cm de diâmetro. A indução da expressão da proteína sob controlo do promotor Lac é desencadeada a 42°C na presença de isopropil-tio- -galactosido (IPTG). As proteínas sintetizadas são adsorvidas sobre filtro de nitrocelulose para serem incubadas na presença de anticorpos de coelho anti-P30, de acordo com o processo descrito no exemplo 1. Os anticorpos fixados são detectados com um segundo anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase; em seguida revela-se este complexo mediante uma coloração com o 4-cioro-1-nafto 1 na presença do peróxido de hidrogénio. Esta detecção permite identificar os fagos recombinantes cuja inserção de cDNA dirige a síntese de uma proteína ou fracção de proteína comportando os epitopes reconhecidos pelos anticorpos anti-P30.

EXEMPLO 4: SUB-CLONAGEM N0 PLASMlDEO pUC 13 Ε N0 FAGO M13 mp10:

ι.

Após purificação do clone P30-8, os fagos são produzidos em grandes quantidades, purificados e o ADN extraído de acordo com técnicas clássicas (Maniatis e colab., 1982). Hidrolisa-se, em seguida, o ADN com a enzima EcoRI e separa-se a inserção mediante electroforese em gel de agarose 2% antes de se recuperar mediante electroeluição. A inserção é sub-clonada no sítio EcoRI do plasmídeo pUC 13 (Pharmacia) mediante acção da

DNA ligase e utiliza-se o plasmídeo recombinante obtido, de acordo com a presente invenção, para transformar a estirpe E.coli JM 109. 0 plasmídeo recombinante prepara-se em grande quantidade de acordo com o método descrito por Birnboim e Doly (1979) e a inserção reprepara-se após hidrólise pela EcoRI de acordo com o método descrito antes. A sub-clonagem no vector fágico M13 mp10 efectua-se seguindo as instruções do fornecedor (Amersham) e utiliza-se o ADN do fago de cordão simples para as determinações de sequência de acordo com o método descrito por Sanger e colab.

EXEMPLO 5: SÍNTESE DE PEPTIDOS péptido correspondente à sequência C-terminal do clone é sintetizado em fase sólida (Merrifield, 1963) e os grupos activos protegidos. Após clivagem com HF, purifica-se o péptido mediante gel filtração em Eractogel TSK-HWUO-S (Merck) na presença de ácido clorídrico, pH 2, e liofiliza-se depois, (/erifica-se a pureza do péptido mediante cromatografia em camada fina e mediante HPLC em fase inversa. A identidade do péptido verifica-se mediante análise dos aminoácidos após hidrólise ácida.

Conjuga-se o péptido com albumina bovina com glutaraldeído: dissolve-se o péptido (1,5y4.mole) com a proteína portadora (2 mg) em um tampão de fosfato de sódio, pH 7, e, em seguida, ajusta-se o pH a 8 com hidrogenocarbonato de sódio. Adiciona-se quotidianamente uma solução de glutaraldeído a 2,5% (20 ) durante três dias, sob agitação constante. Depois de quatro dias, dialisa-se a mistura contra cloreto de sódio 0,15 M.

EXEMPLO .6: PROPRIEDADE VACINANTE DO ANTIGENIO P30:

A imunização de coelhos com 150ytg do antigénio reconhecido pelos anticorpos anti-P30 purificado, quer mediante imunoadsorção quer mediante HPLC, realiza-se de acordo com a técnica descrita por Vaitukatis e colab. (1971). Uma injecção de manutenção de 30ytg efectua-se um mês mais tarde por via intramuscular.

EXEMPLO 7: DESPISTAGEM E IDENTIFICAÇÃO DE TOXOPLASMA GONDII

MEDIANTE PCR:

Utiliza-se iniciadores 1 e 2 de acordo com a presente invenção na técnica PCR e efectua-se 30 ciclos de amplificação, cada um definido pelas seguintes três etapas;

- desnaturação do ADN a 94°C durante 1 minuto;

- hibridação dos iniciadores com ADN de cordão simples a 55°C durante 2 minutos.

- síntese dos novos cordões a 72°C.

A reacção efectua-se na presença de uma mistura de dexinucleótidos (dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 200yt«M final de cada um) dois iniciadores (0,5 ytcM) d e 1 de ADN e 2,5 unidades de Taq polimerase (CETUS). A automatização das etapas é assegurada graças ao Cycler Perkin Elmer Cetus.

Nas condições descritas, obtém-se a amplificação de uma banda única cujo tamanho, calculado em 250 pb após análise em gel de agarose a 2?ó, corresponde à pretendida. A utilização da sonda oligonucleotídica de acordo com a presente invenção e definida pela fórmula IV antes permite revelar mediante hibridação Southern a mesma banda e verificar assim a especificidade da reacção.

Uma experiência de diluição do ADN de taquizóito no ADN humano permite determinar o limite de detecção da técnica como sendo o equivalente a 10 taquizóitos.

A reacção é específica do ADN de T. gondii, na medida em que o ADN humano, de murganho ou de arenque não dão produtos de amplificação.

EXEMPLO 8: CLONAGEM DA INSERÇÃO GPP5

A inserção do clone do ADNc P-30.8 serve para o rastreio de um banco de ADN genómico no uector lambda gt10. Isola-se um clone contendo uma inserção de 1600 pares de bases, que corresponde a um fragmento do ADN genómico de Toxoplasma gondii e denominado G42 pelos Inventores.

A sub-clonagem dos fragmentos Pst I-Pst I leva à caracterização e à sequenciação do clone GPP5.

Sobressai, assim, do descrito anteriormente que a presente invenção não se limita de modo algum a estes modos de utilização, de realização e de aplicação que acabam de ser descritos de modo mais explícito, pelo contrário, engloba, todas as variantes que possam vir ao espírito do técnico na matéria, sem se desviar do quadro, nem do alcance da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de uma sequência de ácido nucleico, caracterizado pelo facto de se preparar a sequência em bases nucleotldicas de fórmula I seguinte:

1 10 20 30 40 50

AAGGGGAGACCGGTGGACGGTCCAGGTCTTCGTGGAATGCTCGTCTTGCGCGCACCGGC

60 70 80 90 100 110

CGAAATTTCCGGTTCTACGACCCGGCGAAAGTGAAGAGCCTCGTGGTCACGGACTTCAG (

120 130 140 150 160

TCGCCTCATGCTCCGCAAGGCCCTGGAGAAGAAAGAAGCCCTCAAG (I) , que codifica para uma proteína reconhecida pelos anticorpos anti-P30.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida sequência compreender pelo menos um fragmento da sequência de fórmula I definida antes e de apresentar a seguinte sequência em bases nucleotídicas de fórmula II:

1« de 3·· 4· 5· 6· ύ ϋ ύ 0 ύ

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141 154 16· ave ae· _υ Ú ú _r-ii---ώ-rninrrecTCGCCAACACTCCGGTTCCTTCA4ÃAOOGgAOACCGCTCGACCCTCCAOGTe_

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ATGTCGAAAGOOGCAGCTGCCAGTCGGGGAOTTTCGTCCACCTOCAO

3.- Processo para a preparação de um oligonucleotido caracte rizado pelo facto de se preparar o referido nucleotido a partir de uma sequência nucleotídica obtida pelo processo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2.
4.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido oligonucleotido apresentar a seguinte se quência de fórmula geral III:
5' CAGCTGCGATAGAAGCGTCGCAGTG

III

5.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido oligonucleotido apresentar a seguinte sequência de fórmula IV:

5’ GGGGAGACCGGTGGACGGTCCAGGTC IV
6.- Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido oligonucleotido apresentar a seguinte sequência de fórmula V

5’ GCAGGTCGACCCAGCGACCTCAGC
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo facto de o referido oligonucleotido se obter por síntese.
8, - Processo para a preparação de pares de iniciação para a síntese de um ácido nucleico de Toxoplasma gondii, caracterizado pelo facto de se preparar cada um dos pares de iniciação de maneira que comporte uma sequência ou um fragmento de sequência nucleotídica obtidos de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.
9.- Processo de acordo com a reivindicação 8, para a preparação de pares de iniciação, caracterizado pelo facto de os referidos pares de iniciação se poderem, com vantagem, marcar mediante qualquer meio apropriado.
10.-2

10,- Processo de acordo com a reivindicação 8 ou a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido par de iniciação ser constituído por um oligonucleotido de fórmula III obtido de acordo com a reivindicação 4 a par com um oligonucleotido de fórmula V obtido de acordo com a reivindicação 6, para a síntese do referido ácido nucleico.
11. - Processo para a preparação de sondas nucleotldicas, carac terizado pelo facto de se preparar cada uma das sondas de maneira a compreenderem uma sequência nucleotídica ou um fragmento desta ultima obtidos de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, eventualmente marcada com um marcador tal como um isótopo radioactivo, uma enzima apropriada, um fluorocromo ou mediante qualquer outra modificação química ou um anticorpo.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a referida sonda ser constituída por um oligonucleotido de fórmula IV obtido de acordo com a reivindicação 5.
13. - Processo para a preparação de uma proteína e/ou um fragmento desta última apresentando propriedades antigénicas, caracteri zado pelo facto de se preparar a referida proteína e/ou fragmento de sequência em aminoácidos de fórmula VI dada a seguir, deduzida da sequência de fórmula I de acordo com a reivindicação 1

Glyl-Glu-Thr-Gly-Gly-Arg-Ser-Arg-Ser-Ser^-Trp-Asn-AlaArg-Leu-Ala-Arg-Thr-Gly-Arg2°-Asn-Phe-Arg-Phe-Tyr-AspPro-Ala-Lys-Val^G-Lys-Ser-Leu-Val-Val^S-Thr-Asp-Phe-SerArg⁴^-Leu-Met-Leu-Arg-Lys-Ala-Leu-Glu-Lys-Lys⁵⁰-Glu-AlaLeu-Arg (VI), e de esta proteína ser reconhecida pelos anticorpos anti-P.30.
14. - Processo para a preparação de um péptido, caracterizado pelo facto de se. partir da proteína obtida de acordo com a reivindi cação 13, apresentando o péptido obtido a seguinte sequência de fór mula VII em aminoãcidos:

Thr-Asp-Phe-Ser-Arg-Leu-Met-Leu-Arg-Lys-Ala-Leu-Glu—LysLys-Glu-Ala-Leu-Arg, (VII), de ser reconhecido pelos anticorpos anti-P30 e de corresponder à fracção C-terminal da proteína de fórmula VI obtido de acordo com a reivindicação 13.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o referido péptido comportar como aminoãcido N-terminal uma acetil-cisteína e de apresentar a seguinte sequência em aminoãcidos de fórmula VIII:

Acet ilCys-Asp-Phe-Ser-Arg-Leu-Met-Leu-Arg-Lys-Ala-LeuGlu-Lys-Lys-Glu-Ala-Leu-Arg. (VIII)
16. - Processo para a preparação de um conjugado apresentando propriedades antigénicas, caracterizado pelo facto de se ligar por covalência um péptido obtido de acordo com a reivindicação 14 ou a reivindicação 15 a uma proteína de transporte.

f
17. - Processo de acordo com a reivindicação 16,, caracterizado pelo facto de a proteína de transporte ser constituída por albumina bovina.
18.- Processo para a preparação de uma proteína e/ou de um fragmento desta última racterizado pelo facto fragmento de sequência apresentando propriedades antigénicas, cade se preparar a referida proteína e/ou em aminoácidos de fórmula IX seguinte, deduzida da sequência de fórmula II obtida de acordo com a reivindicação 2:

Glu-Gly-Glu-Thr-Gly-Gly-Arg-Ser-Arg-Ser-Ser-Trp-Asn-AlaArg-Leu-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ile-Asp-Asp-Gly-Gln-Gln-GluGlu-Ara-Gly-Gln-Leu-T.An-nin-ny«-Ãrg-Çer-Ile-Gly-lIft-ArgPro-Ala-Gly-Ser-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Gly-Ser-Gln-Glu-SerGly-Leu-Arg-Ala-Ser-Val-Gly-Phe-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-ArgCys-Arg-Lys-Gly-Gln-Leu-Arg-Val-Gly-Glu-Phe-Arg-Arg-ProAla.

(IX), a qual é reconhecida pelos anticorpos anti-P.30.
19.- Processo de expressão da proteína obtida de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se utilizar um vector de expressão recombinante no qual se inseriu a sequência de ADN de fórmula I e de a referida proteína expressa ter um peso molecular de 120 KDa.
20.- Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de a proteína expressa compreender um fragmento peptídico de 6 KDa que corresponde a uma parte de uma proteína antigénica de Toxoplasma gondii, que é idêntica à proteína de fórmula VI ob tida de acordo com a reivindicação 13 e comporta pelo menos um epítopo reconhecido pelos anticorpos anti-P30.
21.- Plasmídeo recombinante, caracterizado pelo facto de com portar uma inserção de ADN de fórmula I obtida pelo processo de acordo com a reivindicação 1.
22. - Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se encontrar depositado na Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes do INSTITUT PASTEUR, com a data de 24 de Junho de 1988, sob o n9 1-773.
23. - Plasmídeo recombinante, caracterizado pelo facto de comportar uma inserção de ADN contendo o fragmento de ADN de fórmula II de acordo com a reivindicação 2.
24.- Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação 23,

-31caracterizado pelo facto de se encontrar depositado na Collection

Nationale de Cultures de Micro-organismes do INSTITUT PASTEUR, com a data de 22 de Junho de 1989 sob o n9 1-876.
25. - Processo para a preparação de produtos para o diagnóstico da toxoplasmose, caracterizado pelo facto de se preparar os referidos produtos de modo a conterem, como ingredientes activos, uma proteína de fórmula VI obtida de acordo com a reivindicação 13 e/ou uma proteína de fórmula IX obtida de acordo com a reivindicação 18 e/ou um péptido de fórmula VII obtido de acordo com a reivindicação 14 ou VIII de acordo com a reivindicação 15 e/ou um conjugado obtido de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 ou 17, reconhecido(s) pelos anticorpos anti-P30.
26. - Processo para a preparação de produtos para o diagnóstico da toxoplasmose, caracterizado pelo facto de se preparar os referidos produtos de modo a conterem, como ingredientes activos, uma sequência de ácido nucleico e/ou um fragmento desta última obtida de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.
27. - Processo para a preparação de vacinas apropriadas para se conseguir obter uma protecção significativa contra a toxopla^ mose, caracterizado pelo facto de se associar uma proteina e/ou um péptido e/ou um conjugado obtidos de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 18, a pelo menos um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
28. - Processo para a detecção e/ou para a vigilância da toxoplasmose, particularmente da toxoplasmose aguda e da toxoplasmose congénita, caracterizado pelo facto de se utilizar pelo menos um produto de diagnóstico de acordo com uma qualquer das reivindicações 25 ou 26.
29. - Processo de detecção de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de se fazer contactar um produto de diagnóstico de acordo com a reivindicação 25, denominadas adiante frac ções antigénicas, com uma amostra biológica a testar, determinando assim a ligação das referidas fracções antigénicas com anticorpos anti-P30, no caso em que estes se encontram presentes na amostra biológica a testar, e de se revelar o referido complexo de ma neira apropriada.
30.- Processo de detecção de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de se fazer contactar produtos de diagnó^ tico, representados por uma sonda de acordo com a reivindicação 11, com uma amostra biológica tratada de maneira apropriada, de modo a permitir o acesso dos seus ácidos nucleicos à sonda e reali_ zação de uma hibridação efectiva quando os toxoplasmas pretendidos se encontram presentes, eliminação de qualquer sonda não hibridada e detecção apropriada das sondas de ADN retidas mediante hibridação
31.- Processo de detecção de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de, antes da hibridação, se fazer contactar, em condições apropriadas, o ácido nucleico a detectar com pelo menos um par de iniciação de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 10, para amplificar pelo menos um fragmento do referido ácido nucleico.