PT91286B

PT91286B - Processo para a preparacao de sistemas de expressao de pectinas-liases

Info

Publication number: PT91286B
Application number: PT91286A
Authority: PT
Inventors: Jutta Heim; Jacob Visser; Bernd Meyhack
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1988-07-28
Filing date: 1989-07-26
Publication date: 1995-03-01
Also published as: IE61871B1; CA1338859C; EP0353188B2; DE68913846T2; ES2063162T5; HUT51333A; DK175534B1; ES2063162T3; DE68913846D1; FI893541A0; NO893063L; IL91111A; PT91286A; JPH03108487A; HU212832B; DK370989D0; FI104637B; EP0353188A3; NZ230077A; AU633012B2

Description

presente invento diz respeito a um processo para a preparação de moléculas de DNA recombinante codificadoras de sistemas de expressão da pectina-liase (PL) e seus derivados, tais como os genes estruturais de PLA, PLB, PLC, PLE e PLF e correspondentes sequências reguladoras, e.g. promotor, sequências sinal e termina dora e vectores híbridos compreendendo os correspondentes DNAs, incluindo vectores híbridos com DNA codificador de polipeptídeos homólogos ou heterólogos, hospedeiros, especialmente fungos filamentosos, e.g., hospedeiros AspergilCIBA-GEIGY AG

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE SISTEMAS DE EXPRESSÃO DE PECTI NAS-LI ASES lus, transformados pelos referidos vectores , métodos para a preparação das referidas moléculas de DNA recombinante e referidos hospedeiros e utilização das moléculas de DNA recombinante na preparação de novos sistemas de expressão.

Um outro objectivo é a preparação de po1ipeptídeos por meio dos referidos DNAs e dos referidos hospedeiros.

-3*

Novo Sistema de Expressão

Campo do Invento invento relaciona-se com o campo da engenharia genética e proporciona novas moléculas de DnA compreendendo sequências de DNA codificadoras de várias pectina-1iases de Aspergi11us niger e/ou o seu promotor, sequências sinal e terminador. As novas moléculas de DNA são úteis para a super-produção de pectinaT1iases em Aspergillus e/ou na construção de vectores híbridos expressando genes estruturais em fungos filamentados e outros. E agora possível produzir uma única pectina-1iase não contaminada com outras pectina-1iases .

Fundamento do Invento

Se bem que nas técnicas de engenharia genética sejam conhecidos numerosos sistemas de expressão de polipeptideos para hospedeiros procarióticos e eucarióticos, existe uma necessidade constante de novos sistemas que tenham vantagens relativamente ao já conhecidos.

São largamente usados o hospedeiro procariótico Escherichia coli e o hospedeiro eucariótico, e.g. Saccharomyces cerevisiae, para os quais foi desenvolvido um número elevado de diferentes vectores híbridos de expressão, a maior parte plasmídeos. As desvantagens dos hospedeiros coli residem em não poderem glicosilar o polipeptídeo formado e pela ausência de secreção e peptídeo estranho poder acumular-se dentro da célula hospedeira e entrar posterior crescimento. Os hospedeiros levedura glicosilam, mas, tal como E. coli, não secretam os polipeptí-4-

deos , excepto os muito pequenos, para o meio nutritivo. As leveduras secretam apenas para o espaço periplasmático . São hospedeiros do tipo eucariótas superior as células tumorais de mamífero que são capazes de glicosilar e secretar o meio nutritivo, no entanto a sua cultura é muito lenta e cara e existe o perigo de os ácidos nucleicos oncogénicos serem isolados juntamente com o peptideo pretendido do qual este último pode não se libertar.

Face à necessidade de outros hospedeiros também os fungos filamentados taisaomo Neurospora crassa , Aspergillus nidu1ans e Aspergillus niger, foram estudados. Tais fungos já são largamente usados para fins industriais, no entanto, a sua aplicação em técnicas de engenharia genética ficou para trás, principalmente devido â ausência de um sistema de transformação adequado. Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, os fungos filamentosos não contêm plasmídeos que possam ser usados para a introdução de genes estranhos e selecção de fenótipos. E no entanto possível transformar fungos filamentosos com plasmídeos estranhos contendo um gene marcador seleccionável . Todos os vectores até agora descritos para os finges filamentosos não se replicam autónonamente , tal como fazeem os das leveduras, mas são integrados no cromossoma do fungo. Isto ocorre apenas com uma frequência muito baixa.. Por outro lado existe a vantagem da transformação integrativa tornar os transformantes aitóticamente muito estáveis, mesmo em condições não selectivas. A integração estável de mais de uma centena de cópias foi já divulgada.

primeiro vector descrito para fungos filamentosos contendo o gene qa-2 de Neurospora crassa como marca selectiva. Este gene codifica a enzima catabólica desidroquinase e pode ser usado na comp1ementação funcional de mutantes aro de N. crassa /“Case, M.E., Schweizer, M., Kushner, S.R. e Giles, N.H. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 76, 5259-52637. Os mutantes aro são incapazes de crescer em meio mínimo sem um suplemento de aminoácidos aromáticos. A transformação de fÇ crassa pelo vector qa-2 deu-se pela integração de uma única cópia do plasmideo no cromossoma, 30% dos integrantes Aro⁺ mantiveram o gene qa-2 integrado ainda ligado a sequências do plasmideo bacteriano / Case, M.E. (1982) em Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D., Kaplan, S., Konisky, J., Savage, D. e Wolfe, R.S., eds) pág. 87- 100, Plenum7. Esta observação tornou possível a cotransformação de sequências de DNA não selectivas juntamente com selectivas.

Em Aspergi11us nidu 1 ans , o qual tem um ciclo sexuado e é portanto adequado às manipulações genéticas clássicas, foram identificados sistemas de selecção negativos e positivos. Quer usando DNA heterólogo quer DNA homólogo para N. crassa obteve-se complementação funcional de mutantes pyrto de A. niduIans por transformação com plasmídeos contendo o gene pyr G (Ballance et al BBRC 112, 284, 1983; Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983 ). Noutros sistemas mutações no locus trpC ou argB foram funcionalmente complementadas por transformação com os plasmídeos adequados /Yelton et al., PNAS 8 1 , 1470, 1984; Yelton et Timberlake J. Cell. Biochem. Suppl. 9C 173, 1985; Jonstone et al. , EMBO J . 4 , 1307 , 19837 .

Foi também desenvolvido um sistema de selecção positiva dominante fazendo uso do gene amdS isolado a partir de A. niduI ans que permite a A. niger transformado com ele crescer em acetamida com a única fonte de azoto (Tilburn et a 1 . , Gene 26 , 205, 1983; Wermars et a 1 . , Curr. Genet. 9, 36 1, 1985; Kelly J.M. et al . , EMBO J. 4. 475 1985 ) .

Comparado com N_. crassa ou A. nidulans, A. niger é de longe o organismo mais importante. E

-6largamente usado na produção industrial de enzimas, e.g. para usar na industria alimentar. A. n i ger difere de A. n idu1 ase pela sua capacidade secretora, por secretar uma variedade de enzimas hidroliticas , e.g. g1ucoami1 ase , pectinase, celulose, β-glucanase, p-ga1actosidase , naringinase, pentosanase, proteína ácida e linhase, o complexo glucoamilase e pectinase sendo os mais importantes.

A niger não tem ciclo sexuado conhecido. As mutações não podem pois ser introduzidas via recombinação meiõticas. No entanto, por processos clássicos de mutação e selecção, foram conseguidos grandes melhoramentos de estirpes na secreção de enzimas hidroliticas.

Dos genes de enzimas de A. niger apenas os da glucoamilase (Boel et al EMBO J. 1581, 1984) e álcool- e aldeídos-desidrogenase (W086/06097), juntamente com o seu promotor e sequência sinal foram caracterizados e usados na transformação de Anidulans e A-niger respectivamente.

Como marcas selectivas para A .n iger têm sido usadas o gene heterólogo amds (Kelly e Hynes , EMBO J. 4, 475, 1985) e o gene argB (Buxton et al., Gene 37 , 207, 1985; EP 184 438; W086/06097), ambos obtidos a partir de A. n i du1ans.

A. niduIans pela sua capacidade se secretora, por secretar uma variedade de enzimas hidroliticas, e.g. glucoamilase, pÇ-amilase, pectinase, celulose, ^-glucanase, (3-gal actos idase , naringinase, pentoanase , protease ácida e linhase, o complexo glucoamilase e pectinase sendo os mais importantes.

A. niger não tem ciclo sexuado conhecido. As mutações não podem pois ser introduzidas via recomb nação meóticas. No entanto por processos clássicos de mutação e selecção, foram conseguidos grandes melhoramentos de estirpes na secreção de enzimas hidrolíticos.

Dos genes de enzimas de A. niger apenas os da glucoamilase (Biol et al., EMBO J. 3, 1581, 1984) e álcool e aldeídos desidrogenase (WO 86/06097) juntamente com o seu promotor e sequência sinal foram caracterizados e usados na transformação de A. n idu 1 ans e A. n iger respect i vamente.

Como marcas selectivas para A. niger têm sido usadas o gene heterólogo amds (Kelly e Hynes , EMBO J. 4, 475, 1985 ) e o gene argB (Buxton et al., Gene 37 , 207, 1985, EP 184 438; WO 86/06097), ambos obtidos a partir de A . n i du 1 ans .

A. niger é o organismo mais importante para a produção industrial de enzimas que degradam pectina. As pectinas são poligalacturonidos de alto peso molec lar (20 000-40 000 D) consistindo em polímeros do ácido D-galacturõnico ligado por ligações - 1 ,4-glicosidicas e surgem na natureza como constituinte de células de plantas superiores, onde estão ligadas às moléculas de celulose e onde são encontradas principalmente na parede celular primária e na lamela média. Entre as fontes mais ricas de pectina estão a casca do limão e da laranja, a qual contem cerca de 30% deste polissacárido. As enzimas pectinas degradam o substrato, polímero de açúcar, por hidrólise da ligação c< - 1,4-glicosidica (poliga1acturonase) ou por trans-eliminação do resíduo insaturado o<-4,5-galacturónico da molécula de peptina (pectina-1íase diferentes). 0 nome sistemático da pectina-1iase é pectina-transeliminase (EC: 4.2.2.10).

-8Em A. niger as protêinas do complexo péctico não são expressas constitutivamente. Em condições indutoras usando pectiva ou os seus produtos de degradação A. niger expressa as enzimas atrás referidas, incluindo PLI, quando outras fontes de carbono, tais como glucose ou sucrose, são limitantes. Nas culturas em superfície as enzimas pecticas tendem a permanecer associadas à parede celular externa. 0 aumento da concentração de pectina e de Ca²⁺ no meio conduz à secreção total.

Pectinases, tais como PLI, são usadas pela indústria alimentar principalmente na clarificação de sumos de fruta.

A partir de A, niger foram purificadas e parcialmente caracterizadas duas pectina-1iases diferentes, PLI e PLII, por F.E.A. Van Houdenhoven (22). PLI contem quatro resíduos de manose enquanto PLII tem dois resíduos de glucose e dois de manose. As enzimas têm pesos moleculares diferentes (PLI: 37,5 KD, PLII: 36 KD).

A sequência de aminoácidos de PLI foi determinada e está descrita em EP 88 101 397.3. Este invento foi baseado na determinação parcial da estrutura da pectina-1iase I (PLI) que permitiu a síntese de sondas de DNA codificadoras de partes importantes da protéina. Através das sondas de DNA foi possível fazer o despiste e isolar DNA codificador de PLI, eventualmente juntamente com as suas sequências pre e post, a partir de uma biblioteca de genes de A. niger.

Por hibridação de partes do gene PLI com uma biblioteca genómica de A. niger outros genes PL foram detectados os quais não são assunto do presente invento. 0 gene estrutural PLI com a regiaõ delimitante do extremo N obtida a partir de A. niger N756 é no seu extremo N idêntico ao gene PLD obtido a partir de A. niger

N400. Deste modo este último não faz parte do presente in-9vento. 0 presente PLA parece ser parte da mistura PL préviamente purificada designada PLII.

Daqui em diante PLI é também designado PLD e o gene estrutural PLI é designado pe1D.

Objectivos do invento

Os objectivos do invento são moléculas de DNA recombinante compreendendo sequências de DNA codificadoras de novos sistemas de expressão de pectina-liases e seus derivados, tais como os genes estruturais das referidas pectina-1iases e correspondentes sequências reguladoras, e.g. promotor, sequências sinal e terminadora e vectores llbridos compreendendo os correspondentes DNAs, incluindo vectores llbridos com DNA codificador de polipeptideos homólogos ou heterólogos, hospedeiros,especia 1 mente fungos filamentosos, e.g. hospedeiros Aspergi11us, transformadas pelos referidos hospedeiros, métodos para a preparação das referidas moléculas de DNA recombinante e referidos hospedeiros e a utilização das moléculas de DNA recombinante na preparação de novos sistemas de expressão.

Um outro objectivo ê a preparação de po1ipeptideos por meio dos referidos DNAs e referidos hospedeiros.

Os novos sistemas de expressão de pectina-1iases compreendem sequências de DNA codificadores dos promotores, as sequências sinal, os genes estruturais e os terminadores dos referidos novos genes de pectina-liases. As novas pectina-1iases são designadas PLA, PLB, PLC, PLE e PLF.

Mais part i cularmente , um objectivo do presente invento ê a construção de vectores híbridos compreendendo sequências de DNA codificadoras dos promotores de PLA, PLB, PLC, PLE e PLF, facultativamente para a sequên-

-10cia sinal destas protêinas e facultivamente para os seus terminadores. Estes vectores híbridos são usados na incorporação de genes codificadores de protêinas particulares e para a transformação de fungos filamentosos, tais como Asperg i11us, Pen i c i11i um e Cepha1ospori um. A cotransformação de A. niger com 2 plasmídeos diferentes pode ser efectuada sendo um dos plasmídeos seleccionado do grupo dos novos vectores híbridos do invento e o outro é um plasmídeo de selecção especialmente construído que funciona em ligação com uma estirpe mutagenizada de um fungo filamentoso.

presente invento também diz respeito à superproduçaõ das referidas novas pectina-1iases em espécies de Aspergillus e à produção das PLs isoladas não contaminadas com as outras PLs, ou de suas misturas artificiais predeterminadas.

presente invento diz respeito à produçaõ de qualquer proteína o ggie estrutural da qual pode ser expresso na presença ou sob o controle dos presentes DNAs de PL recombinantes.

Os vários temas do invento tornarse-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada do invento que se segue.

Descrição detalhada do invento

Moléculas de DNA recombinante

Mais particularmente, o presente invento diz respeito a uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA codificadora dos sistemas de expressão das pectina-1iases PLA, PLB, PLC, PLE ou PLF ou os seus derivados.

-110 termo sistema de expressão significa uma sequência de DNA capaz de expressar um polipeptideo e compreende o promotor, a sequência sinal, o gene estrutural e o terminador.

termo derivado quando usado em ligação com as novas sequências de DNA pretende incluir derivados grandes com sequências delimitantes, fragmentos da referida sequência de DNA, mutantes, especialmente mutantes naturais e sequências de DNA que são degeneradas de acordo com o código genético.

Derivados grandes das novas moléculas de DNA recombinante são os removíveis do genoma de A. niger e compreendendo as sequências de DNA mostradas nas Figuras 1 a 3, 5 e 6, tal como pode ser encontrada numa biblioteca genómica de A. niger N400 obtida por fragmentação dos ãcidos nucleicos, tratamento dos fragmentos com uma enzima de restriçaõ adequada , e.g. EcoRI, BamHI ou H i nd 111 , ligação num vector adequado , e.g. o fago lambda e o plasmídeo pBR322, cloragem, e.g. em E. coli e novamente excisão com a mesma enzima de restrição. Tais derivados são e.g. as inserções dos plasmideos pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 e pGW880 mostradas nas Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6.

Fragmentos da sequência de DNA da Fórmula I (Fig.9) são aqueles que se estendem entre sítios de restrição destes plasmideos e mantendo as funções de promotor, sinal , estrutural e terminador.

São fragmentos preferidos os que contêm a sequência do promotor, a sequência sinal, o gene estrutural de uma nova PL ou a sequência do terminador ou qualquer combinação deles.

Os fragmentos da sequência de DNA podem conter adaptadores que proporcionam ligação fácil a

-12outras moléculas de DNA.

A sequência do promotor PL está contida na região do DNA antes do gene estrutural e compreende até cerca de 2000, de preferência até cerca de 1000 a 1400 nuc1eotídeos . Em pGW820 o promotor está situado na sequência entre os sítios de restrição Sall (1240) e PstI(2420). Para a sequência do promotor são importantes as caixas TATAA como sítios de reconhecimento da RNA-polimerase. Em pe 1A a caixa TATAA está situada na posição 1221 (Fig.10), em pelB na posição 951 (Fig.11) e em pelCna posição 1261 (Fig.12).

Os promotores mais curtos desde a vizinhança das caixas TATAA atê ao inicio das sequências sinal são de particular interesse para a expressão não induzida de polipeptideos.

Se for necessária a expressão induzida da pectina as sequências a montante das caixas TATAA são necessárias para regulação da força do promotor. Pode-se ligar a estes fragmentos promotores adequados.

promotor de PLI de A.niger é induzível, i.e., a expressão do gene natural a ele ligado,e.g. o gene estrutural codificador de uma PL ou qualquer gene estranho, é induzida pela adição de pectina ou de produtos de degradação da pectina ao meio. Na ausência de pectina e presença de glucose suficiente o promotor não está operacional. Se não estiverem presentes as sequências reguladoras a montante o promotor torna-se constitutivo.

DNA codificador da sequência sinal estende-se entre o extremo do promotor e o começo da sequência codificadora da protêina madura. Em PLA e PLB a sequência sinal contem cerca de 20 aminoácidos, em pe 1C cerca de 18 aminoácidos. A correspondente região codificadora estende-se em pelA desde o codão ATG na posição 1361 até ao sítio de clivagem PstI a junante na posição 1420, em pelB desde a posição 1134 atê pelo menos à posição 1191 e em pelC

-13desde a posição 1368 até à posição 1422.

Como é evidente a partir das fórmulas I, II e III os genes estruturais de PLA, PLB e PLC contêm vãrios intrões. Também os genes estruturais podem conter adaptadores adequados.

Os terminadores começam com os codões de paragem, e.g. TAA, e podem estender-se até um dos sítios de restrição dentro das referidas sequências. 0 fragmento terminador contem pelo menos 300 pb e pode conter adaptadores adequados.

Adaptadores adequados para os fragmentos atrás têm uma sequência de DNA que se adapta ao sítio de restrição do DNA a que se quer ligar o fragmento.

Eles podem conter um sítio de restrição predeterminado.

Os fragmentos de sequência de DNA do invento incluem também os compostos por fragmentos mais pequenos, e.g. os que contêm o promotor, o promotor e a sequência sinal ou estrutural, a sequência sinal e a estrutural ou o gene estrutural sem os intrões e similares.

Mutantes da sequência de DNA d.Oxin~ vento são e.g. mutantes naturais. 0 invento compreende também mutantes naturais ou sintéticos da sequência sinal com um perfil de hidrofobicidade semelhante ou idêntico, e.g. em que os codões para os aminoácidos polares lisina (K⁶⁺), tirosina (Y^6_) e arginina (R⁶⁺) são trocados por codões para outros aminoácidos tendo cargas semelhantes e os aminoácidos hidrofóbicos alamina (A), leucina (L) e treonina (I) são substituídos por codões para outros aminoácidos hidrofóbicos Por exemplo, o codão para a lisina carregada positivamente pode ser substituído por um codão para a arginina e viceversa, o codão para a tirosina carregada negativamente por

-14um codão para glutamato ou aspartato e/ou o codão para alamina hidrofóbica não polar por qualquer um dos codões para treonina, prolina, valina, isoleucina, leucina, metionina ou fenilalamina e similares. Outras mutações são mutações silenciosas em que um ou alguns nucleotídeos, e.g. até cerca de 30, são substituídos por um ou outros nucleotídeos, em que os novos codões codificam o(s) mesmo(s) aminoâcido(s).

Sequências de DNA do invento que são degeneradas são, tal como as mutações silenciosas, tais que a degenerescência está dentro do significado do código genético em que um número ilimitado de nucleotídeos são substituídos por outros nucleotídeos sem alteração da sequência de aminoácidos que eles codificam. Tais sequências de DNA degeneradas podem ser úteis devido aos seus diferentes sítios de restrição.

As moléculas de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA do invento ou um seu derivado são especialmente vectores recombinantes, como alternativa designados vectores híbridos, contendo tais sequências de DNA com inserções. Elas são usadas para clonagem em hospedeiros, tais como bactérias, fungos ou células animais. Tais vectores híbridos são derivados de qualquer vector útil no campo da engenharia genética, como sejam fagos, cosmídeos, plasmídeos ou DNA cromossómico, tais como derivados do fago A ,e.g. NM 989, ou do fago M13, e.g. DNA do fago M13mp8 (ref.15) linearizado por digestão com BamHI, plasmídeos bacterianos, e.g. pBR 322, pUN121, pUC18 ou plasmídeos de levedura, e.g. plasmídeo 2 μ de levedura ou também DNA cromossómico, derivado e.g. de Aspergillus, e.g.

A. niger, por exemplo os descritos em EP 184 438 ou fagos defectivos ou plasmídeos defectivos na presença de um fago auxiliar ou um plasmídeo auxiliar permitindo a replicação dos referidos fagos defectivos ou plasmídeos, e.g. vector M13(+)KS na presença de e.g. fago auxiliar M13K07.

-15Um vector híbrido do invento contem, além das sequências de DNA do invento ou um seu derivado, um sítio de replicação e facultativamente, dependendo do tipo do derivado de DNA, uma sequência de controle da expressão, como seja uma sequência potenciadora, sítio de activação a montante, um promotor e sequência sinal e/ou um gene estrutural diferente das correspondentes sequências derivadas de A. niger presentes. Tal sequência potenciadora pode ser derivada do DNA ribossonal extracromossómico de Physarum polycepha1 um (PCT/EP 8500278) ou pode ser o sítio de activação a montante do gene da fosfatase ácida PH05 (EP Appl. No. 86 111 820.6) ou Ο PH05, trp, híbrido PH05-GAPDH (EP Appl. Ns 86 111 820.6) ou o promotor similar.

Genes estruturais ligados ao presente promotor, sequências sinal e/ou terminador são, além das codificadoras das pectina-1iases PLA, PLB, PLC, PLE e PLF com ou sem intrões, também outros genes de pectina-1iases homólogos, e.g. o gene PLD (ou PLI) ou outros genes de Aspergillus e genes estruturais heterólogos derivados de vírus, células procarióticas ou células eucarióticas e que podem ser derivados de DNA genómico ou de cDNA preparado pela via do mRNA ou podem ser obtidos por síntese química, codificadores de uma grande variedade de polipeptídeos úteis incluindo polipeptideos g1icosi1ados, em particular de eucariotas superiores, especialmente de mamíferos, como seja de origem animal ou especialmente humanos, como sejam enzimas que podem ser usadas, por exemplo, na produção de nutrientes e na efectuação de reacções enzimaticas em química ou po1ipeptideos, os quais são úteis e importantes no tratamento de doenças de humanos e de animais ou na sua prevenção, por exemplo hormonas, polipeptideos com propriedades imunomodu1 adoras, anti-virais e anti-tumorais, anticorpos, antigênios virais, vacinas, factores de coagulação, alimentos e similares.

-16São exemplos de tais genes estruturais heterólogos e.g. os codificadores de hormonas tais como secretina, tirrosina, relaxina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiróide, adrenocorticotropina, hormona estimuladora de melanócitos, B-lipotrópina, urogastrina ou insulina, factores de crescimento, tais como o factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento tipo insulina (IGF), e.g. IGF-I e IGF-II, factor de crescimento de mastócitos factor de crescimento das células nervosas, factor de crescimento das células nervosas derivado da glia ou factor de crescimento transformante (TGF), como seja TGF B, hormonas de crescimento, tais como hormonas de crescimento humana e bovina, interleuquina, como seja interleuquina 1 ou 2, factor inibidor da migração de macrófagos (MIF) humano, interferões, como seja interferão humano, por exemplo i nterf erão-A , Β , <xD ou<\F, interferão B, interferãoΎou um interferão híbrido, por exemplo um interferão híbrido oáA-^d outxB-o<D, especialmente o interferão híbrido BDBB, inibidores de proteinases tais como antitripsinacs, SLPI e similares, antigénios do vírus da hepatite, como seja antigénio da superfície ou do nucleóide do vírus da hepatite B ou antigénio do vírus da hepatite A ou antigénio da hepatite não A-não B, activadores do plasminogénio, tais como activador do plasminogénio tipo tecido ou uroquinase, factor de necrose tumoral, somatostatina, remina, B-endorfina, imunoglobulina, como sejam as cadeias leve e/ou pesada da imunoglobulina D, E ou G ou imunog1obu 1 inas híbridas humano-ratinho, factores de ligação à imunoglobulina, tais como factor de ligação à imunoglobulina E, calcitonina, peptideo relacionado com a calcitonina humana, factores de coagulação do sangue, tais como factor IX ou VIIIc, eritropoíetina, eglina, como seja eglina C, hirudina, dessulfatohirudina, como seja variante da dessulfato-hirudina HV1,

HV2 ou PA, superóxido-dismutase humana, timidina-cinase virai, Β-1 actamase, g1ucose-isomerase. São preferidos os genes codificadores de um interferão humano ou de um inter-

-17ferão humano ou de um interferão híbrido, activador do plasminogénio tipo tecido (t-PA) humano, antigênio de superfície do vírus da hepatite B (HBVsAg), factor de crescimento tipo insulina I e II, eglina C e dessu1fato-hirudina, e.g. variante HV1. Nos vectores híbridos do presente invento, o presente promotor e/Ou sequência sinal é opera cionalmente ligado à região codificadora do polipeptideo de modo a asasgurar expressão eficaz do polipeptideo.

As moléculas de DNA do presente invento podem conter marcas selectivas dependendo do hospedeiro que se pretende transformar, seleccionar e cionar.

Pode ser usada qualquer marca genética que facilite a selecção dos transformantes devido à expressão fenótipica da marca. São particularmente adequadas as marcas que expressam resistência a antibióticos, e.g. contra tetraciclina ou ampicilina ou no caso de mutantes de levedura auxotróficos, genes que complementem lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exeriplo, resistência ao antibiótico ciclo-heximida ou proporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotrófico, por exemplo o gene ura3, leu2, h i s3 ou trp1. E também possível empregar como marcas genes estruturais que estejam associados a um segmento de replicação autónoma desde que o hospedeiro a ser transformado seja auxotrófico para o produto expresso pela marca.

São de particular importância os genes marcadores que complementem lesões do hospedeiro A. niger, como seja o gene argB codificador da ormitina carbamoi1-transferase, e.g. derivado de A. n i ger ou de A. nidu1ans (EP 184 438), ou fragmentos de DNA de A. nidu1ans homólogos do gene pyr4 de N. crassa (26).

As execuções preferidas do presente invento são vectores híbridos em que o gene estrutural, especialmente o gene estrutural heterólogo está operacionalmente ligado do promotor e sequências sinal do presente invento. Tal vector híbrido preferido é e.g. pUC19/pelA-IFN AM119. Um outro destes vectores híbridos preferidos é e.g. M1 3(+ )KS/pe1 A-1FN AM119.

As moléculas de DNA do invento e seus derivados, incluindo fragmentos podem ser usadas no despiste de bancos de genes de DNA ou mRNA relativamente a outros DNAs ou mRNAs semelhantes.

Processo para a preparação de moléculas de DNA recombinante invento diz respeito também a um processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante codificadora de um sistema de expressão da pectina-liase PLA, PLB, PLC, PLE e PLF ou um seu derivado, caracterizando-se pela cultura de um hospedeiro transformado com uma molécula de DNA contendo uma sequência codificadora do sistema de expressão da pectina-1iase ou um seu derivado e isolamento da molécula de DNA recombinante pretendida ou seu derivado ou sua preparação por uma síntese in vitro.

A cultura dos hospedeiros é efectuada num meio nutritivo convencional que pode ser suplementado ou desprovido de compostos químicos permitindo a selecção negativa ou positiva dos transformantes, i.e. tais hospedeiros contendo a molécula de DNA pretendida juntamente com uma marca de selecção, dos não transformantes, i.e. hospedeiros que não possuem a molécula de DNA pretendida.

Podem ser usadas quaisquer hospedeiros transformáveis úteis no campo, e.g. bactérias, tais como E.coli, fungos tais como Saccharomyces cerevisiae ou

-ZQ-

em paritculas fungos filamentosos, tais como Aspergi Ilus, e.g. A. n i du1ans , A. oryzae, A.carbonarius e especialmente A. niger. Um hospedeiro é A.niger An8, um novo mutante sem o gene pyrA, como descrito abaixo. A transformação dos hos pedeiros é efectuada por métodos convencionais.

A sequência de DNA codificadora do sistema de expressão PL ê obtida a partir de um fungo filamentoso contendo tal sistema, em particular a partir de uma biblioteca genómica ou também via mRNA.

Segue-se a preparação dos presentes sistemas de expressão PL numa forma mais detalhada.

Uma biblioteca genómica pode ser preparada e.g. por digestão parcial do DNA genómico de uma estirpe de A, n i ger, e.g. N756 ou N400 com e.g. Sau3AI ou Mbol, e clonagem dos fragmentos de DNA de alto peso molecular um vector adequado para o hospedeiro, e.g. o plasmídeo pUN121 de E. coli ou um vector lambda, e.g. EMBL4.

Qualquer outra estirpe de A.niger produtora das PLs pretendidas pode servir como fonte para a biblioteca genómica e igualmente outros vectores adequados podem ser usados como recipientes para os fragmentos.

Para se fazer um despiste com sucesso da biblioteca genómica no que respeita âs sequências de DNA codificadoras de PLs é necessária uma sonda DNA hibridante. Esta pode ser uma sonda de DNA sintético se a sequência da PL pretendida fôr conhecida ou pode ser de um gene PL conhecido ou de partes dele. A primeira abordagem foi usada para encontrar o gene PLI como descrito em EP 88 101 397.3. A segunda abordagem foi usada no presente invento. Uma vez que a sequência de DNA total do gene PLI ficou disponível tanto sondas de DNA contendo todo o gene

ou qualquer parte dele tendo pelo menos 14 pb pode agora ser usado para despiste, o qual inclui também o despiste de mRNA codificador do sistema PL.

Para fins de despiste as sondas de

DNA são marcadas radioactivamente no extremo 5' por métov ^{3 2} dos conhecidos usando ι P-ATP e T4-cinase. Os microorganismos hospedeiros portadores dos ácidos nucleicos do presente invento como inserção, são identificados por hibridação com a sonda de DNA marcada em réplicas de filtro da bi blioteca de genes .

Os clones mostrando uma resposta de hibridição a uma ou mais sondas de DNA são isoladas e amplifiçadas.

As condições de hibridição usadas podem ser mais ou menos restrictivas , e.g. simplesmente escoltando temperaturas diferentes e em combinação com a utilização de sondas de DNA diferentes derivadas do gene PLI (ou PLD), e.g. por medição das várias respostas de hibridição a um fragmento completo BamHI/PstI de 1,6 Kpb, ao fragmento BamHI/Xhol de 649 pb(o fragmento do extremo N) e o fragmento Xhol/PstI de 244 pb (o fragmento do extremo C) de pCG3B11 ou pGN840 (Fig.4), os clones podem ser divididos em classes diferentes com base no seu grau de homologia (Tabelas II ou IV). Cinco vectores/ (X-PL113,X -PL122, X-PL109, X-PL1O2 e X-PL116) foram finalmente identificados, cortados com enzimas de restrição e subclon dos seus genes pel preparados em pBR322 conduzindo aos plasmídeos pGW820, PGW830, pGW850, pGW860 e pGW880 (Figs.1 a 3, 5 e 6). Os cinco genes destes clones foram designados pelA, pe IB, pe IC, pelE e pelF respectivamente.

Os genes podem ser sequenciados. Sequências completas de pelA, pelB e pel C estão representadas pelas Fórmulas I, II e III (Figs. 10, 11 e 12).

Uma pesquisa por computador de sequências consensus de junções de splicing exão/intrão assim como de sequências internas de intrões (Boel E. et al. (24) e Mount S.M. (25) ) conduz à hipótese, tal como em peID, da presença de quatro intrões em pelA e pe1B (Fig. 10 e 11) e dos três intrões em pelC (Figura 12).

Os plasmideos pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 e pGW880 foram usados para preparar outras moléculas de DNA recombinante do invento. Tais outras moléculas de DNA são preparadas de modo convencional aplicando enzimas de restrição, adaptadores e processos convencionais de ligação amplificação e isolamento.

Por exemplo o plasmideo pGW820 foi cortado com HindIII. 0 fragmento HindIII de 3,9 Kpb foi subclonado no sítio HindIII do pBR322. 0 fragmento BamHI-HindlII de 3,3 Kpb do plasmideo obtido pGW822 contendo o gene pe1A foi clonado no Êitio BamHI e HindIII do vector pUC19 para dar um vector chamado pUC19/pelA. Um gene estrutural de pe1A foi removido por digestão com Sall e PstI.

Ao restante fragmento contendo o promotor pelA, sequências sinal e terminadoras ligou-se entre a sequência sinal e terminador um gene codificador do interferão híbrido BDBB por meio de um adaptador adequado. 0 plasmideo obtido foi designado pUC19/pelA-IFN AM119 (Fig. 11) e contem o promotor e sequência sinal de pelA, o gene do IFN BDBB e o terminador de pelA ligado ao fragmento HindlII-BamHI de pUC19.

Este plasmideo foi cotransformado com pCG59D7 no mutante An8 de A.niger auxotrófico para uridina (DSM 3917). Os transformantes foram seleccionados em meio mínimo contendo arginina e Bacto-Agar e analizados quanto à expressão de

interferão.

Numa outra execução do invento a sequência sinal de pelA pode ser eliminada. 0 plasmídeo obtido foi designado M13(+)KS/pelA ss-IFN AM119 e contem a sequência do promotor de pelA , o gene do IFN BDBB e o terminador de pelA ligado ao fragmento HindlII-BamHI do vector Bluescrip M13(+)KS. Este plasmídeo foi cotransformado com pCG59D7 no mutante An8 de A.niger (DSM 3917) auxotrófico para uridina. Os transformantes foram seleccionados em meio nGnimo contendo arginina e Bacto-Agar e analisados quanto à expressão de interferão.

Mutantes contendo novos sítios de restrição podem ser preparados por exemplo in vitro por mutagénese dirigida, de acordo com métodos convencionais /ver artigo de revisão de M.J. Zoller e M. Smith, Methods

Enzymol. 100, 468(1983), D. Botstein e D. Sortle, Science 229, 1 193 ( 1985 ) ou K. Norris et a I. , Nucl. Acids Res. 11 , 5103 (1983)7Para taxas de expressão mais elevadas, qualquer sequência terminadora eucariótica pode ser ligada ao extremo do gene estrutural.

As bactérias foram transformadas por um método convencional e os transformantes identificados pela sua resistência, e.g. contra a tetracic1ina.

Em particular os vectores de expressão descritos foram amplificados em estirpes hospedeiras de E. col i adequadas, como seja HB101 , transformados e seleccionados por métodos conhecidos. 0 DNA do plasmídeo amplificado foi isolado da bactéria por meios convencionais, em particular como descrito por Birnboim & Doly (23).

De modo semelhante podem ser construídos outros plasmideos com outros genes homólogos ou heteró1ogos.

As moléculas de DNA do presente invento podem também ser preparadas por uma síntese in vitro de acordo com os métodos convencionais. A síntese in vitro é especialmente aplicável na preparação de fragmentos mais pequenos do sistema de expressão PL, e.g. das sequências de DNA codificadoras do promotor ou da sequência sinal dos PLs ou seus mutantes.

As moléculas de DNA do invento compreendendo um promotor PL e facultativamente uma sequência sinal PL, um gene estrutural PL, qualquer outro gene estrutural heterólogo e/ou um terminador de PL podem também ser usadas para transformar fungos filamentosos, tais como Asperg i11us, Pen i c i11i um ou Cephalosporium , e.g. A . n i du 1 ans , A. oryza1, A. carbonarius, A. awanori e especialmente A. niger.

Para permitir a selecção dos fungos transformados de entre os não transformados, as moléculas de DNA do invento são portadoras de uma marca selectiva ou, como alternativa, os fungos são cotransformados com um segundo vector contendo tal marca. Tal como noutros sistemas tal marca selectiva é um gene estrutural expressãvel, o polipeptideo expressa a partir dele (uma enzima) proporciona resistência contra compostos tóxicos para o transformante ou completa o sistema enzimático de um mutante sem tal polipeptideo essencial. Tais genes marcadores são por exemplo os genes conhecidos ga-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS ou argB.

Como descrito em EP 88 101 397-3 um novo gene marcador, designado pyrA, foi isolado a partir da biblioteca genómica de A. niger, o qual estã relacionado e tem funções semelhantes a pyrG de A. n i du 1 ans e pyr4 e FÇ crassa, nomeadamente produzindo a enzima orotidina 5'-fosfato-descarboxilase. Esta sequência catalisa a descarboxi1 ação de orotidina 5'-fosfato para ãcido uridilico (uridina 5'-fosfato) e também de ácido f1uoro-orótico para o produto tóxico f 1 uoro-uri di na . Um clone de j[. co 1 i contendo o gene pyrA foi identificado por hibridação com o fragmento H i nd 111 de 1,1 kb, do pJDB2 (24) contendo parte do gene pyr4, no entanto pode ser usado o DNA de qualquer outro gene pyr codificador de orotidina-5*-fosfato-descarboxilase. A partir de um clone positivo designado £. coli B75 1 83/pCG59D7 , foi isolado o plasmídeo pCG59D7, compreendendo o gene pyrA, e usado para cotrnasformação de um mutante A. niger pyrA”. Tal mutante pyrA” ê defectivo no gene da orotidina-5¹-fosfato-descarboxilase e portanto incapaz de produzir a correspondente enzima. Tal mutação foi preparado por tratamento de conidiosporos de A. niger N756 com irradiação UV mutagenizante e as colónias que sobrevivem na presença do ácido f1uoro-orótico e uridina foram seleccionadas. As colónias que sobreviveram na presença de ácido fluoro-orótico e uridina foram seleccionadas.

As colónias que sobreviveram na presença de ácido fluororótico e ausência de uridina foram eliminadas. Os restantes mutantes necessitados de uridina, de acordo com a sua capacidade de serem transformados, pertecem a dois grupos de complementação pyrA e pyrB, representados pelos mutantes An8 e An10, respectivamente. Eles foram tratados na sua forma de protoplastos, em condições de transformação com o plasmídeo pCG59D7 contendo pyrA. Apenas as colónias An8 foram transformadas e possuem o gene pyrA conforme evidenciado pela capacidade de hibridação do seu DNA digerido com DNA de pUN121.

invento diz respeito a hospedeiros transformados com os vectores híbridos do invento e métodos para a sua produção. Tais transformantes são por exem pio bactérias, tais como £. coli, de fungos fi1amentoses, tais como Asperg i11us , Penici11ium ou Caphalosporium e em particular A. n i du1ans, A. oryzae , A. carbonarius , A. an i amori ou de preferência A. niger, e.g. A. niger An8. 0 invento diz também respeito a um método para a preparação de tais transformantes compreendendo tratamento de um hospedeiro em condições transformantes com uma molécula de DNA recombinante, especialmente um vector híbrido do invento facultativamente juntamente com uma marca selectiva e selecção dos transformantes.

invento também diz respeito à utilização dos DNAs recombinantes ou de um seu derivado para a preparação de vectores híbridos que expressam polipeptídeos híbridos homólogos ou heterólogos. Foram aqui dados exemplos de genes codificadores de tais polipeptídeos úteis.

invento diz ainda respeito a um método para a preparação de po1ipeptídeos caracterizado por um vector híbrido do invento ser expresso num hospedeiro ade quado. Quando necessário o polipeptídeo é isolado de modo convencional. Dependendo da construção do vector os produtos são expressos, ou se estiver presente numa sequência sinal, são expressos e secretados.

Este método compreende a produção de proteínas homólogos ou heterólogos úteis num hospedeiro adequado, e.g. de Asparagi11us, através de cultura de um hos pedeiro transformado com um vector híbrido de expressão. Foram aqui dados exemplos de genes codificadores de tais proteínas.

E agora também possível produzir individualmente os polipeptideos PLA, PLB, PLC, PLD, PLE ou PLF, o que significa na forma pura e sem contaminação com qualquer outro Pl, sendo possível para tal aplicar vários métodos E.g. um método para a produção de um único polipeptídeo seleccionado do grupo constituido por PLA, PLB, PLC, PLD, PLE e PLF ê caracterizado por um hospedeiro que não ê capaz de expressar qualquer pectina-1iase PL ser transformado com DNA de um vector de expressão expresando o produto de PLA, PLB, PLC, PLD, PLE ou PLF.

Um hospedeiro não capaz de expressar qualquer pactina liase PL pode ser um microoorganismo não tendo gene correspondente, e.g. uma estirpe PL~ de Aspergi11us, um outro fungo sem ser Aspergi 11us ou qualquer outro microorganismo eucariótico ou procariótico ou uma estirpe de Aspergillus cuja produção de PLs é suprimida por meio de crescimento adequadamente condicionado. Por exemplo, um único gene PL pode ser expresso sob controle do promotor da g1ucoami1 ase em A. niger ou A. awamori, sob o controle do promotor PH05 em S. cerevisiase ou sob controle de um promotor PL numa estirpe PL“ de A. niger.

Descrição breve das Figuras

Figura 1	mostra o mapa de	restrição	de	pGW820	contendo
o gene	pelA
Figura 2	mostra	o mapa de	restrição	de	pGW830	contendo
	o gene	pelB
Figura 3	mostra	o mapa de	restrição	de	pGW850	contendo
	o gene	pe 1C
Figura 4	mostra	o mapa de	restrição	de	pGW840	contendo
	o gene	pe 1D
Figura 5	mostra	o mapa de	restrição	de	pGW880	contendo
	o gene	pelE

A Figura 6 mostra o mapa de restrição de pGW860 contendo o gene pe1F

A Figura 7 mostra a estratégia de sequenciação para o gene pelA

A Figura 8 mostra a estratégia de sequeciação para o gene pel B

A Figura 9 mostra a estratégia de sequenciação para o gene pelC

A Figura 10 mostra a sequência da molécula de DNA pe 1A, tendo a Fórmula I contendo o gene codificador de PLA

A Figura 11 mostra a sequência da molécula de DNA pelB, tendo a Fórmula II, contendo o gene codificador de PLB

A Figura 12 mostra a sequência da molécula de DNA pelC, tendo a Fórmula III, contendo o gene codificador de PLC

A Figura 13 mostra a homologia ao nível da sequência de aminoácidos entre PLD, PLA e PLC

A Figura 14 mostra a construção do vector pUC19/pelA-IFN

AM119, contendo o gene codificador do interferão híbrido BDBB

A Figura 15 mostra a cadeia não codificadora de parte de fusão pelA-IFN no plasmídeo pelA-ΙFN AM119 com a sequência sinal extndida alinhada com o oligonucleotídeo iniciador usado na mutagénese por deleção da sequência sinal pelA

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar a Invento, no entanto não pretendem de modo algum ser restrictivos dele.

As abreviaturas têm os seguintes significados:

Amp ampicilina

ATP trifosfato de adenosina

BSA albumina do soro bovina

CIP fosfatase alcalina de intestino de vitela

DNA ácido desoxirribonucleico

DTT 1 ,4-ditiotreitol

EDTA sal disódico do ácido etilenodiaminatetracético EGTA ácido bis-(aminoeti1)-glico1eter)N,N,N¹,N'-tetracético Kpb quilopares de bases

LMP ponto de fusão baixo mOsm miliosmoles

PEG polietilenoglicol

RNA ácido ribonucleico rpm rotações por minuto

SDS dodeci1su1fato de sódio

Tc tetraciclina

Tris tris(hidroximetil)-aminometano

U unidades

V vo 11

Tampões, meios,	reagentes:
HHA B/g	tampão 10χ para enzimas de restrição usado para digestões com BamHI, BglII, HindIII Mbol, PstI e Xhol, contendo 60 mM Tris-HC1 (pH 7,4), 60 mM ^-mrecaptoetano1, 60 mM MgCl₂, 500 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,1% gelatina
tampão EcoRI	tampão 5χ para enzimas de restrição usado para digestões com EcoRI, contendo 500 mM Tris-HCl (pH 7,2), 25 mM MgCly 250 mM NaCl, 0,05% BSA, 0,05% gelatina
IPTG	100 mM isoprofi1-B-tio-galactopiranosido (23,8 mg/ml) em âgua
meio LC	1% peptona tripticase (BBL), 0,5% extracto de levedura (BBL), 0,8% NaCl, 1 ml Tris- -HC1 pH 7,5 por litro
meio mínimo	1,05% K₂HP0₄, 0,45 KH₂P0₄, 0,1% (NH₄)₂S0_4>0,05% de citrato de sódio. 2H₂0 para E. coli, 1 mM MgS0₄, 1 mM tiamina-HCl, 0,2% de glucose
meio 2XTY	por litro 16 g de tripticase peptona (BBL), 10 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl
tampão TBE	1 litro contem 10,8 g Tris, 5,5g ácido bórico, 4 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0)
tampão TE	10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)
tampão TE baixo	10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA (pH 8,0)

X-gal 2% (5-bromo-4-cloro-3-indoli1-^-ga1actosido) em dimetilformamida

SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M citrato de sódio meio mínimo 1 litro contem 1,5 g KH₂P0₄, 0,5 g KC1, 0,5g para A. niger MgS0₄. 7H₂0, 4,0 g NA^Cl, 10,0 g glucose, pequenas quantidades de FeSO^, MnSO^, ZnCl₂, ajustado a pH 5,5 com NaOH meio completo para A. niger solução de vitaminas meio mínimo mais 0,2% tripticase peptona (BBL) 0,1% casaminoácidos (Difco), 0,1% extracto de levedura (BBL), 0,05% do sal sódio de ácido ribonucleico de levedura (ICN, Cleveland, USA), 2 ml de solução de vitaminas por litro por 100 ml 10 mg de tiamina, 100 mg de riboflavina, 10 mg de ácido pantoténico, 2 mg de biotina, 10 mg de ácido p-aminobenzôico, 100 mg de nicotinamida, 50 mg piridoxina-HC1

Para as placas todos os meios foram solidificados pela adição de 1,5% de agar (BBL), para topagar(ose) usou-se 0,7% de agar (BBL) ou agarose (Seakem).

PBS	por litro 0,37 g NaH₂P0₄, 2,7 g Na₂HP0_4> 8,5 g NaCl
PSB	10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 0,05% de gelatina
LDB	10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂

-32> t

Usaram-se as seguintes estirpes:

A. niger	tipo selvagem N400
A. niger N593	cspA, pyrA

A. niger N756 seleccionada para elevada produção de en-

	zimas do complexo pectinase
A. niger AN8	DSM 3917, muiaite de A. niger N756 auxotrófico para uridina
E.coli NM539	metB, supE, hsdM⁺, hsdR”, supF, (P2cox3)
E.coli MH 1	ara D139, Λ 1acX74, galU, galK, hsr“, hsm⁺, strA,
E.coli JM103	lac-pro, thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR4, F¹, traD36, proAB, laclq, Z M15
E.coli JM109	(lac-proAB), recAl, endAl, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relAl , Λ. /~F, traD36, proAB, lacl^, ΖΔ157
E.coli CJ236	(dut-1, ung-1, thi-1, relA-1 ; pCJ105(Cm^r); Kit de mutagénese in vitro Muta-Gene M13 BIO-RAD)
E.coli MV1190	/~Δ( lac-proAB), thi, supE, £\(srl-recA)306: :Tn10(tet^r) (F¹ :traD36, proAB, lac 1^ΖΔΜ15)7. A estirpe MV1190 estã descrita no manual para o Kit de mutagénese in vitro MUTA-GENE M13 BIO-RAD.

-33Usaram-se os seguintes vectores:

EMBL4

EMBL4 ê um vector de substituição de lambda com uma capacidade de clonagem de 9-23 kpb (Frischauf et al., ref. 2). Ele contem uma região de clonagem múltipla entre os braços de lambda e a região não essencial. Isto permite efectuar digestões com múltpilas enzimas de restrição de modo que a religação da região não essencial aos braços do vector seja reduzida quando o DNA estranho de interesse é inserido. 0 vector também utiliza o fenótipo Spi para propocionar uma selecção directa dos recombinantes (Zissler et a 1., ref.20).

pC63B11

Este plasmideo foi descrito no Pedido de Patente Europeia 88 101 397.3, ele contem o gene pe1D (PLI) de A, niger N756 cíonado no pBR322.

pPL29-5

Este plasmideo foi descrito no Pedido de Patente Europeia 88 101 397.3, ele contem o fragmento EcoRI N-terminal do gene pe1D (PLI).

PPL35-5

Este plasmideo foi descrito no Pedido de Patente Europeia 88 101 397.3, ele possui o fragmento EcoRI C-terminal do gene pelD (PLI).

pBR322 plasmideo pBR322 é portador de

-34genes para a resistência aos antibióticos ampicilina (amp^r) e tetraciclina (tet^r). 0 plasmídeo ê portador de vários sítios de clonagem únicos, dos quais alguns estão situados no gene amp ou tet de modo que a inserção do DNA clonado conduz a bactérias sensivéis ao antibiótico.

PEMBL18 e pEMBL19

Estes plasmídeos foram descritos por Dente et al., (refs. 7,8).

pGW61 3

Este plasmídeo foi descrito por

Goosem et a 1 (ref. 12).

Fago M13mp

Os vectores M13mp18 e M13mp19 (Norrander et a 1., ref.21) são derivados do DNA bacteriofãgico de cadeia simples M13 e são destinados a facilitar a sequênciação de DNA permitindo a clonagem dos fragmentos de DNA num sítio poliadaptador versátil e a clonagem do mesmo fragmento de restrição em ambas as orientações possíveis. As sequências clonadas nestes vectores podem ser fácilmente usadas como moldes para as reacções de sequênciação ou para a produção de sondas de cadeia simples usando o iniciador oligonucleotídico convencional e o fragmento Klenow da DNA-polimerase I de E.coli. 0 DNA vector é portador do promotor do operão lac de E.coli e da informação genética para os primeiros 145 aminoácidos da ^-ga1actosidaose. As sequências do poliadaptador contendo múltiplos sítios de restrição são inseridas na sequência lac7. 0 po1iadaptador mantém a grelha de leitura lacZ e o vector dá complementação alélica de uma estirpe hospedeira LacZo<, dando placas azuis em placas contendo IPTG e X-gal. Os fagos recombinantes

-35contendo inserções que destroem a grelha de leitura ou que de outro modo interferem com a expressão do peptídeo lacZ são reveladas como placas incolores.

PCG59D7

Este plasmideo está descrito em EP 88 101 397.3 e pode ser obtido a partir de E.coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968). 0 plasmideo compreende o gene pyrA e ê usado na cotransformação de mutantes A,niger pyrA~.

M13(+)KS (Bluescript) (STRATAGENE, San Diego, CA, USA)

Vector de dsDNA, compreendendo a origem de replicação do fago M13. Na presença de um fago auxiliar, e.g. M13K07 (ref.29) ou R408 (ref.9), a cadeia (+)- do vector é replicada, eucapsidada e mandada para o meio.

M13 K07

Fago M13 auxiliar para M13(+)KS. Descrito em Mead et al. (ref.29)

R408

Fago M13 auxiliar para M13(+)KS. Descrito em Russell et al. (ref.9).

Exemplo 1: Construção de uma biblioteca genómica de Aspergillus niger

Exemplo 1.1: Isolamento de DNA de alto peso molecular a partir de A.niger

L—-

-36Conidiôsporos de Aspergillus niger estirpe N400 foram inoculados em 200 ml de meio mínimo para uma densidade final de esporos de 10θ esporos/ml e agitados em Erlenmeyrs de 1 1 durante 24 h a 28°C a 300 rpm usando um agitador rotativo New Brunswick. Colheu-se o micélio por filtração usando um funil Biíchner com Myracloth, lavou-se com soro fisiológico estéril e frio, congelou-se em azoto líquido e guardou-se a -60°C ou usou-se directamente. 0 método usado para isolamento de DNA para preparar a biblioteca genómica baseou-se no processo descrito por Yelton et al. (ref.1). 0 rendimento de DNA é de cerca de 50-100 ug/g de micélio com este método.

Para a construção da biblioteca 10 g de micélio foi triturado em azoto líquido em porções de 1 g num micro-desintrgador Braun. 0 micélio triturado foi transferido para um erlenmeyer esterilizado de 1 litro, contendo 200 ml de tampão de extracção (50 mM EDTA pH 8,5, 0,2%

SDS) e 200 pi de dieti1fisocarbonato. A mistura foi lentamente aquecida até à temperatura ambiente e depois aquecida durante 20 min. até 68°C com agitação ocasional. A suspensão foi arrefecida até à temperatura ambiente e centrifugada durante 15 min. a 12000 x g. Ao sobrenadante adicionou-se 1/16 do volume de uma solução de acetato de potássio 8M pH 4,2 e a mistura foi deixada em gelo durante 1 h. Removeu-se o precipitado por centrifuração (20 min.; 16000 x g; 4°C). Os ãcidos nucleicos foram precipitados do sobrenadante por uma incubação com 0,6 volumes de isopropanol em gelo durante 15 min.. 0 sedimento foi colhido por centrifugação (10 min.; 6000 xg; 4°C), lavado com etanol a 70% e seco rãpidamente. Ressuspendeu-se o sedimento em 10 ml de TE contendo 20 yug/ml de RNase A, (Boehringer, Mannheim) e incubou-se durante 15 min. a 37°C. 0 DNA foi tratado com pronase sem contaminação com nucleases (1 mg/ml concentração final) (Kochlight, Coinbrook) durante 1 h a 37°C. A solução stock da pronase em tampão TE contem 20 mg/ml de enzima que foi

-37incubada durante 1 h a 37°C para dirigir as nucleases.

Dissolveu-se 8,5g de CsCl em 9 ml de solução de DNA, adicionou-se 0,2 ml de brometo de etídio a 10 mg/ml e esta solução foi centrifugada num rotor Beckman SW41 durante 60 h a 33 000 rpm ou num rotor Beckman 50Ti com tubos quickseal durante 40 h a 45 000 rpm. Colheu-se a banda de DNA furando a parede lateral do tubo. Removeu-se o brometo de etídio por múltiplas extracções com água e isopropenol saturado com NaCl. Adicionou-se 5 volumes de TE, o DNA foi extraído com fenol saturado com TE, fenol/clorofórmio/álcool isoamílico 25:24:1 e clorofórmio/ãlcool isoamílico 24:1. 0 DNA foi precipitado pela adição de 0,1 volumes de acetato de sódio 3M pH 5,2, 2,5 volumes de etanol e uma incubação durante a noite a -20°C. 0 precipitado foi colhido por centrifugação (1 h; 30 000 xg; 4°C) lavado com etanol a 70%, seco e dissolvido em 400 μΐ de TE baixo.

Exemplo 1.2: Digestão parcial de DNA de A.niger com Mbol e isolamento dos fragmentos

Para testar a concentração de Mbol que dá a maior quantidade de fragmentos entre 13,6 e 23 Kbp, porções de 1 ug de DNA de A.niger foram digeridas no tampão adequado com quantidades decrescentes de Mbol (0,5-0,001 U) durante 1 h a 37°C num volume de 10 μΐ. Parou-se a reacção através da adição de 1 jjl de 0,25 M EDTA e as amostras foram aplicadas num gel de 0,6% de agarose em TBE, contendo 1 pg/m de brometo de etídio. São marcas adequadas uma mistura de DNA de lambda e DNA de lambda digerido com BglII, que dá bandas de 49, 22,8, 13,6, 9,8, 2,3 Kpb e um fragmento não visivel de 0,45 Kpb. A concentração de Mbol, necessária para dar uma produção elevada dos fragmentos pretendidos de 13,6-23 pb é 0,02 U/pg DNA. Assim, 200 ^jg de DNA num volume total de 2 ml foram digeridos e divididos em 20 fracções do mesmo tamanho imediatamente após adição da enzima. Após

-381 h a 37°C os produtos da digestão foram colocados em gelo e uma amostra de 1 pg foi corrida num gel para tratar a digestão correcta. Quando de um resultado positivo adicionou-se EDTA para uma concentração final de 25 mM para parar a reacção , a enzima ê inactivada pelo calor a 65°C durante 10 min., as amostras foram reunidas e o DNA foi precipitado, lavado, seco e dissolvido em 400 pl de TE.

DNA fragmentado foi separado durante a noite num gel preparativo de 0,4% de agarose (poço central 120x1,5 mm). 0 DNA de lambda digerido com BglII foi usado como marca para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA parcialmente digeridos quando da e1ectroforese a 4°C e 40 V (3 V/cm). A região do gel contendo fragmentos do tamanho correcto foi removida do gel e o DNA electrocluido do gel num tubo de diãlise estéril em 2 ml de TBE durante

2-3 horas a 100 V. A corrente foi invertida durante 30 seg. e o tampão contendo o DNA foi colhido. Os fragmentos foram então concentrados por precipitação com etanol e dissolvidos em 100 ul de TE baixo.

Exemp 1 1.3: Preparação de DNA vector e clonagem de fragmentos de DNA de alto peso molecular de A.niger em EMBL 4

A biblioteca genómica de A.niger estirpe N400 foi construida no vector lambda EMBL4. 0 vector que tem uma capacidade de clonagem de 9-23 kpb foi descrito por Frischauf et a 1., (ref.2) e Karn et al., (ref.3) e adquirido à Promega Biotech. Inc. Para evitar duplas inserções derivadas de partes diferentes do genoma usámos um comprimento mínimo de fragmentos de 13,6 Kpb para clonagem.

jjg de DNA de lambda EMBL4 foi digerido totalmente com 50 unidades de BamHI no tampão adequado num volume de 100 pl durante 2 h a 37°C. A enzima

foi inactivada pelo calor durante 10 min a 65°C. A concentração de NaCl foi aumentada para 150 mM e adicionou-se 50 unidades de Sall tendo-se continuado a incubação durante mais 2 horas a 370. Após adição de EDTA para 25 mM e inactivação da enzima (10 min a 65°C) a solução foi extraída com iguais volumes de fenol (saturado com TE), fenol/clorofórmio/á1 coo 1 isoamílico 25:24:1, clorofórmio/álcool isoamílico. Para eliminar os fragmentos pequenos de poliadaptadores BamHI/SalI o DNA foi precipitado com 0,6 volumes de isopropanol após a adição de 0,1 vol de acetato de sódio 3M pH 5,2. Após 15 min em gelo e 15 min de centrifugação a 12 000 xg e 4°C o precipitado foi lavado com etanol a 70%, seco e dissolvido em 40 pl de TE baixo.

Exemplo 1.4: ligação e empacotamento in vitro de fragmentos de DNA genómico de A. niger

E essêncial que os sítios cos do vector preparado de acordo com o exemplo 1.3 sejam emparelhados antes da reacção de ligação. 0 vector em 100 mM Tris-HCl pH 7,5 e 10 mM MgC^ foi aquecido durante 10 min a 65°C e depois emparelhado durante 1 h a 42°C. Dos ensaios de ligação encontrou-se uma proporção de vector para fragmentos de aproximadamente 1:1 (por peso) para dar um máximo de recombinantes.

A ligação decorre em 50 mM Tris HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT e 1 mM ATP, usando 9,5 pg de vector e 10 pg de fragmentos de DNA num volume de 100 jjl. Em seguida adicionou-se DNA ligase (BRL) numa concentração de 0,5U/|jg de DNA e a mistura de ligação foi incubada durante a noite a 14°C. Para testar a ligação uma amostra do DNA ligado correu num gel de agarose. Também uma quantidade de 0,5 pg de vector foi ligada sem a adição dos fragmen-

-40tos num volume de 5 pl.

A mistura de ligação num volume grande foi concentrada por precipitação com etanol e dissolvido em 20 pl de TE baixo antes da encapsidação in vitro.

A encapsidação in vitro foi feita com extractos Promega Packagene de acordo com as instruções do fabricante usando porções de 10 pl para encapsidar 1 pg de DNA. Do lambda CI857 Sam 7 de alto peso molecular, fornecido com os extractos, encapsidou-se 1 pg separadamente para servir de testemunha. Após encapsidação adicionou-se 500 pl de tampão de solução para fagos (PSB) e 5 pl de clorofórmio. Os stocks de fagos recombinantes podem ser guardados a 4°C. A biblioteca obtida foi construída a partir de duas experiências de ligação separadas.

Exemplo 1.5: Titulação e amplificação da biblioteca genómica de A. niger estirpe N400

As células de £. coli NM 539 foram cultivadas em meio LC contendo 0,2% de maltose, 10 mM MgSO^ e 1 mM CaCl₂ até uma densidade óptica (600 nm) de 1,0. Em seguid⁵ amostras de 0,2 ml desta cultura foram adicionados a 0,1 mol de uma série de diluições de fagos em PSB. Após adsorção dos fagos durante 20 min a 37°C , adicionou-se 3 ml de 0,6% de agar de tipo LC a 45°C, a mistura foi semeada em placas de agar LC e estas incubadas durante a roite a 37°C. Os resultados de titulação expressos como o número de unidades formadoras de placas (pfu) por ml de suspensão de fagos foram 13x10$ e 4,2x10$ pfu/ml para os dois stocks de fagos preparados de acordo com o exemplo 1.4. Após subtracção do fundo que foi calculado a partir das ligações testemunha sem fragmentos (17% e 40% respectivamente) o número absoluto de recombinantes foi de 6x10⁵ que é cerca de

-41200 vezes o tamanho do genoma.

Para amplificar a biblioteca, porções de 80 /j1 de ambos os stocks de fagos foram usadas para infectar células £. coli NM 539 nas quais foram semeadas em agarose de topo LC em placas de agar LC e depois incubadas durante a noite a 37°C. Os fagos foram eluidos da agarose por agitação suave das placas com 5 ml de PSB por placa durante 1 h à temperatura ambiente. Colheu-se o PSB, centrifugou-se (10 min a 6000 xg) para remover as bactérias e adicionou-se clorofórmio (0,5% concentração final). Ambos os stocks de fagos, os quais foram amplificados aproximadamente no mesmo grau, foram então misturados (stocks de 40 ml), titulados (8x10^ pfu/ml ) e guardados a 4°C.

Exemplo 2: Despiste da biblioteca genómica de A. niger N400 para o gene da pectina -1iase D (pel D) e isolamento do gene

Exemplo 2.1: Despiste da biblioteca

Para o isolamento do gene peID a partir da biblioteca genómica em lambda obtida como descri4 to no Exemplo 1, 2,5x10 fagos foram misturados com agarose de topo LC liquefeita e semeado em 5 placas de agar LC. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C e arrefecidas durante 2 horas a 4°C. A partir de cada uma das placas fizeram-se 2 réplicas segundo o método de hibridação de pacas de Benton e Davis (ref. 4). 0 primeiro filtro (Sehleicher and Schtill BA85 ou Millipore HATF085 ) foi colocado no topo da placa durante 1 min, a segunda réplica durante dois minutos e a posição das réplicas marcada usando tinta da china.

-42Após remoção dos filtros eles foram colocados numa placa contendo 100 ml de uma solução desnatu ante (1M NaCl, 0,5M NaOH) durante 1 min e durante 1 min em 100 ml de solução renaturante (0,5M Tris/HCl pH 7,6 1,5M NaCl). Em seguida os filtros foram transferidos para uma placa contendo 5xSSC (SSC=0,15M NaCl, citrato de sódio 0.015M pH 7,0). Os filtros foram passados suavemente com uma mão enluvada para remover detr tos bacterianos, transferidos para uma nova placa contendo 3xSSC e agitados suavemente durante 20 ?in â temperatura ambiente. Os filtros foram transferidos para papel Whatman 3MM e secos durante 10 min á temperatura ambiente. Os filtros foram incubados em papel Whatmann 3MM numa estufa a 80°C durante 2 horas. Subsequentemente foram lavados durante 0,5h em 6xSSC à temperatura ambiente e depois transferidos para 50 ml de mistura de pré-hibridação pré-aquecida (56°C) a qual consisite em 50 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 1M NaCl, 0,5% SDS,

0,1% pirofosfato de sódio, 10x Denhardt's (50x Denhardt's= = 1% BSA, fracção V Boehringer; 1% polivini1pirro1idona-40 ;

1% Ficoll 400). A mistura de pré-hibridação adiciona-se na altura: 0,1 mg/ml de DNA desnaturado de esperma de salmão (Maniatis et a I, pág. 327; ref. 5) e 0,01 mg/ml de rA. Fez-se pré-hibridação durante 4 h a 56°C com agitação suave. A sonda usada para hibridação foi o fragmento EcoRI de 3,5 kpb do pPL35-5 submetido a nick-translation, o qual contem a regia. C-terminal do gene pe1D da estirpe A. niger N756 ( disponível a partir de £. coli BJ5183/pCG3B 11 , DSM 3916,

EP 88 101 397.3). 0 ftagmnto foi préviamente isolado a partir de um gel de agarose de baixo ponto de fusão e 0,3 ug do fragmento foi submetido a nick-translation (Maniatis et a 1., pag. 109-112; ref. 5). 0 DNA sujeito a nick-translation foi desnaturado durante 10 min num banho-maria fervente, arrefecido em gelo e adicionado a 50 ml de mistura de pré-hibridçaão préviamente aquecida. Os filtros pré-hibridados foram transferidos para a mistura de hibridação um a um. A hibridação decorreu a 56°C durante a noite com agitação suave. Os filtros foram lavados a 56°C : 2x30 min com

0,5 1 4xSSC, 0,1% SDS e 2x30 min com 2xSSC, 0,1% SDS. Os filtros foram adsorvidos a papel 3MM e secos ao ar durante 1 h. Após montagem em papel 3MM e marcação adequada com tinta radioactiva, os filtros foram cobertos com revestimento Saram e submetidos a autorradiografia durante a noite a -70°C usando filmes de raios X Konica e cassetes Kodak-X-0watic com écrans de intensificação regulares. Deste modo obtiveram-se 44 sinais positivos a partir de 5 placas testadas. As placas positivas foram repicadas com uma pipeta de Pasteur estéril dispondo as placas cuidadosamente sobre o autorradiograma de modo correcto usando as marcas de tinta. Os pedaços de agar contendo as placas positivas foram distribuídas por quantidades de 1 ml de PSB. Deixou-se os fagos difundir do agar durante 1 h â te; peratura ambiente com vortex ocasional. 0 agar e os detritos das células bacterianas foram removidos por centrifugação durante 5 min, adicionou-se 10 pl de clor fórmio e os stocks de fagos foram guardados a 4°C. Os clones positivos foram designados -PL1 a Λ-PL44. Uma vez que os fagos foram semeados numa densidade elevada, as placas positivas tiveram de ser purificadas duas vezes sendo semeadas a uma densidade baixa (+ 100 fagos/placa; 0,1 ml da diluição 10 do stock de fagos) e repetindo todo o processo de sementeira por transferência de réplicas, hibridação e repicagem das placas pos it i vas .

Exemplo 2.2: Iso1amento de DNA do lambda

Para isolar DNA a partir dos clones recombinantes, os fagos primeiro amplificados infectando E. coli NM 539 com 0,1 ml de stocks de fagos derivados de clones purificados como descrito no exemplo 1.5 e sementeira das células em agarose de topo LC sobre placas de agar LC. Isto dá placas com hse completo das bactérias indicadoras. Emparelhou-se 5 ml de PSB sobre as placas e os fagos foram eluidos durante 2 h com agitação suave. Os fagos eluidos foram colhidos, os detritos celulares foram removidos por centrifugação e adicionado clorofórmio até 1%.

lisado de placas resultante foi guardado a 4°C. Geralmen11 te um título de cerca de 10 pfu/ml.

Uma vez que os processos de isolamento em pequena escala a partir de stocks de lisados de placas e de culturas em meio líquido em pequena escala (Maniatis et a 1. pág. 65-58; ref. 5) nem sempre resultam nas nossas mãos em DNA digerível, os fagos foram isolados a partir de lisados de 250 ml. Estes foram preparados por crescim nto do hospedeiro, £. coIi NM 539, até uma ΟΟθθθ de 0,3 em LC + 0,2% de maltose, 10 mM MgSO. 1 mM CaC1₉ e depois 10 ^{4 ά} adicionado aproximadamente 10 pfu do lisado de placas. Continu mente a incubação as bactérias lisam dentro de 4 hrs.

Adicionou-se RNase e DNase ao lisado para uma concentração final de 2 yug/ml e o lisado foi deixado à temperatura ambiente durante 1 h. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação (20 min., temperatura ambiente, 10 OOOxg). 14,8 g de NaCl e 25 g de PEG 6000 foram dissolvidos no sobrenadante para se obter concentraçõ s finais de 1M NaCl e 25% (p/v) de PEG. Os fagos foram deixados a precipitar durante 1 hora em gelo ou durante a noite a 4°C e colhidos por centrifugaçã (20 min., 10 OOOxg;

-454°C). Os sedimentos foram suspensos em 3 ml de tampão de diluição de lambda (LDB; = 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 20 mM MgC^» 100 mM NaCl). Dissolveu-se 2,5 g de CsCl em 4 ml da sus ensão de fagos e a mistura foi pipetada para tubos quickseal Beckman de 5 ml que foram acabados de encher com CsCl na mesma concentração em LDB. Os tubos foram selados e centrifugados durante a noite num rotor Beckman UTi 65.2 a 50 000 rpm e 4°C. A banda turva de fagos, visivel com uma lâmpada normal foi re ovida furando a parede lateral do tubo. Removeu-se o CsCl por diálise em manga de diálise estéril contra 2 1 de 10 mM Tris/HCl pH 7,5 10 mM MgC^, 50 mM NaCl a 4°C durante 4 horas. 0 tempão foi mudado uma vez. Os fagos foram colhidos em tubos Greinee estéres, o volume ajustado a 1 ml com tampão de diálise, adicionou-se 50 μΐ de 10% SDS, 50 μΐ de 0,5M EDTA pH 8,0 e 25 ul de pronase a 20 mg/ml livre de nucleases e os tubos foram incubados durante 1 h a 37°C. 0 volume foi aumentado para 3 ml com TE e esta solução foi extraída com iguais volumes de fenol saturado com TE, feno1/clorofórmio/á1 coo 1 isoanílico 25:24:1 e c1orofórmio/á1 coo 1 isoamílico 24:1. Após adição de 0,1 volume de acetato de sódio 3M pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol , e DNA foi precipitado durante a noite a -20°C e colhido por centrifugação (1 h 20 OOOxg a 4°C). Lavou-se o sedimen o com etanol a 70% secou-se, dissolveu-se em 200 pl de TE baixo. A produção de DNA fágico foi de cerca de 200 jug/250 ml de lisado.

Exemplo 2.3: Análise de restrição dos clones pelD

De entre os fagos positivos escolheram-se 10 ao acaso para posterior análise 1 pg de DNA fágico foi digerido com 10 unidades de EcoRI ou BglII num volume de 20 1 durante 2 horas a 37°C em tampões recombinados pelo fornecedor. As amostras foram separadas num gel de 0,6% de agarose usando 1 ug de DNA de lambda CI857 Sam 7 digerido com HindIII (lambda x HindIII) como marcadores e DNA de EMBL4 e DNA de pCG3811 digerido com EcoRI como testemunha. 0 gel foi fotografado num transi1aminador de UV usando filmes Polaroid 667 (4s, diafragma 8). 0 DNA foi transferido para filtros de nitrocelulose Schleicher and Schiill BA85 de acordo com o método de Southerm ( 1975) como descrito por Maniatis pág. 382-386; (ref. 5). Os filtros fo a hibri ados com uma mistura de fragmentos marcados 32 com P por nick-trans1ation do gene peI D cobrindo todo o gene. Estes fragmentos são o fragmento EcoRI de 2,9 kpl do pPL29-5 e o fragmento EcoRI de 3,5 kpb de pPL35-5. As condições de hibridação e de lavagem são idênticas às descritas no exemplo 2.1. Os comprimentos das bandas foram calculados a partir da fotografia e autorradiogramas por comparação gráfica em papel geritmico com as bandas marcadoras conhecidas. Os mapas de restrição dos clones estão apresentados na Fig. 1. Os clones yL-PL4, -14 e -40 contêm amb s os fragmentos hibridantes EcoRI de 2,9 e 3,5 kpb tal como em pCG3B1 1. À--PL5, -6, -10 e -33 contêm o fragmento EcoRI de 3,5 kpb juntamente com um outro fragmento hibridante EcoRI. Os clones -PL26 e -28 contêm o fragmento EcoRI de 2,9 kpb juntamente com um ouro fragmento hibrid nte, enquanto que A,-PL9 apenas contem um pequeno fragmento hibridante EcoRI de 1,2 kpb. 0 fragmento BglII completo de 5,0 kpb do pCG3B11, contendo todo o gene estrutural pel D está presente apenas nos clones yt-PL4, -14 e -40. A banda hibridante de 3,7 kpb, presente nos clones -PL5 , -6, -10, -14, -33 e -40 mas não em pCG3B11, está situada a jusante do gene pelD no fragmento de 5,0 kpb. Alguns fragmentos hibridantes, BglII ainda contêm 1,2 kpb do traço direito do vector. Todos os clones contêm também fragmentos n~o hibridantes que são idênticos. Uma vez que aparentemente os padrões de restrição do gene estrutural e das regiões â volta do gene são idênticos em todos os clones, concluiu-se que derivam do mesmo gene v i ζ o gene peID de A. n iger estirpe N400. A partir do número de clones semeados e do pressuposto comprimento do genoma de 3x10? pb, para 25 000 clones com um comprimento de inserção urídio de 15 kpb esperou-se encontrar pelo menos 10 clones peID. Uma vez que apenas e dos 10 clones analisados são idênticos, a complexidade da biblioteca é mesmo maior do que suposto (cf . Exemp1 o 3 ).

Exemplo 2.4: Subclonagem dos fragmentos pelD

Os fragmentos BglII de 5,0 kpb de

À-PLH e de PCG3B11 contendo os genes de pe1D de A. n iger N400 e N756 respectivamente, foram subclonados no sítio BamHI do plasmídeo pBR322 (ver vectores de clonagem). 4 ^ig de λ -PL4 e 2 ug de pCG3B11 foram totalmente digeridos em 20 ^il com 10U de BglII durante 2 h a 37°C. Os fragmentos foram separados num gel de 1% de agarose de ponto de fusão baixo LMP(BRL) em TBE + 1 ^ig/ml do brometo de etídio a 50V.

fragmento de 5,0 kpb foi removido do gel, diluído com 0,4 ml de TE, adicionou-se um volume igual de fenol e a mistura foi aqu cida a 65°C durante 10 min para fundir a agarose. Após centrifugação durante 5 min a 12 000 rpm numa centrífuga de bancada Eppendorf 5414S, a fase aquosa foi extraída com fenol/clorofórmio e clorofórmio, precipitado com etanol, lavada, seca e final ente dissolvida em 10 ^il de TE baixo.

-481pg de DNA do pBR322, preparado pelo método de preparação de plasmideo em larga escala (Maniatis et a 1 , pág. 86; ref 5) e purificado por centrifugação em cloreto de césio, foi digerido com 51) de BamHI durante 2 horas a 37°C num volume de 20 pl. 2 pl de tampão CIP10x e 0,02 unidades de CIP foram adicionados e a incubação continuou durante mais 30 min. Adicionou-se EDTA para uma concentração final de 25 mM e a mistura foi aquecida durante 10 min a 65°C. A solução foi diluída para 200 pl com TE e extraída três vezes com fenol saturado com TE, uma vez com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio. Após precipitação com etanol o DNA foi dissolvido em 50 pl de TE baixo.

pg de DNA do pBR322, preparado pelo método de preparação de plasmideo em larga escala (Maniatis et a 1 p. 86: ref 5) e purificado por centrifugação em CsCl, foi digerido com 51) de BamHI durante 2h a 37°C num volume de 20 pl. Adicionou-se 2 pl de tampão CIP 10x e 0,02 unidades de CIP e a incubação continuou durante mais 30 min. Adicionou-se EDTA para uma concentração final de 25 mM e a mistura foi aquecida durante 10 min a 65°C. A solução foi diluída para 200 pl com TE e extraída três vezes com fenol saturado com TE, uma vez com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio. Após precipitação com etanol, o DNA foi dissolvido em 50 pl de TE baixo.

100 ng do fragmento de DNA foi ligado com 20 ng de DNA vector num volume de 20 ul, nas condições descritas no exemplo 1.4. Metade da mistura de ligação foi usado para transformar células competentes Ej. col i MH1, preparadas pelo método do CaC^ (Maniatis et a 1., p. 250; ref. 5). As células foram semeadas em placas de agar LC contendo 50 ug/ml de ampicilina e incubadas durante a noite a 37°C. Os transformantes foram testados quanto â sensibilidade â tetraciclina semeando colónias primeiro em placas LC contendo 20 pg/ml Tc e depois em placas LC + amp.

Os transformantes foram cultivados durante a noite em 5 ml de LC + amp a 37°C e o DNA isolado a partir de 1,5 ml da cultura, usando o método de minipreparação com lise alcalina (Maniatis et a 1 pág. 368; ref 5).

As minipreparações de DNA foram digeridas com BamHI e PstI e os fragmentos analisados num gel de 1% de agarose. Dois plasmid os derivados de .À-PL4, contndo o fragmento BglII de 5,0 kpb em orientação oposta foram designados pGW840 e pGW841. Outros plasmfdeos derivados de pCG3B11 foram designados pGW870 e pGW871. As células MH 1 portadoras deles foram mantidas em glicerol a -70°C. 0 DNA de plasmideo de cultura de 0,5 1 destes clones foi isolado em larga escala (Maniatis et a 1, pág 86; ref. 5), purificado por centrifugação em CsCl , fenolizado, precipitado com etanol e dissolvido em 400 jjl de TE baixo.

rendimento foi de aproximadamente 500 jjg. Os plasmídeos foram sujeitos a mapeamento de restrição. 0 mapa do plasmídeo pGW840 está apresentado na Fig. 2 e não se distingue de pGW870. Também, os plasmídeos pGW841 e pGW871 que contém o fragmento na orientação oposta não se conseguem distinguir indicando a identificação dos gases pe1D de A. n iger estirpe N400 e N756.

-50Exemplo 3: Despiste de genes relacionados com pelD, sem isolamento e caracterização

Exemplo 3.1: Estabelecimento das condições de hibridação por análise de transferências genómicas de A, niger N400

Amostras de 2 yug do DNA de A. niger estirpe N400, isolado como descrito no Exemplo 1.1, foram digeridos num volume de 20 yjl durante 4 horas a 37°C usando BamHI (BRL) ou HINDIII (BRL) em tampão HHAB/g. As amostras digeridas foram separadas por electroforese em géis de 0,6% de agarose a 40V durante 18 horas. 0 DNA foi transferido para filtros de nitrocelulose, e incubados como descrito no Exemplo 2.3. As soluções de pré-hibridação são idênticas ãs descritas no Exemplo 2d.

A temperatura usada para pré-hibridação é sempre a mesma da temperatura de hibridação. 0 fragmento BamHI/PstI de 1,6 kpb sujeito a nick translation de pGW840 que contem a região codificadora do gene pelD, foi usada como sonda. A hibridação decorreu a diferentes temperaturas (52, 60 e 68°C) durante 16 horas e 40 horas. Usaram-se as duas condições de lavagem que se seguemàs três temperaturas diferentes 2x30 min 5xSSC , 0,1% SDS seguido de 2x30 min SSC, 0,1% SDS comparado com 4x30 min 5xSSC ,

0,1% SDS. Para 68°C lavagem duas vezes com 2xSSC, 0,1% SDS e duas vezes com 0,2xSSC, 0,1% SDS foi também incluído. A 68°C usando lavagem com 0,2xSSC apenas ocorreram as hibridações de homólogos. Usando concentrações de sal mais elevadas surgem alguns outros fracos. A 52°C o fundo é alto e a libertação fraca. As melhores condições encontradas para hibridação heteróloga são 60°C durante 40 horas usando a combinação de lavagem de 5xSSC e 3xSSC. Isto pode ser ainda optimizado usando 4xSSC em combinação com 3xSSC em vez de 5xSSC em combinação com 3xSSC. Os sinais observados nestas

-51transferências genómicas de A. niger N400 quando hibridado com o fragmento BamHI/PstI de 1,6 kpb de pGW840 estão resumidos na Tabela 1.

Tabela 1. Sinais de hibridação em DNA genómico de A. niger N400 despistado com BamHI/PstI de 1,6 kb de pGW840

BamHI HindIII

7,5 pb fortemente homólogo; 21,0 kpb fortemente homólogo;

peI D pe 1D

4,3 kpb forte	3,9 kpb forte
4,1 kpb fraco	7,1 kpb mais fraco
18,1 kpb fraco	4,4 kpb fraco
8,4 kpb muito fraco	4,6 kpb fraco

,5 kpb muito fraco

-52Exemplo 3.2: Despiste da biblioteca

2,5x10⁴ fagos da biblioteca de N400 em lambda foram semeados com 5 placas e fizeram-se 3 replicas em nitroce 1u1ose para cada placa, como descrito no Exemplo 2.1. 0 tampão de (pré)-hibridação está também descrito no Exemplo 2.1. A primeira réplica de cada placa foi hibridada a 60°C durante 40 horas com o fragmento BAmHI/ /PstI de 1,6 kpb de pGW840 e lavada duas vezes àquela temperatura durante 30 min com 4xSSC, 0,1% SDS e duas vezes durante 30 min com 2xSSC, 0,1% SDS como descrito no Exemplo 3.1. Estas condições são referidas como as condições heterólogas. A segunda réplica de cada placa foi hibridada a 68°C com o mesmo fragmento lavando duas vezes durante 30 min com 2xSSC , 0,1% SDS e duas vezes durante 30 min com 0,2xSSC, 0,1% SDS a esta temperatura. Estas condições são referidas como condições homólogas. A terceira réplica de cada placa foi hibri ada homólogamente com o fragmento BamHI de 0,35 kpb de pGW840, o qual está situado na região do promotor de pe1D directamente adjacente ao fragmento BamHI/ /PstI de 1,6 kpb. Obtiveram-se 29 placas que hibridaram heteró1ogamente mas não homólogamente (ou muito fracamente). Estas foram designadas ^/-PL101 a X-PL129. 0btiveram-se 19 placas que hibridam fortemente de modo homólogo e heterólogo com a sonda BamHI/PstI. Estas foram designadas -PL 130 a ,L-PL148 e foram consideradas como sendo clones peID. Destes, 2 hibridam apenas fracamente com a sonda BamHI de 0,35 kpb, -PL145 e F -PL146) e portanto provávelmente contêm apenas parte da região do promotor, as outras hibridam fortemente. Obteve-se um único clone que hibrida apenas com a sonda BamHI de 0,35 kpb ( Λ -PL149).

Todos os clones foram repicados e purificados duas vezes por sementeira e hibridação heteróloga com a sonda BamHI/PstI de 1,6 kpb. Numa segunda experiência de despiste obtiveram-se 23 clones pelD e 25 ou-

-53tros elones foram ainda obtidos ( /C-PL151 a X-PL198).

Exemplo 3.3: Caracterização dos elones de lambda por sinal de hibridação de placa com diferentes sondas derivadas de pelD

Nesta experiência foi descrita uma classificação dos elones isolados usando diferentes partes da região codificadora de pelD como sonda. Foram incluidos Λ -PL101 a -130, -145 enquanto Á--PL4 foi usado como testemunha positiva. Semearam-se os elones e apenas se faz uma réplica que foi dividida em 6 partes. Isto pretendeu excluir diferenças de sinal de hibridação entre réplicas, partes separadas das réplicas foram hibridadas homóloga e heterologamente com as seguintes sondas marcadas com

32,

1: o fragmento completo BamHI/PstI de 1,6 kpb de pGW840

2: o fragmento BamHI/Xhol de 649 kpb de pGW840 parte codificadora (N) terminal de pelD)

3: o fragmento Xhol/PstI de 244 pb de pGW840 (parte codificadora (C) terminal de pelD).

λ—PL4, -130 e -145, assim como 2/-PL101 hibridam fortemente com estas sondas em condições homólogas e heterólogas, confo me esperado para os elones pelD. 0 último clone, J^-PLIOI, está situado na aresta do filt o de um filtro no Exemplo 3.2 a portanto não contado como pelD no primeiro despiste. Os elones agora mencionados foram classificados como elones. Classe I (pelD) .

Tz-PL112, -126, e -127 mostraram-se negativos nesta experiencia. Todos os outros elones pod m ser divididos em duas outras classes. Classe II híbrida heterólogamente não só com toda a sonda como também com a sonda N-terminal. A hi-

-54bridação homóloga é apenas fraca com todo o gene peID como sonda. Os ciones da Caísse III não hibridam de todo com a sonda N-terminal e também não hibridam homólogamente com toda a sonda. A sonda C-terminal não híbrida com os ciones da Classe II e da Classe III. Destas experiências concluímos que existem pelo menos dois genes relacionados entre os ciones isolados.

Aos ciones da Classe II pertencem: -PL104, -105, -109, -113, -114, -115, -119- -122, -124,

-125 , - 128 e - 129.

Os ciones a Classe III são: PL102, -103, -106, -107, -108, -110, -111, -116, -117, -118, -120, -121 e -123.

Exemplo 3,4: Análise de restrição dos ciones de lambda isolados (Classe I , II)

Stocks de lisados de placas, lisados de 250 ml de meio líquido e preparações de DNA fágico em larga escala a partir destes lisados foram preparados como descrito no Exemplo 2.2. Isto foi feito para 24 ciones, 3 deles sendo ciones pelD ( >^-Ρ14, -130, -145). 0 DNA de um clone perdeu-se durante o isolamento de DNA (>t-PL124). 0 DNA isolado a partir destes ciones foi digerido em amostras de 1 jjg num total de 20 ^il com 10 unidades de enzima. Todos os ciones foram digerido' com EcoRI, BamHI, HindIII, EcoRI/BamHI, BamHI/Hind111 , EcoR I/Hind 111 e EcoRI/BamHI/HindlII. Os fragmentos foram separados num gel de 0,6% de agarose e transferidos para filtros de nitrocelulose como descrito no Exemplo 1.3. As transferências foram hibridadas heterólogamente com o fragmento BamHI/PstI de 1,6 kpb de pGW840 como descrito no Exemplo 3.1. Dois

-55clones não hibridaram ( A-'- P L 112 e ^-PL129). Os comprimentos das bandas de fotografias e de autorradiogramas foram calculados. Excepto para o clone Z--PL 113 , todos os clones contêm demasiados fragmentos para derivar um mapa comp1eto.

No entanto é possível derivar um mapa da região de hibridação e por combinação de resultados de outras bandas que não hibridaram, assinalar quais os clones derivados do mesmo gene. E claro que entre os restantes clones das Classe II e III, estão presente 5 genes. Estes foram designados pelA, peIB , pelC , pe1E e peIF .

A atribuição de clones a estes genes está resumido na Tabela II.

Tabela II: Atribuição de clones a diferentes genes peI (Parte) significa que a banda de hibridação está apenas parcialmente presente nestes clones

Classe	Gene	Clones-
I.	pelD	PL4, PL130, PL145 (parte) \|
II.	E£Ã^a	PL113, PL104, PL115, PL125 (partjá
pelB	PL119, PL122, PL128, PL105 (parte)
pelC	PL109
III.	pelE	PL116, PL107 (parte)
pelF	PL102, PL103, PL110, PL120 PL121 (part), PL123 (parte)

Tabela III: Comparação das bandas de hibridação em transferências cromossómicas e genes isolados. 0 comprimento da banda está em kpb

	EcoRI	BamHI	HindIII
Cro mossómico	2.9 + 3.5	7.5	21.0 Sinal homólogo pelD
	+ bandas	4.3	3.9 Sinais heterólogos
	maiores		mais fortes
		18.0	7.1 Sinais mais fracos
			4.4 Sinais fracos
		8.4	4.6 Sinais fracos
		4.1	1.5 Sinais fracos
pelD	2.9 + 3.5	7.5 grande
pel A	7.5	4.3	3.9
pelB	8.7	grande	7.1
pelC	5.0	grande	4.4
pel£	6.2	8.4	4.6
pelF	grande	4.1	1.5 + 2.8 (muito fraco)

Na Tabela III está apresentado uma comparação dos comprimentos dos fragmentos hibridantes dos genes isolados e dos comprimentos dos fragmentos hibridantes de transferências de DNA genómico. Com base nestes resultados concluiu-se que todas as bandas que hibridam nas transferências genómicas estão presentes nos clones isolados e que nestas condições de hibridação nenhum outro gene relacionado pode ser isolado. Os resultados de hibridação de placas (Exemplos 3.3) revelam que, não considerando os clones parciais, todos os genes tem um padrão de hibridação específico com a sonda testada. Isto dá resumido na Tabela IV.

Tabela IV: Comparação de força do sinal de diferentes genes em hibridação de placas homóloga e heteróloga com diferentes sondas pelD de acordo com a experiência descrita no Exemplo 3.3. 0 grau de hibridação foi expresso pelo número de sinais +.

gene homólogo pe1D híbrida com pelo menos 10 sinais +; + hibridação muito fraca; - nenhuma hibridação

	hibridação heteróloga	hibridação homóloga
Sonda	gene N-term C-term completo	gene com- N-term C-term pleto
pelA pelB pelC pelE pelF	++++ ++++ + ++++ ++++ ± +++ ++++ +++ ++++ ± ±	1+ 1 14-4- 44- 1 1 1 14 1+ 1 1 1 1 1

Exemplo 3.5: Subclonagem de genes seleccionados com pelD pBR322

Fizeram-se subclones dos fragmentos de hibridação que foram obtidos a partir de clones À descritos no Exemplo 3.3 no vector pBR322 que foi digerido com EcoRI, BamHI ou HindIII e subsequentemente desfosforilados. 0 isolamento de fragmentos, a partir de géis de agarose LMP, preparação de vectores ligação, transformação de £. coli MH 1 , isolamento de DNA em minipreparações e isolamento de plasmídeos em larga escala foi tudo feito usando processos convencionais que foram descritos no Exemplo 2.4.

Os fragmentos foram ligados ao vector adequado como descrito no Exemplo 2.4. As células L· coIi MH1 transformadas foram semeadas em LC+50 ug/ml Amp Os transformantes foram testados quanto à sensibilidade à tetracic1ina. Os clones EcoRI são todos resistentes. Os DNAs das minipreparações foram então digeridos com enzimas adequadas para testar as inserções e para determinar a orientação dos fragmentos. Os plasmídeos que foram seleccionados estão resumidos na Tabela V. As células portadoras deles foram guardadas em glicerol a -70°C.

Tabela V Subclones dos genes pe 1 em pBR322

plasmicfec	t gene	-r—ι fragmento	origem	orientação
pGW820	pelA	7.5 EcoRI	X-PL113	2
pGW821		4.3 BamHI		2
pGW822		3.9 HindIII		2
pGW823		7.5 EcoRI		1
pGW824		4.3 BamHI		1
pGW825		3.9 HindIII		1
pGW830	pelB	7.1 HindIII	X-PL122	1
pGW850	pelC	5.0 EcoRI	X-PL109	1
pGW851		5.0 EcoRI		2
pGW860	pelF	4.1 BamHI	X-PL102	1
pGW880	pelE	4.6 HindIII	X-PL109	1
pGW881		4.6 HindIII		2

Os plasmídeos pGW820, -830, -850,

860 e -880 foram isolados em larga escala e feitos os seus mapas de restrição. Os mapas destes plasmídeos estão apresentados nas Figuras 1 a 6.

Para determinar a localização e orientação dos genes, transferências Southerm das digestões de plasmídeos foram hibridadas heterólogamente com o fragmento BamHI/PstI de 1,6 kpb do pGW840 e transferências idênticas foram hibridadas heterólogamente com um fragmento N-60-

-terminal do mesmo plasmideo, que é o fragmento BamHI/Xhol de 649 pb para o mapeamento de pGW820 e -830 e o fragmento BamHI/EcoRI de 766 pb para pGW850 e -860.

Os plasmídeos pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 e pGW880 foram clonados em E_. coI i HB101 e depositados em 1 de Fevereiro de 1988 na Dentasche Sammlung fiir Mikroorganismem, Grisebachstr. 8 3400. Eles receberam os

DSM-Nos. 4388, 4389, 4390, 4391 e 4392, respectivamente.

Exemplo 4: Determinação da sequência dos genes pe1D , pe1A , pe1B e pe1C

Exemplo 4.1: Sequência parcial do gene de A. niger estirpe N400 e sua identidade com pell de A, niger estirpe N756

Fragmentos de restrição adequados foram isolados a partir de pGW840 após e1ectroforese em gel de agarose LMP como descrito no Exemplo 2.4. Estes foram ligados aos vectores M13mp18RF e M13mp19RF de acordo com o manual de instruções de BRL para clonagem em M13/sequênciação didesoxi (pag. 26, 27, ref. 6). A transformação de E. coli JM103, sementeira em placas indicadoras X-gal, e isolamento do DNA de cadeia simples a partir dos fagos recombinantes foi feito de acordo com as instruções no mesmo manual (Pág. 29-34). Alguns clones foram sequênciados usando o método de terminação de cadeias didesoxi da Sanger descrito nas págs. 38-74 do manual BRL.

As sequências determinadas entre os nucleotídeos -457 e +100 são idênticos â correspondente sequência do gene PLI, derivado de A. niger N756 e presente

no plasmídeo pCG3B11 (EP 88 101 397.3). A sequência determinada desde BamHI na posição -457 até à posição +100 compreende 457 nucleotídeos da sequência do promotor, os 57 nucleotídeos codificadores da sequência sinal e 43 nucleotídeos codificadores dos 13 primeiros aminoácidos N-terminais da proteína PLD madura.

Considerando os mapas de restrição idênticos do gene N400 pelD em pGW840 e do N756pelD em pCG3B11 e os dados da sequência N-terminal totalmente idênticos assumiu-se que ambos os genes são idênticos. Assim assumiu-se que a proteína PLD é idêntica à primeira proteína PLI .

Exemplo 4.2: Determinação da sequência do gene pe 1A , pe IB e pe 1 C

Fragmentos de pGW820, pGW830 e pGW850 foram subclonados em M13mp18RF e M13mp19RF (ver Exemplo 4.1.) ou nos plasmídeos pEMBL18 e pEMBL19 (Dente et a 1 . ref. 7, 8). Os DNAs de cadeia simples de clones dos plasmídeos foram obtidos por infecção com fago auxiliar R408 (Russell et a 1. ref. 9).

Prepararam-se clones de delecção de pGW850 com exonuclease III pelo método de Hemikoff (ref. 28). 0 fragmento Smal-BglII de 3,0 kb do pGW850 em que o gene pelC está situado, foi subclonado em pEMBL19. 50 ug deste clone foi digerido com Smal e Saci e após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol foi digerido com exonuclease III. Retiraram-se amostras a diferentes intervalos de tempo, a exonuclease III foi inactivada pela adição de NaCl e EDTA e incubação a 70°C durante 10 min.

Os extremos protuberantes de ssDNA foram removidos pela nuclease S1 e os extremos coesivos tornados cerses com DNA-polimerase de T4. Após auto-ligação e transformação de E. co1i JM103 com estes clones de delecção obtiveram-se DNAs de cadeia simples por infecção com o fago auxiliar R408. pGW820 foi sequênciado a partir do sítio PvuII na posição 1000 até ao sítio C I na posição 4175 (ver Fig. 1).

No caso de pGW830 foi sequênciado o fragmento Xhol de 2774 pb (ver Fig. 2). pGW850 foi sequênciado desde o sítio EcoRI na posição 0 até â posição 3168 (ver Fig. 3).

As estratégias de sequênciação para estes genes estão indicadas na Fig. 7, 8 e 9. foram sintetizados vários oligonucleotideos usando o método fosforamidato de Caruthers (ref. 10) usando um sintetizador de oligonucleotídeos Applied Biosystem (modelo 380B). Eles foram usados como iniciadores de sequênciação e a sua posição está indicada na Fig. 7 e 8.

Toda a sequência do gene peIA está apresentada na Fig. 9 na direcção 5' -^3'. A sequênciação de 3175 pb começa com o primeiro nucleotídeo do sítio PvuII na posição 1000 em pGW820 e termina no último nucleotídeo do sítio Ciai na posição 4175 em pGW820.

A sequência pe1A compreende nucleotídeos da região do promotor, 1355 resíduos da parte estrutural e 360 nucleotídeos da região do terminador.

A sequência de aminoácidos de PLA (ver Exemplo 6.3) está precedido de uma sequência sinal de 20 aminoácidos conforme pode ser deduzido a partir da sequência de nucleotídeos.

-63MET-LYS-TYR-SER-THR-ILE-PHE-SER-ALA-ALA-ALA-ALA-VAL-PHE-ALA-GLY* * * * * * *

SER-ALA-ALA-ALA * * *

A homologia com a sequência sinal do gene pe1D está indicada por um asterisco. Também os primeiros 5 resíduos da proteína madura têm a mesma sequência de aminoácidos em pe1A e pe1D.

Toda a sequência do gene peIB está apresentada na Figura 10, também na direcçao 5' 3'. A sequência de 2774 pb começa com os primeiros nucleotídeos do sítio Xhol em pGW830 e termina no último nucleotídeo da segunda sítio Xhol .

A sequência pelB compreende 1133 nucleotídeos da região do promotor, 1373 resíduos da parte est utural e 268 da região terminadora. 0 gene pe1B codifica uma sequência sinal de pelo menos 20 aminoácidos.

A sequência pe1C compreende 1367 nucleotídeos da região do promotor, 1340 resíduos da parte estrutural e 461 da região do terminador. 0 gene peIC codifica uma sequência sinal de 18 aminoácidos.

pelC	MET-LYS-VAL-PRO X -	X -PHE-LEU-GLN-	LEU-LEU-CYS-LEU-ASN-ALA-ALA
pelB	*		*	*
pelA	* *		*	*
pelD	* *			* *
pelC	LEU-ALA-SER-ALA
pelB	*	*
pelA	*	*
pelD	* *	*
		A	homologia com	a sequência sinal
do gene pelA, pelB e	pe 1D	está indicado	em cada uma das po-
siç~es com um asterisco.	Os Xs estão incluídos para alinha-
mento das	sequênc i as

A procura de sequências consensus de junções de splicing exão/intrão de fungos e uma sequência interna de intrão (Ballance, ref. 11) conduziu-nos a postular a presença de quatro intrões no gene pe1A, B e C.

As posições nas quais os intrões estão situados dentro das regiões codificadoras destas gesnes peI foram conservadas no sentido de existirem potêncialmente cinco posições de intrões mas em cada um dos genes falta um intrão diferente. No entanto, para o gene pe1C apenas três intrões foram postulados. Destes apenas um foi encontrado numa posição correspondente à posição de um intrão em pe1D e peIA (intrão 5). As posições destes intrões e os respectivos comprimentos estão resumidos na Tabela Via.

-65Tabe1 a Via Posições de intrões nas sequências de pe I D , pelA, pe1B e pe 1C . As posições referem-se às sequências codificadoras na Fig. 10, 11 e 12 e à sequência de pe1D

gene	pelD	pelA	pelB	pelC
	posição	posição	posição	posição
Intrão	comprimento pb	comprimento pb	comprimento pb	comprimento pb
1	202-267 66	ausente	1337-1398 62	ausente
2	410-471 62	1708-1759 52	1543-1598 56	ausente
3	598-660 6JJ	1886-1933 48	1725-1781 57	ausente
4	ausente	ausente	ãusente	1853-1930 78
5	1446-1502 57	2031-2094 64	ausente	1998-2062 65
6	ausente	ausente	ausente	2232-2294 63
7	ausente	2329-2382 54	2113-2169 57	ausente

Os comprimentos dos exões entre intrões dos quatro genes pel , é o mesmo nestes casos. Na Figura 13 estão apresentadas as sequências de aminoácidos derivadas alinhadas de PLA, PLB, PLC e PLD. Na parte N-terminal das regiões codificadoras de pelA, pe1B e pel D observou-se aproximadamente 80% de homologia com base na ho mologia da sequência de nucleotídeos e cerca de 80% com base na homologia da sequência de aminoácidos. Esta percentagem é muito mais inferior com pe1C. Na parte C-terminal de pelA, pelB e pe1D para lá do resíduo 285 da proteína madura (correspondendo ao resíduo 305 na Fig. 13) perde-se a homologia em grande parte e volta apenas perto do extremo

C.

-66Excepto para as sequências do sinal de splicing e dos sítioq de splicing 3' e 5' (Tabela VIb) não se encontrou qualquer homologia nos intrões.

Tabela VIb Comparação das sequências consensus de intrão

intrão	dador aceitador exão 1 intrão lariat intrão exon 2
pelD 1 pelB 1	AAGAC GTGAGTTT..32 GGCTGACC..12..TGCCAG TTTCG AGAAC GTAGGTCG..32..GCCTAACA...8..ATCCAG CTTCG
pelD 2 pelA 2 pelB 2	ACCTA GTAAGTTG..37..TGCTGACA...3..GGATAG CAACA GAATA GTATGTCC..29..ATCTAACT...1..GGATAG CTACA ACTTA GTATGTTG..31..TGCTGATA...3..GTATAG TGATA
pelD 3 pelA 3 pelB 3	ATCCA GTATGCAT..32..AACTAACC...9..CCACAG GAACA ATCCA GTAGGTTA..25..CTCTAACG...1..AATCAG GAACA ATCCA GTGAGTGC..33..TGCTAATA...2..GGCCAG GAACA
pelD 5 pelA 5 pelC 5	TTACT GTAAGTCG..31..CACTAATG. . . 4 . .CTTCAG ACTGC TTACT GTACGTCT..40..AGTTAACA...2..TGACAG ACCGC GCGAG GTAAGACA..39..CGTTGACT...4..GATTAG ACCTC
pelC 6	CCAGA GTACGTGT..30..AACTAACA..11..TCACAG ACAAC
pelA 7 pelB 7	ACTGT GTAAGTTG..24..ACCTGACT...8..TTGCAG GTCAA ACGCC GTATGTCG..28..TACTGACA...7..CTACAG GTGAA
CONSENSUS	----- GTA-GT—. .24..— CTAAC-.. .1. .---CAG----- g c 40 t G t 12 T a

As sequências de aminoácidos derivadas para as proteínas PLA, PLB, PLC e PLD indicam um total de 359 resíduos para as duas primeiras proteínas 360 para PLC e 354 para PLD. Em relação á N-glicosilação um potêncial sítio de glicosilação está presente nas quatro proteínas na posição 109 (na proteína madura) (para PLC isto corresponde â posição 105 na sequência não alinhada). Em PLB está presente num segundo sítio potêncial na posição 232 enquanto que em PLD dois outros sítios potênciais de glicosilação estão presentes nos resíduos 255 e 329.

Exemplo 5:	Construção de A. niger usando o gene pyrA de
A. niger como marca selectiva e os vários genes
pel de A. niger como plasmídeos cotransforman-
tes
Exemplo 5 . 1	: Propagação e purificação de plasmídeos usados
	para transforma A. niger

Todos os plasmídeos foram propagados em E. coli estirpe MH 1 e o DNA de plasmídeo foi recuperado de 500 ml de culturas crescidas durante a noite como descrito por Maniatis et a 1 . , pág. 90-91; ref. 5). A uma solução de 2,5 ml de DNA em TE, contendo até 1 mg de DNA adicionou-se 2,2 g de CsCl e 1 ml de brometo de etídio (10 mg/ml em água). A solução foi transferida para tubos quick-seal os quais foram cheios é selados conforme recomendado pelo fornecedor (Beckman). A centrifugação decorreu num rotor VTi 65.2 a 20°C durante 16 horas a 45 000 rpm. Das duas bandas fluorescentes visiveis com luz ultravioleta, a maior inferior contendo o DNA de plasmídeo foi isolada furando o tubo lateralmente. A solução de DNA (aprox. 1 ml) foi extraída 5 vezes com butanol saturado com água para remover o brometo de etídio. Em seguida o DNA

-68foi precipitado com etanol, ressuspenso em TE, extraído uma vez com fenol/clorofórmio e clorofórmio, precipitado e guardado a -20°C. 0 plasmídeo pGW613 que é portador do gene

OMP-descarboxi1 ase (pyrA) num fragmento de DNA de 5 kpb de A. niger foi usado para seleccionar transformantes (Goosen et a 1 , ref. 12). Os plasmídeos pGW820, pGW830 , pGW840 , pGW850, pGW860 e pGW880 que estão descritos no Exemplo 3.5 foram usados como plasmídeos co-transformantes.

Exemplo 5.2: Preparação de protoplastos e transformação do mutante auxotrófico para uridina A. n i ger estirpe N593

A estirpe N593 de A. niger (aspA, pyrA) que é um derivado da estirpe perental N400 foi obtida por selecção positiva contra o análogo toxico ácido 5-f1uoro-orótico tal como em levedura (Boeke et a 1., ref. 13) na presença de uridina como descrito por Goosen et aI .;

(ref. 12).

Meio mínimo líquido suplementado com 0,5% de extracto da levedura, 0,2% de casaminoácidos , mM uridina (Janssen Chimica) e 50 mM glucose foi inoculado com 10θ comi diósporos de A. n i ger N593 por ml e incubado durante 20 horas a 30°C num agitador orbital New Brunswick. 0 micélio foi colhido por filtração, através de Miracloth, lavado com meio mínimo (STC) iso-osmótico (STS) tendo a seguinte composição: sorbitol 1,33M, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂ ajustado a 1,7 mOsm. Uma quantidade de 1 g de micélio foi ressuspenso em 20 ml de STC. Os protoplastos foram libertados do micélio após 2 horas pela adição de 250 ml de Novogym 234 (Novo Industries, Denmark) esterilizada por filtração e incubação da mistura a 30°C num agitador a 95 rpm. Os protoplastos foram separados do

micélio residual por filtração usando um funil com uma almofada de lã de vidro e purificados por centrifugação (10 min., 2500 rpm) por sedimentação e ressuspensão em STC.

Para transformação 5x10⁶ protoplastos foram ressuspensos em 200 pl que foram então incubados juntamente com 1 pg de pGW613 e 10 pg de um dos seguintes plasmídeos pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 e pGW880 (volume inferior a 20 pl). Para pGW840 uma proporção de 1:3 foi usada tomando 6 pg de pGW613. Após a adição do DNA de plasmídeo dos protoplastos adicionou-se 50 pl de PCT (12 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000) e a mistura de incubação foi mantida em gelo durante 20 min.

Em seguida adicionou-se mais 2 ml de PCT e a mistura foi incubada durante mais 5 min â temperatura ambiente. Finalmente, adicionou-se 4 ml de STC e misturou-se. Quantidades de 1 ml desta solução de transformação final foram misturados com 4 ml de agar de topo MM iso-osmótico liquefeito estabilizado com 0,95M sucrose (ajustado a 1,7 mOsm). A mistura de protoplastos foi imediatamente semeada em placas de agar contendo o mesmo meio mínimo iso-osmótico e estas foram incubadas a 30°C. Experiências testemunha adequadas incluem protoplastos tratados de modo semelhante com DNA de plasmídeo e em meio mínimo não estabilizado com 2,5 mM uridina.

Após 3 dias de crescimento a 30°C surgem transformantes bem desenvolvidos que esporulam (50-150 transformantes/yug pGW613). Ainda, surge também um grande número de transformantes presumivelmente abortivos. Os esporos de transformantes individuais foram então semeados separadamente em meio mínimo com glucose 50 mM para se obter colónias isoladas que foram usafes para propagar esporos para posterior análise dos transformantes.

-70Em qualquer dos casos pelo menos dez testemunhas foram cultivadas em meio mínimo líquido, o DNA foi extraído e analisado quanto à presença de DNA do plasmideo cotransformante. 0 DNA fúngico foi isolado por um processo ligeiramente modificado usado para isolar RNA de plantas (Slater, ref. 14). 0 micélio foi lavado com soro fisiológico, congelado em azoto líquido e 0,5 g destruído usando um microdesintegrador (Braun). 0 pó de micélio foi extraído com tampão de extracção preparado de fresco. 0 tampão de extracção foi preparado como se segue:

ml de ácido de tri-isopropilnaftalenossulfónico (TNS) mg/ml foi misturado com 1 ml de ácido p-aminossalici1ico (PAS) (120 mg/ml) e 0,5 ml de tampão RNB 5x (5x RNB contem 121,1 g de Tris, 73,04 g de NaCl e 95.1 EGTA em 1 1, pH 8,5). Após a adição de 1,5 ml de fenol, o tampão de extracção foi equilibrado durante 10 min a 55°C. 0 tampão aquecido foi então adicionado ao pó de micélio e a suspensão misturada durante 1 min. usando um misturador vortex.

Em seguida adicionou-se 1 ml de cloroformio e misturou-se durante 1 min.

Por centrifugação (10 min. 10 OOOxg) a fase aquosa foi separada e extraída uma vez mais com igual volume de fenol/clorofórmio (1:1) e depois duas vezes com clorofórmio.

A fase aquosa contem RNA e DNA. 0 DNA foi precipitado com 2 vol de etanol à temperatura ambiente e colhido por centrifugação (10 min., 10 000 xg), lavado duas vezes por redissolução em água destilada esterilizada e novamente precipitação com etanol. Removeu-se o RNA pela adição de RNase A (20 ^ug/ml) , â solução final.

processo resulta em DNA de alto peso molecular (100-200 Kpb) com um rendimento de cerca de 300 /jg DNA/g de micélio o qual foi ainda purificado por centrifugação em gradiente de densidade com CaCl/brometo de etídio essêncialmente de

acordo com Maniatis et aI. pág. 93; (ref. 5).

As digestões do DNA cromossómico (2 ug) foram feitas por incubação durante 2 horas a 37°C com EcoRI para os transformantes peIA (pGW820) e peIC (pGW850), Hindlll para os transformantes pelB (pGW830), EcoRI ou BglII para os transformantes pelD. Em todos os casos usou-se inicialmente 20U de enzima de restrição após o que a incubação foi prolongada durante mais 2 horas adicionada de novo 20U das enzimas de restrição. As digestões foram efectuadas nos tampões de reacção adequados fornecidos pela BRL.

Em seguida o DNA foi fraccionado em 0,6% de agarose, transferido para nitrocelulose hibridado essencia 1 mente como descrito por Maniatis et a 1 (ref. 5), pág. 382-386 usando as correspondentes sondas marcadas com /oZ -³²P 7.

Obtiveram-se as seguintes frequências de cotransformação: pGW820 (pe 1A) 70%; pGW830 (pe1B ) , 70%, pGW840 (pelD) 15%, pGW850 (pelC) 60%.

A proporção de massa de pGW613 versus o plasmídeo de cotransformação pGW820, pGW830, pGW850 (1:10) e pGW840 (1:3) levou na maior dos casos observados â integração cromossõmica de várias cópias dos plasmideos cotransformantes.

Exemplo 5,3: Análise genómica de A. niger estirpe A15 transformada com pe1A

Uma série dos transformantes com várias cópias descritos em 5.2 foi analisado e a análise do transformante pe1A A15 está apresentado como um exemplo detalhado.

DNA de A. niger estirpe N593 e do transformante de várias cópias pe 1A estirpe A15 foi isolado e analisado por hibridação de transferências Southern como descrito no Exemplo 3.1. Como sonda peIA foi usado o fragmento EcoRI de 7,5 kpb (ver Fig. 39). Na transferência genómica encontrou-se uma banda interna de 7,4 kpb na estirpe A15 transformada que deriva de casos de integração tipo I e/ou tipo II, (cf. Hinnen et a 1., ref. 14a). Também se encontraram algumas bandas menos abundantes de vários comprimentos que representam fragmentos laterais de rearranjos dos casos de integração tipo II.

As densidades ópticas das bandas EcoRI de 7,4 kpb nos transformantes de A. niger pe1A e A. niger N593 foram lidas usando um Ultrascan XL (LKB) . Os valores foram corrigidos para pequenas diferenças na concentração de DNA entre N593 e o transformante A15 medindo as densidades ópticas obtidas com uma segunda sonda que híbrida com o gene da piruvato-cinase, presente como cópia única em ambas as estirpes. A partir destes resultados calculados que no transformante pelA A15 estão presentes aproximadamente 19 cópias intactas do gene pelA.

Usando a inserção HindIII de pGW830 (Fig. 3b) como sonda, a análise da transferência Sonthern da estirpe A15 transformada indica que a integração de sequências pelA não ocorreu no locus pelB. De modo semelhan-73te, a análise da estirpe transformada pe1Β B13, da estirpe transformada pu IC C16 e da estirpe transformada peID D12 com 90 sondas correspondentes adequadas dá números de cópias de aproximadamente 15, 50 e 10.

Exemplo 5.4: Análise de transferências Northern de micélio induzido e não induzido de A. niger transformado com pelA estirpe A15 e de A. niger N400

Meio mínimo (250 ml) contendo glucose 50 mM ou 1% (p/v) de pectina de maçã (Brown Ribbon, d.e. 72,8%, Olipektin AG, Bischofsze 11 ) foi inoculado a uma densidade de esporos de 10$ esporos/ml com esporos do transformante A15 ou esporos da estirpe tipo selvagem N400 e foi colhido após 30 horas, de crescimento a 30°C. As amostras do meio de cultura (2 ml) foram também colhidas, dialisadas contra 2 1 de tampão fosfato de sódio 10 mM pH 7,0 a 4°C e guardados a -20°C.

Os ácidos nucleicos foram isolados a partir do micélio como descrito no Exemplo 5.2. 0 RNA foi precipitado a partir da fase aquosa após extracção com clorofórmio pela adição de 1/3 do volume de 8M LiCl. A solução foi bem misturada e incubada durante a noite a °0C. 0 RNA foi colhido por centrifugação (300 rpm durante 30 min.) usando uma centrífuga MSE Super-MInor e depois lavado uma vez com 2M LiCl frio (-20°C) e uma vez com etanol a 96% frio (-20°C). Finalmente o RNA foi dissolvido em água destilada a uma concentração de cerca de 1 mg/ml . As preparações práticamente sem DNA contaminante deram um 1-2 mg de RNA por g de micélio. Quantidades de aproximadamente 10 pg do RNA foram sujeitas a e1ectroforese em géis de 1% de agarose desnaturante com formaldeído de acordo com Maniatis et a 1 . , pág. 202-203; ref. 5) usando DNA de lambda digerido com HindIII ou a escada de DNA da BRL como marcadores de peso molecular. Os géis foram transferidos para Nytron (Schleicher and Schuell) conforme recomendado pelo fabricante e hibridados a 68°C durante 16 horas com a sonda de DNA de pe1A EcoRI de 7,4 kpb. Os processos de hibridação e de lavagem foram os descritos em condições homólogas de acordo com o Exemplo 3.2).

Ambas as estirpes de A. niger produzem um mRNA induzido por pectina com um comprimento de aproximadamente 1,6 kpb. A leitura da densidade óptica dos dois autorradiogramas indica uma diferença de 15-20 vezes na intensidade entre o transformante A15 e a estirpe tipo selvagem que está relacionado com o aumento do número de cópias calculado a partir da análise de transferências Southern.

Exemplo 5,5: Produção de pectina-1iase pela estirpe D12 de A. niger transformado transformante D12 de A. niger peID obtido de acordo com o Exemplo 5.2 foi cultivado num processo de cultura em 2 passos semelhantes ao processo des crito por Hermersdõfer et al (27) para a produção de poligolactaronase. formou-se uma camada de micélio no topo de uma cultura líquida modulando 10⁶ esporos por ml de Pre Cultivation Médium (PCM) consistindo em polpa de beterraba (4%) e NH^NOg (1%) pH 4,5. Após 5 dias de crescimento a 30°C o micélio cultivado em 30 ml de meio foi lavado com soro fisiológico e transferido para 50 ml de Main Cultivetion Médium (MCM). Esta cultura foi cultivada a 30°C num agitador orbital a 100 rpm. A composição de MCM é por litro de meio, glucose (5%), pectina (d.e. 72,8%, 0,1%),

-75NH₄N0₃ (0,75%), KH₂P0₄ (0,5%), FeS0₄7H₂0 (0,03%), MgS0₄7H₂0 (0,03%), CaCl₃ (0,03%), NaNOg (0,03%) pH 4,5. Retiraram-se amostras durante 24 horas a diferentes intervalos de tempo e foram analisadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. A expressão de pe1D é jã máxima após 7 horas de cultura. A proteína migra de modo idêntico â PLI usada como referência.

Exemplo 5.6: Produção de pectina -1 iase pela estirpe A15 de A. niger transformado e por A. niger N400

Os filtrados de cultura dialisados (Exemplo 5.4) foram 1iofi1izados , ressuspensos em 0,2 ml de água destilada e sujeitos a electroforese em gel de SDS-poliacri1amida (géis de 10%) usando métodos convencionais (Laemmli, ref. 15). As proteínas separadas foram transferidas para nitrocelulose (Towbin et a 1., ref. 16). As transferências foram saturadas durante 5 horas à temperatura ambientecom uma solução a 1% de BSA em tampao 10 mM Tris-HCl pH 7,5 com 0,35M NaCl. Isto foi seguido de uma incubação durante 16 horas à temperatura ambiente com anticorpos policlonais (0,1%) induzido contra duas pectina-liases purificadas de acordo com van Houdehoven (1975) em 50 ml do mesmo tampão contendo 150 mM NaCl, 0,5% BSAm, 1% Triton X100, 0,5% de desoxicolato e 0,1% SDS. As transferências foram então lavadas 5 vezes com 200 ml de PBS antes da incubação com 30 μΐ de IgG de cabra anti-coe 1ho-HRP (Sigma) como segundo anticorpo por 50 ml e lavado novamente 5 vezes com PBS. As transferências foram finalmente coradas usando 4-cloro-1-naftol como substrato. 40 mg do substrato foram dissolvidos em 0,5 ml de etanol a 90% e misturados com 100 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,5 e 30 pl de peróxido de hidrogénio a 30% e adicionado então às transferências.

Exemplo 5.7: Despiste de estirpes transformadas com pe1A pela formação de halos no meio sólido contendo pectina

Conídios de estirpes transformadas com pelA foram inoculadas a uma densidade de esporos de aproximadamente 40 colónias por placa de Petri , em papéis de filtro esterilizados (Schleicher and Schuell) que foram postos no topo de meio mínimo solidificado com 1% de agar contendo 0,01% de Triton X-100 e pectina de maçã (1% d.e. 72,8% Obipektin) como fonte de carbono. 0 período de incubação foi de 72 horas a 30°C resultando em colónias indi viduais (2-4 mm). 0 papel de filtro foi transferido para uma outra placa de Petri esterilizada e a placa contendo meio foi corada com pelo menos 5 ml de uma solução de vermelho de ruténio (0,1% p/v) ém água destilada, incubado durante 2 horas e depois lavado várias vezes com água destilada para remover o corante não adsorvido, seguindo essêncialmente um processo descrito por Ried e Collmer (ref. 17) para poligelacturonato para caracterizar as actividades da enzima pectato-1iase bacteriana.

Os transformantes superprodutores da proteína PLA foram detectados por um aumento no diâmetro do halo à volta das colónias individuais comparado com a estirpe parental N400.

Exemplo 6: Isolamento e purificação e caracterização de pectina -1iase A (PLA) a partir do transformante A 15 de A . niger pe1A

Exemplo 6.1: Condições de cultura para preparar pectina-1i ase A transformante A15 de A. niger pelA descrito no Exemplo 5 foi cultivado em meio completo em placas de Petri durante 3 dias a 28°C para produzir conídios. Os conídios foram colhidos destas placas suspendendo os esporos em 5 ml de soro fisiológico estéril contendo 0,005% de Tween 80. A suspensão foi agitada fortemente num agitador Griffin durante 20 min. Meio mínimo (ref. 21) contendo 1% (p/v) de pectina de maça (Brown Ribbon d.e. 72,8%; Obipektin AG, Bischofzell) foi inoculado a uma densidade de esporos de 10⁶ esporos/ml usando 250 ml de meio em frascos Erlenmeyer si 11 conizados de 1 1. 0 micélio foi cultivado durante 40 horas a 30°C usando um agitador orbital Gallenkomp a 200 rpm. Após cultura o micélio foi removido por filtração através de Miracloth usando um funil Biichner. 0 filtrado da cultura (ref. 21) foi diluido com água destilada (ref. 21), o pH do filtrado (pH 3,7) foi levado a pH 6,0 usando 1N NaOH e depois filtrado novamennte usando papel de filtro Whatman 1.

Exemplo 6,1: Purificação de PLA filtrado da cultura diluido ( 4 1) foi aplicado a uma coluna de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (10 cmx 2,6 cm), pré-equi1ibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM pH 6,0. A coluna foi eluida com o mesmo tampaõ até a absorvância a 280 nm atingir um valor / 0,1 O.D.

A actividade de pectina-1iase foi então eluida da coluna

aplicando um gradiente linear composto por tampão fosfato de sódio 20 mM (150 ml) e tampão fosfato de sódio 20 mM contendo 1M NaCl (150 ml).

As fracções foram testadas quanto à presença de pectina-1iase activa de acordo com o processo descrito por van Houdenhoven (ref. 18 p. 11) usando pectina Brown Ribbon (d.e. 72,8% )como substrato. A actividade aparece à volta de uma concentração de 0,43 m NaCl no gradiente salino. As fracç'oes activas foram reunidas e dialisadas duas vezes contra 1 1 de tampão 20 mM piperazina-HCl pH 5,5 (tamanho da amostra : 45,5 ml). No passo seguinte a amostra dialisada foi dividida em 3 porções de igualtamanho que foram sujeitas a cromatografia de permuta aniónica em três corridas separadas usando uma coluna MONO Q Pharmacia convencional em combinação com o sistema FPLC Pharmacia. A coluna foi pré-equi1ibrada com tampão 20 mM piperazina-HCl pH 5,5. Após aplicação da amostra de enzima a coluna foi eluida com o mesmo tampão a um caudal de 1 ml/min até a linha de base de absorvância ser novamente atingida. Em seguida aplicou-se gradiente salino linear. Após 22 ml de tampão de eluição aplicado na coluna atingiu-se uma concentração final de 0,6M NaCl.

A fracçao activa (4,4 ml) foi colhida, diluída para 25 ml usando tampão de equilíbrio e repetido o mesmo processo cromatográfico.

Duas fracções contendo a enzima activa (volume final total de 3 ml) foram então dialisados contra um tampão 25 mM piperazina pH 5,0 e injectadas em porções de 1 ml numa coluna ΜΟΝΟ P (Pharmacia), pré-equilibrada com o mesmo tampão. Após as injecções formou-se um gradiente de pH usando uma solução a 5% de politampão TM74 (em água destilada levada a pH 3,0 usando HC1 4N). A enzima activa (3,2 ml) surge à volta de pH 3,2. A prepara-79-

ção foi extensivamente dializada contra tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 e guardada a -20°C. Os resultados de purificação estão resumidos na Tabela Vila e foram comparados com os dados de uma purificação semelhante para a pectina-liase produzida por A. niger estirpe N400 (Tabela Vllb).

Tabela V11a e V11b Esquema de purificação da pectina-1 iase A a partir do transformante A. niger pelA N593 e da pectina-1iase de A. ni-

ger estirpe N400
V11 a
Passo	Volume	Actividade total	Actividade es-
	m 1	(i.u.)	pecífica da pect i na-1iase ( U . I. /mg de pr teina)
DEAE Sepharose cromatografia	45,5	39 ,8	4,9
em MONO Q	2,3	19,9	18 ,4
(2 x) cromatografia em MONO P	3,2	17,4	28,6
VI Ib tipo selvagem
DEAE Sepharose cromatograf i a	43 ,0	10 , 1	0,9
em MONO Q crómaí^graf i a	1,1	2,5	6 ,3
em MONO P	1,4	1,7	10,0

-80As concentrações de proteína foram determinadas usando o reagente para ensaio de proteína BCA (lierce) de acordo com as instruções do fabricante.

Comparado com a actividade total tipo selvagem a actividade total de A. niger N592 transformado com pGW820 aumentou após purificação cerca de 10 vezes e a actividade específica cerca de 3 vezes.

Exemplo 6.3: Determinação da sequência de aminoácidos da parte N-terminal da pectina-1iase A

500 ug de pectina-1iase A (PLA), purificada de acordo com o Exemplo 6.2, foram dialisadas três vezes contra 1 1 de água destilada filtrada por Millipore e 1 iofi1izadas . As sequências de aminoácidos foram determinadas com um sequênciador de proteínas Applied Biosystems modelo 470A, ligado a um analisador 120A PTH, de acordo com o método descrito por Hunkapiller (ref. 17). Determinou-se a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal para a enzima:

VAL-GLI -VAL-SER-GLI-SER-ALA-GLU-GLI-FEN-ALA-GLU-?-VAL-TRE-GLI-GLI-GLI-ASP-ALA.

A sequência de aminoácidos assim determinados corresponde exactamente à baseada na sequência de nucleotídeos do gene pelA (ver Exemplo 4.2).

\

-81Exemplo 6.4: Propriedades da pectina-1iase A

Tanto A. niger estirpe N400 como o transformante peIA A15 foram cultivados como descrito no Exemplo 6.1 e a seguir purificada a partir do filtrado da cultura de acordo com o processo no Exemplo 6.2. As duas preparações de enzima assim obtidas foram comparadas com pectina-1iase II que foi purificada de acordo com van Houdeshouven (ref . 18).

A electroforese em gel de SDS-poliacrilamida usando géis de 10% resulta numa única banda de peso molecular idêntico em todos os três casos aplicando em cada caso 2-5 ug de proteína.

A focagem isoeléctrica foi efectuada usando processos convencionais (ver e.g. panfleto de instruções da Pharmacia, Isoelectric Facusing, 1982). Usou-se o aparelho FSBE-3000 e a correspondente fonte ECPS 3000/ /150 (Pharmacia A PLA obtida mostrou-se homogénea quando da isoeiectrofocagem e tem um ponto isoeléctrico inferior (0,2 unidades de pH) ao de PLII descrito como sendo 3,75 de acordo com um Houdenhoven (ref. 18). APLII purificada a partir do filtrado da cultura N400 é heterogéneo na focagem isoeléctrica. A sonda principal corresponde em posição â proteína PLA. Duas bandas minoritárias descolaram-se ligeiramente para o cátodo. Assim no transformante A15 de A. niger com várias cópias não se observam as formas menos abundantes da enzima observadas em N400.

Uma comparação directa dos parâmetros cinéticos de PLA e de PLII, que no último caso foram estabelecidos por um Houdenhoven (ref. 18), usando pectina de maça esterificada a 95% como substrato indica idênticos valores de K_m e V_max para ambas as enzimas.

Exemplo 7: Isolamento, purificação e caracterização de pectina-Iiase D (PLD) a partir do transformante de A. niger pe1D D12

Exemplo 7.1: Condições de cultura para preparar pectina-1i ase D transformante de A. niger peID

D12 obtido de acordo com o Exemplo 5.2, foi inicialmente cul tivado de acordo com o Exemplo 5.5 em quantidade de 300 ml. Após um período de crescimento de 5 dias em PCM a 30°C, a partir de micélio foi então transferida para tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0), contendo cloreto de sódio 0,1M. Agitando o micélio em 150 ml num agitador orbital a 200 rpm durante 2 horas a maior parte da pectina liase foi libertada para o meio.

Exemplo 7.2: Purificação de PLD

Após remoção do micélio por filtração, a solução de enzima foi aplicada numa coluna de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (25 cm χ 1,25 cm) pré-equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0), contendo cloreto de sódio 0,2M. A coluna foi eluida com o mesmo tampão até a absorvância a 280 nm atingir um valor 0,1.

A actividade de pectina-1iase foi eluida da coluna aplicando um gradiente linear de cloreto de sódio (0,2 a 0,7M) em tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0 (volume total 800 ml). As fracções foram testadas quanto à presença de pectina-liaseD por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferência Western (Towbin et a 1., ref. 16) como descrito no Exemplo 5.6. As fracções contendo pectina-1iase D foram reunidas e dializadas contra tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0) contendo cloreto de sódio 0,15M e sujeitas a cro-83-

matografia de permuta aniónica usando uma coluna MONOQ convencional Pharmacia em combinação com o sistema de FPLC.

Após aplicação, a coluna foi lavada com o mesmo tampão antes de aplicação de um gradiente linear de 50 ml de cloreto de sódio em tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0). As fracçoes activas foram colhidas e quantidades de 1 ml foram aplicadas à coluna de permeação de 100 ml de gel Superose-12, equilibrada em fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0) contendo cloreto de sódio 0,2M e ligada ao sistema FPLC. As fracçoes de enzima activas (1 ml cada) obtidas a partir da coluna GPL foram analisadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida para testar a pureza da pectina -1iase obtida.

Tabela VI11 Esquema de purificação da pectina-1 iase D a partir do transformante de A. niger

Passo	Volume (ml )	Act i v idade (u. I. )	Actividade es pecifica de pectina-1iase (UI /mg/proteína)
filtrado da cultu ra	1950	109	0,096
DEAE-SepharoseFF	103	32 ,2	5 ,65
MONO Q e GPC	14,5	10,4	7,5

Exemplo 7.3: Determinação da sequência de aminoácidos da parte N-terminal da pectina -1iase D

500 pg da pectina-1iase D, purificada de acordo com o Exemplo 6.2 foram dializados três vezes contra 1 1 de água destilada filtrado por Millipore e liofilizada. As sequências de aminoácidos foram determinadas com um sequênciador de proteínas Applied Biosystems modelo 470A, ligado ao analisador 120A PTH, de acordo com o método descrito por Hunkapillar (ref. 19).

Determinou-se a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal para a enzima:

VAL-GLI -VAL-SER-GLI-TRE-PRO-VAL-GLI-FEN-ALA-SER-ALA-TRE-GLI-GLI-GLI-ASP-ALA-TRE

A sequência de aminoácidos determinada corresponde exactamente à baseada na sequência de nucleotídeos do gene pe1D.

Exemplo	8.	Isolamento, purificação e caracterização de
pectina-1iase B(PLB) a partir do transforman-
te B13 de A. niger
Exemplo	8. 1	: Condições de cultura para preparar pectina-lia-
		se B

transformante A. niger pelB B13 obtido de acordo com o Exemplo 5.2 foi analisado quanto à existência de várias cópias de acordo com o Exemplo 5.3. Análise de transferência Northeran, de acordo com o processo descrito no Exemplo 5.4, mostra que foi produzido um mRNA induzível por pectina com um comprimento de aproximadamente

-851,6 kb. A cultura durante 35 horas a 30°C em meio mínimo contendo 1% (p/v) de pectina de citrino (d.e. 72,8%) e 1% de farelo de trigo foi usado para produzir a enzima como descrito no Exemplo 5.4. A enzima foi também produzida usando um meio composto de 4% de polpa de beterraba açucareira e 1% de NH^HOg.

Exemplo 8.2: Purificação de PLB filtrado da cultura foi diluído duas vezes com água destilada e o pH levado até pH 6,0 usando 1N NaOH e depois novamente filtrado usando papel de filtro Wchtman 1. 0 filtrado diluido (2 1) foi então aplicado a uma coluna de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (9 cm χ 3,2 cm) que foi pré-equi1ibrada com tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0. Parte da actividade de pectina-liase está presente no eluato conforme pode ser testado pelo processo descrito por van Houdenhober (ref. 18, p. 11) usando pectina Brown Ribbon (d.e. 72,8%) ou pectina altamente esterificada (d. e. 94%). A maioria da actividade de pectina-1iase pode ser eluida aplicando um gradiente salino. Esta actividade surge no gradiente salino e é idêntica à PLA com base no comportamento de eluição e peso molecular aparente por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida como descrito no Exemplo 6.

eluato da coluna DEAE Sepharose Fast Flow foi dializado contra água destilada e aplicado numa coluna MONO S (Pharmacia) a qual foi préviamente equilibrada com tampão acetato de sódio 20 mM pH 4,5. A enzima foi eluida da coluna por aplicação de um gradiente salino de cloreto de sódio 0-1,0M no mesmo tampão. A enzima foi eluida quase imediatamente da coluna. As fracções activas foram reunidas e depois diluídas aproximadamente quatro vezes com água destilada. Nova cromatografia da so-86-

lução de enzima resulta em fracções que contem a proteína PLB pura com base em electroforese em gel de SDS_poliacri1amida.

Exemplo 8.3: Propriedades da pectina-1Iase B

As propriedades da enzima purificada a partir do transformante peIB B13 de acordo com o EXemplo 8.2 foram determinadas e comparadas com pectina-1iase A e D.

A electroforese em géis de SDS-poliacrilamida usando géis de 10%, resulta numa única banda com um peso molecular aparente de 39,7 KDa. Nas mesmas condições a massa molecular aparente de PLA e PLD é de 49,1 KDa e 52,3 KDa respectivamente.

A focagem isoelectrica foi efectuada como descrito no Exemplo 6.4. 0 ponto isoelectrico de PLB é 6,0 usando um gradiente de pH antes pH 3 e 7. A amostra é aplicada aproximadamente numa posição correspondente a um pi de 5,0.

A enzima PLB purificada também reage com anticorpos policlonais preparados entra PLI e PLII conforme testado por análise de transferência Wostern. PLD, A e B podem ser fácilmente descriminadas deste modo pelos seus valores do peso molecular aparente.

-87Exemplo 8.4: Propriedades cinéticas de PLB

A enzima purificada de acordo com o Exemplo 8.2 foi caracterizado cinéticamente. A enzima catalisa uma reacção de pectina-1iase e é activa numa larga gama de pH (pH 5-9,5) conforme testado em tampão Mc Ilvane (u = 0,5) de diferentes valores de pH (van Houdenhoven, ref. 18). 0 pH óptimo é largo (pH 7,5-8,5). A pH 6,0 a actividade é de aproximadamente 55%, a pH 9,5 esta é ainda 85% da activi ade a pH 8,0. Tanto pectina-1iase altamente esterificada (d.e. 94%) como pectinas com um grau de esterificação mais baixo tal como a pectina de maçã Brown Ribbon (d.e. 72,8%, Obipektin AG Bischoffze11 ) podem ser usadas como substrato. A actividade mais alta é obtida com pectina altamente esterificada. A enzima não reage com poliga1acturonato.

A reacção de pectina-1iase catalisada por PLB pode ser inibiad pela adição de EDTA A mistura de reacção (3 mM foi a concentração final usada); a enzima

Λ é reactivada pela adição de iões Ca^z+ em excesso. Assim peIB codifica uma pectina-1iase dependente de Ca^⁺. A 25° a enzima tem um número de renovação de 5500 e um valor de km de 2,5 mM quando se usa pectina altamente esterificada como substrato. Estes valores foram determinados de acordo com o processo de van Houdenhaven (ref. 18) usando um tampão Mcllumine de pH 8,0 (p = 0,5).

BAD ORIGINAL

-88Exemplo 9 Expressão e secreção de genes estranhos sob o controle do promotor pelA fragmento Hindlll de 3,9 kb do plasmídeo pGW820 foi subclonado no sítio Hindlll do pBR322.

DNA de plasmídeo dos transformantes resistentes à ampicilina foi analisado por digestão com as enzimas de restrição Hindlll e Sall. Um clone que contem a inserção pe1A na orientação dos ponteiros do relógio foi designada pGW822. 0 promotor induzível de pelA foi usado para expressar genes estranhos em A. niger. 0 gene pelA completo está presente no plasmídeo pGW820. 0 promotor e a sequência sinal pe 1A estão num fragmento BamHI-PstI de 1 kb. 0 sítio de clivagem PstI na posição de nucleotídeo 1420 (Fig. 10) coincide com o extremo 3' da sequência sinal e pode ser usado para a fusão na mesma grelha de leitura da sequência codificadora de uma proteína estranha. Os sinais de terminação da transcrição de pe1A estão num fragmento SalI-HindIII de 1,3 kb.

Exemplo 9.1: Subclonagem do gene pelA no vector pUC19 fragmento BamHI-HindIII de 3,3 kb do plasmídeo pGW822 contem o gene pelA. 0 fragmento foi cionado no vector pUC19 (Pharmacia) cortado com BamHI e Hindlll. Os fragmentos purificados foram ligados. Uma amostra da mistura de ligação foi usada para transformar células JM109 competentes tratadas com Ca²⁺. A clonagem com êxito do fragmento BamHI-HindIII de 3,3 kb em pUC19 foi seleccionado em placas de ampicilina na presença de X-Gel e IPTG (T. Maniatis et al em Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring, Harbor Laboratory, 1982, p. 52). Repicaram-se os transformantes brancos resistentes â ampicilina. 0 DNA de plasmídeo destas colónias foi analisado

-89por dupla digestão com BamHI/HindIII. Um transformante com uma inserção correcta foi designado como pUC19/pelA. Uma construção análoga com pUC18 resulta em pUC18/pelA.

Exemplo 9.2: Expressão de interferão hibrido humano BDBB sob o controle do promotor peIA

9.2.1: Construção do plasmideo pUC 19/pelA-IFN AM119 (ver

Figura 14 ) plasmideo pUC19/pelA foi digerido com Sall. Os extremos coesivos do fragmento linear foram preenchidos numa reacção com DNA-polinurase I Klenow (BRL) na presença de dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 0,1 mM cada, 60 mM Tris-HCl, pH, 7,5, 10 mM MgCl₂ durante 30 min â temperatura ambiente. A reacção foi parada pela adição de EDTA para uma concentração final de 12,5 mM. 0 DNA foi purificado com etanol. 0 fragmento de DNA linear foi digerido com PstI. Após extracçâo com fenol/clorofórmio o DNA foi precipitado com etanol .

Um oligodesoxinucleotídeo adaptador da fórmula

PstI Ddel (I) 5'- TGTGATÇTGCC -3' (II) 3'- ACGTACACTAGACGGAGT -5' foi ligado ao sítio PstI do plasmideo linearizado. 0 adaptador preenche o extremo protuberante 3' do sítio PstI que

-90colncide com o extremo da sequência sinal pe1A e estabelece a fusão na mesma grelha à sequência codificadora do interferão BDBB. (I) representa a sequência de nucleotídeos 5' terminal do gene do interferão BDBB até ao sítio de restrição D de T.

200 pmoles de cada um dos oligonucleotídeos (I) e (II) foram fosforilados e emparelhados. 0 plasmídeo pUC19/pelA cortado com PstI e um excesso molar de 100 vezes do DNA adaptador de cadeia dupla foram ligados em 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 5 mM DTT e 400 unidades de DNA-ligase de T4 durante 16 horas a 15°C. A DNA-ligase foi inactivada durante 10 min. a 85°C.

excesso de adaptadores foi removido por precipitação na presença de 10 mM EDTA, 300 mM acetato de sódio pH 6,0 e 0,54 volumes de isopropanol.

fragmento grande de 5 kb foi isolado num gel preparativo de 0,6% de agarose. 0 fragmento compreende o promotor pe1A e a sequência sinal (BamHI-/Pst17/-adaptador) e o terminador pe1A (/Sal I_7cersc-Hind111 ) no vector pUC 19.

plasmídeo pJDB207/PH05-IFN AM119 (EP 205 404 ) contem o gene do interferãoCx( hibrido BDBB sob o controle do promotor regulado da fosfatase ácida de levedura (PH05). 0 DNA de plasmídeo foi digerido com BamHI e HindIII, o fragmento BamHI-HlndlII de 1,3 kb foi isolado e contem o promotor PH05, a sequência codificadora do IFN BDBB e as sequências de terminação de transcrição de PH05.

fragmento foi purificado por cromatografia em DE52 e precipitação com etanol e ainda digerido com Taql. Os extremos coesivos dos fragmentos de restrição Taql foram preenchidos numa reacção com DNA-PolimeraseI Klenow (BRL) na presença de dCTP e dGTP 0,1 mM cada, 60 mM Tris.HCl pH 7,5, mM MgCl₂ durante 30 min à temperatura ambiente. A reac-91ção foi parada pela adição de EDTA para uma concentração final de 12,5 mM. Os fragmentos de DNA foram precipitados com etanol e ainda digeridos com Ddel. 0 fragmentos de DNA foram separados num gel preparativo de 0,8% de agarose. 0 fragmento DdeI-/’Taql7 cerca de 549 pb foi electroeluido do gel, purificado por cromatografia de permuta iónica em DE52 e precipitação com etanol. 0 fragmento de DNA foi ressuspenso em E^O numa concentração de cerca de 0,1 pmoles/u1.

0,2 pmoles do fragmento Ddel-/Taq-17 cersc de 549 pb e 0,1 pmoles do fragmento vector de 5 kb foram ligados em 10 ul de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT e 200 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs) durante 1 6 horas a 15°C. Uma quantidade de 1 ul da mistura de ligação fci usada para transformar céΛ lulas HB101 competentes tratadas com Ca^⁺.

DNA do plasmideo foi preparado a partir de 12 colónias transformadas resistentes à ampicilina e analisado por digestão com EcoRI, PvuII, Ciai e EcoR I/Hind111. Seleccionou-se um clone com o padrão de restrição esperado. A fusão correcta na mesma grelha da sequência sinal pe1A e da sequência codificadora madura do interferão BPBB foi verificado por sequênciação de DNA. 0 DNA do plasmideo do clone seleccionado foi designado pUC19/ /pelA-IFN AM1 19.

Uma construção análoga com pUC 15/ /pelA resulta no plasmideo pUC18/pe1 A-1FN AM119.

-92Exerrplo 9.2.2 : Contransfornjação co Aspergi 11 us niger mutan te AnD com pCC59D7 e pUCi9/pe1 A-JFN AM1I9 muténte auxotiíficc para a uridina An8/ = DSM 3917, descrito em EP 88 101 397.3) foi transformado com o plasmideo pCG59D7 para dar prototrofia para uridina. Juntamente ccr.i c plasmideo transformante adicionou-se o plasmideo não selectivc pUC 19/pelA-IFN AnH19 para dar coirtegrantes ao acaso cuantío da cr.t ransformação.

Os esporos de conídios de A. niger An8 foram cultivados durante 4 dias, a 28°C em meio compleQ to té totalmente esporulados 2x10 conidiósporos foram usados para inocular 200 ml de meio mínimo suplementado com 1 g/1 de arginina e uridina.

Após 20 horas de crescimento a 28°C e 180 rpm o micélio foi colhido por filtração através de Miracloth, lavado duas vezes com 10 ml de 0,8M KC1, 50 mM CaCl₂ e ressuspenso em 20 ml de 0,8M KC1 , 50 mM CaCl₂, 0,5 mg/ml de Novozym 234 (Novo Industries). A mistura foi incubada num banho-maria com agitação (30°C, 50 rpm) até a libertação de protoplastos poder ser detectada por microscopia (90-120 minutos6. A suspensão de protoplastos foi filtrada através de uma almofada de lã de vidro num funil para remover os detritos de micélio. os protoplastos foram sedimentados por centrifugação ligeira (10 min., 2000 rpm) à temperatura ambiente e lavados duas vezes com 10 ml de 0,8 M KC1, 50 mM CaCl₂. Os protoplastos foram finalmente ressuspensos em 200-500 jul de 0 ,8M KC1, 50 mM CaCl₉ para 8 dar uma concentração de 1x10 /ml.

Para transformação uma amostra de 200 pl da dispersão de protoplastos foi incubada com 5 pg de pCG59D7 e 10 yug de DNA de pUC19/pelA-IFN AM119, 50 pl

BAD ORIGINAL

PCT/10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl_2> 25% PEG 6000). A mistura de incubação foi mantida em gelo durante 20 min, adicionou-se mais 2 ml de PCT e incubou-se a mistura durante mais 5 min ã temperatura ambiente. Adicionou-se 4 ml de 0,8M KC1, 50 mM CaCl₂ e amostras de 1 ml da solução de transformação final foram misturadas com meio mínimo de agar liquified (Meio mínimo + 1 g/1 arginina + 10 g/1 Bacto-Agar (Difco) ) , estabilizado com 0,8M KC1. As misturas foram imediatamente vertidas sobre placas de agar do mesmo meio e incubadas a 28°C.

Após 2-3 dias de crescimento a 28°C , os transformantes estáveis surgiram como colónias de crescimento vigoroso e esporulantes sobre um crescimento de fundo de muitos centenas de pequenas transformantes presumivelmente abortivos.

Exemplo 9.2.3: Expressão do gene do interferão híbrido BDBB sob o controle do promotor pelA transformantes da experiência de cotransformação (Exemplo 9.2.2) foram repicados e analisados quanto à expressão de interferão. A actividade de interferão foi determinada de acordo com o processo de Armstrong (J.A. Armstrong , Appl. Microbiol. 2 1 , 732 ( 197 1 )) usando células humanas CCL-23 e o vírus da estomatite vesicular (VSV) como vírus de desafio.

Os esporos dos cónídios dos transformantes foram pré-cultivados individualmente em 50 ml de um meio de pré-cultura (Pectin Slow Set L (Unipectina SA, Redon, France) 3 g/1, NH₄C1 2 g/1, KH₂P0₄, 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, Mg₂S0₄ x 7H₂0 0,5 g/1, Ca₂S0₄ x 2Η_£0 0,5 g/1, pH

7,0). A pré-cultura foi incubada durante 72 horas a 250 rpm e 28°C. 10% da pré-cultura foi usado para inocular 50 ml de meio de cultura principal (Farinha de soja 20 g/1, pectina Slow Set 5 g/1). A cultura foi crescida durante 72-96 horas a 250 rpm e 28°C. A vários tempos (de 20 em 20 horas) retiraram-se amostras, as células foram sedimentadas por centrifugação e rebentadas por desintegração ultra-sónica. Os sobrenadantes e extractos celulares foram ambos testados quanto à actividade de ínterferão como descrito (supra). 0 grosso da actividade de ínterferão encontra-se secretado para o meio.

Exemplo 10: Construção do plasmideo Μ13(+) KS/peI Ass-1FN

AM 119

A cassete de expressão de 2,8 kb do pia mídeo M13(+)KS (pelA Ass-IFN AM1 19 compreende o promotor pelA induzível, a sequên ia codificadora do interferão híbrido BDBB e o terminador da transcrição pelA no vector Bluscript M13(+)KS. 0 ínterferão híbrido BDBB será expresso e localizado na célula hospedeira. 0 plasmídeo M13( +)KS/pelA Ass-IFN AM119 é derivado de pUC 18/pe1 A-1FN AM119 (ver Exemplo 9.2.1). A sequência sinal pelA (ss) foi removida por mutagenése dirigida (ver Fig. 15). 0 interferã híbrido expresso a partir da construção sem sequência sinal espera-se que esteja situado no citossol.

Exemplo 10. 1 Subclonagem da cassete pelA-IFN AM 119 no vector Bluescript M13(+)KS plasmídeo pUC 18/pe1A-1FNAM 119 (ver Exemplo 9.2.1) foi digerido com BamHI e HindIII. 0 fragmento BamH I-Hind 111 de 2,8 kb contem o promotor peIA , e sequência sinal, a sequência codifi adora de IFN BDBB e o terminador de pelA. 0 fragmento BamHI-Hind111 foi isolado e ligado ao vector Bluescript M13(+)KS (Stratagene) , cortado com BamHI e HindIII. Uma amostra da mistura de ligação foi usada para transformar células JM109 competentes tratadas com cálcio. A clonagem com êxito do fragmento BamHI-HindlII de 2,6 kb em M13(+)KS foi seleccionada em placas de ampicilina na presença de X-Gal e 1PTG. Repicaram-se 12colónias brancas resistentes à ampiaiina. 0 DNA de plasmídeo destas colónias foi analisado por dupla digestão com BamHI/BglII. Um transformante com a inserção correcta foi desig ado M 13(+ )KS/pe1 A-1FN Am119.

Exemplo 10.2: Recuperação de DNA de cadeia simples a partir de células contendo o plasmídeo Bluescript M13(+ )KS plasmídeo M13( + )KS/pelA-IFN AM 119 foi usado para transformar £. co1i estirpe CJ 236 competente (dut-1 , ung-1 , Thi-1, rei A-1 ; pCJ105 (Cm^M); Kit de mutagenése in vitro Muta-Gene M13 BTO-RAD), Esta estirpe permite a incorporação de uracilo no DNA. CJ236 foi cultivada em 10 ml de meio LB cont ndo 100 mg/ml de ampicilina. Numa θΟθθθ de 0,5 as células foram superinfectadas com o fago M13K07 (Mead et a 1 ref. 29) numa multiplicidade de infecão de 50. Após uma hora a 37°C adicionou-se casamicina (50 mg/ml e a cultura foi incubada a 3/°C num agitador durante 5 a 6 horas. A cadeia não codificadora relativamente â inserção pelA-IFN AM119 do plasmídeo M13(+)KS/pelA-IFN

-96ΑΜ119 foi sintetizada, encapsidada e libertada para o meio. Pre arou-se DNA de cadeia simples a parti do sobrenadant de cultura de acordo com Kunkel et al (ref. 30).

Exemplo 10.3: Mutagenése dirigida com olígonucleotídeo no DNA molde de cadeia simples

A mutagenese dirigida por delecção ftã efectuada na cadeia simples não codificadora do molde peIA-1FN AM 119 para remover a sequência sinal peiA (Fig. 15).

iniciador mutegénico compreende parte da sequência do promotor pe1Ã incluindo o ATG (posição de nucleotídeo 1343 a 1363 na Fig. 10) e 21 nucleotídeos codificadores dos aminoácidos 1 a 7 do IFN BDBB maduro.

Para a mut génese 200 pmoles do iniciador mutagénico for m fosforilados em 20 pl de 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 5 mM DTT e 0,5 mM ATP usando 8 unidades de poiinucleotídeos-cinase de T4 (Boehringer).

Após uma hora a 37°C a reacção foi parada por aquecimento a 65°C durante 10 min.

0,2 pmoles do molde de cadeia simples foi in ubado com 10 pmoles do iniciador oligodesoxirribonucleotídeo mutagénico fosforilado e 10 pmoles do iniciador de sequênciação universal M13 em 30 pl de 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM DTT a 80°C durante 5 min. A solução foi deixada arrefecer lentamente até à temperatura ambiente durante um período de 30 minutos.

A mistura emparelhada juntou-se 10 pl de solução de enzima-dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) contendo 1 pl de tampao

-97/~0,2M Tris.HCl pH 7,5, 0,1M MgCl₂ 7, 5 pl de mistura de dNTP 2 mM, 0,5 ul de 20 mM ATP, 1 pi de 0,2M DTT, 0,5 pl de DNA-ligase de T4 (Biolabs, 400 U/pl) e 1,2 pl de DNA polimerase Klenow (BRL, 5U/ul). A mistura foi incubada a 15°C durante 16 horas. A reação foi parada por incubação a 65°C durante 10 min.

pi e 3 pi da mistura de ligação foram usados para transformar 0,2 ml de células competentes da estirpe refair-minus E. coIi MV1190 (1ac-pro- AB), thi, supE, /1 ( sr 1-recA )306 : : Tn 10 (tet^r) ( F ¹ : TraD36 , proAB , ac I ΖA M15) 7- A estirp MV 1190 estã descrita no manual do kit de mutagenese in vitro MUTA-GENE Mi3 BIO-RAD. Repicaram-se 12 colónias resistentes â ampicilina. 0 DNA de pias ídeo foi preparado e analisado por digestão com Seal.

A remoção da sequência sinal pelA remove também um sítio Seal. Os piasmídeos correctos foram linearizados no sítio Seal no vector Bluescript. Um plasmídeo foi pósteriormente analisado. A junção correcta entre o promotor peIA e a sequência codificadora para o IFN BDBB híbrido com o ATG incluído foi confirmado por sequênciação de DNA. Uma construção correcta foi designada M13(+ )KS/pe 1A Ass-IFN AM 119.

Exemplo 10.4: Cotransformação de A. niger e expressão do interferão híbrido

Os piasmídeos M13(+)KS/pe1A Ass-IFN AM119 e pCG59D7 foram usados para cotransformar A. niger mutante An8 de acordo com o Exenplo 8.2.2. Os transformantes foram cultivados como descrito no Exemplo 8.2.3. A vários tempos (todas as 20 horas) retiraram-se amostras, as células foram sedimentadas por centrifugação e rebentadas por desintegração com ultra-sons. Os extractos celulares foram testados quanto â actividade de interferão (supra).

grosso da actividade de interferão encontra-se dentro da célula.

Depósito de microorganismos

Os microorganismos que se seguem foram depositados de acordo com o Tratado de Budapeste na

Deutsche Sammlung v D-3300 Braunschweig n Mikroorganismen,

Mascheroder Weg lb,

Microorganismos

Escherichia	coli	HB
Escherichia	coli	HB
Escherichia	coli	HB
Escherichia	coli	HB
Escherichia	coli	HB

		Dep.	Nr.
01/pGW	820	DSM	4388
01/pGW	830	DSM	4389
01/pGW	850	DSM	4390
01/pGW	860	DSM	4391
01/pGW	880	DSM	4392

Data de Dep.

February	1.	1988
February	1,	1988
February	1,	1988
February	1,	1988
February	1,	1988

-99Referênc i as

1. Yelton, M.M. , Hamer, J.E. and Timberlake, W.E.(1984 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 1470-1474.

2. Frischauf, A.M. , Lehrach, Η., Poustra, A. and Murray, N. (1983)

J.Mol. Biol. 170, 827-842.

3. Karn, J., Brenner, S., Barneff, L. and Cesareni, G. (1980) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 7 7, 5172-5176.

4. Benton, W.D. and Davis, R.W. (1977) Science 196, 180-182.

5. Haniatis, T. , Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) in: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Harbor, New York.

6. BRL. Ml 3 cloning/dideoxy sequencing instruction manual.

7. Dente, L., Cesareni, G. and Cortese, R. (1983) Nucl. Acids Res. 11, 1645-1655.

8. Dente, L., Sollazzo, Μ. , Baldari, C., G. Cesareni and R. Cortese. in: DNA Cloning vol. 1. a practical approach ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford 1985.

9. Russell, Μ. , Kidd, S. and Kelley, M.R. (1986) Gene 45, 333-338.

10. Caruther, M.H. Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments: a laboratory manual, Verlag Chemie (1982).

11. Ballance, D.J. (1986) Yeast 2^ 229-236.

12. Goosen, T., Bloemheuvel, G., Gysler, Ch., de Bier, D.A., van den Broek, H.W.J. and Swart, K. (1987) Current Genetics 11, 499-503.

-10013. Boeke, J.D., Lacroute, F. and Fink, G.R. (1984) Mol. Gen. Genet. 197 345-346.

14. Slater, R.J. (1984) in: Methods in Molecular Biology vol. 2 Ed. J.M. Walker, The Humana Press Inc.

14a.Hinnen A., Hicks J.B. & Fink G.R. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 75, 1929-1933.

15. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 681-682.

16. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7 6, 4350-4354.

17. Ried, J.L. and Collmer, A. (1985) Applied and Environm. Microbiol. 50, 615-622.

18. van Houdenhoven, F.E.A. (1975) Ph.D. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands.

19. Hunkapiller, M.W. (1985) PTH Amino Acid Analysis, User Bulletin no. 14 Applied Biosystems.

20. Zissler, J. et al. (1971) in: The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Labs, New York, A.D. Hersley editor.

21. Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J. (1983) Gene 26, 101-106.

22. F.E.A. von Houdenhoven. Ph.D. Thesius Agricultural University, Wageningen in Communications Agricultural University Wageningen,

The Netherlands 75-13 (1975).

23. Birnboim H.C. & Doly J. (1979). Nucleic Acids Res 7, 1513-1523.

24. Boel Ε., Hansen M.T., Hjort I-, Hoegh I., Fiil N.P. (1984).

EMBO J. 3, 1581-1585.

-10125. Mount S.M. (1982). Nucleic Acids Res.10. 459-472.

26. Ballance D.J. and Turner G. (1985), Gene 36, 321-331.

27. Hermersdòrfer H, Leuchtenberger A, Wardsack Ch and Ruttloff H (1907) Influence of culture conditions on mycelial structure and polygalacturonase synthesis of A. niger. J. Basic Microbiol. 27, 309-315.

28. Henikoff, S. (1984) Gerne 28, 351-359.

29. Mead et al., (1986) Protein Engeneering 1, 67.

30. Kunkel et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 485.

-102-

Claims

REIVINDICAÇÕES

1³. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA codificadora do sistema de expressão das pectinas-1iases PLA, PLB, PLE ou PLF ou um seu derivado, caracterizado pela cultura de um hospedeiro transformado com uma molécula de DNA contendo uma sequência de DNA codificadora do sistema de expressão das pectina-1iase PLA, PLB, PLC ou PLF ou um seu derivado e isolamento da molécula de DNA recombinante pretendida ou um seu derivado ou sua preparação por uma sintese in vitro.
2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante compreeder o promotor, a sequência sinal, o gene estrutural ou o terminador de qualquer um dos sistemas de expressão PL ou qualquer combinação destes fragmentos.
3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante compreeder uma sequência de DNA da fórmula I ou um seu derivado.

-103- (Formula I): pelA

PvuII

CAGCTGGACCCGAAATATGATTGATAGGGGCAACGTCACTCCATCTCCCCTGATTCGTGA

10 30 50

TAAAAATGAGTTATGATTGATGCCTACGGAGTCCCAGATACTCCCACCTTATCCTGACCA

70 90 110

GTCACCCGTTCAGACTGGATGACAAAATCATCAGTCAACCAACTAGATCGGTGCTAAAAA

130 150 170

Xhol Sall

TGGACGGCTAAATTTCTGCACTGGATTCGAAACTCGAGGAGCAATAGCTGCCCGGAGGTC

190 210 230

EcoRV

GACTTGATGGGTGGTGTCCTGATATCGCCGAAGCCCGAAGGTTCCACTGTGGGCCACTTG

250 270 290

ACCGGCGTTCCTGGCGCCTTACCAAGAACGCCTAATTCGTGGCTTTTTTCTTTTCTTTTT

310 330 350

PvuII

TTTTTCTTTACTTTGCGCAGCTTTTCCAGCTGCTCTCATTTGACTAGAAGACCGACTGGA

370 390 410

BamHI

GATATAGAGAGGCGTGGGGAGATACTGGATCCATTAATAATCGAAACGGAAACGGTCTCA

430 450 470

GGTGGAGGCTAAACCTTTCAAAGAAGCTGGATTCGTGATGCAAAATTGTTTCCCCCCCGG

490 510 530

TTCCCCTCTTGTTCTTCACCACTGATGAACAGCCCTAACTGTCGAGCACGTCCAGCCTTC

590

570

550 (contd.)

-104(contd.)

CATCCGTAACATCCTCAAACTACTAGCTACACCCTGATGGTCGGATTCGGTATTTTCCCG

610 630 650

ACTATCATTGCCACAAGGACTCTGCCAAGACGGAGGAATTGCTTCTTTACAGAATTTCAA

670 690 710

TCGCGAGGTCCACCAGCCCGAGTGGATGGACTAGTTACTTTAGACTACCGTGACTAAGTC

730 750 770

GCCGGCGCGGGCATCATGAAACGCCGTAAATCCCCCGACTCCCTCCTAAGATCCACCTAT

790 810 830

GACCTTCAACAGCCTGCAAGACAGTGGGCTGTCCAGCTCAGTGTCCACGAACAGGGGCCA

850 870 890

TCACCGTGATGGACAACCATGTGGCTACGACTCCTCCCTCCCCCTTCCAATCTTGGTTGT

910 930 950

Ciai

CATCGATGCCTATCACTCCATCCATGGTCCGATACGATGGACCCCCTTCAATCTACTTGC

970 990 1010

TCGGCCAGTACCGACTTTAGCGCCGGTGGACTGACCCAGAAGAATCAACGGTTTTGCTCA

1030 1050 1070

ATCGCCCTTGGCTACTAATCAAAGATGCACTTGGCCGTTTCATACCGATCACCCGTCCAA

1090 1110 1130

TTTACCCAGAATGGTCTGAGCCAGAGGGGAAGCTCTATCAGATTCTTGTCAAATGCTTCC

1150 1170 1190

GTCAACGAGTCAGTCTTCCCTATAAAAGGCCCCAATCCCATCCGTATTGACCTCTTCTCT • · 1250

1230

1210 (contd.)

- 105GTATCAAACCATTCCTTCCTTTTCTTTCCTTTTCTCTTCATACCTCTATCTTCACCTTAG

1270 1290 1310

Μ K Y S Τ I F

TCTTTCTTTCCCCTTCATAGCTGGTTCTACACACTTCACCATGAAGTACTCTACTATCTT

1330 1350 1370

PstI

SAAAAVFAGSAAAVGVSGSA

CAGCGCTGCTGCCGCTGTTTTCGCTGGTTCCGCCGCTGCAGTCGGCGTGTCCGGCTCTGC

1390 1410 1430

EGFAEGVTGGGDATPVYPDT

TGAGGGTTTCGCCGAGGGCGTCACCGGTGGCGGTGATGCCACCCCCGTCTACCCCGACAC

1450 1470 1490

Ciai

IDELVSYLGDDEARVIVLTK

TATCGATGAGCTGGTCTCTTACCTTGGAGACGATGAGGCCCGCGTCATTGTCCTGACCAA

1510 1530 1550

Kpnl Kpnl

TFDFTDSEGTTTGTGCAPWG

GACCTTCGACTTCACCGACAGCGAAGGTACCACCACTGGCACTGGTTGCGCTCCCTGGGG

1570 1590 1610

TASACQVAIDQDDWCENYEP

TACCGCTTCCGCCTGCCAGGTTGCTATTGACCAGGACGACTGGTGCGAGAACTACGAGCC

1630 1650 1670

DAPSVSVEY

CGATGCTCCCTCTGTCAGCGTTGAATAGTATGTCCTTGGGGATTGTCACCCGCTTCGATC

1690 1710 1730

YNAGVLGITVTSNK

TTGTATCTAACTTGGATAGCTACAACGCTGGTGTCCTCGGTATCACCGTCACCTCCAACA

1790

1770

1750 (contd.)

-106- |(contd.)

SLIGECSSGAIKGKGLRIVS

AGTCCCTCATCGGTGAGGGCTCCTCTGGTGCAATCAAGGGCAAGGGTCTCCGTATTGTCA

1810 1830 1850

GAENIIIQ

GCGGTGCTGAGAACATCATCATCCAGTAGGTTATGCTCGGTGTCATTAGGAATTTGCTCT

1870 1890 1910

NIAVTDINPKYVWGGD

CTAACGAAATCAGGAACATCGCGGTTACCGACATCAACCCCAAGTACCTCTGGGGTGGTG

1930 1950 1970

AITLDDCDLVWIDHVT

ATGCTATTACTCTTGATGACTGCGACCTGGTCTGGATCGACCATGTTACTGTACGTCTTC

1990 2010 2030

T A

ATCTTATTCAACTACTACATTATATTTCAAGAGCATTGAGTTAACATATGACAGACCGCC

2050 2070 2090

RIGRQHYVLGTSADNRVSLT

CGCATCGGTCGCCAGCACTACGTCCTTGGAACCAGCGCCGACAACCGCGTCTCTCTCACC

2110 2130 2150 nnyidgvsdysatcdgyhyw aacaactacattgacggtgtctccgactactccgccacctgcgatggctaccactactgg

2170 2190 2210 giyldgdadlvthkgnyiyh ggcatctacctcgatggtgacgccgacttggtcaccatgaagggcaactacatctaccac

2230 2250 2270 tsgrspkvqdntllhc acctccggccgtagccccaaggtccaggacaacactctcctccactgtgtaagttgcctt

2330

2310

2290 (contd.) (contd.)

-107-

V N N Y F Y

TTCTCTGCTGGCCGCTTCCGACCTGACTAATCATTGTTGCAGGTCAACAACTACTTCTAC

2350 2370 2390

DI SGHAFEIGEGGYVLAEGN GACATCTCCGGCCACGCTTTTGAGATCGGTGAGGGTGGCTACGTCCTGGCTGAGGGCAAC

2410 2430 2450

Sall

VFQNVDTVLETYEGAAFTVP

GTTTTCCAGAACGTCGACACCGTCCTTGAGACCTACGAGGGCGCGGCCTTCACCGTCCCC

2470 2490 2510

STTAGEVCSTYLGRDCVI NG TCCACCACCGCCGGTGAAGTCTGCTCCACCTACCTTGGCCGTGACTGTGTCATCAACGGC

2530 2550 2570

FGCSGTFSEDSTSFLSDFEG

TTCCGCTGCTCCGGCACTTTCTCCGAGGACAGCACCTCTTTCCTCTCCGACTTCGAGGGC

2590 2610 2630

KN IASASAYTSVASRVVANA AAGAACATTGCCTCTGCTTCCGCTTACACCTCTGTTGCCTCTCGCGTTGTTGCTAACGCC

2650 2670 2690

G Q G N L

GGTCAGGGCAACCTGTAAATGAGTTGACTCATTTATGGTAGATAGCAGTGGATGTAATCT

2710 2730 2750

AGGGGATGCGGCGTGCTTGAGAAGTTACCTTTCTTGTATCTACTTCTATAATAAATTATG

2770 2790 2810

GGGAGTGTTCACGACCCTAATCTGGTTGAATAACCAGCCGACACAATGACATTATTGTCT • « · · · ·

2830 2850 2870

ACAGAGTTTTCAAGTAGATATGTTCCTTTCACATGTAGTAAGGAGTATAGAGTGTTAACA

2890

2910

2930 (contd.)

-108, (contd.)

ATTGATAAGATGGCGATCGTGAACCAAACTTTCCCACCCGATGTCCCAAGATAGGACTAA

2950 2970 2990

AAGTCTAATCTGGATAGCCGAGCCGGCTATACTTCACACTCCCAAAAAGTCTTTTATTAG

3010 3030 3050

TAGAGGCATCATCCTGGAATCGAATATTCTTTGCCATTCAAACTAAGTTCCAGGATTTTG

3070 3090 3110

Ciai

ACCCTTTCCTCTCTGAAGCCAGCAAAGTAGCAAAGCAACTTATCNAJJACATCGAT

3130

3150

3170

-109-
4^ã. - Processo de acordo com a rei vindi ação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante compreender uma sequência de DNA da fórmula II ou um seu derivado.

-110(Formula II): pelB

Xhol

CTCGAGTCCAGTAGTTAGTAGTTGCGGATAACAAGGATAGATCATCCCCTTTGGTTATGT

10 30 50

GTGAGTCTGACCAAGGAAGCATTGGGGGAGAGACTATTGGGTCAATGGCACTCACGGGAA

70 90 110

AAAGAGGCGAAAGGGATGGGAGAGGTGATGCCTGAGGCCGCATGAATATATCATGTGAGA

130 150 170

GCAAAGAAGATCAAACAAACAATACAAACCCCAGCGTGACCCCTCACTGCCACGTGATTT

190 210 230

CCCAGCTAATCCTCTTCGGGGTGTTTTCCCCCCCAATCGGGGCTTCTTGGCAACCACTAA

250 270 290

TTTCCATAATTTCCACTGGACTCTTGAACGGTTCTTGCAATGTCTCACTGTCAGACTGAG

310 330 350

AGTACCACTTTTCTCCCTCTACCAAGCCTTGAAATAGGTCAGGGCCGTTCATGGGACCCT

370 390 410

GACCTCCACCCCTTCGGAAGCCAGCCGGATTGCTTCTAAGACATCCTGAACTGGGCCACC

430 450 470

ATCCGGCTCTCACCATTCCTATGCTCTGCCAAGCGACTCGACCTCGTTCTTCACCGGAGT

490 510 530

Smal

GCCCGGGTCCGCCCTGAACTCAAGGTCTGCATGGGAAGAGATTTCCGGCTGTTTCCCCCA

550

570

590 (contd.)

-111(contd.)

Bell

ACGGCGTCTAGGCAGATAGGCTAGGCGTTGTGTTCCTGGCTTGATCAGCAAGGTTTATCA

610 630 650

TAGTCCTCATGACTCGTAAAACCCAAGAAGATAAAATGAAGATGTTGGGTCCGCCAGTCC

670 690 710

GGTGATGTCTGGGCAGCAGTAGTAACACTCTAAAATATAAGCCACCACACCCACTGACAG

730 750 770

GTTAATCTCCGGTAGAAGAACCAAGACCTACCTGCCAAGCCACGTTGATTGGGTTCTCAT

790 810 830

CCATTTCAGGTCCTGTCCCCGGTCCCCTGGTGTCATTCCAGAACATGGTCAAGGAAATCA

850 870 890

AACGGCCACTGTCTGACTGCCAGCTCCACCATCATGTAATCCGGCTTCTCTATATAAACT

910 930 950

TGGGAATGTTCCCCTCTCCTGTGCCACCCAGAAGAACACATCACCTTCCTTGCTTCTACA

970 990 1010

AGCCTGTCACTCTTTCCAGGCCGTCGTTCTTTGATATTTCTCACTAGACTTTCATTCTCT

1030 1050 1070

Nsil Μ Η Y

TGAATATTTTCTTTTTGTTTTCCCTCGTATTTTCTGTGCTTTGAGAGCCCAACATGCATT

1090 1110 1130

KLLFAAAAASLASAVSAAGV

ACAAACTGCTTTTTGCTGCTGCCGCAGCATCCTTGGCCAGCGCTGTCAGTGCCGCCGGTG

1150

1170

1190 (contd.)

-112(contd.)

Ncol

VGAAEGFAHGVTGGGSASPV

TTGTTGGTGCCGCCGAGGGTTTCGCCCATGGTGTCACTGGCGGTGGCAGCGCTTCCCCCG

1210 1230 1250

Smal

YPTTTDELVSYLGDNEP.RVI

TCTATCCTACGACTACTGATGAGCTGGTCTCTTACCTCGGAGATAACGAGCCCCGGGTGA

1270 1290 1310

I L D R T

TTATCCTGGATAGAACGTAGGTCGATCCTCAATTGGAAATGGATGGGTAGACGTGGGCCT

1330 1350 1370

PvuII

FDFTGTEGTETTTG

AACAGGTTGATAATCCAGCTTCGACTTCACCGGCACTGAGGGTACTGAAACTACCACCGG

1390 1410 1430

CAPWGTASQCQVAINLHSWC

ATGTGCCCCCTGGGGAACTGCTTCCCAATGCCAGGTGGCCATCAACCTGCACAGCTGGTG

1450 1470 1490

DNYQASAPKVSVTY

TGACAACTACCAGGCTAGCGCCCCCAAGGTATCCGTGACTTAGTATGTTGTCCCCGTTCG

1510 1530 1550

D K A G I L P

ATTGGTGACCCTGTCTTTCCATGCTGATAGCCGTATAGTGATAAGGCGGGTATCCTCCCC

1570 1590 1610

HincII

ITVNSNKSIVGQGTKGVIKG

ATTACGGTCAACTCCAACAAAAGTATCCTTGGTCAGGGCACCAAGGGAGTCATCAAGGGC

1630 1650 1670

KGLRVVSGAKNVIIQ

AAGGGTCTCCGTGTGGTCAGCGGTGCCAAGAACGTCATCATCCAGTGAGTGCAGAACATC

1730

1690

1710 (contd.)

-113(contd.)

N I A V T D

GGTCTTAGGATGTGAAAAAACCCTTTGCTAATAAAGGCCAGGAACATTGCCGTTACCCAC ·««·«

1750 1770 1790 inpkyvwggdaitvddsdlv

ATCAACCCCAAGTATGTCTGGGGTGGTGATGCCATTACTCTCGATGACTCTGATCTGGTC ······

1810 1830 1850

WIDHVTTARICRQHIVLGTS

TGGATCGACCATGTGACCACTGCTCGCATTGGTCGCCAGCACATCGTTCTGGGAACCAGC

1870 1890 1910

Clal

ADNRVTISYSLIDGRSDYSA

GCCGACAACCGCGTCACCATCTCCTACTCCCTCATCGATGGTCGCTCCGACTACTCTCCC

1930 1950 1970

TCNGHHYWGVYLDGSNDMVT

ACCTGCAACGGCCACCACTACTGGGGCGTGTACCTGGACGGCAGCAACGACATGGTCACC

1990 2010 2030

LKGNYFYNLSGRHPKVQGNT

CTTAAGGGCAACTACTTCTACAACCTGAGCGGCCGCATGCCCAAGGTICAGGGTAACACT

2050 2070 2090

L L Η A

CTGCTGCACGCCGTATGTCGCCTTGAGCCTCCTATATGATTTGCACATTACTGACAAGTC

2110 2130 2150

VNNLFHNFDGHAFEIGT

TGACTACAGGTGAACAACCTCTTCCACAACTTTGACGGCCACGCCTTCGAAATCGGCACT

2170 2190 2210

HincII

GGYVLAEGNVFQDVNIVVET

GGTGGCTACGTCCTGGCCGAGGGTAACGTCTTCCAGGACGTTAACATTGTGGTGGAGACG

2270

22S0

2230 (contd.)

-114(contd.)

PI SGQLFSSPDANTNQQCAS CCCATCAGCGGCCAGCTCTTCAGCTCCCCCGACGCCAACACCAACCAGCAGTGCGCCTCC « · · · · * 2290 2310 2330

VFGRSCQLNAFGNSGSMSGS

GTCTTCGGTCGTTCCTGCCAGCTCAACGCCTTCGGCAACTCCGGCTCGATGTCCGGATCG

2350 2370 2390

Smal

DTSI ISKFAGKTIAAAHPPG GACACCAGCATCATCAGCAAGTTCGCTGGCAAGACCATTGCTGCGGCTCACCCCCCGGGT

2410 2430 2450

N IAQWTMKNAGQGK

AACATTGCCCAGTGGACCATGAAGAACGCTGGCCAGGGCAAATAAGGTTTTACAGCAGAA

2470 2490 2510

Kpnl

CAATTCTGTGAAGGAGGCTGGCCAAAGCCCAGATGAGGATAGAGGGTACCTGCTTCGACA

2530 2550 2570

TCTATAGTTCAATAGTCCAGGATTATAGACGAATGATTATTGCTCCAGAATGGTGAAGTA

2590 2610 2630

TTTCTAGCAGACCATGACGCGTACGCAACATAGACCGCTCCATGTTACTGACTGCGACTG

2650 2670 2690

TATTTGGAGGATTGAGGAAAGCTAGATAAAAGTATATACTACAAAACCGCCATAACAGCA

2710 2730 2750

Xhol

ACCGACGCCTCGAG

2770

-1155*. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante compreender uma sequência de DNA da fórmula III ou um seu derivado.

-116- (Formula III): pelC

EcoRI

GAATTCGAATCTGGAGGACATTACGTGTGCCTGACTTCGGGGTACTTCTGTCTTCACTGT

10 30 50

AGCCAGGCACTATCCCTGACACTCTGCCCCCTACGTGGTCTTACCTTTATCGGATTTAGA

70 90 110

TAGTAACCAATCTGATCCCACATCCTGATACCTGGATACTTTTCCCCATGGCATCGTGTA

130 150 170

ATCTATGATACTCAAAGGAACAAAGCAGATACTTGAAGCTGCATAGACCTTGTCTCAGAG

190 210 230

ATCGCAGCTTTGTTGTTTAGAAACACAGTCTGTCACCGGTTCGCCAGATTAAGTGTTAAA

250 270 290

CATGTGACAGGCACCTAAAAGCTGACAGCCTCGGCCTGAGCTCGTAGAGTACCCTCTTCT

310 330 350

AGGTCTTTGTGGGTTGACTGCAAGCAAAGGATCAAGCTTGTCGGAGAATTTGGAGCTTTT

370 390 410

GCATGTAATTTTTCCGACTGGGGTCCGAGTATTTCCCGCGGTGTATGTTAGAATGGTTAG

430 450 470

HincII

TATGGATAGATTGGTAGAAAAGTTGACCTGAAACATTGAGATATCTGATTAGTAGTATGC

490 510 530

BglII

TATAGATCTGGATATACATTTCTGCAATGAAATGTGATCATATGAACTTTTTGAAATGAA

550

570

590 (contd.) (contd.)

-117Bell

GGAGATATATGCATAGTTGTGAAATATGCGCGTGGCCTGTCCGTTCTCAGCCCTGACGGG

610 630 650

TGACATCCCGTTCGGCTGTTTAGTGGAAAGCCGCGTGGCTGTCTCGGGGGAGTGGGTCAG

670 690 710

GGTCCTCCAGGAATTTTCTTTTCTAGGTTAGTTCTTCCAGCCTTCCAGGGTCCTGCAGAC

730 750 770

PvuII

CCGCCTCCAAACAGCTGATTGTGGTGTAACCGTTTACAAGACTGGCCAGCATATTTTTGT

790 810 830

ATATGTCACTATCGTGAAGATTATATTCATCTTATATCAATTGGAGCTTGAGGTCTATCT

850 870 890

CTTAGTGTGCGCACAAAAAGCCGATATGATTCAATGCGTCTGTCAAATAACCCGAACTGT

910 930 950

Hinfl

CCGAATCATCACACCCACAGAGTGCTGCGAAGGTCGTGATCCTTCCAAGTATCTCAGAAA

970 990 1010

AGACCACTACACTGGACCCCCAACAAAGGTACACAATAACTTCGGGTAGAGAATTGTGCG

1030 1050 1070

ATGCAGAGCATAGTATATCTGAAACAACTGTCACTGCAGACCTTICCTACTTGTGCATCC • · * · · ·

1090 1110 1130

GGTTCGCATTGCAGTGGCGCAGGGCAGTTCTTGGCCGAAGAACTATGATCACTTTGTAAC

1150 1170 1190

Ncol

AACGGTGGCCCCTGTAGCTACCAGTGTTCTGTACTTCGGCAAAATTCAATCCTTGGCTTC

1210

1230

1250 (contd.) (contd.) \

-118Stnal

TATATGTCACTAGGTGACTTTGAATACATAAAGATGAAATGTTGGAACTTTGGACGATAC

1270 1290 1310

HincII

Μ K V P F

CTCTGTCTGTCAACACAATCTGTACTTTTCCAAAACCCTTATCCATTATGAAGGICCCCT

1330 1350 1370

PvuII

LQLLCLNAALASANVVQGAA • TCCTCCAACTTCTCTGCCTAAATGCCGCCTTGGCTAGTGCCAATGTTGTTCAAGGTGCTG

1390 1410 1430

QGFAAGVTGGGDITPSYPKT

CCCAGGGTTTCGCAGCCGGCGTCACTGGCGGCGGCGATATAACTCCCAGCTACCCCAAAA

1450 1470 1490

Xhol

Aval

NEELVSLLESDEPQVVVLTK

CCAACGAGGAGCTTGTCTCCCTGCTCGAGAGTGACGAACCCCAAGTCGTCGTACTCACCA

1510 1530 1550

Kpnl

TFDFIGTEGTTTEDGCAPWG

AGACCTTTGATTTCATCGGTACCGAGGGAACCACGACCGAGGATGGATGCGCGCCCTGGG

1570 1590 1610

PvuII

TGKSCQLAINSNGWCGKNPV

GTACTGGGAAGTCCTGCCAGCTGGCCATCAACTCCAATGGATGGTGTGGTAAAAATCCCG

1630 1650 1670

Hinfl

VTITYDNAAKNGIHIKSNKT

TCGTAACCATCACGTATGATAACGCCGCCAAGAATGGCATTCATATCAAGTCCAACAAGA

1690 1710 1730

LVGEGDKGVLSGKGLYFEGG

CTCTTGTTGGTGAGGGAGACAAGGGCGTGCTCAGCGGAAAGGGTCTCTACTTTGAGGGTG

1750

1770

1790 (contd.) (contd.)

-119-

VSNIIVQNIKITNLNPG

GTGTTTCCAATATCATCGTGCAGAACATTAAGATTACGAACCTCAACCCTGGGTATGTAT

1810 1830 1850

CATCCCAGTAACTAGGAGTTCTCGAATGCTTTGGGAGACACACCATGTGTTCTAACGTCT

1870 1890 1910

Ciai

FVWGGDAFTFFGADLIW

TTCACTACAGTTTTGTCTGGGGTGGCGACGCGTTTACTTTCTTTGGCGCTGACCTGATCT

1930 1950 1970

I D H C E

GGATCGACCACTGCGAGGTAAGACAGAAATCTCCATCATCTGATAATCATGATTGAGTTT

1990 2010 2030

HincII

TSLTGRQHYVTGF

CTCACCTTCACTTATGGATTAGACCTCCCTCACCGGACCCCAACACTACGTGACCGGCTT

2050 2070 2090

HPNTRMTWSNNFLNGVTTHS

CCACCCCAACACCCGCATGACTTGGTCCAATAACTTCCTTAACGGCGTAACCACCCACTC

2110 2130 2150

AGC DDHHYWTMELVGPGDEI CGCAGGCTGTGATGACCACCACTACTGGACAATGGAGCTAGTTGGCCCTGGGGACGAGAT

2170 2190 2210

T F Q N

TACCTTCCAGAGTACGTGTCCCATGAAAACCTAAAAGAAGCATCTATTCAACTAACATAC

2230 2250 2270

Accl

NYVYHT TGRGPALSG GTGTTCACTCACAGACAACTACGTCTACCACACCACCGGCCGTGGACCCGCTCTCTCCGG

2330

2310

2290 (contd.) (contd.)

-120HincII

TTLFHAVNSVWSSIPGHAIE

CACGACCCTCTTCCACGCAGTCAACAGCGTCTGGTCTTCCATCCCCGGACACGCCATCGA

2350 2370 2390

GGDKGRGLFEGCFFEDVVEI

GGGCGGTGACAAGGGCCGCGGTCTTTTCGAGGGATGCTTCTTCGAAGATGTTGTCGAGAT

2410 2430 2450

Aval

APAKPENQLFSASEANAASC

CGCCCCCGCCAAGCCCGAGAACCAACTCTTCAGCGCCAGTGAAGCCAACGCCGCATCTTG

2470 2490 2510

KSALGRACQANGYSKSGAFG

CAAGTCCGCCTTGGGACGCGCTTGCCAGGCCAATGGCTATAGCAAATCTGGTGCTTTTGG

2530 2550 2570

SSETGFFKDFAGLTIAPAGS

CAGTTCTGAAACTGGCTTTTTCAAGGACTTTGCCGGACTGACTATTGCACCGGCCGGCTC

2590 2610 2630

ATDALAYVPKNCGIGRLESC

TGCGACCGACGCTCTCGCTTATGTTCCTAAGAATTGTGGTATTGGGCGTCTTGAAAGCTG

2650 2670 2690

D A Hinfl

CGATGCTTAGGGTGGAGCTTGTTGAGTCTATATTTGACCAATAGGGTGTACTTTATTCTA

2710 2730 2750

Xhol

CTTCAGTCCGGTTAATATATGTAATATATTTGGATTCTGCGCGCAACTTGTGCTTTCCTC • « · · ·

2770 2790 2810

AGTTCTGCAATATCCATTCAAGTAGTCTACGCATCTCTATAGACTATTGATCAATATAAC «·«···

2830 2850 2870

ATAGCAGACAACACTGCCAACCAAAATATAAGACCCAGTATATACTTTCCGTGAAGTATT ···«··

2890 2910 2930 (contd.)

-121 (contd.)

TAAAACAGATTACATCTAGCTTGAAAATCATCCCTCTCTGGTTCAAGTATTCACGTCAGT ··«···

2950 2970 2990

AGCTGAAAAGGGAATAACGATGACCGCGAATAATTTGACAATCATCTACCCGATGAATAC ····««

3010 3030 3050

CAATCAAGGAAAACAAAAGTCGTGAGAAAAATGCAAGGGAGAAAGTTATATCTTACAAAA «···««

3070 3090 3110

GAAACATACAACAGAAGGAATATGTCAGTGGTCATTGAACATTACAAA

3130

3150

65. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante ser pGW820.

-122-
7³. - Processo de acordo com a reivind cação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante ser pGW830.
8⁵. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante ser pGW850.

95. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinan e ser pGW880.

105. _ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante ser pGW860.

115. _ processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante, compreender um fragmento que se estende entre dois sítios de restrição dos plasmídeo pGW820, pGW830, pGW850, pGW880 ou pGW860 e que retem a função do promotor, sinal, estrutural ou do terminador ou uma combinação de tais fragmentos .

125. _ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante compreender a sequ?encia do promotor de pelA.

-12313⁹. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante, compreender a sequência do promotor de pelA, pelB, pelC , pelE ou pe1F.

14?. _ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante, compreender a sequência sinal de pelA, pelB, pelC , pelE ou pelF.

15⁹. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante compreeder o gene estrutural de PLI, peIA, pelB, pe1C, pe1E ou pe1F .

16⁹. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a molécula de DNA recombinante, compreender os genes estruturais de peI , pelB, pelC, pe1E ou pe1F sem os intrões.

17^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pora molécula de DNA recombinante, compreeder o terminador de pelA , pel B, pelC , pe1E ou pelF.

18^a. - Processo de acordo com a reivind cação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante, ser um vector híbrido recombinante compreendendo um gene estrutural heterólogo para Aspergi 1lusniger.

-12419³. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula deDNA recombinante, ser um vector híbrido compreendendo o gene estrutural heterõlogo codificador de interferão híbrido BDBB.

20³. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante, ser o vector híbrido pUC 19/peIA-IFN AM119.

21³. - Processo de acordo com a reivindicação i, caracterizado por a molécula de DNA recombinante, ser o vector híbrido M13( + )KS/pelA/iss-IFN AM 1 19.

22³. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de DNA recombinante ser o vector híbrido M13(+)KS/pelA-IFN AM119.

23³ . - Processo para a preparação de um hospedeiro transformado contendo uma molécula de DNA recombinante a qual compreende uma sequência de DNA codificadora do sistema de expressão das pectinas-1iases PLA, PLB, PLC, PLE ou PLF ou um seu derivado, caracterizado pelo tratamento de tal hospedeiro em condições de transformação com uma molécula de DNA recombinante de acordo com a reivin dicação 1, facultativamente juntamente com um gene de uma marca selectiva e selecção dos transformantes.

24³. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o hospedeiro transformado ser Escherichia coli HB101/pGW820 (DSM 4388).

-12525³. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o hospedeiro transformado ser Escherichia coli HB101(pGW830(DSM 4389).

26®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o hospedeiro transformado ser Escherichia coli HB101/pGW850(DSM 4390).

27®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o hospedeiro transformado ser Escherichia coli HB101/pGW860 (DSM 4391).

28®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o hospede ro transformado ser Escherichia coli HB 10 1/pGW880(DSM 4392 ).

29®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o Aspergi11us niger An8 ser transformado com uma molécula de DNA recombinante prepara a de acordo com a reivindicação 1, e com o plasmídeo da marca selectiva pcG59D7.

30®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se preparar um hospedeiro transformado que é Aspergi11us niger An8 (DSM 3917) transformado com uma molécula de DNA recombinante preparada de acordo com a reivindicação 1 e com o plasmídeo da marca selectiva pcG59D7.

31®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se preparar um hospedeiro transformado que é Aspergi11us niger An8 (DSM 3917) transformado com pUC 19/pelA-IFN AM119 e com o plasmideo da marca selectiva pcG59D7.

-12632³. - Processo de acordo com a reivindicaçã 23, caracterizado por se preparar um hospedeiro transformado que é Aspergíllus niger An8 (DSM 3917) transformado com M13(+)KS/pe 1 AjAss-1FN AM119 e com o plasmídeo da marca selectiva pCG59D7.

33^Ê. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se preparar um hospedeiro transformado que é Aspergi11us niger An8(DSM 39 17) transformado com M13( + )KS/pelA-IFN AM 119 e com o plasmideo da marca selectiva pCG59D7.

34³. - Método para a preparação de um poiipeptídeo, caracterizado por o vector híbrido preparado de acordo com a reivindicação 1 ser expresso num hospedeiro adequado.

35³. - Método para a preparação de um poiipeptídeo, caracterizado por um vector híbrido preparado de acordo com a reivindicação 18 ser expresso num hospedeiro adequado.

36⁵. - Método de acordo com a reivindicação 34 para a super-produção das pectinas-1iases PLA, PLB, PLC, PLE ou PLF em espécies de Aspergíllus caracterizado pela cultura de um hospedeiro Aspergíllus transformado com um vector híbrido de expressão para a expressão das refe idas pectinas-1iases.

-12737^a. - Método de acordo com a reivindicação 35 para a produção de interferão híbrido BDBB em espécies de Aspergillus caracterizado pela cultura de um hospedeiro Aspergillus transformado com um vector híbrido de expressão para a expressão do referido interferão híbrido

38^a se preparar pectinas-1iases pura.

- Processo caracterizado por PLA, PLB, PLE ou PLF na forma

Lisboa, 26 de Julho de 1989

Ajer.íj Oficial da Prcpricóâúe Industrial rua VICTOR COROOU. 10-A. 1/ 1200 LISSOA

Figura 1 Mapa de restrição do plasmídeo pGW820 contendo pelA

FOLHA 1 (31 FOLHAS)